Vergleichende Untersuchungen Methicillin-resistenter Staphylococcus aureus des Klinikums Kassel der Jahre 1999 bis 2004 INAUGURAL – DISSERTATION zur Erlangung des akademischen Grades eines Doktors der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.) im Fachbereich 18 – Naturwissenschaften der Universität Kassel vorgelegt von Cornelia Janusch aus Aua Kassel, Juni 2007 “With the power of soul, anything is possible” Meinem geliebtem Mann INHALTSVERZEICHNIS I 1 Einleitung ........................................................................................................... 1 1.1 Eigenschaften und Pathogenität von Staphylococcus aureus............... 4 1.2 Mechanismen des Gentransfers................................................................ 5 1.3 Staphylococcal Cassette Chromosome - Aufbau und Funktionsweise der mecA-umgebenden DNA ..................................................................... 8 1.4 Typisierung von MRSA ............................................................................ 15 1.4.1 PFGE - Analyse chromosomaler DNA mittels Pulsfeld- Gelelektrophorese................................................................................ 17 1.4.2 MLST – Multi Locus Sequence Typing ................................................ 18 1.4.3 PCR-basierende Techniken................................................................. 19 1.5 Entstehung und Entwicklung von MRSA ............................................... 20 1.6 C-MRSA - Community aquired Methicillin-resistant S. aureus ............. 22 1.7 Vorkommen von MRSA – Verbreitung epidemischer Stämme ............. 24 1.8 MR-KNS – Methicillin-resistente Koagulase-negative Staphylokokken . 29 1.9 Toxine in S. aureus und MRSA................................................................ 30 1.9.1 Enterotoxine ........................................................................................ 31 1.9.2 Toxic Shock Syndrome Toxin.............................................................. 33 1.9.3 Exfoliativtoxine A und B....................................................................... 34 1.9.4 Panton-Valentine Leukozidin - PVL..................................................... 34 1.10 Antibiotikaresistenzen bei S. aureus und MRSA ................................... 35 1.10.1 β-Laktame – Penicillin ......................................................................... 35 1.10.2 Methicillin............................................................................................. 36 1.10.3 Aminoglykoside ................................................................................... 37 1.10.4 Chinolone ............................................................................................ 38 1.10.5 Makrolide Lincosamide Streptogramine .............................................. 39 1.10.6 Quinupristin-Dalfopristin ...................................................................... 40 1.10.7 Oxazolidinone...................................................................................... 41 1.10.8 Mupirocin............................................................................................. 41 1.10.9 Tetracycline ......................................................................................... 42 1.10.10 Rifampicin............................................................................................ 42 1.10.11 Cotrimoxazol........................................................................................ 43 1.10.12 Glykopeptidantibiotika ......................................................................... 43 1.11 Plasmide.................................................................................................... 45 1.11.1 Konjugative Plasmide .......................................................................... 45 1.11.2 Eigenschaften der Multiresistenzplasmide .......................................... 46 1.11.3 Plasmide bei MRSA............................................................................. 47 2 Ziele der Arbeit................................................................................................. 48 3 Material und Methoden.................................................................................... 49 3.1 Geräte und Zubehör ................................................................................. 49 3.2 Chemikalien .............................................................................................. 51 3.3 Antibiotika ................................................................................................. 52 3.4 Nährmedien............................................................................................... 53 3.5 Enzyme ...................................................................................................... 55 3.6 Bakterienstämme...................................................................................... 56 3.7 Anzucht und Kultivierung der MRSA-Stämme....................................... 57 3.8 Resistenzbestimmungen ......................................................................... 57 3.8.1 Nachweis der Methicillin-Resistenz mittels Agar-Screen-Test............. 57 3.8.2 Antibiotikaresistenzbestimmung mittels Agardiffusionstest ................. 57 3.8.3 Resistenzbestimmungen durch Überimpfung auf Selektivmedien....... 58 INHALTSVERZEICHNIS II 3.9 Nachweis und Charakterisierung von DNA............................................ 58 3.9.1 Plasmidpräparation mit Qiagen-Anionenaustauschersäulen ............... 58 3.9.2 Präparation von Plasmid DNA mittels Fast Prep-System .................... 61 3.9.3 Nachweis von Plasmid-DNA mittels abgewandelter Eckhardt-Lyse .... 62 3.9.4 Präparation genomischer DNA mittels DNeasy Tissue Kit (Qiagen) ... 63 3.9.5 Photometrische Konzentrationsbestimmung von DNA........................ 64 3.9.6 Einsatz von Restriktionsendonukleasen .............................................. 65 3.9.7 Nachweis spezifischer DNA-Abschnitte durch PCR ............................ 65 3.9.7.1 PCR mit Koloniesuspensionen ..................................................... 66 3.9.7.2 Multiplex-PCR zum Nachweis von Antibiotikaresistenzgenen...... 69 3.9.7.3 Nachweis von Enterotoxin A-E, G-J, ............................................... Toxic Shock Syndrome Toxin 1 und Exfoliativtoxin A und B ........ 69 3.9.7.4 PCR zum Nachweis der .................................................................. Panton-Valentine Leukozidin-Determinante ................................. 70 3.9.7.5 Multiplex-PCR zur Bestimmung von SCCmec ................................. nach Oliveira u. Lencastre [2002] ................................................ 71 3.9.7.6 Multiplex-PCR zum Nachweis des ccrA1, ccr A2, ccr A3 ............. 72 3.9.7.7 PCR zum Nachweis von ccrC ...................................................... 73 3.9.7.8 PCR zur Bestimmung der dru-Anzahl in der HVR ........................ 73 3.9.8 Nachweis von DNA durch Agarose-Gelelektrophorese ....................... 74 3.9.9 Elektroporation von S. aureus nach Schenk u. Laddaga [1992].......... 76 3.9.10 Konjugativer Plasmidtransfer............................................................... 77 3.9.10.1 PEG-vermittelter Transfer nach Townsend et al. [1985]............... 77 3.9.10.2 Membranfilter-Methode nach Simon et al. [1983]......................... 77 4 Ergebnisse ....................................................................................................... 78 4.1 Die MRSA-Kollektive ................................................................................ 78 4.2 Ergebnisse PCR-Untersuchungen .......................................................... 81 4.2.1 SCCmec-Typisierung nach Oliveira u. Lencastre [2002] ..................... 82 4.2.2 Bestimmung der dru-Anzahl in der HVR.............................................. 86 4.2.3 Bestimmung von ccrA1, ccrA2, ccrA3 und ccrC .................................. 87 4.2.4 Nachweis von Antibiotikaresistenzgenen ............................................ 88 4.2.5 Nachweis von Toxingenen................................................................... 91 4.2.6 Zusammenhang des Vorkommens von Antibiotikaresistenzgenen und Toxingenen .......................................................................................... 93 4.3 Vergleich der Kollektive aus dem Klinikum Kassel ............................... 95 4.3.1 SCCmec-Typisierung nach Oliveira u. Lencastre [2002] ..................... 95 4.3.2 Bestimmung der dru-Anzahl in der HVR.............................................. 96 4.3.3 Nachweis von ccrA1, ccrA2, ccrA3 und ccrC....................................... 97 4.3.4 Vorkommen von Antibiotikaresistenzgenen......................................... 98 4.3.5 Vorkommen von Toxingenen............................................................. 100 4.4 Vergleich der Kollektive aus dem Klinikum Kassel mit denen anderer Probenahmeorte ..................................................................................... 103 4.5 Korrelation des SCCmec-Typs mit anderen ermittelten Eigenschaften der MRSA ................................................................................................ 111 4.5.1 Zusammenhang von SCCmec-Typen, ccr-Typ und dru-Anzahl ........ 111 4.5.2 Vorkommen von Antibiotikaresistenz- und Toxingenen .......................... bei SCCmec-Typen ........................................................................... 114 4.6 Vorkommen von Plasmiden................................................................... 118 4.6.1 Vorkommen von Plasmiden in KKS-99 bis KKS-04........................... 119 INHALTSVERZEICHNIS III 4.6.2 Vorkommen von Plasmiden bei Stämmen aus dem Klinikum Kassel verglichen mit anderen Probenahmeorten ......................................... 122 4.6.3 Vorkommen von Plasmiden bei SCCmec-Typen............................... 124 4.6.4 Zusammenhang zwischen Plasmidgehalt und Anzahl der Antibiotikaresistenz- bzw Toxingene.................................................. 126 4.6.5 Restriktionsanalyse präparierter MRSA-Plasmide............................. 129 4.6.6 Weitere Untersuchungen der Plasmide ............................................. 134 4.7 Entwicklung von MRSA mit SCCmec IV von 1999 – 2004 ................... 135 5 Diskussion...................................................................................................... 138 5.1 Typisierung der MRSA-Stämme anhand der SCCmec-Region........... 138 5.1.1 SCCmec-Typisierung nach Oliveira u. Lencastre [2002] ................... 138 5.1.1.1 Nicht nach Oliveira u. Lencastre [2002] klassifizierbare MRSA.. 140 5.1.2 Bestimmung der dru-Anzahl in der HVR............................................ 150 5.1.3 Bestimmung von ccrA1, ccrA2, ccrA3 und ccrC ................................ 151 5.2 Nachweis von Antibiotikaresistenzgenen ............................................ 152 5.3 Nachweis von Toxingenen..................................................................... 154 5.4 Zusammenhang des Vorkommens von Antibiotikaresistenzgenen und Toxingenen ............................................................................................. 158 5.5 Vergleich der Kollektive aus dem Klinikum Kassel ............................. 159 5.5.1 Vorkommen von SCCmec-Typen bei KKS-99 – KKS-04................... 159 5.5.2 Vorkommen von Antibiotikaresistenzgenen bei KKS-99 bis KKS-04. 160 5.5.3 Vorkommen von Toxingenen bei KKS-99 bis KKS-04....................... 162 5.6 Vergleich der Kollektive des Klinikums Kassel mit denen anderer Probenahmeorte ..................................................................................... 163 5.7 Zusammenhang von SSCmec und anderen ermittelten Eigenschaften .. .................................................................................................................. 165 5.7.1 Zusammenhang SCCmec, ccr-Typ und dru-Anzahl .......................... 165 5.7.2 Vorkommen von Antibiotikaresistenz- und Toxingenen .......................... bei SCCmec-Typen ........................................................................... 167 5.8 Plasmide.................................................................................................. 172 5.8.1 Methoden zur Plasmidpräparation..................................................... 172 5.8.2 Vorkommen von Plasmiden bei MRSA.............................................. 173 5.8.2.1 Plasmide in den Kollektiven KKS-99 bis KKS-04 ....................... 175 5.8.2.2 Vergleich der Kollektive des Klinikums Kassel mit denen anderer Probenahmeorte......................................................................... 176 5.8.2.3 Zusammenhang von SCCmec-Typ und Plasmidgehalt.............. 176 5.8.3 Zusammenhang zwischen Grad der Multiresistenz bzw. „Multitoxizität“ und dem Plasmidgehalt .............................................. 177 5.8.4 Restriktionsanalyse der präparierten MRSA-Plasmide...................... 178 5.9 Entwicklung von MRSA mit SCCmec IV von 1999 - 2004.................... 185 6 Zusammenfassung ........................................................................................ 187 7 Ausblick.......................................................................................................... 189 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS IV Abkürzungsverzeichnis °C Grad Celsius (e)BURST (enhanced) based upon related sequence types 16S rDNA ribosomale DNA der kleinen Untereinheit (16S) A. bidest Aqua bidestillata aacA-aphD Gen für Aminoglykosid-Resistenz mittels AAC(6’)-APH(2’’) Ab Antibiotikum Abb. Abbildung Abs/r Sensitivität/Resistenz gegenüber Antibiotikum AP-PCR arbitrarily primed PCR arcC Carbamat Kinase aroE Shikimate Dehydrogenase AS Aminosäure ATCC American Type Culture Collection ATP Adenosintriphosphat att attachment site BEI Beiseförth (Rehaklinik Beiseförth) BFKS Burgfeld Krankenhaus Kassel BHI brain heart Infusion bla Gen für β-Lactamase bom basis of mobility bp Basenpaare BSA Bad Soden Allendorf (Klinik Hoher Meißner) BURP based upon repeat pattern BW Bad Wildungen (Asklepios Stadtklinik) cap capsular polysaccharide CASO casein soy peptone CC clonal complex CCC covalent closed circular ccr cassette chromosome recombinase ccrA1/-2/-3 Gen für site-spezifische Rekombinase des SCCmec CDC Centers for Disease Control and Prevention CFU colony forming units C-MRSA community aquired MRSA dcs downstream constant sequence DHFR Dihydrofolat-Reduktase DHPS Dihydropteroat-Synthetase DIAKS Diakonissenkrankenhaus Kassel DNA desoxyribonucleic acid dNTP Desoxy-Nukleosid-5'-Triphosphat dru(s) direct repeat unit(s) DSMZ Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS V E Extinktion EARSS European Resistance Surveillance System EDTA Ethylendiamintetraessigsäure egc enterotoxin gene cluster ELKS Elisabeth Krankenhaus Kassel ermA Gen für erythromycin resistance methylase A ermC Gen für erythromycin resistance methylase B ET Exfoliativtoxin et al. et alii eta Gen für Exfoliativtoxin A etb Gen für Exfoliativtoxin B ETBr Ethidiumbromid EtOH Ethanol EXT Extern(e) (Ambulanz, niedergelassene Ärzte) FR Fritzlar (Hospital zum Heiligen Geist) FSG Fastprep System nach Günther g Gramm g Erdbeschleunigung GENARS German Network for Antimicrobial Resistance Surveillance GISA qlycopeptide intermediate susceptible S. aureus glpF Glycerol Kinase Gm Gentamicin gmk Guanylat Kinase GP großes Plasmid GuKP großes und kleines Plasmid h hour HELI Hessisch Lichtenau (Orthopädische Klinik Lichtenau) H-MRSA hospital aquired MRSA – im Krankenhaus erworbener MRSA HOM Homberg (Klinimuk Homberg) HVR Hypervariable Region i.d.R in der Regel IE Internationale Einheiten IMH Immenhausen (Fachklinik für Lungenerkrankungen) Inc Inkompatibilitätsgruppe (Klassifizierungsschema für Plasmide) IR inverted repeat IS Insertionselement J-Region junkyard-Region K-A1 Positivkontrolle ccrA1 K-A2 Positivkontrolle ccrA2 K-A3 Positivkontrolle ccrA3 KAU Kaufungen (DRK Klinik Kaufungen) kb Kilobasen kd Kilodalton ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS VI KISS Krankenhaus Infektions Surveillance System KKS Kollektiv Klinikum Kassel K-neg Negativkontrolle für PCR KNS Koagulase-negative Staphylokokken konz. konzentriert KP kleines Plasmid K-pos Positivkontrolle für PCR K-R-… Positivkontrolle für PCR mittels Referenzstamm … KS Kassel l Liter Lsg. Lösung lukF Gen für Panton-Valentine Leukozidin Komponente LW Leitungswasser M Molarität M Marker m... milli ... mecA Gen für Methicillin-Resistenz MEL Melsungen (Klinikum Melsungen) mer Gen für Quecksilberresistenz M-Fast High Marker - Fast Ruler DNA Ladder, High Range (MBI) M-Fast Low Marker - Fast Ruler DNA Ladder, Low Range (MBI) M-FastMiddle Marker - Fast Ruler DNA Ladder, Middle Range (MBI) M-Ladder Mix Marker - GeneRuler DNA Ladder Mix (MBI) MHA/BA Müller Hinton-Agar/Bouillon MHC major histocompatibility complex min Minute MLEE Multi Locus Enzyme Electrophoresis MLST Multi Locus Sequence Typing MO Mikroorganismus mob Mobilisierungsgene MOPS ( N-Morpholino )-Propansulfonsäure MP mehrere Plasmide (mehr als ein großes und ein kleines Plasmid) MR-KNS Methicillin-resistente Koagulase-negative Staphylokokken mRNA messenger RNA MRSA Methicillin-resistente(r) Staphylococcus aureus MSSA Methicillin-sensitive(r) Staphylococcus aureus nd nicht durchgeführt neg negativ / Eigenschaft nicht nachgewiesen NHANES National Health and Nutrition Examination Survey nic Einzelstrangbruchstelle nm Nanometer NORM(VET) Norwegian Organization for Surveillance of Antibiotic Resistant Microorganisms (Coordinated Veterinary Program) ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS VII NRZ Nationales Referenzzentrum OC open circular OD546 / 260 Optische Dichte, bei 546 nm bzw. 260 nm OKS Orthopädische Klinik Kassel orf open reading frame oriT origin of transformation p.a. per analyse PABA p-Aminobezoesäure PBP Penicillin-bindendes-Protein PCR polymerase chain reaction PEG Paul Ehrlich Gesellschaft PEG Polyethylenglycol PFGE Pulsed Field Gel Electrophoresis pls Gen für plasmin surface protein pos positiv pta Phosphate Acetyltransferase PTSA Pyrogene toxische Superantigene PVL Panton-Valentine Leukozidin R Referenzstamm RAPD random amplified polymorphic DNA RCR rolling circle replication recA Gen für Rekombinationsprotein RecA RecA Rekombinationsprotein RG Resistenzgene RKI Robert Koch Institut RNA Ribonucleicacid RNAse Ribonuklease ROT Rotenburg (Kreiskrankhaus Rotenburg) rpm rotations per minute RT Raumtemperatur s Sekunde s.u. siehe unten SCC(mec) Staphylococcal Cassette Chromosome SDS Sodium-dodecyl-sulfate SE Staphylokokken Enterotoxine sea Gen für Enterotoxin A seb Gen für Enterotoxin B sec Gen für Enterotoxin C sed Gen für Enterotoxin D see Gen für Enterotoxin E seg Gen für Enterotoxin G seh Gen für Enterotoxin H sei Gen für Enterotoxin I ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS VIII sej Gen für Enterotoxin J Sm Streptomycin sog. sogenannte SSSS staphylococcal scaled skin syndrome ST sequence type SZH Schwalmstadt Ziegenhain (Klinikum Ziegehain) Tab. Tabelle Taq Thermus aquaticus TBE Tris Boric acid EDTA tetK Gen für Tetracyclin-Resistenz über aktiven Efflux tetM Gen für Tetracyclin-Resistenz über Targetveränderung TG Toxingene THB Todd Hewitt Broth Tn Transposon tra Transfergene Tris Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan TSST Toxic Shock Syndrome Toxin tst Gen für Toxic Shock Syndrome Toxin 1 U Unit u.a. unter anderem ÜN Über Nacht (Kultur) USA United States of America V Volt v/v volume/volume vatA Gen für MLS-Resistenz vatB Gen für MLS-Resistenz vatC Gen für MLS-Resistenz VISA Vancomycin intermediate Staphylococcus aureus VRSA Vancomycin resistant Staphylococcus aureus VT Volumenteil w/v weight/volume WH Wolfhagen (Kreisklinik Wolfhagen) WIH Witzenhausen (Kreis-und Stadtkrankenhaus) yqiL Acetyl Coenzym A acetyltransferase z.B. zum Beispiel μ… mikro… ABBILDUNGVERZEICHNIS IX Abbildungsverzeichnis Abb. 1 Aufbau von SCCmec I-V................................................................................................... 14 Abb. 2 Häufigkeit von MRSA-Isolaten in 1999, 2001, 2003 und 2005 laut EARSS........................ 25 Abb. 3 Weltweites Vorkommen von MRSA. ................................................................................. 26 Abb. 4 Ausbreitung epidemischer MRSA in Deutschland von 2001 bis 2006 ................................ 28 Abb. 5 Verwendete lineare DNA-Marker.. .................................................................................... 75 Abb. 6 SCCmec-Typisierung einer Auswahl von MRSA aus KKS-99. .......................................... 83 Abb. 7 SCCmec-Typisierung einer Auswahl von MRSA aus KKS-04............................................ 83 Abb. 8 SCCmec-Typisierung einer Auswahl von MRSA aus KKS-01 und KKS-02. ...................... 84 Abb. 9 SCCmec-Typisierung durchgeführt in Form von PCRs mit jedem Primerpaar einzeln........ 84 Abb. 10 SCCmec-Typisierung. Ergebnis aller untersuchten Stämme aus dem Klinikum Kassel und anderen Kollektiven..................................................................................................... 85 Abb. 11 Bestimmung der dru-Anzahl in der HVR von MRSA aus 2002........................................... 86 Abb. 12 Bestimmung der dru-Anzahl in der HVR. Ergebnis aller untersuchten Stämme aus dem Klinikum Kassel und anderen Kollektiven. ................................................................... 86 Abb. 13 Multiplex-PCR zur Bestimmung von ccrA1, ccrA2 oder ccrA3 aller MRSA aus 2004.......... 87 Abb. 14 Bestimmung von ccrA1, ccrA2, ccrA3 oder ccrC. Ergebnis aller untersuchten Stämme aus dem Klinikum Kassel und anderen Kollektiven. ............................................................ 87 Abb. 15 Multiplex-PCR zum Nachweis von Antibtiotikaresistenzgenen bei MRSA aus KKS-99....... 88 Abb. 16 Multiplex-PCR zum Nachweis von Antibtiotikaresistenzgenen bei MRSA aus KKS-04....... 88 Abb. 17 Häufigkeit der nachgewiesenen Antibiotikaresistenzgene. Ergebnis aller untersuchten Stämmen aus dem Klinikum Kassel und anderen Kollektiven. ................................. 89 Abb. 18 Häufigkeit der Anzahl von Resistenzgenen bei einem MRSA-Stamm................................ 90 Abb. 19 Multiplex-PCR zum Nachweis der Enterotoxingene sea, seb, sec, sed, see und seg, seh, sei und sej von MRSA aus 2003. ...................................................................................... 91 Abb. 20 Vorkommen der nachgewiesenen Toxingene bei allen untersuchten Stämmen aus dem Klinikum Kassel und anderen Kollektiven..................................................................... 92 Abb. 21 Häufigkeit der Anzahl von Toxingenen bei einem Stamm.................................................. 92 Abb. 22 Zusammenhang zwischen Resistenzgengehalt und Toxingengehalt aller untersuchten Stämme ...................................................................................................................... 93 Abb. 23 Zusammenhang zwischen Toxingengehlat und Resistenzgengehalt aller untersuchten Stämme ...................................................................................................................... 94 Abb. 24 SCCmec-Typisierung. Vergleich der Anteile der SCCmec-Typen an den Kollektiven des Klinikums Kassel der Jahre 1999-2004. ....................................................................... 95 Abb. 25 Bestimmung der dru-Anzahl in der HVR. Vergleich der Ergebnisse der Kollektive des Klinikums Kassel der Jahre 1999-2004........................................................................ 96 Abb. 26 Bestimmung von ccrA1, ccrA2, ccrA3 und ccrC. Vergleich der Ergebnisse der MRSA aus KKS–99 – KKS-04....................................................................................................... 97 Abb. 27 Nachweis von Antibiotika-Resistenzgenen. Vergleich der Ergebnisse der Stämme der Kollektive des Klinikums Kassel von 1999 – 2004....................................................... 98 Abb. 28 Ausprägung der Multiresistenz der Kollektive des Klinikums Kassel 1999-2004 ................ 99 Abb. 29 Nachweis von Toxingenen. Vergleich der Ergebnisse der Stämme der Kollektive des Klinikums Kassel von 1999 – 2004. ............................................................................ 100 Abb. 30 Vorkommen von mehreren Toxingenen bei Stämmen der Kollektive des Klinikums Kassel der Jahre 1999-2004 .................................................................................................. 102 Abb. 31 Vergleich der Häufigkeit von SCCmec-Typen bei MRSA-Stämmen des Klinikums Kassel mit denen anderer Herkunftsorte. ..................................................................................... 103 Abb. 32 Vergleich der Häufigkeit von SCCmec-Typen bei MRSA-Stämmen des Klinikums Kassel mit denen anderer Herkunftsorte aus Kassel und Nordhessen aus dem Jahr 2003. ......... 104 Abb. 33 Vergleich der Häufigkeit der dru-Anzahl bei MRSA-Stämmen des Klinikums Kassel mit denen anderer Herkunftsorte. ..................................................................................... 105 Abb. 34 Vergleich der Häufigkeit der dru-Anzahl bei MRSA-Stämmen des Klinikums Kassel mit denen anderer Herkunftsorte aus Kassel und der Region Nordhessen 2003 ............... 105 Abb. 35 Vergleich der Häufigkeit der ccr-Typen bei MRSA-Stämmen des Klinikums Kassel mit denen anderer Herkunftsorte. ..................................................................................... 106 Abb. 36 Vergleich der Häufigkeit der ccr-Typen bei MRSA-Stämmen des Klinikums Kassel mit denen anderer Herkunftsorte aus Kassel und der Region Nordhessen 2003. .............. 106 Abb. 37 Vergleich der Häufigkeit von Antibiotikaresistenzgenen bei MRSA-Stämmen des Klinikums Kassel mit denen anderer Herkunftsorte.. ................................................................... 107 Abb. 38 Vergleich der Häufigkeit von Antibiotikaresistenzgenen bei MRSA-Stämmen des Klinikums Kassel mit denen anderer Herkunftsorte aus dem Jahr 2003. ..................................... 108 ABBILDUNGVERZEICHNIS X Abb. 39 Vergleich der Häufigkeit von Toxingenen bei MRSA-Stämmen des Klinikums Kassel mit denen anderer Herkunftsorte. ..................................................................................... 109 Abb. 40 Vergleich der Häufigkeit von Toxingenen bei MRSA-Stämmen des Klinikums Kassel mit denen anderer Herkunftsorte aus dem Jahr 2003. ...................................................... 110 Abb. 41 Zusammenhang zwischen SCCmec-Typ und dru-Anzahl aller untersuchten Stämmen. .. 111 Abb. 42 Zusammenhang zwischen SCCmec-Typ und ccr-Typ bei allen untersuchten Stämmen .. 112 Abb. 43 Zusammenhang zwischen ccr-Typ und dru-Anzahl bei den nachgewiesenen SCCmec- Typen aller Stämme. ................................................................................................. 113 Abb. 44 Vorkommen von Antibiotikaresistenzgenen bei SCCmec-Typen bei allen untersuchten Stämmen................................................................................................................... 114 Abb. 45 Häufigkeit von SCCmec-Typen bei den untersuchten Antibiotikaresistenzgenen bei allen untersuchten Stämmen.............................................................................................. 115 Abb. 46 Vorkommen von Toxingenen bei SCCmec-Typen bei allen untersuchten Stämmen. ....... 116 Abb. 47 Häufigkeit von SCCmec-Typen bei den untersuchten Toxingenen bei allen untersuchten Stämmen................................................................................................................... 117 Abb. 48 Vorkommen von Plasmiden bei allen untersuchten Stämmen. ....................................... 118 Abb. 49 Vorkommen von Plasmiden in den KKS – 99 bis KKS - 04.............................................. 119 Abb. 50 Plasmidpräparation von MRSA aus KKS - 99.................................................................. 120 Abb. 51 Plasmidpräparation von MRSA aus KKS – 02 und zwei Isolaten des Jahres 2002 aus Fritzlar....................................................................................................................... 120 Abb. 52 Plasmidpräparation von MRSA verschiedener Herkunftsorte des Jahres 2002................ 121 Abb. 53 Plasmidpräparation von MRSA aus KKS-03 und Isolaten verschiedener Herkunftsorte des Jahres 2003. ............................................................................................................. 121 Abb. 54 Plasmidpräparation von MRSA aus KKS-04, sowie zwei Isolaten der Gruppe externer Proben. ..................................................................................................................... 122 Abb. 55 Vorkommen von Plasmiden bei MRSA-Stämmen des Klinikums Kassel verglichen mit denen anderer Herkunftsorte. .................................................................................... 123 Abb. 56 Vergleich des Vorkommens von Plasmiden bei MRSA-Stämmen des Klinikums Kassel mit denen anderer Herkunftsorte.. ................................................................................... 123 Abb. 57 Zusammenhang des Vorkommens von Plasmiden und ermittelten SCCmec-Typen ........ 124 Abb. 58 Zusammenhang des Vorkommens von Plasmiden und ermittelten SCCmec-Typen ........ 125 Abb. 59 Häufgkeit ermittelter Plasmidgruppen in Abhängigkeit des Resistenzgengehaltes der untersuchten Stämme. .............................................................................................. 126 Abb. 60 Vorkommen von Mehrfachresistenzen bei den ermittelten Plasmidgruppen aller untersuchten Stämme. .............................................................................................. 127 Abb. 61 Häufgkeit ermittelter Plasmidgruppen bei MRSA in Abhängigkeit des Toxingengehaltes der untersuchten Stämme. .............................................................................................. 127 Abb. 62 Vorkommen von Mehreren Toxingenen bei den ermittelten Plasmidgruppen aller untersuchten Stämme. .............................................................................................. 128 Abb. 63 EcoRI-Restriktion verschiedener Plasmidtypen aus MRSA-Stämmen aus KKS-99.......... 129 Abb. 64 PstI-Restriktion verschiedener Plasmidtypen aus MRSA-Stämmen aus KKS-99 ............. 130 Abb. 65 Kombinierte EcoRI- und PstI-Restriktion verschiedener Plasmidtypen aus MRSA-Stämmen aus KKS-99. .............................................................................................................. 130 Abb. 66 HindIII-Restriktion verschiedener Plasmidtypen von Referenzstämmen und aus MRSA- Stämmen aus KKS-99. .............................................................................................. 131 Abb. 67 Veränderungen im Plasmidgehalt von MRSA mit SCCmec IV des Klinikums Kassel der Jahre 1999 bis 2004. ................................................................................................. 135 Abb. 68 Veränderungen im Vorkommen von Antibiotikaresistenzgenen bei MRSA mit SCCmec IV des Klinikums Kassel der Jahre 1999 bis 2004. ........................................................ 136 Abb. 69 Veränderungen im Vorkommen von Toxingenen bei MRSA mit SCCmec IV des Klinikums Kassel der Jahre 1999 bis 2004................................................................................. 137 Abb. 70 SCCmec Typisierung. Bei den jeweiligen SCCmec-Typen inkl. des in vorliegender Arbeit definierten SCCmec IA/II typischerweise nachweisbare Loci...................................... 139 Abb. 71 Skizzen möglicher EcoRI-PstI-Restriktionskarten in vorliegender Arbeit beschriebener Plasmide. .................................................................................................................. 180 TABELLENVERZEICHNIS XI Tabellenverzeichnis Tab. 1 Verwendete Antibiotika..................................................................................................... 52 Tab. 2 Verwendete Antibiotikatestblättchen ................................................................................. 52 Tab. 3 Verwendete Restriktionsendonukleasen ........................................................................... 55 Tab. 4 Verwendete Bakterienstämme.......................................................................................... 56 Tab. 5 Verwendete Primer........................................................................................................... 67 Tab. 6 Herkunftsorte der untersuchten MRSA-Stämme................................................................ 79 Tab. 7 Anzahl Proben eines Jahres aller Herkunftsorte................................................................ 80 Tab. 8 EcoRI-Restriktionsanalyse von MRSA-Plasmiden........................................................... 131 Tab. 9 PstI-Restriktionsanalyse von MRSA-Plasmiden. ............................................................. 132 Tab. 10 EcoRI+PstI-Restriktionsanalyse von MRSA-Plasmiden................................................... 132 Tab. 11 HindIII-Restriktionsanalyse von MRSA-Plasmiden.. ........................................................ 133 Tab. 12 HincII-Restriktionsanalyse von MRSA-Plasmiden. .......................................................... 133 Tab. 13 Eigenschaften der SCCmec-Region nicht klassifizierbarer Isolate.. ................................. 147 Tab. 14 Eigenschaften der SCCmec IA/II-Stämme. ..................................................................... 149 Tab. 15 SCCmec IIIA-haltige MRSA-Stämme und deren wichtigste in vorliegender Arbeit ermittelte Eigenschaften.. ......................................................................................................... 168 Tab. 16 Vergleich der in vorliegender Arbeit ermittelten EcoRI-Restriktionsmuster mit pI524 [Murphy u. Novick, 1980]......................................................................................................... 183 Tab. 17 Vergleich der in vorliegender Arbeit ermittelten EcoRI-Restriktionsmuster mit von Udo et al. [2006] bei einem MRSA-Plasmid ermittelten. ............................................................. 183 Tab. 18 Vergleich der in vorliegender Arbeit ermittelten EcoRI-Restriktionsmuster mit von Udo et al. [2006] bei einem MRSA-Plasmid ermittelten. ............................................................. 183 Tab. 19 Vergleich der in vorliegender Arbeit ermittelten EcoRI-Restriktionsmuster mit von Zucarelli et al. [1996] bei einem MRSA-Plasmid ermittelten...................................................... 184 Tab. 20 Vergleich der in vorliegender Arbeit ermittelten EcoRI-Restriktionsmuster von pFL35-4 mit pI258 [Murphy u. Novick, 1980] und einem von Zucarelli et al. [1996] bei MRSA ermittelten. ................................................................................................................ 184 Tab. 21 Zusammenfassung der ermittelten Eigenschaften aller untersuchten Isolate. .................. 191 EINLEITUNG 1 1 Einleitung Staphylococcus aureus gehört zu den bedeutendsten humanpathogenen Bakterien, ist aber andererseits auch ein gewöhnlicher Kommensale des Menschen. Sein bevorzugtes Habitat beim Menschen ist der Bereich der vorderen Nasenhöhle. Gesunde Menschen mit intaktem Immunsystem werden häufig von S. aureus besiedelt ohne eine ernsthafte Infektion als Folge. So sind bis zu 20 % der Bevölkerung permanent durch S. aureus kolonisiert, 60 % sind zeitweilige Träger, während nur 20 % niemals einen S. aureus tragen [Foster, 2004]. Auch in der Umgebung des Menschen ist S. aureus verbreitet, er ist an Tiere adaptiert und hat die Fähigkeit in der Umwelt und dort besonders auf Oberflächen überdauern zu können [Köhler et al., 2001]. Die Übertragung von S. aureus erfolgt somit nicht nur von Mensch zu Mensch. Übertragungswege über Gegenstände in der Umgebung des Menschen sind, besonders im klinischen Bereich, ebenfalls von Bedeutung. Vor der antibiotischen Ära führten S. aureus-Infektionen zu zahlreichen Todesfällen, die Sterblichkeitsrate bei Bakteriämien lag damals bei bis zu 80 % [Smith u. Wickers, 1960]. Mit Einführung des Penicillins in den 40er Jahren verbesserte sich diese Situation zunächst deutlich. Jedoch ging mit dem Einsatz und der Weiterentwicklung von Antibiotika auch die Resistenzentwicklung bei Bakterien einher. Bereits Ende der 50er Jahre hatte S. aureus Resistenz gegenüber nahezu allen verfügbaren Antibiotika inklusive Erythromycin, Streptomycin und den Tetracyclinen entwickelt [Fluckiger u. Widmer, 1999]. 1959 wurde mit Methicillin die erste Generation der Penicillinase-festen semisynthetischen Penicilline eingeführt, die eine Therapierung von Infektionen durch Penicillin-resistente S. aureus wieder ermöglichte. Doch bereits zwei Jahre nach Einführung des Methicillins wurde in Großbritannien der erste Methicillin-resistente S. aureus (MRSA) beschrieben [Jevons, 1961]. In der Folge wurden auch in anderen europäischen Ländern und später auch in Japan, Australien und den USA MRSA isoliert und beschrieben [Stewart u. Holt, 1963; Benner u. Kayser, 1968; Crossley et al., 1979; Doebbeling, 1995; Klimek et al. ,1976]. Die Methicillin-Resistenz bei MRSA beruht auf einem durch mecA kodierten zusätzlichen Penicillin-bindenden-Protein (PBP), dem PBP2’ (PBP2a). Dieses besitzt eine geringe Bindungsaffiniät zu β-Laktam-Antibiotika und kann somit als Transpeptidase in der Peptidoglykansynthese fungieren, wenn die normal EINLEITUNG 2 vorhandenen PBPs (PBP1, PBP2, PBP3, PBP3’, PBP4) durch bestehende Antibiotikakonzentrationen gehemmt sind [Chambers, 1997]. Es wird vermutet, dass mecA von S. aureus durch horizontalen Gentransfer aus einer entfernt verwandten Staphylokokkenspezies erlangt wurde [Hiramatsu et al., 2001]. Das mecA-Gen liegt innerhalb eines in das Chromosom integrierten mobilen genetischen Elementes, dem Staphylococcal Cassette Chromosome (SCC oder SCCmec). Diese Genkassette enthält neben mecA dessen regulatorische Gene, evtl. weitere Resistenzgene und Gene zum Transfer des Elementes [Katayama et al., 2000]. Von SCCmec sind derzeit fünf Haupttypen bekannt, die sich bzgl. der beinhalteten genetischen Marker und somit auch in ihrer Größe unterscheiden [Ito et al., 2001, 2004; Ma et al., 2002]. MRSA gelangten bald nach Auftreten der ersten Stämme in den Fokus vielfältiger wissenschaftlicher Untersuchungen. Ihre rasche weltweite Ausbreitung, entwickelte Multiresistenzen welche die therapeutischen Möglichkeiten stark einschränkten und die Eigenschaft sich im klinischen Umfeld „festzusetzen“, bedingen ihre Zugehörigkeit zu den wichtigsten Erregern nosokomialer Infektionen [Hiramatsu, 1995; RKI, 2003]. Somit wurde es für die klinische Praxis zunächst wichtig, MRSA möglichst schnell und zuverlässig zu diagnostizieren und letztendlich zu therapieren. Bei hochgradig multiresistenten Stämmen blieben als Behandlungsmöglichkeit oft nur Glykopeptidantibiotika wie Vancomycin und in jüngerer Zeit Linezolid und die Kombination Quinopristin/Dalfopristin [Sousa u. Lencastre, 2004]. Die Epidemiologie von MRSA verändert sich jedoch stetig. In den vergangenen 46 Jahren der MRSA-Geschichte lassen sich Evolutionsstadien beobachten. Zwei dieser Stadien der MRSA-Entwicklung, die in den letzten zehn Jahren von besonderer Bedeutung waren, sind zum einen die Entstehung von MRSA-Stämmen mit verminderter Empfindlichkeit gegenüber Glykopeptidantibiotika (GISA – glycopeptide intermediate susceptible Staphylococcus aureus) und zum anderen außerhalb des Krankenhauses erworbene MRSA-Infektionen bei Personen ohne Risikofaktoren für eine solche Infektion (Community aquired MRSA – C-MRSA) [CDC, 1999; CDC, 2002]. Multiresistenz bei MRSA wird in letzter Zeit oft als rückläufig beschrieben während, besonders bei C-MRSA, eine bei früheren MRSA-Stämmen nicht vorhandene erhöhte Virulenz zu beobachten ist [Braulke et al., 1999; Fey et al., 2003]. EINLEITUNG 3 Im Laufe der Zeit wurde es immer wichtiger MRSA nicht nur als solche zu diagnostizieren, sondern zu typisieren, da die Wichtigkeit von Stämmen mit bestimmten Eigenschaften deutlicher wurde. Typisierte epidemische MRSA zeigten eine erhöhte Tendenz zur Verbreitung, wobei sich Dynamiken innerhalb bestimmter Gebiete erkennen ließen [Witte et al., 1997 a, b]. Die Typisierung von MRSA-Stämmen ist problematisch, da SCCmec eine hohe Variabilität aufweist. Es ist eine Region die aufgrund des Vorhandenseins von Insertionselementen und Transposons zum Erlangen neuer Genabschnitte prädestiniert ist [Brakstad u. Mæland, 1997; Ito u. Hiramatsu, 1998]. Die Veränderlichkeit des mecA-umgebenden DNA-Bereiches bedingt die Notwendigkeit der Weiterentwicklung darauf basierender Typisierungsmethoden, so dass neu entstehende Subtypen erfasst werden können. Klassifizierungsschemata für MRSA-Stämme wurden in den letzten Jahren mehrfach entwickelt, verbessert und erweitert. Ein wichtiger Punkt dabei ist die Aufwändigkeit und auch laborübergreifende Reproduzierbarkeit einer Methode [Witte, 2002]. Das Vorhandensein von Plasmiden und durch sie vermittelte Eigenschaften bei MRSA rückte in den letzten Jahren immer weiter in den Hintergrund der wissenschaftlichen Diskussion. Dies bedingte sich nicht zuletzt durch die Weiterentwicklung molekularbiologischer Methoden, welche z.B. Plasmide als Typisierungsansatz unattraktiv machten. Dennoch sind Plasmide und durch sie vermittelte Eigenschaften, wie bei vielen anderen Bakterien, auch bei MRSA von Bedeutung. So sind z.B. sowohl einige Antibiotikaresistenz- als auch Toxingene bei MRSA plasmidär kodiert und teilweise auf übertragbaren Plasmiden lokalisiert (s. 1.11). Plasmide spielen somit trotz oder gerade wegen des Vorhandenseins von SCCmec eine wichtige Rolle für den horizontalen Gentransfer bei S. aureus, der auch Art- und Gattungsgrenzen überschreiten kann [Hodel-Christian u. Murray, 1991; Skurray u. Firth, 1997]. EINLEITUNG 4 1.1 Eigenschaften und Pathogenität von Staphylococcus aureus Staphylokokken sind unbewegliche, meist in Haufen gelagerte Gram-positive Kokken. Die meisten Vertreter der Gattung sind fakultativ anaerob und bilden Katalase, welche die bei der phagozytären Abwehr gebildeten Sauerstoffradikale abfängt. Der Katalasenachweis ist die Leitreaktion für den biochemsichen Nachweis der Gattung [Neumeister, 1995]. Von Bedeutung im klinischen Alltag sind neben S. aureus auch Koagulase-negative Staphylokokken (KNS) wie S. epidermidis, S. haemolyticus und S. saprophyticus (s.a. 1.8). S. aureus grenzt sich von den KNS durch das Vorhandensein des Pathogenitätsfaktors Koagulase ab. Diese führt über die Aktivierung von Prothrombin über Thrombin zur Ausfällung von Fibrinogen zu Fibrin. Somit umgibt sich S. aureus im infizierten Gewebe mit einer Schutzschicht aus wirtseigenem Protein. Einer der weiteren Faktoren auf dem die Pathogenität von S. aureus beruht ist Protein A, welches in der Lage ist den Fc-Teil von Immunglobulinen zu binden. Protein A behindert so die Phagozytose antikörpermarkierter Bakterienzellen über den Fc-Rezeptor der Makrophagen. Des Weiteren verfügt S. aureus über Hämolysine, die u.a. Erythrozyten und Thrombozytenmembranen angreifen, sowie über Leukozidine welche Leukozyten und Makrophagen zerstören. Darüber hinaus bilden ein Teil der S. aureus Stämme Enterotoxine, Exfoliativtoxine und Toxic Shock Syndrome-Toxine, auf die in den Abschnitten 1.9 bis 1.9.4 unter Einbezug der durch sie verursachten Krankheiten eingegangen wird. Durch S. aureus bedingte Krankheiten lassen sich in zwei große Gruppen einteilen: eitrige Infektionen und toxinbedingte Erkrankungen. Zu der Gruppe der eitrigen Infektionen gehören Furunkel, Karbunkel, Abszesse und Wundinfektionen. Bei solchen Infektionen kann es dazu kommen, dass Bakterien vom Eiterherd ausgehend über die Lymphwege oder die Blutbahn in andere Körperregionen gelangen [Neumeister, 1995]. Bei toxinbedingten Erkrankungen sind Lebensmittelvergiftungen am bedeutsamsten, welche durch verschiedene Enterotoxine verursacht werden [Le Loir et al., 2003]. EINLEITUNG 5 Im klinischen Alltag sind zwei Eigenschaften von S. aureus von besonderer Bedeutung. Zum einen birgt die hohe Affinität zu künstlichen Oberflächen die Gefahr von fremdkörperassoziierten Infektionen, zum anderen verfügt das Bakterium über die scheinbar widersprüchliche Eigenschaft sich in Abszessen abzukapseln und dennoch gleichzeitig systemisch auszubreiten [Linde u. Lehn, 2005]. S. aureus-Infektionen können jedoch auch chronisch-persistierend, weniger aggressiv und mit verminderter Entzündungsreaktion verlaufen, auch wenn der verursachende S. aureus-Stamm die komplette Ausstattung mit Virulenzfaktoren für akut aggressive Verläufe besitzt [Eiff et al., 2000]. Solch chronisch-persistierende Verläufe sind häufig assoziiert mit phänotypisch abweichenden S. aureus Varianten, den sogenannten small colony variants (SCV), welche sich durch ein vermindertes und verlangsamtes Wachstum auszeichnen [Proctor et al., 1995; Eiff et al., 2006]. 