Etablierung neuer Methoden zur in vitro Kultivierung der Baumart Fraxinus excelsior L. und Entwicklung von Verfahren zur Kryokonservierung von in vitro Sprossspitzen Inaugural-Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades eines Doktors der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.) am Institut für Biologie der Universität Kassel vorgelegt von Katja Schönweiß aus Kassel Kassel, Dezember 2005 Als Dissertation dem Fachbereich eingereicht am: 02.12.2005 1. Referent: Prof. Dr. R. Grotha 2. Referent: Prof. Dr. U. Kutschera Datum der Disputation: 16.02.2006 Teile dieser Arbeit wurden vorab in folgenden Zeitschriften oder Kongressbänden veröffentlicht: REED B. M., KOVALCHUK I., KUSHNARENKO S., MEIER-DINKEL A., SCHOENWEISS K., PLUTA S., STRACZYNSKA K. (2004). Evaluation of critical points in technology transfer of cryopreservation protocols to international plant conservation laboratories, Cryoletters 25: 341-352. SCHÖNWEIß K. (2004). In vitro culture and cryopreservation of selected genotypes of Common Ash (Fraxinus excelsior). In: Bayrisches Landesamt für forstliche Saat- und Pflanzenzucht (Ed). Ergebnisse forstgenetischer Feldversuche und Laborstudien und ihre Umsetzung in die Praxis. Tagungsbericht zur 11. Arbeitstagung vom 20.-22. September 2004, Teisendorf, 266-274. SCHOENWEISS K., MEIER-DINKEL A., GROTHA R. (2005). Comparison of cryopreservation techniques for long-term storage of ash (Fraxinus excelsior L.). CryoLetters 26 (3): 201-212. SCHOENWEISS K., MEIER-DINKEL A. (2005). In vitro propagation of selected mature trees and juvenile embryo-derived cultures of Common Ash (Fraxinus excelsior L.). Journal of Ornamental Plant Propagation 5 (3): 137-145. Inhaltsverzeichnis Seite 1 Einleitung ............................................................................1 2 Zielsetzung und theoretische Grundlagen.......................3 2.1 Politische Grundsatzentscheidungen der deutschen Forstpolitik ..........3 2.2 Ziele und Aufgaben der Forstpflanzenzüchtung .......................................3 2.2.1 Vorteile der Gewebekultur für die Forstwirtschaft ...........................................4 2.2.2 Langzeitlagerung von in Prüfung befindlichem Material .................................5 2.3 Die Gemeine Esche (Fraxinus excelsior L.) ...............................................5 2.3.1 Morphologie ....................................................................................................5 2.3.2 Vorkommen und Bedeutung der Gemeinen Esche in Deutschland und Europa ............................................................................................................7 2.3.3 Konservierungsmaßnahmen und Versorgung mit Pflanzgut in Deutschland....................................................................................................9 2.4 Das europäische Eschenprojekt RAP.......................................................10 2.5 Gewebekultur ..............................................................................................11 2.5.1 In vitro Kultur von Gehölzen .........................................................................11 2.5.2 Vermehrungsverfahren der Achselsprossmethode.......................................12 2.5.2.1 Etablierungsphase in vitro.............................................................................12 2.5.2.2 Vermehrungsphase in vitro ...........................................................................13 2.5.2.3 Bewurzelungsphase in vitro ..........................................................................13 2.5.2.4 Überführung in unsterile Bedingungen und Anpassung an Freilandbedingungen ....................................................................................13 2.5.3 Nährmedien ..................................................................................................14 2.5.4 Phytohormone ..............................................................................................15 2.5.4.1 Cytokinine .....................................................................................................16 2.5.4.2 Auxine...........................................................................................................17 2.5.4.3 Einsatz von Cytokininen und Auxinen in der in vitro Kultur...........................18 2.5.4.4 Thidiazuron (TDZ).........................................................................................19 2.5.5 In vitro Vermehrung von Fraxinus excelsior L...............................................19 2.5.6 Strategie zur Entwicklung eines in vitro Protokolls für Fraxinus excelsior L. 20 2.6 Kryokonservierung.....................................................................................21 2.6.1 Theoretische Grundlagen der Kryokonservierung ........................................21 2.6.1.1 Gefrierprozesse in pflanzlichen Systemen....................................................22 2.6.2 Kryokonservierungsverfahren.......................................................................23 2.6.2.1 Kryoprotektantien..........................................................................................23 2.6.2.2 Grundlagen der Vitrifikationsmethode...........................................................24 2.6.2.3 Alginat- / Dehydrationsmethode ...................................................................25 2.6.2.4 Vitrifikation mit PVS2 ....................................................................................25 2.6.2.5 Regeneration kryokonservierter Sprosse......................................................26 2.6.3 Kryokonservierung von Fraxinus excelsior L. ...............................................26 2.7 Besonderheiten und Zielsetzung der vorliegenden Arbeit .....................27 3 Methoden und Material ....................................................28 3.1 Geräte, spezieller Laborbedarf und Chemikalien ....................................28 3.1.1 Geräte...........................................................................................................28 3.1.2 Spezieller Laborbedarf..................................................................................28 3.1.3 Chemikalien ..................................................................................................29 3.2 Methoden zur in vitro Kultur von Fraxinus excelsior ..............................29 3.2.1 Kulturgefäße .................................................................................................29 3.2.2 Kulturbedingungen........................................................................................30 3.2.3 Pflanzenmaterial ...........................................................................................30 3.2.3.1 Saatgut .........................................................................................................30 3.2.3.2 Ausgewählte Plusbäume aus dem 1985 angelegten Eschenherkunftsversuch...............................................................................30 3.2.4 Etablierung und Vermehrung von juvenilen Sprosskulturen aus zygotischen Embryonen................................................................................32 3.2.4.1 Medium .........................................................................................................32 3.2.4.2 Oberflächensterilisation des Saatgutes, Präparation und Vermehrung ........32 3.2.5 Etablierung adulter Kulturen mit Explantaten geworben von den Mutterbäumen...............................................................................................33 3.2.5.1 Oberflächensterilisation, Präparation und Etablierung frischer Triebe von Mutterbäumen...............................................................................................33 3.2.5.2 Oberflächensterilisation, Präparation und Etablierung ruhender Knospen von Mutterbäumen........................................................................................35 3.2.5.2.1 Einfluss des Werbungsdatums auf die Regeneration von Winterknospen ...36 3.2.6 Etablierung adulter Kulturen aus Explantaten von Pfropflingen der Mutterbäume.................................................................................................37 3.2.6.1 Einfluss des Sterilisationsmittels auf Kontaminationen der Explantate.........39 3.2.6.2 Einfluss von Umweltfaktoren auf Kontaminationen der Explantate ..............39 3.2.6.3 Einfluss der Jahreszeit auf Kontaminationen der Explantate........................40 3.2.6.4 Optimierung der Etablierungsrate durch Zusatz von TDZ ............................40 3.2.7 Optimierung der Vermehrungsrate von etablierten juvenilen und adulten in vitro Kulturen.................................................................................................40 3.2.7.1 Wahl des optimalen Basismediums..............................................................40 3.2.7.2 Einfluss des verwendeten Cytokinins und des Cytokinin / Auxin- Verhältnisses auf die Vermehrungsrate........................................................41 3.2.7.3 Einfluss des Kulturgefäßes auf die Vermehrungsrate...................................41 3.2.7.4 Einfluss von TDZ auf die Vermehrungsrate ..................................................42 3.2.7.5 Einfluss von Agar und TDZ auf die Vermehrungsrate ..................................42 3.2.7.6 Vergleich der Vermehrungsraten des Standardmediums in Weckgläsern mit einem abgewandelten Medium in Honiggläsern .....................................42 3.2.8 Bewurzelung juveniler und adulter etablierter Kulturen ................................43 3.2.8.1 Einfluss von Dunkelheit und IBA-Konzentrationen auf die Bewurzelung......44 3.2.8.2 Einfluss von IBA und BAP auf die Bewurzelung...........................................45 3.2.8.3 Einfluss einer zusätzlichen Kultivierung auf Kohlemedium auf die Bewurzelung .................................................................................................45 3.2.8.4 Einfluss verschiedener Auxine und deren Applikationsform auf die Bewurzelung .................................................................................................45 3.2.9 Optimiertes in vitro Protokoll zur Etablierung adulter Kulturen von Fraxinus excelsior L.....................................................................................................45 3.3 Methoden zur Kryokonservierung von Fraxinus excelsior.....................47 3.3.1 Herstellung von sterilen Lösungen und Medien............................................47 3.3.2 Pflanzenmaterial und Kulturbedingungen.....................................................47 3.3.2.1 Abhärtungsbedingungen...............................................................................47 3.3.3 Sprosspräparation ........................................................................................47 3.3.4 Alginat- / Dehydrationsmethode ...................................................................48 3.3.4.1 Bestimmung des Wassergehaltes der Kugeln ..............................................49 3.3.4.2 Bestimmung der Regeneration nach den einzelnen Behandlungsschritten .50 3.3.5 Vitrifikationsmethode mit PVS2.....................................................................50 3.3.5.1 Erwärmung und Regeneration der Proben ...................................................50 3.3.5.2 Einfluss zweier Vorbehandlungslösungen (BSA und Glycerol) auf die Regeneration juveniler Kulturen nach Kryokonservierung............................51 3.3.5.3 Optimierung der Kulturperiode für die Kryokonservierung von juvenilen Kulturen ........................................................................................................51 3.3.5.4 Optimierung des Abhärtungszeitraumes und des Vorkulturmediums für die Kryokonservierung von juvenilen Kulturen....................................................51 3.3.5.5 Langzeitlagerung in flüssigem Stickstoff von fünf juvenilen Kulturen ...........52 3.3.5.6 Vergleich der Regenerationsfähigkeit von juvenilen und adulten Kulturen nach dem für juvenile Kulturen optimierten Kryokonservierungsprotokoll ....52 3.3.5.7 Optimierung der Kulturperiode, der Vorkultur und der PVS2-Inkubation für die Kryokonservierung von adulten Kulturen ................................................52 3.3.5.8 Langzeitlagerung von neun adulten Kulturen in flüssigem Stickstoff............53 3.3.5.9 Optimiertes Kryokonservierungsprotokoll für juvenile und adulte in vitro Kulturen von Fraxinus excelsior....................................................................53 3.4 Beschreibung des Versuchsdesigns und statistische Auswertung......54 4 Ergebnisse ........................................................................56 4.1 In vitro Vermehrung von Fraxinus excelsior............................................56 4.1.1 Etablierung und Vermehrung von juvenilen Sprosskulturen aus zygotischen Embryonen................................................................................56 4.1.2 Etablierung adulter Kulturen mit Explantaten, geworben von den Mutterbäumen...............................................................................................56 4.1.2.1 Oberflächensterilisation, Präparation und Etablierung frischer Triebe von Mutterbäumen...............................................................................................56 4.1.2.2 Oberflächensterilisation, Präparation und Etablierung ruhender Knospen von Mutterbäumen........................................................................................58 4.1.2.2.1 Einfluss des Werbungsdatums auf die Regeneration von Winterknospen ...59 4.1.3 Etablierung adulter Kulturen aus Explantaten von Pfropflingen der Mutterbäume.................................................................................................61 4.1.3.1 Einfluss des Sterilisationsmittels auf Kontaminationen der Explantate.........61 4.1.3.2 Einfluss der Umweltfaktoren auf Kontaminationen der Explantate ...............62 4.1.3.3 Einfluss der Jahreszeit auf Kontaminationen der Explantate........................62 4.1.3.4 Optimierung der Etablierungsrate durch Zusatz von TDZ ............................63 4.1.4 Optimierung der Vermehrungsrate von etablierten juvenilen und adulten in vitro Kulturen.................................................................................................64 4.1.4.1 Wahl des optimalen Basismediums..............................................................64 4.1.4.2 Einfluss des verwendeten Cytokinins und des Cytokinin / Auxin- Verhältnisses auf die Vermehrungsrate........................................................65 4.1.4.3 Einfluss des Kulturgefäßes auf die Vermehrungsrate...................................65 4.1.4.4 Einfluss von TDZ auf die Vermehrungsrate ..................................................66 4.1.4.5 Einfluss von Agar und TDZ auf die Vermehrungsrate ..................................68 4.1.4.6 Vergleich der Vermehrungsraten des Standardmediums in Weckgläsern mit einem abgewandelten Medium in Honiggläsern .....................................68 4.1.5 Bewurzelung juveniler und adulter etablierter Kulturen ................................69 4.1.5.1 Einfluss von Dunkelheit und IBA-Konzentration auf die Bewurzelung..........70 4.1.5.2 Einfluss von IBA und BAP auf die Bewurzelung...........................................71 4.1.5.3 Einfluss einer zusätzlichen Kultivierung auf Kohlemedium auf die Bewurzelung .................................................................................................72 4.1.5.4 Einfluss verschiedener Auxine und Applikationsformen auf die Bewurzelung .................................................................................................73 4.1.6 Ergebnisse der Etablierungs- und Bewurzelungsversuche über die gesamte Projektlaufzeit.................................................................................75 4.2 Kryokonservierung.....................................................................................77 4.2.1 Sprosspräparation ........................................................................................77 4.2.2 Alginat- / Dehydrationsmethode ...................................................................77 4.2.2.1 Bestimmung des Wassergehaltes der Kugeln ..............................................77 4.2.2.2 Bestimmung der Überlebensrate nach einzelnen Behandlungsschritten .....78 4.2.3 Vitrifikationsmethode mit PVS2.....................................................................80 4.2.3.1 Einfluss zweier Vorbehandlungslösungen (BSA und Glycerol) auf die Regeneration juveniler Kulturen nach Kryokonservierung............................80 4.2.3.2 Optimierung der Kulturperiode für die Kryokonservierung von juvenilen Kulturen ........................................................................................................81 4.2.3.3 Optimierung des Abhärtungszeitraumes und des Vorkulturmediums für die Kryokonservierung von juvenilen Kulturen....................................................81 4.2.3.4 Langzeitlagerung in flüssigem Stickstoff von fünf juvenilen Kulturen ...........83 4.2.3.5 Vergleich der Regenerationsfähigkeit von juvenilen und adulten Kulturen nach dem für juvenile Kulturen optimierten Kryokonservierungsprotokoll ....83 4.2.3.6 Optimierung der Kulturperiode, der Vorkultur und der PVS2-Inkubation für die Kryokonservierung von adulten Kulturen ................................................84 4.2.3.7 Langzeitlagerung von neun adulten Kulturen in flüssigem Stickstoff............85 5 Diskussion ........................................................................88 5.1 In vitro Vermehrung....................................................................................91 5.1.1 Kontaminationen...........................................................................................91 5.1.2 Explantatquelle .............................................................................................92 5.1.3 Optimierung der Etablierungserfolge und der Vermehrungsrate ..................93 5.1.4 Optimierung der Bewurzelung ......................................................................96 5.2 Kryokonservierung.....................................................................................99 5.2.1 Alginat- / Dehydrationsmethode .................................................................100 5.2.2 Vitrifikationsmethode mit PVS2...................................................................101 5.3 Fazit der vierjährigen Forschungsarbeit ................................................103 5.4 Ausblick und Zukunft der in vitro Kultur und Kryokonservierung von Gehölzen....................................................................................................103 6 Zusammenfassung.........................................................106 6.1 In vitro Kultur von Fraxinus excelsior ....................................................106 6.2 Kryokonservierung...................................................................................106 7 Literatur und Quellenangaben ......................................107 7.1 Literatur .....................................................................................................107 7.2 Persönliche Mitteilungen .........................................................................115 7.3 Berichte .....................................................................................................115 7.4 Zitierte Projektpartner des RAP-Projektes .............................................116 8 Anhang ............................................................................117 Abkürzungen 2-iP 2-Isopentenyladenin AAO Ascorbinsäureoxidase ABA Abscissic acid (Abscisinsäure) Abb. Abbildung BAP 6-Benzylaminopurin BSA Bovine Serum Albumin °C Grad Celsius d day (Tag) DMSO Dimethylsulfoxid g Gramm h hour (Stunde) IAA Indoleacetic acid (Indol-3-Essigsäure) IBA Indole-3-butyric acid (Indole-3-Buttersäure) l Liter m Meter M molare Masse mM Millimolar mg Milligramm min Minute ml Milliliter µl Mikroliter µmol Mikromol mm Millimeter n Anzahl der Messwerte Kap. Kapitel NFV-C Niedersächsische Forstliche Versuchsanstalt Abteilung C MS Murashige & Skoog PVS2 Vitrification Solution Number 2 rpm rotations per minute RAP Realising Ash´s Potential s Sekunde SEM Standardfehler des Mittelwertes (standard error of the mean) Tab. Tabelle v/v Volumen / Volumen w/v Weight / Volume WPM Woody Plant Medium Einleitung 1 Einleitung Die vorliegende Arbeit wurde im Rahmen des europäischen Eschenprojektes mit dem Akronym RAP (Realising Ash´s Potential) innerhalb des fünften europäischen Rahmenprogramms mit Vertragsnummer QLK5-2001-00631 durchgeführt. Ziele dieser Arbeit waren die Entwicklung eines kommerziell anwendbaren in vitro Vermehrungs- protokolls für die Gemeine Esche und die erstmalige Entwicklung einer Methode zur Langzeitlagerung des pflanzlichen Materials über Kryokonservierungsverfahren. Alle in dieser Arbeit beschriebenen Versuche wurden an der Niedersächsischen Versuchsanstalt Abteilung Waldgenressourcen (NFV-C) durchgeführt. Die wissenschaftliche Entwicklung und Betreuung wurde begleitend zu den praktischen Arbeiten zum einen durch das wissenschaftliche Fachwissen von Dr. Meier-Dinkel im Bereich der Gewebekultur und zum anderen durch Professor Dr. Grotha des Fachgebietes Pflanzenphysiologie am Institut für Biologie der Universität Kassel gewährleistet. Ein internationaler wissenschaftlicher Austausch im Rahmen der Kryokonservierung erfolgte durch einen Forschungsaufenthalt an der Universität Abertay, Dundee, Schottland in der Arbeitsgruppe von Dr. Erica Benson und durch enge Zusammenarbeit mit Barbara Reed vom National Clonal Germplasm Repository, Corvallis, USA. Die vorliegende Arbeit gliedert sich in sieben Kapitel. In dem einführenden allgemeinen Teil des zweiten Kapitels werden vor allem die grundlegenden politischen Rahmenrichtlinien der Forstwirtschaft dargelegt. Diese sind für das Verständnis des Nutzens, der Rolle und der Richtung in die sich die Forstpflanzenzüchtung bewegt bedeutend. Nur durch eine Forstpflanzenzüchtung, die Erhaltung, Verbesserung und Nutzung des genetischen Potentials vereint, ist eine ökologische und wirtschaftliche Sicherung unserer Wälder gewährleistet. In diesem Teil werden neben der Morphologie und Verbreitung die Bedeutung der Gemeinen Esche in Deutschland herausgestellt und das Interesse und der Forschungsbedarf, der sich in dem europäischen Eschenprojekt widerspiegelt, dargestellt. Weiterhin werden in Kapitel 2 das Verfahren der in vitro Vermehrung erläutert und die bis heute in der Literatur beschriebenen Forschungsergebnisse über die Gattung Fraxinus diskutiert sowie die Besonderheit der in vitro Etablierung von adulten Mutterbäumen herausgestellt. Außerdem werden die 1 Einleitung physikalischen Grundzüge der Kryokonservierung dargelegt und die bekanntesten Kryokonservierungsverfahren erörtert. Kapitel 3 und 4 beschäftigen sich mit den in der 4-jährigen Forschungszeit durchgeführten Versuchsreihen. In Kapitel 3 werden die Materialien und Methoden beschrieben, die bei den durchgeführten Versuchen erprobt und verwendet wurden. Kapitel 4 stellt anschließend die Ergebnisse dar. Die daraus gewonnenen Erkenntnisse werden in Kapitel 5 herausgestellt, mit der Literatur verglichen und diskutiert. Kapitel 6 enthält eine Zusammenfassung der Forschungsergebnisse. Verwendete Literatur und Expertengespräche sind in Kapitel 7 aufgeführt. Die erzielten Forschungsergebnisse wurden in Teilen bereits präsentiert bzw. veröffentlicht. Zu nennen sind hier der Tagungsband zur internationalen Tagung des Forums Genetik-Wald-Forstwirtschaft in Teisendorf (SCHÖNWEIß 2004), die Darstellung der Ergebnisse zur Kryokonservierung von in vitro Kulturen der Gemeinen Esche in der internationalen Zeitschrift „CryoLetters“ (SCHOENWEISS et al. 2005) und die Ergebnisse zur in vitro Etablierung in der internationalen Fachzeitschrift „Propagation of Ornamental Plants“ (SCHOENWEISS und MEIER-DINKEL 2005). Unter der Leitung von Babara Reed wurden ebenfalls die Ergebnisse eines internationalen Projektes zur Problematik und Effektivität des Methodentransfers im Bereich der Kryokonservierung veröffentlicht (Reed et al. 2004). 2 Zielsetzung und theoretische Grundlagen 2 Zielsetzung und theoretische Grundlagen 2.1 Politische Grundsatzentscheidungen der deutschen Forstpolitik Ausgehend von den gewonnenen Erfahrungen und maßgeblich beeinflusst von internationalen Resolutionen wie dem internationalen Übereinkommen über die biologische Vielfalt von Rio de Janeiro 1992 und der Ministerkonferenzen zum Schutz der Wälder in Europa von Straßburg 1990, Helsinki 1993 und Lissabon 1998 wurde im Jahr 2000 eine Neufassung des 1987 veröffentlichten Konzepts zur Erhaltung forstlicher Genressourcen verabschiedet (PAUL et al. 2000). Das Ziel dieses Konzeptes ist es, durch eine bewusste und nachhaltige Forstwirtschaft die Vielfalt der Arten und die Vielfalt innerhalb von Baum- und Straucharten zu erhalten, forstliche Genressourcen nachhaltig zu nutzen und lebensfähige Populationen gefährdeter Arten wieder herzustellen. Nur so kann ein Fortbestand leistungsfähiger und gesunder Wälder für die Zukunft gesichert werden. 2.2 Ziele und Aufgaben der Forstpflanzenzüchtung Der Wald ist mit einem Flächenanteil von 30 % der bedeutendste großflächige naturnahe Lebensraum in Deutschland. Die Forstwirtschaft in Deutschland geht von dem Leitbild der multifunktionalen Bewirtschaftung aus, welche die nachhaltige Bereitstellung der Nutz-, Schutz- und Erholungsfunktionen des Waldes in sich vereint. Aus heutiger Sicht ist die Förderung von Mischwaldbeständen mit einem hohen Anteil an Laubbäumen vorrangiges Ziel. Hierbei kommt der Verwendung von leistungsfähigem Vermehrungsgut durch standortangepasste Herkünfte eine große Rolle zu. Immer wieder entstehen hohe wirtschaftliche Schäden durch biotische und abiotische Kalamitäten, die darin begründet sind, dass bei der Aufforstung ungeeignete Herkünfte angepflanzt wurden, die nicht an klimatische Bedingungen des Standortes angepasst sind, z. B. nach dem Orkan Wiebke 1990 (FRANKE 2001). Für den Wirtschaftsbetrieb ist daher die Auslese von anpassungsfähigem, gesundem und leistungsfähigem Material, dessen Qualität durch Herkunftsversuche belegt ist, unerlässlich (BUTTER 2001). Die Anlage von Samenplantagen mit ausgelesenen Phänotypen dient zum einen der Erhaltung der Arten und ihrer genetischen Vielfalt, zum anderen bildet sie die Basis für weitergehende Züchtung. Zusätzlich zu den Herkunftsversuchen werden sogenannte Einzelbaum- 3 Zielsetzung und theoretische Grundlagen nachkommenschaftsprüfungen durchgeführt. Sie erlauben sowohl eine grobe Einschätzung der geographischen Variation als auch eine Prüfung der Variation zwischen den Einzelbäumen und die Auswahl von Elitebäumen (KLEINSCHMIT et al. 2001). Von besonderem Interesse sind hierbei die wertvollen Laubbaumarten, zu denen z. B. die Esche aufgrund ihrer ökologischen Bedeutung und des wirtschaftlichen Interesses der Waldbesitzer gehört. 2.2.1 Vorteile der Gewebekultur für die Forstwirtschaft Da sich die genotypbedingten Wuchseigenschaften wie Gradschaftigkeit, Zwieselung und Wuchsleistung bei Nachkommen von frei abgeblühten Bäumen erst mit zunehmendem Alter einigermaßen sicher erfassen lassen, bietet vor allem die Gewebekultur die Möglichkeit, ausgewählte Elite-Bäume guter Qualität und Wüchsigkeit schnell und in hoher Stückzahl zu vermehren. Konventionelle Methoden wie die Anlage von Samenplantagen über die Veredelung durch Pfropfung hochwertiger Genotypen sind nur mit zeitlicher Verzögerung zur Gewinnung von Vermehrungsgut nutzbar. Die Vermehrung über makrovegetative Stecklinge ist einerseits in ihrer Stückzahl begrenzt und andererseits führt zunehmendes Alter der Mutterbäume zu einer Abnahme der Regenerations- und Bewurzelungsfähigkeit (BÄRTELS 1996). Verwendung können solche hochleistungsfähigen Klongemische in erster Linie auf ehemaligen landwirtschaftlichen Flächen finden aber natürlich auch auf Waldstandorten als Mischbaumart in Beständen anderer Baumarten. Hierbei ist zu betonen, dass aufgrund der nicht vorhersagbaren Nachfrage des Holzmarktes möglichst viele wertvolle Laubbaumarten neben der Erhaltung auch züchterisch bearbeitet werden sollten, um mit entsprechenden Pflanzenangeboten auf die jeweilige Marktnachfrage reagieren zu können. Vorlaufzeiten zwischen Beginn einer Klonprüfung sowie der Bereitstellung und Zulassung von geprüftem Material von mehr als 20 Jahren müssen dabei berücksichtigt werden.[KLEINSCHMIT et al. 2001] Ein weiterer großer Vorteil der genotypgleichen Vermehrung durch in vitro Kulturen ist, dass nur mit dieser Methode besondere genetisch bedingte Qualitätsmerkmale des Holzes, die oft erst mit dem Umtrieb sichtbar werden, erhalten werden und für die Forstpflanzenzüchtung genutzt werden können. Bei Esche ist ein solches Merkmal möglicherweise die Riegelung des Holzes, die den Holzwert erheblich steigert (SOPPA, persönliche Mitteilung). 4 Zielsetzung und theoretische Grundlagen 2.2.2 Langzeitlagerung von in Prüfung befindlichem Material Für den Zeitraum laufender Prüfungen muss das genetische Material der Mutterbäume sicher erhalten werden. Die Erhaltung von in vitro Kulturen über mehrere Jahrzehnte ist ohne Probleme möglich, erfordert aber einen hohen Arbeitsaufwand durch ständiges Rekultivieren und bietet die Gefahr von Verlusten durch Kontaminationen, unsachgemäßes Arbeiten oder technische Defekte. Die Lagerung von etablierten Kulturen mit Hilfe der Kryokonservierung, das Einfrieren von Gewebe, Organen oder Zellverbänden in flüssigem Stickstoff bei -196 °C, stellt dagegen eine kostengünstigere und sichere Möglichkeit dar, etablierte Klone über einen beliebig langen Zeitraum zu konservieren, und schafft die Grundlage zur Entwicklung von Klongenbänken (Benson 1999 a). In Deutschland wurden bis jetzt Kryogenbänke zur Erhaltung landwirtschaftlich nutzbarer Kulturpflanzen ange- legt. Führend hierbei sind das Institut für Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung in Gatersleben (IPK) mit einer Kryogenbank für Knoblauch und die Forschungsanstalt für Landwirtschaft in Braunschweig (FAL) mit einer existierenden Kryogenbank für Kartoffeln. Eine Vorreiterrolle bei der Kryokonservierung von Gehölzen in Deutschland hat die Niedersächsische Forstliche Versuchsanstalt in Escherode. Für Ulme (HARVENGT et al. 2004), Pyrus pyraster und Sorbus torminalis (NFV-C Tätigkeitsbericht 2001) konnten dort funktionierende Kryokonservierungsprotokolle entwickelt werden. 2.3 Die Gemeine Esche (Fraxinus excelsior L.) 2.3.1 Morphologie Morphologisch zeichnet sich die Esche durch ein monopodiales Sprosssystem aus, das ohne negative Umwelteinflüsse eine gerade, sich nicht gabelnde Stammachse mit einer Wuchshöhe von durchschnittlich 30 m bei einem Alter von 100 Jahren erreichen kann. Seitentriebe, die nicht mehr genügend Licht empfangen, sterben nach drei bis fünf Jahren ab und brechen durch mechanische Belastung ab. Die Länge des astfreien Stammabschnitts beträgt ca. 60 bis 70 % der Baumhöhe. Eine Besonderheit der Esche sind ihre dunklen, schwarz-braunen Knospen. Sie sind kurz pyramidenförmig, dicht filzig und mit schwarzen und gerbstoffhaltigen Becherhaaren versehen. Die dichte Haarschicht der Knospenschuppen dient dem Verdunstungsschutz (siehe Abbildung 1). 