1.2 Mechanismen des Gentransfers Da ein wichtiger Aspekt bei der Untersuchung von MRSA-Stämmen deren Veränderung auf genetischer Ebene ist, soll hier kurz auf die grundlegenden Mechanismen des Austauschs von genetischem Material bei Bakterien eingegangen werden. Bei diesen Mechanismen handelt es sich um Transformation, Transduktion und Konjugation. Transformation ist der am längsten bekannte Mechanismus [Griffith, 1928; Avery, 1944] und bezeichnet die Aufnahme nackter DNA aus der Umgebung durch kompetente Bakterienzellen. Kompetenz hängt vom physiologischen Zustand der Zelle ab. Die Integration der aufgenommenen DNA in das Bakteriengenom erfolgt mittels homologer Rekombination. Unter natürlichen Bedingungen werden dabei in der Regel weniger als 10 kb DNA ausgetauscht [Feil et al., 2000]. Am Mechanismus der Transduktion sind Bakteriophagen beteiligt, die in ihnen verpackte Teilstücke eines Chromosoms oder auch ganze Plasmide zu und in ein Bakterium transportieren. Entdeckt wurde dieser Mechanismus 1952 bei Salmonellen [Zinder u. Lederberg, 1952]. Auf diese Weise können bis zu 100 kb ausgetauscht werden, wobei die Menge vor allem durch den limitierten Platz im Phagenpartikel bestimmt wird. EINLEITUNG 6 Die größte Menge an DNA kann über den Mechanismus der Konjugation ausgetauscht werden. Diese wird durch Plasmide oder konjugative Transposons gesteuert und erfordert einen Zell-zu-Zell-Kontakt. Der erste Nachweis, dass konjugative Resistenzplasmide in Staphylokokken existieren und dass ihr Transfer ohne die Beteiligung von Phagen abläuft erfolgte Anfang der 80er [Forbes u. Schaberg, 1983; McDonnell et al., 1983]. Plasmide sind extrachromosomale, sich autonom replizierende, doppelsträngige DNA-Moleküle, die dazu in der Lage sind ihre eigene Kopienzahl zu kontrollieren. Resistenz-Plasmide (R-Plasmide) vermitteln Resistenzen gegenüber Antibiotika und/oder Schwermetallen und sind häufig konjugativ oder mobilisierbar. Dies bedeutet, dass sie über Transfergene (tra) oder Mobilisierungsgene (mob) und eine intakte nic/bom-Stelle verfügen [Wilkins u. Lanka, 1993]. Die tra-Gene veranlassen die Wirtszelle zur Ausbildung eines Konjugationsapparates, durch den physischer Kontakt zur anderen Zelle hergestellt wird. Hierüber erfolgt dann die aktive Übertragung der DNA des Plasmides, welches für die tra-Gene kodiert. Weitere Plasmide können dabei mit übertragen werden, wenn sie mobilisierbar sind, also über Mobilisierungsproteine verfügen. Somit muss mindestens ein Plasmid in der Zelle für Mobilisierungsproteine kodieren. Durch diese Mobilisierungsproteine, die an der nic/bom-Stelle binden, kommt es zum Strangbruch in der Plasmid-DNA und damit ebenfalls zu einer Übertragung der mobilisierbaren Plasmide nach dem rolling circle-Mechanismus [Novick, 1980]. Die nic/bom-Stelle fungiert hier also als oriT. An den Transfer der DNA schließt sich in der Empfängerzelle die DNA- Rekombination an. Hierbei wird unterschieden zwischen genereller (homologer), sequenzspezifischer und illegetimer Rekombination. Bei homologer Rekombination wird DNA, die über längere Strecken Homologien zu einer anderen DNA aufweist, im Bereich der homologen Abschnitte neu gepaart. Auf diese Weise kann sowohl nur ein Einzelstrang der Doppelstränge als auch ein Doppelstrang ausgetauscht werden. Dieser Mechanismus beruht auf dem RecA- System welches dazu in der Lage ist Homologien in Nukleotidsequenzen zu erkennen. Diese müssen aber nicht zu 100 % übereinstimmend sein, was somit zu neuen Genkombinationen führen kann. Sequenzspezifische Rekombination bedarf kürzerer aber wesentlich spezifischerer Erkennungssequenzen und erfolgt nur an bestimmten Stellen. EINLEITUNG 7 Illegetime Rekombination liegt dann vor, wenn keine Erkennungssequenzen für die Insertion der DNA benötigt werden, was bei Insertionselementen, Transposons und Integrons der Fall ist. Solche mobilen genetischen Elemente sind gekennzeichnet durch flankierende Sequenzwiederholungselemente (repeat) und das Vorhandensein einer Rekombinasefunktion zur Exzision und Integration. Für eine Bewegung von Bakteriengenom zu Bakteriengenom benötigen sie aber letztendlich einen der Mechanismen des Gentransfers. Insertionselemente (IS) sind 0,8-1,8 kb groß und verfügen an ihren Enden über 10 - 40 bp große invertierte Sequenzwiederholungen (inverted repeats - IR), welche als Erkennungssequenz für die eigenen Transpositionsenzyme dienen. Insertions- elemente kodieren nur für die Transpositionsgene und die zugehörigen Regulationssignale. Ein charakteristisches Merkmal von IS-Elementen ist eine Zielstellenverdoppelung, die während der Insertion erfolgt. IS-Elemente transponieren in einer Frequenz von 10-2 - 10-7 [Mahillon u. Chandler, 1998]. Transposons enthalten im Gegensatz zu Insertionselementen neben der Information für ihre Übertragung noch zusätzliche Gene, z.B. für Antibiotikaresistenzen. Einige Transposons sind von IS-Elementen flankiert, welche dann für den Transpositionsapparat kodieren. Transposons mit einem solchen Aufbau werden als mobile DNA-Elemente der Klasse I zusammengefasst. Transposons der Klasse II hingegen besitzen nur kurze inverted repeats von 35 - 140 bp und kodieren ihren Transpositionsapparat selbst. Die Frequenz der Transposition von Transposons oder auch IS-Elementen wird durch die Konzentration der Transposase in einer Zelle bestimmt. Springen solche Elemente zu häufig, kann dies letal für die Zelle sein, da dieses Springen zu Mutationen führen kann. Die Kontrolle der Transposase- Genexpression ist deshalb für die Zelle von großer Bedeutung. Transposons sind in der Lage Antibiotikaresistenzen anzusammeln und zu exprimieren. Bestimmte Stellen des Transposons (hot spots of recombination) scheinen für die Aufnahme immer neuer Gene und deren Organisation in sogenannten Genkassetten verantwortlich zu sein. Übertragung von Mehrfachresistenzen durch Transposons ist üblich [Schmidt, 1984; Schmitt, 1986; Liebert et al., 1999]. EINLEITUNG 8 Zu den größten bekannten mobilen genetischen Elementen gehören die 21-67 kb großen SCC-Elemente und die Resistenzinseln von S. aureus [Novick et al., 2001], die PAI-II Pathogenitätsinsel (~190 kb) von E. coli [Blum et al., 1994] und die Symbioseinseln der Rhizobien (~500kb) [Sullivan u. Ronson, 1998]. Robinson und Enright [2004] bearbeiteten die Fragestellung, ob für die Evolution einer Bakterienart mit Hinblick auf S. aureus das eher seltene Ereignis des Austauschs großer Bereiche des Chromosoms eine ebenso bedeutende Rolle spielt wie häufiger vorkommende kleinere Austauschereignisse und die Bewegung mobiler genetischer Elemente. Sie kamen unter Einbeziehung der Ergebnisse von Feil et al. [2003] zu dem Schluss, dass die langfristige Evolution von S. aureus durchaus dem Einfluss solch seltener Genaustauschereignisse im größeren Rahmen unterliegt. 1.3 Staphylococcal Cassette Chromosome - Aufbau und Funktionsweise der mecA-umgebenden DNA Ito et al. [1999] und Katayama et al. [2000] beschrieben die mecA-umgebende DNA- Region erstmals als neues genetisches Element, SCCmec. Dies basierte auf Arbeiten zur Sequenzierung einer MRSA-spezifischen Region des in Japan weit verbreiteten 1982 erstmalig isolierten MRSA-Stammes N315. SCCmec-Elemente sind zwischen 21 und 67 kb groß und in das Chromosom von MRSA-Stämmen an einer einzigen bestimmten Stelle (attBSCC) eingebaut, die nahe des Replikationsursprungs (origin of replication) von S. aureus liegt [Hiramatsu et al., 2001]. SCCmec als genetisches Element wurde ursprünglich durch den Besitz folgender vier Eigenschaften charakterisiert: Terminale inverted und direct repeats an beiden Enden, ein Set site-spezifischer Rekombinasegene (ccr-Komplex), den mecA- Genkomplex und die Integration an orfX [Kondo et al., 2007; Ito et al., 1999; Katayama et al., 2000]. Die Bewegung von SCCmec erfolgt mittels site-spezifischer Rekombinasen, die in jedem Element vorkommen. Bisher wurden die des Typs ccrAB und ccrC beschrieben, die alle der Invertase/Resolvase Familie angehören und Serin- Rekombinasen sind [Noto u. Archer, 2006]. Ihre Funktionsweise ähnelt denen der Integrasen der großen Phagen [Groth u. Calos, 2004]. Sie arbeiten als Dimer und EINLEITUNG 9 bauen so SCCmec in das Staphylokokkenchromosom über Bindung an zwei Anheftungsstellen (attachment sites) ein. Dabei liegt attSCC im SCCmec-Element und attB im Staphylokokkenchromosom am Ende eines open reading frames unbekannter Funktion (orfX). Während der Integration von SCCmec entstehen zwei Hybrid-attachmentsites (attL und attR) an jedem Ende des inserierten SCCmec- Elementes [Noto u. Archer, 2006]. An beiden Enden befindet sich dann eine 15 bp Sequenz. Diese direct repeats sind charakteristisch für SCCmec und unterscheiden sich von durch Zielstellenverdopplung entstehende direct repeats in Transposons dadurch, dass eine der direct repeat-Sequenzen innerhalb des SCCmec am upstream Ende liegt. Die in SCCmec ebenfalls in den Randbereichen liegenden inverted repeats werden anscheinend von den SCCmec-spezifischen Rekombinasen für Integration und Exzision erkannt. Der Vorgang der site-spezifischen Exzision wurde für SCCmec I und SCCmec II durch ccrA und ccrB detailliert untersucht, sowie Exzision und Reintegration von SCCmec V durch ccrC [Ito et al., 2004; Katayama et al., 2000]. Im Gegensatz zum hochkonservierten mecA-Gen zeigen die ccr-Gene eine deutliche Variabilität. So wiesen Hanssen et al. [2004] bis zu 5 % Unterschied auf Nukleotidsequenzebene bei ccrAB-Genen aus SCCmec II und SCCmec IV nach. Daher wird angenommen, dass bestimmte Mutationen in den ccr-Genen zu einem Verlust der Rekombinase-Funktion und somit zu einer Stabilisierung des SCCmec- Elementes im Chromosom führen könnten [Noto u. Archer, 2006]. Dadurch dass die Integration von SCCmec nahe des origin of replication erfolgt, kann das Bakterium schneller einen Vorteil aus mit SCCmec zusätzlich erworbenen Genen wie Antibiotikaresistenzgenen ziehen. Die erworbenen Gene in der Nähe des origin of replication können aufgrund der Unabhängigkeit von DNA-Replikation und Zellteilung in mehrfachen Kopien in der Zelle vorliegen. Durch diese erhöhte Kopienzahl kann eine ineffiziente Translation bedingt durch atypische Codon- Nutzungs-Muster zumindest teilweise ausgeglichen werden [Hiramatsu et al., 2001]. Aufgrund seiner Größe ähnelt SCCmec Pathogenitätsinseln. Da aber bisher keinerlei Virulenzgene in ihm entdeckt wurden, kann man es eher als Antibiotikaresistenzinsel bezeichnen [Katayama et al., 2000]. Neben dem mec-Genkomplex kann es Transposons und integrierte Plasmide enthalten, die Resistenzdeterminanten gegen verschiedenste Substanzen tragen. EINLEITUNG 10 Eine Klassifizierung der SCCmec-Elemente erfolgt anhand der Kombination der vorhandenen Rekombinase-Gene und des Aufbaus des mec-Genkomplexes. Letzterer wird über die genetische Organisation der regulatorischen Gene von mec, mecR1 (Signaltransduktionsprotein) und mecI (Transkriptionsrepressorprotein) s.a. 1.10.2, bestimmt. Weiteren Aufschluss geben zusätzlich vorhandene genetische Elemente. [Hiramatsu et al., 2001; Katayama et al., 2001 ; Ma et al., 2002 ; Okuma et al., 2002] SCCmec-Elemente wurden bisher nur in Staphylokokken beschrieben [Hiramatsu et al., 2001]. Man nimmt an, dass die ccr- und mec-Gene in einem Koagulase-negativen Staphylococcus unbekannter Herkunft zusammen kamen. Dort erfolgte eine Deletion der mec-regulatorischen-Gene, bevor sie in S. aureus transferierten und zur Entstehung von MRSA führten [Archer et al.,1994; Musser u. Kapur, 1992]. Beim ersten vollständig sequenzierten MRSA-Stamm N315 [Ito et al., 1999] handelt es sich um einen sogenannte pre-MRSA (s.a. 1.10.2) der upstream von mecA über die kompletten mec-Regulationsgene verfügt. Downstream von mecA liegt die sogenannte hypervariable Region, die ebenfalls zur Typisierung von Stämmen genutzt werden kann [Ryffel et al., 1991; Nishi et al., 1995]. Das downstream-Ende dieser ca. 3 kb großen Region ist gekennzeichnet durch eine Kopie von IS431. Im pre-MRSA-Stamm besitzt der mecA-Locus den Aufbau mecI-mecR1-mecA- IS431R, was als classA-mec-Komplex bezeichnet wird. In anderen MRSA-Stämmen kann aber eine Deletion des mecI-Genes und des 3’-Endes von mecR1 vorliegen, wobei an der deletierten Stelle häufig ein Teil von IS1272 vorkommt [Archer et al., 1994, 1996]. Der Aufbau IS1272-∆mecR1-mecA-IS431R wird als classB-mec- Komplex bezeichnet. Neben diesen gibt es noch classC-mec mit IS431-∆mecR1- mecA-IS431 und classD-mec mit ∆mecR1-mecA-IS431 [Katayama et al., 2001], wobei letzterer bisher nicht bei S. aureus nachgewiesen wurde [Kondo et al., 2007]. Der ccr-Komplex enthält zwei site-spezifische Rekombinase-Gene, ccrA und ccrB, für die jeweils vier Allotypen bekannt sind (für ccrA: ccrA1, ccrA2, ccrA3, ccrA4; für ccrB: ccrB1, ccrB2, ccrB3, ccrB4) [Ito et al., 2001; Katayama et al., 2000]. Neben diesen klassischen ursprünglichen ccr-Typen wurde mittlerweile noch ccrC beschrieben [Ito et al., 2004], sowie Variationen bzw. neue Kombinationen der bekannten Rekombinase-Komplexe [Heusser et al., 2007]. EINLEITUNG 11 SCCmec I besitzt den classB-mec-Komplex und den Typ 1-ccr-Komplex, SCCmec II classA-mec und Typ 2-ccr, SCCmec III classA-mec und Typ 3-ccr und SCCmec IV classB-mec und Typ 2-ccr [Ito et al., 2001; Ma et al., 2002]. Die Regionen außerhalb der mec- und ccr-Genkomplexe werden als J-(junkyard)- Region bezeichnet und enthalten weitere Gene oder Pseudogene, die mit Ausnahme der durch Plasmide oder Transposons vermittelten Resistenzgene von keinem bisher bekannten Nutzen für das Bakterium sind. Durch die J-Regionen kann eine weitere Unterteilung der SCCmec-Typen erfolgen [Hiramatsu et al., 2002]. J1 ist dabei die Region zwischen ccr und der upstream flankierenden chromosomalen Region, J2 die Region zwischen ccr und mec und J3 die Region zwischen orfX und mec [Kondo et al., 2007]. Die Benennung der SCCmec-Elemente erfolgte nach der Reihenfolge der Isolationszeitpunkte ihrer Ursprungsstämme. Das zuerst beschriebene, aus der Sequenzierung des japanischen Stammes N315 stammende, Element ist somit SCCmec II [Ito et al., 1999]. Die erste Beschreibung von SCCmec I und SCCmec III und der Vergleich mit SCCmec II erfolgte durch Ito et al. [2001], die in dieser Arbeit ursprünglich klären wollten, ob das in dem japanischen Stamm entdeckte SCCmec II weltweit verbreitet ist. Die hierbei neu entdeckten SCCmec I und SCCmec III zeigten große Übereinstimmungen im Aufbau mit SCCmec II, so dass sie einer Familie zugeordnet wurden. Alle beschriebenen SCCmec integrierten an der gleichen Stelle in orfX und verfügten über die charakteristischen 15 bp direct repeats am upstream-Ende. Unterschiede zeigten die SCCmec-Elemente jedoch im Vorhandensein von Antibiotikaresistenzdeterminanten. So besaß das ursprüngliche SCCmec I-Element, welches aus einem MRSA der 60er Jahre und somit aus einer frühen Phase der Chemotherapeutika stammt, keinerlei Resistenzgene außer mecA. SCCmec III, dessen Prototyp aus den 80er Jahren stammt, besaß hingegen eine Vielzahl von Resistenzdeterminanten. Dies bedingte sich dadurch, dass neben einer Kopie des Plasmides pT181, welches Quecksilber- und Tetracyclin-Resistenz vermittelt auch Transposon ΨTn554, verantwortlich für Cadmiumresistenz, und Tn554, kodierend für Erythromycin- und Spectinomycin-Resistenz, nachweisbar waren. Die Kopien dieser beweglichen Elemente lagen downstream des mec-Komplexes. pT181 und das mer- EINLEITUNG 12 Operon waren ferner noch von Kopien des IS431 eingerahmt. Interessanterweise war zwischen diesen IS431-Kopien die SCCmec-typische 15 bp direct repeat Sequenz zu finden, daneben existierte im Element eine weitere ccr-Einheit. Diese Ergebnisse von Ito et al. [1999, 2001] legten nahe, dass SCCmec III sozusagen aus zwei SCCmec-Elementen besteht, wobei der mec-Komplex des einen evtl. zusammen mit dem ccrA-Gen nach der Integration ins Chromosom entfernt wurde. Dies gibt interessante Einblicke in die Entwicklung dieser Genkassetten. Eine entscheidene Rolle für die Zusammensetzung der SCCmec-Elemente, besonders im Hinblick auf den Grad der Multiresistenz, spielt IS431. Dieses flankiert nicht nur pT181 in SCCmec III, sondern auch das in SCCmec II integrierte pUB110. An beiden Enden dieser integrierten Plasmide existieren direct repeats. Dies deutet darauf hin, dass die Integration dieser Plasmide über homologe Rekombination von zwei Kopien von IS431 erfolgte, wovon eine auf dem jeweiligen Plasmid und eine im Chromosom lag [Skinner et al., 1988]. SCCmec IV wurde 2002 erstmals von Ma et al. [2002] beschrieben. SCCmec IV ist wesentlich kleiner als SCCmec II und SCCmec III und liegt mehr im Größenbereich des archaischen SCCmec I. Im Gegensatz zu SCCmec I welches einen veränderten ccrB1-Komplex besitzt, zeichnet sich SCCmec IV aber durch Wildtyp-Rekombinasen aus. Hierdurch lässt sich eventuell seine deutlich höhere Bewegsamkeit erklären. Bisher wurde SCCmec IV in Zusammenhang mit vier verschiedenen genetischen Hintergründen gefunden, was auf die Leichtigkeit hinweist, mit der es im Gegensatz zu SCCmec I, SCCmec II und SCCmec III transferiert [Baba et al., 2002; Ma et al., 2002]. Die Abwesenheit von Funktionen außer des Vorhandenseins von Genen für den Transfer (ccr-Gene) und für Methicillin-Resistenz (mecA) lässt im Zusammenhang mit seiner geringen Größe zu der Ansicht führen, dass SCCmec IV durch evolutionäre Verbesserung zu einem spezifischen Träger der DNA für Methicillin-Resistenz wurde. Weiterhin könnte das Fehlen überflüssiger Funktionen es zu einem besser beweglichen mobilen genetischem Element als die anderen SCCmecs für S. aureus machen. Dies liegt daran, dass eine Reihe von orfs, die von SCCmec I und SCCmec II in deren langer L-C-Region getragen werden, als nutzlos für die S. aureus-Wirtszelle betrachtet werden. Viele dieser orfs sind mutiert oder teilweise deletiert und scheinen nicht aktiv zu sein. Darüber hinaus könnte ein orf von EINLEITUNG 13 SCCmec I welcher für das Plasmin-Oberflächen-Protein (pls) kodiert für die Wirtszelle sogar gefährlich sein, da er die Fibrinogen- und Fibronectin- Bindungseigenschaften dieser beeinträchtigt. [Ma et al., 2002; Vaudaux et al., 1998] SCCmec IV wurde in MRSA-Stämmen gefunden, welche ansonsten identisch zu Methicillin-empfindlichen Stämmen des gleichen Gebietes sind. Es gibt SCCmec IV- haltige Stämme aus unterschiedlichen Regionen, die nicht verwandt erscheinen. Aufgrund dieser beiden Feststellungen wird angenommen, dass nicht verwandte MRSA-Stämme dieses SCC-Element unabhängig voneinander erworben haben [Charlebois et al., 2004; Enright et al., 2002]. Von SCCmec IV wird außerdem vermutet, dass es verantwortlich ist für die Umwandlung von kommensalen S. aureus in MRSA [Hiramatsu et al., 2001]. SCCmec V wurde 2004 von Ito et al. definiert aufgrund des Auffindens eines SCCmec-Elementes, das zwar an der üblichen Stelle ins Chromosom integriert war, aber eine abweichende Struktur der mec-Region und vor allem weder ccrA noch ccrB trug. Stattdessen besaß SCCmec V einen neuen Typ Kassettenchromosom- Rekombinase, kodiert durch ccrC. Dieser neue Typ zeigte aber Homologien zu den bekannten ccrA und ccrB. SCCmec V ist mit ca 28 kb etwas größer als SCCmec IV, enthält aber wie dieses außer mecA keine weiteren Resistenzgene. Neben diesen fünf Haupttypen, wovon nach wie vor hauptsächlich SCCmec I bis SCCmec IV in den verbreitetsten MRSA vorkommen, wurden auch noch eine Reihe von Varianten dieser Typen beschrieben, die neue Kombinationen bekannter SCCmec-Bestandteile oder auch zum Teil neue Bestandteile besitzen [Wielders et al., 2003; Sousa u. Lencastre, 2003; Carleton et al., 2004; Shukla et al., 2004; Corkill et al., 2004: Hanssen et al., 2004; Shore et al., 2005; Kondo et al., 2007; Heusser et al., 2007; Hanssen u. Sollid, 2007]. Oliveira et al. [2006] definierten ein zuvor als SCCmec IV-Subtypen beschriebenes Element aufgrund seines neuen ccrAB-Typs als SCCmec VI, es folgten allerdings keine weiteren Beschreibung anderer Autoren zu einem Element dieser Art. EINLEITUNG 14 Abb. 1 Aufbau von SCCmec I-V. pls: plasmin sensitive surface protein. kdp: kdp- Operon für ATP-abhängigen Kaliumtransport. HVR: Hypervariable Region. dcs: downstream constant sequence. hsd: Typ 1v Restriktions-Modififkations-System. [nach Ito et al., 2001; Oliveira u. Lencastre, 2001; Okuma et al., 2002; Ito et al., 2004] Ito et al. [2001] stellten die These auf, dass SCCmec bzw. SCC nicht auf Antibiotika- resistenz beschränkt ist, sondern als ein generelles System zum Austausch von genetischen Informationen in Staphylokokken fungiert. So wurden bisher vier nicht mec-assozierte SCC-Elemente bei S. aureus und KNS beschrieben. SCCcap1 kommt in S. aureus an der gleichen Stelle vor wie SCCmec und enthält den Virulenzfaktor cap1 (capsular polysaccharide 1), der einen erhöhten Schutz vor Phagozytose verleiht. SCCcap1 ähnelt SCCmec III, ist aber nicht mobil, da es kein ccrA besitzt und das enthaltene ccrB mutiert ist [Luong et al., 2002]. In dem KNS S. hominis (ATCC 27844) ist ein SCC-Element mit ccrAB1 enthalten, das weder Antibiotikaresistenzgene noch mobile genetische Elemente enthält [Katayama et al., 2003 a, b]. In S. epidermidis wurden zwei neue SCC-Elemente beschrieben, SCCcomposite island und SCCpbp4. SCCcomposite island ist 53 kb groß, enthält zwei Paare ccrAB-Rekombinasegene und wird von SCC-spezifischen 28 bp terminal repeat Sequenzen flankiert. SCCpbp4 ist 19 kb groß, trägt ein PBP4- Homolog und liegt innerhalb von SCCcomposite island [Mongkolrattanothai et al., 2004]. pls ccrA B 1 Tn554 ΨTn554 m ecA m ecI m ecR 1 ∆m ecR 1 IS431 IS1272 pUB110 pI258 pT181 HVR kdp hsdR attRattL attL attL attL attL attL attL attR attR attR attR attR orfX ∆m ecR 1 ∆H VR HVR ∆m ecR 1 ∆m ecR 1 ccrC hsdS hsdM ccrA B 2 HVR ccrA B 3 ccrA B 3 ΨTn554 m ecI m ecR 1 m ecI m ecR 1 HVR HVR pI258 attR SCCmec I SCCmec IV SCCmec V SCCmec II SCCmec III SCCmec IIIA SCCmec IA 0kb 10kb 20kb 40kb30kb 50kb 60kb 70kb orfX orfX orfX orfX orfX orfX pls ccrA B 1 ccrAB 2 m ecA m ecA m ecA m ecA m ecA m ecA IS431 IS431 IS431 IS431 IS431 IS431 IS431 IS431 IS431 IS431 IS431 IS431 IS431 pUB110 IS1272 IS1272 Tn554 Tn554 dcs dcs dcs dcs m er operon ∆m ecR 1 IS1272 ccrA B 1 m ecA m ecI m ecR 1 ∆m ecR 1 IS431 IS1272 pT181 hsdR ∆m ecR 1 ∆H VR ∆m ecR 1 ∆m ecR 1 ccrC hsdS hsdM ccrA B 2 ccrA B 3 ccrA B 3 m ecI m ecR 1 m ecI m ecR 1 ccrA B 1 ccrAB 2 m ecA m ecA m ecA m ecA m ecA m ecA IS431 IS431 IS431 IS431 IS431 IS431 IS431 IS431 IS431 IS431 IS431 IS431 IS431 IS1272 IS1272 dcs dcs dcs dcs m er operon ∆m ecR 1 IS1272 EINLEITUNG 15 Diskutiert wurde in der Literatur auch die Auswirkung des Erhalts von SCCmec für einen S. aureus Wirtsstamm. Ender et al. [2004] übertrugen DNA eines SCCmec I tragenden Stammes per Transformation in einen Methicillin-empfindlichen S. aureus und stellten neben dem Erhalt einer high-level Methicillin-Resistenz fest, dass die Transformanten eine erheblich geringe Wachstumsrate aufwiesen. Die Wachstumsrate normalisierte sich wieder, nachdem das SCC-Element in einem „curing“-Ansatz anschließend wieder ausgeschnitten wurde. In vivo scheint der Effekt der verlangsamten Wachtumsrate allerdings dem des Fitness-Gewinns durch den Erhalt der Methicillin-Resistenz zu unterliegen. 1.4 Typisierung von MRSA Die Populationsbiologie von MRSA und anderen Bakterien besser zu verstehen nimmt auch deswegen an Bedeutung zu, da auch die Öffentlichkeit immer größeres Interesse an Themen wie Antibiotikaresistenz und zunehmenden Infektionskrankheiten hat. Einen Beitrag hierzu leisten die fortschreitenden Sequenzierungen von Bakteriengenomen und die Entwicklung, Verbesserung und Standardisierung von Methoden zur Untersuchung der Klonalität von Bakterienpopulationen. Typisierungen im Rahmen epidemiologischer Untersuchungen haben als Hauptanliegen, einen bestimmten epidemischen Stamm anhand gewählter Merkmale von epidemiologisch nicht mit ihm zusammenhängenden Stämmen zu unterscheiden. Die gewählten Merkmale zur Typisierung sollten deswegen derart sein, dass sie stabil innerhalb des einen epidemischen Stammes sind, aber gleichzeitig genügend variabel innerhalb der Gesamtheit der Stämme, also der Spezies-Population. Bezüglich der Wahl von Methoden für vergleichende Untersuchungen muss immer die Ausrichtung der Fragestellung berücksichtigt werden, so z.B. ob man sich mit der Ausbreitung von MRSA in einem Krankenhaus, der Verbreitung von verschiedenen MRSA-Stämmen in einer bestimmten geographischen Region oder der weltweiten epidemiologische Entwicklung der letzten Jahre beschäftigen möchte. Zur Bestimmung der Verwandtheit von MRSA eines Ausbruchs in einem Krankenhaus ist z.B. die Pulsfeld-Gelelektrophorese restringierter chromosomaler DNA eine sinnvolle und gute Methode, sie eignet sich jedoch nicht für weltweite epidemiologische Studien über einen langen Zeitraum. Für solche Studien benötigt EINLEITUNG 16 man Methoden die hoch auflösend unterscheiden, aber zugleich Variationen registrieren die sich langsam anhäufen, wie z.B. Multi Locus Sequence Typing (MLST). Typisierungsmethoden lassen sich zunächst einmal in phänotypsiche und genotypische Methoden unterscheiden. Ansprüche an Typisierungsverfahren und Kriterien ihrer Bewertung sind primär Typisierbarkeit, also die Erzeugung eines eindeutigen Ergebnisses, Reproduzierbarkeit und Diskriminierungspotential. Sekundär von Bedeutung sind Interpretierbarkeit, Praktikabiliät, Kosteneffizienz und Automatisierung [Wichelhaus et al., 2000], sozusagen die Anwenderfreundlichkeit der Methode. Phänotypisierung wie z.B. anhand von Verhalten gegenüber Antibiotika, des Nachweises biochemischer Reaktionen, der Bildung von Toxinen, Multi Locus Enzyme Elektrophoresis (MLEE) u.ä. hat den generellen Nachteil, dass viele phänotypische Eigenschaften aufgrund der variablen Genexpression nicht unter allen Umständen stabil sind. Die zur Charakterisierung herangezogenen Eigenschaften sind also unter Umständen von Faktoren wie Wachstumsbedingungen beeinflusst und geben alleine keinen sicheren Aufschluss zur Typisierung. Ein anderer Grund der allgemein gegen eine Typisierungsmethode spricht kann der sein, dass sich mit ihr in Bezug auf die entscheidenden Eigenschaften keine Unterschiede darstellen lassen. Lysotopie, also Phagentypisierung, war z.B. lange Zeit die Methode der Wahl zur S. aureus-Typisierung. Zur Unterscheidung von MRSA ist Lysotopie alleine aber nicht sinnvoll anwendbar, ganz abgesehen davon, dass sie mit einem erheblichen, sehr speziellen Arbeitsaufwand verbunden ist. Als Ergänzung anderer Methoden oder für begrenzte Fragestellungen sind phänotypische Methoden, wie auch die Phagentypisierung, aber nach wie vor einsetzbar. Auch bei genotypischen Methoden muss man bei der Wahl stets beachten, ob sich mit der gewählten Methode auch gewünschte Unterschiede darstellen lassen. Anhand von Plasmidanalysen lassen sich zwar durchaus Unterschiede zwischen Stämmen darstellen, aber auch diese Typisierungsmethode ist mehr als Ergänzung zu anderen zu sehen. Plasmidanalysen als alleinige Typisierungsmethode sind nicht zweckmäßig, da Plasmide aufgrund ihrer Eigenschaften als bewegliche genetische EINLEITUNG 17 Elemente nicht immer stabil in einem Bakterium verbleiben und auch selbst genotypischen Veränderungen unterliegen können. Bevorzugterweise wird also statt der zusätzlichen plasmidären DNA die chromosomale DNA untersucht. Hierfür ist eine Vielfalt von Methoden entwickelt worden, von denen sich die meisten auch auf S. aureus anwenden lassen und viele auch zu Unterscheidung von MRSA-Stämmen [Witte, 2002; Weller, 2000; Trindade et al., 2003]. Im Folgenden soll nur auf einige, in der vorliegenden Arbeit erwähnte eingegangen werden. 1.4.1 PFGE - Analyse chromosomaler DNA mittels Pulsfeld- Gelelektrophorese Diese ursprünglich für DNA aus Hefen entwickelte Methode [Schwartz u. Cantor, 1984] basiert auf der elektrophoretischen Auftrennung von DNA, welche mit Restriktionsenzymen geschnitten wurde, die wenige Erkennungs- bzw. Schnittstellen haben. Die entstehenden, mit 10-800 kb relativ großen, DNA-Fragmente können nicht in einer konventionellen Gelelektrophorese aufgetrennt werden. Die Auftrennung erfolgt in dieser Methode in einem elektrischen Feld, dessen Ausrichtung sich periodisch ändert, also pulsiert. Die Methode ist zur Unterscheidung von MRSA sehr gut geeignet und wurde lange Zeit als „gold standard“ der MRSA-Typisierung bezeichnet. Auch vom Nationalen Referenzzentrum (NRZ) für Staphylokokken des Robert Koch Institutes (RKI) wurde PFGE zur Typisierung von MRSA angewandt [Bannerman et al., 1995; Tenover et al., 1994]. Als Restriktionsenzym wies sich SmaI als gut geeignet aus, es erzeugt 8-20 Fragmente der Größe 8-800 kb und setzte sich in der Anwendung durch. Es gibt eine Reihe von Untersuchungen und Veröffentlichungen, die sich mit PFGE im Vergleich zu anderen Methoden beschäftigen [Struelens et al., 1992; Schlichting et al., 1993; Strandén et al., 2003]. Nachteil der PFGE ist neben der langen Dauer der Durchführung ihr großer methodischer Aufwand der u.a. dadurch entsteht, dass die DNA mit größter Sorgfalt behandelt werden muss um sie intakt zu halten. Dies bildet auch einen Anteil an den hohen Kosten, die diese Methode verursacht [Weller, 2000]. Trotz alledem ist PFGE eine häufig eingesetzte sehr gut anwendbare Technik, die besonders zur Beobachtung von räumlich und zeitlich begrenzten Ausbrüchen geeignet ist. EINLEITUNG 18 1.4.2 MLST – Multi Locus Sequence Typing MLST leitet sich von der phänotypischen Typisierungsmethode der Multi Locus Enzyme Electrophoresis (MLEE) ab, bei der Proteine elektrophoretisch aufgetrennt und selektiv angefärbt werden. Die durch die unterschiedliche Mobilität bedingte Position einer Bande auf dem Gel steht für die Expression des Genotyps dieses Proteines. Somit lassen sich Allele eines Genes darstellen, da Proteine eines Genlocus zwei Banden in unterschiedlichen Positionen erzeugen. Problem der Methode ist die unterschiedliche Expression von Genen, die dadurch zu nicht eindeutigen Ergebnissen auf der Proteinebene führen kann. Mit der Entwicklung von MLST wurde dieses Problem umgangen und die Gene selbst wurden das zu analysierende Ziel [Maiden et al., 1998]. Verschiedene Sequenzen eines Genes stellen Allele dar, welchen eine Ziffer zugewiesen wird, aus denen sich der MLST Typ ergibt. Die Unterschiede in den Sequenzen werden hierbei nicht gewichtet, d.h. eine Punktmutation erzeugt ebenso einen neuen Alleltyp wie ein größerer Basenaustausch. Untersucht werden interne Bereiche von sogenannten housekeeping-Genen, da diese in allen Stämmen vorkommen, aber noch genügend Variabilität aufweisen. Für S. aureus wird die Analyse der folgenden sieben Loci angewandet: arcC (Carbamat Kinase), aroE (Shikimate Dehydrogenase), glpF (Glycerol Kinase), gmk (Guanylat Kinase), pta (Phosphate Acetyltransferase, tpi (Triosephosphat Isomerase) und yqiL (Acetyl coenzym A Acetyltransferase) [Enright et al., 2000]. Einschränkungen in der Anwendbarkeit entstehen auch bei dieser Methode durch den hohen Laboraufwand einhergehend mit hohen Kosten. Enright et al. [2002] identifizierten elf MRSA-Hauptklone in fünf Gruppen verwandter Genotypen durch MLST Untersuchungen. Die Analyse der MLST Sequenzdaten erfolgte dabei mittels eines speziellen Algorithmus: eBURST – (enhanced) Based Upon Related Sequence Types. Der Algorithmus identifiziert dabei zuerst sich gegenseitig ausschließende Gruppen verwandter Genotpyen und versucht dann den ursprünglichen Genotyp (ST – sequence type) jeder Gruppe zu ermitteln. Dann berechnet der Algorithmus die Abstammung vom ermittelten ursprünglichen Genotyp und stellt diese als radiales Diagramm mit dem ursprünglichen Genotyp als Zentrum dar [http://eburst.mlst.net/]. EINLEITUNG 19 1.4.3 PCR-basierende Techniken Die Methodik der Polymerasekettenreaktion (PCR) kann auf vielfältige Weise für Typisierungstechniken genutzt werden. Zum einen sind Nachweise spezifischer DNA-Elemente möglich, zum anderen lassen sich aber auch unspezifisch DNA- Bereiche vervielfältigen und dadurch entstandene gelelektrophoretische Bandenmuster weiter untersuchen. Häufig angewandt wird aber auch die Kombination der Vervielfältigung eines DNA-Abschnittes und dessen anschließende Analyse mittels Restriktionsenzymen und der elektrophoretischen Auftrennung der dabei entstehenden Fragmente. AP-PCR (arbitrarily primed PCR) bzw. RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) basieren auf der ungerichteten Vervielfältigung von Abschnitten der zu untersuchenden DNA mittels kurzer (ca. 10 bp) Primer, die keine bekannte Homologie zur Ziel-DNA besitzen. So entstehen eine Reihe von Fragmenten die zur Einteilung von Bakterien genutzt werden können [Williams et al., 1990; Welsh u. McClealand, 1990]. Für Rep-PCR (repetitive palindromic extragenic elements PCR) werden Primer für kurze repetetive Elemente verwendet, die im Genom aller Prokaryonten vorkommen und anscheinend auf Art- und Gattungsebene konserviert sind [Versalovic et al., 1991]. Vom NRZ für Staphylokokken des RKI wird seit Mai 2006 zur Typisierung von S. aureus statt Lysotypie und PFGE die spa-Typisierung angewandt. Ziel dieser PCR-basierten Technik ist die sog. X-Region, eine hypervariable Region im Bereich des spa-Genes welches für Protein A kodiert. In der X-Region ist eine repeat-Region enthalten, die mittels PCR amplifiziert und anschließend sequenziert wird. Die repeats sind i.d.R. 24 bp lang, ihre Anzahl schwankt zwischen 1 und 20 [Shuttleworth et al., 1987]. Die Benennung von spa-Typen erfolgt, ähnlich wie bei der MLST-Typisierung, durch die Analyse der ermittelten Sequenez mittels einer Datenbanksofware [www.ridom.de/staphtype.de]. Der spa-Typ ergibt sich dadurch, dass jedem repeat Element ein alpha-numerischer Code zugeordnet wird und somit aus der Art und Reihenfolge der repeat-Elemente [Harmsen et al., 2003]. Der Vergleich der ermittelten Sequenzen mit denen bekannter bzw. definierter spa-Typen erfolgt als Cluster-Analyse mittels eines speziell entwickelten Algorithmus (BURP - Based Upon Repeat Pattern). Die Übereinstimmung der Ergebnisse dieser Methode EINLEITUNG 20 mit denen der PFGE und der MLST sind hoch [Strommenger et al., 2006], so dass diese drei Typisierungsmethoden sich zur Untersuchung von MRSA-Stämmen weltweit etabliert haben und MRSA-Typen aufgrund dieser Methoden definiert werden. Zur Typisierung der SCCmec-Elemente haben sich in den letzten Jahren vor allem zwei PCR-Methoden etabliert. Oliveira u. Lencastre [2002] entwickelten eine Multiplex-PCR basierte Methode zur SCCmec-Typisierung, die auf spezifische Elemente der J-Region abzielt. Die Primer binden dabei an folgende Loci: Locus A liegt downstream des pls-Genes und ist typisch für SCCmec I, Locus B innerhalb des kdp Operons ist spezifisch für SCCmec II, Locus C innerhalb des mecI-Genes kommt in SCCmec II und SCCmec III vor, Locus D in der dcs region kommt in SCCmec I, SCCmec II und SCCmec III vor. Locus E liegt in der Region zwischen dem integrierten Plasmid pI258 und Tn554 bei SCCmec III wie auch Locus F zwischen Tn554 und orfX, Locus G liegt im Bereich der left junction zwischen IS431 und pUB110 und Locus H zwischen IS431 und pT181 (s. Abb. 70). Okuma et al. [2002] entwickelten Primersets mit denen der ccr- und der mec- Komplex erfasst werden kann und anhand der vorliegenden Typen SCCmec definiert wird. Beide PCR-Ansätze erfassen nur die bis zu ihrer Etablierung beschriebenen SCCmec I bis SCCmec IV, werden aber nach wie vor angewandt, wobei sie häufig durch weitere Methoden, wie z.B. einer PCR zur Erfassung von ccrC, ergänzt werden. 1.5 Entstehung und Entwicklung von MRSA Um die Evolution von MRSA zu betrachten, müssen sowohl die Phylogenie des S. aureus Stammes an sich, als auch die SCCmec-Region im speziellen charakterisiert werden [Robinson u. Enright, 2003]. Die Stamm-Phylogenie kann z.B. mittels MLST der sieben housekeeping-Gene dargestellt werden (s.a. 1.4.2) [Enright et al., 2000]. Die SCCmec-Region kann mittels verschiedener PCR-Methoden analysiert werden, die als charakterisierendes Ziel die ccr-Region und die mec-Gene oder andere SCCmec-spezifische Genabschnitte haben. EINLEITUNG 21 Die Entstehung des ersten MRSA-Stammes wurde lange diskutiert und zunächst die These entwickelt, dass die Entstehung von MRSA durch ein singuläres Ereignis stattfand, so dass alle MRSA aus einem einzigen Ursprungsklon hervorgegangen wären, welcher das mecA-Gen erlangt hat [Kreiswirth et al., 1993]. Mittlerweile haben Studien aber eine hohe Diversität einiger MRSA-Stämme belegt, was darauf hindeutet, dass mecA zwischen verschiedenen S. aureus ausgetauscht wurde, bzw. sich in mehreren separaten Ereignissen in S. aureus entwickelte [Fitzgerald et al., 2001; Musser u. Kapur, 1992]. Die evolutionäre Geschichte des ersten MRSA-Stammes wurde in jüngster Vergangenheit durch Enright et al. [2002] mittels MLST und Crisostomo et al. [2001] mittels SCCmec-Typisierung geklärt. Crisostomo et al. [2001] zeigten, dass epidemische MSSA aus den 50er Jahren den gleichen MLST-Typ besaßen wie erste MRSA aus den 60ern. Daraus folgerten sie, dass der erste MRSA-Stamm dadurch entstand, dass ein solcher MSSA-Stamm, wie die aus den 50er Jahren stammenden, SCCmec I erhalten hat. Größere Studien unter der Verwendung von eBURST zeigten die Zugehörigkeit vieler pandemischer MRSA zu einem einzigen klonalen Komplex (CC). Mittlerweile wurden fünf CCs beschrieben die in international verbreitete nosokomiale MRSA enthalten sind. In jedem dieser klonalen Komplexe wurde die Methicillin-Resistenz durch mindestens zwei Ereignisse erlangt [Enright et al., 2002; Oliveira et al., 2002]. Es gibt somit deutliche Hinweise darauf, dass erfolgreiche MSSA-Klone in mehr als einem Ereignis zu MRSA-Klonen wurden. Dies kann durch die Existenz von Isolaten mit dem gleichen ST-Typ aber unterschiedlichen SCCmec-Typen angenommen werden. Zwei der am weitesten verbreiteten ST-Typen (ST-5 und ST-8) kommen bei allen vier bis dahin bekannten SCCmec-Typen vor [Enright et al., 2002] Durch Untersuchung internationaler Kollektive von MRSA konnte somit festgelegt werden, dass Methicillin-Resistenz sich in fünf verschiedenen phylogenetischen Linien entwickelte, innerhalb gegebener phylogenetischer Linien in mehrfachen Ereignissen entstand und die meisten MRSA-Erkrankungen von einer kleinen Anzahl pandemischer Klone verursacht werden [Enright et al., 2002; Crisostomo et al., 2001; Oliveira et al., 2001]. Eine detaillierte evolutionäre Geschichte der MRSA-Entstehung wurde von Robinson u. Enright [2003] mittels einer erweiterten MLST-Typisierung dargestellt. EINLEITUNG 22 Die genauen Mechanismen des mecA- bzw. mec-Tranfers sind nicht bekannt, aber es gibt deutliche Hinweise auf einen horizontalen Transfer des mecA-Gens unter verschiedenen Staphylokokken-Arten [Hanssen et al., 2004]. In S. sciuri konnte ein Gen mit 88 % Homologie zu mecA auf Aminosäure-Ebene nachgewiesen werden [Couto et al., 1996]. Nach der Transduktion dieses mecA- homologen Genes in einen MSSA-Stamm konnte bei diesem PBP2’ und eine Methicillin-Resistenz dokumentiert werden [Couto et al., 2003]. Es sind keine zu mecA homologen Gene in MSSA-Stämmen bekannt, auch daraus wurde geschlussfolgert, dass KNS wie S. sciuri der Ursprung des mecA-Gens sind [Archer u. Niemeyer, 1994]. 1.6 C-MRSA - Community aquired Methicillin-resistant S. aureus MRSA galten in der ersten Zeit nach ihrer Entdeckung nur als Erreger nosokomialer Infektionen, ihr Auftreten und ihre Verbreitung beschränkten sich somit auf Krankenhäuser. In jüngerer Vergangenheit wurde klar, dass sie auch in Alten- und Pflegeheimen vorkommen und darüber ein weiterer wichtiger Ausbreitungsverlauf besteht. Mittlerweile scheint es so, als hätten MRSA einen ganz neuen Verbreitungsweg eingeschlagen, den über die normalen gesunden Menschen [Gorak et al., 1999; Vandenesch et al., 2003]. C-MRSA im strengen Sinne der Definition „community aquired“ kommen völlig unabhängig von Krankenhäusern, Pflegeeinrichtungen o.ä. bei Patienten vor, die keine der für Krankenhausinfektionen bekannten Risikofaktoren (Grunderkrankung, vorheriger Krankenhausaufenthalt, Antibiotikatherapie, Drogengebrauch) besitzen. Die erste Beschreibung von C-MRSA-Stämmen erfolgte in den USA im Zusammenhang mit schweren Hautinfektionen von Teilen einer Bevölkerungsgruppe indianischer Abstammung. Es folgten weitere Beschreibungen ähnlicher Fälle in anderen Teilen Amerikas sowie in Australien. Dann tauchten C-MRSA bei Homosexuellen gehäuft in San Francisco auf. Ein weiterer besonderer Fall eines C- MRSA-Ausbruches ist der auf einem Schiff der US-Navy, bei dem Matrosen an Hautinfektionen erkrankten. Mittlerweile gibt es Beschreibungen von C-MRSA- Ausbrüchen aus fast allen Teilen der Welt [Naimi et al., 2001; Vandenesch et al., 2003]. EINLEITUNG 23 In den USA wurden 1998 C-MRSA-Infektionen bei Kindern und anderen Personen beschrieben, die zuvor keinerlei Kontakt zu medizinischen Einrichtungen hatten. Bei diesen Menschen kam es zu nekrotisierenden Lungenentzündungen die auf PVL (s.a. 1.9.4) zurückführbar waren [CDC, 1999; Gillet et al., 2002]. Seit den ersten Berichten über das Auftauchen von C-MRSA ist noch nicht ganz klar, ob diese Stämme dadurch entstanden, dass sie als ursprünglich nosokomiale Stämme aus dem Krankenhaus in die Umwelt gelangten oder ob sie ein neues Ereignis der Aufnahme von SCCmec darstellen. Obwohl sich genotypische Merkmale wie SmaI-PFGE-Muster oder MLST-Typisierung unterscheiden, zeichnen sich C- MRSA durch vier Haupteigenschaften aus, die sie von MRSA unterscheiden [Okuma et al., 2002]: 1. Empfindlichkeit gegenüber den meisten Antibiotika außer β-Laktamen. So zeigten Linde u. Nehn [2005], dass in Oberbayern vorkommende C-MRSA als weitere Resistenz nur die gegen Fusidinsäure besaßen. 2. Vorhandensein von SCCmec IV, in klassischer Form oder eine Variante dessen 3. Produktion von PVL 4. keine Verwandschaft mit Genotypen, die endemisch in Krankenhäusern vorkommen [Ma et al., 2002; Daum et al., 2002 ; Naimi et al., 2003 ; Dufour, 2002]. Hinsichtlich der C-MRSA-Problematik ist aber ihre Definition als solche von großer Bedeutung. Die Ansichten bzgl. C-MRSA änderten sich im Laufe der Zeit, und Studien zeigten, dass die Anwendung unterschiedlicher Definitionen von C-MRSA zu vollkommen unterschiedlichen Aussagen zu dessen Häufigkeit und Verbreitung führten [Folden et al., 2005]. EINLEITUNG 24 1.7 Vorkommen von MRSA – Verbreitung epidemischer Stämme In Deutschland wie auch in vielen anderen Ländern hat der Anteil von MRSA an S. aureus in den letzten zehn Jahren stark zugenommen. Daten von EARSS zufolge war Deutschland, betrachtet von 1999 bis 2002, eines der europäischen Länder mit der stärksten Zunahme von MRSA (1999: 9 % - 2002: 19 %). In jener Studie wurden die Daten von Antibiotikaresistenzprüfungen von S. aureus aus Blutkulturen dieser Zeit erfasst: 50759 Isolate aus 495 Krankenhäusern aus 26 Ländern. Insgesamt waren 20 % dieser Isolate Methicillin-resistent, wobei die geographischen Unterschiede hier erheblich waren (s. Abb. 2). Dabei ließ sich innerhalb Europas ein Nord-Süd-Gradient beobachten, die MRSA-Anteile einzelner Länder variierten bis zum 100fachen (Island 0,5 % - Griechenland 44 %) [Tiemersma et al., 2004]. Auch aktuellere Daten von EARSS zeigen weiterhin in den meisten Ländern einen Anstieg der Rate von MRSA. Im Jahresreport von EARSS der die Daten von 1999- 2005 betrachtet, besaßen in 2005 nur sieben der 30 an der Studie teilnehmenden Länder eine MRSA-Rate von unter 3 %. In Island (0 %), Norwegen (1 %), Schweden (1 %) und Estland (2 %) blieb diese Rate seit 1999 in etwa konstant. In anderen Ländern hingegen, die ebenfalls für ihre niedrigen MRSA-Raten bekannt waren, ließen sich seit 1999 durchaus signifikante Anstiege dieser verzeichnen. So stieg die MRSA-Rate in den Niederlanden von 0,34 % auf 0,93 %, in Dänemark von 0,28 % auf 1,70 % und in Finnland von 0,95 % auf 2,91 %. In einigen Ländern, die 2001 noch einen MRSA-Anteil von unter 10 % hatten, waren aber wesentlich stärkere Anstiege bis 2005 zu verzeichnen, so in der Tschechischen Republik (13 %), der Slowakei (19 %), Ungarn (19 %) und in Deutschland (21 %). Kontinuierliche Senkung der MRSA-Raten zeigten hingegen auch zwei Länder, dies waren Slowenien (1999: 21 % - 2005: 10 %) und Frankreich (2001: 33 % - 2005: 27 %). [EARRS Annual Report 2005]. Die Abb. 2 von EARSS zeigt den allgemeinen Anstieg der MRSA-Raten von 1999 bis 2005 in europäischen Ländern. Daten der Paul Ehrlich Gesellschaft (PEG) zeigen einen stetigen Anstieg der MRSA- Rate in Deutschland von 15,2 % in 1998 auf 20,7 % in 2001 [Kresken et al., 2003]. Das nationale Krankenhaus Infektions Surveillance System (KISS) machte ähnliche Beobachtungen und beschrieb einen Anstieg des Anteils nosokomialer MRSA Infektionen an allen nosokomialen S. aureus Infektionen in Intensivstationen von 8 % in 1997 auf 30 % in 2003 [RKI, 2004]. EINLEITUNG 25 Abb. 2 Häufigkeit von MRSA-Isolaten in an der EARSS-Studie teilnehmenden Ländern in (a) 1999, (b) 2001, (c) 2003 und (d) 2005. Die Daten beziehen sich auf die Erhebung des Anteils von MRSA an S. aureus in Blutkulturen von Referenzlaboren der jeweiligen Länder. Die Häufigkeiten sind entspreched der Legende in den jeweiligen Farbgebungen der Länder dargestellt. Die Darstellungen wurden mit Hilfe der Datenbankabfrage auf der Internetseite von EARRS erzeugt (http://www.rivm.nl/earss/). Über das weltweite Vorkommen von MRSA vermittelt Abb. 3 einen Eindruck, wobei es für einige Länder und hier vor allem die Entwicklungsländer nicht genügend Daten gibt. Geht man davon aus, dass weltweit ca. 2 Milliarden Menschen S. aureus tragen, so beliefe sich der Anteil an MRSA weltweit ausgehend von den niedrigen Niederländischen Raten auf 2 Millionen, ausgehend von den höheren Raten der USA auf 53 Millionen [Kuehnert et al., 2006]. Japan hat eine der höchsten MRSA-Raten der Welt, so waren 2001 dort fast 70 % der untersuchten Blutkulturen MRSA-positiv [Hori, 2005]. In Norwegen ist die Prävalenz von MRSA mit 0,2 % der S. aureus Isolate sehr gering [Hanssen et al., 2004 laut NORM/NORM-VET, 2001]. Auch in den Niederlanden zeigt sich, dass sich die epidemische Ausbreitung von MRSA durch ein sehr striktes Hygienemanagement im Krankenhaus und auch in Pflegeeinrichtungen eindämmen lässt. EINLEITUNG 26 Abb. 3 Weltweites Vorkommen von MRSA. Aus Grundmann et al. [2006]. Dargestellt sind die MRSA-Raten einzelner Länder basierend auf den Daten verschiedener Studien seit 1998. † Häufigkeit geschätzt basierend auf der Studie eines Krankenhauses ‡ Häufigkeit geschätzt basierend auf Studien aus 1993 und 1997. Solch ein „search & destroy“-Hygienemanagement führt zwar zu hohen Kosten pro Patient, diese müssen aber in Relation gesetzt werden zu den Kosten bei epidemischer Ausbreitung von MRSA und Behandlung erkrankter Patienten. Die direkten Kosten einer MRSA-Septikämie beispielsweise sind ca. dreimal höher als die Kosten einer MSSA bedingten Infektion [Abramson u. Sexton, 1999]. Zur Abwägung der Kosten eines aufwändigen Screenings und strikter Hygienemaßnahmen gegen die Kosten von zu behandelnden MRSA-Infektionen gibt es mehrere Studien [Papia et al., 1999; Vriens et al., 2002; Lemmen et al., 2004; Hugett et al., 2006]. Diese sprechen sich in Abhängigkeit von der Prävalenz bzgl. des Kosten-Nutzen-Faktors für ein Aufnahmescreening mittels schneller Methoden wie PCR aus. Eine Screening aller aufgenommenen Patienten wäre zwar wünschenswert, lässt sich aber aufgrund der hohen Kosten nicht umsetzen. Ein Routinescreening aller Risikopatienten ist hingegen erstrebenswertes Ziel. Risikopatienten sind z.B. definiert durch bekannte MRSA-Infektionen in der Vorgeschichte, mehr als 14 Tage Krankenhausaufenthalt im vorangegangenen Jahr oder auch nur durch eine Verlegung von der Intensivstation [Linde u. Lehn, 2005]. EINLEITUNG 27 Die Epidemiologie von MRSA änderte sich Ende der 90er Jahre sehr deutlich, es kam vermehrt zu echten C-MRSA-Infektionen bei Patienten ohne irgendeinen klaren Risikofaktor [Charlebois et al., 2004]. Seit dem Bekanntwerden von C-MRSA-Infektionen wird bei der Behandlung von MRSA-Thematiken zwischen diesen und den klassischen im Krankenhaus erworbenen H-MRSA (hospital aquired MRSA) unterschieden. Bei den H-MRSA wiederum finden die sogenannten epidemischen MRSA besondere Beachtung, dabei handelt es sich um MRSA die offensichtlich über eine besonders ausgeprägte Ausbreitungsfähigkeit verfügen. Diese Ausbreitungsfähigkeit wird auch als „epidemische Virulenz“ bezeichnet und charakterisiert ein komplexes Verhalten der MRSA-Stämme, welches durch deren Eigenschaften wie Ausstattung mit Pathogenitätsfaktoren und Faktoren ihrer Umwelt wie Maßnahmen gegen Ausbreitung von MRSA bestimmt wird [RKI, 2003]. Definiert sind diese Stämme über Typisierungsverfahren wie PFGE, MLST und spa-Typisierung, bei denen sie stets reproduzierbare eindeutige Erkennungsmerkmale zeigen. Im Gegensatz dazu stehen die sporadischen MRSA, die selten vorkommende Typisierungsergebnisse zeigen und nur vereinzelt auftreten. Etwa 10 % der MRSA sind nicht-epidemische Stämme [Ghebremedhin et al., 2005]. In Deutschland kommen hauptsächlich sechs epidemische Stämme vor die ein geographisches Verbreitungsmuster zeigen, welches vom RKI über Jahre hinweg beobachtet und im Epidemiologischen Bulletin regelmäßig dokumentiert wird (s. Abb. 4). Dabei lassen sich über die Jahre Veränderungen feststellen. So kommt z.B. der früher vor allem im Westen und Südwesten auftretende Rhein-Hessen- Epidemiestamm, mittlerweile bundesweit vor. Der 1996 erstmals in Deutschland in Erscheinung getretene Barnim-Epidemiestamm verbreitete sich rasch [Witte et al., 2001], ist aber trotz weiter Verbreitung laut der RKI Daten zu 2005 und 2006 wie der Berliner-Epidemiestamm primär im Norden Deutschlands anzutreffen [RKI, 2007]. EINLEITUNG 28 Norddeutscher Epidemiestamm Wiener-Epidemistamm Süddeutscher Epidemiestamm Barnim-Epidemiestamm Berliner Epidemiestamm Rhein-Hessen-Epidemiestamm Hannoverscher Epidemiestamm andere MRSA Abb. 4 Ausbreitung epidemischer MRSA in Deutschland von 2001 bis 2006 laut Daten des NRZ für Staphylokokken des RKI. Abb. 2001 aus RKI, 2002. Abb. 2002 aus RKI, 2003. Abb. 2003 aus RKI, 2004. Abb. 2004 aus RKI, 2005. Abb. 2005 und 2006 aus RKI, 2007. EINLEITUNG 29 Abb [2004] zeigte in einer zweijährigen Studie in einem deutschen großen Universitätsklinikum, dass zwar die Mehrheit der auftauchenden MRSA-Isolate sporadische Stämme mit einer hohen genetischen Diversität darstellten, es aber dennoch eine signifikante Ausbreitung von genetisch verwandten Stämmen innerhalb des Krankenhauses gab. Es zeigte sich, dass die MRSA-Stämme eines nosokomialen Clusters sich primär von einem vorherrschenden ableiten und somit eine deutliche Ausbreitung innerhalb des Krankenhauses bzw. einer Abteilung zeigen, während Erstisolate von Patienten ein hohes Maß an genetischer Heterogenität zeigten [Abb, 2004]. 1.8 MR-KNS – Methicillin-resistente Koagulase-negative Staphylokokken Koagulase-negative Staphylokokken werden nicht selten im klinischen Bereich isoliert, so kommen sie z.B. sehr häufig in Blutkulturen vor [Witte, 1999]. Ihre Bedeutung für den klinischen Bereich ist jedoch fraglich. Die in KNS nachweisbaren Resistenzgene sind häufig die gleichen wie in S. aureus [Archer u. Climo, 1994]. Bisher sind 23 Koagulase-negative Staphylokokkenarten beschrieben worden, von denen mindestens 13 humanpathogene Bedeutung erlangen können. Von KNS wird angenommen, dass sie als ein Reservoir für Resistenzgene dienen, die zu S. aureus oder anderen Gram-positiven Bakterien übertragen werden können [Hanssen et al., 2004]. Wielders et al. [2001] zeigten einen möglichen horizontalen in vivo Transfer von mecA in S. aureus in Gegenwart von MR-KNS während einer Antibiotikabehandlung. SCC muss nicht zwingend mit mecA vorkommen, es kann verschiedene Antibiotika- Resistenzdeterminanten beinhalten [Ito et al., 2001]. Dies wurde auch von Luong et al. [2002] beobachtet, die ein SCCcap1 Element in einem mec-negativen S. aureus Stamm beschrieben, und ebenfalls von Katayama et al. [2003 a], die ein SCCmec I Element in einem Methicillin-empfindlichen S. hominis Stamm nachwiesen. Selbst in Norwegen, wo die MRSA-Rate sehr gering ist, sind 70-80 % der KNS aus klinischem und außerklinischem Bereich Methicillin-resistent [Hanssen u. Sollid, 2005]. EINLEITUNG 30 Busscher et al. [2006] untersuchten im Hinblick von KNS als Reservoir für MRSA in den Niederlanden 200 gesunde Pferde von 23 Farmen sowie 42 Personen, die mit diesen Pferden in engem Kontakt standen. Dabei konnten sie bei 45 Pferden (22,5 %) und 15 Menschen (35,7 %) mecA-positive Staphylokokken nachweisen, welche allerdings mit einer Ausnahme Koagulase-negativ waren. Bei den Pferden, bei denen oft mehr als ein mecA-positiver Stamm pro Tier nachgewiesen werden konnte, war S. sciuri der dominierende KNS, bei den Menschen war es S. epidermidis. Bei Untersuchungen von Tieren wurden bereits häufiger MRSA nachgewiesen, die laut PFGE oder ähnlichen vergleichenden Methoden identisch waren mit solchen, die bei Menschen aus der Umgebung dieser Tiere stammten. Dies gibt deutliche Hinweise auf die Übertragung von MRSA zwischen Mensch und Tier [Seguin et al., 1999; Weese et al., 2005]. Bei der Analsye von Methicillin-resistenten und Methicillin-sensiblen S. epidermidis wurde festgestellt, dass eine Vielzahl von ihnen SCCmec-Strukturen besaß, ein Großteil besaß Ähnlichkeiten zu SCCmec IV. Der Erhalt und Verlust von mobilen genetischen Elementen, wie den verschiedenen SCCmec-Strukturen, schien in S. epidermidis Chromosom häufig in der Nähe von orfX stattzufinden [Miragaia et al., 2005]. 1.9 Toxine in S. aureus und MRSA Wie Untersuchungen zur Populationsdynamik und Verbreitung von pathogenen S. aureus-Klonen zeigten, kann sich jeder beim Menschen anzutreffende S. aureus- Genotyp zu einem lebensbedrohlichen verwandeln. Es gibt dabei jedoch bestimmte Klone die eine höhere Virulenz besitzen [Melles et al., 2004]. Viele S. aureus produzieren mehr oder weniger staphylokokkenspezifische Exotoxine, deren Auswirkungen von relativ harmlosen Hautirritationen bis hin zur lebensbedrohlicher Sepsis und dem gefährlichen Toxic Shock Syndrome führen können. Zu den wichtigsten Virulenzfaktoren die S. aureus ausscheidet gehören die der pyrogenen Toxin Superantigen Familie (PTSA), welche das Toxic Shock Syndrome und ähnliche Krankheiten verursachen. Die Symptome eines toxischen Schocks und ähnlich heftiger Immunreaktionen haben ihre Ursache darin, dass Makrophagen und EINLEITUNG 31 T-Zellen durch die S. aureus-Toxine zu einer massiven Cytokinin-Ausschüttung veranlasst werden. Die als Superantigene fungierenden Toxine gehen dabei direkte Bindungen zu den Immunzellen ein, statt den normalen Weg der Antigen- Präsentation über die Klasse II-MHC-Moleküle und die Vß-Region spezifischer T- Zellen zu gehen [Uchiyama et al., 1994]. Zu diesen Superantigenen gehören neben dem Toxic Shock Syndrome Toxin 1 (TSST-1) die Staphylokokken Enterotoxine A bis Q [McCormick et al., 2001]. Die Superantigen-Toxine sind trotz Abweichungen in der primären AS-Sequenz auf struktureller Ebene miteinander verwandt. 1.9.1 Enterotoxine Staphylokokkenenterotoxine (SE) können Lebensmittelintoxikationen und verschiedene allergische und autoimmune Erkrankungen hervorrufen. Allen Enterotoxinen gemeinsam ist ihre Manifestation im Verdauungstrakt und ihre Wirkung als Superantigen [Balaban u. Rasooly, 2000; Dinges et al., 2000]. Aufgrund ihrer Eigenschaften und unterschiedlichen Gensequenzen sind bisher die Toxine SEA bis SEE und SEG bis SEQ beschrieben worden [Kuroda et al., 2001; Baba et al., 2002; Yarwood et al., 2002]. Die Bildung der Enterotoxine erfolgt überwiegend in der postexponentiellen Wachstumsphase. Dabei wird jedes Toxin zunächst als Vorläufer-Toxin in der Bakterienzelle gebildet und mit einer Signalsequenz ausgestattet, welche dann beim Transport aus der Zelle abgespaltet wird. Bei den eigentlichen Toxinen handelt es sich um Proteine mit einem hohen Gehalt an Lysin, Asparaginsäure, Glutaminsäure und Tyrosin und einem Molekulargewicht von 20-30 kDa [Dinges et al., 2000]. Enterotoxine sind stabil gegenüber proteolytischen Enzymen wie Trypsin und Papain und sehr hitzestabil. Dadurch werden sie weder nach oraler Aufnahme beim Verdauungsprozess noch beim normalen Kochprozess zerstört. Selbst bei der Konservenherstellung kann unter Umständen die biologische Aktivität der Enterotoxine erhalten bleiben [Brückler et al., 1994]. Staphylokokkensuperantigene werden häufig durch genetische Elemente wie Plasmide, Transposons, Prophagen und Pathogenitätsinseln kodiert. Pathogenitätsinseln können Gene für ein oder mehrere Staphylokokken- superantigene beinhalten. Es sind zehn Pathogenitätsinseln beschrieben (SaPI1 bis 4, SaPIbov, SaPIn1/SaPIm1, SaGIm, SaPIn2, SaPIm2, SaPIn3/SaPIm3) [Kuroda et al., 2001; Yarwood et al., 2002]. EINLEITUNG 32 Enterotoxine werden aber nicht nur von S. aureus, sondern auch von anderen Staphylokokken-Arten gebildet [Loir et al., 2003]. SEA ist mit 77 % das im Rahmen von Lebensmittelvergiftungen in den USA am häufigsten nachgewiesene SE, gefolgt von SED (37,5 %) und SEB (10 %) [Casman, 1965]. Das Gen sea ist auf dem Genom eines temperenten Bakteriophagen lokalisiert [Betley u. Mekaianos, 1985]. Das seb-Gen ist chromosomalen Ursprungs und wurde als ein Element der Pathogenitätsinsel SaPI3 beschrieben [Yarwood et al., 2002; Shafer u. Iandolo, 1978]. Ein seb-tragendes Plasmid wurde ebenfalls beschrieben [Shalita et al., 1977]. Bei SEC handelt es sich genau genommen um eine Gruppe von hochkonservierten Proteinen, die in Varianten vorkommen (SEC1, SEC2, SEC3) [Bergdoll et al., 1965; Bohach u. Schlievert, 1987; Marr et al. 1993]. Für SED-bildende S. aureus wird häufig ein großes, sed-tragendes, Penicillinase- kodierendes Plasmid beschrieben [Bayles u. Iandolo, 1989]. Durch Sequenzierung des Plasmids pIB485 konnte die Sequenz von sed ermittelt werden, wobei ebenfalls das erstmalig von Zhang et al. [1998] beschriebene sej entdeckt wurde. Sequenzanalysen von SEE zeigten seine Verwandtschaft zu SED und SEA [Van Den Bussche et al., 1993]. SEG wurde 1998 erstmalig beschrieben [Munson et al., 1998]. Aminosäure-Sequenzanalysen ergaben im weiteren Ähnlichkeiten zwischen SEG, SEB und SEC (38-42 % Aminosäureähnlichkeit) sowie zwischen SEI, SEA, SEE und SED (26-28 % Aminosäureähnlichkeit). SEH wurde von Su u. Wong [1995] identifiziert und weitergehend charakterisiert und zeigt Übereinstimmungen in der Aminosäure-Sequenz mit SEE (38 %), SEA (37 %), SED (37 %), SEB (33 %) und SEC (27 %). SEJ hat Ähnlichkeiten zu SEA, SEE und SED und wird durch ein Plasmid kodiert, auf dem sed und sej durch eine 895 bp große Region getrennt sind. Beide Gene werden von S. aureus exprimiert, scheinen aber einer unterschiedlichen Regulation zu unterliegen [Zhang et al., 1998; Akineden et al., 2001]. Die Expression von Virulenzgenen unterliegt in S. aureus meist der Kontrolle des agr-Systems (accessory gene regulator), nicht jedoch die von sej. Das agr-System weist einen Polymorphismus in der Sequenz des Autoinduktions-Peptides und seines Rezeptors auf, anhand dessen man klinische Stämme in vier agr-Typen (agr I - IV) unterteilen kann [Lina et al., 2003]. Der Enterotoxin Gen Cluster (egc) umfasst neben zwei Pseudogenen seo, sem, sei, sen und seg [Jarraud et al., 2001]. EINLEITUNG 33 Die Rolle der in jüngerer Zeit beschriebenen Enterotoxine ab seg als Verursacher von toxinvermittelten Staphylokokkenerkrankungen oder als Verstärker der Schwere einer Infektion ist noch unklar [Becker et al., 2003]. Bei Lebensmittelvergiftungen konnten aber S. aureus nachgewiesen werden, die keines der klassischen Enterotoxine (sea, seb, sec, sed, see) besaßen, jedoch seg, seh, sei und sej [McLauchlin et al., 2000]. 1.9.2 Toxic Shock Syndrome Toxin Wie die oben erwähnten SE gehört auch das Toxic Shock Syndrome Toxin (TSST) zur Gruppe der pyrogenen Superantigene. Über S. aureus im Zusammenhang mit dem Toxic Shock Syndrome wurde erstmals von Todd et al. [1978] berichtet. Es handelt sich hierbei um eine akute multisystemische Erkrankung die durch einen raschen Fieberanstieg, niedrigen Blutdruck, übermäßig durchblutete Schleimhäute und erythematösen Hautausschlag hin zu Desquamation gekennzeichnet ist. Die Erkrankung kann sich im weiteren Verlauf auf viele Organe ausbreiten, zu Erbrechen und Diarrhöe, Bewusstseinsstörungen oder einem hypovolämischen Schock führen. Schädigungen von Leber und Niere können tödliche Auswirkungen haben. Ursprünglich wurde TSS in den USA bei Frauen im Zusammenhang mit der Benutzung von Tampons beschrieben. Mittlerweile wird TSS wesentlich häufiger als Folge von lokalen S. aureus Infektionen beobachtet, sowohl in klinischen Situationen als auch außerhalb dieser [Fitzgerald et al., 2001]. Die häufigste Ursache für TSS ist TSST-1, ein hochwirksames Superantigen, welches von ca. 20 % der natürlich vorkommenden S. aureus gebildet wird. Das kodierende Gen tst ist auf einer Familie aus verwandten Pathogenitätsinseln lokalisiert, welche auf eine sehr spezifische Weise mit bestimmten Staphylokokken- Phagen interagieren. Dieser Interaktion von Pathogenitätsinseln und Phagen wird eine entscheidende Rolle bei der Verbreitung von tst zugeschrieben [Lindsay et al., 1998]. McCormick et al. [2001] beschrieben die Pathogenitätsinseln SaPIbov, SaPI1 und SaPI2, welche das Gen tst beinhalteten. EINLEITUNG 34 1.9.3 Exfoliativtoxine A und B Laut Dajani [1972] kommt das exfoliative bzw. epidermolytische Staphylokokkentoxin (ET) vorzugsweise bei S. aureus Stämmen vor, die im Zusammenhang mit Hautinfektionen des Menschen, wie Impetigo contagiosa bei Erwachsenen oder „toxische Nekrose" bei Kindern, isoliert wurden. Es wurden bisher vier Serotypen beschrieben: ETA, ETB, ETC und ETD [Sato et al. 1994]. ETA und ETB stehen im Zusammenhang mit einer Erkrankung, die als „staphylococcal scaled skin syndrome" (SSSS) bezeichnet wird. Diese Erkrankung betrifft besonders Neugeborene, Kinder oder Patienten mit Immunsuppression oder hochgradiger Niereninsuffizienz. Das klinische Bild beinhaltet eine Blasenbildung der geröteten Haut, ähnlich einer Verbrühung durch kochendes Wasser und geht mit Fieber einher. Diese Blasen sind mit erregerfreier Flüssigkeit gefüllt und heilen innerhalb von sieben bis zehn Tagen meist narbenfrei ab [Piémont et al., 1986]. ETB ist in der Regel plasmidär kodiert, das Gen etb liegt auf einem 37 kb großen Plasmid (pRW001) [Rogolsky et al., 1974; Warren et al., 1974]. ETA hingegen wurde ursprünglich als chromosomal kodiert beschrieben [Lee et al., 1987]. Yamaguchi et al. [2000] zeigten allerdings, dass es als Teil des Genoms eines integrierten temperenten Phagen vorliegt und legten Nahe, dass dieser oder ähnliche Phagen bei S. aureus verantwortlich sein könnten für den Erhalt des eta-Genes. 1.9.4 Panton-Valentine Leukozidin - PVL Panton-Valentine Leukozidin (lukPVL) gehört zu der Gruppe der zweikomponentigen Toxine [Prevost, 1995]. S. aureus mit PVL sind meist verantwortlich für Infektionen der Haut und des Weichgewebes, können aber auch zu ernsten Infektionen wie z.B. nekrotisierenden Lungenentzündungen führen. Typisch für Infektionen in Form von Abszessen und Furunkeln ist hierbei, dass diese ohne sichtbare Eintrittspforte und immer wiederkehrend auftreten [Diep, 2004]. Die toxische Wirkung beruht darauf, dass PV-Leukozidin mit hoher Affinität an Makrophagen und Granulozyten bindet und durch eine Porenbildung zur Ausschüttung des Zellinhaltes und somit zum Zelltod führt [Linde u. Nehn, 2005]. Bei etwa 2-6 % der S. aureus aus klinischem Probenmaterial lässt sich PVL nachweisen [Prevost, 1995]. Von Bedeutung ist hierbei auch, dass die genetische Determinate des Toxins durch Phagen übertragen werden kann. EINLEITUNG 35 1.10 Antibiotikaresistenzen bei S. aureus und MRSA Grundsätzlich gibt es vier verschiedene Resistenzmechanismen, die auch bei S. aureus gegen verschiedenste Antibiotika vorzufinden sind. Bei der Blockierung der Aufnahme wird entweder durch eine Permeabilitätsänderung die Penetration des Antibiotikums ins Zellinnere verhindert oder dieser wird entgegengewirkt, indem das Antibiotikum durch aktiven Transport wieder aus der Zelle heraus gepumpt wird. Die Resistenzmechanismen der Zielortmodifikation und der Substitution chemotherapeutisch empfindlicher Enzyme (bypass) verändern den Angriffs- bzw. Wirkort eines Antibiotikums. Die letzte der vier Resistenzmöglichkeiten ist die der Inaktivierung des Antibiotikums selbst. Diese prinzipiellen Resistenzmechanismen existieren in einer Vielzahl von Varianten und sind durch eine große Zahl von Resistenzdeterminanten kodiert, welche im Genom von S. aureus auf dem Chromosom, Plasmiden, Phagen oder Transposons lokalisiert sein können [Lyon u. Skurray, 1987]. Auf einige Antibtiotika und Resistenzen gegen diese bei S. aureus und MRSA, wird im Folgenden näher eingegangen. 1.10.1 β-Laktame – Penicillin Eine der immer noch am häufigsten genutzten Antibiotika-Gruppen ist die der β- Laktam-Antibiotika. β-Laktam-Antibiotika wirken auf die Penicillin-bindenden-Proteine (PBPs), welche als Transpeptidasen an der Zellwandsynthese beteiligt sind. Penicillin, genauer genommen Benzylpenicillin, war eines der ersten Antibiotika überhaupt und wurde 1941 in den klinischen Gebrauch eingeführt [Chain et al., 1940]. 1942 wurden erste Infektionen durch Penicillin-resistente Staphylokokken beobachtet [Rammelkamp u. Maxon, 1942] und 1944 wurde Penicillin-Resistenz bei Stämmen aus Patienten beobachtet, die nie mit Penicillin behandelt wurden [Kirby, 1944]. Die Wirkungsweise dieses Antibiotikums beruht auf der Verhinderung der Quervernetzung der Zellwand durch Inaktivierung der Transpeptidasen (PBPs). Resistenz gegenüber Penicillin erlangen Staphylokken über die Bildung von β- Laktamase, welche den β-Laktamring hydrolysiert. Das für β-Laktamase kodierede Gen blaZ ist ein Teil eines transponierbaren Elementes und plasmidär lokalisisert. Die Regulation der Expression von blaZ erfolgt über den Repressor blaI und den Antirepressor blaR1 [Kernodle, 2000]. EINLEITUNG 36 Das natürlich vorkommende Penicillin wurde weiterentwickelt, so dass eine Vielfalt von semisynthetischen Penicillinen in Gebrauch sind, die eine bessere Wirkung gegenüber Gram-positiven Bakterien haben. Zu den Breitspektrum-β-Laktamen gehören die Cephalosporine der dritten Generation, Cefamycin und Carbapeneme. 1.10.2 Methicillin Methicillin ist ein semisynthetisches β-Laktamase-resistentes Penicillin und wurde 1959 in den klinischen Gebrauch eingeführt. In der Anwendung wurde Methicillin später durch besser verträgliche Isoxazolylpenicilline wie Oxacillin ersetzt. Im Sprachgebrauch hat sich jedoch für diese Gruppe Methicillin durchgesetzt. Wie bereits erwähnt, beruht die Methicillin-Resistenz bei Staphylokokken auf dem Vorhandensein des mecA-Gens, welches für das zusätzliche PBP2a kodiert, mit dessen Hilfe die Quervernetzung der Zellwand auch unter β-Laktam-Einfluss aufrechterhalten wird. PBP2a besitzt eine sehr geringe Affinität für alle β-Laktam- Antibiotika und vermittelt somit auch Resistenz gegenüber allen, inkl. der Cephalosporine und Carbapeneme [Chambers, 1997; Hartman u. Tomasz, 1984 b; Utsui u. Yokota, 1985; Song et al., 1987]. Die phänotypische Expression der Methicillin-Resistenz ist variabel und jeder MRSA- Stamm zeigt ein bestimmtes Profil des Anteils von Zellen, die bei einer bestimmten Methicillin-Konzentration wachsen [Tomasz et al., 1991]. In einigen MRSA-Stämmen unterliegt die Expression des mecA-Genes mecI-mecR1. Dieses Regulationssystem ist homolg zum blaI-blaR1-System, welches die Resistenz gegenüber β-Laktam- Antibiotika mittels β-Laktamasen reguliert. Stämme in denen mecA zwar vorhanden ist, aber seine Transkription durch mecI und mecR1 reprimiert ist, werden pre-MRSA genannt [Katayama et al., 2001]. MecR1, das mecR1 Produkt, nimmt über seine extrazelluläre Penicillin-bindende-Domäne die Gegenwart von β-Laktamen wahr und aktiviert über autokatalytische Spaltung seine cytoplasmatische Domäne mit Protease-Funktion. Darüber führt es zu einer Spaltung des an die operator-Region von mecA gebundenen MecI-Repressor-Proteins. Die Repression der mecA- Transkription ist dann aufgehoben [Sharma et al., 1998; Zhang et al., 2001]. Weiteren Einfluss auf die Expression der Methicillin-Resistenz haben die fem-Gene (factor essential for resistance to methicillin), welche eine Rolle spielen bei der Quervernetzung des Peptidoglycans [Berger-Bächi, 1994]. Einige MRSA-Stämme zeigen außerdem einen heterogenen Phänotyp der Resistenz. Dies bedeutet, dass nur einige Zellen der Population (ca. 1 %) zu Wachstum bei EINLEITUNG 37 hohen Methicillin-Konzentrationen fähig sind, während der Rest der Population empfindliches Verhalten zeigt [Hartman u. Tomasz, 1984]. Es gibt neben der mecA-vermittelten weitere Möglichkeiten der Methicillin-Resistenz, die gegenüber der mecA-Resistenz aber von untergeordneter Bedeutung sind und auch nur gegen geringere Antibiotika-Konzentrationen als diese wirken. Diese weiteren Möglichkeiten der Methicillin-Resistenz können eine Überexpression von β- Laktamase, eine Überproduktion von PBP4, welches eine geringere Affinität zu β- Laktamen besitzt als die anderen normalen PBPs, oder Mutationen des normalen PBP2 sein [Tomasz et al., 1989; Henze u. Berger-Bächi, 1996]. 1.10.3 Aminoglykoside Aminoglykoside wie z.B. Gentamicin, Kanamycin und Amikazin wurden in den 40er Jahren entdeckt und werden, teilweise semisynthetisch, aus Streptomyces- (Namensendung auf …mycin) oder Micromonospora- (Namensendung auf …micin) Arten hergestellt. Sie weisen ein breites Wirtsspektrum und einen bakteriziden Effekt auf. Die Wirkungsweise beruht dabei auf einer Hemmung der Proteinbiosynthese durch Bindung an die 16S-rRNA der kleinen ribosomalen Untereinheit, wobei eine Störung der Elongation verbunden mit der Einfügung von Lesefehlern erfolgt. Ferner bewirkt der Antibiotikaeinfluss auf die Proteinsynthese durch veränderte Proteine eine Permeabilitätsänderung der Zelle. Diese hat auch Einfluss auf den Transport von Aminoglykosiden ins Zellinnere [Busse et al., 1992]. Die verschiedenen Aminoglykoside unterscheiden sich im Wirkmechanismus u.a. dadurch, dass sie zur rRNA komplementäre Bereiche besitzen, die an unterschiedlichen Stellen der rRNA binden. Eine Resistenz gegenüber Aminoglykosiden beruht im klinischen Bereich überwiegend auf einer enzymatischen Modifikation von Amino- oder Hydroxylgruppen des Aminoglykosid-Moleküls. Diese enzymatische Inaktivierung erfolgt über spezifische N-Acetyltransferasen (AAC), O-Nukleotidtransferasen (APH) oder O-Phosphotransferasen, die jeweils funktionelle Gruppen an bestimmten Positionen im Aminoglykosid-Molekül verändern und nach deren jeweiliger Position benannt werden. Die Einwirkung solcher Aminoglykosid-modifizierender Enzyme erzeugt eine strukturelle Änderung des Antibiotikums, was eine verminderte Fähigkeit zur Anbindung an die RNA-Zielstelle bedingt [Kotra et al., 2000]. Das am häufigsten bei Staphylokokken vorkommende Aminoglykosid-modifizierende Enzym ist das bifunktionale Enzym AAC(6’)-APH(2’’), welches Resistenz gegen Gentamicin, EINLEITUNG 38 Kanamycin und Tobramycin vermittelt und dessen zugehöriges Gen zumeist auf dem Transposon Tn4001 liegt. Dieses Transposon ist weit verbreitet bei Staphylokokken und kann sowohl chromosomal als auch plasmidär lokalisiert sein [Ubukata et al., 1989]. Des Weiteren sind bei Staphylokokken noch das vorwiegend auf Plasmiden liegende ant(4’)-I und das meist mit Tn5405 assozierte aph(3’)-IIIa-Gen von Bedeutung [Stewart et al., 1994; Derbise et al., 1996]. Es gibt eine Korrelation zwischen dem Auftreten von MRSA und einer Aminoglykosid-Resistenz, diese ist aber nicht in allen Ländern/Regionen zu beobachten [Geisel u. Schmitz, 2003]. 1.10.4 Chinolone Mit Nalidixinsäure wurde 1960 das erste Chinolon in den klinischen Gebrauch eingeführt. In den folgenden Jahren erfolgte die Weiterentwicklung dieser rein synthetischen Chemotherapeutika. So entstanden die Fluorochinolone (z.B. Ciprofloxacin), die in den 80er Jahren auf den Markt kamen und ein weitaus größeres Wirkungsspektrum besaßen. Dies machte sie auch wirksamer gegen Gram-positive Bakterien und somit MRSA. Chinolone werden auch als Gyrasehemmer bezeichnet, da ihre Wirkungsweise auf der Hemmung der DNA-Gyrase und der Topoisomerase IV beruht. Unter Einfluss von Chinolonen wird in der Bakterienzelle die DNA somit nicht korrekt prozessiert, es entstehen u.a. Doppelstrangbrüche. Die bakterizide Wirkung aufgrund der Interaktion von Antibiotika und zelleigenen Enzymen ist jedoch noch nicht vollständig geklärt [Drlica u. Zhao, 1997]. Resistenz kann bei Staphylokokken durch Mutationen der Gyrase-Gene (gyrA, gyrB) oder der Topoisomerase IV-Gene (grlA und grlB) bedingt sein oder durch die Wirkung der chromosomal kodierten Effluxpumpe NorA. Die Resistenzentwicklung von MRSA gegenüber dieser Gruppe von Antibiotika erfolgte sehr rasch. So waren wenige Jahre nach Einführung von gegen Staphylokokken wirksamen Chinolonen nahezu alle MRSA resistent gegen diese [Acar u. Goldstein, 1997]. Eine Studie aus Hongkong zeigte, dass die Resistenz von MRSA gegenüber Ciprofloxacin von 9 % in 1988 auf 82 % in 1993 anstieg [Scheel et al., 1996]. Ursache einer solchen Resistenzentwicklung ist häufig eine klonale Verbreitung von MRSA mit der entsprechenden Resistenz [Johnson et al., 2001; De Sousa et al., 2001]. Es scheint jedoch eine Kopplung von Chinolon- und Methicillin- Resistenz zu geben, da diese beiden Resistenzen sehr häufig gemeinsam auftreten. EINLEITUNG 39 Eine erhöhte Mutationsrate kann nicht der Grund sein, die Mutationsrate für Ciprofloxacinresistenz von MRSA gleicht der von MSSA [Schmitz et al., 2000 a]. Grund könnte der erhöhte Selektionsdruck sein, dem die MRSA im klinischen Bereich unterliegen [Lowy, 2003]. 1.10.5 Makrolide Lincosamide Streptogramine In dieser Gruppe werden verschiedene strukturell ähnliche Antibiotika zusammengefasst, deren Angriffsorte im ribosomalen Bereich sich überschneiden. Erythromycin, die Leitsubstanz dieser Gruppe, wird von Streptomyces erythreus gebildet und besteht aus einem 14-gliedrigen Lactonring mit zwei Zuckern. Semisynthetische Derivate des Erythromycins entstehen durch Substitutionen des Moleküls oder Änderung der Größe des Lactonrings. Lincosamide bestehen aus einer an einen Aminzucker gebundenen Aminosäure. Lincomycin wird aus Streptomyces lincolnensis gewonnen, Clindamycin weist chemische Modifikationen auf. Streptogramine stammen von verschiedenen Streptomyces-Arten und werden aufgrund ihrer chemischen Struktur in zwei Gruppen unterteilt. Streptogramine der Gruppe A sind mehrfach ungesättigte Makrolactone, die der Gruppe B zyklische Hexadepsipeptide [Yao et al., 1999]. Erythromycin war das erste Antibiotikum dieser Gruppe das auf den Markt eingeführt wurde [McGuire et al., 1952]. Wie in so vielen Fällen entstanden auch hier bereits kurz nach der Einführung 1952 erste resistente S. aureus-Stämme [Garrod, 1957; Jones et al., 1956], welche sich im Weiteren auch noch als resistent gegenüber anderen Antibiotika der MLS-Gruppe erwiesen. Die Ursache hierfür ist darin zu sehen, dass sich die Zielregionen der MLS-Antibiotika überschneiden. Alle Antibiotika dieser Gruppe greifen im Bereich der 50 S-Untereinheit an, binden reversibel an das Zentrum der Peptidyltransferase und hemmen somit die Proteinbiosynthese. Erythromycin A wirkt auf die frühe Phase der Proteinbiosynthese durch Blockierung des Transports der entstehenden Peptidkette [Andersson u. Kurland, 1987]. Resistenzen gegenüber MLS-Antibiotika können bei Staphylokokken auf drei Weisen entstehen: Inaktivierung des Antibiotikums, aktiver Efflux oder eine Modifikation des Zielortes. Letzteres wird erreicht durch eine Methylierung im Zentrum der Peptidyltransferase [Barta et al., 1994; Skinner et al., 1983]. Verantwortlich dafür ist die erythromycin resistance methylase (Erm), für die bisher bei S. aureus fünf EINLEITUNG 40 verschiedene Gene beschrieben wurden; bei klinischen Isolaten sind ermA und ermC die am häufigsten anzutreffenden [Lina et al., 1999; Westh et al., 1995]. ErmC liegt zumeist plasmidär kodiert vor [Thakker-Varia et al., 1987], ermA wird von Tn554 kodiert, welches in der mec-Region zu finden ist [Dubin et al., 1991]. Dass die Lokalisation des Resistenzgenes einen Einfluss auf die Häufigkeit von MLS- Resistenz bei MRSA hat, zeigt u.a. eine französische Studie die für MRSA eine Häufigkeit des ermA-Genes von 57,6 % und für ermC von 4,9 % zeigte, während die für MSSA bei 5,6% für ermA und 20,1 % für ermC lagen. Der vom msrA-Gen kodierte Mechanismus des aktiven Efflux ist bei S. aureus selten anzutreffen, häufiger hingegen bei KNS [Eady et al., 1993]. Von untergeordneter Bedeutung bei klinischen S. aureus ist der Mechanismus der enzymatischen Inaktivierung. 1.10.6 Quinupristin-Dalfopristin Hierbei handelt es sich um eine Streptogramin A und B-Kombination mit besonderem Stellenwert in der klinischen Anwendung. Bei beiden Einzelsubstanzen handelt es sich um Derivate des natürlich vorkommenden Pristinamycins, welches zwar gute Wirksamkeit aufweist aber bedingt durch seine Wasserunlöslichkeit auch eine schlechte Handhabung im Klinikalltag [Pechère, 1996]. Quinupristin ensteht durch Modifikation von Pristinamycin IA, Dalfopristin durch Veränderung von Pristinamycin IIB. In der Praxis wird eine Mischung im Verhältnis 30:70 (Quinopristin zu Dalfopristin) eingesetzt, die wasserlöslich ist und unter dem Handelsnamen Synercid bekannt wurde. Während die Einzelsubstanzen bakteriostatisch sind, ist die Kombination bakterizid was durch die permanente Hemmung der Proteinbiosynthese verursacht wird [Cocito, 1997]. Die Streptogramin A-Komponente hemmt die Bindung der Aminacyl-tRNA an die Donor- und Akzeptorseite des Peptidyltransferasezentrums. Die Streptogramin B- Komponente bindet an die Peptidyltransferase und unterbindet so die Verlängerung der Polypeptidkette. Somit besitzen die beiden Komponenten unterschiedliche Bindungsstellen innerhalb des Peptidyltransferasezentrums und greifen in verschiedenen Stadien der Bildung der Polypeptidkette ein, was zu der synergistischen Wirkung führt [Chinali et al., 1988]. Resistenz bei Staphylokokken gegenüber der Kombination ergibt sich hauptsächlich durch Resistenz gegenüber Streptogramin A, eine Resistenz gegen Streptogramin B kommt alleine nicht vor [Haroche et al., 2000]. Der Resistenzmechanismus EINLEITUNG 41 gegenüber Streptogramin A beruht bei S. aureus entweder auf Inaktivierung oder auf Efflux. Dabei kodieren vatA, vatB und vatC für Acetyltransferasen die Streptogramin inaktivieren können [Allignet u. ElSolh, 1995]. Am Efflux beteiligt sind Proteine die von vgaA und vgaB kodiert werden [Allignet u. ElSolh, 1997]. Im klinischen Bereich gibt es Stämme mit einer Variation von vgaA, welche auf dem Transposon Tn5406 liegt, das wiederum zusätzlich auch vatB und vgaB trägt [Haroche et al., 2002]. Folgende Antibtiotika sind eher als Reserve Antibiotika anzusehen. 1.10.7 Oxazolidinone Oxazolidinone sind eine in den 70er Jahren entwickelte Klasse synthetischer Antibiotika, die die Proteinbiosynthese hemmen. Sie binden bevorzugt an die 50 S- Untereinheit und inhibieren dabei die Entstehung des N-Formyl-Methionyl-tRNA- Ribosom-mRNA-Komplexes [Shinabarger et al., 1997]. Eine Resistenz gegenüber Linezolid konnte bisher nur in sehr seltenen Einzelfällen nachgewiesen werden [Tsiodras et al., 2001; Picazo et al., 2006]. Somit ist es ein wirksames Antibiotikum gegen MRSA und andere Gram-positive Bakterien dessen Verwendung und die Resistenzentwicklung aber gut beobachtet werden muss [Ross et al., 2007]. 1.10.8 Mupirocin Mupirocin wird durch Fermentation von Pseudomonas fluorescens hergestellt [Fuller et al., 1971]. Es handelt sich bei diesem Antibiotikum um ein Analogon der Aminosäure Isoleucin, welches die Proteinbiosynthese hemmt indem es irreversibel an die Isoleucyl-tRNA-Synthetase bindet [Hughes, 1978]. Eingesetzt wird Mupirocin zumeist in Salbenform, d.h. in lokaler Anwendung. Ziel ist überwiegend die Beseitigung einer Besiedlung des vorderen Nasenraums durch MRSA. Dies wird vor allem bei Krankenhaus- und Pflegepersonal durchgeführt, um eine Verbreitung von MRSA durch sie zu verhindern [Harbath et al., 1999; Hill et al., 1988]. Eine prophylaktische Anwendung von Mupirocinsalbe in diesem Zusammenhang wurde kontrovers diskutiert [Harabth et al., 1999; Kauffman et al., 1993]. Ebenso verhält es sich mit der Beurteilung der Wichtigkeit von Mupirocin-Resistenz bei MRSA. Es gibt hierzu zwar eine Vielzahl von Untersuchungen, besonders im Zusammenhang mit Plasmiden die Mupirocin-Resistenzgen tragen, jedoch noch keine einhellige Meinung zur klinischen Bedeutung der Resistenz [Henkel u. Finley, 1999]. EINLEITUNG 42 1.10.9 Tetracycline Tetracyclin und Oxytetracyclin sind die Tetracycline der ersten Generation und natürlichen Ursprungs. Sie werden von Streptomyces-Arten gebildet und wurden in den 40er Jahren entdeckt. Die zweite Generation umfasst später entwickelte semisynthetische Tetracyclinanaloga, wie z.B. Doxycyclin und Minozyclin [Chopra u. Roberts, 2001]. Tetracycline der dritten Generation werden als Glycylcycline bezeichnet, Tigecyclin ist einer ihrer Vetreter [Testa et al., 1993]. Tetracycline sind Breitbandantibiotika mit bakteriostatischem Effekt. Sie binden reversibel an die 30 S-Untereinheit des Ribosoms [Buck u. Cooperman, 1990] und verhindern dabei die Anlagerung der Aminoacyl-tRNA, was in einer Hemmung der Proteinbiosynthese resultiert [Schnappinger u. Hillen, 1996]. Tetracyclin-Resistenz kann auf verschiedene Weise erlangt werden, was auch durch den unterschiedlichen Aufbau Gram-negativer und -postiver Bakterien und somit dem unterschiedlichen Aufnahmeweg für das Antibiotikum bedingt ist. Bei Staphylokokken sind vier Resistenzgene bekannt, die im Falle von tetK und tetL für den Mechanismus des aktiven Efflux und im Fall von tetM und tetO für den des Schutzes der Ribosomen durch spezielle Proteine kodieren [Chopra u. Roberts, 2001; Levy et al., 1989]. TetK und tetL sind überwiegend auf kleinen Plasmiden wie pT181 lokalisiert, während tetM und tetO auf dem Chromosom liegen oder mit Transposons assoziiert sind [Chopra u. Roberts, 2001]. Der Efflux erfolgt über membrangebundene Proteine, die Protektionsproteine wirken im Cytoplasma. Gemeinsam ist beiden Proteintypen, dass die Expression der sie kodierenden Gene und auch das Resistenzniveau in Gegenwart von Tetracyclinen steigt [Geisel u. Schmitz, 2003 b]. 