5 Zielsetzung und theoretische Grundlagen Abbildung 1: Apikal- und Achselknospen der Gemeinen Esche kurz vor dem Austreiben im Frühjahr. Die Achselknospen sind noch vollständig geschlossen, die Apikalknospe ist leicht ergrünt und fängt an, sich zu öffnen. Die Terminalknospe ist auffallend größer (ca. 1 cm) als die Seitenknospen (ca. 0,5 cm). Die Primärblätter der Esche sind ungeteilt, alle Laubblätter stehen kreuzweise gegenständig und sind 7 bis 15-zählig gefiedert. Die Blühfähigkeit der Esche tritt mit 15 bis 30 Jahren ein. Eschenblüten sind zwittrig, wobei aber auf einem Baum das eine oder andere Geschlecht mehr oder weniger reduziert sein kann bis hin zu rein männlichen oder weiblichen Blüten. Dieses gleichzeitige Vorkommen monozözischer und diözischer Individuen wird auch als triözisch bezeichnet. Die Früchte sind Flügelnüsse und befinden sich an dünnen Stielen in Rispen. Die Samen sind stark dormant. Die Keimhemmung ist z. T. dadurch bedingt, dass der Embryo zur Zeit der Fruchtreife noch nicht völlig entwickelt ist. Weiterhin fördert die im Endosperm lokalisierte Abscisinsäure zusätzlich den Ruhezustand. Aus diesem Grund muss vor der Anzucht von Sämlingen aus Saatgut zunächst die starke Keimhemmung überwunden werden. Dies geschieht durch ein mehrmonatiges Stratifizierungsverfahren, bei dem das Embryowachstum durch Temperaturen um 20 °C gefördert und danach durch Kühllagerung die Keimhemmung der Abscisinsäure überwunden wird. [ROLOFF und PIETZARKA 1997] 6 Zielsetzung und theoretische Grundlagen 2.3.2 Vorkommen und Bedeutung der Gemeinen Esche in Deutschland und Europa Die Gemeine Esche ist eine wuchskräftige, mitteleuropäische Baumart mit einem ausgedehnten Verbreitungsgebiet (siehe Abbildung 2). Die dargestellte Abbildung stammt aus dem im Internet veröffentlichten Projektbericht „Fraxigen“, einem weiteren europäischen Eschenprojekt (www.fraxigen.net). Abbildung 2: Natürliche Verbreitung von Fraxinus excelsior L. In der Veröffentlichung von MARIGO et al. (2000) wird besonders hervorgehoben, dass das Verbreitungsgebiet an den südlichen Grenzen nicht scharf abzugrenzen ist, da es dort immer häufiger zu einer Hybridisierung zwischen Fraxinus excelsior und der in Südeuropa beheimateten Art Fraxinus angustifolia kommt. Die Differenzierung von Fraxinus excselsior und Fraxinus angustifolia anhand von morphologischen Merkmalen ist in diesen Gebieten erschwert. Dies bestätigt auch die Arbeitsgruppe der UNIVERSITÉ PARIS-XI um Nathalie Frascaria-Lacoste (RAP-Projektbericht 2003) mit ihrem Forschungsprojekt. Die Arbeitsgruppe untersuchte die genetische Diversität und die Verteilung dieser beiden Arten mit Hilfe von Mikrosatelliten und morphologischen Merkmalen. Die Untersuchungen 7 Zielsetzung und theoretische Grundlagen fanden vor allem in den Regionen statt, wo beide Arten vorkommen, um so den Genfluss zu dokumentieren. Fraxinus excelsior besiedelt aufgrund der großen Amplitude hinsichtlich des Wasserhaushaltes sowohl Standorte mit zeitweiligem Trockenstress als auch Auenstandorte (ROLOFF und PIETZARKA 1997, MARIGO et al. 2000). In diesen Extrembereichen kann sich die Gemeine Esche gegen konkurrenzstärkere Schattenbaumarten wie z. B. die Buche behaupten, während sie in ihrem optimalen Bereich oft von diesen verdrängt wird. Ein Grund hierfür ist die Veränderung der Lichtansprüche der Esche im Laufe des Alters von einer schattentoleranten zu einer lichtbedürftigen Baumart (ROLOFF und PIETZARKA 1997). Die Esche zählt aufgrund ihrer Holzqualität zu den Edellaubbäumen des mitteleuropäischen Waldes. Neben dem Ahorn ist die Gemeine Esche zahlenmäßig die wichtigste Baumart in dieser Gruppe (KLEINSCHMIT und LÜCK 2001). Die Esche gehört zu den ringporigen Laubhölzern wodurch das Holzbild wesentlich beeinflusst wird. Splint und Kernholz sind meist gleichfarbig (siehe Abbildung 3), ein farbig abgesetztes, olivfarbenes Kernholz entsteht erst im Alter von 60 bis 70 Jahren und wird als Olivesche (siehe Abbildung 4) mit einem teilweise hohen Holzwert, abhängig von Nachfragetrends der Möbelindustrie, gehandelt. Abbildung 3: Gleichfarbiges Eschenholz (aus ARBEITSGEMEINSCHAFT HOLZ e.V.) Abbildung 4: Olivesche geriegelt (aus ARBEITSGEMEINSCHAFT HOLZ e.V.) 8 Zielsetzung und theoretische Grundlagen Bei den holztechnischen Eigenschaften weist Eschenholz hervorragende Merkmale wie eine besondere Zug-, Biege- und Schlagfestigkeit auf und wurde früher aus diesem Grund besonders in der Wagnerei und Tischlerei für Radreifen benutzt. Heute erfreut sich Eschenholz einer hohen Verwendungsbreite, die vom Furnier über Möbelholz, Parkettholz, Treppenbauholz bis hin zur Nutzung für Geräteteile mit besonders anspruchsvollen mechanischen Eigenschaften reicht. [ROLOFF 2001] Zur Zeit ist das Holz der Esche im Vergleich zu anderen Laubbaumarten auf Grund ihrer Häufigkeit und der geringen Nachfrage unterbewertet (KLEINSCHMIT und LÜCK 2001). Die Durchschnittspreise für Stammholz in Deutschland lagen im Jahr 2001 zwischen 111 und 180 Euro pro Festmeter (HOLZ-ZENTRALBLATT 2001) und 2004 zwischen 78 und 133 Euro (HOLZ-ZENTRALBLATT 2004). Stammholz besserer Qualität erzielte Preise bis zu 265 Euro pro Festmeter (HOLZ-ZENTRALBLATT 2004). Dies macht deutlich, dass nur über besondere Qualitäten des Eschenholzes ein erhöhter wirtschaftlicher Profit erzielt werden kann. In anderen europäischen Ländern wie z. B. in Irland ist die Esche eine der Hauptbaumarten bei der Wiederaufforstung von ehemals landwirtschaftlichen Flächen (Douglas, persönliche Mitteilung), oder ihr natürlicher Bestand ist so gering wie z. B. in Belgien, dass ihr Vorkommen durch Aufbau neuer Populationen gesichert werden muss (De Cuyper, persönliche Mitteilung). Dies zeigt, dass die Esche im gesamteuropäischen Kontext als eine wirtschaftlich bedeutende und erhaltungswürdige Baumart angesehen werden muss. 2.3.3 Konservierungsmaßnahmen und Versorgung mit Pflanzgut in Deutschland Vermehrungsgut der Esche ist in der Vergangenheit in großem Umfang aus anderen Ländern, vor allem Südosteuropa, nach Deutschland eingeführt worden (KLEINSCHMIT und LÜCK 2001). Seit 1979 unterliegt die Esche dem Gesetz über forstliches Saat- und Pflanzgut. In den verschiedenen Bundesländern wurden in der Vergangenheit Samenplantagen mit regionalen Vorkommen angelegt und interessante Einzelbäume in Klonarchiven zusammengefasst. Angesichts unregelmäßiger Fruktifikation und auf Grund der günstigen Kosten für die Saatguternte im Ausland wird Eschensaatgut auch in Zukunft über größere Distanzen verbracht werden (KLEINSCHMIT und LÜCK 2001). Dies unterstreicht den Aufklärungsbedarf zu Risiken und Chancen beim Anbau 9 Zielsetzung und theoretische Grundlagen unterschiedlicher Herkünfte sowie den Forschungsbedarf zur Anbaueignung sowohl deutscher als auch nicht heimischer Herkünfte. Um breite Informationen über die geographische Variation der Esche zu gewinnen, wurde 1985 ein europäischer Eschenherkunftsversuch mit 250 Einzelbaumnachkommenschaften aus 52 europäischen Herkünften angelegt (KLEINSCHMIT et al. 1996). Eine Verbesserung der Qualität kann zusätzlich durch in vitro Vermehrung ausgewählter Einzelbäume und anschließender Klonprüfungen erreicht werden. Besonders das Angebot von leistungsstarken Klongemischen ist bei Waldbesitzern von großem anbaulichen Interesse, wie die Entwicklung z. B. bei Wildkirsche (MEIER-DINKEL 2003) zeigt. 2.4 Das europäische Eschenprojekt RAP Die europaweite Bedeutung der Esche wird durch das 2001 gestartete EU-Projekt mit dem Akronym RAP unterstrichen. Die Langform des Projekttitels lautet „Improving Fraxinus (Ash) productivity for European needs by testing, selection, propagation and promotion of improved genetic resources“ (Verbesserung der Produktivität von Fraxinus excelsior (Esche) für europäische Bedürfnisse durch Prüfung, Selektion, Vermehrung und Förderung verbesserter genetischer Resssourcen). Die NFV-C war ein Partner dieses am 01.02.2001 angelaufenen europäischen Eschenprojektes. Die Laufzeit betrug 48 Monate mit einem Fördervolumen von insgesamt 2.000.874 Euro. Im Rahmen des Forschungsprojektes sollten in Zusammenarbeit mit 15 Projektpartnern aus zehn EU-Ländern verschiedene Aspekte zur Verbesserung der Produktivität der Baumart Esche für europäische Bedürfnisse untersucht und weiterentwickelt werden. Entsprechend seiner Hauptziele war das Projekt in drei Arbeitsschwerpunkte eingeteilt: I. Bestimmung der genetischen Diversität und Struktur von Populationen der Esche mit Hilfe konventioneller und molekularer Mittel. II. Entwicklung und Bereitstellung von Verfahren der vegetativen Vermehrung und Blühinduktion zur praktischen Nutzung von selektiertem knappen Ausgangsmaterial. III. Übermittlung der Fortschritte und Ergebnisse an alle potentiellen Endverbraucher, um eine effektive Nutzung des Holzes und Weiterentwicklung des genetischen Potentials der Esche zu gewährleisten. 10 Zielsetzung und theoretische Grundlagen Die in dieser Arbeit vorgestellten Untersuchungen zur in vitro Kultivierung und Kryokonservierung von Fraxinus excelsior waren Hauptbestandteil des zweiten Arbeitsschwerpunkts mit folgenden Zielen: • Entwicklung eines in vitro Vermehrungsprotokolls für Esche und dessen Übertragung in die kommerzielle Anwendung. • Anlage von Klonprüfungen mit den selektierten in vitro vermehrten Genotypen. • Entwicklung von Kryokonservierungsverfahren zur Langzeitlagerung genetischer Ressourcen der Esche. Ausgangspunkt für die wissenschaftliche Arbeit war die Auswertung des 1985 angelegten europäischen Eschenherkunftsversuchs auf zwei Versuchsflächen und die Auswahl von je 31 hervorragenden Einzelbäumen zur vegetativen Vermehrung. 2.5 Gewebekultur 2.5.1 In vitro Kultur von Gehölzen Während die Gewebekultur im Bereich der Kultur- und Zierpflanzenforschung nicht mehr wegzudenken ist, entwickelt sich erst seit den 80er Jahren das Interesse an der Mikro- vermehrung von Gehölzen (JESCH und PLIETZSCH 1996). Für die Forstpflanzenzüchtung ist die Entwicklung von Verfahren zur erbgleichen Vermehrung ausgewählter adulter Bäume mit guten Wuchseigenschaften in Bezug auf Gesundheit, Leistung und Form von Bedeu- tung (KLEINSCHMIT et al. 2001). In vitro Kulturen von Gehölzen bieten über die Achselsprossmethode die Möglichkeit der schnellen und effektiven klonalen Vermehrung mit einem geringen Risiko somaklonaler Veränderungen. Als Explantatquelle werden meristematische Pflanzenteile, meist austreibende Sprossspitzen oder Terminal- und Achselkospen des Mutterbaumes, benutzt. Die Regeneration neuer Triebe wird mit Hilfe von Phytohormonen erreicht. Im Gegensatz zu der Vermehrung von krautigen Pflanzen spielt bei den Gehölzen die ontogenetische Alterung eine große Rolle. Mit zunehmendem Alter der Mutterpflanze sinkt die Regenerationsfähigkeit der Explantate der zu etablierenden Pflanzen (AHUJA 1993). Eine Möglichkeit, adulte Gehölze in Kultur zu nehmen, ist die Durchführung von reaktivierenden Behandlungen wie beispielsweise das Pfropfen auf Sämlingsunterlagen. 11 Zielsetzung und theoretische Grundlagen Weiterhin ist bekannt, dass durch die in vitro Vermehrung selbst ein rejuvenilisierender Effekt adulter Pflanzen stattfindet. Der Grad der Juvenilisierung ist hierbei abhängig von der Anzahl der in vitro Subkulturen und manifestiert sich in einer ansteigenden Vermehrungs- und Bewurzelungsfähigkeit (MEIER-DINKEL 1989, 1993). 2.5.2 Vermehrungsverfahren der Achselsprossmethode Das Verfahren der in vitro Vermehrung kann grob in vier nacheinander folgende Etappen eingeteilt werden: 1. Etablierungsphase in vitro 2. Vermehrungsphase in vitro 3. Bewurzelungsphase in vitro 4. Überführung in unsterile Bedingungen und Anpassung an Freilandbedingungen 2.5.2.1 Etablierungsphase in vitro Der erste Schritt der in vitro Vermehrung ist die Etablierung einer sterilen Kultur. Bei der Mikrovermehrung ausgewählter Genotypen ist dieser Schritt in seiner Wiederholbarkeit begrenzt, da als Explantatquelle nur eine Mutterpflanze oder eine limitierte Anzahl an Pfropflingen zur Verfügung steht. Allgemein ist der Etablierungserfolg abhängig von dem gewählten Explantat, der Jahreszeit, der Methode der Oberflächensterilisation, dem physiologischen und ontogenetischen Zustand der Mutterpflanze sowie dem Genotyp. Häufig benutzte Sterilisationsmittel sind Natriumhypochlorit (NaOCl), Calciumhypochlorit (Ca(OCl)2) oder Quecksilberchlorid (HgCl2) unterschiedlicher Konzentration und Einwirkdauer. Der Sterilisationseffekt kann zusätzlich durch Applikation von Wasserbädern, gründlichem Waschen der Explantate unter fließendem Wasser, geringe Explantatgrößen sowie durch die Entfernung von Knospenschuppen oder Haaren unterstützt werden. Optimierte Oberflächensterilisationsverfahren werden je nach Explantatquelle und Baumart empirisch ermittelt und beruhen meist auf Erfahrungswerten und längeren Beobachtungen (JESCH und PLIETZSCH 1996). Ein großes Problem bei langlebigen Gehölzen sind nichtpathogene endogene Mikroorganismen, die häufig erst nach einigen Subkulturen nachweisbar sind. Eine starke Vermehrung der Endophyten während der in vitro Kultur führt oft zur Wuchsdepression, 12 Zielsetzung und theoretische Grundlagen völligem Absterben der Sprosse oder Schwierigkeiten bei der Bewurzelung. Gegenmaß- nahmen wie Behandlungen mit Antibiotika oder Subkultivierung von Meristemkulturen sind meist nicht oder nur in Einzelfällen erfolgreich (MEIER-DINKEL 1989). 2.5.2.2 Vermehrungsphase in vitro Während der Vermehrungsphase werden Sprossbüschel in etwa einmonatigen Zyklen in Einzelsprosse oder Sprosssegmente zerteilt und zur Vermehrung auf frischem Nährmedium subkultiviert. Der Erfolg der Mikrovermehrung ist abhängig von den herrschenden Kulturbedingungen wie Lichtintensität, Lichtdauer und Temperatur sowie der Zusammensetzung der Nährmedien, ihrer Phytohormonkonzentrationen und den verwendeten Kulturgefäßen. Insbesondere der Verschluss von Kulturgefäßen reguliert die Belüftung innerhalb des Gefäßes. Gasförmige Stoffwechselprodukte wie z. B. CO2 können positive Effekte auf das Wachstums haben, dagegen kann eine zu hohe Luftfeuchtigkeit zur Hyperhydrizität und Deformation der Sprosse führen (MEIER-DINKEL 1989). Vor allem aber ist der Erfolg der Mikrovermehrung von der Art und dem Genotyp abhängig (JESCH und PLIETZSCH 1996). 2.5.2.3 Bewurzelungsphase in vitro Die dritte Phase, die Bewurzelungsphase, weist in der Literatur verschiedene Varianten auf. Vorwiegend wird die Bewurzelung von Gehölzmikrostecklingen in vitro auf einem auxinhaltigen Bewurzelungsmedium oder durch Kultur von wenigen Tagen auf einem Wurzelinduktionsmedium und anschließendem Stecken der unbewurzelten Mikrosteck- linge ex vitro durchgeführt (MEIER-DINKEL 1989). Weiterhin wird in der Literatur der Wechsel zwischen einem auxinhaltigen Medium und einem hormonfreien Kohlemedium beschrieben (SANCHEZ et al. 1996) oder eine einmalige Auxinapplikation durch Inkubation für wenige Sekunden oder Minuten mit einer hohen Dosis (KIM et al. 1998). In weiteren Veröffentlichungen wird die grundsätzliche Effektivität einer exogenen Auxinbehandlung diskutiert (HAUSMAN 2002, TONON et al. 2001). 2.5.2.4 Überführung in unsterile Bedingungen und Anpassung an Freiland- bedingungen Der Transfer bewurzelter oder unbewurzelter in vitro Sprosse aus dem Kulturraum in eine unsterile Umgebung bedeutet einen gravierenden Umweltwechsel für die Pflanze. Die 13 Zielsetzung und theoretische Grundlagen bisherige heterotrophe bzw. mixotrophe Ernährungsweise der Pflanze muss in eine autotrophe Ernährung umgestellt werden. Unter in vitro Bedingungen sind die Blätter der Sprosse nicht voll arbeitsfähig ausgebildet. Mesophyll und Palisadengewebe sind nicht ausreichend entwickelt, die Kutikula nur teilweise oder gar nicht vorhanden und die Spaltöffnungen nur eingeschränkt funktionsfähig. Um einen hohen Wasserverlust der Pflanzen zu vermeiden, wird in den ersten drei bis vier Wochen nach dem Pikieren der Luftfeuchtigkeitsgehalt unter einem Plastiktunnel sehr hoch gehalten und dann schrittweise reduziert. Nach ca. vier Wochen werden die sich entwickelnden Pflanzen in Anzuchtgefäße getopft und unter normalen Gewächshausbedingungen gehalten. [JESCH und PLIETZSCH 1996] 2.5.3 Nährmedien Die Zusammensetzung der Nährmedien für die Etablierung, Vermehrung und Bewurzelung ist für den Erfolg der Mikrovermehrung von entscheidender Bedeutung. Das verwendete Medium steht immer in Interaktion mit dem physiologischen Zustand des in vitro Materials und zusätzlich in Interaktion mit den Kulturbedingungen wie Lichtintensität, Lichtdauer, Temperatur, Agargehalt und pH-Wert. In der Praxis werden Nährmedien für neu zu etablierende Pflanzen meist durch Versuchsreihen mit schon bekannten Nährmedien durchgeführt. MS-Medium (MURASHIGE und SKOOG 1962) ist das bekannteste Nährmedium. Ausgehend von diesem Medium wurden für bestimmte Gehölze neue Medien mit geändertem Gehalt an Makro- und Mikronährstoffen und verändertem Vitamingehalt entwickelt (BONGA und VON ADERKAS 1992). In Tabelle 1 sind die für die Gehölzvermehrung bekanntesten Nährmedien dargestellt. 14 Zielsetzung und theoretische Grundlagen Tabelle 1: Häufig angewendete Nährmedien bei der in vitro Vermehrung von Gehölzen (aus BONGA und VON ADERKAS 1992) Medium Nährstoffe Vitamine Ionen-Konzentration Makro Mikro mM Murashige & Skoog (MS) MS MS MS 95,8 Lloyd & McCown1 (WPM) WPM WPM WPM 44,0 Gamborg et al.2 (B5) B5 B5 B5 61,9 Gresshoff & Doy3 (GD) B5 GD B5 61,9 1Llyod & McCown B. (1980), 2Gambourg et al. (1968), 3Gresshoff and Doy (1972) 2.5.4 Phytohormone Unter Phytohormonen versteht man bestimmte Molekülklassen oder Effektoren, deren Ausbreitung im Gewebe von Zelle zu Zelle, über Leitbündel oder über den interzellularen Gasraum erfolgt. Phytohormone werden in bestimmten Geweben der Pflanze gebildet und von dort zu ihren Wirkorten transportiert, oder aber Bildungsort und Wirkungsort sind identisch. Ein komplexes Zusammenspiel verschiedener Hormone beeinflusst die Wachstums- und Entwicklungsvorgänge teils antagonistisch teils synergistisch. In den letzten Jahren konnten durch die Entschlüsselung des Arabidopsis-Genoms entscheidende Fortschritte über die Wirkweise von Phytohormonen erzielt werden. Die Entschlüsselung der Gene und die Möglichkeit der Herstellung von Knock-out Mutanten oder transgenen Pflanzen mit erhöhter endogener Hormonproduktion (HOWELL et al. 2003, SCHMÜLLING 2002) lieferten die Möglichkeit der Erforschung der Wirkweise von Phytohormonen und ihrer Signaltransduktionswege. Die Wirkung von Phytohormonen unter in vitro Kultur lässt sich nicht vollständig mit denen von intakten Pflanzen vergleichen, da es hier meist nicht das Ziel ist, physiologische Bedingungen zu erhalten und zu simulieren, sondern optimierte und zielgerichtete Effekte zu erhalten (HOWELL et al. 2003). Für das Verständnis der Wirkweise sind aber die gewonnenen Grundlagenkenntnisse unerlässlich. Die Wirkung von Phytohormonen bei in vitro Kulturen ist daher nie allein zu betrachten, sondern immer im Zusammenspiel zwischen endogen produzierten und exogen zugeführten Hormonen. Der Erfolg der Mikrovermehrung hängt neben den richtigen Hormonkonzentrationen und -kombinationen von optimierten, für die Pflanze stressfreien Wachstumsbedingungen ab (BONGA und VON 15 Zielsetzung und theoretische Grundlagen ADERKAS 1992). Die am häufigsten zugesetzten Phytohormone sind Auxine und Cytokinine. 2.5.4.1 Cytokinine Unter Cytokininen werden Substanzen zusammengefasst, die in einem Biotestsystem (Tabakmarkzylinder) Zellteilungen (Cytokinesen) auslösen können (KUTSCHERA 1995). Sie sind zudem an zahlreichen biologischen Prozessen des Pflanzenwachstums sowie der -entwicklung beteiligt und werden hauptsächlich in den Wurzeln produziert. Zu einem geringen Anteil erfolgt die Produktion auch in dem Spross (SHIMIZU-SATO und MORI 2001). Cytokinine spielen sowohl bei der Kontrolle der Zellteilung, dem Brechen der Samenruhe, der Kontrolle der Knospenentwicklung und der Differenzierung sowie der Sprossbildung und -initiierung eine Rolle. In der Veröffentlichung von ROITSCH und EHNEß (2000) wurde weiterhin nachgewiesen, dass Cytokinine die Produktion von extrazellulärer Invertase und von Hexose-Transportern induzieren und somit eine Rolle im Kohlenhydrattransport spielen. Seit der Entdeckung des ersten Cytokininrezeptors im Jahr 2000 (SCHMÜLLING 2002) und der Entdeckung von neun Cytokininsynthese-Genen in Arabidopsis 2001 (HOWELL et al. 2003) sind die Voraussetzungen geschaffen worden, die Signaltransduktionswege, die eine Sprossentwicklung bewirken, näher bestimmen zu können. Dies ist gerade für die Bereitstellung effektiver in vitro Kulturmethoden eine Voraussetzung. Bis heute beruhen die Angaben über benötigte Hormonkonzentrationen auf empirischen Beobachtungen, können aber nicht verifiziert und physiologisch erklärt werden. 2002 wurde von der Arbeitsgruppe CHE et al. die Genexpression während der Sprossent- wicklung von Arabidopsis analysiert. Die Bildung von Sprossen aus Wurzelexplantaten wurde über eine Präinkubation in auxinreichem Kallusinduktionsmedium (CIM) mit folgender Überführung in cytokininreiches Sprossinduktionsmedium (SIM) erreicht. Durch diese Arbeit konnten Aufschlüsse über bestimmte Schlüsselprozesse in der Genexpression während der in vitro Sprossentwicklung gewonnen werden. 2 % der analysierten Gene (insgesamt ca. 8000) von Arabidopsis wurden während der verschiedenen Entwicklungs- stadien bis um das Vierfache hochreguliert. Es zeigte sich, dass bestimmte „hormone response“ Gene wie z. B. Aux / IAA während der CIM-Phase hochreguliert wurden. Gene, die Signalisations- oder Transkriptionkomponenten codieren wurden während oder vor der 16 Zielsetzung und theoretische Grundlagen „shoot commitment phase“ (Phase an der die Wurzelexplantate anfangen Sprosse zu bilden, wenn sie auf hormonfreies Medium gesetzt werden) hochreguliert und Gene, die für Komponenten des Photosyntheseapparates codieren, erst wesentlich später. Weiterhin war erstaunlich, dass mit fortschreitender Entwicklung nicht entsprechend mehr Gene hochreguliert wurden. Nach drei Tagen waren 141 Gene hochreguliert, nach 15 Tagen nur die doppelte Anzahl. In der anschließenden Veröffentlichung von HOWELL et al. 2003 wurde der Cytokinin-Signaltransduktionsweg untersucht und es wurde ein hypothetisches Schema zwischen den Cytokininsignalen und verschiedenen Genaktivierungsmustern je nach Entwicklungsstadien aufgestellt. Die hier aufgezeigten Veröffentlichungen sollen den enormen Fortschritt im Verständnis über die Wirkung von exogen appliziertem Cytokinin auf die Sprossentwicklung demonstrieren. Sie zeigen aber auch die Komplexität, die die Hormonregulation der Sprossentwicklung aufweist. Diese grundlegenden Erkenntnisse können in Zukunft sicherlich dazu beitragen, Strategien zur Regeneration von recalcitranten Pflanzen und zur Optimierung von in vitro Kulturen zu entwickeln. Es wird aber auch deutlich, dass die aufgezeigten Ergebnisse im Moment noch nicht für die Praxis relevant sind und ihre Allgemeingültigkeit für andere Pflanzenarten erst überprüft werden muss. In der Mikrovermehrung von Gehölzen besteht die Hauptaufgabe der Cytokinine in der Unterdrückung der Apikaldominaz und in der Förderung der Achselsprossbildung. In zu hohen Konzentrationen bewirken Cytokinine oft Adventivsprossbildung, die aufgrund der Entwicklung somaklonaler Variationen nicht erwünscht ist (BONGA und VON ADERKAS 1992). Häufig verwendete Cytokinine sind 6-Benzylaminopurin (BAP), Kinetin, 2-Isopentenyladenin (2-iP) und Zeatin. BAP ist das aktivste, autoklavierbare und preisgünstigste Cytokinin und von daher für den kommerziellen Bedarf von großem Interesse. 2.5.4.2 Auxine Auxine werden hauptsächlich in Laubblättern, Embryonen und Meristemen synthetisiert und sind die Ursache der Apikaldominanz. Hierunter versteht man die Unterdrückung des Austriebs der Seitenknospen einer Sprossachse durch das Apikalmeristem. Wird diese durch Dekapitation entfernt, treibt die nächstniedere Achselknospe aus. Der Transport in der Sprossachse erfolgt polar vom Sprossmeristem zur Wurzel (NULTSCH 1991). Während 17 Zielsetzung und theoretische Grundlagen Auxine den Austrieb axillärer Sprosse hemmen, fördern Cytokinine diesen. Die Steuerung des Austriebes hängt von dem Verhältnis der beiden Hormone zueinander ab und nicht von der absoluten Konzentration (SHIMIZU-SATO und MORI 2001). In der Arbeit von SHIMIZU-SATO und MORI (2001) wird ein Modell vorgestellt, dass den Kontrollmechanismus der Apikaldominanz im Zusammenspiel der beiden Hormone Cytokinin und Auxin erklärt. Es wird vermutet, dass bei dekapierten Sprossen Cytokinine in den Internodien der Sprossachse synthetisiert werden, da die Hemmung durch Auxin wegfällt. Von dort wird das Cytokinin in die Knospe transportiert und bewirkt ein Austreiben der Achselknospen. Bei intaktem Spross unterdrückt Auxin die Cytokininsynthese. Weiter konnten die Transkripte von Genen aus ruhenden Knospen isoliert werden, die homolog zu ABA (Abscissic acid, Abscisinsäure) induzierten Transkripten waren. Zusätzlich ließ sich eine hohe ABA-Konzentration in den Knospen nachweisen. Dadurch wurde die Vermutung unterstützt, dass ABA die Knospenruhe in den Knospen erhält oder beeinflusst und nicht Auxin. Obwohl das vorgestellte Modell spekulativ ist, zeigt es die gegenseitige Beeinflussung der Hormone. Auxin ist neben der Apikaldominanz auch maßgeblich an der Wurzelbildung beteiligt. In der Arbeit von KERK et al. (2000) wird das Zusammenspiel von Auxin und Ascorbinsäureoxidase (AAO) betrachtet, deren Interaktion besonders in vitro eine Rolle spielt. AAO kann Auxin oxidativ dekarboxylieren und zu einem verminderten Auxineffekt führen. In der Arbeit wird gezeigt, dass die Interaktion zwischen Auxin und AAO die Wurzelentwicklung durch Regulierung der mitotisch inaktiven Zellen im Wurzelmeristem beeinflusst. Das am häufigsten verwandte Auxin in der Mikrovermehrung von Pflanzen ist IBA (Indole-3-butyric acid, Indole-3-Buttersäure). Im Gegensatz zu dem natürlich vorkommen- den sehr instabilen IAA (Indoleacetic acid, Indol-3-Essigsäure) ist IBA wesentlich unempfindlicher gegenüber Lichteinwirkung und hohen Temperaturen beim Autoklavieren. 2.5.4.3 Einsatz von Cytokininen und Auxinen in der in vitro Kultur Die Wirksamkeit der Pflanzenhormone und besonders das Zusammenspiel wie auch die Balance von Cytokinin und Auxin ist für den Erfolg der Sprossentwicklung oder 18 Zielsetzung und theoretische Grundlagen Wurzelbildung seit langem bekannt. Durch Variation der Konzentrationen von Auxin und Cytokinin ist es möglich, Wurzel oder Sprossbildung zu induzieren (KUTSCHERA 1995). In der in vitro Kultur von Pflanzen wird zur Optimierung der Vermehrungsphase je nach Pflanzenart ein bestimmtes Cytokinin / Auxin-Verhältnis im Medium empirisch ermittelt, bei dem der Auxingehalt sehr gering ist (KYTE und KLEYN 1996). In einigen Arten reicht zudem das endogen produzierte Auxin zur Sprossbildung aus und zusätzlich zugeführtes Auxin kann einen hemmenden Effekt auf die Sprossentwicklung haben (BONGA und VON ADERKAS 1992). Weiterhin kann ein zu hoher Auxingehalt zu starker Kallusbildung und Sprossanomalitäten führen. 2.5.4.4 Thidiazuron (TDZ) TDZ ist ein hochpotentes Cytokinin-Analogon, das vor allem in der in vitro Vermehrung von recalcitranten Gehölzen eingesetzt wird. Es ist ein im Gegensatz zu den Aminopurin- Cytokininen, wie BAP, ein Derivat des Diphenylharnstoffs und beeinflusst vor allem den Metabolismus endogener Cytokinine. Ein Vorteil des Einsatzes von TDZ ist die Unterdrückung des starken monopodialen Wachstums von Gehölzen und somit der Förderung von Achselsprossbildung (HUETTEMAN und PREECE 1993). Gleichzeitig kann die Applikation von TDZ starke Kallus- und Adventivsprossbildung bewirken und stellt somit eine potentielle Gefahr für die Induktion somaklonaler Veränderungen dar. In der Arbeit von ROITSCH und EHNEß (2000) wird beschrieben wie Cytokinine eine wesentliche Rolle bei der apoplastischen Verteilung von Saccharose in der Pflanze spielen. Exogen zugeführte natürliche Cytokinine wie Zeatin führten zu einem Anstieg an mRNA für extrazelluläre Invertase, dem Schlüsselenzym für den apoplastischen Entladungs- mechanismus. Weiter wird gezeigt, dass TDZ im Gegensatz zu synthetisch hergestellten Adeninderivaten wie BAP und Kinetin einen signifikant höheren Anstieg dieses Schlüsselenzyms bewirkt. 2.5.5 In vitro Vermehrung von Fraxinus excelsior L. Die erfolgreiche in vitro Vermehrung juveniler und adulter Sprossspitzen zweier nicht in Deutschland vorkommender Eschenarten (F. pennsylvanica und F. americana) wurde erstmals von PREECE et al. 1987 beschrieben. Seitdem wurden verschiedene Protokolle (ARRILLAGA et al. 1992, KIM et al. 1997, PEREZ-PARRON et al. 1994, PREECE et al. 1995) 19 Zielsetzung und theoretische Grundlagen zur Vermehrung von juvenilem und adultem Material unterschiedlicher Eschenarten (F. ornus, F. pennsylvanica, F. angustifolia und F. americana) entwickelt. Veröffentlichungen über die Mikrovermehrung von Fraxinus excelsior beziehen sich dagegen meist auf in vitro Kulturen, die als Ausgangspunkt für die Etablierung Embryokulturen aus Saatgut nutzen (CHALUPA 1990, HAMMATT und RIDOUT 1992, RAQUIN et al. 2002, TABRETT und HAMMATT 1992) oder juvenile drei bzw. vier bis sieben Jahre alte Mutterbäume (LEFORESTIER et al. 1990, SILVEIRA et al. 1994). In der Veröffent- lichung von HAMMATT (1994) wird erstmals die erfolgreiche in vitro Etablierung eines 70 Jahre alten adulten Baumes der Gemeinen Esche dargestellt. Die Weiterführung der Versuche sowie die Etablierung eines zweiten adulten selektierten Plusbaumes wird in der Veröffentlichung 1996 (HAMMATT 1996) beschrieben. Die Arbeitsgruppe von PIERIK und SPRENKELS arbeitete ebenfalls von 1990 bis 1994 erfolgreich an der Etablierung eines 30 Jahre alten Baumes (PIERIK und SPRENKELS 1997). Beide Arbeitsgruppen beschreiben eine schlechte Regeneration der Primärexplantate, sehr hohe Kontaminationen am Anfang sowie während der Etablierung und geringe Bewurzelungserfolge. Es ist herauszustellen, dass sich alle ermittelten Ergebnisse der beiden Arbeitsgruppen auf jeweils nur einen bzw. zwei verschiedene Genotypen beziehen. Die genannten Veröffentlichungen können somit nur als Anstoß für die hier vorliegende Arbeit gesehen werden, deren Ziel es ist, ein bis jetzt in der Literatur noch nicht existierendes in vitro Protokoll für eine Vielzahl von Genotypen der Baumart Fraxinus excelsior zu entwickeln. Nur so kann das Ziel der Wertsteigerung von Fraxinus excelsior durch die Selektion von Elitebäumen, deren Vermehrung im kommerziellen Maßstab und die Anlage von Klonprüfungen zur Qualitätssicherung erreicht werden. Im Anhang 1 sind alle mir bekannten Arbeiten zur Gattung Fraxinus dargestellt. 2.5.6 Strategie zur Entwicklung eines in vitro Protokolls für Fraxinus excelsior L. Bei der Entwicklung des vorliegenden Protokolls wurden folgende Faktoren berücksichtigt und empirisch untersucht: 1. Ausgangsmaterial (Mutterbäume oder Pfropflinge der ausgewählten Genotypen) 2. Physiologischer Zustand der Explantatquelle (Winterknospen und frische Triebe) 20 Zielsetzung und theoretische Grundlagen 3. Oberflächensterilisation (Vorbehandlung, Sterilisationsmittel, Konzentration und Dauer) 4. Etablierungs-, Vermehrungs- und Bewurzelungsmedium (Basismedium, Hormon- konzentrationen und Agargehalt) 5. Kulturbedingungen (Gefäße, Temperatur und Lichtdauer) 2.6 Kryokonservierung Unter Kryokonservierung (engl.: cryopreservation) versteht man die Lagerung von Organen, Zellen und Zellverbänden in flüssigem Stickstoff bei -196 °C. Bei dieser Temperatur kommt es zum Stillstand aller Stoffwechselprozesse, so dass über Jahre und Jahrzehnte hinweg der zum Einlagerungstag vorherrschende physiologische Zustand des pflanzlichen Materials erhalten bleibt (SAKAI 1995). Dies ist der bedeutende Vorteil der Kryokonservierung gegenüber personal- und kostenaufwendigen traditionellen Erhaltungsmethoden wie der Langzeitlagerung von in vitro Kulturen in Kühlräumen bei 4 °C oder ex situ in Klonarchiven als Pfropflinge oder Stecklinge. Die Erhaltung von pflanzlichem Material über Kryogenbänke stellt somit eine kostengünstige und sichere Alternative der Langzeitlagerung dar (BENSON 1999 a). Vor allem die Gefahr von Verlusten durch Kontaminationen der in vitro Kulturen durch Kühlraumlagerung oder umweltbedingten Schädigungen bei Pfropflings- oder Stecklingsklonarchiven wird vermieden. 