1.10.10 Rifampicin Bei Rifampicin handelt es sich um einen semisynthetischen Abkömmling des Rifamycin B, einer Antibiotikaklasse die von Amycolatopsis mediterranea gebildet wird [Parenti u. Lancini, 1997]. Es wirkt durch Störung der Transkription, da es an die rpoB kodierte RNA-Polymerase Untereinheit bindet [Aboshkiwa et al., 1995]. Kommt es zu Mutationen im rpo-Gen, kann dies zu Veränderungen der Beta-Untereinheit führen, welche über eine reduzierte Affinität für Rifampicin zu einer Resistenz dagegen führen können [Morrow u. Harmon, 1979]. Diese Resistenzentwicklung EINLEITUNG 43 erfolgt sehr schnell, besonders wenn es in Monotherapie eingesetzt wird. Darum kommt Rifampicin immer nur in Kombination mit anderen Antibiotika zum Einsatz, z.B. auch mit der auf den Elongationsfaktor wirkenden Fusidinsäure, die als Einzelsubstanz ebenfalls schnell zu Resistenzen führt [O’Neill et al., 2001]. Resistenz gegenüber Rifampicin ist bei MRSA meist eher gering ausgeprägt, unterliegt aber regionalen Schwankungen [Geisel u. Schmitz, 2003 b]. 1.10.11 Cotrimoxazol Cotrimoxazol ist ein klassisches Beispiel für die synergistische Wirkung zweier antimikrobieller Substanzen, die sich jedoch nicht uneingeschränkt von der in vitro Situation auf die klinische Anwendung übertragen lässt [Bushby u. Hitchings, 1968]. Cotrimoxazol bezeichnet die kommerziell erhältliche Kombination der beiden die Folsäuresynthese hemmenden Stoffe Sulfamethoxazol und Trimethoptim, welche Breitbandwirkung besitzt. Sulfamethoxazol zählt zu den Sulfonamiden, welche Strukturanaloga der p- Aminobenzoesäure (PABA) sind, die als Substrat der Dihydropteroat-Synthetase (DHPS) am finalen Schritt der Folsäuresynthese beteiligt ist. Trimethoprim ist ebenfalls ein Strukturanalogon und zwar eines der Dihydrofolsäure, aus der von der Dihydrofolat-Reduktase (DHFR) Tetrahydrofolsäure gebildet wird. Resistenz gegenüber Trimethoprim erlangen Staphylokokken vorwiegend durch die Bildung einer alternativen DHFR. Diese wird durch das dfrA-Gen kodiert welches auf Tn4003 liegt. Sulfonamid-Resistenz entsteht durch Mutation des dhps(folP)-Genes. Trimethoprim Resistenz ist bei MRSA verbreiteter als bei MSSA, 16-65,4 % gegenüer 1,2-2,6 % laut SENTRY 1997-1999 [Diekema et al. 2001]. 1.10.12 Glykopeptidantibiotika Vancomycin ist neben Teicoplanin das bekannteste Glykopeptidantibiotikum welches seit 1958 in Gebrauch ist und lange Zeit als Reserveantibiotikum für hochgradig multiresitente S. aureus galt. Es verhindert die Zellwandsynthese durch Komplexierung der D-alanyl-D-alanin- Reste des Phosphodisaccharid-Pentapeptid-Lipid-Komplexes [Arthur et al., 1996]. Der vermehrte Einsatz von Vancomycin gegen MRSA- und auch Enterokokken- Infektionen führte zu einer Resistenzentwicklung dieser Antibiotika bei Staphylokokken. So wurde 1987 ein Vancomycin resistentes klinisches Isolat eines EINLEITUNG 44 KNS [Schwalbe et al., 1987] und zehn Jahre später der erste VISA in Japan [Hiramatsu et al., 1997] beschrieben. In der Folge häuften sich die Berichte über MRSA mit reduzierter Empfindlichkeit gegenüber Vancomycin [CDC, 1997 a, b; Bierbaum et al., 1999]. Erste Beschreibungen von wirklich resistenten Stämmen (VRSA) erfolgten in 2002 in den USA [CDC, 2002]. Zwischen der reduzierten Empfindlichkeit der VISA-Stämme und der Resistenz der VRSA-Stämme bestehen wesentliche Unterschiede im Mechanismus. VISA-Stämme haben MHKs für Vancomycin im Bereich von 8-16 µg/ml und ihre verminderte Empfindlichkeit beruht wahrscheinlich auf einer veränderten Peptidoglykansynthese. VISA-Stämme bilden eine größere Menge Peptidoglykan als normale S. aureus und besitzen unregelmäßig geformte, verdickte Zellwände. Darüber hinaus ist die Quervernetzung des Peptidoglykans durch eine kleinere Menge L-Glutamin vermindert. Dies hat Auswirkung auf die Bildung der Pentapeptidbrücken, wodurch mehr freie D-Ala-D-Ala Reste vorhanden sind [Hanaki et al., 1998 a, b]. An diese vermehrt vorhandenen Reste binden Vancomycin- Moleküle und werden somit zum einen weggefangen und zum anderen hindern sie weitere Antibiotikamoleküle daran ihr Ziel zu erreichen. Die Resistenz der VRSA-Stämme beruht hingegen wahrscheinlich auf einem konjugativen Transfer des vanA-Gens von E. faecalis. VanA liegt auf einem Plasmid, das u.a. auch noch für von S. aureus gebildetes Sex-Pheromon kodiert und eine unterstützende Rolle bei der konjugativen Übertragung des Plasmides spielen könnte [Showsh et al., 2001]. VRSA-Stämme zeigen eine vollständige Resistenz mit MHK für Vancomycin die bei ≥128 µg/ml liegen. Verursacht wird die Resistenz durch den Austausch des endständigen D-Ala-D-Ala zu D-Ala-D-Lac [Gonzales-Zorn u. Courvalin, 2003]. Die Forschung für weitere antibakterielle Stoffe ist heutzutage besonders darauf ausgerichtet ganz neue Angriffsziele innerhalb der Bakterien zu entdecken [Garcia- Lara et al., 2005]. EINLEITUNG 45 1.11 Plasmide Seit ihrer Entdeckung in den frühen 60er Jahren werden Plasmide aus S. aureus in drei Hauptklassen eingeteilt: Klasse 1 umfasst kleine (ca. 2-4 kb) Plasmide die zumeist in höherer Kopienzahl pro Zelle (10-50) vorliegen, wenn überhaupt nur ein Resistenzgen tragen und ansonsten kryptisch sind. Diese Gruppe ist die der zuerst beschrieben Staphylokokkenplasmide [Shalita et al., 1980]. Klasse 2-Plasmide sind um die 30 kb groß, liegen in 4-6 Kopien pro Zelle vor und tragen meist mehrere Resistenzgene, darunter sehr häufig Gene zur β-Laktamase-Produktion. Plasmide der Klasse 3 tragen ebenfalls mehrere Resistenzen, sind jedoch weit über 30 kb groß [Novick, 1989] und häufig konjugativ oder dazu in der Lage nicht konjugative Plasmide zu mobilisieren. Viele der kleinen Plasmide sind vollständig sequenziert und dadurch in verwandtschaftliche Beziehungen gestellt. Auf Basis der Ähnlichkeit der Replikationsregion wird diese Gruppe in vier Untergruppen unterteilt, die durch die Leitplasmide pT181, pC194, pSN2 und pE194 gekennzeichnet sind [Berg et al., 1998]. Diese kleinen Plasmide replizieren zumeist über den rolling circle- Mechanismus. Es wurde mit dem 8 kb großen pSH639 allerdings auch schon ein kleines Plasmid aus Staphylokokken beschrieben, welches anscheinend über einen Iteron-kontrollierten Theta-Modus repliziert [Apisiridej et al., 1997]. Dieses Plasmid besaß ferner IS257-flankierte Bereiche die für Thrimethoprim-Resistenz kodierten und Bereiche die für eine Mobilisierbarkeit des Plasmides verantwortlich waren. Bei den größeren Multiresistenzplasmiden der Klasse 2 erfolgt die Replikation hingegen meistens über den Theta-Modus. Die Resistenzdeterminanten der Multiresistenzplasmide sind häufig mit Transposons oder Insertionselementen assoziiert [Berg, 1998]. 1.11.1 Konjugative Plasmide Die zuerst genauer untersuchten konjugativen Plasmide in S. aureus wurden im Zusammenhang mit der Übertragung von Gentamicin-Resistenz entdeckt [Archer u. Johnston, 1983]. Die bekanntesten und am besten untersuchten konjugativen Plasmide bilden eine Gruppe, deren Leitplasmid pSK41 ist. Sie tragen eine Vielzahl von Resistenzen gegen Antibiotika, Schwermetalle und Desinfektionsmittel und ferner oft Transposons wie Tn4001 [Macrina u. Archer, 1993]. pSK41 wurde vollständig sequenziert [Berg et al., 1998], dabei wurde unter anderem die Rolle von EINLEITUNG 46 IS257 deutlich, welches in sieben Kopien in pSK41 vorkommt und auch bei anderen konjugativen Plasmiden verbreitet ist. Diesem Insertionselement und weiteren wie IS256 wird eine wichtige Rolle bei der Entstehung der Plasmide durch Zusammenfügung verschiedener genetischer Komponenten zugeschrieben [Leelaporn et al., 1996; Firth et al., 1999]. Viele der kleinen RCR Plasmide aus Staphylokokken sind mobilisierbar durch konjugative Plasmide [Novick, 1989] oder aber auch über den Mechanismus der Phagen-vermittelten Konjugation, welche neben Zellkontakt das Vorhandensein eines transduzierende Phagens im Donor erfordert [Lyon u. Skurray, 1987]. Während der Phagen-vermittelte Transfer bevorzugt in Flüssigkeiten stattfindet, kommt auf festen Oberflächen eher Konjugation vor [Townsend et al., 1986]. Bisher wurden 15 Inkompatibilitätsgruppen in S. aureus identifiziert [Iordanescu et al., 1978; Novick ,1976] 1.11.2 Eigenschaften der Multiresistenzplasmide Anhand der Eigenschaften von Plasmiden mit mehreren Resistenzdeterminanten lässt sich Einblick nehmen in die Evolution der Plasmide. Bisher sind drei Gruppen von Multiresistenzplasmiden in Staphylokokken bekannt. Sogenannte β-Laktamase-Schwermetall-Resistenzplasmide wurden bei einer Vielzahl von Staphylokokkenisolaten in den 60er und 70er Jahren nachgewiesen [Shalita et al., 1980]. Typische Vertreter dieser Plasmidgruppe tragen das β- Laktamase-kodierende Transposon Tn552 oder Derivate dessen, sowie Genstrukturen die Resistenz gegen Schwermetalle vermitteln. Einige von ihnen tragen zusätzlich Tn551 das Resistenz gegenüber Typ B-MLS-Antibiotika vermittelt, Tn4001 mit IS256 für Aminoglykosidresistenz und evtl. qacA/ qacB verantwortlich für Resistenz gegen Desinfektionsmittel [Lyon u. Skurray, 1987]. Mitte der 70er Jahre wurden dann erstmalig die konjugativen Multiresistenzplasmide vom Typ pSK41 isoliert, welche sich u.a. durch das Vorhandensein von Tn4001 und von durch IS257 flankierte integrierte kleine Plasmide, wie pUB110, auszeichnen [Berg et al., 1998; Bryne et al., 1990]. S. aureus-Stämme der 80er Jahre aus dem klinischen Bereich besaßen häufig Plasmide vom Typ pSK1 [Lyon et al., 1983; Skurray et al., 1988]. Plasmide vom Typ pSK1 tragen oft qacA, Tn4001 und Tn4003 mit IS257. Firth et al. [2000] untersuchten typische Vertreter dieser Hauptgruppen und stellten dabei fest, dass diese alle ein ähnliches Theta-Mode-Replikationssystem besitzen, obwohl sie bis dahin als unverwandt bezeichnet wurden. EINLEITUNG 47 1.11.3 Plasmide bei MRSA Klinische Isolate von S. aureus enthalten meist ein oder mehrere Plasmide die eine große Vielfalt aufweisen [Skurray u. Firth, 1997], dies gilt sowohl für MRSA als auch für MSSA. Die große Vielfalt der MRSA-Plasmide lässt erkennen, dass die Mechanismen des horizontalen Gentransfers, Transposition und Rekombinations- ereignisse permanent zur Entwicklung neuer Plasmidtypen beitragen [Zuccarelli et al., 1996]. Untersuchungen zum Vorkommen von Plasmiden in einem begrenzten Gebiet wie z.B. einem Krankenhaus zeigten, dass sich dabei nachgewiesene Plasmide häufig ähneln [Coia et al., 1988; Doebbeling et al., 1992; Gaterman, 1987]. Hier lässt sich ein Zusammenhang mit der klonalen Ausbreitung von MRSA und der Verbreitung epidemischer Stämme herstellen. Einfluss auf die genetische Ausstattung von S. aureus haben aber nicht nur Plasmide die vornehmlich bei S. aureus selber vorkommen. Von großer Bedeutung ist z.B. auch ein Plasmidtyp der bei Enterokokken vorkommt, ein auf Pheromone reagierendes konjugatives Plasmid, welches z.B. das vanA-kodierende Transposon Tn1546 trägt [Shwosh et al., 2001]. Alle S. aureus scheiden anscheinend ein Peptid aus, welches den horizontalen Transfer solcher Plasmide von Enterokokken zu Staphylokokken fördert. Gelangen solche Plasmide in S. aureus so können sie sich zwar nicht replizieren, aber sie sind lange genug in der Zelle, damit ein auf ihnen enthaltenes Transposon und damit mit ihm verbundenen Gene in das S. aureus Chromosom oder auf ein anderes Plasmid springen können [Clewell et al., 1985]. Auch dies zeigt welche bedeutende Rolle Plasmide, auch über Gattungsgrenzen hinweg, für den Austauch von genetischem Material spielen können. ZIELE DER ARBEIT 48 2 Ziele der Arbeit Ziel der vorliegenden Arbeit war die Untersuchung der lokalen Epidemiologie von MRSA am Klinikum Kassel und seinem regionalen Umfeld in einem Zeitraum von fünf Jahren mittels molekularbiologischer Methoden. Dazu sollten die SCCmec-Regionen der Isolate mit verschiedenen PCR-basierten Methoden analysiert und typisiert werden, unter Einbezug eines Vergleichs der Methoden. Des Weiteren sollte die Verbreitung von Antibiotikaresistenz- und Toxingenen festgestellt werden. Ein anderer Aspekt der Arbeit war die Ermittlung des Vorkommens von Plasmiden bei MRSA. Die Auswertung aller durchgeführten Untersuchungen sollte zwei Hauptfragestellungen beantworten: 1. Die Entwicklung von MRSA eines Krankenhauses im Laufe der Zeit unter Einbeziehung eines Vergleichs mit dem regionalen Umfeld des Krankenhauses. 2. Der Vergleich der Eigenschaften aller in der Region vorkommenden MRSA- Typen mit besonderem Augenmerk auf die Korrelation von ermittelten SCCmec-Typen und nachgewiesenen Antibiotikaresistenz-, Toxingenen, sowie Plasmiden. MATERIAL & METHODEN 49 3 Material und Methoden 3.1 Geräte und Zubehör Dokumentation Minolta 7000 Minolta, Japan W-Transilluminator Appligene, Frankreich Image Documentation System CS-1 Cybertech, Berlin Elektrophorese-Zubehör Horizontalgel-System Eigenbau der Abt. Mikrobiologie Netzgerät Macrodrive 5 LKB, USA Zentrifugen Kühlzentrifuge Sigma 3k30 Schütt, Göttingen Tischzentrifuge Sigma, Osterorde Laborzentrifuge Hermle, Gosheim Untertischzentrifuge Beckmann Coulter, USA PCR-Stripe Zentrifuge ABImed, Göttingen Autoklaven Laborautoklav HST 4-5-6 Zirbus, Osterode Tisch-Autoklav HST 250 Zirbus, Osterode Inkubation Brutschrank Modell 500 Memmert, Schwabach Roller-Inkubator Schütt, Göttingen Schüttelwasserbad Julabo, Seelbad Tisch-Rundschüttler Infors, Schweiz Wasserbad W19 Haake, Karlsruhe Wasserbad 5P Haake, Karlsruhe Analysenwaage BA 110 S Sartorius, Göttingen Präzisionswaage BA 610 Sartorius, Göttingen Mikroprozessor pH-Meter 537 WTW, Weilheim MATERIAL & METHODEN 50 Spektralphotometer Uvikon 930 Kontron Instruments, Eching Mikroskop BH 2 Olympus, Hamburg Sicherheitswerkbank Bleymehl, Inden Eis-Maschine Ziegra, Isernhagen Magnetrührer IkaMag RET IKA Labortechnik, Staufen Elektroporationsgerät BioRad, München Gene-Pulser mit Pulse-Controller BioRad, München Fast Prep FP120 BIO101 Speed-Vac UniVapo 100H Uni Equip, Martinsried Thermocycler Primus MWG-Biotech, Ebersberg Primus 96 plus MWG-Biotech, Ebersberg PTC 200 Gradientencycler MJ Research Gilson-Pipetman Abimed, Langenfeld Dosierpipette Gilson Distriman Abimed, Langenfeld Sonstiges Mikrotiterplatten Sarstedt, Nümbrecht Reaktionsgefäße Sarstedt, Nümbrecht PCR-Gefäße 200 µl Sarstedt, Nümbrecht PCR-Stripes Sarstedt, Nümbrecht PCR-Stripes Biozym Petrischalen Sarstedt, Nümbrecht 3MM Filterpapier Whatman, England Quickseal-Zentrifugenröhrchen Beckmann, USA Schraubdeckelgläschen Wheaton, USA MATERIAL & METHODEN 51 3.2 Chemikalien Agarose NEEO Ultra Qualität Roth, Karlsruhe Bromphenolblau Sigma, Deisenhofen Ethidiumbromid Sigma, Deisenhofen EDTA Dinatrium Dihydrat AppliChem, Darmstadt Ficoll 400 Sigma, Deisenhofen Lambda-DNA Boehringer, Mannheim Lithiumchlorid Sigma, Deisenhofen N-Lauroylsarcosin Sigma, Deisenhofen Natriumdodecylsulfat (SDS) Sigma, Deisenhofen Triton X-100 Sigma, Deisenhofen Xylencyanol Sigma, Deisenhofen Alle übrigen Chemikalien waren in p. a. Qualität von Merck, Darmstadt. MATERIAL & METHODEN 52 3.3 Antibiotika Tab. 1 Verwendete Antibiotika Angegeben ist die Standardkonzentration im Medium Name Abkürzung Konzentration µg/ml Hersteller Amikazin Ak 10 Boehringer, Mannheim Ampicillin Ap 100 Boehringer, Mannheim Chloramphenicol C 30 Sigma, Deisenhofen Gentamicin Gm 50 Sigma, Deisenhofen Kanamycin Km 50 Sigma, Deisenhofen Oxacillin Ox 6 Sigma, Deisenhofen Rifampicin Rif 50, 100 Sigma, Deisenhofen Streptomycin Sm 30 Sigma, Deisenhofen Sulfonamid Su 500 Sigma, Deisenhofen Tetracyclin Tet 15 Sigma, Deisenhofen Tobramicin Tb 10 Sigma, Deisenhofen Trimethoprim Tr 100 Sigma, Deisenhofen Tab. 2 Verwendete Antibiotikatestblättchen Name Abkürzung Konzentration µg Hersteller Bactrim Sulfamethoxazol Trimethoprim SXT 23,75 1,25 Becton Dickinson Cefazolin CZ 30 Becton Dickinson Chloramphenicol C 30 Becton Dickinson Ciprofloxacin CIP 5 Becton Dickinson Clindamycin CC 10 Becton Dickinson Doxycyclin D 30 Becton Dickinson Gentamicin GM 10 Becton Dockinson Netilmicin NET 30 Becton Dickinson Oxacillin OX 5 Becton Dickinson Penicillin G P 10 IE Becton Dickinson Rifampicin RD 2 Oxoid Vancomycin VA 30 Becton Dickinson MATERIAL & METHODEN 53 3.4 Nährmedien Die nachfolgenden Medien wurden nach Herstellerangaben zubereitet: Standard-I-Nähragar /-bouillon (N-I-Agar /-bouillon, Merck) Dieses Medium wurde als Standardmedium zur Zellanzucht von Mikroorganismen verwendet. Zusammensetzung 1 l Pepton 15 g Hefeextrakt 3 g NaCl 6 g D(+)-Glukose 1 g Agar-Agar (fehlt in Bouillon) 12 g pH 7,5 Müller-Hinton-Bouillon oder –Agar (Merck) Dieses Medium ist Standardmedium für Antbiotikaresistenzbestimmungen. Für bestimmte Methoden wurde es mit 2-4 % NaCl versetzt. Zusammensetzung 1 l Rindfleischinfusion 2 g Caseinhydrolysat 17,5 g Stärke 1,5 g Agar-Agar (fehlt in Bouillon) 17 g pH 7,3 Blutagar – Columbia Agar Basis (Merck) Zusammensetzung 1 l Spezialpepton 23 g Stärke 1 g NaCl 5 g Agar-Agar 10 g Schafblut defibriniert 5 % pH 7,3 MATERIAL & METHODEN 54 Des Weiteren wurden folgende Nährmedien hergestellt LB-Boullion Zur Zellanzucht vor Plasmidpräparation Trypton 10 g Hefeextrakt 5 g NaCl 1 g A. bidest ad. 1000 ml pH 7,0 B2-Bouillon Zur Anzucht von S. aureus Zellen zur Präparation kompetenter Zellen für Elektroporation. Caseinhydrolysat 10 g Hefeextrakt 25 g K2HPO4 1 g Glucose 5 g NaCl 2,5 g A. bidest ad. 1000 ml pH 7,5 NYE-Agar Medium zur Anzucht von S. aureus-Transformanden nach Elektroporation. Caseinhydrolysat 10 g Hefeextrakt 5 g NaCl 5 g Agar-Agar 12 g A. bidest ad. 1000 ml pH 7,5 Zur Selektion wird das Medium mit entsprechenden Antibiotika versetzt. MATERIAL & METHODEN 55 3.5 Enzyme Restriktionsendonukleasen MBI Fermentas, New England Biolabs RNAse A Boehringer, Mannheim Lysozym Sigma, Deisenhofen Lysostaphin Sigma, Deisenhofen Proteinase K Boehringer, Mannheim Taq Polymerase Fermentas, New England Biolabs, BioLine und aus eigener Herstellung Tab. 3 Verwendete Restriktionsendonukleasen Enzym Erkennungssequenz Schnittstelle Ende BglI GCCNNNNNGGC G C C N N N N / N G G C C G G N / N N N N C C G NNN - 3´ DdeI CTNAG C / T N A G G A N T / C 5´ - TNA DraI TTTAAA T T T / A A A A A A / T T T blunt EcoRI GAATTC G / A A T T C C T T A A / G 5´ - AATT HincII GTYRAC G T Y / R A C C A R / Y T G blunt HindIII AAGCTT A / A G C T T T T C G A / A 5´ - AGCT HinfI GANTC G / A N T C C T N A / G 5´ - ANT PstI CTGCAG C T G C A / G G / A C G T C TGCA - 3´ MATERIAL & METHODEN 56 3.6 Bakterienstämme Tab. 4 Verwendete Bakterienstämme Weitere Eigenschaften sind dem Ergebnisteil bzw. dem Anhang zu entnehmen. Bakterienstamm Eigenschaft - Verwendungszweck S. aureus 134/93 a MRSA – norddeutscher Epidemiestamm S. aureus 2511/02 a MRSA – süddeutscher Epidemiestamm S. aureus 1000/93 a MRSA – Hannoverscher Epidemiestamm S. aureus 994/93 a MRSA – Südostdeutsch-westösterreichischer Epidemiestamm S. aureus 1678/96 a MRSA – Barnim-Epidemiestamm S. aureus 3391/02 a MRSA – Rhein-Hessen-Epidemiestamm S. aureus 3925/02 a MRSA – in Mitteleuropa weit verbreiteter Community Aquired MRSA S. aureus 694/01 a MRSA - Positivkontrolle Antibiotikaresistenzgen-PCR S. aureus ES 1767 a MSSA - Positivkontrolle Antibiotikaresistenzgen-PCR S. aureus ES 1768 a MSSA - Positivkontrolle Antibiotikaresistenzgen-PCR S. aureus 408/98 a MRSA S. aureus 1155/08-2 a MRSA S. aureus 1442/98 a MRSA S. aureus 359/98 a MRSA S. aureus 8325-4 a MSSA Plasmid- und Prophagen-freier Stamm für Transformations- und Konjugationsexperimente S. aureus 8325-4 Rifr c Rifampicin-resistente Mutante von S. aureus 8325-4 S. aureus ATCC 29213 b MSSA - Kontrollstamm für Antiobiotikaresistenztests S. aureus ATCC 25923 b MSSA - Kontrollstamm für Antiobiotikaresistenztests S. aureus 249 d MSSA – Positivkontrolle Toxingen-PCR S. aureus 239 d MRSA – Positivkontrolle Toxingen-PCR S. aureus 3811 d MSSA – Positivkontrolle Toxingen-PCR S. aureus 332 d MSSA – Positivkontrolle Toxingen-PCR S. aureus 176 d MSSA – Positivkontrolle Toxingen-PCR Staphylococcus spec. 349 d Positivkontrolle Toxingen-PCR Staphylococcus spec. 15664 d Positivkontrolle Toxingen-PCR S. saprophyticus b Koagulase negativer Staphylococcus E. coli V517 b 8 Plasmide als Größenmarker (pVA517A-H) Herkunft: a: RKI, Wernigerode; b: Stammsammlung AG Mikrobiologie Universität Kassel, c: Janusch 2000; d: Universitätsklinikum Münster Die Eigenschaften der in der vorliegenden Arbeit untersuchten MRSA-Isolate sind dem Ergebnisteil (4.1, Tab. 6, Tab. 7) und dem Anhang (Tab. 21) zu entnehmen. MATERIAL & METHODEN 57 3.7 Anzucht und Kultivierung der MRSA-Stämme Die MRSA-Stämme lagen in Form von Stichkulturen in CASO- oder in BHI-Agar vor und wurden zur ersten Anzucht auf Blut- bzw NI-Agar bei 37 °C kultiviert und auf Reinheit überprüft. Weitere Kultivierungen der Reinkulturen erfolgten zumeist auf NI- Agar bei 37 °C i.d.R. über Nacht. Dem Nährmedium wurde bei Bedarf und nach Möglichkeit Antibiotika zur Ausübung eines Selektionsdruckes zum Erhalt von Plasmiden zugefügt. Flüssigkultivierungen erfolgten in NI-Bouillon bzw. zur Zellanzucht vor Plasmidpräparationen in LB-Bouillon, ebenfalls u.U. unter Antibiotika- Zugabe bei 37 °C i.d.R. über Nacht. Dauerkulturen wurden angelegt, indem 1 ml einer Flüssigkultur mit 1 ml einer Glycerinlösung (65 % Glycerin / 0,1 M MgSO4 / 25 mM TrisHCl) versetzt, gut vermischt und sofort bei -70 °C bzw. -21 °C eingefroren wurde. 3.8 Resistenzbestimmungen 3.8.1 Nachweis der Methicillin-Resistenz mittels Agar-Screen-Test Der phänotypische Nachweis der Methicillin-Resistenz erfolgte auf MHA, der mit 4 % NaCl angereichert wurde und 6 mg/l Oxacillin enthielt. Kolonien einer 24 h Kultur wurden in physiologischer NaCl-Lösung suspendiert und auf den McFarland Standard 0,5 (ca. 1,5 x 108 CFU/ml) eingestellt. Diese Suspensionen wurden in eine Mikrotiterplatte pipettiert. Mit Hilfe eines Stahlstempels wurden Tropfen dieser Suspensionen auf die Oxacillin-Agarplatte übertragen. Dieses Verfahren ermöglicht es, 48 Stämme auf einer Platte gleichzeitig zu testen. Die Platten wurden dann für 24 h bei 35 °C bebrütet. Erfolgt unter diesen Bedingungen Wachstum, so ist ein S. aureus Stamm als resistent gegenüber Oxacillin einzustufen [Rice u. Bonomo, 1996]. 3.8.2 Antibiotikaresistenzbestimmung mittels Agardiffusionstest Als Nährmedium dienten MHA-Platten, deren Schichtdicke ca. 3,5 mm betrug. Zur Herstellung des Inokulums wurden 4 bis 5 morphologisch gleichartige Kolonien von einer Agarplatte des zu testenden Stamms entnommen. Diese wurden in Nährbouillon überimpft und 4 h bei 37 °C bebrütet. Von dieser Kultur wurde eine 1/100 Verdünnung mit 0,9 %iger NaCl-Lösung hergestellt. Zur Beimpfung der Testplatten wurden 100 µl dieser Keimsuspension mit einem Drigalskispatel MATERIAL & METHODEN 58 ausplattiert. Nach der Bebrütung sollte es zu dichtstehenden aber nicht konfluierenden Kolonien kommen. Auf die beimpften Testplatten wurden mit Hilfe eines Dispensers die Antibiotikatestblättchen aufgebracht. Nach einer Vordiffusionszeit von 30 min erfolgte die Inkubation der Platten dann für 20 h bei 37 °C bzw. 30 °C bei Oxacillin-Testblättchen bebrütet. Die Einteilung der Stämme in sensitiv, intermediär und resistent gegenüber dem jeweiligen Antibiotikum erfolgte anhand der sich ergebenden Hemmhofdurchmesser und Grenzwertangaben für diese nach DIN 58940. Als Hemmhof wurde dabei die Zone bewertet, in der mit bloßem Auge kein Wachstum feststellbar war. Zur Überprüfung der Methode wurden die Agardiffusionstests auch mit dem Kontrollstamm S. aureus ATCC 25923 durchgeführt. Anhand der sich hierbei ergebenden Hemmhöfe und der nach DIN 58940 festgelegten Kontrollwerte konnte beurteilt werden, ob die gewählten Bedingungen der Norm gerecht wurden. 3.8.3 Resistenzbestimmungen durch Überimpfung auf Selektivmedien Zur Feststellung weiterer Resistenzen und zur einfachen Überprüfung bekannter Resistenzen wurden Kolonien eines Stammes im Dreistrich-Verfahren auf antibiotikahaltige Agarplatten (Ab-Konzentrationen s. Tab. 1 ) überimpft. Zeigte sich deutliches und typisches Wachstum, so wurde der Stamm als resistent eingestuft. 3.9 Nachweis und Charakterisierung von DNA 3.9.1 Plasmidpräparation mit Qiagen-Anionenaustauschersäulen Die Aufreinigung der DNA erfolgt bei dieser Methode nach dem Prinzip der Anionenaustauscherchromatographie, somit kann auch der Einsatz von Phenol zur Abtrennung von Proteinen umgangen werden. Nach der Bindung der DNA an das Säulenmaterial werden zunächst bei geringeren NaCl-Konzentrationen Proteine und unerwünschte Nukleinsäuren abgewaschen und anschließend die doppelsträngige Plasmid-DNA mit 1,25 M NaCl eluiert (pH 8,2). Die Qiagen-Säulen sind in verschiedenen Größen, d.h. mit unterschiedlichen Bindungskapazitäten für Plasmid-DNA bei gleicher Säulenmatrix, kommerziell erhältlich. Mini-Säulen (Qiagen-tip 20) haben eine Kapazität, die auf 20 µg Plasmid- DNA begrenzt ist. Für Präparationen in größerem Maßstab stehen Midi- (Qiagen-tip 100, bis 100 µg) und Maxi-Säulen (Qiagen-tip 500, bis 500 µg) zur Verfügung. MATERIAL & METHODEN 59 Bei dem Qiagen-System zur Plasmidpräparation erfolgt der Aufschluss der Bakterien mittels alkalischer SDS-Lyse. Anschließend findet an der Säulenmatrix die selektive Bindung der Plasmid-DNA statt. Mitgeschleppte Proteine und andere Kontaminanten werden, während die Plasmid-DNA an der Säulenmatrix gebunden ist, durch Spülen der Säule entfernt. Die Ablösung der gebundenen DNA erfolgt durch die Wahl geeigneter pH-Werte und der Salzkonzentration. Um diese Methode zur Präparation von Plasmiden aus Staphylokokken anwenden zu können, muss das Originalprotokoll bezüglich des Lyseschrittes abgewandelt werden. Der standardmäßigen SDS-Lyse wird eine enzymatische Lyse mit Lysostaphin vorgeschaltet. Lösungen: 1. Puffer P1: (Resuspensionspuffer), pH 8,0, +4 °C Tris/HCl 50 mM EDTA 10 mM RNAse A 100 µg/ml Lysostaphinlösung 1 mg/ml (Lysozymlösung 1 mg/ml) 2. Puffer P2: (Lysepuffer), RT NaOH 200 mM SDS 1 % (w/v) 3. Puffer P3: (Neutralisationspuffer), pH 5,5, +4 °C Kaliumacetat 3 M 4. Puffer QBT: (Equilibrierungspuffer), pH 7,0 NaCl 750 mM MOPS 50 mM Ethanol 15 % (v/v) Triton X-100 0,15 % (v/v) MATERIAL & METHODEN 60 5. Puffer QC: (Waschpuffer), pH 7,0 NaCl 1M MOPS 50 mM Ethanol 15 % (v/v) 6. Puffer QF: (Elutionspuffer), pH 8,5 NaOH 1,25 M Tris/HCl 50 mM Ethanol 15 % (v/v) 7. TE-Puffer: pH 8,0 Tris/HCl 10 mM EDTA 1 mM Durchführung Es wurden 4 - 6 ml einer Übernachtkultur für eine Mini-Präparation mit Qiagen-tip 20 bzw. 30 ml für eine Midi-Präparation mit Qiagen-tip 100 durch 5-15 minütiges Zentrifugieren bei 6000 g geerntet. Das Pellet wurde anschließend noch einmal mit Puffer P1 ohne Enzymzugaben gewaschen. Das gewaschene Zellpellet wurde in 0,3 (4) ml P1, der 5 (25) µl Lysostaphinlösung (und 10 bzw. 100 µl Lysozymlösung) enthält resuspendiert und mindestens 1 - 2 h bei 37 °C inkubiert. Auch eine längere Lyse, sogar über Nacht, ist möglich und bringt zumeist erhöhte DNA-Ausbeute. Nach der Lyse wurde der Ansatz mit 0,3 (4) ml P2 versetzt, durch mehrmaliges Kippen vorsichtig durchmischt und dann für 5 min bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden 0,3 (4) ml gekühlter P3 hinzu gegeben, wieder vorsichtig durch Kippen gemischt und für 10 (15) min auf Eis inkubiert. Dann wurde das Lysat für 15 (30) min mit 16000 (30000) g bei 4 °C zentrifugiert und der Überstand auf eine Qiagen-tip 20 (Qiagen-tip 100) Säule aufgetragen, die zuvor mit 1 (4) ml QBT equilibriert wurde. Nach viermaligem (zweimaligem) Waschen der Säule mit jeweils 1 ml (10) QC wurde die Plasmid-DNA mit 0,8 (5) ml QF von der Säule eluiert. MATERIAL & METHODEN 61 Die Präzipitation der Plasmid-DNA erfolgte durch Zugabe von 0,7 VT Isopropanol zum Eluat, welches dann 30 min bei 16000 g und 4 °C zentrifugiert wurde, sodass die DNA pelletierte. Der Überstand wurde vollständig abgekippt, das Sediment zum Entfernen des Restsalzes mit 1 (5) ml -20 °C kaltem 70 % Ethanol gewaschen und durch Zentrifugation erneut pelletiert. Der Überstand wurde vorsichtig abgekippt und das Pellet in einer SpeedVac getrocknet. Zum Schluss wurde die DNA in einem geeigneten Volumen TE-Puffer oder A. bidest gelöst. 3.9.2 Präparation von Plasmid DNA mittels Fast Prep-System Im Gegensatz zum zeit- und kostenintensiven enzymatischen Zellaufschluss mit Lysostaphin erfolgt bei dieser Methode ein physikalischer Aufschluss in einer Art Schüttelmühle. Das Fast Prep-System ist zum Zellaufschluss und zur anschließenden Gewinnung von DNA, RNA oder Proteinen in ca. 20 s aus nahezu allen Probematerialien (pflanzliche und tierische Gewebe/Organe, Bakterien, Hefen, Pilze, Bodenproben) geeignet. Die Aufarbeitung der verschiedenen Probematerialien erfolgt durch unterschiedliche Aufschlussmatrizes, bestehend aus einem Gemisch aus Sand, Keramik- Glas- und Kunststoffkugeln. Der Aufschluss erfolgt in 2 ml Reaktionsgefäßen mit einem Schraubdeckel. Diese Gefäße enthalten neben der Aufschlussmatrix die der Präparationsmethode entsprechenden Pufferlösungen. Zum Zellaufschluss werden die Reaktionsgefäße in der Fast Prep-Maschine eingespannt und dann durch diese bei einstellbarer Schüttelintensität und –dauer mit hoher Geschwindigkeit in einer achtförmigen Bewegung geschüttelt. Dabei durchdringen die Partikel der Lysematrix die Probe gleichzeitig von vielen Richtungen. Es wurden verschiedene Lysematrizes und Protokolle ausgetestet, unter anderem auch die ebenfalls von BIO101 (Qbiogene) zusammen mit der Fast Prep Maschine angebotenen kommerziellen Kits „Fast DNA“ und „FastDNA Spin Kit for soil“. Für die vorliegende Arbeit sollte aber nicht wie eigentlich bei diesen Kits vorgesehen Gesamt-DNA sondern Plasmid-DNA aufgereinigt werden. Um dies zu erreichen, wurde das Aufschlussverfahren mittels der Fast Prep-Maschine mit der Aufreinigung von Plasmid-DNA über Anionenaustauschersäulen nach Austestung verschiedener Möglichkeiten wie folgt kombiniert. MATERIAL & METHODEN 62 Eingesetzte Lysematrix (pro Reaktionsgefäß) Keramikkugeln 1,4 mm Durchmesser 0,7 g Sand 1,0 mm Durchmesser 0,4 g Glaskugel 4,0 mm Durchmesser 1 Stück Für den Aufschluss wurden 6 ml einer Flüssigkultur in LB-Bouillon von S. aureus bei 5000 g 5 Min abzentrifugiert. Das in 400 µl A. bidest gelöste Pellet wurde in das Aufschlussgefäß überführt und diesem Ansatz dann 500 µl P1 Puffer (s. 3.9.1) und 500 µl P2 Puffer (s. 3.9.1) zugesetzt. Der Aufschluss in der Fast Prep-Maschine erfolgte bei 4,5 m/s und einer Dauer von 30 s. Im Anschluss daran wurde das Aufschlussgefäß 5 min lang bei 14000 g in der Tischzentrifuge zentrifugiert. Aus diesem Überstand wurde Plasmid-DNA mittels der Qiagen- Anionenaustauschersäulen aufgereinigt. Dazu wurde ein Teil des Überstandes mit einem entsprechenden Aliquot des Puffers P3 versetzt und das Protokoll der Aufreinigung über die Qiagen-Säulen ab diesem Punkt weitergeführt (s. 3.9.1). 3.9.3 Nachweis von Plasmid-DNA mittels abgewandelter Eckhardt-Lyse Eine relativ schnelle Methode zum Nachweis von Plasmid-DNA ist die sogenannte Eckhardt-Lyse [Eckhardt, 1978]. Dabei werden Bakterienzellen aus Koloniematerial durch enzymatische Lyse in Kombination mit dem Detergens SDS direkt in der Tasche eines Agarosegels lysiert und die DNA anschließend elektrophoretisch aufgetrennt. Dabei wandert vorwiegend nur die Plasmid-DNA aus den Geltaschen in das Gel ein, chromosomale DNA und Zellrückstände bleiben größtenteils in den Geltaschen zurück. Diese Methode ist vor allem dafür geeignet schnell und ohne großen Aufwand nach Plasmiden zu screenen, eine große Anzahl von Kolonien zu untersuchen oder sehr große und somit schwer handhabbare Plasmide darzustellen. MATERIAL & METHODEN 63 E1 - Lösung Saccharose 25 % Ficoll400 7 % Tris 25 mM EDTA 250 mM pH 8,0 vor der Verwendung versetzen mit RNase A 100 µg/ml Lysostaphin 1 mg/ml Durchführung Vorbereitung des Geles 0,6-1,0 % (w/v) Agarose wurden in TAE Puffer (s. 3.9.8) aufgekocht. Nach Abkühlen der Agaroselösung auf ca. 60 °C erfolgte die Zugabe von 2 ml 10 %iger (w/v) SDS- Lösung pro 100 ml Agarose und das Gießen eines üblichen Geles mit benötigter Taschenanzahl und Größe (s. 3.9.8). Vorbereitung der Bakterienzellen und Durchführung des Gellaufes Eine gut gewachsene Einzelkolonie wurde mit einem sterilen Zahnstocher von einer Agarplatte gepickt und in 10 µl TE Puffer resuspendiert. Danach wurde der Ansatz mit 20 µl E1 Lösung und 2 µl Farbmaker versetzt und nach vorsichtigem Durchmischen in eine Geltasche gegeben. Nach einer fünfminütigen Ruhephase erfolgte der Vorlauf des Gels bei 20-30 V für 30 min. Der eigentliche Gellauf zur Auftrennung der Plasmid-DNA erfolgte dann bei 80-120 V für 60 bis 180 min. Im Anschluss daran wurde das Gel für 30 min gewässert, dann im Ethidiumbromid-Bad gefärbt und auf dem UV-Transilluminator betrachtet (s.a. 3.9.8). 3.9.4 Präparation genomischer DNA mittels DNeasy Tissue Kit (Qiagen) Die Methodik dieses Kits beruht auf einer Aufreinigung der DNA mittels einer Silica- Gel-Matrix in Mini-Spin-Säulen. Zur Präparation wurden 1–2 ml einer Flüssigkultur oder eine Suspension von 1-3 Kolonien in 0,9 %iger NaCl verwendet. Die Flüssigkultur bzw. die Koloniesuspension wurde durch 10 minütige Zentrifugation in einer Eppendorf Tischzentrifuge bei 5000 g und RT pelletiert und mit 180 µl Lysepuffer versetzt. Die enzymatische Lyse erfolgte für mindestens 30 min bei 37 °C. MATERIAL & METHODEN 64 Anschließend wurde der Ansatz 25 µl Proteinase K und 200 µl Puffer AL vesetzt, durch vortexen vermischt und für 30 min bei 70 °C inkubiert. Nach dieser Inkubation wurden 200 µl 96-100 %iges Ethanol zum Ansatz gegeben und sorgfältig durch vortexen durchmischt, bevor der komplette Ansatz auf eine Spin- Säule des Kits gegeben wird. Die Spin-Säule, welche in einem Sammelcup steckt, wurde dann für 1 min bei 6000 g zentrifugiert, wonach der Durchfluss und das Sammelcup verworfen wurden. Auf die Spin-Säule wurden nun 500 µl Puffer AW1 gegeben und unter gleichen Bedingungen zentrifugiert. Im Anschluss erfolgte die Zugabe von 500 µl Puffer AW2 und eine Zentrifugation von 3 min bei 20000 g, welche zu einer Trocknung der Spin- Säulen-Membran führt. Der Durchfluss und das Sammelgefäß wurden auch nach diesem Schritt verworfen. Die Ablösung der DNA von der Säulenmatrix erfolgte im nächsten Schritt durch die Zugabe von 200 µl Puffer AE, einer einminütigen Inkubation bei RT, gefolgt von einer einminütigen Zentrifugation bei 6000 g und RT. Dieser Elutionsschritt wurde noch einmal wiederholt, so dass insgesamt 400 µl DNA-haltige Lösung vorlagen. 3.9.5 Photometrische Konzentrationsbestimmung von DNA Die einzelnen Nukleotide der DNA haben ihre Absorptionsmaxima zwischen 253 nm und 271 nm bei pH 7,0. Zur Konzentrationsbestimmung [Clark u. Switzer, 1977] wurde ein Aliquot der DNA-Lösung in eine Quarzküvette überführt und mit einem Spektralphotometer bei 260 nm vermessen. Folgende Näherungswerte lagen der Konzentrationsbestimmung zugrunde: Doppelsträngige (ds) DNA: 1 OD260 entspricht 50 µg/ml Einzelsträngige (ss) DNA: 1 OD260 entspricht 33 µg/ml Einzelsträngige (ss) RNA: 1 OD260 entspricht 40 µg/ml Verunreinigungen konnten durch die Bestimmung der Extinktion bei 230 nm, 260 nm und 280 nm und Bildung der Quotienten E260nm / E230nm und E260nm / E280nm festgestellt werden. Dabei gelten folgende Richtwerte [Marmur, 1961]: E260nm / E230nm < 2,2 und E260nm / E280nm >1,9 MATERIAL & METHODEN 65 3.9.6 Einsatz von Restriktionsendonukleasen Zur Charakterisierung der präparierten Plasmid-DNA wurde diese durch Typ-II- Restriktionsendonukleasen in spezifische Fragmente gespalten. Restriktionsenzyme dieser Art erkennen spezifische kurze DNA-Sequenzen (Tetra- bis Hexanukleotide) und schneiden innerhalb dieser Erkennungssequenz. Dabei können glatte (blunt- ends) oder überstehende (sticky ends) Enden entstehen [Winnacker, 1985]. Die enzymatische Spaltung der DNA erfolgte nach Herstellerangaben der Restriktionsenzyme in einem Ansatz von 20-60 µl Gesamtvolumen. Pro Spaltungsansatz wurden 1-10 µg DNA und 1-10 U Restriktionsenzym eingesetzt, somit eine DNA-Konzentration von möglichst nicht mehr als 1 µg/U. Der Enzymanteil betrug maximal 10 % des Gesamtvolumens, um eine Inhibierung der Reaktion durch das im Lagerungspuffer des Enzyms enthaltene Glycerin zu vermeiden. Durch Zugabe der entsprechenden Menge 10-fach konzentrierten, spezifischen Spaltungspuffers wurden die für das Enzym optimalen Salzkonzentrationen eingestellt. Die Inkubationszeit betrug 1-4 h bei der für das jeweilige Enzym empfohlenen optimalen Temperatur. 3.9.7 Nachweis spezifischer DNA-Abschnitte durch PCR Die Methode der PCR ermöglicht die Amplifizierung einzelner DNA-Fragmente und beruht auf der Fähigkeit der DNA-Polymerase einen DNA-Einzelstrang zu kopieren. Hierbei initiert dieses Enzym die Elongation am 3’-Ende einer kurzen Nukleotidsequnez (Primer) die an einem längeren DNA-Strang (Template- oder Ziel- DNA) gebunden ist. Die Ziel-DNA dient somit als Matrize in dem PCR-Ansatz der aus den Primern, Desoxynucleosidtriphosphaten, Puffer, DNA-Polymerase und A. bidest besteht. Jeder PCR-Zyklus besteht aus drei Schritten. Als erstes wird bei ca. 95 °C die DNA denaturiert und somit die Doppelstränge in Einzelstränge getrennt, damit sich im zweiten Schritt (Annealing), nach erfolgter Abkühlung, die Primer an die Ziel- Sequenz anlagern (hybridisieren) können. Dies geschieht bei einer für jeden Primer individuellen Temperatur. Beim dritten Schritt (Elongation) erfolgt bei 72 °C die Verlängerung der DNA-Stränge zwischen den Primern durch Wirkung der DNA- Polymerase. Ein üblicher PCR-Ansatz beginnt mit einer initialen Denaturierung für ca. 2-4 min bei 95 °C, worauf 25-35 Zyklen der oben beschriebenen Schritte folgen, wobei jede dieser Phasen 30-60 s dauert. Nach dem letzten Zyklus erfolgt eine MATERIAL & METHODEN 66 verlängerte Elongationsphase (bis zu 10 min), damit die DNA-Polymerase alle Stränge auffüllen kann. Statt nur mit einem Primerpaar zu arbeiten, können in einem PCR-Ansatz auch mehrere Primerpaare gleichzeitig eingesetzt werden. Bei einer solchen sog. Multiplex-PCR ist dann zu beachten, dass die Primer nicht miteinander hybridisieren können, sich nicht in ihren Zielsequenzen überschneiden und ihre Annealingtemperatur in möglichst gleichen Temperaturbereichen liegt. Die Zusammensetzung des Reaktionspuffers unterscheidet sich von der einer PCR mit einem einzelnen Primerpaar, so muss demgegenüber z.b. die Konzentration des MgCl2 und der dNTPs erhöht werden. Ferner muss darauf geachtet werden, dass die entstehenden DNA-Fragmente sich so in ihrer Größe unterscheiden, dass sie gut auf einem Gel einzeln nachweisbar sind. Zur Charakterisierung der MRSA-Stämme wurden verschiedene bereits etablierte PCR-Ansätze gewählt, die im Folgenden kurz beschrieben werden sollen. Für sämtliche PCR-Ansätze wurden die Primerpaare einzeln zunächst mit aufgereinigter DNA aus Referenzstämmen bei den in der Literatur angegeben Bedinungen auf ihre Funktionalität hin überprüft, handelte es sich um Multiplex-PCRs so wurde als nächstes der Primer-Mix unter verschiedenen Bedingungen getestet. Alle PCRs wurden mit verschiedenen Taq-Polymerasen durchgeführt. Darunter auch einer in der Arbeitsgruppe selbst hergestellte, die keine Nachteile gegenüber den kommerziellen zeigte, außer der Einschränkung, dass die U/ml nicht genau bekannt waren. Zur Anwendung der selbst hergestellten Taq-Polymerase wurden im Vorfeld Versuchsreihen durchgeführt. 3.9.7.1 PCR mit Koloniesuspensionen Für das PCR-Screening der Kollektive wurde auf eine DNA-Präparation aller Teststämme verzichtet und stattdessen die Methodik der PCR mit Koloniematerial als Template angewandt. Um den hohen Probendurchsatz optimiert bearbeiten zu können wurde wie folgt vorgegangen. Von jedem zu untersuchenden Stamm wurde eine Koloniesuspension von einer bzw. einem Teil einer Kolonie in 200 µl A. bidest hergestellt, von der 1 µl für einen PCR Ansatz von 15-50 µl verwendet wurde. Dieses 1 µl-Template wurde im Reaktionscup (die PCRs erfolgten zumeist in 8er-PCR-Stripes) vorgelegt, so dass das Zusammenbringen von Mastermix und Template möglichst schnell erfolgen konnte. MATERIAL & METHODEN 67 Zur Vereinfachung der Abläufe konnten PCR-Stripes mit vorgelegtem Template oder auch die Koloniesuspensionen ohne Qualitätsverluste für einige Tage bei -21 °C gelagert werden. Vor der Anwendung der Methodik wurde diese durch Einsatz der Referenzstämme wie oben beschrieben getestet. Tab. 5 Verwendete Primer Ziel Primer Sequenz 5’ - 3’ Position Produkt bp mecA 1 AAA ATC GAT GGT AAA GGT TGG C 1282–1303 (a) mecA mecA 2 AGT TCT GCA GTA CCG GAT TTG C 1814–1793 (a) 532 aacA-aphD 1 TAA TCC AAG AGC AAT AAG GGC 2144–2164 (a) aacA- aphD aacA-aphD 2 GCC ACA CTA TCA TAA CCA CTA 2371–2350 (a) 227 ermA 1 AAG CGG TAA ACC CCT CTG A 5074–5056 (a) ermA ermA 2 TTC GCA AAT CCC TTC TCA AC 4885–4904 (a) 190 ermC 1 AAT CGT CAA TTC CTG CAT GT 2068–2088 (a) ermC ermC 2 TAA TCG TGG AAT ACG GGT TTG 2365–2345 (a) 299 tetK 1 GTA GCG ACA ATA GGT AAT AGT 871–891 (a) tetK tetK 2 GTA GTG ACA ATA AAC CTC CTA 1231–1211 (a) 360 tetM 1 AGT GGA GCG ATT ACA GAA 301–318 (a) tetM tetM 2 CAT ATG TCC TGG CGT GTC TA 459–440 (a) 158 vatA 1 TGG TCC CGG AAC AAC ATT TAT 2642–2622 (a) vatA vatA 2 TCC ACC GAC AAT AGA ATA GGG 2375–239 (a) 268 vatB 1 GCT GCG AAT TCA GTT GTT ACA 496–519 (a) vatB vatB 2 CTG ACC AAT CCC ACC ATT TTA 631–611 (a) 136 vatC 1 AAG GCC CCA ATC CAG AAG AA 1326–1345 (a) vatC vatC 2 TCA ACG TTC TTT GTC ACA ACC 1753–1773 (a) 467 16s 1 CAG CTC GTG TCG TGA GAT GT 1058–1077 (a) 16S rDNA 16s 2 AAT CAT TTG TCC CAC CTT CG 1477–1458 (a) 420 sau1 AAT CTT TGT CGG TAC ACG ATA TTC TTC ACG 5–34 (a) S.aureuss pezifisch sau2 CGT AAT GAG ATT TCA GTA GAT AAT ACA ACA 112–83 (a) 107 SEA-3 CCT TTG GAA ACG GTT AAA ACG 487–507 (b) sea SEA-4 TCT GAA CCT TCC CAT CAA AAA C 592–613 (b) 127 SEB-1 TCG CAT CAA ACT GAC AAA CG 634–653 (b) seb SEB-4 GCA GGT ACT CTA TAA GTG CCT GC 1088–1110 (b) 477 SEC-3 CTC AAG AAC TAG ACA TAA AAG CTA GG 665–690 (b) sec SEC-4 TCA AAA TCG GAT TAA CAT TAT CC 913–935 (b) 271 SED-3 CTA GTT TGG TAA TAT CTC CTT TAA ACG 354–380 (b) sed SED-4 TTA ATG CTA TAT CTT ATA GGG TAA ACA TC 644–672 (b) 319 SEE-3 CAG TAC CTA TAG ATA AAG TTA AAA CAA GC 482–510 (b) see SEE-2 TAA CTT ACC GTG GAC CCT TC 640–659 (b) 178 SEG-1W AAT GCY CAA CCY GAT CCT A 223–241 (c) seg SEG-4 CTT CCT TCA ACA GGT GGA GAC 318–338 (c) 116 SEH-1 TTA GAA ATC AAG GTG ATA GTG GC 407–429 (c) seh SEH-2 TTT TGA ATA CCA TCT ACC CAA AC 619–641 (c) 235 SEI-1 GCC ACT TTA TCA GGA CAA TAC TT 469–491 (c) sei SEI-2 AAA ACT TAC AGG CAG TCC ATC TC 776–798 (c) 330 SEJ-1 CTC CCT GAC GTT AAC ACT ACT AAT AA 940–965 (c) sej SEJ-2 TTG TCT GGA TAT TGA CCT ATA ACA TT 1580–1605 (c) 641 MATERIAL & METHODEN 68 Ziel Primer Sequenz 5’ - 3’ Position Produkt bp TST-3 AAG CCC TTT GTT GCT TGC G 51–69 (b) tst TST-6 ATC GAA CTT TGG CCC ATA CTT T 474–495 (b) 445 ETA-3 CTA GTG CAT TTG TTA TTC AAG ACG 374–397 (b) eta ETA-4 TGC ATT GAC ACC ATA GTA CTT ATT C 468–492 (b) 119 ETB-3 ACG GCT ATA TAC ATT CAA TTC AAT G 51–75 (b) etb ETB-4 AAA GTT ATT CAT TTA ATG CAC TGT CTC 286–312 (b) 262 CIF2 F2 TTCGAGTTGCTGATGAAGAAGG 18398–18419a (d) Locus A CIF2 R2 ATTTACCACAAGGACTACCAGC 18892–18871a (d) 495 KDP F1 AATCATCTGCCATTGGTGATGC 10445–10467b (d) Locus B KDP R1 CGAATGAAGTGAAAGAAAGTGG 10728–10707b (d) 284 MECI P2 ATCAAGACTTGCATTCAGGC 42428–42447b (d) Locus C MECI P3 GCGGTTTCAATTCACTTGTC 42636–42617b (d) 209 DCS F2 CATCCTATGATAGCTTGGTC 38011–37992a (d) Locus D DCS R1 CTAAATCATAGCCATGACCG 37670–37689a (d) 342 RIF4 F3 GTGATTGTTCGAGATATGTGG 45587–45607c (d) Locus E RIF4 R9 CGCTTTATCTGTATCTATCGC 45829–45809c (d) 243 RIF5 F10 TTCTTAAGTACACGCTGAATCG 59573–59594c (d) Locus F RIF5 R13 GTCACAGTAATTCCATCAATGC 59986–59965c (d) 414 IS431 P4 CAGGTCTCTTCAGATCTACG 49963–49982b (d) Locus G pUB110 R1 GAGCCATAAACACCAATAGCC 50343–50323b (d) 381 IS431 P4 CAGGTCTCTTCAGATCTACG 29654–29673c (d) Locus H pT181 R1 GAAGAATGGGGAAAGCTTCAC 29976–29956c (d) 303 MECA P4 TCCAGATTACAACTTCACCAGG 1190–1211d (d) mecA MECA P7 CCACTTCATATCTTGTAACG 1351–1332d (d) 162 alle Typen ccrA αc ATCTATTTCAAAAATGAACCA (e) ccrA1 α1 (α2) AACCTATATCATCAATCAGTACGT (f) 700 ccrA2 α2 (α3) TAAAGGCATCAATGCACAAACACT (f) 1 kbp ccrA3 α3 (α4) AGCTCAAAAGCAAGCAATAGAAT (f) 1,6 kbp γF CGTCTATTACAAGATGTTAAGGATAAT (g) ccrC γR CCTTTATAGACTGGATTATTCAAAATAT (g) 520 LukS-PV GGCCTTTCCAATACAATATTGG (h) lukF LukF-PV CCCAATCAACTTCATAAATTG (h) 980 HVR1 ACTATTCCCTCAGGCGTCC 338 - 356 (i) drus in HVR HVR2 GGAGTTAATCTACGTCTCATC 892 - 912 (i) variabel (a) Strommenger et al., 2003. (b) Becker et al., 1998. (c) Becker et al., 2003. (d) Oliveira u. Lencastre, 2002. (e) Okuma et al., 2002. (f) Ito et al., 2001. (g) Ito et al., 2004. (h) O’Brien et al., 2004. (i) Nishi et al., 1995 MATERIAL & METHODEN 69 3.9.7.2 Multiplex-PCR zum Nachweis von Antibiotikaresistenzgenen Diese PCR dient dem Nachweis verschiedener bei S. aureus häufig vorkommender Antibiotikaresistenzgene. Die untersuchten Resistenzgene können auch eine Bedeutung für die Charakterisierung von MRSA-Stämmen haben, da diese im Laufe der Zeit „typische Resistenzverhalten“ zeigen und sich somit „alte“ von „neuen“ Stämmen unterscheiden lassen [Strommenger et al., 2003]. Das Primerset enthält Primerpaare für Resistenzgene gegen Aminoglykoside (aacA, aphD), Makrolide (ermA, ermC), Lincosamin–StretograminB-Verbindungen (vatA, vatB, vatC) und Tetrakzykline (tetK, tetM). Des Weiteren beinhaltet der Ansatz Positivkontrollen zur Typisierung in Form eines Primerpaares zur Gattungsbestätigung mittels eines 16S-rDNA-spezifischen Fragmentes und ein Primerpaar zum Nachweis des mecA-Genes. Mastermix 25 µl PCR-Programm MgCl2 4 mM 94 °C 3 min dNTPs (jedes) 0,4 mM 30 Zyklen Primer (jeder)* 0,1 µM 94 °C 30 s Taq-Polymerase 1,25 U 55 °C 30 s 72 °C 30 s 72 °C 3 min * mecA1, mecA2, aacA-aphD1, aacA-aphD2, ermA1, ermA2, ermC1, ermC2, tetK1, tetK2, tetM1, tetM2, vatA1, vatA2, vatB1, vatB2, vatC1, vatC2 Die Auftrennung der PCR-Fragmente erfolgte auf einem 2,5 %igen TBE-Agarosegel. Als Positivkontrolle dienten die Stämme S. aureus ES 1767 (vatA), S. aureus ES 1768 (vatB) und S. aureus 694/01 (restliche Resistenzgene). 3.9.7.3 Nachweis von Enterotoxin A-E, G–J, Toxic Shock Syndrome Toxin 1 und Exfoliativtoxin A und B Zum Nachweis der Toxingene dienten drei Multiplex-PCR Ansätze, die von der Arbeitsgruppe Becker entwickelt bzw. optimiert wurden [Becker et al., 1998, 2003]. Ansatz 1 erfasst die fünf Haupttypen der Staphylokokken-Enterotoxine, Ansatz 2 vier weitere Enterotoxine und Ansatz 3 die beiden bekannten Exfoliativtoxine A und B sowie das Toxic Shock Syndrome Toxin 1. MATERIAL & METHODEN 70 Mastermix 25 µl PCR-Programm MgCl2 3 mM 95 °C 2 min dNTPs (jedes) 0,2 mM 30 Zyklen Primer (jeder)* 0,3 µM 95 °C 60 s Taq-Polymerase 1 U 55 °C 60 s 72 °C 120 s 72 °C 5 min *Toxingen-Multiplex-PCR 1: SEA-3, SEA-4, SEB-1, SEB-4, SEC-3, SEC-4, SED-3, SED- 4, SEE-3, SEE-2 *Toxingen-Multiplex-PCR 3: SEG-1W, SEG-4, SHE-1, SHE-2, SEI-1, SEI-2, SEJ-1, SEJ-2 *Toxingen-Multiplex-PCR 3: TST-3, TST-6, ETA-3, ETA-4, ETB-3, ETB-4 Die Auftrennung der PCR Fragmente erfolgte auf einem 2,5 %igen TBE-Agarosegel. Als Positivkontrollen dienten für den PCR-Ansatz 1 die Stämme S. aureus 3811 (sea, sed), S. aureus 1000/93 (seb), S. aureus 332 (sec) und S. aureus 176 (see), für den PCR-Ansatz 2 S. aureus 349 (seg, seh, sei) und S. aureus 3811 (sej) und für den PCR-Ansatz 3 Staphylococcus spec. 349 (tst) und Staphylococcus spec. 15664 (eta, etb). 3.9.7.4 PCR zum Nachweis der Panton-Valentine Leukozidin-Determinante Diese in C-MRSA weit verbreitete Determinante wurde mit Hilfe eines Primers für lukF nachgewiesen [O’Brien et al., 2004]. Mastermix 25 µl PCR-Programm MgCl2 2 mM 94 °C 3 min dNTPs (jedes) 0,2 mM 30 Zyklen Primer LukS-PV 0,1 µM 94 °C 30 s Primer LukF-PV 0,1 µM 55 °C 54 s Taq-Polymerase 1 U 72 °C 30 s 72 °C 5 min Die Auftrennung der PCR Fragmente erfolgte auf einem 0,8 %igen TBE-Agarosegel. MATERIAL & METHODEN 71 3.9.7.5 Multiplex-PCR zur Bestimmung von SCCmec nach Oliveira u. Lencastre [2002] Zur Bestimmung von SCCmec gibt es für jeden Typ in dieser PCR einen Locus upstream und einen downstream von mecA. Einer der Loci ist dabei einzigartig für einen bestimmten SCCmec-Typ. SCCmec I und SCCmec II, deren Region downstream mecA sehr ähnlich aufgebaut ist, werden somit typisiert durch das gemeinsame downstream-mecA-Primerpaar Locus D (Primer DCS F2 / DCS R1) und das für den SCCmec-Typ spezifische upstream-mecA-Primerpaar Locus A (Primer CIF2 F2 / CIF2 R2) für SCCmec I und Locus B (Primer KDP F1 / KDP R1) für SCCmec II. Der Typ SCCmec IA wird bestimmt durch das Primerpaar Locus G (Primer IS431 P4 und pUB110 R1), welches in der Region der left junctions zwischen IS431 und dem integrierten Plasmid puB110 greift und somit ein zusätzliches Fragment zu denen für SCCmec I sonst typischen liefert. SCCmec III hat upstream von mecA eine Sequenz die der von SCCmec II gleicht, die Region downstream von mecA ist jedoch sehr viel länger als die von SCCmec I und SCCmec II und unterscheidet sich von diesen. Die Typisierung von SCCmec III erfolgt durch das nicht zwischen SCCmec II und SCCmec III unterscheidende, upstream von mecA bindende Primerpaar Locus C (Primer MECI P2 / MECI P3) und zwei SCCmec III spezifische Primerpaare in der downstream Region, Locus E (Primer RIF4 F3 / RIF4 R9) und Locus F (Primer RIF5 F10 / RIF5 R13). SCCmec IIIA wird charakterisiert durch die Abwesenheit des sonst integrierten Plasmides pT181, welches durch das Primerpaar Locus H (Primer IS431 P4 und pT181 R1) nachgewiesen wird. Somit fehlt bei SCCmec IIIA gegenüber SCCmec III die Bande bei 303 bp auf dem Agarosegel. SCCmec IIIB zeigt sich in dieser Methode durch die Abwesenheit jeglicher Fragmente der downstream Region, so dass auf dem Gel neben der mecA- Kontrollbande nur die 209 bp Bande des upstream-Primerpaares für den Locus C (Primer MECI P2 / MECI P3) zu sehen ist. SCCmec IV ist nah verwandt zu SCCmec I und besitzt die gleiche mecA- downstream-Region wie dieser und auch Teile der Region upstream von mecA sind ähnlich. Trotz Ähnlichkeiten gibt es Teile der Region upstrean von mecA, die nicht in SCCmec I vorkommen. Diese SCCmec IV-spezifische upstream-Region, ist von MATERIAL & METHODEN 72 Stamm zu Stamm variabel. In der PCR von Oliveira u. Lencastre [2002] wird der SCCmec IV-Kassettentyp definiert durch die Abwesenheit der SCCmec I- spezifischen pls-Region (18 kb) in der mecA-upstream-Region. Darum sind Stämme die den SCCmec IV besitzen positiv für den downstream-Locus D (Primer DCS F2 / DCS R1) und negativ für den upstream-Locus A (Primer CIF2 F2 / CIF2 R2, welcher in der pls-Region lokalisiert ist. Die Variante SCCmec IVA zeigt im Gelbild zusätzlich das 381 bp-Fragment für das integrierte Plasmid puB110. Mastermix 25 µl PCR-Programm MgCl2 2 mM 94 °C 4 min dNTPs (jedes) 0,2 mM 30 Zyklen Primermix 1* (jeder) 0,4 µM 94 °C 30 s Primermix 2** (jeder) 0,8 µM 53 °C 30 s Primermix 3*** (jeder) 0,2 µM 72 °C 60 s Taq-Polymerase 1,5 U 72 °C 4 min * CIF2 F2, CIF2 R2, MECI P2, MECI P3, RIF5 F10, RIF5 R13, pUB 110 R1, pT 181 R1 ** DCS F2, DCS R2, MECA P4, MECA P7, IS431 P4 *** KDP F1, KDP R1, RIF4 F3, RIF4 R9 Die Auftrennung der PCR-Fragmente erfolgte auf einem 2,5 %igen TBE-Agarosegel. 3.9.7.6 Multiplex-PCR zum Nachweis des ccrA1, ccr A2, ccr A3 Der Nachweis der Gene der Kassettenchromosom-Rekombinase-Typen, ccrA1, ccrA2, ccrA3, erfolgte mittels Primern des von Okuma et al. [2002] entwickelten Primersets zur Klassifizierung von SCCmec. Dieses enthält neben den Primern für den ccr-Typ noch weitere zur Bestimmung der ccr-Region, sowie solche zur Bestimmung des mec-Komplex-Typs. Mastermix 25 µl PCR-Programm MgCl2 2 mM 94 °C 4 min dNTPs (jedes) 0,2 mM 30 Zyklen Primer αc, α1, α2, α3 94 °C 30 s jeder 0,1 µM 53 °C 30 s Taq-Polymerase 1 U 72 °C 60 s 72 °C 4 min Die Auftrennung der PCR-Fragmente erfolgte auf einem 1 %igen TBE-Agarosegel. MATERIAL & METHODEN 73 3.9.7.7 PCR zum Nachweis von ccrC Der Nachweis des Genes ccrC der bei SCCmec V beschriebenen Kassettenchromosom-Rekombinase erfolgte nach Ito et al. [2004] und wurde hier als Nachweis für diesen SCCmec-Typ eingesetzt. Zwar enthalten auch SCCmec III- Elemente neben dem ccrA3-Rekombinasetyp ein ccrC-Element aber alleinig vorkommend wurde ccrC bisher nur bei SCCmec V beschrieben [Ito T et al., 2004; Chongtrakool et al., 2006]. Mastermix 25 µl PCR-Programm MgCl2 2 mM 94 °C 4 min dNTPs (jedes) 0,2 mM 30 Zyklen Primer γF 0,1 µM 94 °C 30 s Primer γR 0,1 µM 53 °C 30 s Taq-Polymerase 1 U 72 °C 60 s 72 °C 4 min Die Auftrennung der PCR-Fragmente erfolgte auf einem 1 %igen TBE-Agarosegel. 3.9.7.8 PCR zur Bestimmung der dru-Anzahl in der HVR Die Anzahl der jeweils 40 bp-großen direct repeat units (drus) in der hypervariablen Region (HVR) der mec-DNA zwischen IS431 und mecA lässt sich mit Hilfe der PCR nach Nishi et al. [1995] wie folgt bestimmen: Anzahl drus = (Amplifikatgröße in bp – 171) / 40 Hierbei ist der Wert 171 die Anzahl der sich nicht wiederholenden Basenpaare in der amplifizierten Sequenz und 40 die Basenpaarzahl der einzelnen repetetiven Elemente. Mastermix 25 µl PCR-Programm MgCl2 2 mM 94 °C 5 min dNTPs (jedes) 0,25 mM 30 Zyklen Primer HVR1 0,2 µM 94 °C 60 s Primer HVR 2 0,2 µM 55 °C 60 s 72 °C 120 s Taq 1,5 U 72 °C 2 min Die Auftrennung der PCR-Fragmente erfolgte auf einem 1 %igen TBE-Agarosegel. MATERIAL & METHODEN 74 3.9.8 Nachweis von DNA durch Agarose-Gelelektrophorese Nukleinsäuren sind aufgrund ihres Zucker-Phosphat-Rückgrates negativ geladen. Im Agarosegel wird DNA elektrophoretisch nach ihrer Größe getrennt, sie wandert im elektrischen Feld zum Pluspol. Dabei ist die Beweglichkeit linearer DNA-Fragmente innerhalb eines bestimmten Größenbereiches proportional dem Logarithmus ihrer Molekulargewichte [Sambrook, 1989]. Laufpuffer TAE 50 x Tris 242,0 g Eisessig 57,1 ml EDTA 18,61 g A. bidest ad 1000 ml Laufpuffer TBE 10 x Tris 108,0 g Borsäure 55,0 g EDTA 7,48 g A. bidest ad 1000 ml Farbmarker Saccharose 40 % w/v Bromphenolblau 0,25 % Xylencyanol FF 0,25 % Welcher Laufpuffer verwendet wird ist abhängig von der Art der DNA, die auf dem Gel aufgetrennt werden soll. TAE-Puffer wird bei der Auftrennung größerer (> 12 kb) DNA-Fragmente verwendet, in vorliegender Arbeit vor allem für die Auftrennung ganzer Plasmide. TBE-Puffer ist besser geeignet für die Elektrophorese kleinerer DNA-Fragmente, besitzt im Bereich von < 1 kb ein sehr gutes Auflösungsvermögen und ist somit für die Auftrennung von PCR-Fragmenten geeignet. TBE-Puffer interagiert derart mit der Agarose, dass eine geringere Porengröße entsteht als bei TAE-Puffer. Die geringere Porengröße vermindert den Effekt des Schmierens von Banden kleiner DNA-Stücke. Ferner besitzt TBE-Puffer eine höhere Pufferkapazität als TAE-Puffer, welcher nach längeren Gellaufzeiten, z.B. über Nacht, erneuert werden sollte. Allerdings lässt sich DNA aus TBE-gepufferten Gelen schlechter wieder aufreinigen als aus TAE-gepufferten Gelen. Je nach Anwendung und Probenmenge wurden Agarosegele verschiedener Größe hergestellt. Kleine Gele waren dabei ca. 10 x 8 cm groß und hatten 12 oder 24 Geltaschen, große Gele waren ca. 25-32 x 20 cm groß und verfügten über bis zu 150 MATERIAL & METHODEN 75 Geltaschen. Zur Herstellung der Agarosegele wurde die benötigte Menge Agarose (0,6–2,5 %) im jeweiligen Elektrophoresepuffer durch Aufkochen in der Mikrowelle gelöst und nach Abkühlen in die mit einem Gelkamm versehene Plexiglaswanne gegossen. Diese normalen Gele hatten eine Schichtdicke von ca. 3-8 mm. Zum Erhalt von Gelen mit geringerer Schichtdicke wurde alternativ die Agaroselösung auf Glasplatten gegossen, so dass durch die Oberflächenspannung ein Gel gleichmäßiger Schicht mit geringer aber ausreichender Höhe entstand. Diese Glasplattengele haben gegenüber den normalen Gelen mehrere Vorteile. Neben einem kleineren Probenbedarf und einer niedrigeren Nachweisgrenze sind sie durch rasches Erstarren und kürzerer Lauf- und Färbezeiten in kürzerer Zeit als die dickeren Gele durchführbar. Des Weiteren bieten sie für die Aufreinigung von DNA aus Agarosegelen den Vorteil, dass bei den ausgeschnittenen Banden das Verhältnis von DNA-haltiger zu DNA-freier Agarose wesentlich günstiger ist. Jede Art von Gel wurde nach dem Erstarren in einer Elektrophoresekammer mit dem entsprechenden Elektrophoresepuffer überschichtet, wobei der Puffer idelaerweise 3- 5 mm über dem Gel stehen sollte und erst dann der Gelkamm entfernt. Vor dem Auftragen wurden die DNA-Lösungen mit 0,1-0,5 VT Farbmarker versetzt. Zur Größenbestimmung ganzer Plasmide wurden als Standard die Plasmide aus E. coli V517 aufgetragen. Zur Größenbestimmung von restringierter Plasmid-DNA und von PCR-Fragmenten wurden verschiedene lineare DNA-Marker verwendet. Abb. 5 Verwendete lineare DNA-Marker. (a) eigene Herstellung. (Abb. Fermentas; 0,5 µg, 1 % TAE 7 V/cm, 1h). * = Fragmente mit kohäsiven Enden, können sich verbinden und zu zusätzlichen Fragmenten führen. (b), (d)-(g) Fermentas; (a) 0,5 µg, 1 % TAE, 7 V/cm, 45 min, (d)-(f) 80 ng, 1 % TAE, 7 V/cm, 14 min; (g) 0,25 µg, 1 % TAE, 7 V/cm, 1 h. (c) New England Biolabs; 1 µg, 1,8 % TBE. Abbildungen aus Produktkatalogen der Firmen entnommen. MATERIAL & METHODEN 76 3.9.9 Elektroporation von S. aureus nach Schenk u. Laddaga [1992] Bei dieser Methode wird die Permeabilität der bakteriellen Zellmembran durch das kurzzeitige Anlegen einer hohen Spannung vorübergehend erhöht. Gleichzeitig angebotene DNA kann von den Zellen nun aufgenommen werden [Sambrook et al., 1989]. Für die Herstellung kompetenter Zellen zur Transformation durch Elektroporation wurde eine 25 ml Übernachtkultur von S. aureus 8325-4 in B2-Bouillon 1/25 in 25 ml frischem B2-Medium verdünnt. Nach Erreichen der mittleren log-Wachstumsphase (OD578 0,5-0,8) wurden die Zellen durch eine 10-minütige Zentrifugation bei 5000 g, 20 °C geerntet. Anschließend wurden die Zellen dreimal mit dem gleichen Volumen (25 ml) entionisiertem Wassers und je einmal mit 5 ml und 2,5 ml 10 %iger Glycerinlösung gewaschen. Nach der Resuspension der Zellen in 2,5 ml Glycerinlösung wurde dieser Ansatz vor der Zentrifugation für 15 min bei RT inkubiert. Das Pellet wurde dann in 800 µl 10 %iger Glycerinlösung resuspendiert und aliquotiert. Die Zentrifugationen erfolgten für 10 min bei 6000 g und 20 °C. Die so vorbereiteten Elektroporations-Zellen wurden entweder sofort nach der Präparation verwendet oder bei -70 °C gelagert. Für die Elektroporation sind laut Protokoll Elektroporationsküvetten mit einem Elektrodenabstand von 1 mm zu verwenden. Die folgenden Angaben beziehen sich also auf diese. Es wurden aber auch Elektroporationsküvetten mit einem Elektrodenabstand von 2 mm verwendet, wofür die Voluminaangaben verdoppelt wurden. Für die Elektroporation wurden 70 µl der kompetenten Zellen mit der zu elektroporierenden Plasmid-DNA gemischt. Diese Mischung wurde in die Elektroporationsküvetten (20 °C) pipettiert und bei einer Geräteeinstellung von 2,3 kV, 100 Ohm, 25 µF im BioRad Gene Pulser elektroporiert. Die optimale Zeitkonstante für diesen Elektroporationsvorgang liegt bei 2,5 ms. Danach wurden die Zellen sofort mit 390 µl B2-Medium vermischt und aus den Küvetten in ein Eppendorfgefäß überführt. Nach einer Inkubation von 1 h bei 37 °C wurden die Zellsuspensionen auf entsprechend selektive Medien ausplattiert und für 24-48 h bei 37 °C bebrütet. Eine Überprüfung der Elektroporationsergebnisse erfolgte durch mitgeführte Positiv- und Negativkontrollen und durch eine anschließende Plasmidpräparation der Transformanten. MATERIAL & METHODEN 77 3.9.10 Konjugativer Plasmidtransfer 3.9.10.1 PEG-vermittelter Transfer nach Townsend et al. [1985] Townsend et al. [1985] zeigten, dass die Zugabe von Polyethylenglykol zur Mischkultur von Donor und Rezipient die Transferraten konjugativer Plasmide erhöhte. Übernachtkulturen von Donor- und Rezipientenstamm in entsprechend selektiven Medien wurden abzentrifugiert und in einem dem ursprünglichen Kulturansatz entsprechenden Volumen Nährbouillon mit 40 % Polyethylenglykol resuspendiert. 1 ml Donorkultur wurden dann zu 3 ml Rezipientenkultur gegeben und für 5 h bei 37 °C unter leichtem Schütteln inkubiert. Anschließend wurden 100 µl dieser Kultur entsprechend selektiv ausplattiert. 3.9.10.2 Membranfilter-Methode nach Simon et al. [1983] Je 5 ml Donor- und Rezipientenstamm wurden über Nacht selektiv angezogen, geerntet und die Zellen dann in 1 ml 0,9 %iger NaCl-Lösung resuspendiert. Dann wurden 100 µl Donor- mit 1 ml Rezipientensuspension gemischt, kurz abzentrifugiert und die Zellen dann in 200 µl 0,9 %iger NaCl-Lösung resuspendiert. Diese Zellsuspension wurde auf einem Nitrocellulosefilter (0,45 µm Durchmesser), der auf einer Agarplatte aufliegt, verteilt. Nach einer Bebrütung über Nacht bei 37 °C wurden die Zellen mit 1,5 ml 0,9 %iger NaCl Lösung von dem Filter in eine sterile Petrischale abgespült. 100 µl der Zellsuspension wurden dann auf entsprechenden Selektivplatten ausplattiert. ERGEBNISSE 78 4 Ergebnisse 4.1 Die MRSA-Kollektive Die Kollektive KK-99, KK-01, KK-02, KK-03 und KK-04 stammen aus der bakteriologischen Abteilung des Zentrallabors des Klinikums Kassel und stellen einen bestimmten Teil der über einen Zeitraum von jeweils einem viertel Jahr in der Routinediagnostik angefallenen MRSA-Stämme dar. Das Klinikum Kassel ist das größte kommunale Krankenhaus Hessens und befindet sich in der nordhessischen Stadt Kassel, die ca. 200000 Einwohner hat. Das Krankenhaus verfügt über 1139 Betten in 24 Kliniken und Instituten, in denen jährlich ca. 45000 stationäre und 140000 ambulante Patienten behandelt werden. Im Zentrallabor werden neben den klinikeigenen Proben auch einige von externen Einsendern untersucht. Solch externe Proben wurden teilweise ebenfalls in die Untersuchungen mit einbezogen. Der Schwerpunkt dieser Arbeit lag jedoch auf den klinikinternen Proben. Die Art von Untersuchungsmaterial aus dem die MRSA-Stämme kultiviert wurden, stellt die übliche Bandbreite von bakteriologischen Probenahmen dar. Neben vielen Wundabstrichen verschiedenster Körperregionen und Verletzungen, stammen die MRSA aus Urinproben, Punktaten, Blutproben, ferner aus Untersuchungen von Materialen wie z.B. Kathetern. Bei der Zusammenstellung der Kollektive wurde darauf geachtet, dass nur Stämme in die Untersuchungen einbezogen wurden, die aus Patientenuntersuchungen stammen. Bei MRSA-Screenings detektierte MRSA u.ä. wurden nach Möglichkeit nicht mit in das Kollektiv aufgenommen. Ebenso wurde darauf geachtet, dass nicht zwei MRSA von der gleichen Patientenprobe bzw. von zeitlich sehr nahe liegenden Proben eines Patienten mit einbezogen wurden. Neben den Kollektiven aus dem Klinikum Kassel wurden des Weiteren MRSA- Stämme aus einem Diagnostiklabor in Kassel bearbeitet, welches Proben von niedergelassenen Ärzten und diversen hessischen medizinischen Einrichtungen bearbeitet. Hierbei wurden Stämme aus dem Jahr 2003 untersucht. ERGEBNISSE 79 Die Kollektive umfassen MRSA-Stämme, die während des gewählten Probenahmezeitraumes in der Routinediagnostik identifiziert wurden. Sie stellen somit weder die Gesamtzahl der vorkommenden MRSA eines Probenahmeortes zum gewählten Zeitpunkt noch eine gezielte Auswahl von MRSA-Stämme mit bestimmten Eigenschaften dar. Eine genauere Aufschlüsselung der Herkunft der Untersuchungsmaterialen sind den Tab. 6 und Tab. 7 zu entnehmen. Die Eigenschaft der Methicillin-Resistenz wurde sowohl phäno- als auch genotypisch nach Erhalt der Stämme überprüft und bei allen Stämmen bestätigt. Tab. 6 Herkunftsorte der untersuchten MRSA-Stämme. Klinik Abk. Ort Betten Klinikum Kassel KKS Kassel 1139 Diakonie-Gesundheitszentrum Kassel Diakonissen Krankenhaus DIAKS Burgfeld Krankenhaus BFKS Kassel 384 Elisabeth Krankenhaus ELKS Kassel 198 Orthopädische Klinik OKS Kassel 205 Asklepios Stadtklinik BW Bad Wildungen 180 Kreis-und Stadtkrankenhaus WIH Witzenhausen 201 Fachklinik für Lungenerkrankungen IMH Immenhausen 115 Hospital zum Heiligen Geist FR Fritzlar 150 Klinikum Homberg HOM Homberg/Efze 142 Klinikum Melsungen MEL Melsungen 96 Orthopädische Klinik Lichtenau HELI Hessisch Lichtenau 150 Klinikum Ziegenhain SZH Schwalmstadt-Ziegenhain 282 DRK Klinik Kaufungen KAU Kaufungen 100 Klinik Hoher Meißner BSA Bad Sooden-Allendorf 285 Kreisklinik Wolfhagen WH Wolfhagen 104 Rehaklinik Beiseförth BEI Malsfeld Beiseförth Kreiskrankenhaus Rotenburg ROT Rotenburg a.d. Fulda 193 Ambulanz, niedergelassene Ärzte EXT Kassel und Um- gebung ERGEBNISSE 80 Tab. 7 Anzahl Proben eines Jahres aller Herkunftsorte. 1999 2001 2002 2003 2004 KKS 58 58 76 31 81 andere in KS DIAKS 36 ELKS 28 BFKS 2 OKS 1 1 außerhalb KS BW 16 IMH 18 WIH 16 FR 8 4 1 SZH 2 1 9 MEL 1 1 4 HOM 2 1 1 HELI 2 2 KAU 5 BSA 3 BEI 1 ROT 1 Externe Externe 18 KS-Externe 4 2 2 4 ERGEBNISSE 81 4.2 Ergebnisse PCR-Untersuchungen Bei jedem PCR-Ansatz wurde stets eine Negativkontrolle ohne DNA-Zugabe und eine oder mehrere dem Versuchsansatz entsprechende Positivkontrollen mitgeführt. Waren diese nicht wie erwartet, was aber nur sehr selten der Fall war, wurde der PCR-Ansatz komplett wiederholt. Sämtliche PCRs mit den Erwartungen entprechenden Kontrollen wurden pro Stamm mindestens zweimal, oft dreimal, bei Unsicherheiten bzgl. des Ergebnisses bzw. bei widererwartend negativen PCR-Ergebnissen, auch öfter durchgeführt. Die meisten PCRs zur Untersuchung der MRSA-Stämme wurden wie unter 3.9.7.1 beschrieben mit Koloniesuspensionen statt präparierter DNA als Template durchgeführt. Die Anwendbarkeit dieser Methodik wurde überprüft. Dies geschah durch PCRs, besonders von Referenzstämmen, in denen präparierte aufgereinigte DNA und die beschriebenen Koloniesuspensionen vergleichend in allen PCR- Ansätzen verwendet wurden. Hierbei zeigte sich, dass die Koloniesuspensionen die gleichen Ergebnisse erzielten wie die aufgereinigten DNA-Proben. Auch die Qualitiät der PCR-Ergebnisse mit Koloniesuspensionen war gegenüber denen mit aufgereinigter DNA nicht vermindert. Bei Stämmen die unsichere oder aber besonders interessante Ergebnisse zeigten, wurde dennoch zusätzlich auch aufgereinigte DNA untersucht. ERGEBNISSE 82 4.2.1 SCCmec-Typisierung nach Oliveira u. Lencastre [2002] Die PCR ließ sich zumeist gut durchführen, so dass man anhand des entstehenden Bandenmusters die Stämme einem SCCmec-Typ zuordnen konnte. Nur bei wenigen Stämmen gelang dies nicht. Bei diesen Stämmen wurde eine weitere Unterteilung in drei Gruppen vorgenommen. Zu der Gruppe der „nicht genau zuordenbaren“ (SCC-NN) Stämme wurden solche gezählt, die zwar in der PCR für bestimmte SCCmec-Typen charakteristische Banden erzeugten, jedoch nicht alle für einen bestimmten Typ erforderlichen, so dass die Zuordnung nicht eindeutig erfolgen konnte. Im Gegensatz dazu konnten aus den PCR-Ergebnissen der Stämme die zur Gruppe „kein SCCmec-Typ“ (SCC-neg) gezählt wurden, auch nicht annäherungsweise SCCmec-Typen abgeleitet werden, da z.B. gar keine Banden außer der Kontrollbande für mecA vorhanden waren. Die dritte Gruppe der Stämme die nicht mit dem Auswertungsschema der PCR- Methode zu erfassen waren, nimmt eine Sonderstellung ein. Diese Gruppe, „SCCmec IA/II“, tauchte mit einem bestimmten PCR-Bandenmuster auffällig häufig und stets reproduzierbar in fast allen Kollektiven auf, so dass dieser SCCmec-Typ im Weiteren als ein eigenständiger Typ betrachtet und diskutiert wurde. Die Abbildungen Abb. 6 bis Abb. 9 zeigen beispielhaft Bilder von Agarosegelen der PCR nach Oliveira u. Lencastre [2002]. Abb. 6 zeigt ein typisches Agarosegel mit den Ergebnissen der Untersuchung von Stämmen aus dem Jahre 1999, welche zu einem großen Teil SCCmec I zeigen, des Weiteren sind zwei Stämme mit dem Bandenmuster für SCCmec IA zu sehen und ein nicht zuordenbares Ergebnis. In Abb. 7 ist zum Vergleich ein typisches Ergebnisbild für MRSA aus dem Jahr 2004 zu sehen, welche zumeist SCCmec IV besitzen. Abb. 7 zeigt ebenfalls ein Beispiel für das Bandenmuster von SCCmec II, eines von SCCmec III ist in Abb. 8 zu sehen. Bei SCCmec IIIA würde die Bande für Locus H fehlen, bei SCCmec IIIB die der Loci E ,F und H. ERGEBNISSE 83 Abb. 6 SCCmec-Typisierung nach Oliveira u. Lencastre [2002] einer Auswahl von MRSA aus KKS-99. Links: Hauptsächlich nachgewiesene Loci. Im Bild: Als Gegensatz dazu gekennzeichnet der Locus F. KKS-99-23 gehört zu den Stämmen mit nicht einem SCCmec-Typ zuordenbaren Ergebnis. KKS-99-8 und KKS-99-9 zeigen SCCmec IA, die restlichen Stämme SCCmec I. K-neg = PCR-Negativkontrolle. M = Marker. Rechts: Fragmentgrößen Marker - DNA Ladder Mix (MBI). Agarosegel: 2,5 % TBE, 150 V, 2 h. Abb. 7 SCCmec-Typisierung nach Oliveira u. Lencastre [2002] einer Auswahl von MRSA aus KKS-04. Links: Fragmente der nachgewiesenen Loci der Probe KKS-04- 48 mit SCCmec II. Die restlichen Stämme zeigen SCCmec IV. K-neg = PCR- Negativkontrolle. M = Marker. Rechts: Fragmentgrößen Marker - DNA Ladder Mix (MBI). Agarosegel: 2,5 % TBE, 130 V, 3 h. ERGEBNISSE 84 Abb. 8 SCCmec-Typisierung nach Oliveira u. Lencastre [2002] einer Auswahl von MRSA aus KKS-01 und KKS-02. Links: Fragmente der nachgewiesenen Loci der Probe KKS-01-42 mit SCCmec III. KKS-02-2, KKS-02-1 und KKS-02-30 zeigen SCCmec I, die restlichen Stämme SCCmec IV. M = Marker. Rechts: Fragmentgrößen Marker - DNA Ladder Mix (MBI). Agarosegel: 2,5 % TBE, 120 V, 4,5 h. Abb. 9 SCCmec-Typisierung nach Oliveira u. Lencastre [2002] durchgeführt in Form von PCRs mit jedem Primerpaar einzeln. Über den Geltaschen ist angegeben bei welchem SCCmec-Typ das Fragment des jeweiligen Primerpaares erscheint (s.a. 3.9.7.5). Befüllung der Geltaschen, 1-8: KKS-02-6 (SCCmec IA/II), 10-17: KKS-02-28 (SCCmec IVA), 19-26: KKS-02-33 (SCCmec IA/II), 27-34: FR-02-2 (SCCmec IVA), 36-43: KKS-02-27 (NN), 45-52: KKS-02-51 (NN). M = Marker. Links Fragmentgrößen Marker - FastRuler DNA Ladder, Low Range (MBI); Rechts: Fragmentgrößen Marker - O’RangeRuler 200 bp Ladder (MBI). .Agarosegel: 2,5 % TBE, 120 V, ~2 h. ERGEBNISSE 85 Aufgrund der bei einigen Stämmen vorhanden Schwierigkeiten bei der Zuordnung zu einem SCCmec-Typ wurden einige Stämme nicht im Multiplex-PCR-Ansatz untersucht, sondern die Primerpaare in PCR-Einzelreaktionen eingesetzt. Dies war besonders für die Stämme die das Muster SCCmec IA/II ergaben interessant. Auch in solchen Einzelreaktionsansätzen ließ sich das SCCmec IA/II- Muster bei allen fraglichen Stämmen reproduzieren, Abb. 9 zeigt das Agarosegel auf diese Weise untersuchter Stämme. Es ist dort zweimal ein Stamm mit SCCmec IA/II zu sehen, zwei mit SCCmec IVA und zwei mit keinem SCCmec-Typ zuordenbaren Banden. Die Gesamtheit der untersuchten Stämme ließ sich wie in Abb. 10 dargestellt den durch die angewandte Methode definierten SCCmec-Typen zuordnen. Man erkennt in Abb. 10, dass SCCmec IV der überwiegend vorkommende SCCmec- Typ ist, der bei 60 % aller untersuchten MRSA-Stämme nachweisbar war, zusätzlich bei 2 % der Stämme in der Variante SCCmec IVA. Von den bekannten mit der PCR nach Oliveira u. Lencastre erfassbaren SCCmec-Typen kam in größerer Häufigkeit des Weiteren nur SCCmec I bei 13 % der MRSA vor. Interessant ist, dass der nicht im Klassifizierungsschema der PCR vorgesehene, in der vorliegenden Arbeit als SCCmec IA/II benannte SCCmec-Typ bei 8 % der untersuchten Stämme vorkam. Die übrigen SCCmec kamen nur selten vor, so SCCmec IA bei 3 %, SCCmec II bei 2 %, SCCmec III bei 3 %, SCCmec IIIA bei 1 % aller untersuchten MRSA. neg 1% SCC II 2% SCC III 3% SCC IIIA 1% SCC IVA 2% NN 4% SCC I 13% SCC IA 3% IA/II 8% SCC IV 63% Abb. 10 SCCmec-Typisierung nach Oliveira u. Lencastre [2002]. Ergebnis aller untersuchten Stämme (n=501) aus dem Klinikum Kassel und anderen Kollektiven. ERGEBNISSE 86 4.2.2 Bestimmung der dru-Anzahl in der HVR Abb. 11 Bestimmung der dru-Anzahl in der HVR [Nishi et al., 1995] von MRSA aus 2002. M = Marker. Links: Fragmentgrößen Marker - DNA Ladder Mix (MBI). Rechts: Den zu sehenden Amplifikatgrößen entsprechende dru-Anzahlen (611bp = 11 dru, 571 bp = 10 dru, 491 bp = 8 dru). Agarosegel: 1 % TBE, 100 V, ~2 h. neg 18% 7 dru 3% 8 dru 9% 10 dru 3%11 dru 67% Abb. 12 Bestimmung der dru-Anzahl in der HVR [Nishi et al., 1995]. Ergebnis aller untersuchten Stämme (n=501) aus dem Klinikum Kassel und anderen Kollektiven. neg = negative PCR, d.h. kein Amplikon. Am häufigsten nachgewiesen werden konnten bei 67 % aller untersuchten MRSA 11 drus, gefolgt von 8 drus (9 %), 7 drus und 10 drus mit je 3 %. Auffallend hoch ist der Anteil von 18 % der Stämme die kein PCR-Ergebnis lieferten, da sie keinerlei Amplifikat zeigten. Auch in Abb. 11 sind einige dieser Stämme zu sehen, bei denen die angewandte PCR keine Ergebnisbanden erzeugte. ERGEBNISSE 87 4.2.3 Bestimmung von ccrA1, ccrA2, ccrA3 und ccrC Abb. 13 Multiplex-PCR zur Bestimmung von ccrA1, ccrA2 oder ccrA3 [Okuma et al., 2002] aller MRSA aus 2004. K-… = PCR-Kontrollen. M-… = Marker. Links: Fragmentgrößen Marker - Fast Ruler DNA Ladder, High Range (MBI). Agarosegel: 1 % TBE, 90 V, ~1,5 h. ccrA3 3% ccrC 0% neg 12% ccrA1 7% ccrA2 78% Abb. 14 Bestimmung von ccrA1, ccrA2, ccrA3 oder ccrC nach Okuma et al. [2002] und Ito et al. [2004]. Ergebnis aller untersuchten Stämme (n=501) aus dem Klinikum Kassel und anderen Kollektiven. neg= negative PCR, d.h. kein Amplikon. ERGEBNISSE 88 Bei 78 % aller untersuchten Stämme ließ sich ccrA2 nachweisen, ccrA1 kam nur bei 7 % und ccrA3 bei 3 % der untersuchten MRSA vor. Bei keinem Stamm wurde ccrC alleine nachgewiesen. Jedoch zeigten wie erwartet Stämme mit ccrA3 zusätzlich ein positives Signal für ccrC (s. 3.9.7.7). Da aber der alleinige Nachweis von ccrC ausschlaggebend für SCCmec V gewesen wäre, wird auf die Darstellung des Nachweises von ccrC in Kombination mit ccrA3 aus Gründen der Übersichtlichkeit hier und im Folgenden verzichtet. 12 % der Stämme zeigten keinerlei Amplifikat, so dass keiner der untersuchten ccr- Typen bestimmt werden konnte. 4.2.4 Nachweis von Antibiotikaresistenzgenen mittels Multiplex PCR nach Strommenger et al. [2003] Abb. 15 Multiplex-PCR zum Nachweis von Antibtiotikaresistenzgenen [Strommenger et al., 2003] bei MRSA aus KKS-99. M = Marker. Rechts: Fragmentgrößen des Markers - DNA Ladder Mix (MBI). Links: Den Amplifikaten entsprechende Gene. Agarosegel: 2,5 % TBE, 120 V, 1,5 h. Abb. 16 Multiplex-PCR zum Nachweis von Antibtiotikaresistenzgenen [Strommenger et al., 2003] bei MRSA aus KKS-04. M = Marker. Links: Fragmentgrößen des Markers - DNA Ladder Mix (MBI). Rechts: Den Amplifikaten entsprechende Gene. Agarosegel: 2,5 % TBE, 120 V, 3 h. ERGEBNISSE 89 21% 38% 34% 5% 21% 4% 2% 0 10 20 30 40 50 aacA-aphD ermA ermC tetK tetM vatA vatB pr oz en tu al e H äu fig ke it R es is tz en zg en Abb. 17 Häufigkeit der mittels Multiplex-PCR nach Strommenger et al. [2003] nachgewiesenen Antibiotikaresistenzgene. Ergebnis aller untersuchten Stämme (n=501) aus dem Klinikum Kassel und anderen Kollektiven. Die Häufigkeiten der nachgewiesenen Antibiotikaresistenzgene sind Abb. 17 zu entnehmen. Am häufigsten nachweisbar waren die Resistenz gegen Makrolide vermittelnden Gene, ermA mit 38 % und ermC mit 34 %. Das für das bifunktionale Enzym AAC(6’)-APH(2’’) kodierende Gen aacA-aphD kam bei 21 % der Stämme vor. Bei den beiden Tetracyclinresistenzgenen tetK und tetM zeigten sich deutliche Unterschiede in der Häufgkeit des Vorkommens. TetK vermittelt einen aktiven Efflux des Tetracyclins und trat bei 5 % aller untersuchten MRSA auf. TetM kodiert eine Targetveränderung durch Schutz der Ribosomen und war bei 21 % aller untersuchten MRSA nachweisbar. Am seltensten waren vatA mit 4 % und vatB mit 2 %, die beide für eine Acetyltransferase zur Inaktivierung von Streptograminen kodieren. In Abb. 18 ist die Häufigkeit des Vorkommens mehrerer Resistenzgene bei einem Stamm dargestellt. ERGEBNISSE 90 0 RG 28,1% 1 RG 37,5% 2 RG 21,4% 6 RG 1,8% 3 RG 9,2% 5 RG 0,2%4 RG 1,8% Abb. 18 Häufigkeit der Anzahl von Resistenzgenen bei einem MRSA-Stamm. Laut Nachweis der Resistenzgene aacA-aphD, ermA, ermC, tetK. tetM, vatA und vatB mittels Multiplex-PCR nach Strommenger et al. [2003]. Dargestellt ist die Anteiligkeit von Stämmen mit einer bestimmten Anzahl von Resistenzgenen an allen untersuchten Stämmen (n=501) aus dem Klinikum Kassel und anderen Kollektiven. RG = Resistenzgene Bei 28,1 % der Stämme war keines der untersuchten Resistenzgene nachweisbar. Die maximale Anzahl von Resistenzgenen lag bei sechs und kam bei 1,8 % der Stämme (n=9) vor. Somit konnten bei keinem Stamm alle möglichen Gene dieses PCR-Ansatzes detektiert werden. Selten vorkommend waren auch fünf (0,2 %) und vier (1,8 %) Resistenzgene. Drei Resistenzgene konnten bei 9,2 % der Stämme nachgewiesen werden, zwei bei 21,4 %. Der mit 37,5 % größte Anteil der resistenzgenhaltigen MRSA-Stämme besaß somit nur eins der untersuchten Resistenzgene. ERGEBNISSE 91 4.2.5 Nachweis von Toxingenen mittels Multiplex-PCRs nach Becker et al. [1998, 2003] und PCR für lukF nach O’Brien et al. [2004] Abb. 19 Multiplex-PCR zum Nachweis der Enterotoxingene sea, seb, sec, sed, see (oben) und seg, seh, sei und sej (unten) nach Becker et al. [1998, 2003] von MRSA aus 2003. K-neg = Negativkontrolle, K-pos = Positivkontrolle. M = Marker. Rechts oben/unten: Den Amplifikaten entsprechende Gene. Agarosegel: 2,5 % TBE, 150 V, ~ 2 h. Die Häufigkeit der nachgewiesenen Toxingene ist in Abb. 20 dargestellt. Am häufigsten kamen die Enterotoxingene seg und sei vor, dies mit gleicher Häufigkeit von 79 %. Auch sed und sej kamen ähnlich häufig vor, jedoch nur bei 11 % bzw. 13 % der Stämme. Dritthäufigstes Toxingen war sec mit 47 %. Alle anderen untersuchten Toxingene kamen bei unter 5 % der Isolate vor, die beiden Exfoliativtoxine eta und etb bei keinem der untersuchten MRSA. Das Vorkommen von mehreren Toxingenen bei einem Stamm ist aus Abb. 21 zu entnehmen. ERGEBNISSE 92 Die maximale Anzahl von Toxingenen bei einem MRSA lag in der vorliegenden Arbeit bei vier der zwölf untersuchten Gene. Dies kam bei 11 % der Stämme vor. Fast die Hälfte (48 %) der Isolate hatte drei Toxingene, 24 % zwei und 8 % nur eines der hier nachweisbaren. Bei 11 % der MRSA konnte keines dieser Toxingene detektiert werden. 1%0%0% 2% 13%79% 3% 79% 2% 11%47% 2% 4% 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 sea seb sec sed see seg seh sei sej tst eta etb luk pr oz en tu al e H äu fig ke it To xi ng en Abb. 20 Vorkommen der mittels Multiplex-PCRs für sea, seb, sec, sed, see, seg, seh, sei, sej, eta, etb und tst nach Becker et al. [1998, 2003] und PCR für lukF nach O’Brien et al. [2004] nachgewiesenen Toxingene bei allen untersuchten Stämmen (n=501) aus dem Klinikum Kassel und anderen Kollektiven. 3 TG 48% 4 TG 11% 0 TG 9% 1 TG 8% 2 TG 24% Abb. 21 Häufigkeit der Anzahl von Toxingenen bei einem Stamm laut Nachweis der Gene sea, seb, sec, sed, see, seg, seh, sei, sej, eta, etb und lukF mittels Multiplex-PCR nach Becker et al. [1998, 2003] und PCR nach O’Brien et al. [2004]. Dargestellt ist die Anteiligkeit von Stämmen mit einer bestimmten Anzahl von Toxingenen an allen untersuchten Stämmen (n=501) aus dem Klinikum Kassel und anderen Kollektiven. TG= Toxingene ERGEBNISSE 93 4.2.6 Zusammenhang des Vorkommens von Antibiotikaresistenzgenen und Toxingenen Der Zusammenhang zwischen dem Vorkommen von Antibiotikaresistenzgenen und Toxingenen ist in Abb. 22 dargestellt. 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% 0 RG 1 RG 2 RG 3 RG 4 RG 5 RG 6 RG 4 TG 3 TG 2 TG 1 TG 0 TG Abb. 22 Zusammenhang zwischen Resistenzgengehalt und Toxingengehalt aller untersuchten Stämme (n=501). Basierend auf dem Nachweis der Gene sea, seb, sec, sed, see, seg, seh, sei, sej, eta, etb, luk und aacA-aphD, ermA, ermC, tetK, tetM, vatA, vatB nach Strommenger et al. [2003], Becker et al. [1998, 2003], O’Brien et al. [2004]. Bei MRSA ohne eines der untersuchten Resistenzgene war der Anteil der Stämme ohne eines der Toxingene mit 17,0 % am höchsten. Bei der Gruppe der Stämme mit einem Resistenzgen lag er bei 3,2 %, bei der mit zwei bei 8,4 %, bei der mit drei bei 15,2 %, bei den anderen bei Null. Die Gruppe der Stämme mit einem Toxingen zeigt sich bei Stämmen mit ein bis vier Resistenzgenen mit einem Anteil von je 3,5 %, 6,4 %, 14,0 % und 13,0 %. Zwei Toxingene kamen am häufigsten bei Stämmen mit zwei, drei oder vier Resistengenen vor, der Anteil lag hier bei 39,2 %, 36,9 % und 44,4 %. Über die Hälfte der Stämme mit nur einem oder gar keinem Resistenzgen hatte je drei Toxingene, ebenso der einzige Stamm mit fünf Resistenzgenen. Auffallend ist, dass sieben der neun Stämme mit der hier maximalen Anzahl von sechs Resistenzgenen auch die hier vorkommende maximale Anzahl von vier Toxingenen zeigten. Insgesamt wird deutlich, dass bei den untersuchten Stämmen mit der Anzahl der Resistenzgene auch die Zahl der Toxingene stieg. ERGEBNISSE 94 Abb. 23 zeigt diesen Zusammenhang noch einmal in umgekehrt dargestellter Abhängigkeit. Auch hier zeigt sich, dass Stämme mit mehreren Toxingenen häufiger auch mehrere Resistenzgene besaßen. 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% 0 TG 1 TG 2 TG 3 TG 4 TG pr oz en tu al er A nt ei l A nz ah l a n R es is te nz ge ne n an K ol le kt iv 6 RG 5 RG 4 RG 3 RG 2 RG 1 RG 0 RG Abb. 23 Zusammenhang zwischen Toxingengehalt und Resistenzgengehalt aller untersuchten Stämme (n=501). Basierend auf Nachweis der Gene sea, seb, sec, sed, see, seg, seh, sei, sej, eta, etb, lukF und aacA-aphD, ermA, ermC, tetK, tetM, vatA und vatB nach Strommenger et al. [2003], Becker et al. [1998, 2003], O’Brien et al. [2004]. ERGEBNISSE 95 4.3 Vergleich der Kollektive aus dem Klinikum Kassel 4.3.1 SCCmec-Typisierung nach Oliveira u. Lencastre [2002] 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% KKS - 99 KKS - 01 KKS - 02 KKS - 03 KKS - 04 pr oz en tu al e A nt ei le S C C T yp en a n K ol le kt iv SCC neg SCC NN SCC IA/II SCC IV A SCC IV SCC IIIA SCC III SCC II SCC IA SCC I Abb. 24 SCCmec-Typisierung mittels Multiplex-PCR nach Oliveira u. Lencastre [2002]. Vergleich der Anteile der SCCmec-Typen an den Kollektiven des Klinikums Kassel der Jahre 1999-2004 (KKS–99 – KKS-04). Erläuterungen zur Eingruppierung s. 4.2.1. Abb. 24 zeigt die Ergebnisse der SCCmec-Typisierung nach Oliveira u. Lencastre [2002] zur besseren Vergleichbarkeit der unterschiedlich umfangreichen Kollektive als gestapelte Säulen mit Prozentangaben. In dieser Abbildung ist zu erkennen, dass im Laufe der Zeit eine Veränderung der Anteiligkeiten der SCCmec-Typen stattgefunden hat. Während in KKS - 99 noch SCCmec I zusammen mit SCCmec IA mit 50 % am häufigsten war, kommen diese SCCmec-Typen in den Kollektiven ab 2001 kaum noch vor. So ist SCCmec I in Kollektiv KKS - 01 gar nicht und SCCmec IA nur mit 5,2 % vorhanden. Die Prozentwerte für die Kollektive der Jahre 2002 (SCCmec I: 7,9 %, SCCmec IA: 3,9 %), 2003 (SCCmec I: 6,5 %) und 2004 (SCCmec I: 3,7 %) sind ähnlich gering. Vorherrschender SCCmec-Typ der Kollektive aus den jüngsten Jahren ist SCCmec IV mit 63,2 % bis 87,0 % welcher in KKS-99 im Vergleich dazu mit 15,5 % eher selten zu finden war. Zusätzlich kommt die Variante SCCmec IVA bei KKS - 01 und KKS - 02 vor, dies mit 34,0 % bzw. 5,3 %. ERGEBNISSE 96 Ebenso auffällig ist, dass sich SCCmec IIIA nur in KKS - 99 nachweisen ließ, dies zu 10,3 %. SCCmec III konnte nur in KKS – 99 (12,1 %) und KKS - 01 (10,2 %) nachgewiesen werden. SCCmec II scheint über die Jahre hin, mit maximal 5,2 % bei KKS – 99, unverändert selten zu sein und kommt in KKS – 01 und KKS – 02 gar nicht vor. Der zumeist geringe Teil der laut der durchgeführten Untersuchung nicht oder aufgrund unterschiedlicher Ergebnisse nur unsicher einem SCCmec-Typ zuordenbaren Stämme ist in Abb. 24 ebenfalls dargestellt (Erläuterungen zur Einteilung s. 4.2.1). 