2.6.1 Theoretische Grundlagen der Kryokonservierung Die zentrale Rolle in der Kryobiologie nimmt Wasser ein. Unter alltäglichen Bedingungen gefriert Wasser in Anwesenheit eines Gefrierkeimes bei 0 °C. Je kleiner dieser Keim ist, desto tiefer kann Wasser, bis zu einer Temperatur von -40 °C, unterkühlt werden. Unterhalb dieser Temperatur kommt es zur selbstinduzierten homogenen Eisbildung. Dabei entstehen Eiskristalle auch ohne die Anwesenheit von Kristallisationskeimen. Intrazelluläre Eisbildung und der Zelltod sind dabei unvermeidlich. Arten, die unter natürlichen Bedingungen Temperaturen von -40 °C aushalten, erreichen dies durch ihre Adaptionsfähigkeit an eine langsame Dehydrierung (LINCOLN und ZEIGER 1999), deren Potential, starke Volumenänderungen zu tolerieren und durch ihre Fähigkeit, natürliche Gefrierschutzproteine, die z. B. die mechanische Belastbarkeit der Zellmembranen verbessern, zu bilden (MERYMAN und WILIAMS 1985). Durch diese Faktoren wird eine 21 Zielsetzung und theoretische Grundlagen Eiskristallbildung innerhalb der Zellen verhindert, stattdessen kommt es zur Vitrifikation vorhandener Zellflüssigkeiten. Beispiele hierfür sind einige Harthölzer oder Insekten aus Extremgebieten wie z. B. Alaska (MERYMAN und WILIAMS 1985). Die Verhinderung von intrazellulärer Eisbildung bei Temperaturen von -40 °C geschieht dann, wenn die vorhandene Zellflüssigkeit zu viskos ist, um Eiskristalle zu bilden. Hierbei kommt es zu einem direkten Übergang der Wassermoleküle von der flüssigen Form in eine amorphe Glasform (BENSON 1999 a, HOEKSTRA et al. 2001). Die Viskosität der Zellflüssigkeiten wird durch die Konzentration gelöster Stoffe und den Wassergehalt bestimmt. Im Gegensatz zur Eisbildung, bei der es zu einer Volumenänderung aufgrund des Phasenübergangs von flüssig zu fest und zur Bildung von Kristallen kommt, bleibt bei der Glasbildung das Volumen erhalten. Ausschlaggebend für eine Glastransformation ist die Temperatur Tg (Glastransformationstemperatur). In der Kryokonservierung ist eine Lösung unterhalb der Temperatur Tg zu viskos, um Eiskristalle zu bilden. Der entstehende Glaszustand ist metastabil, eine Erhöhung der Temperatur kann zur Rekristallisation führen (MERYMAN und WILIAMS 1985). Eine Glastransformation des Cytoplasmas bei pflanzlichen Organismen kann aufgrund einer Dehydration der Zellen stattfinden. Ursachen hierfür können ein Absenken der Temperatur, Trockenheit oder osmotische Extremsituationen sein (HOEKSTRA et al. 2001). 2.6.1.1 Gefrierprozesse in pflanzlichen Systemen Die Möglichkeit der Glasbildung bei sehr kalten Temperaturen ist für den Einsatz der Kryokonservierung zur Erhaltung pflanzlichen Gewebes entscheidend, da in biologischen Systemen Gefrierprozesse immer sehr langsam und in Anwesenheit von gelösten Stoffen stattfinden (BENSON 1999 a). Unter natürlichen Bedingungen findet Eisbildung zuerst im Extrazellularraum der Pflanze statt und ist für pflanzliche Zellen nicht tödlich. Bei länger andauerndem Frost kommt es zur Dehydration der Protoplasten durch Abgabe von Wasserdampf durch die Plasmamembran nach außen. Dies bewirkt ein weiteres Wachsen der Eiskristalle im Extrazellularraum und eine Erhöhung des Wasserpotentialdefizits zwischen Intra- und Extrazellularraum. Durch diese Zelldehydration kommt es zusätzlich zu einer Erhöhung der Konzentration löslicher Teilchen im Cytoplasma und somit zu einer weiteren Absenkung des Gefrierpunkts im Zellinneren (LINCOLN und ZEIGER 1999). Pflanzen 22 Zielsetzung und theoretische Grundlagen können auf diese Weise, durch die Anhäufung endogener Kryoprotektantien und die dadurch mögliche Unterkühlung ihrer Zellflüssigkeit bis weit unter den Gefrierpunkt, Frostschäden vermeiden (STUSHNOFF et al. 1998). Die Pflanzenzellen tolerieren einen Wasserverlust von 55 bis 75 % unter natürlichen Bedingungen, bevor es zur Plasmolyse der Zellen und Schädigung der Membranen durch zu hohe Konzentrationen der gelösten Stoffe innerhalb der Zelle kommt (MERYMAN und WILIAMS 1985). 2.6.2 Kryokonservierungsverfahren Durch die Untersuchungen der natürlichen Frosttoleranz von Pflanzen (WEISER 1970, WITHERS und KING 1979) sowie der ablaufenden physikalischen und physiologischen Effekte innerhalb des Protoplasten, an den Zellmembranen und im Extrazellularraum (MERYMAN und WILIAMS 1985, SINGH und MILLER 1985) und der Bereitstellung geeigneter Kryoprotektantien wie Dimethylsulphoxid (DMSO), Glycerol und verschiedener Zucker (BERNARD et al. 1985, RUDOLPH und CROWE 1985, TURNER et al. 2001a, b) wurden bis heute verschiedene Verfahren der Kryokonservierung entwickelt. Die bisher am häufigsten angewandte Methode ist die des langsamen Einfrierens (ca. 1 °C / min) basierend auf den Arbeiten von WITHERS (1979). In den neunziger Jahren wurden zusätzlich zu diesem bisher vorherrschenden teuren und meist computergesteuerten Verfahren zwei neue Protokolle, beruhend auf der Vitrifikation vorhandener Zellflüssigkeit während der Überführung in flüssigen Stickstoff, entwickelt. Vor allem in der Kryokonservierung von Gehölzen spielen diese Methoden der Vitrifikation mit Hilfe der sogenannten „Plant Vitrification Solution Number 2“ (PVS2, SAKAI et al. 1990) und der Alginat- / Dehydrationsmethode (DEREUDDRE et al. 1990) eine bedeutende Rolle. In der Veröffentlichung von SAKAI et al. (2000) werden beide Methoden erfolgreich kombiniert. 2.6.2.1 Kryoprotektantien Man kann Kryoprotektantien in zwei Klassen unterteilen, die kolligativen und die osmotischen. Unter kolligativen Kryoprotektantien versteht man Substanzen wie DMSO und Glycerol, die die Fähigkeit besitzen die Zellmembranen zu durchdringen und somit in das Zellinnere eindringen. Dort erhöht sich ihre Konzentration innerhalb der Zellflüssig- keitslösung. Die damit verbundene Erniedrigung des chemischen Potentials der Lösung führt zu einer Gefrierpunktserniedrigung als reiner Entropieeffekt. Weiterhin dürfen kolligative Kryoprotektantien in den Konzentrationen, die zur Gefrierpunkterniedrigung 23 Zielsetzung und theoretische Grundlagen benötigt werden, nicht toxisch sein. DMSO und Glycerol erfüllen diese Eigenschaften. Bei einigen kältetoleranten, in Alaska vorkommenden Insektenarten hat man z. B festgestellt, dass sie hohe Glycerolkonzentrationen von 25 % in ihrem Körper ansammeln können (MERYMAN und WILIAMS 1985). Glycerol ist im Gegensatz zu DMSO auch in sehr hohen Konzentrationen nicht toxisch für Zellen. Ein Nachteil während der Kryokonservierung ist die langsame Passagezeit von Glycerol in die Zellen, womit die Voraussetzungen für die Entstehung eines schädigenden osmotischen Gradienten gegeben sind (MERYMAN und WILIAMS 1985). DMSO dagegen durchdringt schneller die Zellmembranen, ist aber bei zu langer Inkubation und zu hoher Konzentration dagegen toxisch. Osmotische Kryoprotektantien sind vor allem Zucker wie z. B. Sacharose oder Makromoleküle wie Polyethylenglykol. Diese Substanzen bewirken eine osmotische Dehydration der Zellen und eine Erhöhung der extrazellulären Viskosität. Die Konzentration der Substanzen und die Applikationszeit müssen so optimiert werden, dass es zu keiner Schädigung der Zellmembranen durch Dehydration kommt. Eine optimale Kryoprotektanz liegt vor, wenn osmotische Substanzen die Zellen dehydrieren, aber gleichzeitig ein Gleichgewicht zwischen kolligativen Substanzen im Extra- und Intrazellularraum hergestellt wird. Die starke Viskosität bei niedrigen Temperaturen fördert die Glasbildung und beugt somit Zellschädigungen vor. 2.6.2.2 Grundlagen der Vitrifikationsmethode Unter Vitrifikation versteht man den Prozess, bei dem eine wässrige Lösung unterhalb des Gefrierpunktes von Wasser ohne Phasenübergang von der flüssigen Form in eine nicht kristalline amorphe Form (Glaszustand) übergeht. Dieser Zustand tritt ein, wenn eine Lösung so hoch konzentriert ist, dass die Bildung von Kristallisationskeimen unterbunden wird (BENSON 1999 a). Um bei pflanzlichem Gewebe diesen Zustand zu erreichen, können zwei verschiedene Methoden angewandt werden, die nachfolgend beschrieben werden. Anmerkung: Der Begriff Vitrifikation wird in dieser Arbeit ausschließlich für das Entstehen eines Glaszustandes verwendet. In älterer Literatur zur Gewebekultur von Pflanzen wird der Begriff Vitrifikation als Beschreibung des Sprosszustandes von in vitro Kulturen benutzt, die einen glasigen, durchscheinenden Zustand aufweisen und oft die Ausbildung von dünnen zerbrechlichen Blättern zeigen. Dieser Zustand tritt bei zu hoher Luftfeuchtigkeit im Kulturgefäß, bei zu hohen Cytokininkonzentrationen oder bei zu weichem Medium auf und ist auf eine Hyperhydration der 24 Zielsetzung und theoretische Grundlagen Sprosse zurückzuführen. In neuerer Literatur und in dieser Arbeit wird dieser Zustand als Hyperhydrizität bezeichnet. 2.6.2.3 Alginat- / Dehydrationsmethode Bei dieser Methode wird pflanzliches Material (z. B. Sprossspitzen) zuerst in Calziumalginatkügelchen eingekapselt, daraufhin erfolgt eine osmotische Dehydration des Gewebes durch Inkubation der Kugeln in 1,2 M Saccharoselösung, gefolgt von einer definierten Trocknungsphase über Silicagel bis zu einem kritischen Feuchtigkeitsrestgehalt von ca. 25 %. An diesem Punkt liegt fast alles Wasser gebunden vor (LEOPOLD 1990, REED 2001 a). Beim Eintauchen in flüssigen Stickstoff kommt es somit aufgrund der hohen Viskosität der Zellflüssigkeit nicht zur Eisbildung sondern zur Vitrifikation. 2.6.2.4 Vitrifikation mit PVS2 Bei dieser Methode handelt es sich um eine Vitrifikation der extra- und intrazellulären Zellflüssigkeiten mit Hilfe einer hochkonzentrierten Lösung aus verschiedenen Kryoprotektantien. Die von SAKAI entwickelte PVS2-Lösung (SAKAI et al. 1990) besteht aus einer Mischung von 30 % Glycerol, 15 % DMSO und 15 % Ethylenglykol gelöst in einer 0,4 M Saccharoselösung. Der Effekt dieser Lösung beruht auf einer Dehydration der Zellen durch osmotische Substanzen wie Saccharose und Ethylenglykol sowie auf der Änderung der Zellmembran- struktur durch DMSO und das Eindringen von Glycerol und DMSO in das Zellinnere. Durch gleichmäßige Verteilung dieser beiden kolligativen Kryoprotektantien im Extra- und Intrazellularraum und gleichzeitiger Erhöhung der Zellviskosität wird die Eiskristallbildung verhindert und somit auch phasenübergangsbedingte Zellschädigungen durch Volumenänderungen (BENSON 1999 a). Kritische Faktoren dieser Methode sind die Einwirkzeit und der Temperaturverlauf. Bei zu langer Applikation der PVS2-Lösung wirken die genannten Stoffe toxisch. Ebenso ist der Zustand der vitrifizierten Proben nur metastabil. Um eine Kristallisation der Flüssigkeit zu vermeiden, muss der Erwärmungsvorgang sehr schnell und unter definierten Temperaturen (meist 45 °C) stattfinden, gefolgt von einem schnellen Austausch der PVS2-Lösung durch eine 1,2 M Saccharoselösung (BENSON 1999 a). 25 Zielsetzung und theoretische Grundlagen 2.6.2.5 Regeneration kryokonservierter Sprosse Neben der Entwicklung von artspezifischen Kryokonservierungsverfahren spielt die Rege- neration der Sprosse in vitro unter optimalen Kulturbedingungen eine entscheidende Rolle. Zur Vermeidung somaklonaler Variation ist es entscheidend, dass die Sprossregeneration aus den ursprünglichen organisierten Strukturen wie den Sprossmeristemen hervorgeht und nicht über extensive Kallus- oder Adventivsprossbildung (HARDING 1999). 2.6.3 Kryokonservierung von Fraxinus excelsior L. In der Literatur wurde bisher keine Methode zur Kryokonservierung von vegetativ erzeugtem Pflanzenmaterial der Gemeinen Esche oder anderer Arten der Gattung Fraxinus veröffentlicht. Für die Kryokonservierung von zygotischen Embryonen von Fraxinus excelsior existiert eine Veröffentlichung (BREARLEY et al. 1995). Als Ausgangspunkt für die Entwicklung eines spezifischen Kryokonservierungsprotokolls für Fraxinus excelsior wurden zwei vorhandene Standardprotokolle für Wildbirne und Johannisbeere, die auf den Prinzipien der Alginat- / Dehydrationsmethode und der Vitrifikationsmethode mit PVS2 beruhen, verwendet (REED 2001 a). Beide Methoden wurden zunächst am Material der Johannisbeere getestet, um zu gewährleisten, dass nicht technische oder handwerkliche Fehler den Erfolg beeinflussen. Nach einem erfolgreichen Übertrag der Technik auf Kulturen der Johannisbeere, wurden die Methoden zunächst an juvenilem Material von Fraxinus excelsior getestet und zu einem späteren Zeitpunkt für adultes Pflanzenmaterial optimiert. Entscheidend für den Erfolg eines Kryokonservierungsprotokolls ist die Optimierung aller die Regeneration beeinflussender Faktoren (BAJAJ 1995). Bei der Entwicklung des Protokolls für Fraxinus excelsior wurden folgende in Abbildung 5 dargestellten Faktoren untersucht und jeweils die zu dem Untersuchungszeitpunkt besten Bedingungen als Standard für weitere Versuche festgelegt, beibehalten oder weiterentwickelt. 26 Zielsetzung und theoretische Grundlagen In vitro Kultur kontaminationsfrei Kulturalter Abhärtung Kälteabhärtung Zuckermedien Vorbehandlung DMSO, Glycerol BSA Kryoprotektanzien Vitrifikation Alginat- / Dehydrationsmethode Vitrifikation mit PVS2 Andere Methoden Dauer & Konzentration Abbildung 5: Diagramm der verschiedenen Optimierungsschritte bei der Entwicklung eines Kryokonservierungsprotokolls. (Abkürzungen: BSA= Bovine Serum Albumin; DMSO = Dimethylsulfoxid; PVS2 = Plant Vitrification Solution Number 2) 2.7 Besonderheiten und Zielsetzung der vorliegenden Arbeit Ein kritischer Teil dieser Arbeit ist die Bewertung des Erfolges der in vitro Kultur und der Kryokonservierung. Hierbei muss die Gesamtheit dieser Methoden beachtet werden, da der Erfolg der Versuche von einem komplexen Zusammenspiel vieler beeinflussbarer, aber auch nicht beeinflussbarer Faktoren abhängig ist. Unter gleichen Versuchsbedingungen kommt es oft zu Variationen der Entwicklung unterschiedlicher Klone einer Art, aber auch innerhalb eines Genotyps. Die Entwicklung von in vitro Kulturen ist abhängig von ihrem Alter, dem physiologischen Zustand, der Jahreszeit und nicht zuletzt von ihrer Behandlung (BAJAJ 1995). All diese Faktoren erschweren die eindeutige Reproduzierbarkeit der Versuche, da nie nachweisbar mit Pflanzen desselben physiologischen Zustandes gearbeitet werden kann. Das Ziel der dargestellten Untersuchungen war die Erarbeitung eines bis dato noch nicht vorliegenden Verfahrens zur in vitro Vermehrung und Kryokonservierung einer Vielzahl verschiedener Genotypen der Baumart Fraxinus excelsior. Hierbei war zu jedem Zeitpunkt die fortschreitende Entwicklung anwendungsfreundlicher Methoden zur kommerziellen Nutzung von großer Bedeutung. Aufgrund des hohen Anwendungsbezuges der Arbeit wurden Methoden, die nur einen geringen sichtbaren Erfolg lieferten, ohne mehrmalige Wiederholungen verworfen und nur die Optimierung erfolgreicher Versuche fortgesetzt. 27 Methoden und Material 3 Methoden und Material 3.1 Geräte, spezieller Laborbedarf und Chemikalien 3.1.1 Geräte Sterilbank Heraeus HPH 12, Bj. 1995, Querstrom, Strömungsgeschwindigkeit ca. 0,430 m/s, Hanau , Deutschland Trockenschrank Typ Ul 30, Regelbereich 10-280 °C, Firma Memmert Schwabach, Deutschland Lichtschrank Ru/med, Rubarth Apparate GmbH, Deutschland Autoklav Varioklav Dampfsterilisator, Typ 400, H+P Labortechnik, Oberschleißheim, Deutschland Analysewaage Sartorius 140 / MP8, Genauigkeit ± 0,01 mg, Göttingen, Deutschland Waage Sartorius MC 210 P / MP8, Genauigkeit ± 0,05 g, Göttingen, Deutschland Schwenk-Schüttler Typ 1083, GfL, Burgwebel, Deutschland Reinstwasseranlage Barnstead Nanopure, Wilhelm Werner GMBH, Bergisch Gladbach, Deutschland Kryotank Taylor-Wharton 35HC (35 l), Theodore, USA 3.1.2 Spezieller Laborbedarf Kryoröhrchen Cellstar 2 ml, Greiner Labortechnik, Frickenhausen, Deutschland Pikiertöpfe Jiffy 4 × 4, Firma Jiffy, Dänemark Basissubstrat 3 Blumenerdenwerk Stender GmbH, Schermbeck, Deutschland Vermehrungssubstrat Blumenerdenwerk Stender GmbH, Schermbeck, Deutschland Perlite Perlite-Dämmstoff GmbH & Co, Dortmund, Deutschland Weckgläser 250 ml Gläser, Weck GmbH, Werl, Deutschland Honiggläser 250 ml Gläser, Firma Meli, Veurne, Belgien Plastikpipette sterile Einwegpipette, 3ml, Firma Copan, Italien 28 Methoden und Material 3.1.3 Chemikalien IBA C12H13NO2, 3-Indolebutyric Acid, MG: 203,2, Fluka Chemie GmbH, Buchs, Schweiz IAA C10H9NO2, Indole-3-Acetic Acid, MG: 175,2, Fluka Chemie GmbH, Buchs, Schweiz NAA C12H10NO2, Naphthalenacetic Acid, MG: 274,3, Fluka Chemie GmbH, Buchs, Schweiz BAP C12H11N5, 6-Benzylaminopurine, MG: 225,3, Fluka Chemie GmbH, Buchs, Schweiz Kinetin C10H9N5O, 6-Furfurylaminopurine, MG: 215,2, Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim, Deutschland TDZ C9H8N4OS, Thidiazuron, MG:220,25, Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim, Deutschland Glycerol 99,5% C3H8O3, MG: 92,1, d = 1,262 g/ml Fluka Chemie GmbH, Buchs, Schweiz Ethylenglykol C2H6O2, MG: 62,1, d = 1,113 g/ml, Fluka Chemie GmbH, Buchs, Schweiz DMSO C2H6SO, Dimethylsulfoxid, MG: 78,13, d = 1,1 g/ml, Fluka Chemie GmbH, Buchs, Schweiz Alginat A-2158, Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim, Deutschland Agar Difco granulated Becton Dickinson and Company, Sparks, USA Plantagar S1000 Planta, B&V, Italien Gelrite Duchefa; Haarlem, Holland Weiterhin wurden nur Geräte und Chemikalien verwendet, die in einem gut geführten Labor vorhanden sind. 3.2 Methoden zur in vitro Kultur von Fraxinus excelsior 3.2.1 Kulturgefäße Zur Etablierung der Ausgangsexplantate (Sprossexplantate, Knospen oder Embryonen aus Saatgut) wurden Glaspetrischalen (10 cm Durchmesser) mit ca. 35 ml Medium benutzt. Für die anschließende Vermehrungs- und Bewurzelungsphase wurden Weckgläser mit 29 Methoden und Material einem Glasdeckel verwendet. Zum besseren Luftaustausch befand sich ein Zellulosering zwischen Deckel und Glasrand. Weiterhin wurden in der Vermehrungsphase Honiggläser mit einem Plastikschraubdeckel getestet (siehe Kap. 3.1.2). 3.2.2 Kulturbedingungen Die Kulturen wurden in einem Klimaraum bei Temperaturen von 24 °C ± 1 °C während der 16-stündigen Weißlichtphotoperiode und 21 °C ± 1 °C während der Dunkelphase kultiviert. Die Intensität des Weißlichtes betrug 60 bis 80 µmol / m2 s. 3.2.3 Pflanzenmaterial 3.2.3.1 Saatgut Saatgut von folgenden in der NFV-C eingelagerten Einzelbäumen verschiedener Herkünfte wurde für die Versuche verwendet: Far 126-103, ElmEvl 7-3, Bov 16-1, Wolf 129-6, Wenz 47-1, Walk 67-2 und SooA 134-6. Die Herkünfte sind im Anhang 2 aufgelistet. 3.2.3.2 Ausgewählte Plusbäume aus dem 1985 angelegten Eschenherkunftsversuch Auf den Versuchsflächen der zwei Herkunfts-/ Nachkommenschaftsprüfungen mit Fraxinus excelsior in den Forstämtern Dannenberg und Bovenden wurden insgesamt 62 hervorragende Einzelbäume (Anhang 3 und 4) nach den Kriterien Wuchsleistung und Stammform für die vegetative Vermehrung ausgewählt. Die Bäume stammen aus dem zu Beginn des Projektes (Januar 2001) 16 Jahre alten europäischen Herkunftsversuchs mit 250 Einzelbaumnachkommenschaften aus 52 europäischen Herkünften (Kleinschmit et al. 1996). Als Ausgangsmaterial für die in vitro Vermehrung wurden verschiedene Explantatquellen getestet. Zum einen Winterknospen oder junge Triebe, die direkt von den Mutterbäumen auf der Versuchsfläche (siehe Abbildung 6 und Abbildung 7) geworben wurden und zum anderen frische Triebe, die von Pfropflingen der selektierten Bäume stammten (siehe Abbildung 8 und Abbildung 9). 30 Methoden und Material Abbildung 6: Ausschnitt der Versuchsfläche Bovenden im Juli 2001 Abbildung 7: Ausschnitte der Versuchsfläche Bovenden im März 2003 Abbildung 8: Vier Monate alte Pfropflinge (Juli 2001) Abbildung 9: Zwei Jahre alte Pfropflinge (Juli 2003) Im Frühjahr 2001 wurden Pfropflinge von Reisern der Plusbäume aus dem Eschen- Herkunftsversuch Bovenden (siehe Abbildung 8) und im Frühjahr 2002 aus dem Eschen- 31 Methoden und Material Herkunftsversuch Dannenberg hergestellt. Von jedem Mutterbaum standen für Versuchszwecke je nach Klon zwei bis sechs Pfropflinge zur Verfügung. Abbildung 9 zeigt zwei Jahre alte Pfropflinge, die zur in vitro Kultivierung verwendet wurden. 3.2.4 Etablierung und Vermehrung von juvenilen Sprosskulturen aus zygotischen Embryonen 3.2.4.1 Medium Für die Etablierung wurde hormonfreies, halbkonzentriertes MS-Medium benutzt und in der Vermehrungsphase WPM mit 4 mg/l BAP, 0,15 mg/l IBA, 2 % Saccharose und 0,8 % Difco granulated Agar (siehe Kap. 3.1.3). Dieses Medium wird im folgenden als „Standardmedium“ bezeichnet. Der pH-Wert aller zur in vitro Vermehrung getesteten Medien wurde vor dem Autoklavieren (15 min bei 121 °C und 1,2 Bar) mit 0,1 M Natronlauge oder 0,1 M Salzsäure auf 5,7 eingestellt. 3.2.4.2 Oberflächensterilisation des Saatgutes, Präparation und Vermehrung Um die Embryonen unter sterilen Bedingungen aus der Testa herauszupräparieren, erfolgte nach dem Entfernen der Samaras zunächst eine Oberflächensterilisation der Samen für zehn Minuten in 10 % (v/v) NaOCl-Lösung mit einem Tropfen Tween 20 pro 100 ml auf einem Magnetrührer. Danach wurden die Samen gründlich in sterilem Reinstwasser (Nanopur) gespült und dann darin für 48 Stunden bei 24 °C ± 1 °C in einem Becherglas, abgedeckt mit Alufolie unter Kulturbedingungen inkubiert (siehe Kap. 3.2.2). Durch das Quellen der Samen ließ sich die Testa sehr gut aufspalten und der Embryo leicht herauspräparieren. Die Embryonen wurden horizontal auf hormonfreies, halbkonzentriertes MS-Medium in Petrischalen gelegt. Nach drei Wochen unter Kulturbedingungen wurden die sich entwickelnden Wurzeln von dem Sämling (siehe Abbildung 10) abgetrennt und die Sprosse in Weckgläsern auf Standardmedium vermehrt. 32 Methoden und Material Abbildung 10: Vier Wochen alter Sämling mit deutlich entwickelter Wurzel, angezogen aus einem präparierten Embryo 3.2.5 Etablierung adulter Kulturen mit Explantaten geworben von den Mutterbäumen Frische junge Triebe wurden im Zeitraum von Mai bis Juli 2001 und Reiser mit ruhenden Knospen zwischen November 2001 und März 2002 von 26 ausgewählten Plusbäumen geworben, in Plastikbeutel verpackt und je nach Vorbehandlung am gleichen oder am nächsten Tag für die in vitro Kultivierung präpariert. 3.2.5.1 Oberflächensterilisation, Präparation und Etablierung frischer Triebe von Mutterbäumen Die Oberflächensterilisation und Etablierung erfolgte in Anlehnung an die Veröffentlichungen von PIERIK und SPRENKELS (1997) und HAMMATT (1994 und 1996). Die Sprosse wurden in ca. 1 cm lange Segmente mit Apikalspitze oder einem Achselknospenpaar zerteilt und dann oberflächensterilisiert. Um ein optimales Verfahren zu entwickeln, wurden verschiedene Sterilisationssubstanzen, Konzentrationen und Spülzeiten in sterilem Leitungswasser getestet (siehe Tabelle 2). Die Etablierung fand auf verschiedenen Medien statt (siehe Tabelle 3). 33 Methoden und Material Tabelle 2: Darstellung der verschiedenen Sterilisationsmittel, der Spülzeiten in sterilem Leitungswasser zwischen zwei Sterilisationsgängen und der getesteten Etablierungs- und Vermehrungsmedien Sterilisationsmittel Spülzeit Medium 1,5 % NaOCl (v/v) 2 × 10 min 14/3 oder 14/4 1,5 % NaOCl (v/v) 2 × 1,5 h 14/3 oder 14/4 0,1 % HgCl2 (w/v) 2 × 1,5 h 14/31 oder 14/5 0,1 % HgCl2 (w/v) 2 × 1,5 h *14/31 oder *14/5 3,0 % NaOCl (v/v) 2 × 1,5 h *14/31 oder *14/5 *1 Woche in flüssigem MS-Medium und folgende Überführung auf entsprechend genannte Medien (siehe Tabelle 3) Tabelle 3: Zusammensetzung der benutzten Medien bei der Etablierung frischer Triebe von den Mutterbäumen Medium IBA BAP TDZ Basismedium Saccharose Agar* Vit. C [mg/l] [mg/l] [mg/l] Makro Mikro Eisen Vit. [%] [%] [mg/l] 14/3 0,2 1,0 0,22 MS MS MS B5 3 0,8 - 14/31 0,2 2,0 0,22 MS MS MS B5 3 0,8 - 14/4 0,15 5,0 - MS 0,75 MS 0,5 MS MS 2 0,8 2 14/5 0,15 4,0 - WPM MS 0,5 MS MS 2 0,8 2 *Difco granulated, Vit. = Vitamin Die Oberflächensterilisation erfolgte unter ständigem Rühren auf einem Magnetrührer unter der Sterilbank. Zu Beginn des Sterilisationsvorganges wurden die Explantate für eine Minute in 70 % (v/v) Ethanol getaucht, die Inkubationszeit in dem jeweiligen Sterilisationsmittel betrug zweimal 15 Minuten, unterbrochen durch die angegebenen Spülzeiten in sterilem Leitungswasser. Am Ende eines jeden Verfahrens wurden die Explantate für dreimal fünf Minuten in sterilem Leitungswasser gespült und danach entweder direkt präpariert und auf Medium gesetzt oder zunächst für eine Woche in flüssigem, hormonfreien MS-Medium aufbewahrt. Die Präparation erfolgte nach dem Entfernen des Oberflächenwassers auf sterilem Filterpapier. Während der Sterilisation verbräuntes Pflanzengewebe wurde mit dem Skalpell entfernt und die Explantate zu gleichen Teilen auf die zu testenden Etablierungsmedien gesetzt. In allen Versuchen wurde zur Sterilisation von frischen Trieben oder ruhenden Knospen steriles Leitungswasser benutzt. Diese Änderung der Methode ist auf Fachgespräche mit verschiedenen Experten (SOMMER und DOUGLAS, persönliche Mitteilungen) zurückzu- führen. Die Erfahrung hat gezeigt, dass eine Inkubation der Explantate, vor allem von 34 Methoden und Material frischen Trieben, in ionenreduziertem Reinstwasser zu einem schnellen Verbräunen führen kann. Grund hierfür kann das entstehende hohe osmotische Potential zwischen Reinstwasser und Zellinnerem des Pflanzenmaterials, sowie die vorhandenen Schnittstellen durch das Präparieren sein. Durch beide Faktoren kann es zu einem erhöhten Austritt von Gewebeflüssigkeit und somit zu einem „Verwelken“ des Materials kommen. 3.2.5.2 Oberflächensterilisation, Präparation und Etablierung ruhender Knospen von Mutterbäumen In der Literatur sind verschiedene Methoden der Oberflächensterilisation von Winterknos- pen beschrieben. Häufig eingesetzte Sterilisationsmittel sind Natriumhypochlorit und Quecksilberchlorid. Aufgrund der hohen Toxizität von Quecksilberchlorid und der Ergebnisse aus Kapitel 4.1.2.1 wurde die Sterilisation nur mit NaOCl fortgeführt. Reiser mit ruhenden Knospen (siehe Abbildung 11) wurden in Segmente mit Apikal- bzw. Achselknospen enthaltende Segmente von ca. 1 cm Länge zerteilt, direkt oberflächensteri- lisiert oder bei 37 °C für 16 Stunden unter unsterilen Bedingungen in einem Wasserbad vorbehandelt. Die Oberflächensterilisation erfolgte auf einem Magnetrührer durch Inkubation für eine Minute in 70 % Ethanol, gefolgt von einer zweimaligen Behandlung in 3 oder 5 % (v/v) NaOCl-Lösung mit einem Tropfen Tween 20 pro 100 ml für 20 Minuten, unterbrochen durch einen Spülgang (60 min) in sterilem Leitungswasser zwischen den Behandlungsschritten. Nach der Oberflächensterilisation und dreimaligem Spülen in sterilem Leitungswasser wurden die Explantate auf sterilem Filterpapier abgetropft. Unter dem Binokular wurden die Knospen aus dem Reis herauspräpariert sowie die ersten vier Knospenschuppen entfernt. Danach erfolgte die Überführung auf Standardmedium zunächst in Petrischalen und nach vier Wochen in Weckgläsern. 35 Methoden und Material Abbildung 11: Vier Reiser mit ruhenden Apikal- und sichtbaren Achselknospen 3.2.5.2.1 Einfluss des Werbungsdatums auf die Regeneration von Winterknospen In dieser Versuchsreihe sollte ein optimaler Werbungszeitpunkt für Winterreiser von Fraxinus excelsior bestimmt werden. Hierzu wurden 25 verschiedene Plusbäume auf der Versuchsfläche Bovenden bei Göttingen im September, Oktober, November, Dezember, Februar, März und Mai beworben. Die Etablierung erfolgte nach folgender Methode: Vorbehandlung: Wasserbad bei 37 °C für 16 h, die Explantate werden direkt unter unsterilen Bedingungen in das Wasserbad gegeben. Oberflächensterilisation auf einem Magnetrührer: 1 min in 70 % (v/v) Ethanol, 20 min in 5 % (v/v) NaOCl + 1 Tropfen Tween 20 pro 100 ml, 60 min Spülen in sterilem Leitungswasser, 20 min 5 % (v/v) NaOCl + 1 Tropfen Tween 20 pro 100 ml, dreimaliges Waschen je 5 min in sterilem Leitungswasser, Abtropfen der Explantate auf sterilem Filterpapier. Präparation: Herauspräparieren der Knospen aus dem Reis, so dass eine Basis von 2 bis 4 mm bestehen bleibt. Entfernung der ersten vier Knospenschuppen. Etablierung: Transfer der präparierten Explantate auf hormonfreies WPM in Petrischalen für die ersten vier Wochen. Vermehrung: Transfer nach vier Wochen auf Standardmedium in Weckgläsern. Bonitur: Erfassen der Kontaminationen, Verbräunung und des Wachstums nach vier und acht Wochen. 36 Methoden und Material 3.2.6 Etablierung adulter Kulturen aus Explantaten von Pfropflingen der Mutterbäume Im Frühjahr 2002 und 2003 wurden frisch austreibende Triebe von Pfropflingen geworben. Um ein gleichzeitiges Austreiben der Pfropflinge und somit Arbeitsspitzen zu vermeiden, wurden die Pflanzen ab Mitte Februar in Intervallen von 14 Tagen in ein Gewächshaus mit einer Mindesttemperatur von 14 °C überführt. Somit standen von Ende März bis Ende Juni junge Triebe als Explantatquelle für die in vitro Kultur zur Verfügung (siehe Abbildung 12). Der Transfer in ein Gewächshaus sollte zusätzlich Kontaminationen der frühen Austriebe durch offene Umweltbedingungen wie z. B. Regenwasser oder Staub reduzieren. Um dies nachzuweisen, wurde im Jahr 2002 die Hälfte der Pflanzen in ein Gewächshaus transferiert und die andere Hälfte in dem Freiland-Pfropflingsquatier behalten. Diese Pfropflinge werden im folgenden als „Freilandpfropflinge“ bezeichnet. Im Gewächshaus wurden die noch geschlossenen, ruhenden Knospen mit 5 % (v/v) NaOCl eingesprüht und nach 20 Minuten mit sterilem Leitungswasser abgespült. Die Bewässerung der Pflanzen erfolgte daraufhin ausschließlich über die Erde, so dass Sprossspitzen, Achselknospen und Blätter nicht mit Wasser in Berührung kamen. Abbildung 12: Im Gewächshaus angetriebener Pfropfling nach Öffnung der Knospen Die „Freilandpfropflinge“ wurden keiner zusätzlichen Behandlung unterzogen. Die Etablierung erfolgte bei beiden Standorten jeweils drei Wochen nach dem Austrieb der 37 Methoden und Material Pflanzen. Hierzu wurden die frischen Triebe in ca. 0,5 bis 1 cm lange Segmente mit Apikalspitze (siehe Abbildung 13) oder einem Achselknospenpaar zerteilt (siehe Abbildung 14). Abbildung 13: Apikaltrieb sieben Tage nach der Etablierung Abbildung 14: Präpariertes Achselknospenpaar sieben Tage nach der Etablierung Die Oberflächensterilisation erfolgte unter ständigem Rühren auf einem Magnetrührer durch Inkubation für eine Minute in 70 % Ethanol, gefolgt von verschiedenen in der Tabelle 4 aufgelisteten Sterilisationsmethoden. 38 Methoden und Material Tabelle 4: Sterilisationsmittel und Inkubationszeiten für die Oberflächensterilisation von Explantaten aus jungen Trieben von Pfropflingen, die unter Freiland- oder Gewächshausbedingun- gen gehalten wurden Sterilisationsmittel Inkubationszeit Besonderheit 2,0 % NaOCl (v/v) 2 × 20 min Spülen in sterilem Leitungswasser für 60 min zwischen den Sterilisationsschritten 0,2 % HgCl2 (w/v) 10 min Nach der Oberflächensterilisation wurden die Explantate für fünf Minuten in sterilem Leitungswasser gespült, auf sterilem Filterpapier abgetropft und verbräuntes Gewebe entfernt. Anschließend wurden sie für zwei bis vier Wochen auf hormonfreies WPM in Petrischalen überführt und dann auf Standardmedium oder Standardmedium mit 0,1 mg/l TDZ gesetzt. Faktoren, wie die Wahl des Sterilisationsmittels, der Einfluss der Umweltbedingungen und der Zeitpunkt der Etablierung, wurden in verschiedenen Versuchsreihen getestet, ebenso der Einfluss von TDZ auf die Etablierung (siehe Kap. 3.2.6.1 bis 3.2.6.4). 3.2.6.1 Einfluss des Sterilisationsmittels auf Kontaminationen der Explantate Die Konzentration des bisherigen Sterilisationsmittels NaOCl für frische Triebe wurde von 1,5 % auf 2 % erhöht und der Prozentanteil kontaminierter Explantate mit dem nach einer Sterilisation mit Quecksilberchlorid verglichen (siehe Tabelle 4). Die Versuche wurden im Mai 2002 durchgeführt. Für beide Methoden wurden dieselben Klone verwendet. Die Etablierung fand auf hormonfreiem WPM für zwei Wochen statt, danach erfolgte die Überführung auf Standardmedium in Weckgläsern. Die Auswertung erfolgte nach ca. zwölf Wochen. 3.2.6.2 Einfluss von Umweltfaktoren auf Kontaminationen der Explantate Durch die Überführung der Pfropflinge in ein Gewächshaus erfolgte eine Abschirmung der sich öffnenden Knospen gegen Regen und Umwelteinflüsse. Der Prozentanteil der Kontamination der Explantate während der Etablierung wurde in Abhängigkeit zu den beiden Standorten der Pfropflinge (Gewächshaus oder Freiland) verglichen. Die Etablierung der Explantate von Pfropflingen, die im Gewächshaus angetrieben wurden, erfolgte im März; die von „Freilandpfropflingen“ der selben Genotypen im Mai, da diese später austrieben. Die Etablierung fand auf hormonfreiem WPM für zwei Wochen statt, 39 Methoden und Material danach erfolgte die Überführung auf Standardmedium in Weckgläsern. Die Auswertung erfolgte nach ca. zwölf Wochen. 3.2.6.3 Einfluss der Jahreszeit auf Kontaminationen der Explantate Die Etablierung der getesteten Explantate fand im Frühjahr 2003 unter optimierten Sterilisations- und Etablierungsbedingungen statt (Kap. 3.2.9). Die Auswertung erfolgte nach vier Wochen, da sich zu diesem Zeitpunkt fast alle Kontaminationen manifestiert hatten. Auswertungen über den Erfolg einer Sprossetablierung ließen sich zu diesem Zeitpunkt noch nicht treffen, da viele Explantate, obwohl sie anfängliches Wachstum zeigten, im Laufe der folgenden Transfers abstarben. 3.2.6.4 Optimierung der Etablierungsrate durch Zusatz von TDZ Zur Verbesserung der Etablierungsrate wurden im Frühjahr 2003 Explantate von Pfropflingen aller 62 Klone der selektierten Elitebäume (siehe Anhang 3 und 4) mit dem optimierten Oberflächensterilisationsverfahren (Kap. 3.2.9) behandelt, für zwei Wochen auf hormonfreies WPM transferiert und dann zur Hälfte auf Standardmedium oder Standardmedium mit 0,1 mg/l TDZ gesetzt. Weiterhin wurden die Explantate nach Achselknospen- und Sprossspitzenexplantaten aufgeteilt. Für diesen Versuch wurden 3 bis 12 Sprossspitzen- und 6 bis 24 Achselknospenexplantate pro Klon verwendet. 3.2.7 Optimierung der Vermehrungsrate von etablierten juvenilen und adulten in vitro Kulturen Die Vermehrung der Kulturen erfolgte alle vier bis sechs Wochen durch Subkultur auf frisches Vermehrungsmedium. Bei jedem Transfer wurden die Sprosse in 5 bis 15 mm lange Segmente mit Apikalknospe oder einem Achselknospenpaar zerteilt. Die Vermehrungsrate ergab sich aus dem Quotienten von neu erhaltenen Sprosssegmenten geteilt durch die Anzahl der im letzten Zyklus aufgesetzten Segmente. 3.2.7.1 Wahl des optimalen Basismediums Die Bestimmung des geeigneten Grundmediums erfolgte durch Versuchsreihen mit ausgewählten, in der Literatur beschriebenen Medien und deren Abwandlungen (siehe 40 Methoden und Material Tabelle 5). Als Versuchskulturen dienten drei juvenile Kulturen (Klon JK47, F5 und S11) deren Vermehrungsraten über einen Zeitraum von sechs Transfers bestimmt wurden. Tabelle 5: Test dreier unterschiedlicher Grundmedien [WPM, DKW (Driver Kuniyuki Walnut, DRIVER und KUNIYUKI 1984) und MS] mit derselben Hormonkonzentration und zweier aus der Literatur bekannten Medien [QRC (Quercus Rooting Medium) / M9, und WPM / MS] zur in vitro Vermehrung von Fraxinus excelsior Grundmedium Hormone, Zusätze, Besonderheit Quelle WPM 4 mg/l BAP + 0,15 mg/l IBA Definition DKW 4 mg/l BAP + 0,15 mg/l IBA Definition MS 4 mg/l BAP + 0,15 mg/l IBA Definition QRC / M9 5,5 mg/l BAP + 0,2 mg/l IBA + 1,1 mg/l TDZ Alternierende Kultivierung auf hormonfreiem QRC- Medium (SCHMID und MONNEY 1993) und einem abgewandelten MS-Medium mit B5 Vitaminen Etablierungsprotokoll (TEAGASC INSTITUTS, Dublin, Irland) WPM / MS 4 mg/l BAP + 0,15 mg/l IBA + 2 mg/l Ascorbinsäure + 1 mg/l Biotin Makroelemente: WPM, Mikroelemente: MS PIERIK und SPRENKELS (1997) 3.2.7.2 Einfluss des verwendeten Cytokinins und des Cytokinin / Auxin- Verhältnisses auf die Vermehrungsrate Sprosse der juvenilen Kultur des Klons 16-1.2 wurden auf WPM mit 2 % Saccharose, 0,8 % Agar in Weckgläsern und mit verschiedenen Cytokinin / Auxin-Kombinationen über sechs Transfers kultiviert. Folgende BAP / IBA oder Kinetin / IBA-Konzentrationen [mg/l] wurden hierbei getestet: 1/1; 5/3; 3/0,5; 4/0,15; 10/0; 10/10. 3.2.7.3 Einfluss des Kulturgefäßes auf die Vermehrungsrate Sprosse von vier juvenilen Kulturen (Klon S11, JK47, 16-1.1 129-6.2) wurden entweder auf Standardmedium in Honiggläsern (siehe Abbildung 15 links) oder in Weckgläsern (siehe Abbildung 15 rechts) mit jeweils 80 ml Medium kultiviert. 41 Methoden und Material Abbildung 15: Verschiedene Kulturgefäße, links ein Honigglas mit Plastikschraubdeckel und rechts ein Weckglas mit Glasdeckel und Filzring 3.2.7.4 Einfluss von TDZ auf die Vermehrungsrate Sprosse einer juvenilen Kultur (Klon 129-6.1) und dreier adulter Kulturen (Klon T70, 77-19, 77-12) wurden auf Standardmedium in Weckgläsern ohne TDZ, mit 0,01 mg/l TDZ und mit 0,1 mg/l TDZ über neun Transfers kultiviert. 3.2.7.5 Einfluss von Agar und TDZ auf die Vermehrungsrate Sprosse einer juvenilen Kultur (Klon 129-6.1) und drei adulter Kulturen (Klon T70, 77-19, 77-12) wurden auf vier Medien in Weckgläsern über neun Transfers kultiviert: Standardmedium, Standardmedium mit 0,01 mg/l TDZ, Standardmedium mit einer geringeren Agarkonzentration (0,7 %) und Standardmedium mit einer geringeren Agarkonzentration (0,7 %) und 0,01 mg/l TDZ. 3.2.7.6 Vergleich der Vermehrungsraten des Standardmediums in Weckgläsern mit einem abgewandelten Medium in Honiggläsern In diesem Versuch wurden im Vergleich zu dem bisher benutzten Standardmedium in Weckgläsern zwei Faktoren (Agargehalt und Kulturgefäß) gleichzeitig geändert. Ausschlaggebend hierfür waren die Ergebnisse der vorhergehenden Versuche (siehe Kap. 4.1.4.3 bis 4.1.4.5). Die Änderung des Agargehaltes oder des Kulturgefäßes alleine bewirkte keine signifikante Verbesserung der Vermehrungsrate verglichen mit der 42 Methoden und Material Kontrolle. In dem durchgeführten Versuch wurden Sprosse einer juvenilen Kultur (Klon 129-6.1) und dreier adulter Kulturen (Klon T70, 77-19, 77-12) über sechs Transfers auf Standardmedium in Weckgläsern oder Standardmedium mit 0,01 mg/l TDZ und einer geringeren Agarkonzentration (0,7 %) in Honiggläsern kultiviert. 3.2.8 Bewurzelung juveniler und adulter etablierter Kulturen Die Bewurzelung der Mikrostecklinge erfolgte jeweils am Ende einer Subkulturphase. Der dabei gebildete Kallus der in vitro Sprosse wurde entfernt und der Hauptspross unzerteilt auf Bewurzelungsmedium [halb-konzentriertes MS-Medium mit 3 % Saccharose und 0,8 % Agar (Difco granulated)] mit unterschiedlichen Hormonkonzentrationen oder Zusätzen überführt. Nach drei Wochen wurden die Sprosse mit oder ohne Wurzeln in unsterile 5 × 5 cm Pikiertöpfchen (Jiffy-Töpfe, siehe Abbildung 16 und Kap. 3.1.2) in ein torfhaltiges Substrat pikiert. Dem Substrat wurden zusätzlich Kunststoffperlen (Agriperl siehe Kap. 3.1.2) zur besseren Belüftung zugesetzt. Die Akklimatisation an Gewächshausbedingungen für die ersten drei bis fünf Wochen erfolgte unter einem Plastikzelt mit erhöhter Luftfeuchtigkeit. Danach wurden die bewurzelten Pflanzen getopft und in normale Gewächshausbedingungen überführt (siehe Abbildung 17). Die Bonitur der Bewurzelung fand nach drei Wochen auf Bewurzelungsmedium und acht Wochen nach dem Transfer in Erde statt. 43 Methoden und Material Abbildung 16: Jiffy-Pikiertöpfchen mit Mikrostecklingen vier Wochen nach dem Transfer Abbildung 17: Bewurzelte und getopfte Pflanzen nach der Akklimatisation und unter normalen Gewächshausbedingungen 3.2.8.1 Einfluss von Dunkelheit und IBA-Konzentrationen auf die Bewurzelung Mikrostecklinge zweier juveniler Kulturen (Klon S8 und 126-103.1) und einer adulten Kultur (T70) wurden auf Bewurzelungsmedium mit 1, 3, 5 oder 8 mg/l IBA überführt. Innerhalb der dreiwöchigen Bewurzelungsphase wurde eine Hälfte der Pflanzen für die ersten sieben Tage in Dunkelheit (Dunkelinkubation), die andere Hälfte unter normalen Kulturbedingungen (16 h Licht / 8 h Dunkelheit) für die gesamten drei Wochen (kontinuierliche Lichtphase) gehalten. 44 Methoden und Material 3.2.8.2 Einfluss von IBA und BAP auf die Bewurzelung Mikrostecklinge einer juvenilen Kultur (Klon 126-103.1) und zweier adulten Kulturen (Klon 77-2 und 77-3) wurden entweder auf Bewurzelungsmedium mit 2, 3 oder 5 mg/l IBA und 0,25 mg/l BAP oder auf dasselbe Medium ohne BAP überführt. Bei beiden Versuchsreihen diente hormonfreies Bewurzelungsmedium als Kontrolle. 3.2.8.3 Einfluss einer zusätzlichen Kultivierung auf Kohlemedium auf die Bewurzelung Mikrostecklinge einer juvenilen Kultur (S8) und zweier adulten Kulturen (Klon 77-2 und 77-3) wurden entweder direkt nach der dreiwöchigen Kultivierung auf Bewurzelungs- medium mit 2, 3 oder 5 mg/l IBA und 0,25 mg/l BAP in Erde überführt oder für weitere zwei Wochen auf hormonfreiem Bewurzelungsmedium mit 3 % Aktivkohle kultiviert. Die Bonitur der Bewurzelung erfolgte jeweils nach der in vitro Phase und acht Wochen nach der Überführung in Erde. 3.2.8.4 Einfluss verschiedener Auxine und deren Applikationsform auf die Bewurzelung Die Basis der Mikrostecklinge dreier adulter Kulturen (Klon 77-27, 77-3 und 77-8) und einer juvenilen Kultur (Klon S8) wurde für zehn Minuten entweder in eine IBA- oder eine NAA-Lösung mit Konzentrationen von 5 µM, 1 mM oder 12 mM getaucht. Danach wurden die Sprosse auf Aktivkohlemedium für eine Woche in Dunkelheit gehalten und nach weiteren zwei Wochen unter normalen Kulturbedingungen in Erde überführt. In der angelegten Kontrolle wurden die Klone nach der Standardmethode (Kultur auf Bewurzelungsmedium mit 2 mg/l IBA und 0,25 mg/l BAP für drei Wochen und Inkubation in Dunkelheit für die erste Woche) behandelt. Die Bonitur fand nach acht Wochen in Erde statt. 3.2.9 Optimiertes in vitro Protokoll zur Etablierung adulter Kulturen von Fraxinus excelsior L. Material: Pfropflinge von selektierten Plusbäumen wurden Ende Februar in ein Gewächshaus überführt, dort angetrieben und von unten gewässert. Als 45 Methoden und Material Ausgangsexplantate dienten junge zwei Wochen alte Sprossspitzen oder grüne Achselknospen. Etablierungszeitraum: März bis Anfang Mai. Oberflächensterilisation: 1 min 70 % Ethanol, 10 min 0,2 % HgCl2, 5 min Spülen in sterilem Leitungswasser, Abtropfen der Explantate auf sterilem Filterpapier. Präparation: Die Apikal- und Achselknospen wurden nicht herauspräpariert. Der Trieb wurde in ca. 0,5 bis 1 cm lange Segmente mit Sprossspitze oder einem Achselknospenpaar zerteilt. Etablierung Phase 1: Kultur der präparierten Explantate auf hormonfreiem WPM in Petrischalen für vier Wochen. Etablierung Phase 2: Transfer nach vier Wochen auf Standardmedium (WPM mit 4 mg/l BAP, 0,15 mg/l IBA, 2 % Saccharose und 0,8 % Agar) oder Standardmedium mit 0,1 mg/l TDZ in Weckgläsern. Die Dauer der Etablierungsphase 2 war klonabhängig. Der Transfer auf Vermehrungsmedium erfolgte sobald eine Sprossstreckung oder eine Neubildung von Sprossen aus den Achselknospen sichtbar war (siehe Abbildung 18). Abbildung 18: Neubildung von Achselsprossen acht Wochen nach der Etablierung Vermehrung: Die Vermehrung erfolgte auf WPM mit 4 mg/l BAP, 0,15 mg/l IBA, 0,01 mg/l TDZ, 2 % Saccharose und 0,7 % Agar in Honiggläsern. Bewurzelung: Am Ende einer Subkulturphase (5 Wochen) wurden die Mikrostecklinge nach Entfernung des Kallus auf halb-konzentriertes MS-Medium mit 2 mg/l IBA, 0,25 mg/l BAP, 3 % Saccharose und 0,8 % Agar für drei Wochen überführt. In der ersten 46 Methoden und Material Woche erfolgte eine Dunkelinkubation unter Kulturbedingungen. Nach drei Wochen wurden die Mikrostecklinge in Jiffy-Töpfe mit einem torfhaltigen Substrat überführt und es erfolgte die Akklimatisation an Gewächshausbedingungen unter einem Plastikzelt mit erhöhter Luftfeuchtigkeit. Nach drei bis fünf Wochen erfolgte das Topfen der bewurzelten Pflanzen und der Transfer in normale Gewächshausbedingungen. 3.3 Methoden zur Kryokonservierung von Fraxinus excelsior 3.3.1 Herstellung von sterilen Lösungen und Medien Der pH-Wert aller verwendeten Lösungen und Medien betrug 5,8. Bei Medien, die mit Agar verfestigt wurden, erfolgte das Einstellen des pH-Wertes vor dem Autoklavieren. Kryoprotektantien wie Glycerol und DMSO wurden sterilfiltriert und dem Medium nach dem Autoklavieren während der Abkühlungsphase zugefügt. Flüssigmedien wurden am Verarbeitungstag hergestellt und sterilfiltriert. 3.3.2 Pflanzenmaterial und Kulturbedingungen Für die Durchführung der verschiedenen Versuche standen ab Herbst 2001 etablierte juvenile Kulturen (siehe Kap. 3.2.4) und ab Herbst 2002 etablierte adulte Kulturen (siehe Kap. 3.2.6) zur Verfügung. Mit der systematischen Einlagerung von in vitro Kulturen wurde ab Januar 2004 begonnen. In vitro Kulturen zur Kryokonservierung wurden für mindestens zwei Transfers auf TDZ-freiem Standardmedium (siehe Kap. 3.2.4.1) unter normalen Kulturbedingungen kultiviert (siehe Kap. 3.2.2). Als Kulturgefäße dienten Weckgläser mit Glasdeckel (siehe Kap. 3.1.2). 3.3.2.1 Abhärtungsbedingungen Eine Kälteabhärtung der in vitro Kulturen unter definierten Kulturbedingungen erfolgte in einem Klimaschrank mit einer Lichtperiode von acht Stunden und einer Lichtintensität von 37 µmol/m2s bei 22 °C sowie einer Dunkelphase von 16 Stunden bei 0 °C. 3.3.3 Sprosspräparation Für die Kryokonservierung der in vitro Kulturen wurden ca. 1 mm lange, das Meristem enthaltende, Sprossspitzen unter dem Binokular präpariert. Hierbei wurden die 47 Methoden und Material Blattprimordien bis zu dieser Größe vorsichtig entfernt und eine schmale Basis am distalen Ende der Sprossspitze beibehalten. Die Präparation der Explantate fand unter der Sterilbank in einem andauernden Luftstrom (siehe Kap. 3.1.1) statt. Unter diesen Bedingungen kommt es schnell zu einem Austrocknen der Explantate. Um dies zu verhindern, erfolgte die Präparation auf sterilem Filterpapier, getränkt mit WPM- Flüssigmedium und anschließend ein sofortiger Transfer auf ein definiertes Medium in Petrischalen. Es wurden maximal 50 Explantate in einer Petrischale gelagert, um ein weiteres Austrocknen der Sprossspitzen durch das Öffnen der Petrischale zu verhindern. Die Abbildung 19 bis Abbildung 21 zeigen drei Präparationsschritte. Abbildung 19: Präparierte 4 Wochen alte Sprossspitze ca. 20 mm lang Abbildung 20: Präparierte Sprossspitze ca. 11 mm Abbildung 21: Optimal präparierte ca. 1,5 mm lange Sprossspitze 3.3.4 Alginat- / Dehydrationsmethode Als Grundlage für diese Versuchsreihe diente das von REED (2001 a) entwickelte Protokoll für Wildbirne und Johannisbeere (siehe Anhang 7). 21 Tage alte in vitro Kulturen von 48 Methoden und Material Fraxinus excelsior wurden am Ende der Kulturperiode für sieben Tage im Klimaschrank abgehärtet, danach präpariert und auf Standardmedium bis zur Weiterbehandlung am selben Tag gelagert. Die präparierten Sprossspitzen wurden in calciumfreies Flüssigmedium [calciumfreies WPM mit 3 % (w/v) Alginat (siehe Kap. 3.1.3) und 0,75 M Saccharose] überführt und mit dem Medium vorsichtig vermischt. Mit einer sterilen 3 ml Einweg-Plastikpipette (siehe Kap. 3.1.2) wurde jeweils eine Sprossspitze mit Medium aufgenommen und dann ohne Luftblasen in calciumhaltiges Flüssigmedium (WPM mit insgesamt 0,1 M CaCl2 und 0,75 M Saccharose) getropft. Beim Auftreffen des Tropfens koagulieren die beiden Lösungen zu einer Kugel. Die entstandenen Kugeln blieben in der Calciumlösung auf einem Schwenk-Schüttler (80 rpm) für weitere 20 Minuten zum Aushärten. Das Gewicht der Kugeln sollte ca. 50 mg betragen. Die Kugeln wurden über ein Sieb abgegossen und in flüssiges WPM mit 0,75 M Saccharose überführt und dort für 16 Stunden bei 22 °C auf dem Schwenk-Schüttler inkubiert. Nach diesem Schritt der osmotischen Dehydration erfolgte ein Trocknen der Kugeln auf sterilem Filterpapier über Silicagel für fünf Stunden bis zu einem Wassergehalt von 20 bis 25 %. Hierzu wurde zuerst das Oberflächenwasser der Kugeln auf sterilem Filterpapier entfernt. Anschließend wurden jeweils zehn Kugeln mit 50 g sterilem Silicagel, überdeckt mit sterilem Filterpapier, in Petrischalen platziert. Die Petrischalen wurden mit Parafilm verschlossen und bei 22 °C in der Werkbank aufbewahrt. Nach dem Trocknen wurden die zehn Kugeln in 2 ml Kryoröhrchen (siehe Kap. 3.1.2) gegeben, verschlossen und direkt in flüssigen Stickstoff getaucht. Die Proben wurden für mindestens eine Stunde in flüssigem Stickstoff gehalten und dann bei Raumtemperatur über den Zeitraum von zwei Stunden erwärmt. Anschließend erfolgte eine Rehydration der Kugeln in flüssigem WPM mit 1,2 M Saccharose (Regenerationslösung) für 20 Minuten und die Überführung auf Regenerationsmedium [Standardmedium mit 0,1 % weniger Agar (0,7 % w/v)]. 3.3.4.1 Bestimmung des Wassergehaltes der Kugeln Der Wassergehalt der Kugeln wurde nach folgender Formel aus der Differenz von Frischgewicht (Fg) und Trockengewicht (Tg) bestimmt: Fg - Tg × 100 / Fg Zur Bestimmung des Trockengewichtes wurden die Kugeln für 16 Stunden bei 103 °C in einem Trockenschrank getrocknet und dann für eine Stunde in einem Exsikkator abgekühlt. 49 Methoden und Material 3.3.4.2 Bestimmung der Regeneration nach den einzelnen Behandlungsschritten Um die Regenerationsrate nach den einzelnen Behandlungsschritten zu bestimmen, wurden nach jedem Schritt Kugeln für 20 Minuten in Regenerationslösung inkubiert und dann auf Regenerationsmedium gesetzt. Die Auswertung erfolgte nach acht Wochen. 3.3.5 Vitrifikationsmethode mit PVS2 Als Grundlage für die Versuche zur Entwicklung eines Kryokonservierungsprotokolls mit Hilfe der Vitrifikationsmethode mit PVS2 diente ebenfalls ein von REED (2001 a) entwickeltes Protokoll für Wildbirne und Johannisbeere (siehe Anhang 8). In den folgenden Versuchen (siehe Kap. 3.3.5.2 bis 3.3.5.7) wurde die Methode von REED abgewandelt und Schritt für Schritt optimiert. Die Versuche erfolgten zuerst an juvenilem Material und wurden dann für adultes Material optimiert. 3.3.5.1 Erwärmung und Regeneration der Proben Die Probenröhrchen wurden aus dem flüssigen Stickstoff genommen und sofort für eine Minute in 43 °C und dann zehn Sekunden in 22 °C warmes Wasser gehalten. Anschließend wurde die PVS2-Lösung sehr schnell mit einer Pipette abgenommen und mit der Regenerationslösung (flüssiges WPM mit 1,2 M Saccharose) aufgefüllt. Die Sprossspitzen wurden viermal mit dieser Lösung gespült, dann auf steriles Filterpapier gelegt und von dort auf Regenerationsmedium überführt. Proben, die nach einem der Vorbehandlungsschritte auf ihre Regeneration getestet werden sollten, wurden ebenfalls viermal mit der Regenerationslösung gespült. Die abschließende Bonitur erfolgte nach acht Wochen. Als Regenerationsmedium wurde WPM mit 2 mg/l BAP, 0,15 mg/l IBA und 0,7 % (w/v) Agar in Petrischalen benutzt. Ein Transfer der Sprossspitzen auf frische Stellen des Mediums erfolgte am ersten, siebten und 14. Tag. Nach zwei Wochen wurden die Sprossspitzen auf Standardmedium überführt. Sobald sich neue Triebe und Blätter bildeten, spätestens jedoch nach vier Wochen, erfolgte der Transfer der Sprosse auf Standardmedium in Weckgläsern. Bis zur achten Woche wurden die Sprosse alle zwei Wochen auf frisches Medium gesetzt. 50 Methoden und Material 3.3.5.2 Einfluss zweier Vorbehandlungslösungen (BSA und Glycerol) auf die Regeneration juveniler Kulturen nach Kryokonservierung Juvenile in vitro Kulturen (Klon 129-6.2 und 16.1.1) wurden für 28 Tage unter Kultur- und für sieben Tage unter Abhärtungsbedingungen kultiviert. Danach erfolgte eine Vorkultur der präparierten Sprossspitzen für zwei Tage bei 4 °C auf DMSO-Medium [WPM mit 5 % (v/v) DMSO, 3 % (w/v) Saccharose und 0,8 % (w/v) Agar]. Für die Vorbehandlung von jeweils zehn Sprossspitzen fanden drei Varianten Anwendung: Zwei Stunden auf Eis in 1 ml einer 1 % (w/v) BSA-Lösung, 20 Minuten bei 22 °C in 1 ml einer 2 M Glycerollösung mit 0,4 M Saccharose oder gar keine Vorbehandlung. Bei beiden aktiven Vorbehandlungen diente flüssiges WPM in 2 ml Kryoröhrchen als Lösungsmittel. Danach wurde die Lösung mit einer 1 ml Eppendorfpipette abgenommen und durch 1,5 ml PVS2- Lösung ersetzt [30 % (w/v) Glycerol, 15 % (w/v) Ethylenglykol, 15 % (w/v) DMSO und 0,4 M Saccharose, aufgefüllt mit flüssigem WPM]. Die Inkubation erfolgte für 20 Minuten auf Eis, gefolgt von einer sofortigen Überführung in flüssigen Stickstoff. Die Regenerationsrate wurde sowohl nach der PVS2-Inkubation als auch nach der Überführung in flüssigen Stickstoff ermittelt. 3.3.5.3 Optimierung der Kulturperiode für die Kryokonservierung von juvenilen Kulturen Die juvenile in vitro Kultur, Klon 129-6.2, wurde für 16, 21, 28 und 35 Tage inklusive einer Abhärtungsperiode von sieben Tagen kultiviert. Danach erfolgte eine Vorkultur der präparierten Sprossspitzen für zwei Tage bei 4 °C auf DMSO-Medium. Die Vorbehandlung von jeweils zehn Sprossspitzen fand für 20 Minuten bei 22 °C in 1 ml der 2 M Glycerollösung (siehe Kap. 3.3.5.2) statt. Danach wurde die Glycerollösung durch 1,5 ml PVS2-Lösung ersetzt, und es erfolgte eine Inkubation für 20 Minuten auf Eis mit anschließender Überführung in flüssigen Stickstoff. 3.3.5.4 Optimierung des Abhärtungszeitraumes und des Vorkulturmediums für die Kryokonservierung von juvenilen Kulturen Die juvenile in vitro Kultur, Klon 129-6.2, wurde für 28 Tage ohne Abhärtung oder inklusive einer Abhärtungsperiode von sieben oder 14 Tagen kultiviert. Die präparierten Sprossspitzen wurden entweder direkt in die Vorbehandlungslösung überführt oder alternativ für zwei Tage bei 4 °C auf Standardmedium, DMSO-Medium oder auf in 51 Methoden und Material flüssigem DMSO-Medium getränkten Filterpapier inkubiert. In allen Fällen erfolgte eine Vorbehandlung der Sprossspitzen für 20 Minuten bei 22 °C in 1 ml der 2 M Glycerollösung (siehe Kap. 3.3.5.2). Danach wurde die Glycerollösung durch 1,5 ml PVS2-Lösung ersetzt und es erfolgte eine Inkubation für 20 Minuten auf Eis mit anschließender Überführung in flüssigen Stickstoff. 3.3.5.5 Langzeitlagerung in flüssigem Stickstoff von fünf juvenilen Kulturen Fünf juvenile in vitro Kulturen wurden für 28 Tage inklusive einer Abhärtungsperiode von zehn Tagen kultiviert. Danach erfolgte eine Vorkultur der präparierten Sprossspitzen für zwei Tage bei 4 °C auf Standardmedium mit anschließender Inkubation der Sprossspitzen für 20 Minuten bei 22 °C in 1 ml der 2 M Glycerollösung (siehe Kap. 3.3.5.2). Danach wurde die Glycerollösung durch 1,5 ml PVS2-Lösung ersetzt und es erfolgte eine Inkubation für 20 Minuten auf Eis mit anschließender Überführung in flüssigen Stickstoff. Die Proben wurden nach einem Lagerungszeitraum von einem Tag, drei Monaten und sechs Monaten erwärmt, wobei 60 bis 100 Sprossspitzen zur Langzeitlagerung erhalten wurden. 3.3.5.6 Vergleich der Regenerationsfähigkeit von juvenilen und adulten Kulturen nach dem für juvenile Kulturen optimierten Kryokonservierungsprotokoll Zwei juvenile (Klon 129-6.2 und 16.1.1) und zwei adulte in vitro Kulturen (Klon 77-23 und 77-3) wurden für 28 Tage inklusive einer Abhärtungsperiode von zehn Tagen kultiviert. Danach erfolgte eine Vorkultur der präparierten Sprossspitzen für zwei Tage bei 4 °C auf Standardmedium mit anschließender Inkubation der Sprossspitzen für 20 Minuten bei 22 °C in 1 ml der 2 M Glycerollösung (siehe Kap. 3.2.5.2). Danach wurde die Glycerollösung durch 1,5 ml PVS2-Lösung ersetzt und es erfolgte eine Inkubation für 20 Minuten auf Eis mit anschließender Überführung in flüssigen Stickstoff. 3.3.5.7 Optimierung der Kulturperiode, der Vorkultur und der PVS2-Inkubation für die Kryokonservierung von adulten Kulturen Die Subkulturdauer wurde bei den getesteten adulten Kulturen (Klon 77-2, 77-5, 77-19 und 77 3) von 28 auf 33 Tage erhöht, da sie ein langsameres Wachstum in vitro zeigten. Eine Kälteabhärtung erfolgte in den letzten zehn Tagen der Subkulturphase. Danach wurden die Sprossspitzen präpariert und auf Standardmedium für zwei Tage bei 4 °C auf ein 0,8 M 52 Methoden und Material Glycerolmedium [WPM mit 0,8 M Glycerol, 0,4 M Saccharose und 0,8 % (w/v) Agar] transferiert. Die weitere Vorbehandlung erfolgte für 20 Minuten bei 22 °C in 1 ml der 2 M Glycerollösung (siehe Kap. 3.3.5.2). Im nächsten Schritt wurde die Glycerollösung durch 1,5 ml PVS2-Lösung ersetzt, dann die Sprossspitzen für 20 oder 25 Minuten in dieser Lösung auf Eis inkubiert und anschließend in flüssigen Stickstoff überführt. Um den Einfluss der Vorkultur zu testen, wurden Sprossspitzen des Klons 77-3 sowohl auf dem beschriebenen Glycerol- als auch auf dem bisherigen Standardmedium inkubiert. In diesem Versuch erfolgte eine Inkubation in der PVS2-Lösung für 25 Minuten. 3.3.5.8 Langzeitlagerung von neun adulten Kulturen in flüssigem Stickstoff Neun adulte in vitro Kulturen wurden für 33 Tage inklusive einer Abhärtungsperiode von zehn Tagen kultiviert. Danach erfolgte eine Vorkultur der präparierten Sprossspitzen für zwei Tage bei 4 °C auf 0,8 M Glycerolmedium mit anschließender Inkubation der Sprossspitzen für 20 Minuten bei 22 °C in 1 ml der 2 M Glycerollösung (siehe Kap. 3.3.5.2). Danach wurde die Glycerollösung durch 1,5 ml PVS2-Lösung ersetzt und es erfolgte eine Inkubation für 25 Minuten auf Eis mit anschließender Überführung in flüssigen Stickstoff. Die Proben wurden nach einem Lagerungszeitraum von einem Tag auf ihre Regenerationsfähigkeit getestet. 60 bis 100 Sprossspitzen pro Klon wurden langfristig eingelagert und in einer angelegten Datenbank erfasst. 3.3.5.9 Optimiertes Kryokonservierungsprotokoll für juvenile und adulte in vitro Kulturen von Fraxinus excelsior Kulturalter: Bei juvenilen Kulturen ca. 28 Tage, bei adulten 33 bis 35 Tage, stets in Abhängigkeit von der Wüchsigkeit des Klons. Abhärtung: Die letzten sieben Tage des Kulturzyklus wurden die Kulturen unter Abhärtungsbedingungen auf Standardmedium kultiviert. Präparation: Die Sprossspitzen wurden auf eine Größe von ca. 1 mm präpariert. Vorbehandlungsmedium: Präparierte Sprossspitzen wurden für zwei Tage bei 4 °C auf ein 0,8 M Glycerolmedium [WPM mit 0,8 M Glycerol. 0,4 M Saccharose und 0,8 % (w/v) Agar] transferiert. Vorbehandlung: 1 ml der Vorbehandlungslösung [WPM mit 2 M Glycerol und 0,4 M Saccharose] wurde in 2 ml Kryoröhrchen gefüllt, danach wurden maximal zehn 53 Methoden und Material Sprossspitzen dazu gegeben. Die Röhrchen mit den Sprossspitzen wurden geschüttelt, so dass alle Sprossspitzen auf den Boden des Röhrchens absanken. Die Inkubation der Sprossspitzen erfolgte für 20 Minuten bei 22 °C. PVS2-Behandlung: Abnahme der Glycerollösung mit einer 1 ml Eppendorf-Pipette und Auffüllen der Röhrchen mit 1,5 ml der PVS2-Lösung. Die Röhrchen wurden für 25 Minuten auf Eis gehalten. Einlagerung: Nach der Inkubation in der PVS2-Lösung wurden die Kryoröhrchen schnell in einen Aluminium-Röhrchenhalter eingespannt und sofort in flüssigen Stickstoff getaucht. Erwärmung und Regeneration: Die Erwärmung erfolgte für eine Minute in 43 °C und zehn Sekunden in 22 °C warmem Wasser. Anschließend wurde die PVS2-Lösung sehr schnell abgenommen und mit der Regenerationslösung (flüssiges WPM mit 1,2 M Saccharose) aufgefüllt. Nach viermaligem Spülen der Sprossspitzen erfolgte eine Überführung auf steriles Filterpapier und der Transfer auf Regenerationsmedium. 3.4 Beschreibung des Versuchsdesigns und statistische Auswertung Die Wiederholungen verschiedener Versuchsreihen wurden zu verschiedenen Zeitpunkten durchgeführt. Das heißt, bestimmte Faktoren wie Alter der Pfropflinge oder der Mutterbäume bzw. das totale Kulturalter etablierter Kulturen waren nicht identisch. Die Etablierungsversuche für adulte Kulturen wurden nicht unter den selben Bedingungen wiederholt, da sie nur jährlich, in Abhängigkeit zu der Vegetationsperiode, durchgeführt werden konnten. Um eine Entwicklung der Methoden innerhalb der drei Versuchsjahre zu gewährleisten, musste jeweils mit den optimierten Methoden weitergearbeitet werden. Kulturen wurden als etabliert bezeichnet, wenn die Explantate ein Ergrünen, Blattbildung und vor allem eine Sprossstreckung zeigten. Die Vermehrungsraten wurden über eine Subkulturzeit von fünf Wochen und mindestens sechs Transfers bestimmt. Pro Kultur wurde mit anfänglich 32 Sprossen begonnen. Alle Bewurzelungsversuche wurden mit mindestens zehn Sprossen durchgeführt und dreimal wiederholt. 54 Methoden und Material Die Versuchsreihen zur Kryokonservierung von Fraxinus excelsior wurden dreimal wiederholt mit jeweils zehn bis 15 Sprossspitzen pro Behandlung. Die Regeneration verschiedener Genotypen nach der Einlagerung in eine Kryogenbank wurde einmal durchgeführt. Pro Test wurden mindestens zehn Sprossspitzen eingelagert. Durch den Austausch der PVS2-Lösung mit einer 1 ml Eppendorf-Pipetten kam es regelmäßig zum Verlust einiger Sprossspitzen, so dass für die Ermittlung der Regeneration in einigen Fällen nur sechs Sprossspitzen zur Verfügung standen. Die Bonitur aller Versuche erfolgte acht oder zwölf Wochen nach dem Erwärmen. Die statistische Auswertung erfolgte durch Bestimmung der Mittelwerte und des Standardfehlers des Mittelwertes (SEM). Signifikante Mittelwertunterschiede wurden mit einer Irrtumswahrscheinlichkeit von p ≤ 0,05 bestimmt. Für den Vergleich zweier unabhängiger Stichproben wurde der t-Test nach Student (t-Test) benutzt. Bei mehr als zwei unabhängigen Stichproben wurden multiple Mittelwertvergleiche mit Hilfe des Tuckey Tests durchgeführt. Eine Varianzanalyse mit Hilfe des F-Tests wurde durchgeführt, um den Einfluss von einer oder mehreren unabhängigen Variablen auf eine abhängige Variable zu untersuchen und Haupteffekte zu bestimmen. Alle statistischen Auswertungen wurden mit dem Computerprogramm SPSS 11.5 an der Niedersächsischen Versuchsanstalt in Escherode durchgeführt. 55 Ergebnisse 4 Ergebnisse 4.1 In vitro Vermehrung von Fraxinus excelsior 4.1.1 Etablierung und Vermehrung von juvenilen Sprosskulturen aus zygotischen Embryonen 95 % der präparierten Embryonen entwickelten sich zu jungen Sämlingen, aus denen in vitro Kulturen etabliert werden konnten. Insgesamt wurden im Jahr 2001 und 2002 juvenile Kulturen aus Embryonen von sieben verschiedenen Einzelbaumabsaaten etabliert und standen für Versuche zur in vitro Vermehrung und Kryokonservierung zur Verfügung (siehe Anhang 2). 4.1.2 Etablierung adulter Kulturen mit Explantaten, geworben von den Mutterbäumen Die Etablierungsversuche mit Explantaten, die direkt von den Mutterbäumen geworben wurden, führten nur bei zwei Klonen zu einer in vitro Etablierung und Vermehrung. Aufgrund dieser geringen Ausbeute, verglichen mit dem hohen Aufwand der Reiserwerbung an den Mutterbäumen, wurde diese Methode nicht weiter verfolgt. Ein weiterer Grund hierfür stellte das begrenzte Ausgangsmaterial dar. Das Wachstum des Mutterbaumes durfte durch Werbung von Reisern nicht beeinflusst werden. Die einzelnen Ergebnisse sind in Kapitel 4.1.2.1 und 4.1.2.2 dargestellt. 4.1.2.1 Oberflächensterilisation, Präparation und Etablierung frischer Triebe von Mutterbäumen Betrachtet man die Kontaminationen der Explantate nach einer Oberflächensterilisation mit Natriumhypochlorit in Abhängigkeit zu den verschiedenen Spülzeiten, wird deutlich, dass ein intensives Spülen der Explantate zwischen den beiden Sterilisationsphasen eine Abnahme der Kontaminationen bewirkt (siehe Tabelle 6). Bei einem zweimaligen Waschen von jeweils zehn Minuten zwischen den Sterilisationsdurchgängen und einer Oberflächensterilisation mit 1,5 % (v/v) NaOCl lag der Prozentanteil der Kontaminationen bei 94 %. Bei einer Erhöhung der Waschdauer auf 56 Ergebnisse zweimal 1,5 h sank er auf durchschnittlich 68 % ± 6 %. Die Behandlung mit 0,1 % HgCl2 hatte bei derselben Spüldauer eine völlig unzureichende Oberflächensterilisation mit 100 % Kontaminationen zur Folge. Tabelle 6: Etablierungsergebnisse von in vitro Kulturen aus jungen Trieben ausgewählter Plusbäume. Die Oberflächensterilisation erfolgte durch Inkubation der Explantate für eine Minute in 70 % (v/v) Ethanol gefolgt von zweimal 15 Minuten in dem jeweiligen Sterilisationsmittel. Am Ende eines jeden Verfahrens wurden die Explantate dreimal fünf Minuten in sterilem Leitungswasser gespült, auf sterilem Filterpapier präpariert und entweder direkt auf Medium aufgesetzt oder für eine Woche in flüssigem MS-Medium aufbewahrt. Die Auswertung erfolgte nach acht Wochen. Sterilisations- mittel Spülzeit Medium ** Datum Klon n Expl. n braun n Kont. n Ergrünen/ Kallus 1,5 % NaOCl 2 × 10 min 14/31 14/4 18.05.01 4 32 6 % 94 % 0 % 1,5 % NaOCl 2 × 1,5 h 14/3 14/4 18.05.01 4 32 0 % 59 % 41 % 1,5 % NaOCl 2 × 1,5 h 14/3 14/4 21.05.01 3 47 26 % 74 % 0 % 1,5 % NaOCl 2 × 1,5 h 14/31 14/5 31.05.01 4 93 4 % 71 % 25 % 0,1 % HgCl2 2 × 1,5 h 14/31 14/5 01.06.01 4 73 - 100 % 0 % 0,1 % HgCl2 2 × 1,5 h *14/31 *14/5 07.06.01 5 70 1 % 99 % 0 % 3 % NaOCl 2 × 1,5 h *14/31 *14/5 06.06.01 4 48 8 % 92 % 0 % n: Anzahl, Expl. = Explantat, Kont. = Kontamination, *1 Woche in flüssigem MS-Medium **Definition der Medien siehe Methoden Kap. 3.2.5.1, Tabelle 3 Die in der Literatur (ARRILAGA et al. 1992, PREECE et al. 1987) angegebene Inkubation der Explantate in flüssigem Medium förderte das Wachstum der Bakterien und führte durch Kontakt aller Explantate mit demselben Nährmedium zu verstärkten Kontaminationen. Trotz einer Erhöhung der Konzentration des Sterilisationsmittel NaOCl von 1,5 auf 3 % kam es bei diesem Versuch zu Kontaminationen von 92 %. Der Transfer der Explantate auf unterschiedliche Etablierungs- und Vermehrungsmedien zeigte keine auswertbaren Unterschiede. Auf allen Medien zeigten Klone Austriebe an den Apikal- und an den Achselknospen. Zum Teil bildete sich auch Kallus, aber in keinem Fall kam es zur Sprossneubildung. Die Auswertung der dargestellten Versuche zeigt, dass weder die gewählten Sterilisationsverfahren noch die getesteten Etablierungsmedien zu einem effektiven in vitro Protokoll führen würden. 