4.3.2 Bestimmung der dru-Anzahl in der HVR 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% KKS - 99 KKS - 01 KKS - 02 KKS - 03 KKS - 04 pr oz en tu al er A nt ei l d ru A nz ah l i n H VR a n K ol le kt iv neg 11 drus 10 drus 8 drus 7 drus Abb. 25 Bestimmung der dru-Anzahl in der HVR mittels PCR nach Nishi et al. [1995]. Vergleich der Ergebnisse der Kollektive des Klinikums Kassel der Jahre 1999- 2004 (KKS–99 – KKS-04). neg = PCR ohne Amplifikat. Die mittels der PCR nach Nishi et al. [1995] ermittelte Anzahl von drus in der HVR von SCCmec ist in Abb. 25 dargestellt. Diese grafische Darstellung zeigt in Bezug auf die Häufigkeiten der Anzahl von drus bei den Kollektiven Ähnlichkeiten zu Abb. 24 über die Häufigkeit der SCCmec-Typen. Auch hier lässt sich eine Veränderung der Häufigkeiten beobachten. So ließen sich bei 38 % der Stämme aus KKS - 99 8 drus nachweisen, während in den Kollektiven aus den folgenden Jahren diese Anzahl von drus nur noch selten (3-4 %) vorkam, bei KKS - 01 gar nicht. ERGEBNISSE 97 Überwiegend vorkommend bei den Stämmen der Jahre 2001-2004 war eine Anzahl von 11 drus (KKS - 01: 58 %, KKS - 02: 73 %, KKS - 03: 90 %, KKS - 04: 79 %). In allen Kollektiven konnten nur selten 7 drus (0-9 %) oder 10 drus (2-9 %) detektiert werden. Dass die angewandte PCR nicht immer zur Vervielfältigung der Zielsequenz führte, lässt sich in der Grafik an denen für PCRs ohne Ergebnisbande stehenden Säulenteilen („neg“) erkennen, deren Anteil bis zu 21 % groß ist. 4.3.3 Nachweis von ccrA1, ccrA2, ccrA3 und ccrC 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% KKS - 99 KKS - 01 KKS - 02 KKS - 03 KKS - 04 pr oz en tu al er A nt ei l c cr T yp a n K ol le kt iv ccrC neg ccrA 3 ccrA 2 ccrA 1 Abb. 26 Bestimmung von ccrA1, ccrA2, ccrA3 und ccrC nach Okuma et al. 2002 und Ito et al. [2004]. Vergleich der Ergebnisse der Kollektive des Klinikums Kassel der Jahre 1999-2004 (KKS–99 – KKS-04). neg = PCR ohne Amplifikat. Auch wenn diese Methode allein nicht zur Typisierung der Stämme verwendet werden kann, sondern die anderen Methoden ergänzt, lässt sich an der Darstellung ihrer Ergebnisse in Abb. 26 ebenfalls eine Veränderung in den Kollektiven über die Jahre ablesen. Abb. 26 zeigt, dass bei KKS - 99 ccrA1, ccrA2 und ccrA3 in jeweils deutlichen Anteilen vorhanden waren, während hin zum jüngsten Kollektiv KKS - 04 die Anteile von ccrA2 und ccrA3 bis auf Null abnahmen. Der bisher nur bei SCCmec V beschriebene Typ ccrC ließ sich bei keinem der Stämme aus diesen Kollektiven alleine nachweisen, sondern nur in Kombination mit ccrA3. ERGEBNISSE 98 4.3.4 Vorkommen von Antibiotikaresistenzgenen 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 KKS - 99 KKS - 01 KKS - 02 KKS - 03 KKS - 04 Kollektiv pr oz en tu al e H äu fig ke it R es is te nz ge n aacA-aphD ermA ermC tetK tetM vatA vatB Abb. 27 Nachweis von Antibiotika-Resistenzgenen mittels Multiplex-PCR nach Strommenger et al. [2003]. Vergleich der Ergebnisse der Stämme der Kollektive des Klinikums Kassel von 1999 – 2004 (KKS–99 – KKS-04). Wie aus Abb. 27 ersichtlich wird, hat sich die Häufigkeit von Antibiotika- resistenzgenen innerhalb der Kollektive aus dem Klinikum Kassel im Laufe der Zeit teilweise sehr stark geändert hat. So war das Gen aacA-aphD in KKS - 99 bei einem sehr großen Teil der Stämme nachweisbar (84 %), während dies bei den späteren Kollektiven nur noch mit 14-32 % der Fall war. Ebenso kommt das in KKS - 99 zu 90 % detektierte ermA-Gen bei den KKS - 01 bis KKS - 04 mit 23-40 % wesentlich seltener vor. Hingegen konnte ermC bei den jüngeren Kollektiven mit deutlich steigender Häufigkeit nachgewiesen werden. So lag dessen Anteil in KKS - 99 nur bei 3 % und steigerte sich über 32 % bei KKS - 01, 19 % bei KKS - 02, 45 % bei KKS - 03 bis auf 67 % bei KKS - 04. PCR-Signale für tetK waren insgesamt selten, so erfolgte der Nachweis dieses Genes in den Kollektiven KKS - 99 und KKS - 03 gar nicht und bei KKS – 01 (9 %), KKS - 02 (4 %) und KKS – 04 (14 %) in eher geringem Maße. Auffällig ist die Häufigkeit von tetM, dessen Nachweis in größerem Umfang nur in KKS - 99 (40 %) und KKS - 04 (74 %) erfolgte. Die Gene vatA und vatB waren in den Kollektiven von 1999 bis 2003 nahezu gar nicht nachweisbar, lediglich 5 % der Stämme aus KKS – 01 zeigten sich vatA positiv. ERGEBNISSE 99 Beide Gene ließen sich lediglich in KKS – 04 gehäuft nachweisen (vatA: 15 %, vatB: 11 %). Betrachtet man die gesamte Grafik so fällt ferner auf, dass lediglich in KKS - 04 alle durch den PCR-Ansatz erfassbaren Resistenzgene nachgewiesen werden konnten. Ein ähnliches Bild zeigt sich nur bei KKS - 01, bei dem sechs der sieben Resistenzgene detektierbar waren, allerdings zum Teil in wesentlich geringerem Umfang als bei KKS - 04. Bei den verbleibenden Kollektiven KKS - 99, KKS - 02 und KKS - 03 konnten nur für vier der möglichen Resistenzgene Signale erhalten werden. Das Auftreten von Mehrfachresistenzen bei den Stämmen der Kollektive aus dem Klinikum Kassel ist in Abb. 28 dargestellt. 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% KKS - 99 KKS - 01 KKS - 02 KKS - 03 KKS - 04 pr oz en tu al er A nt ei l A nz ah l R es is te nz ge ne a n K ol le kt iv 6 RG 5 RG 4 RG 3 RG 2 RG 1 RG 0 RG Abb. 28 Ausprägung der Multiresistenz der Kollektive des Klinikums Kassel der Jahre 1999-2004 (KKS–99 – KKS-04). Ermittelt anhand der Ergebnisse des Nachweises der Antbiotikaresistenzgene aacA-aphD, ermA, ermC, tetK, tetM, vatA und vatB mittels Multiplex-PCR nach Strommenger et al. [2003]. RG = Resistenzgene. Man kann dieser Abbildung entnehmen, dass auch in Bezug auf die Anzahl von Antibiotikaresistenzgenen bei einem Stamm bei den Kollektiven Unterschiede bestehen. Bei KKS - 99 besaß kein Stamm mehr als vier der getesteten Resistenzgene, die Mehrheit der Stämme zwei (45 %) oder drei (34 %). Der Anteil der Stämme die keines der Resistenzgene besaßen betrug bei KKS - 99 6,9 %. Dieser Anteil ist bei KKS - 01 und KKS - 02 mit 46,6 % und 39,5 % deutlich höher. Bei KKS - 03 ERGEBNISSE 100 wiederum geringer, aber mit 22,6 % dennoch groß im Gegensatz zu KKS - 99 und KKS - 04. Bei KKS - 01 stellen die Isolate ohne eines der Resistenzgene die größte Gruppe dar, gefolgt von Stämmen mit einem der Resistenzgene (36 %) und zwei Resistenzgenen (26 %). Drei Resistenzgene besaß keiner der Stämme, vier kamen bei 5,2 % vor, mehr Resistenzgene kamen, ebenso wie bei KKS - 99, nicht vor. Bei KKS - 02 ist der Anteil der Stämme mit einem der Resistenzgene mit 43 % am umfangreichsten. Somit hat der große Teil von 80 % der Stämme dieses Kollektivs nicht mehr als eines der untersuchten Resistenzgene, zwei konnten bei 16 %, drei bei nur 3,9 % nachgewiesen werden. Mehr als drei der Resistenzgene kamen bei keinem der Stämme aus KKS - 02 vor. Dies ist bei KKS - 03 des Folgejahres zwar ebenso, jedoch waren hier die anderen Anteile etwas in Richtung des häufigeren Vorkommens von Resistenzgenen hin verschoben. Wesentlich deutlicher ist eine solche Verschiebung bei KKS - 04 zu sehen. Hier haben nur 2,5 % der Stämme keines der Resistenzgene, während der größte Teil (43 %) zwei besitzt. Auffällig ist bei diesem Kollektiv das Vorkommen von Stämmen mit bis zu sechs der Resistenzgene. Dieser Anteil ist mit 8,6 % der größte der Stämme mit mehr als drei Resistenzgenen, vier kamen bei 3,7 %, fünf bei 1,2 % vor. 4.3.5 Vorkommen von Toxingenen 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 KKS - 99 KKS - 01 KKS - 02 KKS - 03 KKS - 04 pr oz en tu al e H äu fig ke it To xi ng en sea seb sec sed see seg seh sei sej tst eta etb luk Abb. 29 Nachweis von Toxingenen mittels Multiplex-PCR nach Becker et al. [1998, 2003] und PCR für lukF nach O’Brien [2004]. Vergleich der Ergebnisse der Stämme der Kollektive des Klinikums Kassel von 1999 – 2004 (KKS–99 – KKS-04). ERGEBNISSE 101 Alle Ergebnisse der PCR-Untersuchungen zu Toxingenen bei den Kollektiven aus dem Klinikum Kassel sind in Abb. 29 zusammengefasst. Man kann aus ihr erkennen, dass lediglich die aus medizinischer Sicht weniger bedeutsamen Gene der Enterotoxine SEC, SEG und SEI in starkem Maße vorkamen. Die Gene der Exfoliativtoxine A und B konnten in keinem der Kollektive nachgewiesen werden. Das für die Kodierung von Toxic Shock Syndrome Toxin 1 verantwortliche tst wurde nur in vier Stämmen aus KKS - 99 gefunden. Das für Panton-Valentine Leukozidin mitkodierende lukF nur bei drei Stämmen aus KKS - 02. Die Häufigkeiten der Gene der Entertoxine A, B, C, D, E, G, H, I und J stellen sich wie folgt dar: Die Gene der medizinisch bedeutsamsten Enterotoxine A, B und E wurden bei KKS - 99, KKS - 02 und KKS - 03 nachgewiesen. Deutlich hoch im Vergleich der Kollektive ist hierbei das Vorkommen von sea in KKS - 99 mit 24 %, in KKS - 02 lag dieser Anteil bei 4 %, in KKS - 03 bei 13 %. Das Gen seb war bei 7 % der Stämme aus KKS - 99 und bei 4 % der Stämme aus KKS - 02 vorhanden. Der Anteil der see tragenden MRSA war in KKS - 03 mit 13 % am höchsten, die weiteren Häufigkeiten dieses Genes beliefen sich auf 2 % in KKS - 99, 4 % in KKS - 02 und 1 % in KKS - 04. Sec konnte in allen Kollektiven außer KKS - 99 nachgewiesen werden, in allen anderen Kollektiven war der Anteil mit 54–77 % eher hoch. Das Vorkommen von sed war insgesamt eher gering. In KKS - 03 war keiner der Stämme sed-positiv, während das Vorkommen bei den restlichen Kollektiven zwischen 9 % und 15 % lag. Seg und sei kamen innerhalb eines Kollektivs stets in einer sehr ähnlichen Häufigkeit vor, wobei die Werte in den Kollektiven aus 2001 - 2004 bei ca. 80 % bis zu 98 % lagen und nur im KKS - 99 mit 48 % bzw. 41 % deutlich geringer waren. Der Nachweis von seh erfolgte wenn überhaupt in nur sehr geringer Zahl, so in KKS - 99 mit 3 % und KKS - 02 mit 4 %. Sej hingegen konnte in allen Kollektiven mit einer ähnlichen Häufigkeit detektiert werden, diese lag zwischen 9 % und 15 %. ERGEBNISSE 102 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% KKS - 99 KKS - 01 KKS - 02 KKS - 03 KKS - 04 pr oz en tu al er A nt ei l A nz ah l a n To xi ng en en p ro S ta m m a n K ol le le kt iv 4 TG 3 TG 2 TG 1 TG 0 TG Abb. 30 Vorkommen von mehreren Toxingenen bei Stämmen der Kollektive des Klinikums Kassel der Jahre 1999-2004 (KKS–99 – KKS-04). Ermittelt anhand der Ergebnisse des Nachweises der Gene sea, seb, sec, sed, see, seg, seh, sei, sej, tst, eta, etb, lukF mittels Multiplex-PCR nach Becker et al. [1998, 2003] und PCR für lukF nach O’Brien et al. [2004]. TG = Toxingene. Betrachtet man Abb. 30 so sieht man, dass keiner der Stämme mehr als vier der Toxingene besaß. Was weiterhin deutlich auffällt ist, dass die Anzahl der Stämme ohne eines der Toxingene von 19 % bei KKS - 99 über 10,3 % bei KKS - 01, 7,9 % bei KKS - 02, 3,2 % bei KKS - 03 bis auf Null bei KKS - 04 abnimmt. Der Anteil der Stämme mit drei der Toxingene nimmt hingegen im Laufe der Zeit ausgehend von 10 % bei KKS - 99 zu, wobei ihr Anteil mit 77 % bei KKS - 03 am größten ist. Bei KKS - 01, KKS - 02 und KKS - 04 liegt der Anteil mit 55 – 62 % in ähnlichen Bereichen. Die Maximalanzahl von vier nachgewiesenen der 13 untersuchten Toxingene kommt bei KKS - 02 mit 19,7 % am häufigsten vor, ähnlich hoch ist sie mit 15,5 % bei KKS - 01, während ihr Anteil bei KKS - 03 und KKS - 04 nur etwa halb so groß ist. Bei KKS - 99 besitzen nur 1,7 % der Stämme vier der Toxingene. ERGEBNISSE 103 4.4 Vergleich der Kollektive aus dem Klinikum Kassel mit denen anderer Probenahmeorte In Abb. 31 wurden die untersuchten Stämme der Jahre 1999-2004 nach ihren Probenahmeorten gruppiert. Für jedes der Untersuchungsjahre gab es auch einige Stämme die nicht aus Untersuchungsmaterial von Patienten des Klinikums Kassel stammen. Die Zusammensetzung der Gruppen ist Tab. 6 und Tab. 7 zu entnehmen. 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% KKS außerhalb KS andere in KS Externe pr oz en tu al e A nt ei le S C C T yp en a n K ol le kt iv SCC neg SCC NN SCC IA/II SCC IV A SCC IV SCC IIIA SCC III SCC II SCC IA SCC I Abb. 31 Vergleich der Häufigkeit von SCCmec-Typen nach Oliveira u. Lencastre [2002] bei MRSA-Stämmen des Klinikums Kassel mit denen anderer Herkunftsorte. Zusammensetzung der Gruppen s. Tab. 6, Tab. 7. Diese Art des Datenvergleichs verdeutlicht die Dominanz von SCCmec IV. Diese ist, betrachtet man die Jahre 1999-2004, nicht nur bei Isolaten aus dem Klinikum Kassel, sondern auch aus anderen Krankenhäusern Kassels und der Region Nordhessen, so wie bei Proben von niedergelassenen Ärzten und ambulanten Patienten zu beobachten. Neben SCCmec IV kommt lediglich SCCmec I in größeren Anteilen vor. Bei den Isolaten niedergelassener Ärzte und ambulanter Patienten wurde neben SCCmec IV ein geringer Anteil SCCmec IA nachgewiesen, der sonst nur bei Isolaten aus dem Klinikum Kassel vorkam. SCCmec III und SCCmec IIIA konnten nur selten detektiert werden und dies nur im Klinikum Kassel und aus Proben der Krankenhäuser der Region Nordhessen. ERGEBNISSE 104 Bei dieser Darstellungsweise muss allerdings beachtet werden, dass die Anzahl der Proben aus dem Klinikum Kassel mit n=304 sehr viel höher war als die der anderen Gruppen (außerhalb KS: n=100, andere in KS: n=67, Externe: n=30). Dennoch wird deutlich, dass es keine wesentlichen Unterschiede in der Zusammensetzung der SCCmec-Typen der unterschiedlichen Probenahmeorte gibt. Dies zeigt auch der Vergleich von ähnlich umfangreichen Kollektiven verschiedener Probenahmeorte aus dem Jahr 2003, der in Abb. 32 dargestellt ist. 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% KKS - 03 Bad Wildungen Immenhausen Witzenhausen KS Diakonissen KS Elisabeth Externe 03 pr oz en tu al e A nt ei le S C C T yp en a n K ol le kt iv SCC neg SCC NN SCC IA/II SCC IV A SCC IV SCC IIIA SCC III SCC II SCC IA SCC I Abb. 32 Vergleich der Häufigkeit von SCCmec-Typen nach Oliveira u. Lencastre [2002] bei MRSA-Stämmen des Klinikums Kassel mit denen anderer Herkunftsorte aus Kassel und der Region Nordhessen aus dem Jahr 2003. Zusammensetzung der Gruppen s. Tab. 6, Tab. 7. Auch hier wird deutlich, dass SCCmec IV absolut vorherrschend ist und daneben nur SCCmec I häufig nachgewiesen werden konnte. Auffällig ist der hohe Anteil des nicht im Klassifizierungsschema enthaltenen SCCmec IA/II bei den Isolaten aus der Asklepios Stadtklinik in Bad Wildungen. Die folgenden Diagramme Abb. 33 bis Abb. 36 mit den Ergebnissen der PCR- Untersuchungen zur Bestimmung der Anzahl von drus in der HVR und des ccr-Typs ergeben bei dieser Darstellungsweise, wie auch beim Vergleich der Kollektive nach Probenahmejahr, ein ähnliches Bild. ERGEBNISSE 105 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% KKS außer KS andere in KS externe pr oz en tu al er A nt ei l A nz ah l d ru s in H VR b ei K ol le kt iv neg 11 drus 10 drus 8 drus 7 drus Abb. 33 Vergleich der Häufigkeit der dru-Anzahl nach Nishi et al. [1995] bei MRSA-Stämmen des Klinikums Kassel (KKS) mit denen anderer Herkunftsorte. Zusammensetzung der Gruppen s. Tab. 6, Tab. 7. 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% KKS - 03 Bad Wildungen Immenhausen Witzenhausen KS Diakonissen KS Elisabeth Extern 03 pr oz en tu al er A nt ei l A nz ah l d ru s in H VR b ei K ol le kt iv neg 11 drus 10 drus 8 drus 7 drus Abb. 34 Vergleich der Häufigkeit der dru-Anzahl nach Nishi et al. [1995] bei MRSA-Stämmen des Klinikums Kassel mit denen anderer Herkunftsorte aus Kassel und der Region Nordhessen aus dem Jahr 2003. Zusammensetzung der Gruppen s. Tab. 6 und Tab. 7. ERGEBNISSE 106 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% KKS außer KS andere in KS externe pr oz en tu al er A nt ei l c cr T yp a n K ol le kt iv ccrC neg ccrA 3 ccrA 2 ccrA 1 Abb. 35 Vergleich der Häufigkeit der ccr-Typen nach Okuma et al. [2002] und Ito et al. [2004] bei MRSA-Stämmen des Klinikums Kassel mit denen anderer Herkunftsorte. Zusammensetzung der Gruppen s. Tab. 6, Tab. 7. 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% KKS - 03 Bad Wildungen Immenhausen Witzenhausen KS Diakonissen KS Elisabeth Extern 03 pr oz en tu al er A nt ei l c cr T yp a n K ol le kt iv ccrC neg ccrA 3 ccrA 2 ccrA 1 Abb. 36 Vergleich der Häufigkeit der ccr-Typen nach Okuma et al. [2002] und Ito et al. [2004] bei MRSA-Stämmen des Klinikums Kassel mit denen anderer Herkunftsorte aus Kassel und der Region Nordhessen aus dem Jahr 2003. Zusammensetzung der Gruppen s. Tab. 6, Tab. 7. ERGEBNISSE 107 Vergleicht man das Vorkommen von Antibiotikaresistenz- und Toxingenen auf diese Weise ergeben sich folgende Diagrammbilder (Abb. 37 bis Abb. 40). 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 KKS außerhalb KS andere in KS externe Kollektiv pr oz en tu al e H äu fig ke it R es is te nz ge n aacA-aphD ermA ermC tetK tetM vatA vatB Abb. 37 Vergleich der Häufigkeit von Antibiotikaresistenzgenen nach Strommenger et al. [2003] bei MRSA-Stämmen des Klinikums Kassel mit denen anderer Herkunftsorte. Zusammensetzung der Gruppen s. Tab. 6, Tab. 7. Abb. 37 zeigt die Häufigkeit von Antibiotikaresistenzgenen bei den MRSA des Klinikums Kassel im Vergleich zu der bei Isolaten aus anderen Probenahmeorten. Während die Häufigkeit von ermC und tetK bei allen hier verglichenen Gruppen nahezu gleich ist, zeigen sich bei den anderen Resistenzgenen zum Teil deutliche Unterschiede. So konnten bei den Isolaten aus dem Klinikum Kassel tetM und aacA- aphD mit 28 % bzw. 30 % nachgewiesen werden, bei den anderen Gruppen liegt der prozentuale Anteil dieser Gene bei maximal 14 %. ErmA kam bei Isolaten aus dem Klinikum Kassel zu 44 % vor, ähnlich hoch sind die Werte mit 34 % und 32 % bei der Gruppe der Isolate aus der Region Nordhessen und der Gruppe der externen Proben. Bei der Gruppe der anderen Krankenhäuser aus Kassel liegt der Wert für ermA bei lediglich 14 %. VatA- und vatB-positive Stämme kamen nur bei MRSA aus dem Klinikum Kassel und bei solchen aus der Region vor, dies aber auch nur mit einem geringen Anteil. Betrachtet man nur die Stämme verschiedener Probenahmeorte aus dem Jahr 2003 zeigen sich noch deutlichere Unterschiede (s. Abb. 38). ERGEBNISSE 108 0 10 20 30 40 50 60 70 80 KKS - 03 Bad Wildungen Immenhausen Witzenhausen KS Diakonissen KS Elisabeth Extern 03 pr oz en tu al e H äu fig ke it R es is te nz ge n aacA-aphD ermA ermC tetK tetM vatA vatB Abb. 38 Vergleich der Häufigkeit von Antibiotikaresistenzgenen nach Strommenger et al [2003] bei MRSA-Stämmen des Klinikums Kassel mit denen anderer Herkunftsorte aus dem Jahr 2003. Zusammensetzung der Gruppen s. Tab. 6, Tab. 7. Bei allen Gruppen vorkommend sind laut Abb. 38 Resistenzgene gegen Makrolide, jedoch kommen ermA und ermC in teilweise sehr unterschiedlichen Anteilen vor. Eine Ausnahme bilden die Stämmen aus Witzenhausen, hier kam nur ermC vor und neben diesem konnte keines der anderen Resistenzgene nachgewiesen werden. TetK und tetM konnten zusammen nur in Stämmen aus dem Diakonissen Krankenhaus nachgewiesen werden. Die Stämme aus dem Klinikum Kassel besaßen ebenso wie die aus Immenhausen nur tetM als Tetracyclin-Resistenzgen, während bei den Stämmen aus externen Proben nur tetK amplifiziert werden konnte. Auffällig hoch ist der Anteil der Stämme mit dem Gen aacA-aphD aus dem Klinikum Kassel. Dieses Resistenzgen war bei den anderen Gruppen nur bei 5 % der Stämme aus dem Diakonissen Krankenhaus und denen „externer“ Proben nachweisbar. Die Resistenzgene vatA und vatB sind in keiner dieser Gruppen vertreten. ERGEBNISSE 109 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 KKS außerhalb KS andere in KS externe pr oz en tu al e H äu fig ke it R es is te nz ge n sea seb sec sed see seg seh sei sej tst eta etb luk Abb. 39 Vergleich der Häufigkeit von Toxingenen nach Becker et al. [1998, 2003] und O’Brien et al. [2004] bei MRSA-Stämmen des Klinikums Kassel mit denen anderer Herkunftsorte. Zusammensetzung der Gruppen s. Tab. 6, Tab. 7. Es zeigt sich in Abb. 39 bei allen Gruppen eine ähnliche Häufigkeit des Vorkommens der untersuchten Toxingene. So liegen die Anteile der häufig und bei allen Gruppen vorkommenden Toxingene für sec bei 35-48 %, die für seg bei 69-80 % und für sei bei 69-80 %. Ebenfalls bei allen Gruppen nachweisbar waren sed, sej und tst, jedoch weitaus seltener. Sea war nur bei Stämmen aus dem Klinikum Kassel (7 %) und bei Stämmen aus der Gruppe „externe“ Proben (3 %) zu sehen. Ebenfalls nur in diesen beiden Gruppen kam seb vor, jedoch mit einem deutlichen Unterschied in der Häufigkeit, KKS: 2 %, externe: 16 %. Schlüsselt man die Porbenahmeorte des Jahres 2003 auf, so zeigt sich ein in vielen Punkten ähnliches Bild (s. Abb. 40). ERGEBNISSE 110 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 KKS - 03 Bad Wildungen Immenhausen Witzenhausen KS Diakonissen KS Elisabeth Extern 03 pr oz en tu al e H äu fig ke it R es is te nz ge n sea seb sec sed see seg seh sei sej tst eta etb luk Abb. 40 Vergleich der Häufigkeit von Toxingenen nach Becker et al. [1998, 2003] und O’Brien et al. [2004] bei MRSA-Stämmen des Klinikums Kassel mit denen anderer Herkunftsorte aus dem Jahr 2003. Zusammensetzung der Gruppen s. Tab. 6, Tab. 7. Wie Abb. 40 zeigt, waren seg und sei die am häufigsten vorkommenden Toxingene. Jedoch zeigen sich bei dieser Darstellungsweise größere Unterschiede zwischen den einzelnen Gruppen als in Abb. 39. Besonders auffällig ist hierbei die geringe Häufigkeit bei den Proben aus Immenhausen (seg: 33 %, sei: 44 %). Größere Unterschiede werden auch für das Vorkommen von sec deutlich, dessen Häufigkeit in den Proben aus dem Klinikum Kassel bei 77 % lag, bei denen aus Witzenhausen bei 63 %, während sie bei den externen Proben nur 11 % betrug. Die Werte der anderen Gruppen liegen im Bereich von 30-47 %. Deutlich wird in Abb. 40, dass z.B. tst nicht in allen Gruppen nachweisbar ist. Die meisten tst-positiven Stämme waren mit 13 % bei MRSA aus Witzenhausen nachweisbar. Auch bzgl. des Vorkommens von sej zeigen sich deutlichere Unterschiede als in Abb. 39. ERGEBNISSE 111 4.5 Korrelation des SCCmec-Typs mit anderen ermittelten Eigenschaften der MRSA 4.5.1 Zusammenhang von SCCmec-Typen, ccr-Typ und dru-Anzahl 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% SCC I SCC IA SCC IA/II SCC II SCC III SCC IIIA SCC IV SCC IVA SCC NN SCC neg pr oz en tu al er A nt ei l A nz ah l d ru s in H VR b ei K ol le kt iv neg 11 dru 10 dru 8 dru 7 dru Abb. 41 Zusammenhang zwischen SCCmec-Typ nach Oliveira u. Lencastre [2002] und der dru-Anzahl nach Nishi et al. [1995] bei allen untersuchten Stämmen (n=501). Betrachtet man den in Abb. 41 dargestellten Zusammenhang zwischen den ermittelten SCCmec-Typen und der festgestellten Anzahl an dru-Elementen in der HVR des SCCmec aller untersuchten MRSA, so ergibt sich folgendes. Bei SCCmec I konnten vorwiegend (56,1 %) 8 drus nachgewiesen werden, häufig aber auch 11 drus (30,3 %), selten 7 drus (7,6 %), 10 drus (3,0 %) oder gar keine drus (3,0 %). Bei SCCmec IA verschieben sich diese Anteiligkeiten hin zu 11 drus (64,3 %), während 8 drus bei 21,4 % der Stämme vorkamen. Der Anteil der Isolate mit 7 drus entspricht mit 7,1 % dem bei SCCmec I. Der Anteil der Stämme bei dem keine drus nachgewiesen werden konnten lag mit 7,1 % höher als bei SCCmec I. Bei den MRSA mit SCCmec II konnten entweder gar keine drus (66,7 %) oder 11 drus (33,3 %) nachgewiesen werden. Beim in der vorliegenden Arbeit definierten Typ SCCmec IA/II konnten bei fast allen Stämmen (97,6 %) keine drus detektiert werden, bei den verbleibenden 8 drus. 38,5 % der SCCmec III-Isolate zeichneten sich durch 10 drus aus, bei keinem anderen SCCmec-Typ kam diese dru-Anzahl derart häufig vor. Der Rest der SCCmec III-Stämme besaß entweder 7 drus (46,2 %) oder gar keine drus (15,4 %). ERGEBNISSE 112 SCCmec IIIA unterscheidet sich laut der vorliegenden Ergebnisse die Anzahl der drus betreffend deutlich von SCCmec III. Der überwiegende Teil der Isolate mit SCCmec IIIA besaß 11 drus (83,3 %), beim Rest der Stämme konnten 7 drus detektiert werden. Ein sehr klares Bild ergab sich auch bei SCCmec IV, hier hatten 90,9 % der Stämme 11 drus, die restlichen 9 % teilten sich wie folgt auf: 10 drus bei 3,1 %, 8 drus bei 1,3 % und keine drus bei 4,7 %. Bei der Variante SCCmec IVA konnten hingegen in allen acht Fällen keine drus nachgewiesen werden. Bei 80 % der Stämme die keinerlei SCCmec-Typ zeigten konnten auch keine drus nachgewiesen werden, bei den verbleibenden 20 % (n=1) 11 drus. Bei den Stämmen bei denen lediglich die exakte Zuordnung zu einem der SCCmec- Typen nicht möglich war, lag der Anteil der Stämme bei denen kein dru-Nachweis erfolgte bei nur 47,4 %, während 20,0 % dieser Stämme 11 drus und 5,3 % 8 drus besaßen. Über den Zusammenhang von ermitteltem SCCmec-Typ und ccr-Typ gibt Abb. 42 Aufschluss. 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% SCC I SCC IA SCC IA/II SCC II SCC III SCC IIIA SCC IV SCC IVA SCC NN SCC neg pr oz en tu al er A nt ei l c cr T yp a n K ol le kt iv neg ccrC ccrA3 ccrA2 ccrA1 Abb. 42 Zusammenhang zwischen SCCmec-Typ nach Oliveira u. Lencastre [2002] und ccr-Typ nach Okuma et al. [2002] und Ito et al. [2004] bei allen untersuchten Stämmen (n=501). Das Gen ccrC alleine konnte bei keinem der untersuchten Stämme nachgewiesen werden. ERGEBNISSE 113 Stämme mit SCCmec I besaßen zu 38 % ccrA1, zu 45 % ccrA2 und bei 17 % konnte keiner der untersuchten ccr-Typen nachgewiesen werden. Bei SCCmec IA sehen diese Werte ähnlich aus, so kam hier bei 43 % ccrA1, bei 36 % ccrA2 und bei 21 % keiner der ccr-Typen vor. Anders zeigt sich das Ergebnis der Untersuchung der MRSA mit SCCmec II, diese zeigten alle ein Signal für ccrA2. Ähnlich hoch ist der Anteil der ccrA2-positiven mit 93 % bei SCCmec IA/II, die restlichen 7 % der Stämme zeigten ein Signal für ccrA1. Bei SCCmec III wurde bei der Mehrheit ccrA3 nachgewiesen (77 %), die verbleibenden Stämme verhielten sich negativ gegenüber allen getesteten Primern. Größer als bei SCCmec III ist der Anteil von ccrA3 bei SCCmec IIIA, er beläuft sich dort auf 83 %, der Rest der Stämme zeigte sich positiv für den Typ ccrA2. Stämme mit SCCmec IV besaßen laut der vorliegenden Untersuchungen zu 94 % ccrA2, während der Rest von 6 % keinerlei positives Ergebnis zeigte. Bei SCCmec IVA zeigte die Hälfte der Stämme ein PCR-Signal für ccrA2, die andere Hälfte gar kein Signal. Bei den Gruppen der schwer oder gar nicht den SCCmec-Typen der durchgeführten PCR zuordenbaren Stämme konnte bei einer großen Mehrheit keine der untersuchten Gensequenzen nachgewiesen werden (74 % SCC NN, 80 % SCC neg), bei den verbleibenden 26 % bzw. 20 % wurde der Typ ccrA2 detektiert. Abb. 43 kombiniert Abb. 41 und Abb. 42 und zeigt den Zusammenhang von ccr-Typ mit Anzahl der drus im Verhältnis zu den SCCmec-Typen. 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% SCC I SCC IA SCC IA/II SCC II SCC III SCC IIIA SCC IV SCC IVA SCC NN neg - neg neg - 7 dru neg - 8 dru neg - 10 dru neg - 11 dru ccrA3 - neg ccrA3 - 7 dru ccrA3 - 8 dru ccrA3 - 10 dru ccrA3 - 11 dru ccrA2 - neg ccrA2 - 7 dru ddrA2 - 8 dru ccr A2 - 10 dru ccrA2 - 11 dru ccrA1 - neg ccr A1 - 7 dru ccr A1 - 8 dru ccrA1 - 10 dru ccrA1 - 11 dru Abb. 43 Zusammenhang zwischen ccr-Typ und dru-Anzahl bei den nachgewiesenen SCCmec-Typen aller Stämme (n=501). ERGEBNISSE 114 4.5.2 Vorkommen von Antibiotikaresistenz- und Toxingenen bei SCCmec- Typen 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 SCC I SCC IA SCC IA/II SCC II SCC III SCC IIIA SCC IV SCC IVA SCC NN/neg Kollektiv pr oz en tu al e H äu fig ke it R es is te nz ge n aacA-aphD ermA ermC tetK tetM vatA vatB Abb. 44 Vorkommen von Antibiotikaresistenzgenen nach Strommenger et al. [2003] bei SCCmec-Typen laut Oliveira u. Lencastre [2002] bei allen untersuchten Stämmen (n=501). Betrachtet man das in Abb. 44 dargestellte Vorkommen der untersuchten Antibiotikaresistenzgene bei den verschiedenen SCCmec-Typen, so fällt auf, dass nur bei SCCmec II, SCCmec IV und SCCmec IA/II alle Resistenzgene nachgewiesen werden konnten. Bei SCCmec IV sind die Anteile jedoch insgesamt deutlich geringer, besonders die für tetK (2,8 %), vatA und vatB (je 0,9 %). Stämme mit SCCmec IVA besaßen nur ermA (63 %) und ermC (25 %). Bei SCCmec I konnten alle untersuchten Resistenzgene mit Ausnahme von tetK detektiert werden, auch hier war die Häufigkeit von vatA (3,0 %) und vatB (1,5 %) sehr gering, die von ermC auch nur mäßig hoch (15 %). SCCmec IA hat wie SCCmec I einen hohen Anteil an aacA-aphD, ermA und tetM, wobei alle Gene bei SCCmec IA häufiger sind (aacA-aphD: SCCmec IA – 93 %, SCCmec I – 55 %; ermA: SCCmec IA – 86 %, SCCmec I – 55 %; tetM: SCCmec IA – 29 %, SCCmec I – 11 %). Auch bei SCCmec III und SCCmec IIIA sind diese Gene am stärksten mit ähnlich hohen Prozentzahlen vertreten. Bei beiden SCCmec III-Typen konnte auch ermC nachgewiesen werden, jedoch mit 7,7 % bei SCCmec III und 17 % bei SCCmec IIIA wesentlich seltener als die anderen Resistenzgene. Isolate mit SCCmec III verfügten gegenüber denen mit SCCmec IIIA zusätzlich noch über tetK (46 %) und vatA (23 %). ERGEBNISSE 115 Bei den nicht genau oder gar nicht mit der PCR nach Oliveira u. Lencastre [2002] erfassbaren Stämmen, die für diese Grafik gemeinsam betrachtet wurden, konnten alle untersuchten Resistenzgene detektiert werden, jedoch in eher geringem Maße. Ändert man die Darstellungsweise für den Zusammenhang von Antibiotikaresistenzgenen und SCCmec-Typen wie in Abb. 45, so werden die unterschiedlichen Häufigkeiten der Resistenzgene noch deutlicher. Bei allen SCCmec-Typen kommt ermA in großen Anteilen vor. ErmC hingegen kommt zwar bei allen SCCmec-Typen außer SCCmec IA vor, jedoch mit Ausnahme von SCCmec IV in einem geringeren Maße. Wie ermA ist auch tetM bei allen SCCmec-Typen zu finden, besonders häufig bei SCCmec IIIA. TetK konnte im Vergleich zu tetM seltener nachgewiesen werden, bei Stämmen mit SCCmec I, SCCmec IA und SCCmec IIIA gar nicht. VatA und vatB waren die seltensten Resistenzgene, nur bei SCCmec II und SCCmec IA/II kamen sie gehäuft vor (vatA: SCCmec II – 22 %, SCCmec IA/II – 19 %; vatB: SCCmec II – 22 %, SCCmec IA/II – 7,1 %). AacA-aphD kam bei SCCmec I, SCCmec IA, SCCmec III und SCCmec IIIA sehr häufig vor (55-93 %), während diese Gene bei den restlichen SCCmec-Typen weit weniger verbreitet waren (9,5-11 %). 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 aacA-aphD ermA ermC tetK tetM vatA vatB Pr oz en tu al e H äu fig ke it SC C T yp en b ei A nt ib io tik ar es is te nz ge n- G ru pp en SCC I SCC IA SCC IA/II SCC II SCC III SCC IIIA SCC IV SCC IVA SCC NN/neg Abb. 45 Häufigkeit von SCCmec-Typen laut Oliveira u. Lencastre [2002] bei den untersuchten Antibiotikaresistenzgenen nach Strommenger et al. [2003] bei allen untersuchten Stämmen (n=501). Abb. 46 und Abb. 47 zeigen den Zusammenhang der untersuchten Toxingene und der ermittelten SCCmec-Typen. ERGEBNISSE 116 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 SCC I SCC IA SCC IA/II SCC II SCC III SCC IIIA SCC IV SCC IVA SCC NN/neg pr oz en tu al e H äu fig ke it R es is te nz ge n sea seb sec sed see seg seh sei sej tst eta etb luk Abb. 46 Vorkommen von Toxingenen nach Becker et al. [1998, 2003] und O’Brien et al. [2004] bei SCCmec-Typen laut Oliveira u. Lencastre [2002] bei allen untersuchten Stämmen (n=501). Wie aus Abb. 46 ersichtlich konnten die Gene der Exfoliativtoxine eta und etb bei keinem der Stämme nachgewiesen werden, lukF nur bei 1,9 % der Stämme mit SCCmec IV. Tst konnte bei allen SCCmec-Typen, mit Ausnahme von SCCmec IA/II und SCCmec IVA, detektiert werden, allerdings meist in geringen Anteilen. Häufiger anzufinden waren bei allen SCCmec-Typen Gene für Enterotoxine. Bei SCCmec IV konnten alle neun untersuchten Enterotoxingene nachgewiesen werden, bei SCCmec IVA sechs, bei SCCmec I und SCCmec II je sieben, bei SCCmec IA sechs, bei SCCmec III fünf. Stämme mit SCCmec IA/II zeigten vier der Enterotoxine, solche mit SCCmec IIIA nur zwei. Die Häufigkeiten der einzelnen Toxingene war dabei sehr unterschiedlich wie auch Abb. 46 zeigt. So sind bei SCCmec IA/II alle vier nachgewiesenen Enterotoxine sehr häufig vorhanden (sed: 71 %, seg: 79 %, sei: 81 %, sej: 74 %). Seg und sei konnten mit 50-89 % auch bei SCCmec I, SCCmec IA, SCCmec II und SCCmec IV ähnlich oft nachgewiesen werden, seltener bei SCCmec III (seg: 38 % und sei: 23 %), gar nicht bei SCCmec IIIA. Letzteres zeichnet sich vor allem dadurch aus, dass bei allen diesem Typ zugeordneten Stämmen sea nachgewiesen werden konnte, bei 17 % zusätzlich das sonst eher seltene tst. Bei SCCmec III sind alle Toxingene in geringer Anteiligkeit vorhanden, keines der Gene kam bei mehr als 38 % der Stämme vor. ERGEBNISSE 117 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 sea seb sec sed see seg seh sei sej tst eta etb luk pr oz en tu al e H äu fig ke it To xi ng en e SCC I SCC IA SCC IA/II SCC II SCC III SCC IIIA SCC IV SCC IVA SCC NN/neg Abb. 47 Häufigkeit von SCCmec-Typen nach Oliveira u. Lencastre [2002] bei den untersuchten Toxingenen nach Becker et al. [1998, 2003] und O’Brien et al. [2004] bei allen untersuchten Stämmen (n=501). Abb. 47 vedeutlicht noch einmal die sehr unterschiedlichen Häufigkeiten der einzelnen Toxingene. Man erkennt hier die Seltenheit von lukF, welches nur bei 1,9 % der Stämme mit SCCmec IV nachgewiesen werden konnte. Auch tst kam eher selten, wenn auch bei fast allen SCCmec-Typen vor. Seine größte Häufigkeit lag bei 17,0 % der Isolate mit SCCmec IIIA. Bei SCCmec II und SCCmec III kam tst zu 11 bzw. 7,7 % vor, bei SCCmec I bei 3,0 %, bei SCCmec IV nur bei 1,6 % der Stämme. Seg und sei konnten bei allen Typen mit Ausnahme von SCCmec IIIA detektiert werden, bei SCCmec III deutlich seltener als bei den anderen. Auch sej war bei allen Stämmen außer solchen mit SCCmec IA und SCCmec IIIA nachweisbar, auch hier bei SCCmec III weniger häufig als bei den anderen. Von den Enterotoxingenen war see das bei den verschiedenen SCCmec-Typen am seltensten vertretene, es kam nur bei SCCmec II, SCCmec IV und SCCmec IVA vor, bei ersterem zu 33 %. Interessant ist hier der Unterschied zwischen SCCmec IV und SCCmec IVA, die Häufigkeit liegt hier bei 1,3 % bzw. 38 %. Seh konnte nur bei SCCmec I, SCCmec IA und SCCmec IV detektiert werden, seb nur bei SCCmec IA, SCCmec II und SCCmec IV. Auffallend hoch im Gegensatz zu den anderen Typen sind die Vorkommen von sea bei SCCmec IIIA (100 %), sec bei SCCmec IV (66 %), see bei SCCmec II (33 %) und SCCmec IVA, sowie von sed bei SCCmec IA/II (71 %). Letzteres besonders weil der Typ SCCmec IA/II in der vorliegenden Arbeit definiert wurde und nicht im Klassifizierungsschema der angewandten Typisierungsmethode vorkam. ERGEBNISSE 118 4.6 Vorkommen von Plasmiden Alle MRSA-Stämme wurden auf das Vorkommen von Plasmiden hin untersucht. Dies erfolgte zumeist mittels der abgewandelten Präparation mit Qiagen- Anionenaustauschersäulen. Die Etablierung der Methode der Plasmidpräparation mittels des Fast Prep-Systems und der modifizierten Eckhardt-Lyse war erfolgreich und wurde in einigen Fällen zum schnelleren Screening angwandt. Auf die Darstellung von Gelbildern als Ergebnis dieser Methodenetablierung wird aufgrund der Qualität der Bilder und des Umfangs vorliegender Arbeit verzichtet. Zur Vereinfachung der folgenden Darstellungen wurden die Plasmidtypen in einfache Gruppen unterteteilt, die der üblichen Grobunterteilung von Plasmiden bei Staphylokokken entsprechen (s. 1.11). „Kleines Plasmid“ meint hierbei Plasmide mit einer Größe unter 30 kb i.d.R. ca 3 kb groß. „Großes Plasmid“ bezeichnet solche mit einer Größe um oder über 30 kb. Das häufig zu beobachtende Vorkommen von einem kleinen und einem großen Plasmid (s.a. Abb. 51, Abb. 53) ist in der entsprechenden Gruppe zusammengefasst. Die Gruppe „mehr als zwei Plasmide“ beinhaltet Stämme mit mehreren Plasmiden, die nicht dem Typ „ein großes und ein kleines Plasmid“ entsprechen. Abb. 48 zeigt das Vorkommen von Plasmiden bei allen untersuchten MRSA. Aus ihr wird ersichtlich, dass bei ca. 80 % der Stämme Plasmide nachgewiesen werden konnten. 44 % der Isolate zeigten dabei nur ein großes Plasmid. Ein kleines Plasmid alleine kam dagegen mit 7 % eher selten vor. Die Kombination aus einem großen und einem kleinen Plasmid war bei 25 % detektierbar. Nur ein geringer Teil von 2 % der MRSA besaß mehrere Plasmide. KP 7,2% GuKP 25,0% neg 21,8% GP 44,1%MP 2% Abb. 48 Vorkommen von Plasmiden bei allen untersuchten Stämmen (n=501). GP = großes Plasmid, KP = kleines Plasmid, GuKP = großes und kleines Plasmid, MP= mehrere Plasmide, neg = keine Plasmide nachgewiesen. ERGEBNISSE 119 4.6.1 Vorkommen von Plasmiden in KKS-99 bis KKS-04 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% KKS - 99 KKS - 01 KKS - 02 KKS - 03 KKS - 04 pr oz en tu al er A nt ei l P la sm id gr up pe n neg MP GuKP KP GP Abb. 49 Vorkommen von Plasmiden in KKS – 99 bis KKS - 04. GP = großes Plasmid, KP = kleines Plasmid, GuKP = großes und kleines Plasmid, MP= mehrere Plasmide, neg = keine Plasmide nachgewiesen Abb. 49 zeigt, dass in allen untersuchten Kollektiven nur ein kleiner Anteil der untersuchten Stämme plasmidfrei war und die Anzahl der plasmidhaltigen Stämme zwischen 71 und 88 % lag. Zum Teil deutliche Unterschiede gibt es bei der Art und Anzahl der vorkommenden Plasmide. So ließ sich bei KKS - 99 vorwiegend (74 %) ein großes Plasmid nachweisen, ein kleineres hingegen nur bei 12 % der Stämme. Eine Kombination aus beidem oder Stämme mit mehreren Plasmiden konnten in KKS - 99 im Gegensatz zu allen anderen Kollektiven nicht beschrieben werden. In den Kollektiven ab dem Jahr 2001 zeigt sich mit wachsendem Anteil (KKS - 01: 12 %, KKS - 02: 28 %, KKS - 03: 29 %, KKS - 04: 44 %) stets das typische Bild eines kleinen und eines großen Plasmides in einem Stamm. Ein kleines Plasmid alleine ließ sich, außer in KKS - 02, in stets ähnlichen Anteilen von 7-13 % nachweisen. Das Vorkommen von MRSA mit mehreren Plasmiden war mit 1,2 % bis 3,9 % stets gering, in KKS - 99 kamen solche Stämme gar nicht vor. Abb. 50 - Abb. 54 zeigen Bilder typischer Agarosegele von Plasmidpräparationen der Jahre 1999, 2002, 2003 und 2004 und lassen Veränderungen im Vorkommenden von Plasmiden erkennen. ERGEBNISSE 120 So zeigt Abb. 50 das für Isolate aus KKS – 99 typische Vorkommen von nur einem großen Plasmid. Abb. 50 Plasmidpräparation von MRSA aus KKS - 99. Präparation: Mit Qiagen- Mini-Säulen aus 7 ml ÜN-Kultur. Auftrag: Je 3 µl des in 25 µl A. bidest gelösten DNA- Pellets. Rechts: Größe der Plasmide des Markers, M = E. coli V517; Chr. = Laufhöhe Reste chromosomaler DNA. Agarosegel: 0,8 % TAE, 90 V, ~2 h. Abb. 51 Plasmidpräparation von MRSA aus KKS – 02 und zwei Isolaten des Jahres 2002 aus Fritzlar. Präparation: Mit Qiagen-Mini-Säulen aus 5 ml ÜN-Kultur. Auftrag: Je 3 µl des in 25 µl A. bidest gelösten DNA-Pellets. Rechts: Größe der Plasmide des Markers, M = E. coli V517; Chr. = Laufhöhe Reste chromosomaler DNA. Agarosegel: 0,8 % TAE, 90 V, 2 h. ERGEBNISSE 121 In Abb. 51 in Bahn 4, 6 und 11, Abb. 52 Bahn 6 und 7, sowie einer Vielzahl von Bahnen der Abb. 53 und Abb. 54 ist das typische Bild von Isolaten mit Plasmiden der in der vorliegenden Arbeit definierten Gruppe „ein großes und ein kleines Plasmid“ zu erkennen. Bahn 5 in Abb. 52 zeigt mit KKS – 02-12 einen der wenigen MRSA- Stämme mit mehren Plasmiden. Abb. 52 Plasmidpräparation von MRSA verschiedener Herkunftsorte des Jahres 2002. Präparation: Mit Qiagen-Mini-Säulen aus 5 ml ÜN Kultur. Auftrag: Je 3 µl des in 20 µl A. bidest gelösten DNA-Pellets. Rechts: Größe der Plasmide des Markers, M = E. coli V517; Chr. = Laufhöhe Reste chromosomaler DNA. Agarosegel: 0,8 % TAE, 90 V, ~2 h. Abb. 53 Plasmidpräparation von MRSA aus KKS-03 und Isolaten verschiedener Herkunftsorte des Jahres 2003. Links: Größe der Plasmide des Markers, M = E. coli V517; Chr. = Laufhöhe Reste chromosomaler DNA.. Agarosegel: 0,8 % TAE, 100 V, ~5 h. Abb. aus Spezialpraktikum Koch u. Billen [2005]. ERGEBNISSE 122 In Abb. 54 ist in Bahn 9 die Plasmid-DNA von KKS – 04-72 aufgetragen, dessen kleines Plasmid sich deutlich von denen der anderen MRSA-Stämme unterscheidet. Abb. 54 Plasmidpräparation von MRSA aus KKS-04, sowie zwei Isolaten der Gruppe externer Proben. Bahn 8, 19 und 20 enthielten Proben misslungener Präparationen. Präparation: Mit Qiagen-Mini-Säulen aus 5 ml ÜN Kultur. Auftrag: Je 4 µl des in 20 µl A. bidest gelösten DNA-Pellets. Rechts und links: Größe der Plasmide des Markers, M = E. coli V517; Chr. = Laufhöhe Reste chromosomaler DNA. Agarosegel: 0,8 % TAE, 100 V, ~3 h. 4.6.2 Vorkommen von Plasmiden bei Stämmen aus dem Klinikum Kassel verglichen mit anderen Probenahmeorten Betrachtet man das Vorkommen von Plasmiden in der Darstellung des Vergleichs von Stämmen aus dem Klinikum Kassel, medizinischen Einrichtungen außerhalb und in Kassels, sowie von niedergelassenen Ärzten und ambulanten Patienten, so kann man sehen, dass die Anteiligkeiten der definierten Plasmidgruppen stets ähnlich sind (Abb. 55). Der genauere Vergleich von Proben aus dem Jahr 2003 unter gleichem Aspekt bestätigt dies (Abb. 56). ERGEBNISSE 123 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% KKS außerhalb KS andere in KS Externe pr oz en tu al er A nt ei l neg MP GuKP KP GP Abb. 55 Vorkommen von Plasmiden bei MRSA-Stämmen des Klinikums Kassel verglichen mit denen anderer Herkunftsorte. Zusammensetzung der Gruppen s. Tab. 6, Tab. 7 GP = großes Plasmid, KP = kleines Plasmid, GuKP = großes und kleines Plasmid, MP= mehrere Plasmide, neg = keine Plasmide nachgewiesen. 