57 Ergebnisse 4.1.2.2 Oberflächensterilisation, Präparation und Etablierung ruhender Knospen von Mutterbäumen Erste Versuche mit ruhenden Knospen von Fraxinus excelsior wurden im August und September 2001 durchgeführt. Es stellte sich heraus, dass die im Freiland gewonnenen Knospen in hohem Maße mit Pilzen und Bakterien kontaminiert waren. 93 % der ohne Wasserbad behandelten Explantate wiesen Kontaminationen mit einem großen Anteil an Pilzinfektionen auf. Eine Ursache hierfür kann in dem Aufbau der Knospen liegen. Die eng aneinander liegenden schwarzen, festen und relativ großen Schuppen, die filzig mit schwarzen Haaren versehen sind, können das Eindringen der applizierten Sterilisationslösungen in die inneren Bereiche der Knospe verhindern. Bakterien und Pilzsporen werden somit nur unzureichend abgetötet. Ein Wasserbad der Reiser für 16 Stunden bei 37 °C Grad vor der Oberflächensterilisation sollte ein Auskeimen der Pilzsporen und ein Aufweichen der braunen Schuppenknospen bewirken, so dass in dem darauf folgenden Oberflächensterilisationsverfahren das Natriumhypochlorit besser wirken konnte.Tabelle 7 zeigt den Erfolg dieser Methode. Durch das vorangehende Wasserbad wurden die Kontaminationen bei einer Oberflächensterilisation mit 3 % NaOCl von 93 % signifikant auf 50 % gesenkt. Pilzkontaminationen waren nicht mehr zu beobachten. Tabelle 7: Darstellung der mittleren Kontaminationen in Abhängigkeit von der Konzentration des Sterilisationsmittels und der Vorbehandlung. Die Sterilisation erfolgte für eine Minute in 70 % Ethanol gefolgt von einer zweimaligen Behandlung in 3 oder 5 % (v/v) NaOCl-Lösung. Zwischen den Behandlungsschritten wurde ein Spülgang in sterilem Leitungswasser für 60 Minuten durchgeführt. Nach abschließendem dreimaligen Spülen in sterilem Leitungswasser wurden die Explantate auf sterilem Filterpapier abgetropft und auf Medium überführt. Sterilisationsmittel Vorbehandlung Mittelwert [%] SEM [%] Versuchsreihen n Explantate n 3 % NaOCl ohne Wasserbad 92,70 a 4,90 10 8-30 Wasserbad 49,50b 8,26 8 5-27 5 % NaOCl ohne Wasserbad 76,67 c 6,15 6 5-10 Wasserbad 30,38d 7,82 8 5-29 a, b, c, d Mittelwerte mit verschiedenen Buchstaben sind signifikant (p ≤ 0,05) unterschiedlich. Eine Erhöhung der Konzentration des Sterilisationsmittels von 3 auf 5 % brachte eine zusätzliche signifikante Verringerung der Kontaminationen auf 30 %. Trotzdem lag die Überlebensrate innerhalb der ersten acht Wochen bei beiden Methoden unter 10 %. 58 Ergebnisse Winterknospen, die ohne vorhergehendes Wasserbad oberflächensterilisiert wurden, zeigten eine Überlebensrate von durchschnittlich 4 % und jene, die mit einem Wasserbad inkubiert wurden von 7 %. Das Hauptproblem lag in der Verbräunung der präparierten Knospen und der geringen Regeneration. Alle präparierten Explantate waren nach zwölf Wochen abgestorben. 4.1.2.2.1 Einfluss des Werbungsdatums auf die Regeneration von Winterknospen In sieben Versuchsmonaten wurden insgesamt 711 Explantate von 25 verschiedenen Mutterbäumen oberflächensterilisiert und auf Etablierungsmedium überführt. Explantate von Reisern, die in den Monaten September, Oktober und November geworben wurden, zeigten keine Knospenöffnung und nur ein geringes Ergrünen der Knospenschuppen auf Etablierungsmedium und in wenigen Fällen Wachstum in Form von Kallusbildung (siehe Abbildung 22, 1. Sep., 1. Okt., 5. Nov.). Es kam zu einem schnellen Verbräunen dieser Knospen innerhalb der ersten acht Wochen (siehe Abbildung 23, 1. Sep., 1. Okt., 5. Nov.). Explantate aus den Monaten Dezember, Januar und März zeigten in den ersten vier Wochen ein besseres Wachstum durch verstärktes Öffnen der Knospen und Austreiben von kleinen Blättern aus der Knospe (siehe Abbildung 22, 5. Dez., 2. Jan., 6. März.). Eine Sprossstreckung, die für eine in vitro Vermehrung wichtig ist, blieb bei der Mehrzahl der Klone aus. Acht Wochen nach der Etablierung waren die Explantate von allen Klonen bis auf zwei verbräunt (siehe Abbildung 23). Die hohe Kontamination der Explantate, die im Mai geworben wurden (siehe Abbildung 22, Abbildung 23) lässt sich durch das leichte Öffnen der Knospen zu diesem Zeitpunkt erklären. Durch das wärmere Wetter und das Einsetzen des Sprosswachstums wurde auch eine erhöhte Vermehrung von Bakterien hervorgerufen. In Abbildung 22 und Abbildung 23 sind drei normalerweise unabhängige Parameter in Abhängigkeit zueinander dargestellt. Dies war aus arbeitstechnischen Gründen notwendig, da kontaminierte Explantate sofort verworfen wurden. Der Anteil an Kontaminationen bezieht sich auf den absoluten Anteil unabhängig davon, ob Wachstum oder ein Verbräunen auftrat. Unter verbräunten Explantaten sind nur die zu verstehen, die weder kontaminiert waren noch Wachstum zeigten. Bei der Vielzahl an Explantaten und der zielgerichteten Fragestellung nach einer erfolgreichen Etablierung, wurde nicht 59 Ergebnisse berücksichtigt inwieweit Pflanzen die Ergrünen oder Verbräunen einen unterschiedlichen Anteil an Kontaminationen zeigen. 0% 25% 50% 75% 100% 1. S ep. 1. O kt. 5. N ov. 5. D ez. 2. Jan. 6. M ärz 6. M ai 4 Wochen Kontaminationen braun Ergrünen/Knospenöffnung/Kallusbildung Abbildung 22: Darstellung des Ergrünens bzw. der Knospenöffnung oder Kallusbildung sowie der Kontaminationen und der Verbräunung der oberflächensterilisierten Explantate in Abhängigkeit des Werbungsdatums der Reiser nach vier Wochen 0% 25% 50% 75% 100% 1. S ep. 1. O kt. 5. N ov. 5. D ez. 2. Jan. 6. M ärz 6. M ai 8 Wochen Kontaminationen braun Blattbildung/Sprossstreckung Abbildung 23: Darstellung des Wachstums sowie der Kontaminationen und der Verbräunung der oberflächensterilisierten Explantate in Abhängigkeit des Werbungsdatums der Reiser nach acht Wochen 60 Ergebnisse Wie in der Veröffentlichung von SILVEIRA and COTTIGNIES (1994) zeigt sich in den durchgeführten Versuchsreihen die Tendenz, dass der Werbungsmonat den Erfolg der Etablierung beeinflusst. Vergleicht man die Temperaturentwicklung von September 2001 bis Mai 2002 mit der Regeneration der Knospen innerhalb der ersten vier Wochen erkennt man, dass es nach dem ersten Frost im November (siehe Tabelle 8) zu einem Anstieg des Ergrünens und der Knospenöffnung im Dezember, Januar und März kam (siehe Abbildung 22). Tabelle 8: Frosttage im Raum Göttingen in den Monaten August 2001 bis April 2002 aufgelistet vor dem jeweiligen Etablierungsdatum (Quelle: Wetterstation Göttingen). Monat Aug. 01 Sep. 01 Okt. 01 Nov. 01 Dez. 01 Feb. 02 März 02 April 02 Frosttage 0 0 0 4 17 7 6 6 4.1.3 Etablierung adulter Kulturen aus Explantaten von Pfropflingen der Mutterbäume Pfropflinge der Mutterbäume erwiesen sich als optimale Explantatquelle zur Etablierung neuer adulter Kulturen. Durch Optimierung der Oberflächensterilisationsmethode, des Etablierungszeitpunktes sowie des Mediums konnte ein optimiertes Etablierungsprotokoll entwickelt werden. Die einzelnen Ergebnisse der durchgeführten Versuche sind in Kapitel 4.1.3.1 bis 4.1.3.4 dargestellt. 4.1.3.1 Einfluss des Sterilisationsmittels auf Kontaminationen der Explantate Versuche zur Optimierung des Sterilisationsmittels ergaben eine signifikant (t-Test) höhere Verbräunung der Explantate die mit 2 % NaOCl sterilisiert wurden, verglichen mit einer Oberflächensterilisation mit Quecksilberdichlorid (siehe Abbildung 24). Nach zwölf Wochen zeigten ca. 27 % der Explantate, die mit HgCl2 und ca. 14 %, die mit 2 % NaOCl sterilisiert wurden, sichtbares Wachstum, dass sich in einer Sprossstreckung und Blattbildung manifestierte. Aufgrund dieser Ergebnisse wurde für weiterführende Versuche HgCl2 als Oberflächensterilisationsmittel verwendet und NaOCl verworfen. Auch bei diesem Versuch wurden kontaminierte Explantate verworfen und ihre Entwicklung nicht weiterverfolgt. 61 Ergebnisse Abbildung 24: Darstellung des Wachstums, der Kontaminationen und des Verbräunens der Explantate zwölf Wochen nach der Sterilisation mit der jeweiligen Sterilisationsmethode. Die Balken stellen die Mittelwerte dar, die Fehlerbalken den Standardfehler des Mittelwertes. Balken mit verschiedenen Buchstaben (a, b) sind signifikant (p ≤ 0,05) unterschiedlich. 4.1.3.2 Einfluss der Umweltfaktoren auf Kontaminationen der Explantate Die Abschirmung der Pfropflinge vor zusätzlichen Umwelteinflüssen während des Austriebes bewirkte eine Reduktion der Kontaminationen. Explantate der Pfropflinge, die im Gewächshaus angetrieben wurden, zeigten signifikant (t-Test) geringere Konta- minationen (26 ± 3 %) bei der Verwendung von 0,2 % HgCl2 als die Explantate der Freilandpfropflinge (84 ± 23 %). 4.1.3.3 Einfluss der Jahreszeit auf Kontaminationen der Explantate Es zeigte sich, dass ein Transfer der Pfropflinge nur mit vollständig geschlossenen ruhenden Knospen zu einer Reduktion der Kontaminationen führte. Abbildung 25 zeigt einen Anstieg der Kontaminationen bei dem letzten Etablierungsversuch am 10.06.2003. Die entsprechenden Pfropflinge wurden Anfang Mai mit schon leicht geöffneten Knospen in das Gewächshaus transferiert, während bei den vorhergehenden Etablierungsversuchen die Knospen vollständig geschlossen und noch nicht angeschwollen waren. Abbildung 25 stellt den Anstieg der Kontaminationen in Abhängigkeit zu dem Etablierungsdatum dar. 62 Ergebnisse 25 24 25 32 71 6 22 17 10 6 69 54 58 58 23 0 20 40 60 80 100 04.04. 10.04. 24.04. 06.05. 10.06. [% ] Wachstum braun kontaminiert Abbildung 25: Darstellung der Kontaminationen, des Wachstums und des Verbräunens in Abhängigkeit des Etablierungsdatums. Die Auswertung erfolgte nach acht Wochen. 4.1.3.4 Optimierung der Etablierungsrate durch Zusatz von TDZ Diese Versuchsreihe zeigte nach neun Transfers, dass sowohl der Klon als auch das gewählte Medium den Erfolg der Etablierung bestimmen. Von den getesteten Klonen konnten auf Standardmedium 15 Klone (24 %) etabliert werden und auf Standardmedium mit 0,1 mg/l TDZ 12 Klone (19 %). In fünf Fällen wurden dieselben Klone auf beiden Medien etabliert, so dass insgesamt 21 (34 %) Klone im Jahr 2003 etabliert werden konnten. Bei zwei Klonen zeigten sich signifikante Unterschiede hinsichtlich des benutzten Mediums. Der Zusatz von 0,1 mg/l TDZ führte bei Klon 77-19 zu einer Verbesserung der Vermehrungsrate, bei Klon 77-2 dagegen zu einer Abnahme (siehe Tabelle 9). Tabelle 9: Einfluss von TDZ auf die Vermehrungsrate während der Etablierungsphase zweier Kulturen (Klon 77-2 und 77-19). Die Daten stellen die mittlere Vermehrungsrate ± den Standardfehler des Mittelwertes (SEM) nach neun Transfers auf Standardmedium mit 0,1 mg/l TDZ (+TDZ) oder ohne TDZ (-TDZ) dar. Statistisch signifikante Unterschiede (t-Test) zwischen den Medien (p ≤ 0,05) sind mit einem Stern gekennzeichnet. Klonbezeichnung +TDZ -TDZ Klon 77-2 0,53 ± 0,18* 1,58 ± 0,17 Klon 77-19 2,02 ± 0,10* 1,36 ± 0,27 Hinsichtlich der Explantatquelle zeigte sich auf Standardmedium kein Unterschied im Etablierungserfolg. 21 % der Klone ließen sich aus Achselknospen und 19 % aus Apikalknospen etablieren. Auf Standardmedium mit 0,1 mg/l TDZ konnten dagegen nur 5 % der Klone aus Apikalknospen, aber 16 % aus Achselknospen etabliert werden. 63 Ergebnisse Etablierte Kulturen auf Standardmedium zeigten eine strenge Apikaldominanz, Bildung von wenig Kallus und einen normalen Habitus der Blätter (siehe Kap. 4.1.4.4, Abbildung 29). Etablierte Sprosse auf Standardmedium mit 0,1 mg/l TDZ produzierten mehr Kallus und bildeten neue Sprosse aus den Achselknospen und zum Teil Adventivsprosse. Die Blattform war meist schmal und lanzettförmig (siehe Kap. 4.1.4.4, Abbildung 27). Morphologische Veränderungen der Sprosse auf Standardmedium mit 0,1 mg/l TDZ ließen sich durch Überführung auf Standardmedium wieder rückgängig machen. Ein Nachteil der Vermehrung auf TDZ-Medium war, dass viele der erhaltenen Segmente verbräunten und nicht zu neuen Sprossen regenerierten. Aus diesem Grund wurden weitere Versuche zur Optimierung der TDZ-Konzentration durchgeführt mit dem Ziel einer Steigerung der Vermehrungsrate ohne Änderungen der Blattmorphologie, drohender Hyperhydrizität oder Adventivsprossbildung (siehe Kap. 4.1.4). 4.1.4 Optimierung der Vermehrungsrate von etablierten juvenilen und adulten in vitro Kulturen Durch zahlreiche Versuche zur Verbesserung der Vermehrungsrate konnte ein optimiertes Vermehrungsprotokoll (siehe Kap. 3.2.9) entwickelt werden. Die in diesem Kapitel darge- stellten Versuche zeigten allerdings, dass ausschlaggebend für die Vermehrungsraten der Genotyp war. 4.1.4.1 Wahl des optimalen Basismediums Sprosse, die auf MS-Medium kultiviert wurden, ließen sich weder Vermehren noch Erhalten. Die präparierten Sprosssegmente zeigten eine starke Verbräunung und kein Wachstum. Nach drei Transfers waren die Kulturen abgestorben. Die durchschnittlichen Vermehrungsraten der Sprosskulturen auf den unterschiedlichen Medien sind inTabelle 10 dargestellt. Sprosse, die auf WPM kultiviert wurden, zeigten eine signifikant (p ≤ 0,05) höhere Vermehrungsrate mit einem Mittelwert von 1,34 verglichen mit den mittleren Vermehrungsraten von 0,94 bis 1,04 derjenigen Sprosse, die auf den Medien DKW, QRC / M9, WPM / MS kultiviert wurden. Aus diesem Grund wurde für alle folgenden Versuche WPM als Basalmedium verwendet. 64 Ergebnisse Tabelle 10: Mittlere Vermehrungsraten dreier juveniler Kulturen. Die Sprosse wurden auf folgenden Medien kultiviert: WPM + 4 mg/l BAP + 0,15 mg/l IBA (WPM); DKW + 4 mg/l BAP + 0,15 mg/l IBA (DKW); QRC / M9 + 5,5 mg/l BAP + 0,2 mg/l IBA + 1,1 mg/l TDZ (QRC / M9); WPM / MS + 4mg/l BAP + 0,15 mg/l IBA + 2 mg/l Ascorbinsäure + 1 mg/l Biotin (WPM / MS). Die Daten stellen den Mittelwert und den SEM nach sechs Transfers dar. Werte mit verschiedenen Buchstaben sind signifikant (p ≤ 0,05) unterschiedlich (Tukey). WPM DKW QRC / M9 WPM / MS Vermehrungsrate ± SEM 1,3a ± 0,3 0,98b ± 0,4 1,04b ± 0,4 0,94b ± 0,3 4.1.4.2 Einfluss des verwendeten Cytokinins und des Cytokinin / Auxin- Verhältnisses auf die Vermehrungsrate Die Verwendung unterschiedlicher Cytokininarten hatte einen signifikanten Einfluss (F-Test) auf die Vermehrungsrate. Sprosse, die auf Medium mit Kinetin und IBA kultiviert wurden, zeigten bis auf die Kombination 1/1 eine signifikant geringere Vermehrungsrate im Vergleich zu Sprossen auf Medium mit BAP und IBA (siehe Tabelle 11). Insgesamt ergab die Kombination von 4 mg/l BAP und 0,15 mg/l IBA die beste mittlere Vermehrungsrate mit 1,7 verglichen mit fast allen anderen Kombinationen. Aus diesem Grund wurde für alle folgenden Versuche das Standardmedium weiterverwendet. Tabelle 11: Darstellung der durchschnittlichen Vermehrungsraten der Kultur (16-1.2) auf WPM mit zwei unterschiedlichen Cytokininen (BAP und Kinetin) und jeweils sechs verschiedenen Cytokinin / Auxin-Kombinationen. Der Mittelwert und der SEM wurden nach sechs Transfers bestimmt. Werte mit verschiedenen Buchstaben sind signifikant (p ≤ 0,05) unterschiedlich (Tukey). BAP / IBA - Verhältnis [mg/l] Kombination 1/1 5/3 3/0,5 4/0,15 10/0 10/10 Vermehrungsrate ± SEM 1,24ab ± 0,14 0,87b ± 0,18 1,26ab ± 0,23 1,71a ± 0,20 0,95b ± 0,28 0,77b ± 0,15 Kinetin / IBA - Verhältnis [mg/l] Kombination 1/1 5/3 3/0,5 4/0,15 10/0 10/10 Vermehrungsrate ± SEM 1,28ab ± 0,18 0,73b ± 0,06 0,88b ± 0,14 0,75b ± 0,12 0,77b ± 0,17 0,78b ± 0,17 4.1.4.3 Einfluss des Kulturgefäßes auf die Vermehrungsrate Der Einfluss des Kulturgefäßes auf die Vermehrungsrate war nicht signifikant. In Honiggläsern bildete sich während des Kulturzeitraumes mehr Kondenswasser an den Seitenwänden. Aufgrund der daraus resultierenden höheren Luftfeuchtigkeit zeigten die Kulturen ein stärkeres Längenwachstum, was sich aber nicht in einer signifikant besseren 65 Ergebnisse Vermehrungsrate widerspiegelte. Abbildung 26 verdeutlicht den starken Einfluss des Genotyps auf die Vermehrungsrate. Abbildung 26: Darstellung der mittleren Vermehrungsraten von vier verschiedenen Kulturen (Klone S11, JK47, 16-1.1 und 129-6.2) in Abhängigkeit von dem benutzten Kulturgefäß (WG = Weckglas, HG = Honigglas). Es wurden jeweils sechs Transfers durchgeführt. Der Fehlerbalken stellt den Standardfehler des Mittelwerts dar. 4.1.4.4 Einfluss von TDZ auf die Vermehrungsrate Sprosse auf Standardmedium mit 0,1 mg/l TDZ zeigten nach neun Subkulturen eine signifikant niedrigere mittlere Vermehrungsrate (1,15 ± 0,34) verglichen mit Standardmedium ohne TDZ (1,35 ± 0,31) oder mit 0.01 mg/l TDZ (1,46 ± 0,34). Eine Zugabe von 0,1 mg/l TDZ unterdrückte die Sprossstreckung und führte zur Ausbildung von länglichen und dünnen Blättern. Die Kulturen zeigten für die Vermehrung ungeeignetes buschiges Wachstum (siehe Abbildung 27). Die Applikation einer zehnfach geringeren TDZ-Konzentration (0,01 mg/l) stimulierte den Austrieb der Achselknospen und führte zu einer für die Vermehrung ausreichenden Elongation der Sprosse (siehe Abbildung 28). Sprosse auf Medium ohne TDZ zeigten eine starke Apikaldominanz und keine Verzeigung (siehe Abbildung 29). 66 Ergebnisse Abbildung 27: Morphologie zweier Sprosse des juvenilen Klons 129-61 nach einer Subkultur von fünf Wochen auf Standardmedium mit 0,1 mg/l TDZ, Maßstab in cm Abbildung 28: Morphologie zweier Sprosse des juvenilen Klons 129-61 nach einer Subkultur von fünf Wochen auf Standardmedium mit 0,01 mg/l TDZ, Maßstab in cm Abbildung 29: Morphologie zweier Sprosse des juvenilen Klons 129-61 nach einer Subkultur von fünf Wochen auf Standardmedium ohne TDZ, Maßstab in cm 67 Ergebnisse 4.1.4.5 Einfluss von Agar und TDZ auf die Vermehrungsrate Die Varianzanalyse (F-Test) der Vermehrungsraten der durchgeführten Versuche zeigte keine signifikanten Unterschiede aufgrund der verwendeten Agarkonzentrationen (0,8 oder 0,7 %) und der applizierten TDZ-Konzentrationen (0 oder 0,01 mg/l TDZ). Die Sprosse auf den vier verschiedenen Medien lieferten mittlere Vermehrungsraten zwischen 1,39 und 1,51 (siehe Tabelle 12). Tabelle 12: Mittelwert der Vermehrungsrate ± SEM von Kulturen (Klon T70, 129-6.1, 77-19, 77-12), die auf Medium mit 0,8 % oder mit 0,7 % Agar kultiviert wurden. Zusätzlich wurde das Wachstum der Sprosse auf TDZ-freiem Medium mit dem auf TDZ-haltigem Medium (0,01 mg/l TDZ) verglichen. 0 mg/l TDZ 0,01 mg/l TDZ 0,8 % Agar 1,39 ± 0,31 1,40 ± 0,37 0,7 % Agar 1,43 ± 0,42 1,51 ± 0,46 4.1.4.6 Vergleich der Vermehrungsraten des Standardmediums in Weckgläsern mit einem abgewandelten Medium in Honiggläsern Die Kultivierung der Sprosse auf dem modifizierten Standardmedium mit 0,01 mg/l TDZ und einer geringeren Agarkonzentration (0,7 %) in Honiggläsern bewirkte einen signifikanten Anstieg der Vermehrungsrate auf 2,04 ± 0,15 (t-Test) verglichen mit 1,55 ± 0,10 auf Standardmedium in Weckgläsern (siehe Abbildung 30). Die Vermehrungsrate eines jeden einzelnen Klones war auf dem abgewandelten Medium in Honiggläsern signifikant besser (Tukey) als auf dem bisher benutzten Standardmedium in Weckgläsern. 68 Ergebnisse Abbildung 30: Mittlere Vermehrungsraten einer juvenilen Kultur (Klon 129-6.1) und dreier adulter Kulturen (Klon T70, 77-19, 77-12) über sechs Transfers auf Standardmedium in Weckgläsern (Standardprotokoll) oder Standardmedium mit 0,01 mg/l TDZ und einer geringeren Agarkonzentration (0,7 %) in Honiggläsern (optimiertes Protokoll). Die Fehlerbalken stellen den Standardfehler des Mittelwertes dar. Signifikante Unterschiede (p ≤ 0,05) zwischen den Medien sind durch einen Stern gekennzeichnet. Weiterhin macht dieser Versuch den ontogenetischen Einfluss des Ausgangsmaterials auf die Vermehrungsrate deutlich. Nach zwei Jahren in vitro Kultivierung zeigte die juvenile Kultur 129-6.1 die besten Vermehrungsraten, während die adulten Kulturen 77 19 und 77-12 die niedrigsten aufwiesen. Kultur T70 wurde von unserem Partnerinstitut Teagasc in Irland von einem adulten Baum gewonnen und wird seit mindestens sechs Jahren in vitro kultiviert. Seine Vermehrungsraten entsprechen der juvenilen Kultur 129-6.1 und lassen auf rejuvenilisierende Effekte der in vitro Kultur schließen. Diese werden in der Literatur häufig beschrieben (MEIER DINKEL 1993, BONGA und VON ADERKAS 1992). 4.1.5 Bewurzelung juveniler und adulter etablierter Kulturen Insgesamt ließen sich Mikrostecklinge der gemeinen Esche schlecht in vitro bewurzeln. Nur 10 % der Mikrostecklinge juveniler Kulturen zeigten nach drei Wochen auf Bewurzelungsmedium Wurzeln und keine der adulten Kulturen (siehe Abbildung 31). Die Bewurzelung erfolgte in den meisten Fällen erst nach dem Transfer in Erde (siehe Abbildung 32). 69 Ergebnisse Basis der Mikrostecklinge nach 21 Tagen auf Bewurzelungsmedium juveniler Klon adulter Klon Abbildung 31: Bewurzelung juveniler (Foto links) und adulter Klone (Foto rechts). Nach 21 Tagen auf Bewurzelungsmedium zeigte die juvenile Kultur eine Hauptwurzel, die adulte Kultur zeigte an der Basis des Mikrostecklings nur die Bildung von Kallus. Abbildung 32: Bewurzelter juveniler Mikrosteckling acht Wochen nach dem Transfer in Erde 4.1.5.1 Einfluss von Dunkelheit und IBA-Konzentration auf die Bewurzelung Mikrostecklinge, die für sieben Tage in Dunkelheit gehalten wurden, zeigten eine signifikant höhere Bewurzelung nach dem Transfer in Erde als die Vergleichsgruppe (siehe Abbildung 33). Die applizierte IBA-Konzentration hatte keinen signifikanten Einfluss (F-Test) auf die Bewurzelung. 70 Ergebnisse Abbildung 33: Mittlere Bewurzelung [%] zweier juveniler Kulturen (Klon S8 und 126-103.1) und einer adulten Kultur (Klon T7) acht Wochen nach dem Transfer in Erde. Die Kulturen wurden entweder die ersten sieben Tage in Dunkelheit (Dunkelinkubation) oder unter kontinuierlichen Lichtbedingungen (Kont. Lichtbedingungen) für die gesamten drei Wochen gehalten. Das Bewurzelungsmedium enthielt 1, 3, 5 oder 8 mg/l IBA. Die Fehlerbalken stellen den SEM dar und signifikante Unterschiede (p ≤ 0,05) zwischen den Methoden sind durch einen Stern gekennzeichnet. xq stellt den Mittelwert der Bewurzelung aller in Dunkelheit oder unter kontinuierlichen Lichtbedingungen durchgeführten Versuche dar. 4.1.5.2 Einfluss von IBA und BAP auf die Bewurzelung Der Zusatz von BAP zu dem Bewurzelungsmedium hatte einen signifikanten Einfluss (F-Test) auf die Bewurzelung der verschiedenen Klone nach der Überführung in Erde. Die Bewurzelung der juvenilen Kultur 126-103.1 lag nach der in vitro Kultur auf hormonfreiem Bewurzelungsmedium (Kontrolle) sowie auf Medium mit BAP (+BAP) bei 95-100 % (siehe Abbildung 34). Ohne den Zusatz von BAP (-BAP) und bei IBA- Konzentrationen von 3 und 5 mg/l im Bewurzelungsmedium sank die Bewurzelung nach dem Transfer in Erde auf 75 %. Adulte Kulturen zeigten nach der Kultur auf hormonfreien Kontrollmedium gar keine (Klon 77-2) oder nur geringe (Klon 77-3) Bewurzelung in Erde. Als Standardprotokoll für nachfolgende Bewurzelungsmaßnahmen wurde eine IBA- Konzentration von 2 mg/l und 0,25 mg/l BAP für das Bewurzelungsmedium festgelegt. 71 Ergebnisse Abbildung 34: Mittlere Bewurzelung [%] der juvenilen Kultur (Klon 126-103.1) und zweier adulten Kulturen (Klon 77-2 und 77-3) acht Wochen nach der Überführung in Erde. Die Mikrostecklinge wurden entweder auf Bewurzelungsmedium mit 2, 3 oder 5 mg/l IBA und 0,25 mg/l BAP (+BAP) oder auf dem selben Medium ohne BAP (-BAP) kultiviert. Bei beiden Versuchsreihen diente hormonfreies Bewurzelungsmedium als Kontrolle. Fehlerbalken stellen den Standardfehler des Mittelwertes dar. 4.1.5.3 Einfluss einer zusätzlichen Kultivierung auf Kohlemedium auf die Bewurzelung Wie bei den bisherigen Versuchen war ein signifikanter Unterschied der Bewurzelung in Abhängigkeit zu der benutzten IBA-Konzentration nicht zu erkennen. Der zusätzliche Transfer auf Kohlemedium hatte ebenfalls keinen signifikanten Einfluss. Nach zwei Wochen auf Kohlemedium zeigten ca. 9 % der Sprosse in vitro Wurzeln, die Bewurzelung nach weiteren zwei Monaten in Erde betrug 32 % ± 7 %. Bei den Mikrostecklingen, die direkt vom Bewurzelungsmedium in Erde pikiert wurden, zeigten 1 % der Sprosse Wurzeln in vitro und 38 % ± 7 % nach zwei Monaten in Erde. Insgesamt bewurzelten sich nur juvenile Klone in vitro. Betrachtet man die Ergebnisse, dargestellt in Abbildung 35, erkennt man den signifikanten Effekt des Genotyps auf die Bewurzelung. Die höchsten Bewurzelungsraten beider adulten Kulturen wurden bei diesem Versuch mit geringen IBA-Konzentrationen von 1 oder 2 mg/l erzielt. 72 Ergebnisse Abbildung 35: Bewurzelung des juvenilen Klons S8 und der adulten Klone 77-3 und 77-2 acht Wochen nach dem Transfer in Erde. Die Sprosse wurden entweder für vier Wochen auf Bewurze- lungsmedium mit verschiedenen IBA-Konzentrationen und 0,25 mg/l BAP (Standardbewurzelung) kultiviert oder für vier Wochen auf demselben Bewurzelungsmedien und zusätzlichen zwei Wochen auf Kohlemedium (Kohlemedium). 4.1.5.4 Einfluss verschiedener Auxine und Applikationsformen auf die Bewurzelung Abbildung 36 a zeigt, dass eine Inkubation der Sprosse für zehn Minuten in einer 1 mM IBA-Lösung die höchsten, aber sehr klonabhängigen Bewurzelungsraten von 25 bis 100 % lieferte. Die angefertigten Kontrollen auf dem Standardbewurzelungsmedium führten zu einer Bewurzelung bei allen getesteten Klonen von durchschnittlich 80 % ± 7,75 %. Alle anderen Konzentrationen und die Verwendung von NAA als Auxin (siehe Abbildung 36 b) führten zu einem Fehlen der Bewurzelung bei einigen Klonen. 73 Ergebnisse a b Abbildung 36: Bewurzelung von vier adulten Kulturen (Klon 77-27, 77-3, 77-8 und T70) und einer juvenilen Kultur (Klon S8). Die Basis der Mikrostecklinge wurde für zehn Minuten in eine IBA- (Abb. 36 a) oder NAA-Lösung (Abb. 36 b) mit Konzentrationen von 5 µM, 1 mM oder 12 mM getaucht, danach wurden die Sprosse auf Kohlemedium für eine Woche in Dunkelheit gehalten und nach weiteren zwei Wochen in Erde überführt. In der angelegten Kontrolle wurden die Klone nach der Standardmethode behandelt. Die Bonitur erfolgte nach acht Wochen in Erde. 74 Ergebnisse Da sich die Bewurzelung der getesteten Klone nach einer Inkubation für zehn Minuten in einer 1 mM IBA-Lösung nicht signifikant von den angefertigten Kontrollen unterschied, wurde die bisherige Standardmethode beibehalten und an verschiedenen etablierten Klonen getestet. Die Ergebnisse dieses Bewurzelungsversuchs im Jahr 2004 sind in Abbildung 37 dargestellt. juvenile Klone adulte Klone Abbildung 37: Bewurzelung verschiedener juveniler und adulter Kulturen acht Wochen nach dem Transfer in Erde. Die Sprosse wurden für vier Wochen auf Standardbewurzelungsmedium kultiviert und dann in Erde überführt. Der Fehlerbalken stellt bei Klonen, die mehrmals bewurzelt wurden den Standardfehler des Mittelwertes dar. Die Bewurzelung von juvenilen Klonen lagen im Durchschnitt bei 95 %, die der adulten Klone bei 74 %. Insgesamt zeigten adulte Klone eine starke Klonabhängigkeit des Bewurzelungserfolges. 4.1.6 Ergebnisse der Etablierungs- und Bewurzelungsversuche über die gesamte Projektlaufzeit Insgesamt konnten während der Projektlaufzeit 18 juvenile Kulturen aus sieben Einzelbaumabsaaten etabliert werden. Davon wurden sieben Klone bewurzelt und zwölf als in vitro Kultur im Kühlraum eingelagert (siehe Anhang 2). Der irische Klon S8 wurde ebenfalls bewurzelt und eingelagert. 75 Ergebnisse Mit der in Kapitel 3.2.9 beschriebenen Methode konnten bis zum Projektende im Januar 2005 26 Klone der 62 zur Verfügung stehenden adulten ausgewählten Plusbäume der Eschen Herkunfts-/ Nachkommenschaftsversuche in vitro überführt und zwölf bewurzelt werden (siehe Anhang 5). Die Vermehrungsrate war klonabhängig und lag zwischen eins und zwei. Vermehrungsraten über zwei wurden nur bei einigen Kulturen (z. B. Klon 77-3, 77-23, 519-18, 519-21) erreicht. Weiterhin wurden Kulturen von 12 Klonen als in vitro Kultur im Kühlraum eingelagert (siehe Anhang 5). Im Mai 2005 wurden alle noch vorhandenen adulten in vitro Kulturen mit einer durchschnittlichen Bewurzelung von 86 % in Erde überführt (siehe Anhang 6). In Abbildung 38 ist schematisch das neu entwickelte in vitro Protokoll für Fraxinus excelsior dargestellt. beginnende Sprossentwicklung Bewurzelungsmedium 0,5 konz. MS + 2mg l-1 IBA, 0,25 mg l-1BAP Abbildung 38: Diagramm zur neu entwickelten Methode der vegetativen in vitro Vermehrung der Gemeinen Esche (Fraxinus excelsior L.). 76 Ergebnisse 4.2 Kryokonservierung 4.2.1 Sprosspräparation Optimal präparierte Explantate zeigten nach maximal zwei Wochen eine normale Sprossbildung mit einer geringen Kallusbildung an der Sprossbasis. Bei Schädigung des Sprossmeristems während der Präparation kam es zur Kallusbildung ohne Sprossbildung oder zur Ausbildung von einzelnen Blättern bei meist starker Kallusbildung. Die Regenerationsrate der präparierten Sprossspitzen ist daher sehr abhängig vom Präparateur. Unter optimalen Bedingungen lag sie bei 80 bis 100 %. 4.2.2 Alginat- / Dehydrationsmethode Aufgrund der geringen Regeneration der präparierten Sprossspitzen nach den verschiedenen Vorbehandlungsschritten sowie nach der Lagerung in flüssigem Stickstoff, wurde diese Methode zur Kryokonservierung von Fraxinus excelsior nicht weiterverfolgt und verwendet. In Kapitel 4.2.2.1 und 4.2.2.2 sind die wesentlichen Ergebnisse der Versuche zu dieser Methode dargestellt. 4.2.2.1 Bestimmung des Wassergehaltes der Kugeln Die Größe der Kugeln und die Dauer der Trocknung über Silicagel beeinflusst den Feuchtigkeitsgehalt der einzulagernden Alginatkugeln. Trocknungsversuche der Alginatkugeln zeigten, dass der erforderliche Feuchtigkeitsgehalt von ca. 25 % nach fünf Stunden Trocknung über Silicagel, mit einem Kugelgewicht von 50 bis 60 mg bei der verwendeten Methode am häufigsten erreicht wurde (siehe Tabelle 13). Bei diesem Versuch wurden die Proben als Aliquot gewogen und das Trockengewicht festgestellt, um für weitere Versuche optimale Kugelgrößen und Trocknungszeiten zu ermitteln. 77 Ergebnisse Tabelle 13: Darstellung des Frischgewichts der Alginatkugeln, sortiert nach Gewichtsgruppen und dem dazugehörigen mittleren Feuchtigkeitsgehalt [%] nach fünf Stunden Trocknung über Silicagel. Frischgewicht [mg] n Mittelwert des Frischgewichts [mg ± SEM] Mittelwert des Feuchtigkeitsgehalts nach 5 h Trocknung [% ± SEM] 61-70 5 63,6 ± 1 26 ±1 51-60 25 54,4 ± 3 26 ± 2 41-50 24 44,9 ± 3 23 ± 3 31-40 6 38,0 ± 2 22 ± 2 SEM = Standardfehler des Mittelwertes 4.2.2.2 Bestimmung der Überlebensrate nach einzelnen Behandlungsschritten Während unbehandelte präparierte Sprossspitzen in diesem Versuch eine Regeneration von ca. 80 % zeigten, sank die Regeneration durch die Einkapselung auf ca. 63 %. Ein weiteres Absinken der Regeneration erfolgte durch den Schritt der osmotischen Dehydration in 0,75 M Saccharose. Ein sofortiges Verbräunen der Explantate in den Alginatkugeln zeigte sich nach Trocknungszeiten über Silicagel von vier und fünf Stunden (siehe Tabelle 14). Tabelle 14: Sprossspitzen der juvenilen Kultur des Klons 129-6.2 wurden nach jedem Vorbehandlungsschritt ohne Lagerung in flüssigem Stickstoff auf Regenerationsmedium gesetzt. Die mittlere Regeneration [%] wurde aus drei unabhängigen Versuchen mit mindestens zehn Sprossspitzen pro Behandlung nach acht Wochen ermittelt. Behandlung Präparation Einkapselung Saccharose Trocknung 2 h 4 h 5 h Regeneration [% ± SEM] 80,0 ± 7,1 63,3 ± 4,1 10,0 ± 7,1 6,7 ± 4,1 0 0 Feuchtigkeitsgehalt der Kugeln [% ± SEM] - 81,6 ± 0,8 75,2 ± 0,7 50,2 ± 3,8 28,6 ± 3,7 20,7 ± 3,1 SEM = Standardfehler des Mittelwerts In den Abbildung 39 bis Abbildung 41 ist die Regeneration von Sprossspitzen nach vier Wochen in Abhängigkeit zu der jeweiligen Behandlung beispielhaft dargestellt. 78 Ergebnisse Abbildung 39: Regeneration von Sprossspitzen, die nach der Präparation direkt auf Regenerationsmedium gesetzt wurden. Die Aufnahme erfolgte nach vier Wochen. Abbildung 40: Regeneration von Spross- spitzen, die nach der Präparation in Al- ginatkugeln eingekapselt wurden und danach auf Regenerationsmedium gesetzt wurden. Die Aufnahme erfolgte nach vier Wochen. Abbildung 41: Regeneration von Sprossspitzen, die entsprechend dem Protokoll behandelt und für 4 h auf Silicagel getrocknet wurden. Die Auf- nahme erfolgte nach vier Wochen. Nach Optimierung der Ausgangsbedingungen wie Kulturalter, Abhärtungszeit und Vorbehandlung, die hauptsächlich in den Versuchen zur Vitrifikation mit PVS2-Lösung (siehe Kap. 4.2.3) erfolgten, konnte zu einem späteren Zeitpunkt eine Regeneration juveniler Kulturen von durchschnittlich 23 % nach der Vorbehandlung und 7 % nach der Lagerung in flüssigem Stickstoff erreicht werden. 79 Ergebnisse 4.2.3 Vitrifikationsmethode mit PVS2 Das Ausgangsprotokoll von REED erwies sich für Sprossspitzen verschiedener Kulturen von Fraxinus excelsior als ungeeignet. Durch Optimierung mehrerer die Kryokonservierung beeinflussender Faktoren (siehe Kap. 2.6.3, Abbildung 5) konnte das vorliegende Protokoll so verändert werden, dass sich mit dem jetzigen optimierten Protokoll (siehe Kap. 3.3.5.9) sowohl juvenile als auch adulte Kulturen erfolgreich kryokonservieren ließen (siehe Anhang 2 und 5). Bis Januar 2005 konnten Kulturen von sieben juvenilen und 21 adulten Klonen kryokonserviert werden. Bei 15 Klonen konnte innerhalb der Projektlaufzeit die Regeneration ermittelt werden; nur ein Klon ließ sich nicht regenerieren (siehe Anhang 9). Somit stehen 80 bis 100 Sprossspitzen pro eingelagertem Klon für die Zukunft als hochwertiges Material der Gemeinen Esche und als jederzeit nutzbares Ausgangsmaterial für die Vermehrung zur Verfügung. In den Kapiteln 4.2.3.1 bis 4.2.3.6 sind die wesentlichen Versuche, die zur Entwicklung des ersten existierenden Kryokonservierungsprotokolls für in vitro Kulturen von Fraxinus excelsior geführt haben, dargestellt. 4.2.3.1 Einfluss zweier Vorbehandlungslösungen (BSA und Glycerol) auf die Regeneration juveniler Kulturen nach Kryokonservierung Die Regeneration der Sprossspitzen nach einer Vorbehandlung in Glycerollösung war sowohl nach der Inkubation in der PVS2-Lösung, als auch nach der abschließenden Stickstofflagerung signifikant (Tuckey) besser, verglichen mit der Regeneration nach einer Vorbehandlung in der BSA-Lösung oder gar keiner Vorbehandlung (siehe Tabelle 15). Signifikante Unterschiede der Regeneration zwischen den verschiedenen Genotypen wurden nicht beobachtet. Tabelle 15: Einfluss der Vorbehandlung auf die Sprossregeneration juveniler Kulturen (Klon 129-6.2 und 16-1.1) nach der Inkubation in PVS2-Lösung und Überführung in flüssigen Stickstoff. Es erfolgte entweder gar keine Vorbehandlung, eine Vorbehandlung in der BSA-Lösung für zwei Stunden auf Eis oder eine Vorbehandlung für 20 Minuten in einer Glycerollösung. Die Daten stellen die mittlere Regeneration [%] der beiden Genotypen dar. Signifikante Unterschiede (p ≤ 0,05) zwischen den Vorbehandlungsmethoden sind mit einem Stern gekennzeichnet. Vorbehandlung PVS2 [% ± SEM] PVS2 und LN [% ± SEM] Keine Vorbehandlung 16,5 ± 3,1 0 1 % BSA 10,0 ± 1,7 0 2 M Glycerol + 0,4 M Saccharose 43,3* ± 12,0 34,7* ± 16,2 n = 60 bis 80 Sprossspitzen pro Vorbehandlung, LN = Liquid Nitrogen, SEM = Standardfehler des Mittelwerts 80 Ergebnisse Aufgrund dieser Ergebnisse wurde die BSA-Vorbehandlung verworfen und nur noch die Glycerolvorbehandlung für alle folgenden Versuche weiter verwendet. 4.2.3.2 Optimierung der Kulturperiode für die Kryokonservierung von juvenilen Kulturen Eine Kulturdauer von 28 Tagen inklusive der Abhärtungsperiode von sieben Tagen erwies sich als optimal für die Kryokonservierung von juvenilen Kulturen (siehe Abbildung 42). Auf diese Weise konnte eine signifikant (Tuckey) bessere Regeneration von ca. 70 %, verglichen mit den Regenerationen nach allen anderen Kulturzeiten (20 bis 25 %), erreicht werden. * 16d 21d 28d 35d Kulturperiode 0 25 50 75 100 R eg en er at io n na ch L N [% ] $ $ $ $ n = 30 bis 40 Sprossspitzen pro Behandlungen Abbildung 42: Einfluss der Kulturperiode auf die Sprossregeneration der juvenilen Kultur, Klon 129 6.2, nach der Kryokonservierung. Die in vitro Kultur wurde entweder für 16, 21, 28 oder 35 Tage inklusive einer Abhärtungsperiode von sieben Tagen kultiviert. Die Datenpunkte stellen den Mittelwert der Regeneration [%] und der Fehlerbalken den Standardfehler des Mittelwertes dar. Signifikante Unterschiede (p ≤ 0,05) zwischen der Kulturperiode sind mit einem Stern gekennzeichnet. 4.2.3.3 Optimierung des Abhärtungszeitraumes und des Vorkulturmediums für die Kryokonservierung von juvenilen Kulturen Eine Abhärtungsperiode von sieben und 14 Tagen führte zu einer signifikant (Tuckey) besseren Regeneration der Sprossspitzen nach dem Erwärmen, verglichen mit der Regeneration von Sprossspitzen der Kulturen, die nicht abgehärtet wurden. Ein Unterschied des Wachstums nach der Kryokonservierung zwischen den beiden Abhärtungsperioden war nicht zu erkennen. 81 Ergebnisse Die Verwendung eines DMSO-haltigen Vorkulturmediums beeinflusste ebenfalls signifikant die Regeneration der in Stickstoff gelagerten Sprossspitzen. Verglichen mit der Regeneration nach einer Vorkultur auf DMSO-Medium (57 %) oder in flüssigem DMSO- Medium (13 %) führte sowohl eine Weiterbehandlung der präparierten Sprossspitzen ohne Vorkultur als auch eine Vorkultur für zwei Tage auf Standardmedium zu einer signifikant (Tuckey) besseren Regeneration (ca. 81 %). Aufgrund dieser Ergebnisse (siehe Abbildung 43) wurde die bisherige Lagerung von zwei Tagen auf DMSO-Medium durch eine Lagerung auf Standardmedium ersetzt. Die Zwischenlagerung auf einem Vorbehandlungsmedium war aus arbeitstechnischen Gründen notwendig, um die für die Kryokonservierung hohe Stückzahl an präparierten Sprossspitzen an einem Tag produzieren zu können und an einem anderen Tag weiterzubehandeln. Die Methode, präparierte Sprossspitzen direkt in die Glycerollösung zu überführen, wurde aus diesem Grund verworfen. a a b c A B C D Vorkultur 0 25 50 75 100 R eg en er at io n na ch L N [% ] D D D D n = 30 bis 40 Sprossspitzen pro Behandlungen Abbildung 43: Einfluss der Vorkultur auf die Sprossregeneration der juvenilen Kultur, Klon 129-6.2 nach der Inkubation in PVS2-Lösung und folgender Überführung in flüssigen Stickstoff. Die präparierten Sprossspitzen wurden entweder direkt in die Vorbehandlungslösung überführt (A) oder für zwei Tage bei 4 °C auf Standardmedium (B), DMSO-Medium (C) oder auf Filterpapier, getränkt mit flüssigem DMSO-Medium (D), inkubiert. Die Balken stellen den Mittelwert der Regeneration [%] und der Fehlerbalken den Standardfehler des Mittelwertes dar. Werte mit gleichen Buchstaben sind nicht signifikant (p ≤ 0,05) unterschiedlich. 82 Ergebnisse 4.2.3.4 Langzeitlagerung in flüssigem Stickstoff von fünf juvenilen Kulturen Die Einlagerungsdauer (1 Tag, 3 Monate und 6 Monate) kryokonservierter Sprossspitzen juveniler Kulturen zeigte keinen Einfluss auf die Regeneration nach dem Erwärmen. Die Regeneration war klonabhängig und lag zwischen 50 und 100 % (siehe Tabelle 16). Fasst man die Regeneration der drei Einlagerungszeiten zusammen, zeigt sich für die Klone 47-1.1 und 126 103.1 eine signifikant geringere Regeneration (57 % und 65 %) verglichen mit einer Regeneration von 85 % für Klon 129-6.2. Die Klone 129-8 und 16-1.1 zeigten mit einer Regeneration von 80 und 81 % ein besseres Wachstum verglichen mit Klon 47-1.1 (siehe Tabelle 16). Tabelle 16: Regeneration von Sprossspitzen die mit einer modifizierten Vitrifikationsmethode mit PVS2 kryokonserviert wurden. Als in vitro Material dienten fünf juvenile Kulturen. Die Daten stellen die mittlere Regeneration [%] der Genotypen dar und der SEM den Standardfehler des Mittelwertes. Werte mit denselben Buchstaben (a, b, c) sind nicht signifikant (p ≤ 0,05) unterschiedlich. Regeneration [%] nach definierter Lagerungsdauer juveniler Klon 1 Tag 3 Monate 6 Monate Mittelwert [% ± SEM] 129-8 81 80 80 80,3 ± 0,3 bc 129-6.2 77 100 90 85,0 ± 6,6 c 16-1.1 80 83 80 81,0 ± 1,0 bc 47-1.1 50 60 60 56,7 ± 3,3 a 126-103.1 58 78 60 65,3 ± 6,4 ab n = 10 bis 15 Sprossspitzen pro Behandlungen 4.2.3.5 Vergleich der Regenerationsfähigkeit von juvenilen und adulten Kulturen nach dem für juvenile Kulturen optimierten Kryokonservierungsprotokoll Innerhalb der getesteten Gruppen der juvenilen und adulten Kulturen zeigten sich keine signifikanten Unterschiede in der Regenerationsfähigkeit der Sprossspitzen nach erfolgter Kryokonservierung. Abbildung 44 stellt die Regeneration der beiden Gruppen nach den einzelnen Behandlungsschritten dar. 83 Ergebnisse juvenile Klone adulte Klone Kontrolle PVS2 LN 0 25 50 75 100 R eg en er at io n [% ] D D D D D D ** n = 30 bis 34 Sprossspitzen pro Behandlungen Abbildung 44: Mittlere Regeneration [%] von Sprossspitzen zweier juveniler (Klon 129-6.2 und 16-1.1) und zweier adulter in vitro Kulturen (Klon 77-23 und 77-3) nach der Präparation der Sprossspitzen (Kontrolle), nach der PVS2-Behandlung (PVS2) und nach der PVS2-Behandlung und Kryokonservierung (LN). Die Kulturen wurden für 28 Tage inklusive einer Abhärtungsperiode von zehn Tagen kultiviert und dann nach dem für juvenile Kulturen ermittelten Protokoll weiterbehandelt. Die Fehlerbalken stellen den Standardfehler des Mittelwertes dar und signifikante (p ≤ 0,05) Unterschiede zwischen den Kulturen sind mit einem Stern gekennzeichnet. Adulte Kulturen zeigten sowohl nach der PVS2-Behandlung als auch nach der anschließenden Überführung in flüssigen Stickstoff eine signifikant (t-Test) geringere Regeneration der Sprossspitzen (22 %) verglichen mit der Regeneration von Sprossspitzen juveniler Kulturen (76 %). Dagegen wiesen die angefertigten präparierten, aber unbehandelten Kontrollen der Sprossspitzen von juvenilen und adulten Kulturen ähnliche Regenerationsraten zwischen 85 und 90 % auf. 4.2.3.6 Optimierung der Kulturperiode, der Vorkultur und der PVS2-Inkubation für die Kryokonservierung von adulten Kulturen Vergleicht man die Regeneration adulter kryokonservierter Kulturen nach einer PVS2- Inkubation von 20 Minuten und dem bisherigen Kryokonservierungsverfahren (siehe Kap. 4.2.3.5 und Abbildung 44) mit der Regeneration nach einer Vorkultur der präparierten Sprossspitzen auf Glycerolmedium und einer verlängerten Subkulturperiode, zeigte sich eine Verbesserung der Regeneration (siehe Abbildung 45). Die Verlängerung der PVS2-Inkubationszeit von 20 auf 25 Minuten bewirkte eine signifikante Verbesserung der Regeneration für die Klone 77-19 und 77-3 (siehe Abbildung 45). 84 Ergebnisse 20 min 25 min PVS2-Inkubationszeit * * 77-2 77-5 77-19 77-3 Klone 0 25 50 75 100 R eg en er at io n na ch L N [% ] D D D D D D D D n = 30 bis 42 Sprossspitzen pro Behandlungen Abbildung 45: Mittlere Regeneration [%] von Sprossspitzen adulter in vitro Kulturen (Klon 77-2, 77-5, 77-19 und 77-3) nach der Überführung in flüssigen Stickstoff. Die in vitro Kultur erfolgte für 33 Tage inklusive einer Abhärtungsperiode von zehn Tagen. Danach erfolgte eine Vorkultur der präparierten Sprossspitzen für zwei Tage bei 4 °C auf 0,8 M Glycerolmedium, gefolgt von einer Vorbehandlung für 20 Minuten bei 22 °C in einer 2 M Glycerollösung. Die Fehlerbalken stellen den Standardfehler des Mittelwertes dar und signifikante (p ≤ 0,05) Unterschiede zwischen den PVS2- Inkubationszeiten sind mit einem Stern gekennzeichnet. Der Klon 77-3 wurde neben der Vorkultur auf Glycerolmedium auch auf dem bisher ge- nutzten Standardmedium zusammen mit einer PVS2-Inkubation von 25 Minuten getestet. Die Regeneration nach der Kryokonservierung war signifikant (t-Test) niedriger bei einer applizierten Vorkultur auf Standardmedium (48 % ± 14,3 %) verglichen mit der optimierten Methode (80 % ± 3,0 %). Aufgrund dieser Ergebnisse wurde als Standardprotokoll für Fraxinus excelsior eine Subkultur von 33 Tagen, eine Abhärtung von zehn Tagen, eine Vorkultur auf 0,8 M Glycerolmedium, eine Vorbehandlung in 2 M Glycerollösung und eine PVS2-Inkubation von 25 Minuten festgelegt (siehe Kap. 3.3.5.9). 4.2.3.7 Langzeitlagerung von neun adulten Kulturen in flüssigem Stickstoff Die Regeneration der eingelagerten Proben war klonabhängig und lag für die acht Klone, die Wachstum zeigten, zwischen 50 und 80 %. Klon 77-24 ließ sich nicht regenerieren (siehe Tabelle 17). Die Vermehrungsraten der nicht kryokonservierten Kontrollen wiesen keine signifikanten Unterschiede zu denen der kryokonservierten Kulturen auf. 85 Ergebnisse Tabelle 17: Regeneration nach erfolgter Kryokonservierung von Sprossspitzen bei neun verschiedenen adulten Kulturen. Die Kryokonservierung erfolgte nach dem für Fraxinus excelsior verbesserten Kryokonservierungsprotokoll für adulte Kulturen und die Bonitur erfolgte nach acht Wochen. Bei vier Kulturen wurde die mittlere Vermehrungsrate, sowie der Standardfehler des Mittelwertes der Kontrollen und der kryokonservierten Kulturen über fünf Transfers ermittelt. Klon Regeneration nach 1 d in LN [%] Vermehrungsrate nach Kryokonservierung (5 Transfers) Vermehrungsrate nach Präparation (5 Transfers) 77-2 71 1,67 ± 0,23 1,53 ± 0,28 77-5 78 1,55 ± 0,31 1,21 ± 0,38 77-24 0 - - 77-7 53 - - 77-23 50 1,48 ± 0,14 1,54 ± 0,17 77-27 75 - - 77-3 75 1,91 ± 0,28 1,86 ± 0,27 77-8 80 - - 519-21 57 - - n = 6 bis 15 Sprossspitzen pro Behandlung, LN = flüssiger Stickstoff (Liquide Nitrogen), - = nicht ermittelt In den folgenden Abbildungen ist die Entwicklungsreihe einer optimalen Regeneration kryokonservierter Sprossspitzen nach einem Zeitraum von einer (siehe Abbildung 46), drei (siehe Abbildung 47) und nach acht Wochen (siehe Abbildung 48) dargestellt. Abbildung 46: Regeneration einer k vierten Sprossspitze nach einer Wo ca. 2 mm ryokonser- che. Abbildung 47: Regenerat vierten Sprossspitze nachca. 5 mm ion einer kryokonser- drei Wochen. 86 Ergebnisse ca. 15 mm Abbildung 48: Vollständig regenerierte kryokonservierte Sprossspitze nach acht Wochen. Abbildung 49 stellt eine unzureichende bzw. schlechte Regeneration der Sprossspitzen dar. Die Explantate bildeten nach der Kryokonservierung nur Blätter aus, ohne zu einem vollständigen Spross zu regenerieren (siehe Abbildung 49, A und B) oder es bildete sich nur Kallus (siehe Abbildung 49, C). Bei Explantat D ist trotz erhöhter Kallusbildung eine Sprossbildung zu erkennen, die zu einer vollständigen Regeneration führte. ca. 5 mm D C B A Abbildung 49: Unterschiede in der Regeneration kryokonservierter Sprossspitzen eines Klons: Explantat A und B zeigen Blattwachstum mit massiver Kallusbildung, C nur Kallusbildung und D eine schwache Sprossbildung. 87 Diskussion 5 Diskussion Mit den in Kapitel 4 vorgestellten Ergebnissen sind die Voraussetzungen geschaffen, das genetische Potential der Gemeinen Esche, das vor allem selektierte Plusbäume bieten, mit Hilfe der in vitro Vermehrung und Kryokonservierung zu nutzen. Durch die Entwicklung eines in vitro Vermehrungs- und Kryokonservierungsprotokolls, welches jeweils für eine Vielzahl verschiedener Genotypen anwendbar ist, können ausgewählte Bäume in Form von Klonprüfungen getestet und die entsprechenden Genotypen jederzeit wieder zur Pflanzenproduktion eingesetzt werden. Die Form der vegetativen Vermehrung ermöglicht, das Erbgut und damit auch die getesteten Wuchseigenschaften in den Nachkommen zu erhalten. Trotz des Erfolges des Projektes bestätigen die durchgeführten Versuchsreihen den in der Literatur beschriebenen ontogenetischen Einfluss auf die Regenerationsfähigkeit adulter Gehölze (BÄRTELS 1996, BONGA und VON ADERKAS 1992, GIRI et al. 2003, JESCH und PLIETZSCH 1996). Aus Saatgut gewonnene Embryonen ließen sich zu fast 100 % in vitro etablieren. Diese guten Ergebnisse werden auch in der Veröffentlichung von RAQUIN et al. (2002) bestätigt. Die Arbeitsgruppe testete verschiedene Methoden sowohl bei Fraxinus excelsior als auch bei Fraxinus angustifolia (Vahl.) zur in vitro Kultivierung von zygotischen Embryonen. Explantate von adulten Mutterbäumen erwiesen sich als erheblich schwerer zu etablieren. Die vorliegende Arbeit zeigt, dass die Regeneration in Abhängigkeit von der Jahreszeit, dem Ausgangsmaterial, der Behandlung und vor allem dem Genotyp steht. Die Durchführung und Auswertung der Versuche bestätigt zudem, dass sich lediglich über empirische Versuche ermitteln lässt, in wie weit Gehölze in vitro etablierbar (JESCH und PLIETZSCH 1996) und zur Kryokonservierung geeignet sind. Parallel durchgeführte Versuche des Projektpartners „Centre de Recherche Public - Gabriel Lippmann - (CRP-GL)“ unter der Leitung von Dr. Hausman wiesen stressphysiologische Unterschiede zwischen einzelnen Klonen während der in vitro Etablierung und besonders während der Bewurzelung auf. Zum Beispiel zeigten gut zu bewurzelnde Klone einen hohen Anteil der Polyamine Spermidin und Spermin während der Bewurzelung (RAP- PROJEKTBERICHT 2003). Marker, die eine Aussage über das Verhalten der Kulturen im 88 Diskussion vornherein und somit eine effektive Kultivierung erlauben, konnten bis jetzt nicht aufgezeigt werden. Die Etablierung der 62 ausgewählten Elitebäume fand sowohl an der Niedersächsischen Versuchsanstalt in Escherode als auch in den beiden kommerziellen Partnerlabors des RAP-Projektes (Institut für Pflanzenkultur (IFP), Solkau, Deutschland und Vitroform, Arslev, Dänemark) mit Pfropflingen derselben Mutterbäume und somit mit demselben genetischen Material statt. Bis zum Frühjahr 2004 war an der Niedersächsischen Versuchsanstalt die Etablierung von 25 Klonen erfolgreich. Hiervon wurden sieben Klone ebenfalls bei Vitroform und vier bei dem Institut für Pflanzenkultur etabliert. Fünf zusätzliche Klone konnten vom IFP in vitro überführt werden, wurden aber verworfen, da sie Kontaminationen aufwiesen. Es wurden also in allen drei Labors unabhängig voneinander die selben Klone etabliert (siehe Anhang 10). Die übrigen 37 Klone konnten in keinem der drei Labors etabliert werden. Weiterhin zeigte sich während der Projektlaufzeit, dass der Methodentransfer zwischen unterschiedlichen Laboren problematisch ist. Dieser Effekt ist im Rahmen einer Untersuchung von REED et al. (2004) beschrieben worden. Vor allem bei der Bewurzelung kam es zu unterschiedlichen Ergebnissen zwischen den Laboren unter scheinbar denselben Bedingungen. Während in Escherode die Bewurzelung in den meisten Fällen nach dem Transfer in Erde erfolgreich verlief, kam es bei dem Institut für Pflanzenkultur zu einem Absterben der Pflanzen in Erde (PROJEKTBERICHT 2003). Gründe hierfür können die Zusammensetzung der Erde, unterschiedliche Luftfeuchtigkeit oder Faktoren wie z. B. Wechselwirkungen mit Bakterien oder Pilzen sein. Diese Ergebnisse verdeutlichen, dass trotz des nun vorliegenden optimierten Protokolls zur in vitro Kultivierung von Fraxinus excelsior zusätzlich eine Optimierung an vorherrschenden Bedingungen erfolgen muss. Die vorliegende Arbeit mit der Darstellung der wesentlichen Versuchsreihen zur Entwicklung eines effektiven in vitro Protokolls für Fraxinus excelsior stellt den Einfluss verschiedener Faktoren dar und zeigt gleichzeitig die Schwierigkeit auf, reproduzierbare Ergebnisse im Rahmen von in vitro Kulturen zu erhalten. Besonders die Phase der Etablierung und Bewurzelung ist von der jeweiligen Jahreszeit, dem herrschenden Klima und dem physiologischen Zustand der Mutterpflanzen abhängig. Diese Einflüsse sind in mehreren Arbeiten (BENSON 1999 b, CHALUPA 2002, JESCH und PLIETZSCH 1996) 89 Diskussion beschrieben worden. Die Entwicklung des in vitro-Vemehrungsprotokolls und des Kryokonservierungprotokolls für Fraxinus excelsior wurde vor allem durch den zeitlichen Ablauf des Projektes bestimmt und dem jeweils zur Verfügung stehenden Material. In Tabelle 18 sind die einzelnen Entwicklungsschritte dieser Arbeit dargestellt. Tabelle 18: Darstellung der einzelnen Versuchsabschnitte in den Jahren 2001 bis 2005. Weiterführende Ergebnisse in diesem Versuchszeitraum sind jeweils hervorgehoben. Benutztes Ausgangs- material Versuche zur Vermehrung und Bewurzelung Kryokonservierung Frühjahr 2001 Etablierung frischer Triebe der Mutterbäume von der Versuchsfläche Bovenden Erhaltung des juvenilen Materials vom Partnerinstitut Teagasc, Irland 2001/2002 Etablierung ruhender Knospen der Mutter- bäume von der Ver- suchsfläche Bovenden, Etablierung aus Saatgut Erhaltung des juvenilen Materials vom Partnerinstitut Teagasc, Irland Test der Alginat- / Dehydrationsmethode mit juvenilem Material von Fraxinus excelsior und Johannisbeere Frühjahr 2002 Etablierung mit frischen Trieben der ein Jahr alten Pfropflinge (Bovenden) Vermehrungsversuche mit juvenilem Material vom Partnerinstitut Teagasc, Irland, Etabliertes juveniles Material aus Saatgut Test der PVS2-Methode mit juvenilem Material von Fraxinus excelsior und Johannisbeere 2002/2003 Vermehrungsversuche mit juvenilem und adultem Material Optimierung der PVS2- Methode für juveniles Material Frühjahr 2003 Etablierung mit frischen Trieben der zwei und ein Jahre alten Pfropflinge (Bovenden, Dannenberg) Vermehrungsversuche mit juvenilem und adultem Material, erste Bewurzelungsversuche mit juvenilem Material und einigen adulten Klonen Test der PVS2-Methode an adultem Material 2003/2004 Fortführung der Etablierungs- versuche, Massenvermehrung aller Klone mit dem optimierten Vermehrungsprotokoll, Test verschiedener Bewur- zelungsprotokolle für adulte Kulturen Optimierung der PVS2- Methode für adultes Material Frühjahr 2004 frische Triebe der drei und zwei Jahre alten Pfropflinge (Bovenden, Dannenberg) Bewurzelung aller Klone mit dem Standardbewurzelungs- protokoll Einlagerung aller vor- handenen juvenilen und adulten Klone in eine Kryogenbank 2004/2005 Fortführung der Massenvermehrung aller Klone nach dem standardisierten Protokoll Fortführung der Einlager- ung aller vorhandenen ju- venilen und adulten Klone in eine Kryogenbank. 90 Diskussion Der Abschluss aller in dieser Arbeit ausgewerteten Versuche fand im März 2005 statt. Die zu diesem Zeitpunkt vorhandenen Kulturen wurden weitervermehrt und im Mai 2005 erfolgreich bewurzelt (siehe Anhang 6). 5.1 In vitro Vermehrung Als Ausgangspunkt für die Etablierungsversuche dienten vorliegende Veröffentlichungen (siehe Kap. 2.5.5) und die in Escherode gemachten Erfahrungen mit der in vitro Etablierung folgender Laubbaumarten: Prunus avium, Betula spec., Quercus, Sorbus torminalis, Ulmus spec (MEIER DINKEL, persönliche Mitteilung). 5.1.1 Kontaminationen Aus der Literatur war bekannt, dass adulte Laubbäume in hohem Maße mit Bakterien kontaminiert sind (BONGA und VON ADERKAS 1992). Dies wurde in den ersten durchgeführten Versuchen zur Etablierung von Sprossspitzen adulter Mutterbäume mit einem Kontaminationsanteil der Explantate von 68 % bestätigt. Ein ähnlicher Anteil von 63 % wurde in der Veröffentlichung von PIERIK und SPRENKELS (1997) beschrieben. HAMMATT (1996) beobachtete ein Ausbrechen von Kontaminationen vier Monate nach der Etablierung. Untersuchungen über Interaktionen zwischen Pflanzen und Bakterien zeigen, dass artspezifische Bakterien in die Pflanze über natürliche Öffnungen oder Verletzungen eindringen können (WILSON et al. 1999). Die von HAMMATT (1996) gemachten Beobachtungen lassen somit auf einen Befall der Explantate mit endogenen Bakterien schließen. Dies wurde auch von unserem Partnerlabor, dem Institut für Pflanzenkultur, beobachtet. Weiterhin zeigten Untersuchungen an verschiedenen Pflanzenarten, dass der Bakterienbesatz vor allem auf Blättern je nach Art (KINKEL et al. 2000), Jahreszeit (SUNDIN und JACOBS 1999) und den aktuellen Umwelteinflüssen (HIRANO und UPPER 2000) sehr unterschiedlich ist. Die Ergebnisse, dargestellt in den Kapiteln 4.1.2.2.1 und 4.1.3.2, unterstreichen dies und stellen den Einfluss der Jahreszeit sowie der Umweltbedingungen auf die Häufigkeit der Kontaminationen dar. Unter natürlichen Umweltbedingungen zeigten frisch austreibende Triebe von Pfropflingen im Frühjahr den höchsten Anteil an Kontaminationen, wobei ein Abschirmen der Pflanzen 91 Diskussion gegen Regen und Staubeinwirkung eine signifikante Reduktion der Kontaminationen bewirkte. Der Wechsel des Sterilisationsmittels von Natriumhypochlorit zu Quecksilberchlorid bewirkte zudem eine Verbesserung der Überlebensrate (siehe Kap. 4.1.3.1) nach der Oberflächensterilisation. Bei den Mutterpflanzen zeigten belaubte Reiser mit Winterknospen, die im September und Oktober geworben wurden, Kontaminationen von durchschnittlich 68 %. Explantate, die in den Monaten November, Dezember, Januar und März geworben wurden dagegen nur von durchschnittlich 39 %. 5.1.2 Explantatquelle Kulturen mit direkt den Mutterbäumen entnommenen Explantaten aus frischen Trieben ließen sich in keinem Fall etablieren und nur bei zwei Klonen aus ruhenden Knospen. Trotz dieses geringen Etablierungserfolges zeigte sich in den Versuchen der Einfluss des Werbungsdatums auf die Regeneration. In der Veröffentlichung von SILVEIRA und COTTIGNIES (1994) wird dieser Einfluss ebenfalls beobachtet. Als Versuchspflanzen dienten bei dieser Arbeit vier bis sieben Jahre alte Mutterbäume von Fraxinus excelsior. Die dort ermittelten Ergebnisse zeigen, dass Apikalknospen, die im September, Januar und März geworben wurden, etabliert werden konnten, Reiser aus den Werbungsmonaten Mai und Juni dagegen nicht. Die in der vorliegenden Arbeit durchgeführten Untersuchungen wurden mit wesentlich älteren (15 Jahre) Bäumen durchgeführt. Übereinstimmend konnte festgestellt werden, dass eine Etablierung von frischen Trieben nicht möglich ist. Ruhende Knospen zeigten die deutlichsten Etablierungszeichen wie Ergrünen und Öffnen der Knospen, wenn sie nach dem ersten Frost geworben wurden. Eine Neubildung von Sprossen konnte nur bei zwei Klonen (10 % der Explantate) beobachtet werden. Auf Grund der ermittelten schlechten Etablierungsergebnisse von Fraxinus excelsior wurden die Versuche mit Reisern von den Mutterbäumen nicht fortgeführt. Aus Versuchen zur vegetativen Vermehrung von Gehölzen (BÄRTELS 1996, VON ADERKAS und BONGA 2000) ist bekannt, dass es bei der Veredelung adulter Reiser auf juvenilen Unterlagen zu einer physiologischen Verjüngung (Reinvigoration) des Ausgangsmaterials kommt. Deutlich wird dies an der Veränderung bestimmter Eigenschaften neu austreibender Pfropflinge, wie z. B. Wachstumsrate, Habitus und Bewurzelungsfähigkeit. Nach und nach entsprechen diese typischen Ausprägungen den Merkmalen juveniler Sämlinge (MEIER-DINKEL 1993). Explantate solcher verjüngten Pflanzen, die zur in vitro Etablierung benutzt werden, zeigen häufig eine verbesserte Sprossregenerationsfähigkeit 92 Diskussion (BONGA und VON ADERKAS 1992). In der Arbeit von BALLESTER et al. 1990 gelang die in vitro Etablierung eines 30 Jahre alten Esskastanien-Baumes (Castanea sativa) erst nach dem Pfropfen von Reisern mit ruhenden Knospen auf Wurzelststöcke zwei Wochen alter Sämlinge. Die in der vorliegenden Arbeit dargestellten Ergebnisse zeigen ebenfalls, dass das Pfropfen des adulten Ausgangsmaterials auf juvenile Unterlagen zu einer besseren Regeneration der Explantate bei der in vitro Etablierung führte. Es ließen sich nur zwei der 31 Klone auf der Versuchsfläche Bovenden von Explantaten der Mutterbäume, aber zwölf von Explantaten der Pfropflinge etablieren. 5.1.3 Optimierung der Etablierungserfolge und der Vermehrungsrate Optimale Nährstoff- und Hormonverhältnisse sind notwendig, um eine erfolgreiche Etablierung und Vermehrung von in vitro Kulturen zu gewährleisen. In mehreren Veröffentlichungen zur in vitro Vermehrung von Fraxinus excelsior wurde vor allem der Einfluss verschiedener Medien und Hormonkonzentrationen auf das Wachstum und die Vermehrungsraten der Pflanzen untersucht. Die Veröffentlichung von CHALUPA (1990) sowie die von HAMMATT und RIDOUT (1992) stellen dar, dass MS-Medium für die Vermehrung und Etablierung ungeeignet ist. Eine Vielzahl der Sprosse auf diesem Medium starb ab, während Sprosse auf WPM und DKW (DRIVER und KUNIYUKI 1984) eine gute Überlebensrate zeigten. Sprosse auf DKW-Medium lieferten die höchsten Etablierungsraten mit wenig Kallusbildung, während bei der Verwendung von WPM viel Kallus an der Basis des Sprosses produziert wurde. In Veröffentlichungen von LEFORESTIER et al. (1990) sowie SILVEIRA und COTTIGNIES (1994) wird das QL-Medium (QUOIRIN und LEPOIVRE, 1977) als das optimale Medium zur Vermehrung benutzt. Von CHALUPA (1990) wurde dies als ungeeignet beschrieben. In allen Veröffentlichungen werden dem Medium zur Vermehrung Wachstumshormone beigefügt. Der Cytokiningehalt liegt zwischen 2 und 20 mg/l BAP und der Auxingehalt zwischen 0,02 und 2 mg/l IBA. In der Veröffentlichung von PIERIK und SPRENKELS (1997) haben sowohl juvenile als auch adulte Pflanzen das beste Wachstum auf WPM. Zusätzlich wurde hier der Einfluss von TDZ auf die Vermehrungsrate und das Wachstum untersucht. Die Ergebnisse aus den genannten Veröffentlichungen sind sehr unterschiedlich. Aus diesem Grund lag parallel zu den Etablierungsversuchen ein Schwerpunkt der Arbeiten in 93 Diskussion der Verbesserung des Wachstums und der Vermehrungsrate von schon bestehenden Kulturen. Ausgehend von den dargestellten Ergebnissen wurden für unsere Untersuchungen WPM mit 4 mg/l BAP und 0,15 mg/l IBA als Standardmedium benutzt und im Vergleich zu verschiedenen Medien getestet (siehe Kap 4.1.4.1). Die Versuchsreihen fanden zunächst nur an juvenilem Material von unserem Projektpartner Teagasc und etablierten in vitro Kulturen aus Embryos statt. Die Auswertung zeigte ein signifikant besseres Wachstum auf dem neu definierten Standardmedium. Der Test verschiedener Cytokinin- und Auxinkonzentrationen, wie sie in der Veröffentlichung von KYTE und KLEYN (1996) beschrieben werden, bestätigt zudem das bisher benutzte Verhältnis von 4 mg/l BAP und 0,15 mg/l IBA (siehe Kap. 4.1.4.2). Neben den herkömmlichen Cytokininen wurde der Einfluss von TDZ auf in vitro Kulturen von Fraxinus excelsior getestet. Aufgrund der vielfältigen Wirkungen auf die Sprossmorphologie und das Wachstum von in vitro Kulturen wird die Verwendung von TDZ stark diskutiert (MURTHY et al. 1998). Je nach Konzentration bewirkt die Zugabe von TDZ eine Änderung der Morphologie der Sprosse. So führt der Zusatz von geringen TDZ- Konzentrationen (< 1 µM) zur Stimulation der Achselsprossbildung und in einigen Fällen zur Hemmung der Sprossstreckung. Hohe Konzentrationen (> 1 µM) fördern die Kallus- und Adventivsprossbildung (HUETTEMAN und PREECE 1993). Bei einer gewünschten klonalen Mikrovermehrung muss die TDZ-Konzentration in jedem Fall so gewählt werden, dass Adventivsprossbildung vermieden wird. In der Veröffentlichung von KIM et al. (1997) wurde eine Steigerung der Vermehrungsrate von juvenilen Kulturen von Fraxinus pennsylvanica Marsh. mit einer TDZ-Konzentration von 10 µM (2,2 mg/l) und einer BAP Konzentration von 40 µM (9 mg/l) erreicht. Auch hier wurden vor allem signifikante Kloneffekte beobachtet. PIERIK und SPRENKELS (1997) beschreiben in ihrer Veröffentlichung zur in vitro Kultivierung von Fraxinus excelsior den positiven Einfluss von 0,01 mg/l TDZ zusammen mit 2-3 mg/l BAP und 0,15 mg/l IBA auf den Austrieb von Achselknospen bei juvenilen Kulturen. Bei einer Erhöhung der TDZ- Konzentration kam es zu einem beschriebenen Zwergenwuchs. Dieses Ergebnis konnte durch die hier vorgelegte Arbeit bei einigen Klonen bestätigt werden. Eine TDZ- Konzentration von mehr als 0,1 mg/l führte bei dauerhafter Kultivierung von mehr als vier Transfers klonabhängig zu einem anfänglichen Anstieg und dann zu einer Verringerung der Vermehrungsrate. Bei dem Transfer der neu geschnittenen Mikrostecklinge von sehr 94 Diskussion kleinen Sprossbüscheln kam es häufig zum Verbräunen der neu geschnittenen Mikrostecklinge. In vielen Fällen zeigten die Kulturen auch Symptome von Hyperhydrizität. Dieser Effekt wird beim Einsatz von TDZ oft beobachtet (HUETTEMAN und PREECE 1993). Es kommt hierbei zur Ausbildung von sehr schmalen Blättern und die Sprosse selber erscheinen durchscheinend. Die Applikation von 0,1 mg/l TDZ während der Etablierungsphase konnte dagegen bei Primärexplantaten einiger Klone einen Austrieb neuer Sprosse aus den vorhandenen Achselknospen ermöglichen. Bei anderen Genotypen bewirkte dieselbe Hormonkonzentration ein beschleunigtes Absterben der Explantate im Vergleich zu dem TDZ-freien Etablierungsmedium. Diese Ergebnisse zeigen deutlich, dass bei dem Einsatz von TDZ eine genaue Dokumentation der Sprossmorphologie erfolgen muss. Ein stimulierender Einsatz über einen je nach Genotyp definierten Zeitraum sollte getestet werden, um eine mögliche Etablierung bzw. eine verbesserte Vermehrung zu erreichen (siehe Kap. 4.1.3.4 und 4.1.4.4). Weiterhin zeigten die Versuche, dass die TDZ-Wirkung nach spätestens drei Transfers nicht mehr zu beobachten ist. Dies wurde ebenfalls von unseren Projektpartnern (Teagasc und IFP) bestätigt. Die erfolgreiche Vermehrung der in Irland etablierten Kulturen, nach der Methode einer wechselnden Kultivierung auf einem Medium mit hoher TDZ- Konzentration und auf einem hormonfreien Kohlemedium (DOUGLAS 2001), führte unter den Kulturbedingungen in Escherode zu einem Absinken der Vermehrungsrate (siehe Kap. 4.1.4.1). Aus diesem Grund wurde diese Methode verworfen. In dem Jahresbericht der NFV (2000) wurden für Kulturen von Vogelkirsche (Prunus avium) und Stieleiche (Quercus robur) Honiggläser als das optimale Kulturgefäß empfohlen. Bei dieser Gefäßart ist der Luftaustausch durch einen Plastikschraubdeckel geringer als bei den herkömmlichen Weckgläsern mit Filzring und Glasdeckel. In vitro Kulturen der Gemeinen Esche zeigten bei der Verwendung von Honiggläsern einen veränderten Habitus der Sprosse. Es kam zu einer stärkeren Sprossstreckung, aber ohne zusätzliche Bildung von Sprossen oder Achselknospen. Honiggläser erhöhten also nicht, bei Beibehaltung des Standardmediums, die Vermehrungsraten (siehe Kap. 4.1.4.3) der in vitro Kulturen. Sie führten aber bei sehr kleinwüchsigen Kulturen zu einer Vereinfachung der Kultivierung, da der Zeitaufwand beim Zerteilen der Sprosse geringer ist. Die 95 Diskussion beobachtete Sprossstreckung durch Erhöhung der Luftfeuchtigkeit in den Kulturgefäßen wurde ebenfalls von Douglas (DOUGLAS, persönliche Mitteilung) beobachtet. Die Verwendung von Honiggläsern zusammen mit einer Änderung des Standardmediums durch Zusatz von 0,01 mg/l TDZ und die Verminderung des Agargehaltes um 0,1 % führte zu einer Steigerung der Vermehrungsrate. Mit dieser Methode kam es bei den meisten Genotypen durch Förderung des Austriebs von Achselknospen zu einem Brechen des monopodialen Wachstums ohne extensive Kallusbildung und zu starker Wuchsdepression. Neben den beschriebenen Versuchsreihen wurde zusätzlich der Einfluss verschiedener Agarmarken (Difco granulated, Plantagar) und einer Kombinationen aus Agar und Gelrite (siehe Kap. 3.1.3) auf die Vermehrungsrate der in vitro Kulturen getestet. In einem Expertengespräch mit dem Leiter des dänischen Gewebekulturlabors, Vitroform, Arslev (SOMMER, persönliche Mitteilung) und in der Arbeit von LEFORESTIER et al. (1993) wurde die Zusammensetzung des Verfestigungsmittels bzw. der Agarmarke als ein die Vermehrungsrate und die Sprossmorphologie beeinflussender Faktor beschrieben. Dies konnte in den durchgeführten Versuchen nicht bestätigt werden. In keinem Fall konnte im Vergleich zu dem bisher benutzten Standardmedium mit Difco granulated Agar ein signifikant unterschiedliches Ergebnis ermittelt werden. 5.1.4 Optimierung der Bewurzelung Die Bewurzelungsfähigkeit sowohl von konventionellen Stecklingen als auch von Mikrostecklingen während einer in vitro Kultur steht in Abhängigkeit zu dem Alter der Pflanzen. Sowohl Stecklinge von juvenilen Gehölzen als auch in vitro Mikrostecklinge zeigen während der juvenilen Phase eine bessere Bewurzelungsfähigkeit als das Material von adulten Bäumen (JESCH und PLIETZSCH 1996). Das Alter der Mutterbäume stellt somit bei allen Schritten den kritischen Faktor der in vitro Vermehrung dar. Ausgehend von den vorliegenden Veröffentlichungen (HAMMATT 1994, 1996) und den Erfahrungen unseres Projektpartners Teagasc wurde halbkonzentriertes MS-Medium mit verschiedenen IBA- Konzentrationen als Bewurzelungsmedium verwendet. Im Gegensatz zu deren Ergebnissen ließen sich auf den getesteten Medien unter den Kulturbedingungen in Escherode keine adulten Klone während der in vitro Phase bewurzeln. Juvenile Klone bildeten in vitro sehr selten Wurzeln, zeigten aber eine sehr gute Bewurzelung nach dem Transfer in Erde, die je nach Klon zwischen 70 und 100 % schwankte. Die Kultivierung auf Bewurzelungsmedien 96 Diskussion mit unterschiedlicher IBA-Konzentration zeigte keinen signifikanten Einfluss auf die Bewurzelung juveniler Kulturen. Dies wurde auch in der Arbeit von DOUGLAS (2001) bei etablierten juvenilen Klonen der Gemeinen Esche beobachtet. Eine Dunkelinkubation für eine bestimmte Periode am Anfang der Wurzelinduktionsphase wird in der Veröffentlichung von BONGA und VON ADERKAS (1992) als stimulierend für die Wurzelbildung beschrieben. Dies wird ebenfalls in den zwei Veröffentlichungen von HAMMATT (1996) und PIERIK und SPRENKELS (1997) zur in vitro Kultivierung von adulten Kulturen von Fraxinus excelsior genannt und zusätzlich durch die in dieser Arbeit vorgelegten Ergebnisse bestätigt (siehe Kap. 4.1.5.1). In der Veröffentlichung von BONGA und VON ADERKAS (1992) wird zusätzlich auf eine verbesserte Bewurzelung bei einem hohen Auxin / Cytokinin-Verhältnis und auf die Verbesserung der Bewurzelung in Anwesenheit einer geringen Cytokininkonzentration bei einigen Gehölzen hingewiesen. Dies zeigen ebenfalls die hier vorgelegten Ergebnisse auf (siehe Kap. 4.1.5.2). Adulte Kulturen von Fraxinus excelsior ließen sich ohne die Zufuhr von BAP wesentlich schlechter bewurzeln. Der Zusatz von Aktivkohle wurde von MCCOWN (1988) als stimulierend für die Wurzelbildung beschrieben. Der Effekt der Aktivkohle beruht auf der Bindung von entwicklungshemmenden Substanzen in dem Medium (FRIDBORG und ERIKSSON 1975), z. B. als Exkrete aus den Sprossen. Eine Bewurzelung auf Kohlemedium hatte bei den in dieser Arbeit durchgeführten Versuchen keinen zusätzlichen Einfluss auf die Bewurzelungsfähigkeit (siehe Kap. 4.1.5.3). In der Veröffentlichung von SANCHEZ et al. (1996) zur in vitro Bewurzelung von adulten Kulturen der Eiche (Quercus robur und Quercus rubra) wurde eine Kultivierung auf hormonfreiem Medium mit dem Zusatz von 1 % Aktivkohle nach einer 24-stündigen Inkubation auf Medium mit 15 mg/l IBA getestet. Auch dort wurde kein signifikanter Einfluss auf die Bewurzelung nachgewiesen. Für Fraxinus excelsior wies sich eine initiale Dunkelperiode positiv auf die spätere Bewurzelung in Erde aus (siehe Kap. 4.1.5.1). Dieser positive Effekt wird von DRUART et al. (1982) auf eine Reduktion der Peroxidaseaktivität und einem Absenken des endogenen Phenolgehaltes während der Wurzelinduktionsphase zurückgeführt. 97 Diskussion Die Änderung der Auxinapplikationsform hin zu einer Inkubation für nur einige Minuten in einer Auxinlösung gefolgt von einer Kultivierung auf Kohlemedium, wie in der Arbeit von KIM et al. (1998) zur Bewurzelung von juvenilen Klonen von Fraxinus pennsylvanica beschrieben, hatte im Vergleich zu dem bisherigen Verfahren keine Verbesserung der Bewurzelung zur Folge und wurde nicht weiter verfolgt. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit bestätigen, dass nicht die Auxinkonzentration, sondern der einzelne Genotyp und das ontogenetische Alter der Mutterpflanzen die Bewurzelung signifikant beeinflussen. Im Gegensatz zu früheren Arbeiten, bei denen die Bewurzelung in Abhängigkeit von der zugeführten Auxinkonzentration beschrieben wird, betrachten neuere Arbeiten das Zusammenspiel zwischen exogen zugeführtem Auxin und endogenen Abläufen. In der Arbeit von BALLESTER et al. (1999) werden die biochemischen und anatomischen Veränderungen der Bewurzelungsfähigkeit von juvenilen (einfach zu bewurzelnden) mit adulten (schwer zu bewurzelnden) in vitro Kulturen der Ess-Kastanie während der Wurzelinduktionsphase verglichen. Während juvenile Sprosse drei Tage nach der Induktion Wurzelprimordien entwickelten, kam es bei adulten Sprossen zu Zellteilungen des Kambiums ohne Differenzierung. Dies zeigt, dass ausschlaggebend für die Bewurzelungsfähigkeit juveniler Kulturen die Fähigkeit zur schnellen Differenzierung der Kambiumzellen unter Einfluss von exogen applizierten Auxin ist. Der zusätzlich hohe endogene Auxingehalt adulter Kulturen, der in der Arbeit von BALLESTER et al. (1999) ermittelt wurde, lässt die Vermutung zu, dass die Bewurzelung von in vitro Kulturen nicht in Abhängigkeit des exogen zugeführten Hormons gesehen werden kann, sondern als Veränderungen des gesamten Phytohormonmetabolismus der Kulturen betrachtet werden muss. In der Arbeit von HAUSMAN (2002) über das Zusammenspiel von Auxin und Wurzel wird hervorgehoben, dass nicht das exogen zugeführte Hormon, sondern das Zusammenspiel aller endogenen und exogenen Hormone das Wachstum und die Entwicklung der Pflanzen beeinflussen. Neben den hormonellen Bedingungen in der Pflanze spielen Umwelteinflüsse, besonders während der unsterilen Bewurzelungsphase ex vitro eine Rolle. Es ist bekannt, dass Bakterien und Pilze das Wachstum von Pflanzen beeinflussen können. Die 98 Diskussion unterschiedlichen Bewurzelungsergebnisse der in Escherode durchgeführten Versuche und die des Partnerlabors „Institut für Pflanzenkultur“ verdeutlichen dies. Mykorrhiza-Pilze spielen bei der Entwicklung von Gehölzen eine bedeutsame Rolle, durch die Symbiose dieser Wurzelpilze wird die Nährstoffaufnahme der Bäume optimiert. Für die Bewurzelung nach sterilen in vitro Kulturen ist es nötig, dass diese Symbiose möglichst bald nach dem Transfer in Erde hergestellt wird. Bei dem Einsatz von unsteriler Erde wird dies schnell erreicht (BONGA und VON ADERKAS 1992). Routinemäßig wurde zur Bewurzelung in allen beteiligten Labors unsterile Erde verwendet. Es kann aber keine Aussage über den Bakterien- und Mykorrhizapilzgehalt der jeweils benutzten Erde getroffen werden, da eine systematische Untersuchung der Bewurzelung in unsteriler und steriler Erde nicht durchgeführt wurde. Grund hierfür war der enorme Pflanzenbedarf an adulten in vitro Sprossen, der für eine solche Untersuchung nötig gewesen wäre. Die zum damaligen Zeitpunkt (Frühjahr 2004, siehe Kap. 5, Tabelle 18) forcierten Versuche zur Kryokonservierung adulter Pflanzen ließen eine Abgabe von Sprossen nicht zu. Der unterschiedliche Mikrorganismenbesatz kann also eine Ursache für die unterschiedliche Bewurzelung sein. 5.2 Kryokonservierung In der Literatur wurden bisher keine Methoden zur Kryokonservierung von vegetativ erzeugtem Pflanzenmaterial der Gemeinen Esche oder anderer Arten der Gattung Fraxinus veröffentlicht. Mit dem in dieser Arbeit beschriebenen Kryokonservierungsprotokoll für Fraxinus excelsior besteht erstmalig die Möglichkeit, Kulturen über einen unbestimmten Zeitraum zu lagern und den Genotyp der Mutterpflanzen zu erhalten. Dies bietet für die Forstwirtschaft die Möglichkeit, besonders wertvolle Genotypen mit bestimmten Merkmalen, die die Mutterbäume evtl. erst im hohen Alter oder nach dem Fällen am liegenden Baum aufweisen (z. B. Riegelung des Holzes), für Züchtungszwecke zu nutzen. Kryokonservierte Kulturen können jederzeit wieder regeneriert werden und bieten deshalb eine hochwertige Genressource für mögliche Züchtungsprogramme oder Nachfragen aus der Wirtschaft. Die Entwicklung des Kryokonservierungsprotokolls für Fraxinus excelsior war geprägt durch eine persönliche Schulung durch Barbara Reed (National Clonal Germplasm Repository, Corvallis, USA) und Erika Benson (University of Abertay, Dundee, 99 Diskussion Schottland) sowie den vorliegenden Kryokonservierungsprotokollen für Johannisbeere und Wildbirne von REED (2001 a). Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, durch eine detaillierte Beschreibung der methodischen und empirischen Vorgehensweise bei der Entwicklung des Verfahrens, Anhaltspunkte für die Entwicklung weiterer Protokolle zur Kryokonservierung von Gehölzen zu liefern. Eine Optimierung der Versuchsbedingungen muss immer in Abhängigkeit von dem Ausgangsmaterial (juvenil oder adult), der Art und den Laborbedingungen erfolgen. Die 2004 veröffentlichte Arbeit von REED et al. dokumentiert, dass die Übermittlung derselben Methoden und desselben Kulturmaterials in unterschiedlichen Laboren zu sehr unterschiedlichen Ergebnissen führte. Der erste entscheidende Schritt bei der Kryokonservierung ist die Präparation der Sprossspitzen. Nur bei optimaler und reproduzierbarer Regeneration der Sprossspitzen nach der Präparation können die Versuche fortgesetzt werden. Dies bedeutet ein intensives Training der Mitarbeiter, die an den Versuchen arbeiten. 5.2.1 Alginat- / Dehydrationsmethode Die Arbeiten zur Kryokonservierung wurden mit der Alginat- / Dehydrationsmethode begonnen. Grund hierfür war die einfach zu handhabende Methode der Einkapselung in Alginat. Die vorliegenden Ergebnisse zeigen, dass die Methode für Sprossspitzen der Gemeinen Esche ungeeignet ist, da die Explantate sehr sensitiv auf osmotische Dehydration und auf Trocknung reagierten. Dies spiegelt sich in den Ergebnissen (siehe Kap. 4.2.2.2) und in zusätzlichen nicht dargestellten Versuchen, die zur Abhärtung der in vitro Kulturen vor der Kryokonservierung durchgeführt wurden, wider. In diesen Versuchen wurden ca. 1 cm lange juvenile Sprosse anstelle einer Kälteabhärtung einer Abhärtung auf einem Medium mit 0,75 M Saccharose unterzogen. Der Habitus der Pflanzen nach vier Tagen auf diesem Medium war wesentlich schlechter als nach einer Kälteabhärtung von 28 Tagen. Sprosse auf dem Saccharosemedium bildeten bräunliche und weiche Sprossachsen sowie braune ruhende Achselknospen. Aus diesem Grund wurde diese auch in der Literatur beschriebene Abhärtung von in vitro Kulturen auf Zuckermedien (WANG et al. 2002) nicht weiterverfolgt. Weiterhin zeigte sich, dass die Alginat- / Dehydrationsmethode anfällig für nicht beeinflussbare Faktoren ist, die die Reproduzierbarkeit beeinträchtigen. Zum Beispiel hat 100 Diskussion die Kugelgröße, Form und Gewicht, die trotz optimierter Herstellung von Mitarbeiter zu Mitarbeiter variiert (siehe Kap. 4.2.2.1), einen Einfluss auf die Trocknungsgeschwindigkeit. Auch die Witterungsbedingungen, besonders die Luftfeuchtigkeit bei den vorliegenden Laborbedingungen, hatten einen Einfluss auf den Feuchtigkeitsgehalt der Kugeln. Auffällig war dies besonders nach der Trocknung unter dem Luftstrom der Werkbank, die in der Anleitung nach REED (2001 a) beschrieben ist. Ein Wechsel zu einer Trocknung über Silicagel brachte konstantere Ergebnisse und wurde als Standard festgelegt (siehe Kap. 3.3.4). 5.2.2 Vitrifikationsmethode mit PVS2 Die Kryokonservierung von Sprossspitzen durch Vitrifikation mit Hilfe der PVS2-Lösung führte zu der Entwicklung eines für die Gemeine Esche optimierten Protokolls. Durch die Entwicklung der PVS2-Lösung nach SAKAI et al. (1990) ist die Möglichkeit der kompletten Vitrifikation, sowohl des Cytosols als auch der umgebenden Lösung geschaffen worden. Die PVS2-Lösung ist die am häufigsten eingesetzte Gefrierschutzlösung und wird zur Kryokonservierung verschiedener Arten verwandt (TSAI und HUBSCHER 2004). Trotz dieser Erfolge wurden bis heute nur wenige Laubbaumarten erfolgreich kryokonserviert. So existieren veröffentlichte Protokolle für vegetative Explantate (ruhende Knospen oder in vitro Sprossspitzen) von Ulmus spp., Populus spp. und einigen Obstbäumen (TSAI und HUBSCHER 2004). An der Niedersächsischen Versuchsanstalt in Escherode wurden bisher Winterknospen von Ulmus spp. über die Methode des schrittweisen Einfrierens (HARVENGT et al. 2004) und Sprossspitzen von Prunus avium und Betula spp. mit der Vitrifikationsmethode mit PVS2 (unveröffentlicht) erfolgreich kryokonserviert. Eine Verbesserung des PVS2-Protokolls wurde für besonders recalcitrante Arten durch eine 2-Stufen-Behandlung (Vorbehandlung in einer Lösung mit 2 M Glycerol und 0,4 M Saccharose) erreicht (SAKAI 1995). Diese Methode führte auch bei der vorliegenden Arbeit zu einer Regeneration der kryokonservierten Sprossspitzen. Die anfängliche Vorbehandlung in einer BSA-Lösung (siehe Kap. 3.3.5.2, wie sie von REED (2001 a) beschrieben wird, führte zu einem sofortigen Absterben der Explantate nach dem Erwärmen. Sichtbar wurde dies durch ein sofortiges Verbräunen der Sprossspitzen. 101 Diskussion Der zweite große Schritt bei der Optimierung des Vitrifikationsprotokolls ist durch das Absetzen der Vorkultur auf einem 5 % DMSO-Medium bzw. den Wechsel zu einem neutralen Medium wie dem Standardmedium gelungen. DMSO ist neben Glycerol eines der am häufigsten verwendeten Kryoprotektantien. Die Vorkultur der Sprossspitzen auf einem DMSO-Medium soll vor allem eine Stabilisation der Zellmembranen bewirken und somit die Regeneration nach der Kryokonservierung fördern (PENCE 1995). Die Konzentration, bei der DMSO toxisch auf die Zellen wirkt, ist je nach Art verschieden und muss empirisch ermittelt werden (JEKKEL et al. 1995). Gründe für die schlechte Regeneration kryokonservierter Sprossspitzen von Fraxinus excelsior nach einer DMSO- Vorbehandlung können somit eine zu hohe, für diese Art toxische DMSO-Konzentration des Vorbehandlungsmediums sein (siehe Kap. 4.2.3.3). Eine Vorkultur auf einem Medium mit 0,8 M Glycerol und 0,4 M Saccharose wird in der Veröffentlichung von TURNER et al. (2001 a) positiv für die Regeneration kryokonservierter Sprossspitzen beschrieben. In einer weiteren Publikation derselben Arbeitsgruppe (TURNER et al. 2001 b) wird die stereochemische Anordnung der Hydroxylgruppen bei verschiedenen Zuckern und Polyalkoholen untersucht und die gute Regeneration nach einer Inkubation in glycerolhaltigem Medien auf die Anordnung und Anzahl der Hydroxylgruppen bezogen. Der positive Einfluss von Glycerol in den Vorbehandlungsmedien auf die Regeneration wird auch mit der vorliegenden Arbeit bestätigt. Faktoren, wie die Kulturdauer und die Abhärtungszeit, sind entscheidend für den Erfolg der Kryokonservierung, müssen aber für jede Kultur bzw. für die jeweiligen Kulturbedingungen optimiert werden. Optimierte in vitro Bedingungen sind Voraussetzung für den Erfolg der Kryokonservierung. Der Erfolg dieser Arbeit zur Kryokonservierung von Fraxinus excelsior liegt vor allem in der Anwendbarkeit des Protokolls sowohl für juvenile als auch für adulte Klone. Herauszustellen ist, dass für eine zukünftige Kryokonservierung verschiedener Genotypen die Regeneration nach der Einlagerung in Stichproben überprüft werden muss. Für eine sichere Langzeitlagerung sollte die Anzahl der eingelagerten Proben der Überlebensrate angepasst werden (REED 2001 b). 102 Diskussion 5.3 Fazit der vierjährigen Forschungsarbeit Mit dieser vorliegenden Arbeit wird eine Methode zur Verfügung gestellt, die die Erhaltung und Vermehrung von ausgewählten Genotypen von Fraxinus excelsior gewährleistet. Für die Zukunft sollen diese Methoden der in vitro Kultivierung und Kryokonservierung sicher stellen, dass selektierte hochwertige Genotypen der Gemeinen Esche jederzeit bei Anfragen aus der Wirtschaft oder der Forschung zur Verfügung stehen. Weiterhin ist geplant, von den etablierten Kulturen Klonprüfungen anzulegen, um damit die Stabilität der selektierten Eigenschaften zu überprüfen. Mit dieser Arbeit soll außerdem herausgestellt werden, dass sowohl die in vitro Kultivierung von Gehölzen als auch die Kryokonservierung in großem Maße von dem Genotyp der Mutterpflanzen abhängen. Bis heute gibt es keine Methoden, die feststellen oder vorhersagen können, ob bestimmte Genotypen recalcitrant für die in vitro Kultivierung oder Kryokonservierung sind. Aus diesem Grund ist es wichtig, eine große Anzahl Individuen unterschiedlicher Herkunft zu testen, um mit den resultierenden etablierten Kulturen eine möglichst hohe Diversität zu gewährleisten. 5.4 Ausblick und Zukunft der in vitro Kultur und Kryokonservierung von Gehölzen Einen positiven Ausblick für die Zukunft von in vitro Kulturen bieten die in den letzten Jahren gemachten Fortschritte zur Wirkweise der Phytohormone im pflanzlichen Organismus. Die in Kapitel 2.5.4 vorgestellten neuen Arbeiten aus den Jahren 2000 bis 2003 zu Signaltransduktionswegen von Cytokininen sowie deren Genexpression während verschiedener Entwicklungsstadien der in vitro Kulturen von Arabidopsis (SCHMÜLLING 2002, CHE et al. 2002, HOWELL et al. 2003) sowie dem abhängigen Zusammenspiel von Auxin und Cytokinin im Zusammenhang mit der Apikaldominanz (SHIMIZU-SATO und MORI 2000) zeigen, dass eine Vertiefung im Verständnis der physiologischen Abläufe abhängig von dem Fortschritt molekularbiologischer Forschung ist. Alle vorgestellten Untersuchungen wurden an Arabidopsis durchgeführt. Mehr als 7000 Wissenschaftler benutzen derzeit Arabidopsis als Modellpflanze (TAYLOR 2002). Dies zeigt das Bedürfnis der Forschung nach einem System an dem Grundlagen modellhaft erarbeitet werden können. Einerseits fördert dies das Grundlagenwissen, andererseits ist es 103 Diskussion fraglich, inwieweit dort gewonnene Ergebnisse auf andere Organismen übertragen werden können. Gehölze zum Beispiel unterscheiden sich grundsätzlich, aufgrund ihrer Entwicklung und Langlebigkeit, von krautigen Pflanzen wie Arabidopsis. Ein entscheidender Unterschied ist die Bildung von sekundärem Xylem, aber trotz der augenscheinlichen Unterschiede konnten bisher z. B. dieselben xylembildenden Gene in Arabidopsis und in Pinien gefunden werden (TAYLOR 2002). Solche Ergebnisse zeigen die Notwendigkeit von Modellpflanzen. In den letzten Jahren entwickelte sich die Gattung Populus zur Modellpflanze der Gehölze. Ihr relativ kleines Genom (450-550 MBp), welches mittlerweile fast entschlüsselt ist, bietet die Möglichkeit, transgene Pflanzen herzustellen und prädestiniert somit speziell Populus zur Modellpflanze (TAYLOR 2002). Klone dieser Art lassen sich außerdem leicht in Gewebekultur überführen. Diese Fähigkeit der guten Vegetativvermehrung und das schnelle Wachstum von Populus schaffen die Sicherheit, ausreichend klonales Material für Versuche und deren Wiederholungen zur Verfügung zu stellen (FLADUNG 1998). Im Gegensatz zu anderen Baumarten, die aufgrund ihres Wertes oder ihrer Seltenheit züchterisch bearbeitet oder erhalten werden, steht bei Populus die Erforschung des Grundlagenwissens im Vordergrund. Besonders hier zeigt sich die Problematik, Ergebnisse auf andere Baumarten zu übertragen. Zu verschieden sind Wuchs und Entwicklung verschiedener Baumarten. Zum Beispiel unterscheidet sich die Blühfähigkeit der Bäume erheblich. Bei Weide wird diese mit einem Jahr, bei Populus mit sechs und bei Eiche mit 60 Jahren erreicht (TAYLOR 2002). Die Gemeine Esche erreicht ihre Blühfähigkeit mit ca. 15 bis 30 Jahren (ROLOFF und PIETZARKA 1997). Die hier vorgelegte Arbeit macht deutlich, dass trotz des sich schnell entwickelnden Grundlagenwissens diese Erkenntnisse bis heute nur unzureichend in die Praxis übertragen werden können. Die Methoden und die Durchführung der in vitro Etablierung, aber auch die Methoden der Kryokonservierung beruhen nach wie vor auf Beobachtung und Weiterentwicklung der Versuchsbedingungen. Auch zeigen die zahlreich existierenden Veröffentlichungen zur in vitro Kultur verschiedener Bäume und krautiger Pflanzen, dass die Ergebnisse nicht übertragbar sind, sondern auch heute artspezifisch und empirisch ermittelt werden müssen. Molekularbiologische Methoden werden aber besonders zur 104 Diskussion Qualitätsabsicherung und Kontrolle immer mehr an Bedeutung im Rahmen der Gehölzpflanzenproduktion über Gewebekulturen gewinnen. Die politischen Richtlinien, wie in der Einleitung dargestellt (siehe Kap. 2.1 und 2.2) zeigen, dass der Einsatz von z. B. transgenen Bäumen noch nicht vorstellbar ist. In dem Forum Genetik-Wald-Forstwirtschaft, das im September 2004 in Teisendorf, Deutschland stattfand, wurden Ergebnisse forstgenetischer Feldversuche, Laborstudien und ihre Umsetzung in die Praxis vorgestellt (BAYRISCHES AMT FÜR FORSTLICHE SAAT- UND PFLANZENZUCHT 2004). Fazit dieser Tagung war, dass Erkenntnisse über Wuchsform und Eigenschaften von Gehölzen weiterhin über groß angelegte Feldversuche durchgeführt werden müssen, diese aber von molekularbiologischen Erkenntnissen zukünftigt begleitet werden. Gerade die biologische Diversität von Beständen oder die Identifizierung von Herkünften mit Hilfe von molekularen Markern sind von besonderer Bedeutung für eine zukunftsorientierte Forstwirtschaft. Molekulare Methoden werden zukünftig immer mehr zu Kontrollzwecken und als Wegweiser für forstliche Eingriffe benutzt werden. 105 Zusammenfassung 6 Zusammenfassung 6.1 In vitro Kultur von Fraxinus excelsior • Etablierung von in vitro Kulturen aus zygotischen Embryonen war ohne Probleme möglich. • Etablierung von in vitro Kulturen direkt von den Mutterbäumen ist nicht zu empfehlen. Bei jungen Trieben zeigten sich zu hohe Kontaminationen und keine Regeneration. Ruhende Knospen zeigten eine schlechte Regeneration. • Pfropflinge der Mutterbäume stellten eine optimale Explantatquelle dar und bo- ten die Möglichkeit, Kontaminationen durch kontrollierte Umweltbedingungen zu verringern (z. B. Transfer in ein Gewächshaus). • HgCl2 lieferte bessere Regenerationsraten nach der Oberflächensterilisation verglichen mit NaOCl. • Der Zusatz von BAP zu dem Bewurzelungsmedium erhöhte die Bewurzelung bei adulten Kulturen signifikant. • Die Bewurzelung erfolgte meist erst nach dem Transfer in Erde und war von Labor zu Labor unterschiedlich. • Der Genotyp beeinflusste signifikant die Regeneration, Vermehrung und Bewurzelung. 6.2 Kryokonservierung • Die Alginat- / Dehydrationsmethode eignete sich für Sprossspitzen von Fraxinus excelsior nicht, da das eingekapselte Material sehr sensitiv auf Dehydration reagierte. • Die Kryokonservierung von juvenilen und adulten Kulturen war mit der optimierten Vitrifikationsmethode mit PVS2 möglich. • Die Regeneration der einzelnen Genotypen war klonabhängig. • Beginn der Einlagerung aller etablierten Kulturen in eine Datenbank. • Bereitstellung von hochwertigem Material zur Nutzung des genetischen Potentials der Gemeinen Esche. 106 Literatur und Quellenangaben 7 Literatur und Quellenangaben 7.1 Literatur AHUJA M. 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WEISER C. J. (1970). Cold Resistance and injury in woody plants. Science 168: 1269-1277. WILSON M., HIRANO S. S., LINDOW S. E. (1999). Location and survival of leaf-associated bacteria in relation to pathogenicity and potential for growth within leaf. Applied and Environmental Microbiology: 1435-1443. WETTERSTATION GÖTTINGEN. www.wetterstation-göttingen.de WITHERS L. A. (1979). Freeze preservation of somatic embryos and clonal plantlets of carrot (Daucus carota L.). Plant Physiology 63: 460-467. WITHERS L. A., KING P. J., (1979). Proline: A novel cryoprotectant for the freeze preservation of cultured cells of Zea mays L. Plant Physiology 64: 675-678. 7.2 Persönliche Mitteilungen BENSON E. E., Universität of Abertay, Dundee, Schottland DE CUYPER B. Institute for Forestry and Game Management, Hoeilaart, Belgien DOUGLAS G., Teagasc, Kinsealy Research Centre, Dublin , Irland MEIER-DINKEL A., Niedersächsische Forstliche Versuchsanstalt, Abteilung Waldgen- ressourcen, Staufenberg, Deutschland REED B., National Clonal Germplasm Repository, Corvallis, USA. SOMMER L., Vitroform, Arslev, Dänemark SOPPA, B., Niedersächsische Forstliche Versuchsanstalt, Abteilung Waldgenressourcen, Staufenberg, Deutschland 7.3 Berichte RAP-PROJEKTBERICHT 2004, Vertragsnummer QLK5-CT-2001-00631 (2003). Third Progress Report NIEDERSÄCHSISCHE FORSTLICHE VERSUCHSANSTALT. Tätigkeitsbericht (2000). Göttingen, Deutschland NIEDERSÄCHSISCHE FORSTLICHE VERSUCHSANSTALT. Tätigkeitsbericht (2001). Göttingen, Deutschland 115 Literatur und Quellenangaben 7.4 Zitierte Projektpartner des RAP-Projektes CENTRE DE RECHERCHE PUBLIC- GABRIEL LIPPMANN- (CRP-GL), Luxemburg UNIVERSITE PARIS-XI. EMGREF, Laboratoire Evolution et Systématique, Orsay, Frankreich TEAGASC, Kinsealy Research Centre, Dublin, Irland INSTITUT FÜR PFLANZENKULTUR (IFP), Schnega, Deutschland VITROFORM, Arslev, Dänemark 116 Literatur und Quellenangaben 8 Anhang 117 A nh an g An ha ng 1 En gl is ch e Zu sa m m en fa ss un g be ka nn te r V er öf fe nt lic hu ng en z ur in v itr o Ku ltu r v on F ra xi nu s sp p. 1. M ic ro pr op ag at io n of F ra xi nu s ex ce ls io r Tr ee a ge Ex pl an t so ur ce St er ili sa tio n M ed iu m G ro w th re gu la to rs Ty pe o f de ve lo pm en t R ef er en ce 30 y ea r (g ra fte d) sh oo t t ip s, si ng le no de s 1 m in a lc oh ol 7 0% 15 m in N aO C l 1 .5 % 4 h w as hi ng in s te ril e ta p w at er 15 m in N aO C l 1 .5 % 3 tim es w as hi ng in s te ril e ta p w at er 1) M S m ac ro sa lts 0 .7 5 st re ng th * 2) W PM m ac ro sa lts fu ll st re ng th * 3) W PM m ac ro sa lts 0 .5 st re ng th * *M S m ic ro sa lts 0 .5 s tre ng th , N aF eE D TA 3 7. 5 m g/ l, Su cr os e 2 % , M S vi ta m in s, a sc or bi c ac id 2 m g/ l, bi ot in 1 m g/ l, m es o- in os ito l 1 00 m g/ l, D ai ch in A ga r 0. 65 % , p H 6 1) 2) P BA 3 m g/ l IB A 0. 15 m g/ l 3) IB A 1 m g/ l sh oo t g ro w th o f ad ul t a xi lla ry b ud s an d sh oo t t ip s, sh oo t e lo ng at io n, ax illa ry b ra nc hi ng , ro ot in g (b es t r es ul ts af te r 4 d ay s of in iti al da rk ne ss ) Pi er ik a nd S pr en ke ls (1 99 7) . In : B io te ch . i n A gr ic ul tu re a nd Fo re st ry 3 9. B aj aj (E d. ). S pr in ge r V er la g 70 y ea rs , 30 y ea rs sh oo t t ip s, no de s 20 m in 1 0 % d om es to s co m m er ci al bl ea ch s ol ut io n rin se w ith w at er 1) D KW 2) D KW 3) W PM 0 .5 s tre ng th 4) M S 1) -- --- 2) B AP 2 2. 2 µM /l 3) IB A 4. 9 µM /l P G 1 m M 4) T D Z 0. 97 m g/ l sh oo t g ro w th , ro ot in g of s ho ot s, pr od uc tio n of a dv en - tit io us s ho ot s fro m yo un g le av es , ro ot in g of s ho ot s H am m at t ( 19 96 ). In : B io te ch . i n A gr ic ul tu re a nd A gr ic ul tu re a nd Fo re st ry 3 9. B aj aj (E d. ). S pr in ge r V er la g 4 -7 y ea rs ap ic al bu ds , st em cu tti ng s 40 m in a qu eo us s ol ut io n of H gC l 2 an d so di um la ur yl s ul fa te (S D S) 40 m in 9 % (w /v ) C a( C l) 2 (b ud s) 20 m in 5 % (w /v ) C a( C l) 2 h yp oc hl or ite (a ct iv e gr ow th ) rin se 3 ti m es in s te ril e w at er 1) Q L or W PM 2) Q L or W PM 3) W PM 0 .5 s tre ng th + st er ilis ed 4) p ea tp er lit e ve rm ic ul ite m ix tu re 1) -- --- 2) B AP 4 m g/ l IB S 0 .0 1 m g/ l 3) -- --- sh oo t d ev el op m en t fro m a pi ca l a nd ax illa ry b ud s, sh oo t e lo ng at io n, fo rm at io n of c al lu s, ro ot in g of s ho ot s Si lv ei ra a nd C ot tig ne s (1 99 4) . C an ad ia n jo ur na l of B ot an y7 2: 2 61 - 26 7 3 ye ar s ax illa ry bu ds no c om m en ts 1) 2) 3) Q L an d iro n co m pl ex w ith et hy le ne d ia m in e 1) 2) 3) BA P 1 m g/ l IA A 0. 2 m g/ l sh oo t d ev el op m en t fro m a xi lla ry b ud s, ro ot s ap pe ar w ith ou t an y tra ns fe r t o ro ot in g m ed ia Le fo re st ie r e t a l. (1 99 0) . I n: P ro c. o f 7t h In t. C on gr . o n P la nt , T is su e an d C el l C ul tu re . Am st er da m , 1 12 11 8 A nh an g A nh an g 1 En gl is ch e Zu sa m m en fa ss un g be ka nn te r V er öf fe nt lic hu ng en z ur in v itr o K ul tu r v on F ra xi nu s sp p. 1. M ic ro pr op ag at io n of F ra xi nu s ex ce ls io r Tr ee a ge Ex pl an t so ur ce St er ili sa tio n M ed iu m G ro w th re gu la to rs Ty pe o f de ve lo pm en t R ef er en ce br ed m ot he r tre e no da l se gm en ts • 7 m in 0 .2 % H gC l 2 3) W P M + m es oi no si te 3 0m g/ l 5) Z eo lit e/ sa nd /s oi l 1 :1 :3 3) B AP 0 .0 5- 0. 1 m g/ l I AA 0 .7 -1 .5 m g/ l 5) -- --- in du ce s rh iz og en es is u nd er in v itr o co nd iti on s, ad ap ta tio n to g re en - ho us e co nd iti on s G ar el ko va e t a l. (1 99 1) . C om pt és R en du s de l`Á ca de m ie B ul ga re d es S ci en ce s 44 :1 05 - 10 8 m at ur e tre es sh oo t t ip s or b ud s • w as hi ng • 10 m in 0 .1 % H gC l 2 • rin se o nc e in s te ril is ed w at er • 20 m in 7 % c al ci um h yp oc hl or ite • w as h 3 tim es in s te ril e w at er • dr y in th e la m in ar fl ow c ab in et 2) M S /V it. B 5 Q R C (h or m on e fre e M ed iu m ) ch an ge of th e m ed ia ev er y 5- 6 w ee ks 3) M S 1 /1 0 st re ng th 2) B AP 5 m g/ l TD Z 1. 1 m g/ l IB A 0. 2 m g/ l 3) IB A 5- 10 m g/ l sh oo t d ev el op m en t fro m s ho ot ti ps a nd bu ds , e lo ng at io n, ad ve nt iti ou s sh oo t fo rm at io n, ro ot in g of th e sh oo ts D ou gl as a nd M c N am ar a (2 00 0) . Te ag as c, D ub lin 1) = C on di tio ns fo r i ni tia tio n an d is ol at io n 2) = C on di tio ns fo r s ho ot m ul tip lic at io n 3) = C on di tio ns fo r r oo tin g 4) = C on di tio ns fo r a dv en tit io us s ho ot d ev el op m en t 5) = G re en ho us e co nd iti on s 6) = G er m in at io n 11 9 A nh an g A nh an g 1 En gl is ch e Zu sa m m en fa ss un g be ka nn te r V er öf fe nt lic hu ng en z ur in v itr o K ul tu r v on F ra xi nu s sp p. 2. M ic ro pr op ag at io n of F ra xi nu s ss p. Tr ee a ge Ex pl an t so ur ce St er ili sa tio n M ed iu m G ro w th re gu la to rs Ty pe o f de ve lo pm en t R ef er en ce 15 -2 5 ye ar s ( F . am er i- ca na ) 20 -3 0 ye ar s ( F . pe nn sy l- va ni ca ) sh oo t t ip s • 20 m in 0 .5 % N aO C L + Tw ee n 20 • 3 x 5 m in w as hi ng in s te ril is ed de io ni ze d w at er 1) W PM 2) li qu id W PM 3) W PM 1) -- --- 2) B AP 5 - 10 m g/ l 3) IB A 0. 1 - 1 m g/ l + 10 g /l ac tiv at ed c ha rc oa l o r m oi st en ed v er m ic ul ite sh oo t e lo ng at io n, br an ch in g (o nl y on w hi te a sh ), ro ot in g of s ho ot s Pr ee ce e t a l. (1 98 7) . P ro ce ed in gs , I nt er - na tio na l P la nt P ro - pa ga to rs ` S oc ie ty , 37 : 3 66 -3 73 . 30 y ea r ol d (F . o rn us ) sh oo t ap ic es • st em s w er e rin se d fo r 1 2 h in ru nn in g ta p w at er • 30 s ec 7 0 % e th an ol 0 .1 % T w ee n 80 • 15 m in 3 % N aO C l • 1) li qu id R ug in i ( R ug in i, 19 86 ) 2) s ol id ifi ed R ug in i 3) H el le r m ed iu m (H el le r, R . 1 95 3) 1) B AP 2 2. 2 µM 2) -- --- 3) B AP 0 .4 µ M N AA 2 .5 µ M ax illa ry b ud d e- ve lo pm en t, sh oo t p ro lif er at io n, el on ga tio n, ro ot in g of th e sh oo ts Ar ril ag a et a l. (1 99 2) . J. A m er . S oc . H or t. Sc i. 11 7: 3 46 -3 50 10 y ea r ol d ( F . an gu s- tif ol ia ) ap ic al b ud pl us o ne no de , si ng le no de • 30 m in 1 .6 % N aO C l • rin se 3 ti m es in s te ril e di st ille d w at er 1) Q l 2) D KW 3) W PM 1) -- --- 2) B AP 4 .4 µ M IB A 0 ,9 8 µM 3) IB A 0 .9 8- 4 .9 µ M ax illa ry b ud d e- ve lo pm en t, sh oo t p ro lif er at io n, el on ga tio n, ro ot in g of th e sh oo ts Pe rr ez -P ar ro n et al . ( 19 94 ). Pl . C el l T is su e an d O rg an C ul tu re V ol . 37 : 2 97 -3 02 1) = C on di tio ns fo r i ni tia tio n an d is ol at io n 2) = C on di tio ns fo r s ho ot m ul tip lic at io n 3) = C on di tio ns fo r r oo tin g 4) = C on di tio ns fo r a dv en tit io us s ho ot d ev el op m en t 5) = G re en ho us e co nd iti on s 6) = G er m in at io n 12 0 A nh an g A nh an g 1 En gl is ch e Zu sa m m en fa ss un g be ka nn te r V er öf fe nt lic hu ng en z ur in v itr o K ul tu r v on F ra xi nu s sp p. 3. E st ab lis hm en t o f s ho ot c ul tu re s w ith e m br yo s of F ra xi nu s sp p. Ex pl an t s ou rc e St er ili sa tio n of s ee ds M ed iu m G ro w th re gu la to rs Ty pe o f de ve lo pm en t R ef er en ce Fr ax in us a ng us tif ol ia • se ed s w er e sc ar ifi ed w ith sa nd pa pe r • 30 m in 2 .4 % N aO C l • rin se d th re e tim es in s te ril e di st ille d w at er 6) M S 2) Q L 3) W PM 6) -- --- 2) B AP 8 ,9 µ M IB A 0. 49 µ M 3) IB A = 0. 98 -4 .9 µ M ge rm in at io n, sh oo t m ul tip lic at io n, ro ot in g of th e sh oo ts Pe rr ez -P ar ro n et a l. (1 99 4) . Pl an t C el l, Ti ss ue an d O rg an C ul tu re 3 7: 29 7- 30 2 F. a m er ic an a , F. p en ns yl va ni ca M ar sh . F. a ng us tif ol ia V ah l. ss p. • 30 m in 1 % N AO C l + 0 .0 1 % Tw ee n 20 • rin se 3 x 5 m in i n st er ile de io ni ze d w at er • on e th ird o f t he o pp os ite ra di cl e w as d is se ct ed 6) M S 2) M S 3) p ea t p lu gs 6) 2) T D Z 1 µM 3) -- --- ge rm in at io n. sh oo t m ul tip lic at io n, ro ot in g of th e sh oo ts P re ec e et a l. (1 99 5) . C an . J ou rn al o f Fo re st R es se ar ch 25 : 1 36 8- 13 74 Fr ax in us e xc el si or L . • 10 m in 0 .8 % N aO C l • rin si ng • so ak s ee ds fo r 4 8 ho ur s in st er ile w at er 4 ° C • re st er ilis e se ed s 6) M S 0. 5 st re ng th 2) D KW 3) W PM 0 .5 s tre ng th 4) M S 6) -- --- 2) B AP 2 2. 2 µM ol 3) IB A 4. 9 µM ol +P G 1 m M af te r 2 1 da ys tr an sf er to ho rm on e fre e W P M 4) fr om le av es : T D Z 4. 4 µM fro m e m br yo h yp oc ot yl : TD Z 0. 44 µ M + IB A 0. 49 µ M fro m c ot yl ed on s: TD Z 0. 22 µ M + IB A 0. 49 µ M ge rm in at io n, de ve lo pm en t o f sh oo ts fr om se ed lin gs , ro ot in g of s ho ot s, ad ve nt iti ou s sh oo ts H am m at t ( 19 96 ). In : B io te ch no lo gy in A gr ic ul tu re a nd Fo re st ry 3 9. B aj aj (E d. ). S pr in ge r V er la g Fr ax in us e xc el si or L . Fr ax in us a ng us tif ol ia (V ah l.) • 20 m in 0 .3 M N aO H • ov er n ig ht 0 .2 % C a( C lO ) 2 a t 4° C • 2 h 2 % C a( C lO ) 2 a t r oo m te m pe ra tu re 6) H 0 an d H 10 : m od ifi ed M S 2) H 10 : m od ifi ed M S - ge rm in at io n R aq ui n et a l. (2 00 2) . A nn al s of Fo re st S ci en ce 59 : 21 9- 22 4. 12 1 A nh an g Ex pl an t s ou rc e St er ili sa tio n of s ee ds M ed iu m G ro w th re gu la to rs Ty pe o f de ve lo pm en t R ef er en ce F. p en ns yl va ni ca M ar sh . • 1m in 7 0 % e th an ol • 10 m in 1 ,0 5 % N aO C l • fiv e rin se s in s te ril e, d is til le d w at er 6) M S+ B5 V ita m in s 2) M S+ B5 V ita m in s 3) M S+ B5 V ita m in s 6) -- --- 2) T D Z 5 µM B AP 5 µ M IB A 1 µM 3) IB A 5 µM ge rm in at io n, st ab le a xi lla ry sh oo t pr ol ife ra tio n, ro ot in g of s ho ot s Ki m e t a l. (1 99 7) . Pl an t C el l, Ti ss ue an d O rg an C ul tu re 48 : 4 5- 52 Ki m . e t a l. (1 99 8) . N ew F or es ts 1 6: 4 3- 57 Fr ax in us a ng us tif ol ia Em br yo a xe s an d co ty le do ns fr om m at ur e se ed s • 3 m in 7 0 % e th an ol • 20 m in 1 .8 % N aO C l • 3 rin se s in s te ril e di st ille d w at er 6) M S (O .5 s tre ng th ) 2) D KW 3) W PM 6) B AP 2 .2 µ M 2) B AP 2 .2 µ M 3) -- --- ge rm in at io n, bu d de ve lo pm en t (D uc he fa G el rit e po si tiv el y af fe ct ed th e nu m be r o f n ew bu ds ), ro ot in g of s ho ot s To ni n et a l. (2 00 1) . Sc ie nt ia H or tic ul tu re 87 : 2 91 -3 01 1) = C on di tio ns fo r i ni tia tio n an d is ol at io n 2) = C on di tio ns fo r s ho ot m ul tip lic at io n 3) = C on di tio ns fo r r oo tin g 4) = C on di tio ns fo r a dv en tit io us s ho ot d ev el op m en t 5) = G re en ho us e co nd iti on s 6) = G er m in at io n Ab br ev ia tio n: M S = M ur as hi ge a nd S ko og W PM = W oo dy P la nt M ed iu m B5 = G am bo ur g et a l. Q R C = Q ue rc us ro bu r c ul tu re M ed iu m Q L = Q uo iri n an d Le po iv re D K W = D riv er a nd K un iy uk i IB A = In do le -3 -b ut yr ic a ci d BA P = 6- Be nz yl am in op ur in e PB A = 6- (b en zy la m in o) -9 -(2 -te tra hy dr op yr an yl )-9 H -p ur in e ED TA = e th yl en e- di am in e- te tra -a ce ta te P G = 1 ,3 ,5 tr ih yd ro xy be nz en e (p hl or og lu ci no l) TD Z = Th id ia zu ro n (N -p he ny l-N ´-1 ,2 ,3 -th id ia zo l-5 -y lu re a 12 2 Anhang Anhang 2 Zusammenstellung der Anzahl von Kulturen etabliert aus zygotischen Embryonen von Fraxinus excelsior. Die Zahlen geben den Stand im Januar 2005 wieder. Dargestellt sind die Anzahl an in vitro Kulturen in der aktuellen Kultivierungsphase (in vitro), die Anzahl der bewurzelten Pflanzen ex vitro (bewurzelt), die Anzahl der im Kühlraum eingelagerten Pflanzen (Kühlraum) und ob die Kulturen kryokonserviert wurden (kryokonserviert). Klon Etabliert Einzelbaum- in vitro bewurzelt Kühlraum kryokonserviert von Jahr absaat 126-103.2 NFV-V 2002 Far 126-103 96 ja 126-103.3 NFV-C 2002 Far 126-103 48 126-103.4 NFV-C 2002 Far 126-103 96 129-6.1 NFV-C 2001 Wolf 129-6 96 ja 129-6.2 NFV-C 2001 Wolf 129-6 24 96 134-6.2 NFV-C 2002 SooA 134-6 96 ja 134-6.3 NFV-C 2002 SooA 134-6 28 96 16-1.1 NFV-C 2001 Bov 16-1 37 96 ja 16-1.2 NFV-C 2001 Bov 16-1 30 96 16-1.3 NFV-C 2001 Bov 16-1 96 47-1.1 NFV-C 2001 Wenz 47-1 32 47-1.2 NFV-C 2001 Wenz 47-1 80 47-1.3 NFV-C 2001 Wenz 47-1 80 28 47-1.5 NFV-C 2001 Wenz 47-1 96 ja 67-2.1 NFV-C 2002 Walk 67-2 32 41 96 ja 67-2.2 NFV-C 2002 Walk 67-2 96 7-3.2 NFV-C 2001 ElmEvl 7-3 6 7-3.3 NFV-C 2001 ElmEvl 7-3 16 S 8 Teagasc - - 61 96 ja 123 Anhang Anhang 3 Herkunft der 31 ausgewählten (29.03.01) Plusbäume des Eschen Herkunfts-/ Nachkommen- schaftsversuchs im Forstamt Bovenden und Anzahl der produzierten Pfropflinge und ihre Anwuchsrate. Von jedem Klon wurden mindestens zwei und maximal fünf Pflanzen zu Versuchszwecken genutzt, der Rest wurde an Projektpartner verschickt. Nr. Klonname Familienname Pfropfdatum 19.04.01 Anwuchserfolg am 13.11.01 no Pfropflinge n [%] 1 Bov 77-1 Kelheim3 8 6 (75) 2 Bov 77-2 Lüchow 326-2 8 7 (88) 3 Bov 77-3 Lüchow 326-2 8 8 (100) 4 Bov 77-4 Geislingen 3 8 4 (50) 5 Bov 77-5 Öhringen 1 8 5 (63) 6 Bov 77-6 Wienhausen 4-3 8 8 (100) 7 Bov 77-7 Witzenhausen 7 8 7 (88) 8 Bov 77-8 Lichtenfels 3 8 7 (88) 9 Bov 77-9 LWK Cloppenburg 1 8 7 (88) 10 Bov 77-10 Kelheim 1 8 6 (75) 11 Bov 77-11 Montabaur 2 8 7 (88) 12 Bov 77-12 Sinntal 1 8 8 (100) 13 Bov 77-13 Stauffenburg 2 45 B/4 8 6 (75) 14 Bov 77-14 Giengen 1 8 7 (88) 15 Bov 77-15 Busschewald 2 8 6 (75) 16 Bov 77-16 Geislingen 2 8 2 (25) 17 Bov 77-17 Farchau 126-1 8 7 (88) 18 Bov 77-18 Mellrichstadt 3 8 7 (88) 19 Bov 77-19 Mellrichstadt 3 8 8 (100) 20 Bov 77-20 Paderborn 34 8 8 (100) 21 Bov 77-21 Lichtenfels 3 8 6 (75) 22 Bov 77-22 Lichtenfels 3 8 8 (100) 23 Bov 77-23 Rendsburg 13-1 8 8 (100) 24 Bov 77-24 Wieselburg 4-1 8 5 (63) 25 Bov 77-25 Wieselburg 4-1 8 8 (100) 26 Bov 77-26 Spießingshol 3 8 5 (63) 27 Bov 77-27 Spießingshol 3 8 6 (75) 28 Bov 77-28 Mellrichstadt 1 7 7 (100) 29 Bov 77-29 Kehlheim 2 6 2 (33) 30 Bov 77-30 Kehlheim 3 8 5 (63) 31 Bov 77-31 Kehlheim 3 8 5 (63) Gesamt 2451 1961 (802) 1Anzahl der Pfropflinge. 2Mittelwert des Anwuchserfolges [%] 124 Anhang Anhang 4 Herkunft der 31 ausgewählten (26.04.01) Plusbäume des Eschen Herkunfts-/ Nachkommen- schaftsversuch im Forstamt Dannenberg und Anzahl der hergestellten Pfropflinge und ihre Anwuchsrate. Von jedem Klon wurden mindestens zwei und maximal sechs Pflanzen zu Versuchszwecken genutzt, der Rest wurde an Projektpartner verschickt. Nr. Klonname Familienname Pfropfdatum 12.03.02 Anwuchserfolg 13.12.02 Anzahl Pfropflinge n (%) 1 Dan 519-1 Montabaur 5 11 8 (73) 2 Dan 519-2 Lichtenfels 1 11 7 (64) 3 Dan 519-3 Rosenau 2 11 8 (73) 4 Dan 519-4 Lüchow 5 12 8 (67) 5 Dan 519-5 Lensahn 2 11 10 (91) 6 Dan 519-6 Lauterberg 7 11 8 (73) 7 Dan 519-7 Weissenhorn 1 12 12 (100) 8 Dan 519-8 Dierdorf 2 11 9 (82) 9 Dan 519-9 Rosenau 5 11 9 (82) 10 Dan 519-10 Lüchow 2 11 9 (82) 11 Dan 519-11 Lutter 1 11 9 (82) 12 Dan 519-12 Montabaur 5 11 9 (82) 13 Dan 519-13 Lüchow 4 11 9 (82) 14 Dan 519-14 Wieselburg 4 11 9 (82) 15 Dan 519-15 Lahr 5 11 11 (100) 16 Dan 519-16 Farchau 1 11 11 (100) 17 Dan 519-17 Rosenau 1 11 10 (91) 18 Dan 519-18 Lensahn 3 11 9 (82) 19 Dan 519-19 Lensahn 3 11 8 (73) 20 Dan 519-20 Busschewald 5 11 9 (82) 21 Dan 519-21 Dierdorf 5 11 11 (100) 22 Dan 519-22 Kelheim 4 11 9 (82) 23 Dan 519-23 Kelheim 4 11 11 (100) 24 Dan 519-24 Lüchow 1 11 10 (91) 25 Dan 519-25 Aargau - Muri 1 11 10 (91) 26 Dan 519-26 Farchau 5 11 9 (82) 27 Dan 519-27 Schöningen 3 11 10 (91) 28 Dan 519-28 Lüchow 2 11 9 (82) 29 Dan 519-29 Lüchow 2 11 10 (91) 30 Dan 519-30 Busschewald 1 11 10 (91) 31 Dan 519-31 Lüchow 2 11 11 (100) Gesamt 343 2921 (852) 1Anzahl der Pfropflinge. 2Mittelwert des Anwuchserfolges [%] 125 Anhang Anhang 5 Zusammenstellung der Anzahl von Kulturen etabliert von Pfropflingen der selektierten Plusbäume. Die Zahlen geben den Stand im Januar 2005 wieder. Dargestellt sind die Anzahl an in vitro Kul- turen in der aktuellen Kultivierungsphase (in vitro), die Anzahl der bewurzelten Pflanzen ex vitro (bewurzelt), die Anzahl der im Kühlraum eingelagerten Pflanzen (Kühlraum) und ob die Kulturen kryokonserviert wurden (kryokonserviert). Klon Etablierungsjahr Familie in vitro bewurzelt Kühlraum kryokonserviert Bov 77-2 2002 Lüchow 326-2 61 96 ja Bov 77-3 2002 Lüchow 326-2 95 96 ja Bov 77-5 2002 Öhringen 1 18 96 ja Bov 77-12 2002 Sinntal 1 27 ja Bov 77-19 2002 Mellrichstadt 3 11 96 ja Bov 77-23 2002 Rendsburg 13-1 31 96 ja Bov 77-24 2002 Wieselburg 4-1 27 96 ja Bov 77-2 2003 Lüchow 326-2 17 96 ja Bov 77-8 2003 Lichtenfels 3 58 13 Bov 77-9 2003 LWK Cloppenburg 1 54 Bov 77-12 2003 Sinntal 1 23 ja Bov 77-15 2003 Busschewald 2 45 Bov 77-23 2003 Kelheim 4 96 ja Bov 77-27 2003 Schöningen 3 37 96 ja Dan 519-1 2003 Montabaur 5 90 26 Dan 519-2 2003 Lichtenfels 1 96 ja Dan 519-4 2003 Lüchow 5 96 ja Dan 519-5 2003 Lensahn 2 96 ja Dan 519-6 2003 Lauterberg 7 91 Dan 519-9 2003 Rosenau 5 32 Dan 519-10 2003 Lüchow 4 96 ja Dan 519-12 2003 Montabaur 5 63 Dan 519-16 2003 Farchau 1 96 ja Dan 519-20 2003 Busschewald 5 100 ja Dan 519-21 2003 Dierdorf 5 41 96 ja Dan 519-27 2003 Schöningen 3 96 ja Dan 519-28 2003 Lüchow 2 2 Bov 77-3 2004 Lüchow 326-2 36 Dan 519-7 2004 Weissenhorn 1 21 Dan 519-18 2004 Lensahn 3 96 ja 126 Anhang Anhang 6 Anzahl und Erfolg der mit dem optimierten Bewurzelungsprotokoll behandelten Kulturen im Mai 2005 nach dem Projekt- und Forschungsende im Januar 2005. Versnr. Klon Medium Pikierdatum n Topfdatum bewurzelt n bewurzelt % 1903/03-05 519-2 14/225 24.05.2005 20 13.07.2005 19 95,00 1903/03-19 519-5 14/225 24.05.2005 2 08.07.2005 2 100,00 1903/03-37 519-10 14/225 24.05.2005 24 13.07.2005 22 91,67 1903/04-04 519-16 14/225 24.05.2005 21 13.07.2005 18 85,71 1903/05-07 77-2 14/225 25.05.2005 28 - - - 1903/06-31 77-23 14/225 24.05.2005 63 13.07.2005 63 100,00 1903/06-48 77-27 14/225 24.05.2005 11 13.07.2005 4 36,36 1903/12-25 519-4 14/225 24.05.2005 4 08.07.2005 3 75,00 1903/13-01 77-5 14/225 24.05.2005 99 08.07.2005 90 90,91 1903/13-04 77-24 14/225 24.05.2005 9 13.07.2005 9 100,00 1903/13-07 77-3 14/225 25.05.2005 43 14.07.2005 33 76,74 1903/13-11 77-23 14/225 25.05.2005 33 07.07.2005 30 90,91 1903/14-10 77-19 14/225 25.05.2005 5 14.07.2005 4 80,00 1903/14-22 77-2 14/225 25.05.2005 44 14.07.2005 25 56,82 1904/06-16 519-18 14/225 25.05.2005 30 14.07.2005 17 56,67 1904/03-02 77-8 14/225 20.05.2005 33 12.07.2005 33 100,00 1904/17-02 126-103.1 14/225 20.05.2005 12 12.07.2005 12 100,00 1904/17-03 77-3 14/225 20.05.2005 12 08.07.2005 10 83,33 1904/17-04 77-23 14/225 20.05.2005 8 08.07.2005 8 100,00 1904/17-05 77-5 14/225 20.05.2005 12 12.07.2005 6 50,00 1904/17-06 77-5 14/225 20.05.2005 12 08.07.2005 12 100,00 1904/17-07 77-19 14/225 20.05.2005 5 08.07.2005 5 100,00 1904/17-08 126-103.1 14/225 20.05.2005 12 07.07.2005 12 100,00 1904/17-09 47-1.1 14/225 20.05.2005 5 07.07.2005 3 60,00 1904/17-10 129-6.2 14/225 20.05.2005 12 08.07.2005 9 75,00 1904/20-01 77-8 14/225 20.05.2005 9 08.07.2005 9 100,00 1904/20-02 77-8 14/225 20.05.2005 10 12.07.2005 8 80,00 1904/20-03 77-23 14/225 20.05.2005 6 08.07.2005 6 100,00 1904/20-04 77-23 14/225 20.05.2005 6 08.07.2005 6 100,00 1904/20-05 77-2 14/225 20.05.2005 5 08.07.2005 3 60,00 1904/20-07 77-27 14/225 20.05.2005 1 08.07.2005 1 100,00 1904/20-10 77-3 14/225 20.05.2005 10 08.07.2005 9 90,00 1904/20-15 77-8 14/225 20.05.2005 6 08.07.2005 6 100,00 1904/20-16 77-8 14/225 20.05.2005 6 12.07.2005 5 83,33 1904/20-17 T70 14/225 20.05.2005 9 08.07.2005 9 100,00 127 Anhang Anhang 7 Alginat- / Dehydrations-Methode Übersetzt aus der Anleitung vom National Clonal Germplasm Repository-Corvallis (Reed 2001 a) Material 1. Sprosskulturen werden 1 Woche abgehärtet, d.h. bei einem Temperaturwechsel von 22 °C und –1 °C (8 h Licht/ 16 h Dunkelheit) kultiviert 2. Agarplatten zum Aufbewahren der Meristeme nach dem Schneiden. (Man benutzt das reguläre Wachstumsmedium oder hormonfreies MS-Medium) 3. Flüssiges MS-Medium mit 0,75 M Saccharose zur Vorbehandlung (75 ml in 125 ml Erlenmeyerkolben) 4. Flüssiges MS-Medium ohne Calcium und mit 3 % Alginat (Sigma A-2158) und 0,75 M Saccharose Das Alginat ist schwer zu lösen. Das Medium wird zuerst erhitzt und dann wird das Alginat langsam unter ständigem Rühren dazugegeben. Um die Kugeln zu gießen, benötigt man: 5. Flüssiges MS-Medium mit 100 mM Calciumchlorid (Erlenmeyerkolben) 6. Sterile 250 ml Bechergläser 7. Sterile Pipetten (Einweg-Kunststoff-Pipetten) 8. Sterile Glaspetrischalen mit Filterpapier zum Abtropfen der Alginatkugeln 9. Sterile Petrischalen um die Kugeln während der Dehydrierung aufzubewahren Vorbereitung • Ein Erlenmeyerkolben mit 0,75 M Saccharose (MS-Saccharose-Medium) • 250 ml mit Calciumchlorid Medium (MS-CaCl2-Medium), • 100 ml Becherglas mit Alginat Lösung (20-25 ml) (MS-Alginat ohne Calcium) • 1 sterile Petrischale und Pipette pro Behandlung (Genotyp) • Flüssiges MS-Medium (Rehydrierungsmedium) • Regenerationsmedium, das Regenerationsmedium sollte etwas weicher als das normale Medium sein (1 g Agar/l weniger) Methode 1. Die Meristeme (0,8 mm) werden präpariert und auf Vermehrungsmedium in Petrischalen gesammelt, bis genügend vorhanden sind. 2. Sie werden dann in ein kleines Becherglas oder in eine Petrischale mit Alginatlösung gelegt. 3. Die Meristeme werden mit der Alginatlösung vermischt. Um die Kugeln (50 mg) zu gießen, werden die Meristeme mit einer sterilen Pipette aufgenommen und in ein 250 ml Becherglas mit flüssigem MS-CaCl2- Medium getropft (mind. 100 ml). 4. Zur Aushärtung lässt man die Kugeln für ca. 20 Minuten (10-30 min.) in dieser Lösung. Anschließend werden die Kugeln mit einem sterilen Teesieb abgesiebt und in das Saccharose Medium gegeben. 128 Anhang 5. Die Kugeln werden 18 Stunden in einem 125 ml Erlenmeyerkolben mit MS-Saccharose Medium auf einem Schüttler inkubiert. Die Kugeln werden steril abgesiebt und in eine sterile Petrischale mit Filterpapier gegeben. 25 Kugeln werden in eine 10 cm Petrischale gelegt und im Luftstrom für 3-4 Stunden getrocknet. Sie sollten sich nicht gegenseitig oder die Wand berühren, da sie sonst nicht vollständig trocknen. 6. Die Kugeln werden in sterile Kryoröhrchen gegeben und einmal in den Container mit flüssigem Stickstoff (LN) getaucht, sie werden für 30 Sekunden unter der Oberfläche gehalten und danach an ihren Lagerplatz gegeben. 7. Aufbewahrung in LN für mindestens 1 Stunde oder auch länger 8. Das Auftauen erfolgt bei Raumtemperatur über 20 Minuten. Zur Rehydrierung werden die Kugeln für 5 bis 10 Minuten in flüssiges MS-Medium gegeben. Danach werden die Kugeln so auf das Regenerationsmedium gelegt, dass die Meristemseite nach unten zeigt. Das Regenerationsmedium sollte etwas weicher als das normale Medium sein (1 g Agar/l weniger). 9. Nach zwei Wochen werden die Sprosse, falls nötig von den Kugeln befreit. 10. Die Regeneration erfolgt innerhalb einer Woche. Bestimmung des Feuchtigkeitsgehalts der Alginatkugeln • Der Feuchtigkeitsgehalt wird über das Verhältnis Frischgewicht zu Trockengewicht bestimmt. Erwünscht ist ein Feuchtigkeitsgehalt von 15-25 % (18-22 %) des Frischgewichts. • Um den erforderlichen Feuchtigkeitsgehalt unter den gegebenen Laborbedingungen zu ermitteln, werden 10 Kugeln in Aluminiumschälchen gewogen, für eine bestimmte Zeit getrocknet und dann wieder gewogen. Danach werden die Kugeln 16 h in einem Ofen bei 103 °C getrocknet. Das Abkühlen erfolgt in einem Exsikkator und das Trockengewicht wird bestimmt. 129 Anhang Folgende Medien werden für die Herstellung der Alginatkugeln benötigt: 1. Alginatlösung Dieses Medium darf kein Calcium enthalten. • MS-Medium ohne Calcium • Saccharose 0,75 M (256,73 g/l) • pH: 5,7 • Alginic Acid 30 g/l (Viskosität von 2 %, Sigma A-2158) Das Alginat wird vor dem Erhitzen und unter sehr langsamen Rühren dazugegeben. Erst wenn alles gelöst ist, erfolgt das Erhitzen. Wenn man zuerst erhitzt, bildet sich ein unlösbarer Klumpen, der auch im Autoklaven nicht mehr schmilzt. Es werden 125 ml oder 250 ml in einen Erlenmeyerkolbens (zur Hälfte gefüllt) autoklaviert. 2. MS-Saccharose Medium (0,75 M) 0,75 M Saccharose Medium wird als Inkubationsmedium für die Kugeln hergestellt. Die Inkubation erfolgt über Nacht. 3. MS-CaCl2 Medium (100 mM) Calciumchlorid-Medium für die Herstellung der Kugeln Herstellung des MS-Saccharose Medium (0,75 M) und MS-CaCl2 Medium (100 mM): Medium Konz/l 500 ml 500 ml MS-Saccharose Medium MS-CaCl2 0,75 mM Saccharose 100 mM CaCL2 MS-Macro 50 ml MS-Micro 5 ml MS-Vitamine 5 ml MS-Eisen 10 ml Saccharose 30 g Es wird auf 500 ml aufgefüllt (2 x konz.) 500 ml doppelt konzentriertes MS-Medium in 2*250 ml aufteilen 250 ml 250 ml Saccharose MW 342,3 extra Saccharose 141,15 g/500 ml ----- CaCl2 ----- 7,3 g/500 ml Endvolumen 500 ml 500 ml Einstellen des pH-Wertes auf 5,7 mit 1 N HCL oder HCL Das 0,75 mM Saccharose Medium wird in 125 ml Erlenmeyerkolben (75 ml pro Erlenmeyerkolben, weite Öffnung) gegeben. Die Calciumchloridlösung wird in 250 ml Erlenmeyerkolben oder größer (100 ml / 250 ml Erlenmeyerkolben) gegeben. Beide Lösungen werden autoklaviert und müssen vor Gebrauch abgekühlt sein. 130 Anhang Anhang 8 Vitrifikationtechnik mit PVS2 Übersetzt aus der Anleitung vom National Clonal Germplasm Repository-Corvallis (Reed 2001 a) Vorbereitungen 1. Sprosskulturen werden 1 Woche bei einem Temperaturwechsel von 22 °C und –1 °C (8 h Licht/ 16 h Dunkelheit ) abgehärtet. Die Abhärtung erfolgt 2-3 Wochen nach dem letzten Transfer. 2. Petrischalen mit dem Vorbehandlungsmedium (5 % DMSO, höherer Agargehalt) 3. Flüssiges Medium mit 0,4 M Saccharose, pH 5,8 4. Sterile Bechergläser oder Petrischalen für die Gefrierschutzlösung und das flüssige Medium 5. Flüssiges Medium mit 1,2 M Saccharose, pH 5,8 6. Sterile Filterpapierstreifen in Petrischalen, um die Meristeme oberflächlich zu trocknen 7. Vermehrungsmedium in Petrischalen 8. Auf Eis gelagerte oder eingefrorene Halter für die Kryoröhrchen Isolation der Meristeme 1. Die Meristeme werden präpariert (nicht quetschen) und weitere 2 Tage auf Medium mit 5 % DMSO (v/v) und höherem Agargehalt unter den Abhärtungsbedingungen (siehe oben) aufbewahrt. 2. Nach 2 Tagen erfolgt eine Vorinkubation der Meristeme auf Eis oder im Kühlschrank in einer der folgenden Lösungen: A) Vorinkubation für 2 Stunden in einer sterilfiltrierten, 1%igen Lösung (0,4 M Saccharose) aus Bovin Serum Albumin (BSA, Sigma A9418) oder 10 % Prolin. Erst danach wird die PVS2 Lösung in die Kryoröhrchen gegeben. B) Vorinkubation für 20 Minuten in 2 M Glycerol und 0,4 M Saccharose/ MS-Medium. Ablauf der Vorinkubation und des Einfrierens Die Arbeiten werden unter der Sterilbank durchgeführt. 1. Kryoröhrchen mit 1 ml 1 % BSA-Lösung füllen. Der Röhrchenhalter soll in einem Eisblock eingefroren sein, bzw in Eis stehen. 2. Die Meristeme werden vom Vorbehandlungsmedium in die Kryoröhrchen überführt (10-25 Stück/ Röhrchen). Einwirkdauer 2 Stunden. 3. Nach 2 Stunden wird die BSA-Lösung mit einer sterilen Einwegpipette oder Einwegspritze möglichst vollständig abgesaugt. (Achtung: Nicht die Meristeme aufsaugen!). 4. 1 ml PVS2-Lösung wird zu den Meristemen in das Kryoröhrchen gegeben. Die Meristeme sollen in dieser Lösung absinken. 5. Die Einwirkdauer der PVS2-Lösung bei 0 °C (Röhrchenhalter im Eisblock) soll genau 20, 25 oder 30 Minuten betragen. Die Röhrchen bleiben in dieser Zeit in der Sterilbank in Eis. Kleiner Dewar oder Transportgefäß wird mit flüssigem Stickstoff gefüllt. 6. Nach 20 Minuten werden die Kryoröhrchen schnell in einen Aluminium-Röhrchenhalter eingespannt und sofort in flüssigen Stickstoff getaucht. Einwirkzeit 1 Stunde. Zu diesem Zeitpunkt wird eine Kontrolle mit 1,2 M Saccharosemedium gespült und auf Regenerationsmedium gesetzt. Auftauen Das Arbeiten erfolgt unter der Sterilbank 1. Aus dem Stickstoff werden die Röhrchen sehr schnell mit Röhrchenhalter für 1 min in 45 °C warmes Wasser, danach für 1-2 min in raumwarmes (25 °C) Wasser gegeben, um ein Überwärmen zu verhindern. Nach dem Wasserbad wird das Haftwasser abgeschüttelt und das Röhrchen mit Alkohol abgesprüht, um Kontaminationen zu vermeiden. 2. Die Lösung wird dann schnell mit einer Pipette oder Einwegspritze abgesaugt und 2 mal durch neues 1,2 M Saccharosemedium ersetzt. Das Absaugen und Auffüllen muss sehr schnell erfolgen. 3. Die Meristeme werden mit der Pipette auf steriles Filterpapier gelegt und anschließend sehr vorsichtig auf Regenerationsmedium überführt. Die Meristeme dürfen nicht trocken werden. 131 Anhang Folgende Lösungen werden benötigt: 1) Kryo-Vorbehandlungsmedium (5 % DMSO-Platten) Stammlsg: Konz. Menge MS-Macro 20-fach 50 ml MS-Micro 200-fach 5 ml MS-Vitamine 200-fach 5 ml MS-Eisen 100-fach 10 ml Saccharose 30 g DMSO 50 ml mit Reinstwasser auf 1 l auffüllen, der pH-Wert wird mit 1 N NaOH oder HCL auf 5,7 eingestellt. Agar: 8 g/l Difco Bacto Es kann auch eine Mischung aus Agar und Gelrite benutzt werden. Agar: 3,5 g/l Gelrite: 1,75 g/l 2) Flüssiges MS-Saccharosemedium: • 0,5 l Saccharosemedium 0,4 M --->Vitrifikationslösung • 0,5 l Saccharosemedium1,2 M ---> Waschen der Meristeme nach dem Auftauen Stammlsg. Konz. Menge 0,4 M 1,2 M Saccharosemedium Saccharosemedium MS-Macro 20-fach 50 ml MS-Micro 200-fach 5 ml MS-Eisen 100-fach 10 ml Es wird auf 500 ml aufgefüllt (2 x konz.) Die Lösung wird in 2 mal 250 ml geteilt: 250 ml 250 ml 0,4 M Saccharose 136,92 g/l 68,46 g ----- 1,2 M Saccharose 410,76 g/l ----------- 205,38 g Endvolumen 500 ml 500 ml mit Reinstwasser auffüllen Der pH-Wert wird mit 1 N NaOH oder HCL auf 5,8 eingestellt. Das Medium wird in 125 ml Erlenmeyerkolben abgefüllt, verschlossen und autoklaviert. Nach dem Autoklavieren im Kühlschrank aufbewahren. 3) Gefrierschutzlösung (PVS2) 50 ml (immer frisch ansetzen, Handschuhe tragen) Vorlage von 20 ml 0,4 M Saccharosemedium in einem 50 ml Messkolben für 50 ml 25 ml Glycerol 30 %(w/v) 11,9 ml 5,9 ml Ethylen Glykol 15 % (w/v) 6,8 ml 3,4 ml DMSO 15 % (w/v) 6,8 ml 3,4 ml Mit flüssigem 0,4 M Saccharosemedium (136,92 g/l) auf 50 ml auffüllen. Die Gefrierschutzlösung wird sterilfiltriert und im Kühlschrank aufbewahrt. 132 Anhang Anhang 9 Liste der bis Ende des Projektes Januar 2005 kyokonservierten adulten Kulturen und der jeweiligen Regenerationsrate der Kontrolle. Nr. Klon Datum Kryokonservierung Kontrolle [n] [n] Kallus / kein Wachstum Regeneration braun 1 77-2 21.07.2004 70 7 29% 71% 0% 2 77-5 21.07.2004 68 9 22% 78% 0% 3 77-24 01.09.2004 60 14 64% 0% 36% 4 77-2 15.09.2004 80 15 33% 53% 13% 5 77-23 15.09.2004 80 12 8% 50% 42% 6 77-27 13.10.2004 60 12 8% 67% 25% 7 519-21 13.10.2004 90 8 25% 38% 38% 8 519-21 13.10.2004 80 7 0% 57% 43% 9 77-3 14.10.2004 80 8 25% 63% 13% 10 77-8 14.10.2004 90 10 0% 100% 0% 11 77-5 14.10.2004 60 10 30% 30% 40% 12 T70 20.10.2004 70 10 0% 80% 20% 13 77-2 03.11.2004 80 11 36% 27% 36% 14 519-10 03.11.2004 70 9 56% 44% 0% 15 519-2 03.11.2004 60 10 60% 40% 0% 16 519-16 03.11.2004 80 8 0% 50% 50% 17 519-21 24.11.2004 80 13 85% 15% 0% 18 77-19 24.11.2004 80 10 0% 80% 20% 19 519-4 01.12.2004 70 5 0% 100% 0% 20 77-27 15.12.2004 70 8 0% 38% 63% 21 77-2 22.12.2004 70 6 0% 33% 67% 22 77-23 22.12.2004 60 10 0% 40% 60% 23 519-18 07.01.2005 70 9 0% 89% 11% 24 77-12 12.01.2005 70 10 20% 20% 60% 25 77-23 19.01.2005 60 10 0% 50% 50% 26 77-24 19.01.2005 60 6 0% 50% 50% 27 519-5 20.01.2005 70 6 17% 33% 50% 28 77-24 20.01.2005 60 8 25% 25% 50% Bonitur nach 8 Wochen 133 Anhang Anhang 10 Liste der aus 62 ausgewählten Elitebäume etablierten Klone. Die Versuche wurden sowohl an der Niedersächsischen Versuchsanstalt in Escherode als auch in den beiden kommerziellen Partnerlabors (Institut für Pflanzenkultur (IFP), Solkau, Deutschland und Vitroform, Dänemark) mit Pfropflingen derselben Mutterbäume durchgeführt. Die Anzahl der in vitro Pflanzen pro Kultur entspricht dem Stand Frühjahr 2004. Klon Familie etabliert von NFV IFP Vitroform total Dan 519-1 Montabaur 5 NFV, vitroform 13 200 213 Dan 519-2 Lichtenfels 1 NFV, vitroform 17 50 67 Dan 519-4 Lüchow 5 NFV 28 2 30 Dan 519-5 Lensahn 2 NFV 15 15 Dan 519-6 Lauterberg 7 NFV 16 5 21 Dan 519-16 Farchau 1 NFV 9 10 19 Dan 519-9 Rosenau 5 NFV 14 14 Dan 519-10 Lüchow 4 NFV 23 23 Dan 519-12 Montabaur 5 NFV 4 4 Dan 519-20 Busschewald 5 NFV 20 10 30 Dan 519-21 Dierdorf 5 NFV 282 95 10 387 Dan 519-27 Schöningen 3 NFV 27 5 32 Dan 519-28 Lüchow 2 NFV 2 2 4 Bov 77-2 Lüchow 326-2 NFV, vitroform 293 103 14 410 Bov 77-3 Lüchow 326-2 NFV, IFP 279 400 53 732 Bov 77-5 Öhringen 1 NFV, vitroform 151 57 15 223 Bov 77-6 Öhringen 1 IFP 151 184 335 Bov 77-8 Lichtenfels 3 NFV, vitroform 6 300 306 Bov 77-9 LWK Cloppenburg 1 NFV 4 4 Bov 77-12 Sinntal 1 NFV, vitroform 90 20 110 Bov 77-15 Busschewald 2 NFV 4 4 Bov 77-19 Mellrichstadt 3 NFV 175 10 20 205 Bov 77-23 Kelheim 4 NFV 246 53 15 314 Bov 77-24 Wieselburg 4-1 NFV 145 48 193 Bov 77-27 Schöningen 3 NFV, vitroform 25 300 325 Anzahl der Sprosse 134 Danksagung Ich möchte allen Menschen danken, die mich bei der Fertigstellung der Dissertation und auf dem Weg dorthin mit Ratschlägen, Aufmunterungen oder einfach nur durch ihre Anwesenheit unterstüzt haben. Besonderer Bedanken möchte ich mich hier bei meiner Freundin Ute, die mir zu jeder Zeit immer mit Hilfe zur Seite stand und mich stets ermuntert hat die Arbeit nicht aus den Augen zu verlieren und bei meiner Mutter Rosemarie. Ein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. Grotha, der die Betreuung meiner Arbeit übernommen hat und mir mit Diskussionen und Anregungen jederzeit zur Seite stand. Weiterhin danke ich Herrn Prof. Dr. Kutschera für die Übernahme des Koreferats. Ein großer Dank gilt allen MitarbeiterInnen der Niedersächsischen Forstlichen Versuchsanstalt in Escherode, durch deren Unterstützung diese Arbeit erst möglich wurde. Besonders herrvorheben möchte ich die technischen Assistenten Herrn Serge Havel, Frau Ulrike Seifert und Frau Silvia Köhler, die mich bei allen Labor- und Freilandarbeiten unterstützt haben und den Fachgebietsleiter Herrn Dr. Meier-Dinkel für die Betreuung der Projektarbeit über den gesamten Zeitraum. Besonders erwähnen und danken möchte ich an dieser Stelle noch meinem sehr guten Freund Jörg Stederoth. Sein großes Fachwissen in allen naturwissenschaftlichen Bereichen, sein großes technisches Verständnis und seine Geduld hat mich seit meinem Studium begleitet. Diskussionen und Gespräche mit Ihm haben in der gesamten Zeit zur Klärung vielfältiger fachlicher Fragen und Anwendungen sowie zur Entwicklung neuer Ideen geführt. Zum Schluss möchte ich mich noch bei seiner Frau Christiane bedanken, die mir eine große Hilfe bei der Korrektur und Endformatierung dieser Arbeit war. 135 Lebenslauf Persönliche Angaben Name: Katja Schönweiß Geburtsdatum: 26.02.1970 Geburtsort: München Schulische und berufliche Ausbildung 08.1980 - 05.1989 Albert-Schweitzer Gymnasium, Kassel Allgemeine Hochschulreife 1989 11.1990 - 10.1992 Ausbildung zur Krankengymnastin, Hessisch-Lichtenau 11.1992 - 10.1993 Krankengymnastisches Anerkennungsjahr, Bayreuth Universitätsstudium 10.1995 - 01.2001 Diplomstudiengang Biologe an der Universität Kassel 16.01.2001 Studienabschluss Diplom Biologin an der Universität Kassel seit 05.2002 Doktorandin am Institut für Biologie, Abteilung Pflanzenphysiologie an der Universität Kassel Berufstätigkeit 01.1994 - 05.1995 Anstellung in einer Krankengymnastikpraxis, Ihringen 05.1995 - 09.1995 Anstellung als Krankengymnastin an der Orthopädischen Klinik, Hessisch-Lichtenau 02.1996 - 09.2005 Tätigkeit in einer Krankengymnastikpraxis, Kassel 04.2001 - 03.2005 Promotionsstelle an der Niedersächsischen Forstlichen Versuchsanstalt, Abteilung Waldgenressourcen in Escherode im Rahmen eines 4-jährigen EU-Projektes 04.2005 - 09.2005 arbeitssuchend und Fertigstellung der Dissertation seit 10.2005 Anstellung als Medical Advisor bei der Firma BSN-Jobst GmbH in Emmerich ___________________ ___________________ Ort, Datum Katja Schönweiß 136 137 Selbständigkeitserklärung Hiermit versichere ich, dass ich die folgende vorliegende Dissertation selbständig und ohne unerlaubte Hilfe angefertigt und andere als die in der Dissertation angegebenen Hilfsmittel nicht benutzt habe. Alle Stellen, die wörtlich oder sinngemäß aus veröffentlichten oder unveröffentlichten Schriften entnommen sind, habe ich als solche kenntlich gemacht. Kein Teil dieser Arbeit ist in einem anderen Promotions- oder Habilitationsverfahren verwendet worden. ___________________ ___________________ Ort, Datum Katja Schönweiß