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% KK S - 03 Ba d W ild un ge n Im me nh au se n W itz en ha us en KS D iak on iss en KS E lis ab eth Ex ter ne pr oz en tu al er A nt ei l neg MP GuKP KP GP Abb. 56 Vergleich des Vorkommens von Plasmiden bei MRSA-Stämmen des Klinikums Kassel mit denen anderer Herkunftsorte aus dem Jahr 2003 Zusammensetzung der Gruppen s. Tab. 6, Tab. 7. GP = großes Plasmid, KP = kleines Plasmid, GuKP = großes und kleines Plasmid, MP = mehrere Plasmide, neg = keine Plasmide nachgewiesen. ERGEBNISSE 124 4.6.3 Vorkommen von Plasmiden bei SCCmec-Typen 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% SCC I SCC IA SCC IA/II SCC II SCC III SCC IIIA SCC IV SCC IVA SCC NN SCC neg pr oz en tu al er A nt ei l P la sm id gr up pe n neg MP GuKP KP GP Abb. 57 Zusammenhang des Vorkommens von Plasmiden und ermittelten SCCmec-Typen nach Oliveira u. Lencastre [2002]. Angegeben ist die prozentuale Häufigkeit der definierten Plasmidgruppen bei den ermittelten SCCmec-Typen. GP = großes Plasmid, KP = kleines Plasmid, GuKP = großes und kleines Plasmid, MP= mehrere Plasmide, neg = keine Plasmide nachgewiesen. Betrachtet man das Vorkommen von Plasmiden im Vergleich zu den ermittelten SCCmec-Typen in Abb. 57, so lassen sich teilweise deutliche Unterschiede erkennen. Der Anteil plasmidfreier Stämme bewegt sich im Bereich von 0 bis 42,9 %, die Anteile der anderen definierten Plasmidgruppen dementsprechend. Auffällig ist, dass Stämme mit mehreren Plasmiden nur bei SCCmec II (11,1 %) und SCCmec IV (2,5 %) und solchen Stämmen die keinem SCCmec-Typ zuzuordnen waren (4,5 %) bestimmt werden konnten. Bei SCCmec I, SCCmec IA, SCCmec IA/II, SCCmec II, SCCmec III, SCCmec IVA und der Gruppe der nicht sicher zuordenbaren Stämme war der Anteil des Vorkommens von einem großen Plasmid am größten und lag bei 50 % bis 76,9 %. Bei SCCmec IV und SCCmec IIIA und der Gruppe der nicht zuordenbaren Stämme betrug dieser Anteil jeweils 36,7 %, 16,7 % und 40,0 %. Ein kleines Plasmid alleine ließ sich bei Stämmen mit SCCmec IA, SCCmec III, SCCmec IVA und der Gruppe der nicht zuordenbaren nicht nachweisen. Bei SCCmec I, SCCmec IA/II, SCCmec II, SCCmec IV und der Gruppe der nicht genau zuordenbaren Stämme lag der Anteil bei 6,1 % bis 11,1 %. Hingegen zeigten 83,3 % der Isolate mit SCCmec IIIA ein kleines Plasmid alleine. ERGEBNISSE 125 Die Kombination von einem kleinen und einem großen Plasmid war bei SCCmec IV mit 31,3 % am häufigsten zu finden, gefolgt von SCCmec IA/II mit 26,2 % und SCCmec III mit 23,1 %. Bei SCCmec IA und SCCmec II war dieser Anteil mit 7,1 % bzw. 11,1 % geringer. Mehrere Plasmide ließen sich nur bei Stämmen mit SCCmec II (11,1 %) und SCCmec IV (2,5 %) und Stämmen mit keinem zuordenbaren SCCmec-Typ (4,5 %) nachweisen. In Abb. 58 sind noch einmal die SCCmec-Typen in Abhängigkeit zu den gewählten Plasmidgruppen dargestellt 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% GP KP GuKP MP neg pr oz en tu al er A nt ei l S C C T yp en a n P la sm id gr up pe n SCC neg SCC NN SCC IA/II SCC IVA SCC IV SCC IIIA SCC III SCC II SCC IA SCC I Abb. 58 Zusammenhang des Vorkommens von Plasmiden und ermittelten SCCmec-Typen nach Oliveira u. Lencastre [2002]. Angegeben ist die prozentuale Häufigkeit der ermittelten SCCmec-Typen bei den definierten Plasmidgruppen. GP = großes Plasmid, KP = kleines Plasmid, GuKP = großes und kleines Plasmid, MP= mehrere Plasmide, neg = keine Plasmide nachgewiesen. ERGEBNISSE 126 4.6.4 Zusammenhang zwischen Plasmidgehalt und Anzahl der Antibiotikaresistenz- bzw. Toxingene 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% 0 RG 1 RG 2 RG 3 RG 4, 5, 6 RG pr oz en tu al er A nt ei l neg MP GuKP KP GP Abb. 59 Häufgkeit ermittelter Plasmidgruppen in Abhängigkeit des Resistenzgengehaltes der untersuchten Stämme (n=501). GP = großes Plasmid, KP = kleines Plasmid, GuKP = großes und kleines Plasmid, MP = mehrere Plasmide, neg = keine Plasmide nachgewiesen, RG = Resistenzgene. Der Zusammenhang zwischen dem Plasmidgehalt der untersuchten MRSA und der bei ihnen vorkommenden Antibiotikaresistenzgene ist in Abb. 59 dargestellt. Diese zeigt, dass plasmidfreie Isolate mit 34,0 % den höchsten Anteil an Stämmen ohne eines der untersuchten Antibiotikaresistenzgene besaßen. Dieser lag allerdings nur wenig über dem der Stämme mit einem großen Plasmid (31,9 %). Der Anteil der Stämme ohne Plasmid nimmt mit Anzahl der nachgewiesenen Antibiotikaresistenzgene ab, von 19,9 % bei einem über 13,6 % bei zwei und 10,9 % bei drei auf Null bei vier oder mehr Resistenzgenen. In Bezug auf das Vorkommen der anderen Plasmidgruppen sind jedoch keine weiteren deutlichen Tendenzen zu erkennen. Der Anteil der Stämme mit einem kleinen Plasmid beträgt bei den Isolaten ohne eines der untersuchten Resistenzgene 9,3 %. Bei den restlichen Gruppen kam ein kleines Plasmid wie folgt vor: 1 RG: 5,1 %, 2 RG: 7,3 %, 3 RG: 6,5 %, 4 oder mehr RG: 3,6 %. Isolate mit „einem großen und einem kleinen Plasmid“ sind bei der Gruppe der MRSA mit vier oder mehr Resistenzgenen mit 14,3 % am seltensten. Bei den anderen Gruppen ist er ähnlich groß (0 RG: 20,0 %, 1 RG: 26,2 %, 2 RG: 23,6 %, 3 RG: 30,4 %). Mehrere Plasmide ließen sich am häufigsten bei Stämmen mit drei Resistenzgenen nachweisen (8,7 %), gefolgt von Stämmen mit einem Resistenzgen (2,1 %). Bei Stämmen mit keinem oder zwei Resistenzgenen war der Anteil von ERGEBNISSE 127 Isolaten mit mehreren Plasmiden mit 0,7 bzw. 0,9 % sehr gering. Bei Stämmen mit vier oder mehr Resistenzgenen ließen sich gar keine Stämme mit mehreren Plasmiden nachweisen, die nicht dem „ein großes und ein kleines Plasmid“-Muster entsprachen. Abb. 60 zeigt noch einmal die Häufigkeit vorkommender Resistenzgene in Abhängigkeit der definierten Plasmidgruppen. 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% GP KP GuKP MP neg pr oz en ut al er A nt ei l M eh rf ac hr es is te nz en b ei P la sm id gr up pe n 4, 5, 6 RG 3 RG 2 RG 1 RG 0 RG Abb. 60 Vorkommen von Mehrfachresistenzen bei den ermittelten Plasmidgruppen aller untersuchten Stämme (n=501). GP = großes Plasmid, KP = kleines Plasmid, GuKP = großes und kleines Plasmid, MP = mehrere Plasmide, neg = keine Plasmide nachgewiesen, RG = Resistenzgene. 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% 0 TG 1 TG 2 TG 3 TG 4 TG pr oz en tu al er A nt ei l neg MP GuKP KP GP Abb. 61 Häufigkeit ermittelter Plasmidgruppen bei MRSA in Abhängigkeit des Toxingengehaltes der untersuchten Stämme (n=501). GP = großes Plasmid, KP = kleines Plasmid, GuKP = großes und kleines Plasmid, MP = mehrere Plasmide, neg = keine Plasmide nachgewiesen, TG = Toxingene. ERGEBNISSE 128 Wie aus Abb. 61 ersichtlich wird, gibt es einen Zusammenhang zwischen dem Vorkommen von Toxingenen und dem von Plasmiden. Der Anteil der Stämme ohne Plasmid ist bei der Gruppe der Stämme ohne eines der untersuchten Toxingene mit 34,5 % am größten und bei der Gruppe mit vier Toxingenen mit 6,8 % am kleinsten. Isolate mit einem Toxingen hatten zu 11,6 % kein Plasmid, mit zwei Toxingenen zu 24,4 % und mit drei Toxingenen zu 21,3 %. Der Anteil von Stämmen mit einem großen Plasmid ist in allen Toxingengruppen am größten, bei null Toxingenen: 43,5 %, bei einem Toxingen: 39,0 %, bei zwei Toxingenen: 45,4 %, bei drei Toxingenen: 40,6 % und bei vier Toxingenen am höchsten: 60,7 %. Der Anteil der Stämme mit nur einem kleinem Plasmid ist bei Stämmen mit einem Toxingen mit 16,3 % deutlich höher gegenüber dem der anderen Gruppen (0 TG: 1,8 %, 2 TG: 4,9 %, 3 TG: 7,1 %, 4 TG: 8,5 %). Ein großes und ein kleines Plasmid kommen in allen Gruppen in einem deutlichen Anteil von 9,1 % bis 30,2 % vor. Mehrere Plasmide waren hingegen nur bei Stämmen mit keinem (1,8 %), zwei (0,8 %) und drei der Toxingene (3,3 %) nachweisbar. Abb. 62 zeigt noch einmal die Häufigkeit vorkommender Toxingene in Abhängigkeit der definierten Plasmidgruppen. 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% GP KP GuKP MP neg 4 TG 3 TG 2 TG 1 TG 0 TG Abb. 62 Vorkommen von mehreren Toxingenen bei den ermittelten Plasmidgruppen aller untersuchten Stämme (n=501). GP = großes Plasmid, KP = kleines Plasmid, GuKP = großes und kleines Plasmid, MP = mehrere Plasmide, neg = keine Plasmide nachgewiesen, TG = Toxingene. ERGEBNISSE 129 4.6.5 Restriktionsanalyse präparierter MRSA-Plasmide Abb. 63 bis Abb. 66 zeigen beispielhaft Agarosegele mit verschiedenen Enzymen restringierter Plasmid-DNA. Zur Bestimmung der Restriktionsfragmentgrößen wurden die Gelbilder mit den Programmen Gelscan V5.1 (BioSciTec) und Labimage 2006 (Kapelan) analysiert. Sowohl die Restriktionsanalysen als auch die Größenbestimmungen dieser wurden, zumindest für eine bestimmte Anzahl der Stämme, mehrfach durchgeführt und die erhaltenen Werte gemittelt (Tab. 11 bis Tab. 12). Die Definition der Plasmidtypen erfolgte bereits in einer früheren Arbeit zum Vorkommen von Plasmiden bei MRSA-Stämmen aus dem Klinikum Kassel [Janusch, 2000]. Es konnten in der vorliegenden Arbeit keine neuen von diesen Typen abweichenden Restriktionsmuster festgestellt werden. Abb. 63 EcoRI-Restriktion verschiedener Plasmidtypen aus KKS-99. Bahn 2 und 3: pFL 35-1, Bahn 4 und 5: pFL 35-2, Bahn 6: pFL 35-2’, Bahn 7: pFL 35-3, Bahn 8: pFL 35-4. Rechts und links: Größen der DNA-Fragmente der beiden Marker (λ-DNA PstI, MBI Ladder Mix). Agarosegel: 1 % TAE, 70 V., ~ 2,5 h. ERGEBNISSE 130 Abb. 64 PstI-Restriktion verschiedener Plasmidtypen aus KKS-99. Bahn 2 und 3: pFL 35-1, Bahn 4 und 5: pFL 35-2, Bahn 6: pFL 35-2’, Bahn 7: pFL 35-3, Bahn 8: pFL 35- 4. Rechts und links: Größen der DNA-Fragmente der beiden Marker: λ-DNA-PstI, MBI Ladder Mix. Agarosegel: 1 % TAE, 70 V, ~ 2,5 h. Abb. 65 Kombinierte EcoRI- und PstI-Restriktion verschiedener Plasmidtypen aus KKS-99. Bahn 2 und 3: pFL 35-1, Bahn 4 und 5: pFL 35-2, Bahn 6: pFL 35-2’, Bahn 7: pFL 35-3, Bahn 8: pFL 35-4. Rechts und links: Größen der DNA-Fragmente der beiden Marker: λ-DNA-PstI, MBI Ladder Mix. Agarosegel: 1 % TAE, 80 V, ~ 2 h. ERGEBNISSE 131 Abb. 66 HindIII-Restriktion verschiedener Plasmidtypen von Referenzstämmen und aus MRSA-Stämmen aus KKS-99. Bahn 16: pFL 35-1, Bahn 17: pFL 35-2, Bahn 18: pFL 35-2’, Bahn 19: pFL 35-3, Bahn 20: pFL 35-4. Rechts: Größe der DNA- Fragmente des Markers: λ-DNA-PstI. Agarosegel: 1,2 % TAE, 100 V, 5 h. Tab. 8 EcoRI-Restriktionsanalyse von MRSA-Plasmiden. Angegeben sind Mittelwerte mit Standardabweichung der Restriktionsfragmente der verschiedenen ermittelten Plasmidtypen und die resultierende Gesamtgröße des Plasmides. Angaben in kb. EcoRI pFL 35-1 pFL 35-2 pFL 35-2’ pFL 35-3 pFL 35-4 gesamt 32,10 ±0,40 33,98 ±0,35 33,48 ±0,40 35,47 ±0,91 30,16 ±0,82 Fragment 1 10,26 ±0,66 11,11 ±0,49 10,8 ±0,67 10,21 ±0,60 10,08 ±0,58 2 8,53 ±0,64 8,99 ±0,67 9,49 ±0,74 9,19 ±1,34 8,71 ±0,83 3 7,34 ±0,60 7,82 ±0,64 7,28 ±0,74 7,32 ±0,61 6,31 ±0,62 4 2,58 ±0,11 2,65 ±0,10 2,58 ±0,12 2,63 ±0,12 5,06 ±0,14 5 2,28 ±0,19 2,27 ±0,14 2,22 ±0,11 2,34 ±0,11 6 1,11 ±0,19 1,14 ±0,05 1,11 ±0,05 1,16 ±0,05 ERGEBNISSE 132 Tab. 9 PstI-Restriktionsanalyse von MRSA-Plasmiden. Angegeben sind Mittelwerte mit Standardabweichung der Restriktionsfragmente der verschiedenen ermittelten Plasmidtypen und die resultierende Gesamtgröße des Plasmides. Angaben in kb. nd = nicht durchgeführt PstI pFL 35-1 pFL 35-2 pFL 35-2’ pFL 35-3 pFL 35- 4 gesamt 28,42 ±0,23 27,88 ±0,17 28,78 ±0,21 31,58 ±0,94 nd Fragment 1 10,99 ±0,35 10,89 ±0,11 11,26 ±0,17 10,81 ±0,14 2 5,51 ±0,39 5,32 ±0,37 5,55 ±0,47 5,39 ±0,13 3 4,84 ±0,20 4,71 ±0,12 4,88 ±0,20 4,75 ±0,06 4 3,79 ±0,10 3,74 ±0,14 3,80 ±0,13 3,77 ±0,07 5 3,28 ±0,92 3,20 ±0,10 3,29 ±0,12 3,56 ±0,11 6 3,30 ±0,05 Tab. 10 EcoRI+PstI-Restriktionsanalyse von MRSA-Plasmiden. Angegeben sind Mittelwerte mit Standardabweichung der Restriktionsfragmente der verschiedenen ermittelten Plasmidtypen und die daraus resultierende Gesamtgröße des Plasmides. Angaben in kb. EcoRI+PstI pFL 35-1 pFL 35-2 pFL 35-2’ pFL 35-3 pFL 35-4 gesamt 31,71 ±0,23 30,38 ±0,43 29,20 ±0,39 33,74 ±0,27 29,67 Fragment 1 8,20 ±0,78 8,92 ±1,17 9,44 ±1,21 10,13 ±0,89 10,58 ±0,72 2 5,49 ±0,81 6,31 ±1,15 5,89 ±1,29 5,84 ±1,13 8,53 ±0,54 3 4,20 ±0,16 3,86 ±0,49 3,34 ±0,34 3,66 ±0,20 5,85 ±0,48 4 3,23 ±0,14 2,83 ±0,26 2,61 ±0,10 3,39 ±0,17 4,71 ±0,32 5 2,56 ±0,04 2,38 ±0,14 2,29 ±0,07 2,64 ±0,04 6 2,31 ±0,03 2,11 ±0,16 2,02 ±0,40 2,34 ±0,01 7 2,04 ±0,02 1,64 ±0,33 1,44 ±0,02 2,05 ±0,01 8 1,46 ±0,02 1,24 ±0,17 1,10 ±0,02 1,47 ±0,00 9 1,11 ±0,02 1,07 ±0,02 1,05 ±0,02 1,14 ±0,01 ERGEBNISSE 133 Tab. 11 HindIII-Restriktionsanalyse von MRSA-Plasmiden. Angegeben sind Mittelwerte mit Standardabweichung der Restriktionsfragmente der verschiedenen ermittelten Plasmidtypen und die resultierende Gesamtgröße des Plasmides. Angaben in kb. HindIII pFL 35-1 pFL 35-2 pFL 35-2’ pFL 35-3 pFL 35-4 gesamt 28,86 ±0,09 33,54 ±0,11 34,55 ±0,16 31,91 ±0,04 30,74 ±0,12 Fragment 1 9,75 ±0,30 9,62 ±0,38 9,69 ±0,33 9,34 ±0,10 10,87 ±0,35 2 4,49 ±0,10 4,80 ±0,18 4,80 ±0,20 4,48 ±0,05 9,42 ±0,18 3 4,05 ±0,07 4,12 ±0,09 4,14 ±0,10 4,18 ±0,04 8,7 ±0,15 4 3,83 ±0,09 3,95 ±0,07 3,47 ±0,62 3,84 ±0,04 1,8 ±0,02 5 3,21 ±0,04 6 2,96 ±0,11 3,08 ±0,14 3,08 ±0,15 2,91 ±0,07 7 2,32 ±0,09 2,27 ±0,19 8 1,74 ±0,04 1,84 ±0,09 1,84 ±0,09 1,75 ±0,04 9 1,45 ±0,06 10 1,17 ±0,02 1,24 ±0,05 1,25 ±0,06 1,16 ±0,01 11 0,98 ±0,02 1,02 ±0,05 1,02 ±0,06 0,97 ±0,01 12 0,80 ±0,05 0,80 ±0,05 0,81 ±0,07 0,79 ±0,03 13 0,73 ±0,05 0,73 ±0,05 0,74 ±0,06 0,72 ±0,02 Tab. 12 HincII-Restriktionsanalyse von MRSA-Plasmiden. Angegeben sind Mittelwerte mit Standardabweichung der Restriktionsfragmente der verschiedenen ermittelten Plasmidtypen und die resultierende Gesamtgröße des Plasmides. Angaben in kb. nd = nicht durchgeführt. HincII pFL 35-1 pFL 35-2 pFL 35-2’ pFL 35-3 pFL 35-4 gesamt 30,94 ±0,07 27,18 ±0,01 27,31 nd 26,71 Fragment 1 10,98 ±0,66 7,51 ±0,03 7,45 11,67 2 4,79 ±0,05 4,77 ±0,01 4,75 6,76 3 4,07 ±0,03 4,02 ±0,02 4,04 4,04 4 3,05 ±0,04 2,99 ±0,07 2,99 2,41 5 2,57 ±0,03 2,53 ±0,01 2,56 1,14 6 1,34 ±0,08 1,31 ±0,01 1,45 0,72 7 1,05 ±0,03 1,02 ±0,01 1,05 8 0,93 ±0,00 0,09 ±0,01 0,92 9 0,79 ±0,02 0,76 ±0,01 0,82 10 0,73 ±0,00 0,71 ±0,02 0,73 11 0,64 ±0,00 0,61 ±0,01 0,64 ERGEBNISSE 134 Neben den Enzymen EcoRI, HindIII, PstI und HincII wurden für einen Teil der Plasmide noch weitere Restriktionsenzyme eingesetzt. Damit sollte überprüft werden, ob die damit festgestellten Restriktionsmuster ebenfalls bei den ermittelten Plasmidtypen übereinstimmten, was der Fall war. Bei den kleinen Plasmiden um 2 kb sollte mit dem Einsatz weiterer Restriktionsenzyme versucht werden, diese einer genaueren Restriktionsanalyse zu unterziehen. Denn die kleinen Plasmide zeigten bei den vier hauptsächlich eingesetzten Enzymen nur eine HindIII Schnittstelle, die zu einer Linearisierung des Plasmides führte. Bei den zusätzlich eingesetzen Enzymen BglI, DdeI, HinfI und DraI zeigten sich nur bei letzterem mehrere Fragmente. Die untersuchten Plasmide um 2 kb Größe ließen sich mit DraI in vier Fragmente spalten. 4.6.6 Weitere Untersuchungen der Plasmide Mit einigen großen Plasmiden wurden Transformations- und Konjugationsansätze durchgeführt. Da dies nicht mit allen Plasmiden erfolgte und zu keinen weiterführenden Schlüssen führte, wird auf diese Ergebnisse nicht detailliert eingegangen. Konjugation von MRSA zum Rezipientenstamm S. aureus 8325-4 bzw. S. aureus 8325-4-Rifr konnte bei keinem der untersuchten Plasmide nachgewiesen werden. Auch eine Konjugation von verschiedenen MRSA der Kollektive zu ausgewählten Enterococcus faecalis der Arbeitsgruppe oder umgekehrt wurde nicht belegt [Schäfer u. Wurzbacher, 2004]. Transformationen verschiedener Plasmide in S. aureus 8325-4 bzw. S. aureus 8325- 4-Rifr wurden hingegen erfolgreich nach der Methode von Schenk u. Laddaga [1992] durchgeführt. Mit dieser Methode konnte bei einem Teil der Stämme eine plasmidäre Lokalisation von Antibiotikaresistenzgenen belegt werden. ERGEBNISSE 135 4.7 Entwicklung von MRSA mit SCCmec IV von 1999 – 2004 Anhand des mit Ausnahme des Kollektivs KKS – 99 am weitesten verbreitetsten SCCmec IV lassen sich Veränderungen von MRSA-Stämmen mit diesem SCCmec- Typ wie folgt darstellen (Abb. 67). 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% IV 1999 IV 2001 IV 2002 IV 2003 IV 2004 pr oz en tu al er A nt ei l neg MP GuKP KP GP Abb. 67 Veränderungen im Plasmidgehalt von MRSA mit SCCmec IV des Klinikums Kassel der Jahre 1999 bis 2004. n = 193, IV 1999: n = 9, IV 2001: n = 42, IV 2002: n = 48, IV 2003: n = 27, IV 2004: n = 67. Während sich der Anteil plasmidhaltiger Stämme im Laufe der Jahre eher geringfügig änderte und sich darin auch kein deutlicher Trend feststellen lässt, ist dies bei der Art der vorkommenden Plasmide anders. Während Stämme mit SCCmec IV aus KKS - 99 entweder ein großes Plasmid (55,6 %) oder ein kleines Plasmid (22,2 %) besaßen, verminderten sich diese Anteile im Laufe der Jahre deutlich hin zum Vorkommen von einem großen und einem kleinen Plasmid bei einem Stamm. So veränderte sich dieser Anteil im Laufe der Jahre wie folgt: KKS - 01: 7,1 %; KKS - 02: 43,8 %; KKS – 03: 33,3 %; KKS – 04: 50,8 %. Stämme mit mehreren Plasmiden kamen nur bei SCCmec IV aus KKS - 01, KKS - 02 und KKS - 03 vor, dies mit geringen Häufigkeiten von 2,4 %, 6,3 % und 3,7 % respektive. ERGEBNISSE 136 0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0 70,0 80,0 90,0 IV 1999 IV 2001 IV 2002 IV 2003 IV 2004 Kollektiv pr oz en tu al e H äu fig ke it R es is te nz ge n aacA-aphD ermA ermC tetK tetM vatA vatB Abb. 68 Veränderungen im Vorkommen von Antibiotikaresistenzgenen bei MRSA mit SCCmec IV des Klinikums Kassel der Jahre 1999 bis 2004. n = 193, IV 1999: n = 9, IV 2001: n = 42, IV 2002: n = 48, IV 2003: n = 27, IV 2004: n = 67. Auch bezüglich des Vorkommens von Antibiotikaresistenzgenen lassen sich Unterschiede bei den SCCmec IV im Laufe der Jahre feststellen, die in Abb. 68 dargestellt sind. Auffallend ist hierbei zunächst, dass bei den SCCmec IV-Stämmen aus KKS – 04, im Gegensatz zu denen der Jahre zuvor, alle untersuchten Resistenzgene nachweisbar waren. Die Isolate der früheren Jahre besaßen nur drei oder vier der sieben untersuchten Gene. Eine deutliche Änderung liegt bei der Häufigkeit von aacA-aphD und ermA vor. Beide Gene kamen bei SCCmec IV aus KKS - 99 sehr häufig mit 66,7 % und 77,8 % vor. Bei den MRSA aus KKS - 01 lagen diese Anteile jedoch nur noch bei 7,1 % für aacA- aphD und 14,3 % für ermA. Bis 2004 fand dann wiederum ein Anstieg der Häufigkeit dieser Resistenzgene statt: aacA-aphD auf 13,4 % und ermA auf 34,3 %. Für ermC lässt sich eine Steigerung der Häufigkeit von 2001 bis 2004 von 42,9 % auf 70,1 % beobachten. SCCmec IV-haltige Stämme mit tetM ließen sich mit größerer Häufigkeit nur in KKS - 99 mit 44,4 % und im KKS - 04 mit 71,6 % nachweisen, in geringer Anzahl von 3,7 % in KKS - 03. ERGEBNISSE 137 0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0 70,0 80,0 90,0 100,0 IV 1999 IV 2001 IV 2002 IV 2003 IV 2004 pr oz en tu al e H äu fig ke it R es is te nz ge n sea seb sec sed see seg seh sei sej tst eta etb luk Abb. 69 Veränderungen im Vorkommen von Toxingenen bei MRSA mit SCCmec IV des Klinikums Kassel der Jahre 1999 bis 2004. n = 193, IV 1999: n = 9, IV 2001: n = 42, IV 2002: n = 48, IV 2003: n = 27, IV 2004: n = 67. Auch bei der Betrachtung des Vorkommens von Toxingenen lassen sich Veränderungen über die Jahre hin feststellen (Abb. 69). Hier fällt besonders auf, dass seg und sei in den Jahren 2001 bis 2004 nahezu bei allen (85,2 – 100 %) SCCmec IV-haltigen Stämmen vorkamen, bei Isolaten aus 1999 nur bei 33,3 % der Stämme. Bei MRSA mit SCCmec IV aus KKS - 99 waren im Gegensatz zu den jüngeren Stämmen die Anteiligkeiten von sed und sej höher. Tst ließ sich nur bei SCCmec IV aus KKS – 99 nachweisen. DISKUSSION 138 5 Diskussion 5.1 Typisierung der MRSA-Stämme anhand der SCCmec-Region 5.1.1 SCCmec-Typisierung nach Oliveira u. Lencastre [2002] Die SCCmec-Typisierung nach Oliveira u. Lencastre [2002] war gut durchführbar und lieferte meist eindeutige Ergebnisse. Es gab jedoch einen Anteil von 6 % mit dieser Methode nicht oder nicht genau bestimmbarer SCCmec. Dies spricht aber nicht gegen diese Methode, sondern zeigt vor allem, dass es aufgrund der hohen Variabilität von SCCmec schwierig ist mit einer nicht zu aufwändigen und kostenintensiven Methode möglichst viele Varianten von SCCmec möglichst sicher erfassen zu können. Eine Schwachstelle der Multiplex-PCR nach Oliveira u. Lencastre [2002] liegt in der Erfassung von SCCmec IV-Subtypen, was die Autoren bei Veröffentlichung der Methode bereits selber erwähnten. Solche Subtypen entstehen durch die Variabilität der Region upstream von mecA und sind mit geringem Aufwand schwer erfassbar. SCCmec IV wird bei der Methode nach Oliveira u. Lencastre [2002] bestimmt durch die Abwesenheit der pls-Region in der mecA- upstream-Region. Dadurch findet eine Abgrenzung zum nah verwandten und in Teilen der upstream Region identischen SCCmec I statt, für den das Vorhandensein der pls-Region (Locus A) spezifisch ist. Ein weiterer Mangel der angewandten Methode ist, dass sie das nach ihrer Entwicklung beschriebene SCCmec V-Element nicht erfasst, es wird als SCCmec III falsch klassifiziert [Zhang et al., 2005]. In der vorliegenden Arbeit wurde dies dadurch ausgeglichen, dass in einer weiteren PCR nach ccrC gescreent wurde, welches als alleiniges ccr-Element in einem MRSA bisher nur in SCCmec V beschrieben wurde. Auffällig bei der Analyse der PCR-Ergebnisse war das reproduzierbare Auftreten eines SCCmec-Typs, der nicht im Klassifizierungsschema vorgesehen war. Dieser Typ SCCmec IA/II zeigte alle Loci von SCCmec II und zusätzlich den in der pls- region liegenden Locus A und besitzt somit auch alle SCCmec IA-typischen Loci. Eine Kombination dieser PCR-Fragmente sollte eigentlich nicht möglich sein. Zwar besitzen SCCmec I und SCCmec II sehr ähnliche aufgebaute mecA-downstream- Regionen, was sich in der PCR auch durch den bei beiden vorhandenen downstream DISKUSSION 139 Locus D zeigt, jedoch sind die mecA-upstream-Regionen unterschiedlich und werden in der PCR durch die Primerpaare für die Loci A und B zur Unterscheidung genutzt. Eine Fehlinterpretation der Banden ist auszuschließen, da alle SCCmec IA/II- Stämme dieses Ergebnis reproduzierbar zeigten. Sie wurden mehrfach untersucht, sowohl mit Koloniesuspensionen als auch mit aufgereinigter DNA als Template. Neben dem Multiplex-PCR-Ansatz wurden zusätzlich PCRs mit den einzelnen Primerpaaren durchgeführt. Auch wurde auf eine ausreichende Auflösung der PCR- Banden auf dem Agarosegel unter Verwendung genauer Marker geachtet. Der Typ SCCmec IA/II wurde dennoch bei 42 Stämmen und somit 8 % aller Isolate bestätigt. Abb. 70 SCCmec Typisierung nach Oliveira u. Lencastre [2002]. Bei den jeweiligen SCCmec-Typen inkl. des in vorliegender Arbeit definierten SCCmec IA/II typischerweise nachweisbare Loci. Zum Vergleich s. Abb. 1 Die Anteile der keinem SCCmec-Typ zuordenbaren PCR-Ergebnisse waren eher gering und zumeist übereinstimmend mit den Ergebnissen der anderen in der vorliegenden Arbeit angewandten auf die SCCmec-Region abzielenden Methoden (dru in HVR und ccr-Bestimmung). Solche Stämme waren also dann zumeist mit keiner der angewandten Methoden zur Einteilung der Stämme im Bereich von SCCmec erfassbar und lieferten bei jeder Methode entweder gar kein oder ein nicht im Auswertungsschema vorgesehenes Ergebnis. A pls B kdp C mecI A pls D dcs SCCmec I SCCmec IVA SCCmec V SCCmec II SCCmec III SCCmec III A SCCmec IA SCCmec IV SCCmec III B SCCmec IA/II C mecI C mecI C mecI D dcs D dcs D dcs G pUB110 G pUB110 G pUB110 H pT181 E E pI258 Tn554 F F Tn554 orfX E m ecA D dcs D dcs C mecI B kdp A pls m ecA m ecA m ecA m ecA m ecA m ecA m ecA m ecA m ecA G pUB110 m ecA m ecA m ecA m ecA m ecA m ecA m ecA m ecA m ecA m ecA DISKUSSION 140 Eine genauere Beschreibung und Diskussion aller nicht genau identifizierbaren Stämme inkl. SCCmec IA/II findet unter 5.1.1.1 statt. Die laut Methode bestimmbaren SCCmec-Typen ließen sich zu weit über der Hälfte mit 63 % SCCmec IV zuordnen, 65 % wenn man den erfassbaren Subtyp SCCmec IVA mit einbezieht. Am zweithäufigsten war der zu SCCmec IV nah verwandte Typ SCCmec I mit 13 %, 16 % unter Einbezug des Subtyps SCCmec IA. SCCmec III ließ sich nur bei 3 % der Stämme nachweisen, weitere 1 % zeigten die Variante SCCmec IIIA. Am seltensten nachweisbar war SCCmec II mit 2 %. Pérez-Roth et al. [2004] untersuchten 375 in den Jahren 1998 bis 2002 gesammelte MRSA eines spanischen Krankenhauses mittels PFGE, MLST und der auch in vorliegender Arbeit angewandten Multiplex-PCR zur Bestimmung des SCCmec-Typs. Am häufigsten nachweisen konnten sie dabei bei 53,4 % SCCmec II, bei 22,4 % SCCmec IA, bei 18,1 % SCCmec IVA und nur bei 3,2 % SCCmec IV. Diese Daten zeigen somit keinerlei Übereinstimmung zu den hier vorliegenden. Ursache dafür ist wahrscheinlich das länderspezifische Vorkommen von SCCmec-Typen bzw. epidemischen MRSA. Übereinstimmung mit dieser Studie besteht aber in dem Punkt, dass ein Anteil von 2,9 % der untersuchten Stämme PCR-Fragmentmuster zeigte, die nicht im Klassifizierungsschema der PCR vorgesehen waren. 5.1.1.1 Nicht nach Oliveira u. Lencastre [2002] klassifizierbare MRSA Nicht alle MRSA-Isolate können mittels der publizierten PCRs für die ccr- und mec- Region-Genkomplexe typisiert werden, dies weist auf die Existenz neuer SCCmec- Typen hin [Enright et al., 2002]. Mittels der in vorliegender Arbeit eingesetzten PCR- Methode nach Oliveira u. Lencastre [2002] konnten folgende Subtypen von SCCmec I bis SCCmec IV erfasst werden: SCCmec IA, das im Gegensatz zu SCCmec I downstream des mec-Komplexes über eine Kopie des integrierten Plasmides pUB110 verfügt. SCCmec IIIA unterscheidet sich ebenfalls in einem Plasmidmerkmal von SCCmec III, im fehlt das beim Grundtyp integrierte pT181 sowie die es flankierenden IS431-Elemente. SCCmec IIIB hingegen fehlen neben pt181 auch Tn554 sowie das mer-Operon inklusive der mit ihm assoziierten Insertionssequenzen [Oliveira et al., 2001]. Der Subtyp SCCmec IVA unterscheidet sich vom Grundtyp durch das Vorhandensein eines integrierten pUB110. Die von Oliveira u. Lencastre [2002] beschriebene Methode zur Klassifizierung von SCCmec wurde vielfach von Forschergruppen weltweit durchgeführt und lieferte dabei zumeist zuverlässige und mittels des Klassifizierungsschemas interpretierbare DISKUSSION 141 Ergebnisse. Allerdings gab es in vielen dieser Untersuchungen auch einen Teil nicht klassifizierbarer Isolate. Selbst aus der Autorengruppe dieser PCR-Methode wurde ca. ein Jahr nach Publikation eine weitere Arbeit veröffentlicht, in der MRSA beschrieben wurden, deren SCCmec durch die publizierte PCR-Methode nicht zuverlässig bestimmt werden konnte [Sousa u. Lencastre, 2003]. Allerdings hatte diese Studie zum Ziel 41 MRSA Isolate internationaler Stammsammlungen näher zu charakterisieren, die in ihren PFGE-Mustern und mecA- und Tn554-Polymorphismen, sowie ihrem epidemischen Verhalten deutlich von den sechs verbreitetsten pandemischen MRSA-Klonen abwichen. Von diesen sporadischen MRSA konnten vier anhand der PCR-Fragmentmuster nicht einem SCCmec-Typ zugeordnet werden. Diese wurden mittels des Primersets von Okuma et al. [2002], welches auf den ccr- Typ und den mec-Genkomplex abzielt, analysiert. Ein Stamm der aufgrund dieser PCRs als SCCmec III eingestuft wurde (Typ 3-ccr und class A-mec), hatte im Multiplexansatz zuvor die Amplifizierung des Locus D der dcs-Region gezeigt, der zuvor noch nie bei SCCmec III beschrieben wurde. [Sousa u. Lencastre, 2003] Auch in der vorliegenden Arbeit zeigte KKS-99-5 die drei SCCmec III spezifischen Banden inkl. des Locus C in Kombination mit Locus D der dcs-Region. Bei KKS-02-51 und KKS-02-75 zeigte sich in vorliegender Arbeit die Kombination von SCCmec III-Locus F und -Locus H mit dem SCCmec I-spezifischen Locus A, sowie bei KKS-02-75 mit dem dcs-Locus D. Zwei weitere Isolate wurden von Sousa u. Lencastre [2003] nach Okuma et al. [2002] als SCCmec II eingestuft (Typ 2-ccr und class A-mec), nachdem sie zuvor nicht die dafür typischen Banden des kdp-Operons (Locus B) und des mecI-Genes (Locus C) gezeigt hatten. Ein durch Typ 2-ccr und class B-mec als SCCmec IV definierter Stamm zeigte in der PCR nach Oliveira u. Lencastre [2002] ein SCCmec III spezifisches Element. Auch eine weitere Untersuchung der nach Oliveira u. Lencastre [2002] sicher als SCCmec IV identifizierten Stämme, zeigte dass vier von ihnen nach Okuma et al. [2002] als neue Typen einzustufen waren, da zwei von ihnen noch unbekannte mec-Komplexe und die anderen zwei dazu zusätzlich auch unbekannte ccr-Typen besaßen [Sousa u. Lencastre, 2003]. Carleton et al. [2004] fanden bei einer Untersuchung von 490 MRSA aus San Francisco neun Isolate, deren PCR-Muster nicht denen von Oliveira u. Lencastre [2002] und Okuma et al. [2002] zuzuordnen waren. Die untersuchten MRSA DISKUSSION 142 stammten aus einem Kollektiv von über sieben Jahre in San Francisco gesammelten 2154 Isolaten stationärer und ambulanter Patienten. Shukla et al. [2004] definierten in einer Studie über 581 MRSA aus Wisconsin basierend auf der PCR nach Oliveira u. Lencastre [2002] vier neue SCCmec- Varianten. Fünfzehn der von den Autoren untersuchten Stämme zeigten ein SCCmec II-Muster ohne den Locus G für das integrierte Plasmid pUB110. Ein Isolat zeigte nur Locus B (kdp-Operon) und D (dcs-Region), zwei weitere nur Locus D und E, wie BSA-03-3 der vorliegenden Arbeit. Drei weitere Isolate zeigten Locus D und G, somit laut Oliveira u. Lencastre [2002] SCCmec IVA, wurden aber von Shukla et al. [2004] als SCCmec Ib bezeichnet. Auch in einer Studie über MRSA der Grenzregion von Belgien, Deutschland und den Niederlanden konnten unter 152 Isolaten vier nicht nach Oliveira u. Lencastre [2002] typisiert werden. Ein Stamm zeigte dabei die Fragmente der spezifischen Loci aller SCCmec-Typen (Locus A bis F), ein anderer Stamm die Loci C bis F und beide in PCRs für ccrAB und ccrC den ccrA3-Typ. Bei einem Isolat wurde keiner der Loci nachgewiesen, bei einem anderen nur der Locus E [Deurenberg et al., 2005]. Darüber hinaus gibt es noch weitere Studien die nicht nach Oliveira u. Lencastre [2002] definierbare SCCmec beschreiben, so auch aus Dänemark wo eine Arbeitsgruppe die Isolate aller 81 MRSA-Infektionen des Landes im Jahr 2001 untersuchte [Faria et al., 2005]. In einer irischen Studie konnten durch Sequenzierungen der SCCmec-Region von 86 nicht nach Oliveira u. Lencastre [2002] definierbarer MRSA sieben neue SCCmec- Typen beschrieben werden [Shore et al., 2005]. Untersucht wurden in dieser Studie 172 MRSA die in den Jahren 1971 bis 2002 gesammelt wurden. Die Hälfte dieser Stämme konnte nicht sicher einem bekannten SCCmec-Typ zugeordnet werden. Dabei wurde auch hier wie bei Sousa u. Lencastre [2003] mit einer Kombination der Primer von Okuma et al. [2002] und des Multiplex-Ansatzes von Oliveira u. Lencastre [2002] gearbeitet. Unstimmigkeiten ergaben sich dabei wie folgt: Bei neun Isolaten zeigte sich im Ansatz nach Oliveira u. Lencastre [2002] das typische Bandenmuster für SCCmec IV, laut der Ergebnisse der Okuma-Primer handelte es sich aber um SCCmec I. Der Fall, dass MRSA der vorliegenden Arbeit einen solchen SCCmec I- minus-pls-Typ besitzen, der sich im Multiplex-PCR-Bild als eindeutiger SCCmec IV zeigt, kann ausgeschlossen werden, da keiner der untersuchten Stämme mit SCCmec IV ein ccrA1-Signal zeigte. DISKUSSION 143 Dies zeigt die Wichtigkeit SCCmec-Typisierungen nicht nur mit einer Methode durchzuführen. Shore et al. [2005] beschrieben außerdem ein SCCmec III-Element, dem der Locus E fehlte. Szczepanik et al. [2007] dokumentierten ein gehäuftes Auftreten von einer SCCmec III-Variante der neben Locus E auch Locus F fehlte. Dieser SCCmec IIIC- Typ wurde zuvor von Krzyszton-Russjan et al. [2005] neben dem Typ SCCmec IIID mit einem kleineren Locus H-Amplifikat beschrieben. Bei nach Okuma et al. [2002] als SCCmec II definierten Stämmen konnten Shore et al. [2005] verschiedene unvollständige SCCmec II-Muster nach Oliveira u. Lencastre [2002] beschreiben. Benannt bezugnehmend auf die Genregionen der Loci der Multiplex-PCR-Primer waren dies SCCmec II-minus-kdp, SCCmec II–minus- kdp/mecI, SCCmec II-minus-kdp/pUB110. Keiner der vorangehend von Shore et al. [2005] beschriebenen SCCmec-Subtypen wies eine hundertprozentige Übereinstimmung mit in vorliegender Arbeit beobachteten Stämmen auf. Interessant ist bei Shore et al. [2005] jedoch das Vorkommen von SCCmec, die zwar nach Okuma et al. [2002] als SCCmec IV identifiziert wurden, aber im Ansatz nach Oliveira u. Lencastre [2002] nur die Kontrollbande für mecA zeigten. Stämme ohne Amplifikate außer dem des mecA-Kontrollprimers wurden zwar auch mehrfach in vorliegender Arbeit beobachtet (s. Tab. 13), jedoch besaß nur einer dieser Stämme (KKS-03-3) ccrA2, was auf SCCmec IV (oder SCCmec II) hinweisen würde. SCCmec IV ist seit längerer Zeit für seine besonders hohe Variabilität bekannt. Die von Ma et al. [2002] beschriebenen Varianten SCCmec IVa und SCCmec IVb besitzen beide die downstream constant sequence (dcs), unterschieden sich aber in ihren DNA-Sequenzen vom ccr-Komplex bis zum Ende des SCCmec-Elementes (L- C-Region). SCCmec IVc und SCCmec IVd unterscheiden sich ebenfalls in der L-C- Region, SCCmec IVc trägt dabei eine integrierte Kopie von Tn4001, welches häufig mit aacA-aphD assoziiert ist, die auf beiden Seiten von IS256 flankiert wird [Ito et al., 2003]. Da sowohl SCCmec I als auch SCCmec IV über einen an der gleichen Stelle inserierten mec-Komplex mit IS1272 verfügen, wurde vorgeschlagen, dass SCCmec IV durch Rekombination von SCCmec I mit anderen Sequenzen entstanden ist [Ma et al., 2002]. DISKUSSION 144 Corkill et al. [2004] untersuchten außerhalb des Krankenhauses erworbene Fusidin- resistente MRSA und MSSA u.a. mittels SCCmec-Typisierung anhand von ccrA1 und ccrB1 mit den von Ito et al. [2001] beschriebenen Primern und der in vorliegender Arbeit ebenfalls angewandten Multiplex-PCR nach Oliveira u. Lencastre [2002]. Dabei entdeckten sie zwei Fusidin-resistente mecA-negative MSSA-Stämme, die positive PCR-Signale für die dcs-Region und ccrA1 und ccrB1 zeigten. Für die Region downstream von pls konnten jedoch keine Signale erhalten werden. SCCs ohne Antibiotika-Resistenzdeterminanten wurden im Methicillin-empfindlichen S. hominis GIFU12263 gefunden. Es wurde gezeigt, dass diese als ein Vehikel zum Transport einer Vielzahl von genetischen Markern zwischen Staphylokokken-Spezies dienten [Katayama et al., 2003]. Hanssen et al. [2004] fanden den mec-Locus ohne vorkommende bekannte ccrAB- Typen in MRSA und KNS. Ein MRSA-Isolat und 22 KNS zeigten keine zu ccrAB homologen Gene, trugen aber mec-Gene und waren Methicillin-resistent. Eine Möglichkeit der Entstehung von SCC-Varianten ist die Deletion von ccrAB. Dies wurde für einen MSSA vorgeschlagen der ein in orfX inseriertes DNA-Fragment besitzt, das an den Enden Ähnlichkeit zu SCCmec zeigte. Eine andere Möglichkeit der Entstehung eines solchen Elementes wäre eine chromosomale Inserierung von mecA, die unabhängig von jeglichem ccrAB-homologen Gen erfolgte [Ito et al., 2001]. Die zitierten Arbeiten zeigen, wie vielfältig SCC-Elemente sein können die von mit etablierten PCRs erfassbaren Haupttypen abweichen. Die mutmaßlichen Ursachen dieser abweichenden Strukturen sind ebenso vielfältig, basieren aber alle letztendlich auf der hohen genetischen Variabilität des SCC. Oliveira et al. [2000] zeigten, dass Polymorphismen in der downstream-Region von SCCmec durch die Anwesenheit der linearisierten Plasmide puB110, pT181, pI258 und durch IS256 verursacht werden. Hanssen u. Sollid [2007] kamen aufgrund der beobachteten großen Vielfalt von SCCmec zu der Schlussfolgerung, dass KNS ein großes Reservoir für Variationen von SCCmec darstellen. In ihrer Untersuchung von 42 Staphylokokken-Isolaten aus Norwegen beschrieben sie zehn anscheinend neue SCCmec-Typen und eine bisher unbekannte Variante von SCCmec III in KNS. Qi et al. (2005) kamen jedoch durch ihre Untersuchungen von MRSA und MR-KNS in der Schweiz zu dem Schluss, dass trotz des Vorkommens neuer SCCmec-Typen in MR-KNS der Austausch von SCCmec zwischen MR-KNS und MRSA nicht häufig stattfindet. Bei einem aus dieser Studie stammenden MRSA wurde später ein neues DISKUSSION 145 SCCmec-Element beschrieben, welches neben einem an üblicher Stelle vorkommenden ccrAB2-Locus einen ccrC-Locus zwischen orfX und der HVR besaß [Heusser et al., 2007]. Der in der vorliegenden Arbeit so häufig aufgetretene Typ SCCmec IA/II wurde bisher noch nicht beschrieben. Allerdings beschrieben Wielders et al. [2003] ein SCCmec I-Element, das zusätzlich die eigentlich SCCmec II-spezifische kdp-Region trug, auf die Locus B der PCR nach Oliveira u. Lencastre [2002] abzielt. Des Weiteren wurde ein SCCmec IV-Element beschrieben, das zusätzlich über den eigentlich nur bei SCCmec I vorkommenden Locus A der pls-Region verfügt. Beides deutet somit auf Umstrukturierungen der L-C- Region bekannter SCCmec-Elemente hin. Eine solche Umstrukturierung könnte auch Ursache der Entstehung des in vorliegender Arbeit definierten SCCmec IA/II sein. Ursachen für die anderen in vorliegender Arbeit aufgetretenen SCCmec-Varianten lassen sich ebenso nicht ohne weiteres sicher benennen. Fest steht nur, dass die nach Oliveira u. Lencastre [2002] nachgewiesenen Genloci-Kombinationen dieser Stämme so nicht bei den bekannten und durch diese PCR erfassbaren SCCmec vorkommen. Auch die durchgeführten Bestimmungen des ccr-Typs und der dru- Anzahl geben nur weitere Hinweise auf Varianten von bekannten SCCmec. Bei den nicht klassifizierbaren Stämmen wurde meist kein ccr-Typ und in sechs Fällen ccrA2 nachgewiesen. Fünf dieser ccrA2-Stämme besaßen dabei den auch bei SCCmec II vorkommenden dcs-Locus D, zwei zusätzlich den SCCmec II-spezifischen Locus B. Acht der 27 nicht klassifizierbaren Stämme zeigten 11 drus, welche in vorliegender Arbeit vor allem bei SCCmec IV, aber auch bei SCCmec IA, SCCmec I und SCCmec II vorkamen. Aus der Bestimmung der dru-Anzahl konnten somit keine weiteren hilfreichen Schlüsse zur Bestimmung von SCCmec-Varianten bei nicht nach Oliveira u. Lencastre [2002] definierbaren Stämmen gezogen werden. Für solche Schlüsse müsste eine genauere Analyse der SCCmec-Region dieser nicht klassifizierbaren Stämme mittels anderer PCR-Ansätze und DNA-Sequenzanalysen erfolgen. Zhang et al. [2005] entwickelten eine neue Multiplex-PCR, die alle bisher beschriebenen SCCmec-Typen und auch Untertypen erfasst (I, II, III, IVa, IVb, IVc, IVd und V). Im Gegensatz zu der bis dahin einzig bekannten zuverlässig DISKUSSION 146 funktionierenden Multiplex-PCR von Oliveira u. Lencastre [2002] zur Bestimmung des SCCmec-Typs zielt die PCR von Zhang et al. [2005] nicht primär auf die J- Region ab. Kondo et al. [2007] entwickelten ein System zur SCCmec-Typisierung, dass auf der Kombination von sechs Multiplex-PCRs besteht, diese zielen auf den ccr-Komplex, den mec-Komplex und Strukturen der J-Region ab. Ein Primerset zielt dabei auf die möglicherweise integrierten Plasmide pUB110 und pT181 ab. Im Gegensatz zu den Primern die bei Oliveira u. Lencastre [2002] für diese Loci enthalten sind, werden die Plasmide durch die Primer von Kondo et al. [2007] nur erfasst wenn sie downstream nahe mecA liegen. Dies zeigt zwar eine weitere Schwachstelle der Typisierung nach Oliveira u. Lencastre [2002], allerdings ist diese nach wie vor aufgrund der einfachen Durchführung in nur einem PCR-Ansatz mit 17 Primern attraktiv und anwendbar. Der Ansatz von Kondo et al. bedarf noch weiterer Optimierung, da auch mit ihm noch nicht alle getesteten Stämme eindeutig in allen Eigenschaften bestimmt werden konnten [Kondo et al., 2007]. Die zur Klassifizierung von SCCmec wichtigen Eigenschaften der nicht klassifizierbaren Stämme sind in Tab. 13 dargestellt. Von besonderem Interesse sind hierbei die beiden Stämme des Jahres 2002 aus Fritzlar (FR-02-5 und FR-02-7). Bei diesen zeigte sich in der PCR nach Oliveira u. Lencastre [2002] kein positives Signal für die interne mecA-Kontrolle. Bei der internen mecA-Kontrolle der PCR zu den Antibiotikaresistenzgenen nach Strommenger et al. [2003] erzeugten sie aber das entsprechende Fragment und auch im phänotypischen Verhalten gegen Oxacillin ließen sich keine Abweichungen zu anderen Stämmen feststellen. Auffallend ist aber, dass nicht nur diese beiden nicht klassifizierbaren Isolate aus Fritzlar dieses Phänomen zeigten, sondern auch noch fünf weitere Stämme. Drei dieser Stämme stammten ebenfalls aus dem Jahr 2002 und Fritzlar und besaßen SCCmec IVA (FR- 02-1, FR-02-2, FR-02-3), zwei Isolate mit SCCmec IVA aus 2001 und dem Klinikum Kassel (KKS-01-22, KKS-01-58). Diese Ergebnisse werfen die Frage auf, ob es Veränderungen im mecA-Bereich bei SCCmec IVA gibt und/oder diese besonderen MRSA in Fritzlar gehäuft vorkommen. DISKUSSION 147 Tab. 13 Eigenschaften der SCCmec-Region nicht klassifizierbarer Isolate. Dargestellt sind die Ergebnisse der durchgeführten PCRs zur Untersuchung von SCCmec. X = positiv / vorhanden, ° = negativ / nicht vorhanden. SCCmec-Primer-Loci nach Oliveira u. Lencastre 2002 A pls B kdp C mecI D dcs E pI258 Tn554 F Tn554 orfX G puB110 H pT181 ccr A dru KKS-99-5 ° ° X X X X X ° ° 11 KKS-99-23 ° ° ° X ° X ° ° 2 ° KKS-01-8 ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° KKS-01-9 ° ° ° ° ° ° ° ° ° 11 KKS-01-40 ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° KKS-01-56 X ° ° ° ° ° ° ° ° ° KKS-01-57 ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° KKS-02-27 X X X ° ° ° X ° ° 11 KKS-02-29 ° ° ° X ° ° ° ° ° ° KKS-02-50 ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° KKS-02-51 X ° ° ° ° X ° X ° 11 KKS-02-53 ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° KKS-02-75 X ° ° X ° X ° X ° 11 KKS-02-76 ° ° ° X ° ° ° ° ° ° KKS-03-3 ° ° ° ° ° ° ° ° 2 ° KKS-04-16 X X X X ° ° ° ° 2 ° KKS-04-71 ° ° ° ° ° ° ° ° ° 11 FR-02-5 ° ° ° X ° ° ° ° ° ° FR-02-7 ° ° ° X ° ° ° ° ° ° FR-03-12 X X X X ° ° ° ° 2 ° SZH-04-12 X ° ° X X ° ° ° 2 11 BSA-03-3 ° ° ° X X ° ° ° 2 8 HOM-03-4 ° X X X ° ° ° ° ° ° ROT-03-1 X ° ° ° ° ° ° ° ° 11 ELKS-03-6 ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° EXT-02-6 ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° EXT-03-10 X ° ° ° ° ° ° ° ° ° Wie man aus Tab. 13 entnehmen kann, kamen nicht klassifizierbare SCCmec in allen Kollektiven aus dem Klinikum Kassel, sowie in Stämmen aus verschiedenen anderen Probenahmeorten vor. Es gab zwar Stämme mit gleichen Merkmalen wie z.B. KKS- 04-16 und FR-03-12, sowie die zehn Stämme die in der PCR nach Oliveira u. Lencastre [2002] nur den mecA-Locus zeigten, aber aufgrund der verschiedenen Herkunftsorte der Isolate lässt sich keine Korrelation zwischen SCCmec-Varianten und einer bestimmten Region erkennen. Auch in den weiteren untersuchten Eigenschaften zeigen die nicht klassifizierbaren Stämme keine nennenswerten Übereinstimmungen. Diese Ergebnisse legen somit nahe, dass es sich bei den nicht klassifizierbaren Isolaten um sporadisch aufgetretene MRSA-Stämme handelt, die kein permanentes Vorkommen am untersuchten Standort, d.h. kein epidemisches Verhalten zeigen. DISKUSSION 148 Anders verhält sich dies bei Stämmen mit dem in vorliegender Arbeit definierten Typ SCCmec IA/II (s. Tab. 14). Diese kamen in allen Kollektiven des Klinikums Kassel außer dem des Jahres 2001 und 2003, sowie in zwei anderen Krankenhäusern in Kassel und in drei Kliniken außerhalb Kassels vor. Alle Stämme zeigten bis auf eine Ausnahme (KKS-04-75) keine dru-Elemente. Der überwiegende Teil besaß ccrA2, mit Ausnahme von BW-03-2 welcher kein ccr-Signal zeigte und ELKS – 03-8, ELKS – 03-17 und ELKS – 03-26 mit ccrA1. Auch in den weiteren Eigenschaften grenzte sich der SCCmec IA/II-Typ von den anderen SCCmec-Typen ab. So besaß er zwar Antibiotikaresistenzgene die in ähnlicher Häufigkeit bei SCCmec II vorkamen, aber sein Toxingenmuster entsprach eher dem von SCCmec I. In Bezug auf das Vorkommen von Plasmiden nahm er eine ebenso gesonderte Stellung ein. Dies wird auch im Folgenden unter den jeweiligen Punkten noch einmal diskutiert. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das in der vorliegenden Arbeit definierte SCCmec IA/II sich in allen untersuchten Eigenschaften in unterschiedlicher Deutlichkeit von den anderen in vorliegender Arbeit untersuchten und in der Literatur beschriebenen SCCmec-Typen unterscheidet. SCCmec IA/II stellt daher einen neuen SCCmec-(Sub)typ dar. DISKUSSION 149 Tab. 14 Eigenschaften der SCCmec IA/II-Stämme. X = postiv / vorhanden, ° = negativ / nicht vorhanden, G = großes Plasmid, B = großes und kleines Plasmid, K = kleines Plasmid, n.b. = nicht bestimmt dr us cc rA aa cA -a ph D er m A er m C te tK te tM va tA va tB se a se b se c se d se e se g se h se i se j ts t lu kF Pl as m id Pl as m id ty p KKS-99-37 0 2 X X ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° X ° ° ° ° ° G pFL-35-2’ KKS-99-52 0 2 ° X ° ° ° ° ° ° ° ° X ° X ° X X ° ° G pFL-35-1 KKS-02-4 0 2 ° X ° ° ° ° ° ° ° ° X ° X ° X X ° ° G n.b. KKS-02-5 0 2 ° X ° ° ° ° ° ° ° ° X ° X ° X X ° ° G pFL-35-2 KKS-02-6 0 2 ° X ° ° ° ° ° ° ° ° X ° X ° X X ° ° G pFL-35-2’ KKS-02-21 0 2 ° X ° ° ° ° ° ° ° ° X ° X ° X X ° ° G n.b. KKS-02-33 0 2 ° X ° ° ° ° ° ° ° ° X ° X ° X X ° ° G n.b. KKS-02-34 0 2 ° X ° ° ° ° ° ° ° ° X ° X ° X X ° ° G pFL-35-3 KKS-02-57 0 2 ° X ° ° ° ° ° ° ° ° X ° X ° X X ° ° G n.b. KKS-02-58 0 2 ° X ° ° ° ° ° ° ° ° X ° X ° X X ° ° G pFL-35-1 KKS-02-59 0 2 ° X ° ° ° ° ° ° ° ° X ° X ° X X ° ° G n.b. KKS-04-10 0 2 X X X X X X ° ° ° ° X ° X ° X X ° ° G pFL-35-1 KKS-04-35 0 2 ° X ° ° ° X X ° ° ° X ° X ° X X ° ° B n.b. KKS-04-45 0 2 ° X X X X X X ° ° ° X ° X ° X X ° ° G n.b. KKS-04-56 0 2 ° X X ° X X ° ° ° ° X ° X ° X X ° ° G n.b. KKS-04-67 0 2 ° X ° X X X ° ° ° ° X ° ° ° ° ° ° ° G n.b. KKS-04-75 8 2 X X X X X X ° ° ° ° X ° X ° X X ° ° G n.b. BW-03-1 0 2 ° X ° ° ° ° ° ° ° ° X ° X ° X X ° ° B n.b. BW-03-2 0 ° ° X ° ° ° ° ° ° ° ° X ° X ° X X ° ° G pFL-35-4 BW-03-3 0 2 ° X ° ° ° ° ° ° ° ° X ° X ° X X ° ° K n.b. BW-03-4 0 2 ° X ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° X ° X ° ° ° ° ° BW-03-5 0 2 ° X ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° X ° X X ° ° G n.b. BW-03-6 0 2 ° X ° ° ° ° ° ° ° ° X ° X ° X X ° ° B n.b. BW-03-15 0 2 ° X ° ° ° ° ° ° ° ° X ° ° ° ° ° ° ° B n.b. IMH-03-7 0 2 ° ° ° ° X ° ° ° ° ° X ° ° ° X X ° ° K n.b. IMH-03-11 0 2 ° ° ° ° X ° ° ° ° ° X ° ° ° X X ° ° B n.b. IMH-03-15 0 2 ° X ° ° ° ° ° ° ° ° X ° ° ° ° ° ° ° B n.b. IMH-03-17 0 2 ° X ° ° ° ° ° ° ° ° X ° ° ° ° ° ° ° B n.b. SZH-04-5 0 2 X X X X X X ° ° ° ° X ° X ° X X ° ° G n.b. SZH-04-6 0 2 ° X X X X X X ° ° ° X ° X ° X X ° ° G n.b. DIAKS-03-2 0 2 ° X ° ° ° ° ° ° ° ° X ° X ° X X ° ° B n.b. DIAKS-03-3 0 2 ° X ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° X ° X X ° ° G n.b. DIAKS-03-26 0 2 ° X ° ° ° ° ° ° ° ° X ° X ° X X ° ° K n.b. DIAKS-03-27 0 2 ° X ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° X ° X X ° ° ° ° ELKS-03-8 0 1 ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° B n.b. ELKS-03-17 0 1 ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° B n.b. ELKS-03-26 0 1 ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° EXT-03-13 0 2 ° X ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° X ° X ° ° ° B n.b. EXT-03-16 0 2 ° X ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° X ° X X ° ° G n.b. EXT-03-22 0 2 ° X ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° X ° X ° ° ° G pFL-35-2 EXT-03-24 0 2 ° X ° ° ° ° ° ° ° ° X ° X ° X X ° ° K n.b. EXT-03-26 0 2 ° X ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° X ° X X ° ° G pFL-35-1 DISKUSSION 150 5.1.2 Bestimmung der dru-Anzahl in der HVR Der Anteil der nicht typisierbaren Stämme war bei der Bestimmung der dru-Anzahl [Nishi et al., 1995] im Vergleich mit der PCR zur Typisierung von SCCmec nach Oliveira u. Lencastre [2002] und den PCRs zur Bestimmung des ccr-Typs [Okuma et al., 2002; Ito et al., 2004] mit 18 % am höchsten. Die Stabilität der dru-Elemente sowohl innerhalb der Kolonien eines Stammes als auch in dessen Generationenfolge wurde jedoch von Tohda et al. [1997] gezeigt. Bei 120 MRSA eines Krankenhauses in Tokyo konnten sie ferner fünf verschiedene dru-Anzahlen feststellen, die in unterschiedlichen Häufigkeiten vorkamen. Senna et al. [2002] untersuchten mit dieser Methode 254 MRSA-Stämme die zwischen 1996 und 1998 in Krankenhäusern zweier Städte in Brasilien und Uruguay gesammelt wurden und konnten bei all diesen Stämmen Amplikons erhalten, die zwischen 290 und 650 bp groß waren. Auch die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse wurde dabei erfolgreich belegt. Die Studie hatte zum Ziel das Diskriminierungspotential von HVR- und PFGE-Typisierung zu vergleichen. Am häufigsten nachgewiesen wurden von Senna et al. [2002], dabei die Anzahl von 10 drus bei 46 % der Stämme, gefolgt von 22 % mit 11 drus, 20 % mit 8 drus und 6,7 % mit 7 drus. Des Weiteren konnten noch Stämme mit 3, 5, 9 und 12 drus detektiert werden. Diese Werte unterscheiden sich deutlich von den in der vorliegenden Arbeit ermittelten von 3 % für 10 drus, 67 % für 11 drus, 9 % für 8 drus und 3 % für 7 drus, andere Anzahlen von drus konnten nicht nachgewiesen werden. Eine Ursache liegt aber sicher im Probenahmejahr der untersuchten Stämme. Die von Senna et al. [2002] untersuchten Stämme stammen aus den Jahren 1996 bis 1998, entsprechen also zeitlich gesehen am ehesten den Stämmen aus KKS-99. Bei diesem Kollektiv waren die Anteiligkeiten deutlich anders als bei den Kollektiven der Folgejahre. So kamen 10 drus bei 8,6 % der Stämme vor, 11 drus bei 29,3 % und 8 drus bei 37,9 %. Auch diese Werte unterscheiden sich zwar von denen von Senna et al. [2002] ermittelten, liegen aber in ähnlicheren Bereichen. Schmitz et al. [1998] untersuchten ebenfalls eine Kollektion von MRSA, um die Typisierung durch HVR-PCR mit anderen Typisierungsmethoden zu vergleichen. Sie wendeten dabei selbst entwickelte Primersets für die HVR-Region bei 183 MRSA aus der Region Düsseldorf an, die aus den Jahren 1993 bis 1995 stammten. Dabei konnten sie reproduzierbar fünf verschiedene Typen unterscheiden die 6, 7, 8, 9 oder 10 drus enthielten. DISKUSSION 151 Nishi et al. [2002] analysierten mit der von ihnen entwickelten HVR-PCR 809 MRSA eines japanischen Universitätsklinikums. Da ihnen aber die Unzulänglichkeit ihrer Methode als alleinige Unterscheidungsmethode bekannt war, kombinierten sie diese mit einer Multiplex-PCR zum Nachweis der Toxingene sea bis see, tst-1, eta und etb [Mehrotra et al., 2000]. Dabei konnten sie vier neue dru-Genotypen nachweisen und Kombinationen von dru-Typen und Toxingenen. Es gibt aber keine Übereinstimmung zu Ergebnissen der vorliegenden Arbeit. Bessere Ergebnisse zur Differenzierung von MRSA-Stämmen mit Hilfe der HVR lassen sich mittels Sequenzanalysen der dru-Bereiche [Nahvi et al., 2001] oder über Hybridisierungen dieser Region [Salmenlinna u. Vuopio-Varkila, 2001] erreichen. 5.1.3 Bestimmung von ccrA1, ccrA2, ccrA3 und ccrC Das bisher nur bei Stämmen mit dem jüngsten beschriebenen SCCmec V alleinig vorkommende ccrC [Ito et al., 2004] konnte bei keinem der in der vorliegenden Arbeit untersuchten Stämme alleine nachgewiesen werden. Es kam nur bei Stämmen vor, die auch ccrA3 besaßen und vom Typ SCCmec III waren, ein in der Literatur bekanntes Phänomen [Chongtrakool et al., 2006]. Die Überprüfung des Vorhandenseins von ccrC war in vorliegender Arbeit eine Absicherung der SCCmec- Typisierung mittels der PCR nach Oliveira u. Lencastre [2002], da diese SCCmec V nicht erfasst, sondern falsch als SCCmec III klassifiziert [Zhang et al., 2005]. Auch die Durchführung der PCR zur Feststellung von ccrA1, ccrA2 und ccrA3 diente eher der Überprüfung bzw. Ergänzung der anderen auf die SCCmec-Region abzielenden Methoden, deren Ergebnisse auch verglichen werden sollten. Ohne ergänzende Methoden durchgeführt ist die Multiplex-PCR zur Bestimmung von ccrA1, ccrA2 und ccrA3 nur von bedingter Aussagekraft für den SCCmec-Typ, da die Primer nur Teil eines Primersets zur Bestimmung von SCCmec mittels Klassifizierung des ccr- und des mec-Komplexes sind [Okuma et al., 2002]. Eine gewisse Aussagekraft ist aber natürlich vorhanden, so sollten Stämme mit ccrA1 SCCmec I, Stämme mit ccrA2 SCCmec II oder SCCmec IV und Stämme mit ccrA3 SCCmec III besitzen (s. 1.3). Jedoch gibt es auch Belege für Abweichungen der beschriebenen Korrelation von ccr- und SCCmec-Typ [Chongtrakool et al., 2006; Heusser et al., 2007; Hanssen u. Sollid, 2007] Beim größten Teil der Stämme (78 %) wurde ccrA2 nachgewiesen, welches bei SCCmec II und SCCmec IV vorkommen sollte. Das bei SCCmec I vorkommende DISKUSSION 152 ccrA1-Gen wurde bei 7 %, das bei SCCmec III vorkommende ccrA3-Gen bei 3 % der Isolate nachgewiesen. Betrachtet man die Diagramme der in vorliegender Arbeit ermittelten Ergebnisse zur Verteilung der ccr-Typen (Abb. 14, Abb. 26, Abb. 35, Abb. 36) so zeigen sie große Ähnlichkeit zu der Verteilung der SCCmec-Typen Abb. 10, Abb. 24, Abb. 31, Abb. 32). Auf den genaueren Zusammenhang zwischen ermittelten SCCmec nach Oliveira u. Lencastre [2002] und den ermittelten ccr-Typen, sowie der festgestellten Anzahl von drus in der HVR wird in 5.7.1 nochmals eingegangen. Die Bedeutung dieser PCR für die Feststellung des SCCmec-Typs wurde bereits unter 5.1.1.1 diskutiert. 5.2 Nachweis von Antibiotikaresistenzgenen Alle sieben der in der vorliegenden Arbeit untersuchten Resistenzgene (aacA-aphD, ermA, ermC, tetK, tetM, vatA,vatB) konnten bei keinem der untersuchten 501 MRSA- Stämme nachgewiesen werden. Die maximale Anzahl der vorgefundenen Resistenzgene belief sich auf sechs und kam nur bei 1,8 % (n=9) der Stämme vor. Auch fünf oder vier Resistenzgene bei einem Stamm waren mit 0,2 % bzw. 1,8 % sehr selten. Etwas häufiger konnten drei (9,2 %) oder zwei (21,4 %) Resistenzgene nachgewiesen werden. Der größte Teil der Stämme (37,5 %) besaß somit nur eines der untersuchten Antibiotikaresistenzgene, 28,1 % sogar gar keins. Diese ermittelten Daten stimmen mit den Beobachtungen verschiedener Autoren [Lelievre et al., 1999; Witte et al., 1997, 2001; Braulke et al., 1999] überein, dass seit Mitte der 90er Jahre in Europa der bis dahin typische multiresistente Phänotyp von MRSA rückläufig ist und statt dessen epidemische Stämme mit weniger breitem Resistenzspektrum vermehrt auftreten. Andererseits werden aber auch immer wieder Ausbrüche „alter“ epidemischer MRSA mit größerem Resistenzspektrum beschrieben [Werner et al., 2001; Sousa u. Lencastre 2004]. Dass dieser Effekt auch innerhalb des Klinikums Kassel zu beobachten ist, legen die in Abb. 27 dargestellen Daten der Entwicklung des Vorkommens von Antibiotikaresistenzgenen von 1999 bis 2004 nahe. Dort zeigt sich, dass einzig im Kollektiv aus 2004 alle untersuchten Antibiotikaresistenzgene zu finden waren. Bei den in der vorliegenden Arbeit nachweisbaren Antibiotikaresistenzgenen handelt es sich sozusagen um Gene die Resistenz gegen „alte“ Antibiotika vermitteln. Gerade die Resistenz gegenüber solchen Antibiotika wie Makrolide, Lincosamide, DISKUSSION 153 Gentamicin und Tetracyclin ist wieder von gesteigertem Interesse [Klein u. Cunha, 2001; Strommenger et al., 2003]. Das Resistenzverhalten gegenüber solchen Antibiotika gibt durchaus Aufschluss über die Epidemiologie von MRSA-Stämmen. Der Resistenzphänotyp von MRSA hat sich in den letzten Jahren verändert. Epidemische Stämme wie die vom Barnim-Typ oder der Süddeutsche-Stamm zeigen neben den mecA-vermittelten häufig keine oder nur ein bis zwei weitere Antibiotikaresistenzen [Layer et al., 2006]. Europaweit wurde vor allem die Verbreitung von MRSA-Stämmen mit erhöhter Empfindlichkeit gegen Gentamicin, aber auch gegen andere Antibiotika wie Tetracyclin, Lincomycin, Cotrimoxazol und Rifampicin beobachtet [Lelièvre et al., 1999; Blanc et al., 2001; Hiramatsu et al., 2002; Witte, 2004]. Auch bei den in vorliegender Arbeit untersuchten Stämmen ließ sich über die Jahre eine deutliche Veränderung beim Vorkommen von Antibiotikaresistenzgenen feststellen. Allerdings ließ sich eine eben beschriebene Rückläufigkeit des Vorkommens von Resistenzgenen nur bedingt bestätigen, s.a. 5.5.2. Am häufigsten bei allen untersuchten Stämmen waren die Gene ermA mit 38 % und ermC mit 34 %, welche beide Resistenz gegenüber Makroliden vermitteln. Das Aminoglykosidresistenzgen aacA-aphD kam bei 21 % der Stämme vor, ebenso tetM, tetK hingegen nur bei 5 % der 501 MRSA. Noch seltener nachweisbar waren die Resistenzgene vatA mit 4 % und vatB mit 2 %. Die PCR-Ergebnisse korrelierten dabei mit den ermittelten phänotypischen Resistenzdaten. Von den 189 ermA-positiven Stämmen besaßen 24,9 % auch ermC, von den 172 ermC positiven 27,3 % ermA. Die Kombination dieser Gene kam bei 9,3 % aller untersuchten Stämme vor, während ermA ohne ermC bei 28,3 % und ermC ohne ermA bei 25,0 % nachweisbar war. Beide Gene ließen sich auch in Kombination mit nahezu allen anderen untersuchten Antibiotikaresistenzgenen feststellen. Von den 110 tetM positiven Stämmen besaßen 13,6 % auch tetK, von den 22 tetK postiven 68,2 % auch tetM. Bei 3,0 % aller untersuchten Stämme kamen tetK und tetM vor, während nur 1,4 % tetK ohne tetM und 19,0 % tetM ohne tetK aufwiesen. Bei den Streptograminresistenz vermittelnden Genen kam vatB nur bei einem Stamm nicht zusammen mit vatA vor. Beide Gene gemeinsam ließen sich ebenso wie vatA ohne vatB bei 1,8 % aller MRSA nachweisen. DISKUSSION 154 Laut RKI (Stand 2003) waren ca. 72 % aller MRSA Mitteleuropas resistent gegen Erythromycin (25,4 % S. aureus), 56 % gegen Clindamycin und 24 % gegen Gentamicin [RKI, 2003]. Laut Daten des GENARS Projektes konnten in Deutschland von 2002 bis 2004 keine deutlichen Veränderungen der phänotypischen Häufigkeiten gegen Penicillin, Erythromycin, Doxycyclin und Linezolid festgestellt werden, nur die Häufigkeit der Oxacillin-Resistenz steigerte sich von 9 % auf 11 % [Huppertz et al., 2005]. Schmitz et al. [2000 b] zeigten bei der Untersuchung von 851 klinischen S. aureus aus 24 europäischen Kliniken, dass ermA bei MRSA mit 88 % häufiger vorkommt als bei MSSA mit 38 %. Die in vorliegender Arbeit ermittelte Häufigkeit von ermA bei allen Isolaten würde somit mit der von MSSA übereinstimmen. Für ermC ermittelten Schmitz et al. [2000 b], dass dieses mit 47 % bei MSSA deutlich häufiger ist als mit 5 % bei MRSA. Es liegt in vorliegender Arbeit also eine deutliche Abweichung zu den Ergebnissen von Schmitz et al. [2000 b] vor, die ihre Ursache aber auch darin haben kann, dass in vorliegender Arbeit Stämme eines sehr begrenzten Gebietes untersucht wurden. Allgemein lässt sich zum Vorkommen von Antibiotikaresistenzen noch sagen, dass die Entwicklung von Resistenzen durch Erhalt von Resistenzdeterminanten oder durch Mutationen häufig auf Kosten der Fitness eines Bakteriums geht. Solch Fitness-Verlust zeigt sich z.B. in einer verminderten Wachstumsrate. Resistenzdeterminanten zu besitzen ist somit meist nur dann ein Gewinn für das Bakterium solange es dadurch einen unmittelbaren Selektionsvorteil hat [Andersson u. Levin, 1999; Ender et al., 2004; Novick et al., 2001]. 5.3 Nachweis von Toxingenen Bei keinem der in der vorliegenden Arbeit untersuchten MRSA-Stämme ließen sich eta oder etb nachweisen. Dies stimmt mit der Feststellung überein, dass nur etwa 5 % der klinischen S. aureus Stämme überhaupt Gene für Exfoliativtoxine tragen [Dancer u. Noble, 1991]. Auch bei anderen Untersuchungen von S. aureus- Kollektiven konnten diese Gene nur selten nachgewiesen werden. So konnten Becker et al. [2003], die 429 S. aureus aus Blutkulturen und Nasenabstrichen untersuchten, nur bei 1,2 % dieser Stämme eines der beiden Exfoliativtoxine nachweisen. DISKUSSION 155 Auch das Gen tst für das TSST-1 war in der vorliegenden Arbeit mit 2 % nur sehr selten in den untersuchten Stämmen anzufinden, lukF sogar nur bei 1 % der Isolate. Am häufgsten waren seg und sei, beide mit einer Häufigkeit von 79 %. Ebenfalls mit ähnlichen Häufigkeiten kamen sed (11 %) und sej (13 %) vor. Bei nahezu der Hälfte der Stämme (47 %) konnte sec nachgewiesen werden. Seltener waren sea, seb, see und seh mit 4 %, 2 %, 2 % und 3 % respektive. Was das gleichzeitige Vorkommen mehrerer Toxingene bei einem Stamm betrifft, so konnten in vorliegender Arbeit nicht mehr als vier der möglichen zwölf bei einem MRSA nachgewiesen werden. Dies war bei 11 % der Stämme der Fall. 48 % der Stämme besaßen drei der Toxingene, 24 % zwei und 8 % nur eins. Die Anzahl der MRSA ohne eines der Toxingene lag bei 9 %. Mit anderen Studien lassen sich diese Werte häufig nur bedingt vergleichen, da viele der Studien auf dem immunologischen Nachweis der Toxingenprodukte basieren. Hierbei kann es zur falsch-negativen Einstufung von eigentlich Toxingen-positiven Stämmen kommen, da die Produktion der Toxine von einer Vielfalt von Faktoren abhängig ist und evtl. bedingt durch Laborbedingungen zu schwach für einen Nachweis sein kann [Atanassova et al., 2001; Bergdoll, 1995]. Melter et al. [2003] analysierten in Tschechien aus Krankenhäusern stammende MRSA aus den Jahren 2000 bis 2002 und untersuchten repräsentative Stämme jedes vorkommenden klonalen Typs bezüglich des Vorkommens der Genprodukte SEA, SEB, SEC, SED, SEE, TSST-1, ETA und ETB und konnten dabei nur SEA in 16 Isolaten nachweisen. Hingegen untersuchten Graham et al. [2006] MRSA und MSSA aus Nasenabstrichen nicht-institutionalisierter Personen auf das Vorkommen von Toxingenen und konnten dabei bei MRSA sea (8 %), seb (9 %), sec (2,7 %), sed (57,3 %), seh (1,3 %), tst (6,7 %) und PVL (8 %) nachweisen. Dabei konnten sea und tst häufiger in MSSA als in MRSA nachgewiesen werden, sed und PVL häufiger in MRSA. Schmitz et al. [1997] konnten bei der vergleichenden Untersuchung von MRSA und MSSA des Düsseldorfer Raumes bzgl. des Vorkommens von sea–sed und tst-1 keine signifikanten Unterschiede feststellen. Chini et al. [2006] zeigten bei 177 untersuchten MRSA eines griechischen Krankenhauses aus 2001 bis 2003, die auf das Vorhandensein des Enterotoxin Gen Clusters (egc) mit seo, sem, sei, sen und seg und das Vorkommen von tst hin DISKUSSION 156 untersucht wurden, dass 66 % der Stämme keines der Toxingene und 34 % zumindest eins besaßen. Eine umfassende Arbeit über das Vorkommen von Toxingenen und deren Kopplung bei S. aureus liefert Becker et al. [2003]. Dabei wurden 429 S. aureus untersucht, die aus einer deutschen multizentrischen Studie an 32 verschiedenen Krankenhäusern und aus Routineuntersuchungen eines Zeitraumes von sechs Jahren stammten. Nachgewiesen wurden die auch in der vorliegenden Arbeit untersuchten Toxingene mit den gleichen PCR-Ansätzen. Becker et al. [2003] konnten bei 73 % der Stämme zumindest eines der Gene nachweisen. Am häufigsten waren seg und sei mit je 55 %, die in dieser Untersuchung ausnahmslos in Kombination miteinander vorkamen. Ebenfalls immer in Kombination miteinander wurden sed und sej mit 7 % nachgewiesen. Diese Kopplungen bedingten, dass bei den meisten Stämmen mehr als ein Toxingen nachgewiesen wurde. Häufig vorkommend waren auch tst mit 20,3 %, sea mit 15,9 % und sec mit 11,2 %. Tst kam häufiger in Kombination mit anderen Genen als alleine vor, mit 8,6 % am häufigsten zusammen mit der seg-sei Kombination. Selten kamen auch sea und sec alleine vor. Eine weitere häufige Kombination war die von sec mit seg-sei, die bei 7,7 % der Stämme vorkam. Lediglich 13,5 % der Stämme besaßen nur ein einziges der Gene. Becker et al. [2003] zeigten somit häufiger Kombinationen von Toxingenen außer der von seg-sei und sed-sej als sonst in der Literatur beschrieben [Lehn et al., 1995]. Seb kam bei 6,8 % der Stämme vor, see bei nur 0,5 %, seh bei 5,4 %, eta bei 1,2 % und etb bei 0,5 %. Mit diesen Daten stimmen die in der vorliegenden Arbeit ermittelten Ergebnisse nur teilweise überein. Der Anteil der toxingenfreien Stämme war mit 9 % gegenüber 27 % bei Becker et al. [2003] deutlich geringer. Die häufigsten Gene waren auch in vorliegender Arbeit seg und sei, allerdings zu je 79 %. Weitere Übereinstimmung mit Becker et al. [2003] besteht in etwa beim Vorkommen von sed und sej, seh und der Seltenheit von seb, see, eta und etb. Vollkommen abweichend sind die Werte für sec, sea und vor allem auch tst. Auch bezüglich des gekoppelten Vorkommens von Toxingenen besteht nur teilweise Übereinstimmung. Auch in vorliegender Arbeit kamen seg und sei zumeist gemeinsam vor (78 % von n=501), jedoch besaßen neun der Stämme seg alleine oder in Kombination mit anderen Genen und vier Stämme sei alleine oder mit anderen Toxingenen. Auffallend häufig vorkommend war allerdings auch in DISKUSSION 157 vorliegender Arbeit die Kombination von seg-sei mit sec, die bei 41,7 % der Isolate nachweisbar war. Die Kopplung von sed und sej war in vorliegender Arbeit nicht so strikt wie von Becker et al. [2003] beschrieben. So kamen in vorliegender Arbeit fünf Stämme mit sed ohne sej und 13 Stämme mit sej ohne sed vor, während die Gene gemeinsam bei 49 Stämmen (9,8 %) anzutreffen waren. 7,8 % der Stämme besaßen sowohl die Kombination seg-sei als auch sed-sej. Eine Kopplung von seg mit sei wird ebenfalls von Monday u. Bohach [2001] beschrieben, während Mc Lauchlin et al. [2000] auch das Vorkommen von seg alleine beschreiben. Die Kopplung von sed und sej beruht laut Zhang et al. [1998] darauf, dass das sed kodierende Plasmid auch das sej-Gen enthält, welches in entgegengesetzter Richtung zu sed transkribiert wird und von diesem durch eine 895 bp Region getrennt ist. Zhang et al. [1998] schlugen zwar daraufhin das stets gemeinsame Vorkommen von sed und sej vor, belegten es aber nur bei sechs Stämmen. Die Unterschiede in der Häufigkeit der Toxingene bei Becker et al. [2003] und der vorliegenden Arbeit könnten darin ihre Ursache haben, dass es Unterschiede im Vorkommen von Toxingenen bei MRSA und MSSA gibt. Dies zeigten neben Graham et al. [2006] auch Layer et al. [2006], die ebenfalls MSSA und MRSA bzgl. des Vorkommens von sea-see, seg-sej, tst nach Becker et al. [1998, 2003] und lukS-lukF hin untersuchten. Dabei stellten sie fest, dass 40 % der MSSA eines deutschen Universitätskrankenhauses tst und bis zu vier weitere Enterotoxingene besaßen, wobei die klassischen Enterotoxingene sea, seb und sec selten nachgewiesen wurden. Nur bei acht Isolaten konnte keines der Gene ermittelt werden. Im gleichen Zeitraum isolierte MRSA verfügten zumeist über zwei oder drei Gene des egc. Tst- positive MRSA wurden von dieser Arbeitsgruppe bisher selten entdeckt. Bei einer Untersuchung von 156 MRSA aller belgischen Krankenhäuser wurde bei 9 % tst nachgewiesen [Denis et al., 2006]. Dennoch wird das Vorkommen von tst- positiven MRSA meist als eher selten beschrieben [Ghebremedhin et al., 2005; Kikuchi et al., 2003; Schmitz et al. 1997]. Durand et al. [2006] untersuchten die Eigenschaften von tst-positiven S. aureus in Frankreich und wiesen dabei nach, dass 26,2 % dieser Isolate MRSA waren, die aufgrund der weiteren untersuchten Eigenschaften als eng verwandt eingestuft DISKUSSION 158 wurden. So besaßen alle zusätzlich sed, sec, sel, sem, seo und zeigten fast alle SCCmec IV. Tst-positive Stämme wurden bei S. aureus häufig als nah verwandt beschrieben [Musser et al., 1990; Peackock et al., 2002; Jarraud et al., 2002]. Tst kam in vorliegender Arbeit sowohl alleine (n=4), als auch in Kombination mit sea (n=2); seb (n=3); sec, seg und sei (n=1); seg und sei (n=1) vor. Das Vorkommen von Toxingenen im vorliegenden Kollektiv lässt nur unter Einbeziehung der anderen Versuchsergebnisse besonders interressante Schlüsse zu. So lassen sich sowohl Entwicklungen im Laufe der Zeit, als auch Zusammenhänge mit anderen Eigenschaften der untersuchten MRSA feststellen. 5.4 Zusammenhang des Vorkommens von Antibiotikaresistenzgenen und Toxingenen In der vorliegenden Untersuchung von MRSA ließ sich zeigen, dass Stämme mit mehreren der untersuchten Resistenzgene häufig auch mehrere Toxingene besaßen, dass Multiresistenz also sozusagen mit „Multitoxizität“ einhergeht. Allerdings ist der Anteil der Stämme, die überhaupt mehr als drei Resistenz- bzw Toxingene besitzen, mit 3,8 % bzw. 11 % eher gering. Das Bestehen eines Zusammenhangs zwischen Toxingengehalt und dem Gehalt an Antibiotikaresistenzgenen zeigt sich auch darin, dass über die Hälfte der Stämme ohne eines der untersuchten Toxingene auch kein Antibiotikaresistenzgen besaß, während dieser Anteil bei Stämmen mit ein bis vier Toxingenen deutlich geringer war (s. Abb. 22, Abb. 23). Auch in der Literatur lassen sich vereinzelt Hinweise darauf finden, dass das Vorkommen von Antibiotikaresistenzen in Zusammenhang steht mit dem Besitz von Virulenzfaktoren [Martinez u. Baquero, 2002; Sakoulas et al., 2003; Gill et al., 2005]. Vorliegende Untersuchungen bestätigen solche Hinweise. DISKUSSION 159 5.5 Vergleich der Kollektive aus dem Klinikum Kassel 5.5.1 Vorkommen von SCCmec-Typen bei KKS-99 – KKS-04 Auffällig an den Ergebnissen der SCCmec-Typisierung nach Oliveira u. Lencastre [2002] ist vor allem, dass das Vorkommen von SCCmec IV im Laufe der Jahre stark zugenommen hat. Kam SCCmec IV in KKS - 99, in dem SCCmec I vorherrschend war, nur zu 15,5 % vor, so steigt der Anteil bei KKS-03 auf 87,1 %. Die in KKS - 99 noch recht häufigen SCCmec I (zusammen mit SCCmec IA ca. 50 %) und SCCmec III (mit SCCmec IIIA ca. 23 %), ließen sich in den Kollektiven aus jüngeren Jahren kaum noch nachweisen. So kamen SCCmec I und IA in KKS - 02 nur noch bei 11,8 % der Stämme vor, in KKS - 04 nur noch SCCmec I bei 3,7 %. SCCmec III ließ sich außer bei KKS - 99 nur noch bei 10,2 % der Stämme aus KKS - 01 nachweisen. SCCmec II kam in allen Kollektiven wenn überhaupt nur in geringer Anzahl vor. Die Zusammensetzung der SCCmec-Typen in KKS - 99 ist insgesamt vielfältiger als die in den anderen Kollektiven (Abb. 24). Die Beobachtung des vermehrten Auftretens von SCCmec IV wurde seit längerem in verschiedenen Ländern gemacht. Als Ursache hierfür wird angenommen, dass SCCmec IV aufgrund seiner kompakteren Bauweise ohne zusätzliche Antibiotikaresistenzdeterminanten (s. Abb. 1) leichter übertragen werden kann [Robinson u. Enright, 2003]. Veränderungen im Vorkommen bestimmter MRSA-Stämme werden bei ähnlichen Untersuchungen immer wieder festgestellt. So z.B. die Verdrängung des hauptsächlich vorkommenden pandemischen MRSA eines Krankenhauses, dem sog. Iberischen Klon (ST247-MRSA-IA) innerhalb von fünf Jahren durch den britischen EMRSA-16 Klon (ST36-MRSA-II) [Pérez-Roth et al., 2004]. Beim Betrachten der Zusammensetzung der Kollektive KKS - 99 bis KKS - 04 wird deutlich, dass die Ergebnisse der unterschiedlichen Klassifizierungsmethoden positiv korrelierten und sich zumeist der dem SCCmec-Typ zugehörige ccrA-Typ nachweisen ließ und ein Zusammenhang zwischen SCCmec und dru-Anzahl besteht. Dies ist in den Abb. 25 und Abb. 26 zu erkennen. Betrachtet man diese vergleichend, wird in beiden ersichtlich, dass besonders in KKS - 99 eine sehr viel höhere Variabilität vorhanden ist als in den jüngeren Kollektiven und sich im Laufe der Zeit ein bestimmter Typ durchgesetzt zu haben scheint (SCCmec IV bzw. 11 drus). DISKUSSION 160 Die Ergebnisse der HVR-PCR ergeben somit ein dem der SCCmec-PCR sehr ähnliches Bild, wobei die unterschiedlichen Möglichkeiten hierbei limitierter sind, denn es gab nur das Ergebnis 7, 8, 10 oder 11 drus. Der Zusammenhang zwischen SCCmec-PCR und ccrA-Typ-PCR ist eindeutiger, die Ergebnisse dieser beiden Methoden sollten sich gegenseitig bestätigen. Dies ist bei einem Großteil der Stämme der Fall, Abweichungen sind nur in wenigen Fällen aufgetreten. 5.5.2 Vorkommen von Antibiotikaresistenzgenen bei KKS-99 bis KKS-04 Anhand der Untersuchung der Häufigkeit der sieben untersuchten Resistenzgene lassen sich ebenfalls deutliche Unterschiede zwischen den analysierten Kollektiven erkennen. Mit am auffälligsten bei der Gesamtbetrachtung dieser PCR-Analyse ist das Ergebnis, dass in KKS - 04 alle getesteten Resistenzgene nachweisbar waren. Zwar zum Teil in eher geringer Anzahl, so wie bei aacA-aphD, tetK, vatA und vatB mit 15 %, 14 %, 15 % und 11 %, aber es gab nicht wie bei den anderen Kollektiven den Fall, dass ein Resistenzgen gar nicht nachweisbar war. Ein ähnliches Bild zeigt sich nur bei KKS - 01, bei dem sechs der sieben Resistenzgene detektierbar waren, allerdings in geringerem Umfang. Bei den verbleibenden Kollektiven KKS - 99, KKS - 02 und KKS - 03 konnten nur für vier der Resistenzgene Signale erhalten werden. Die Steigerung der Anzahl von Antibiotikaresistenzgenen im Laufe der Zeit steht scheinbar im Gegensatz zu der häufig geäußerten Beobachtung, dass das Vorkommen von Antibiotikaresistenzen bei MRSA seit Mitte der 90er eher rückläufig ist [Aubry-Damon et al., 1997; Lelievre et al., 1999; Polyzou et al., 2001; Laurent et al., 2001]. Betrachtet man aber Abb. 28 zur Ausprägung der Multiresistenz der Kollektive, so lässt sich interressanterweise feststellen, dass dieser Trend sich durchaus auch bei den in vorliegender Arbeit untersuchten MRSA feststellen lässt. Von 1999 bis 2003 nimmt der Anteil der Stämme mit keinem oder einem Resistenzgen von 17,4 % auf 77,4 % zu. Bei den MRSA aus 2004 fällt er aber wieder auf 25,9 %. Bei diesen Stämmen ist der Anteil der Gruppe mit mehr als drei Resistenzgenen mit 1,4 % am höchsten. Eine mögliche Erklärung ist, dass sich, wie gelegentlich beobachtet, bestimmte „ältere“ epidemische MRSA mit mehreren Resistenzen wieder verbreitet haben [Werner et al., 2001; Sousa u. Lencastre, 2004]. DISKUSSION 161 Weiterhin stark auffällig ist, dass sich bei der Betrachtung des Vorhandenseins einzelner Resistenzgene aus den ermittelten Ergebnissen teilweise sehr deutliche Trends erkennen lassen (s. Abb. 27). So war das aacA-aphD-Gen in KKS - 99 bei 84 % und das ermA-Gen bei 90 % der MRSA nachweisbar, während beide Gene bei den zeitlich folgenden Kollektiven stets seltener zu finden waren. Das Vorkommen lag für aacA-aphD bei KKS - 01, KKS - 02 und KKS - 04 zwischen 14 % und 19 % und nur bei KKS - 03 mit 32 % etwas höher. Die Häufigkeit von ermA nimmt in einem ähnlichen aber nicht so starken Maße ab, von ca. 90 % auf 23–40 %. Neben der Abnahme von ermA lässt sich eine gleichzeitige Zunahme von ermC beobachten, von 3 % auf 67 %. Man kann hier anhand des Vorhandenseins von Resistenzgenen evtl. eine Änderung des Verhaltens gegenüber eingesetzten Antibiotika erkennen. Die Situation bei tetK und tetM stellt sich etwas anders dar. TetK kam in den Kollektiven mit maximal 14 % vor, in KKS - 99 und KKS - 03 gar nicht. TetM war auffälligerweise nur in den zeitlich am weitesten auseinander liegenden Kollektiven KKS - 99 und KKS - 04 in deutlicher Anzahl vertreten. Besonders herausstechend ist hierbei die Tatsache, dass die Änderung der Häufigkeit sprunghaft erscheint. So ist sowohl der Kontrast von ca. 40 % bei KKS - 99 gegenüber 5 % bei KKS - 01, 0 % bei KKS – 02, 3 % bei KKS - 03 sehr groß, als auch der dann folgende zu KKS - 04 mit 74 %. Mit dem vermehrten Auftauchen von Plasmiden in KKS - 04 gegenüber den älteren Kollektiven lässt sich diese starke Zunahme nicht erklären, da tetM in der Regel chromosomal kodiert vorliegt [Chopra u. Roberts, 2001]. Das Vorkommen von vatA und vatB ist in vorliegender Arbeit eher selten. In KKS - 01 konnte bei unter 5 % der Stämme vatA nachgewiesen werden, in KKS - 04 15 % vatA und 11 % vatB. Bei MRSA aus deutschen Krankenhäusern konnte laut RKI von 2000 bis 2006 keine deutlichen Änderungen im Vorkommen von Resistenzen gegen Ciprofloxacin (2000: 95,3 %; 2002: 97,2 %; 2003: 96,4 %; 2004: 93,8 %), Erythromycin (2000: 72,8 %; 2002: 72,3 %; 2003: 71,2 %; 2004: 71,7 %), Clindamycin (2000: 64,3 %; 2002: 67,7 %; 2003: 67,7 %; 2004: 66,4 %), Oxytetracyclin (2000: 9,2 %; 2002: 4,6 %; 2003: 5,4 %; 2004: 6,2 %) und weitere Antibiotika ermittelt werden, mit Ausnahme der Verringerung des Anteils von Gentamicin-resistenten Isolaten (2000: 41,3 %; 2002: 23,9 %; 2003: 23,5 %; 2004: 16,9 %) [RKI, 2007]. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit stehen teilweise im Gegensatz zu diesen Erkenntnissen. DISKUSSION 162 5.5.3 Vorkommen von Toxingenen bei KKS-99 bis KKS-04 Die Ergebnisse der PCR-Untersuchungen zu Toxingenen in den Kollektiven aus dem Klinikum Kassel sind in Abb. 29 zusammengefasst. Man kann hier erkennen, dass lediglich die Gene der eher ungefährlicheren Enterotoxine SEC, SEG und SEI in starkem Maße vorkamen. Keiner der hier untersuchten Stämme aus dem Klinikum Kassel besaß mehr als vier der untersuchten Toxingene (Abb. 30). Die Gene der Exfoliativtoxine A und B konnten in keinem der Kollektive nachgewiesen werden. Das für die Kodierung von Toxic Shock Syndrome Toxin 1 verantwortliche tst wurde nur in vier Stämmen aus KKS - 99 gefunden, das für Panton-Valentine Leukozidin mitkodierende lukF nur in drei Stämmen des Kollektivs KKS - 02. Die Häufigkeiten der Gene der Enterotoxine A, B, C, D, E, G, H, I und J stellen sich wie folgt dar: Die Gene der bedeutendsten Enterotoxine A, B und E wurden überwiegend selten nachgewiesen. Deutlich hoch ist lediglich das Vorkommen von sea in KKS - 99 mit 24 %. In KKS - 02 lag der Anteil von sea bei 4 % und in KKS - 03 bei 13 %. Seb war nur zu 7 % in KKS - 99 und zu 4 % in KKS - 02 vorhanden. Der Anteil der see-tragenden Stämme war in KKS - 03 mit 13 % am höchsten, das weitere Vorkommmen dieses Genes belief sich auf 2 % in KKS - 99, 4 % in KKS - 02 und 1 % in KKS - 04. Sec konnte in allen Kollektiven außer KKS - 99 nachgewiesen werden. In allen anderen Kollektiven war der Anteil dagegen mit 54 % bis 77 % erstaunlich hoch, so dass hier neben der Abnahme von sea im Laufe der Zeit die deutlichste Veränderung im Vorkommen von Toxingenen besteht. Der Nachweis von seh erfolgte, wenn überhaupt, in nur sehr geringer Zahl, so in KKS - 99 mit 3 % und KKS - 02 mit 4 %. Seg und sei kamen innerhalb eines Kollektivs stets in einer sehr ähnlichen Häufigkeit vor, wobei die Werte in KKS - 01 bis KKS - 04 bei über 70 % lagen und nur in KKS - 99 mit 48 % seg und 41 % sei deutlich geringer waren. Das Vorkommen von sed war insgesamt eher gering, in KKS - 99 und KKS - 03 war keiner der Stämme sed-positiv, während das sed-Vorkommen bei den restlichen Kollektiven zwischen 9 % und 15 % lag. Sej konnte in allen Kollektiven bis auf KKS - 03 mit einer ähnlichen Häufigkeit detektiert werden. Auf das gekoppelte Auftreten von seg-sei und sed-sej wurde bereits unter 5.3. eingegangen. Erstaunlich ist bei der DISKUSSION 163 Betrachtung des Vorkommens der Toxingene in den Kollektiven allerdings, dass in KKS - 03 sej (6,7 %) ausschließlich ohne sed vorkam. Insgesamt lassen sich über die Zeit somit Veränderungen beim Auftreten von Toxingenen feststellen. Besonders auffällig sind lediglich die Unterschiede von KKS - 99 zu den anderen Kollektiven, vor allem beim Vorkommen von sec und lukF. Eine weitere Auffälligkeit ist die kontinuirliche Zunahme von seg-sei ab 2001, während die Häufigkeiten dieser beiden Gene in Isolaten aus 1999 wesentlich geringer war. Das jüngste Kollektiv aus 2004 zeigt gegenüber dem ältesten aus 1999 insgesamt weniger verschiedene Toxingene, aber einen deutlich höheren Anteil an sec, seg und sei. Eine tendenzielle Abnahme der Toxingene seo, sem, sei, sen, seg (egc) und tst und eine Abnahme von Stämmen mit allen getesteten Toxingenen und Zunahme von solchen ohne jegliche konnte in 2001 bis 2003 von Chini et al. [2006] bei einer Studie von MRSA in Griechenland festgestellt werden. 5.6 Vergleich der Kollektive des Klinikums Kassel mit denen anderer Probenahmeorte Der Vergleich der Kollektive des Klinikums Kassel mit denen anderer Probenahmeorte ist nur bedingt möglich, da im gesamten Zeitraum von 1999 bis 2004 die Probenmenge aus dem Klinikum Kassel mit n= 304 teilweise viel höher war als die anderer Probenahmeorte. So umfasste die Gruppe der Stämme „außerhalb KS“ n=100 Proben, die Gruppe „andere in KS“ n=67 und die Gruppe „externe“ n=30. Besser vergleichen lassen sich die Daten des Jahres 2003, hier wurden kleinere Probenmengen verschiedener Standorte untersucht, so n=31 des Klinikums Kassel, n=36 des Diakonissen Krankenhauses in Kassel, n=28 des Elisabeth Krankenhauses in Kassel, n=16 aus Bad Wildungen, n=12 aus Immenhausen, n=16 aus Witzenhausen und n=18 für externe Proben. Allerdings sind diese Werte wiederum etwas zu niedrig um gesicherte relevante Aussagen treffen zu können. Eklatante Unterschiede bzgl. Eigenschaften bei diesen Gruppen würden sich aber trotz der geringen Probenmenge erkennen lassen. Insgesamt besteht bzgl. aller untersuchten Merkmale große Ähnlichkeit bei den unterschiedlichen Probenahmeorten. So lässt sich überall die Dominanz von DISKUSSION 164 SCCmec IV beobachten (s. Abb. 31, Abb. 32), was sich auch in den Diagrammen für das Vorkommen der ccrA-Typen und die dru-Anzahl widerspiegelt (s. Abb. 33 - Abb. 36). Auffällig ist lediglich der hohe Anteil von SCCmec IA/II bei den Proben aus der Stadtklinik Bad Wildungen und bei den externen Proben, der sich auch in den anderen Diagrammen zum SCCmec darstellt. Auch die Werte für das Vorkommen der Antibiotikaresistenzgene sind weitestgehend ähnlich (s. Abb. 37, Abb. 38). Besonders auffällig sind hier nur das erhöhte Vorkommen von aacA-aphD bei MRSA des Klinikums Kassel und die Tatsache, dass bei Stämmen aus Witzenhausen ausschließlich ermC nachgewiesen werden konnte. Da dieses Gen vorwiegend auf kleinen Plasmiden wie pE194 liegt, könnte ein Zusammenhang zwischen dem Vorkommen von Plasmiden und dem Vorkommen dieses Genes vorliegen. Bei der Betrachtung des Vorhandenseins von Toxingenen auf diese Weise zeigt sich ähnliches. Auch hierbei lassen sich nur einige Unterschiede ausmachen, so z.B. dass seb nur bei den externen Proben in einem größerem Umfang (16 %) vorliegt, tst nicht in allen Gruppen vorhanden ist und die Stämme aus Immenhausen insgesamt deutlich weniger Toxingene besitzen als die der anderen Gruppen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass zwar durchaus kleine Unterschiede bzgl. einzelner Eigenschaften beim Vergleich von MRSA unterschiedlicher Probenahme- orte einer Region feststellbar sind, sich aber in der vorliegenden Arbeit eine insgesamt hohe Ähnlichkeit dieser Stämme zeigt. Dies entspricht den Erwartungen. DISKUSSION 165 5.7 Zusammenhang von SSCmec und anderen ermittelten Eigenschaften 5.7.1 Zusammenhang SCCmec, ccr-Typ und dru-Anzahl Eigentlich sollte zwischen dem Vorhandensein von ccrA1, ccrA2 und ccrA3 und dem SCCmec-Typ ein klarer Zusammenhang bestehen. Alle SCCmec I-Stämme sollten ccrA1, alle SCCmec II- und SCCmec IV-Stämme ccrA2 und alle SCCmec III-Stämme ccrA3 besitzen. Dieser Zusammenhang ließ sich in vorliegender Arbeit nur bedingt darstellen (s. Abb. 42). Am eindeutigsten war dieser Zusammenhang bei SCCmec II- Isolaten die alle ccrA2 besaßen und SCCmec IV-Isolaten die zu 94 % ccrA2 aufwiesen, wobei bei dem Rest keinerlei ccr-Nachweis möglich war. Auch bei SCCmec III ergibt sich ein stimmiges Bild, da hier zu 76,9 % ccrA3 nachgewiesen wurde, der Rest der Stämme lieferte ein negatives Ergebnis. Auch SCCmec IIIA verfügt laut vorliegender Untersuchungen zum Großteil über ccrA3, bei einem kleinen Teil von 16,7 % wurde allerdings ccrA2 amplifiziert. Bei diesen Betrachtungen muss jedoch berücksichtigt werden, dass die Anzahl von Stämmen mit SCCmec II, SCCmec III und SCCmec IIIA sehr gering war, nämlich 9, 13 und 6 respektive bei einer Gesamtzahl von n=501. Die Anzahl der Stämme des in der vorliegenden Arbeit neu definierten SCCmec IA/II betrug zum Vergleich 42, die von SCCmec IA 14, die von SCCmec I 66. Die Anteiligkeiten der ermittelten ccr-Typen bei SCCmec I und SCCmec II sind sehr ähnlich, bei beiden wurde bei über 15 % kein ccr-Typ ermittelt und die restlichen Anteile werden etwa je zur Hälfte von ccrA1 und ccrA2 gebildet. Dieses Ergebnis entspricht bei der Betrachtung des Zusammenhangs von ccr- und SCCmec-Typ am wenigsten den Erwartungen. Dieses Ergebnis ließe sich eigentlich nur durch Fehler in der ccr-Multiplex-PCR erklären. Dies würde auch die eher hohe Quote von negativen Ergebnissen mit begründen. Was die tatsächlichen Wahrscheinlichkeiten solcher Fehler in der PCR betrifft, so sind diese allerdings eher gering. Die Primerpaare und die gesamte Methode sind etabliert und die verwendeten Referenzstämme zeigten stets die richtigen Amplifikate. Mögliche Ursache könnten Variationen im SCCmec sein, wie sie auch von anderen Arbeitsgruppen bei der vergleichenden Untersuchung von MRSA-Isolaten mit der PCR nach Oliveira u. Lencastre [2002] und ccr-spezifischen Primern wie denen von Okuma et al. [2002] gezeigt wurden (s. 5.1.1.1). DISKUSSION 166 Der Anteil der negativen Ergebnisse der ccr-PCR war bei SCCmec IVA (n=8) mit 50 % und der Gruppe der nicht genau zuordenbaren (n=19) mit 73,7 % und bei der Gruppe der Stämme die gar nicht zugeordnet werden konnten (n=5) mit 80 % am höchsten. Bei den restlichen Stämmen dieser Gruppen wurde jeweils ccrA2 nachgewiesen. Abgesehen von den negativen Ergebnissen bei SCCmec IVA ist dies aber als durchaus passend zu bewerten. SCCmec IVA sollte wie der Grundtyp SCCmec IV ccrA2 enthalten. Bei den schwer oder gar nicht einem SCCmec-Typ zuordenbaren Stämmen liegt die Vermutung nahe, dass diese eine von den bekannten Typen abweichende SCCmec-Struktur besitzen. Die Stämme des Typs SCCmec IA/II wiesen zum überwiegenden Teil ccrA2 auf, was eigentlich seine Verwandtschaft zu SCCmec II zeigt, wenn man die in vorliegender Arbeit für SCCmec I ermittelten Ergebnisse als nur bedingt passend betrachtet. Bezüglich des Typs SCCmec IA/II zeigt sich beim Vergleich des Zusammenhangs von dru-Anzahl und SCCmec-Typ ein besonderes interessantes Bild. 97,6 % (41 von 42) der SCCmec IA/II-Stämme zeigten ein negatives Ergebnis bei Bestimmung der dru-Anzahl. Dieser Anteil war bei SCCmec I und SCCmec IA mit maximal 7,1 % und 66,7 % bei SCCmec II wesentlich geringer. Dies unterstreicht die Sonderstellung des hier beschriebenen SCCmec IA/II. Ansonsten war durchaus eine Korrelation zwischen der dru-Anzahl und dem SCCmec-Typ erkennbar (s. Abb. 41). So wurden 8 drus in größerer Menge nur bei SCCmec I und SCCmec IA nachgewiesen, 10 drus vor allem bei SCCmec III und sonst nur in sehr geringer Zahl bei SCCmec IV und SCCmec I. 7 drus kamen ebenso vor allem bei SCCmec III vor, der entweder 7, 10 oder zu 15,4 % keine drus besaß. Aber auch bei SCCmec IIIA waren 7 drus häufig, auch wenn der weitaus größere Teil der Stämme 11 drus besaß. 11 drus kamen sonst hauptsächlich mit SCCmec IV und etwas seltener mit SCCmec IA, SCCmec I und SCCmec II zusammen vor. Bei sämtlichen SCCmec IVA Stämmen ließen sich keine dru-Elemente nachweisen, was diesen Typ deutlich von SCCmec IV abgrenzt. Bei der Gruppe der nicht oder nur schwer zuordenbaren Stämme war der Anteil derer mit negativem dru-Ergebnis ebenfalls hoch, jedoch ließen sich auch 11 drus nachweisen. Dies wiederum passt zu dem Ergebnis, dass 11 drus hauptsächlich mit ccrA2-tragenden Stämmen assoziiert sind, da diese Anteile die einzig relevanten neben den negativen Ergebnissen beim Vergleich von ccr-Typ und SCCmec-Typ sind. DISKUSSION 167 5.7.2 Vorkommen von Antibiotikaresistenz- und Toxingenen bei SCCmec- Typen Die in der vorliegenden Arbeit durchgeführten Untersuchungen ergaben, dass es Unterschiede im Vorkommen sowohl von Antibiotikaresistenzgenen als auch von Toxingenen bei den verschiedenen SCCmec-Typen gibt (s. Abb. 44 - Abb. 47). Bedingt durch ihren Aufbau (s. Abb. 1) sollten alle SCCmec II- und SCCmec III- Stämme ermA Resistenz zeigen, da diese durch das in ihnen enthaltene Tn554 vermittelt werden kann. Ähnlich verhält es sich mit dem Vorkommen von tetK, dieses kann auf kleinen Plasmiden wie dem in SCCmec III integrierten pT181 liegen [Ito et al., 2003]. Diese Zusammenhänge konnten in der vorliegenden Arbeit nur zum Teil bestätigt werden. Zwar zeigten alle SCCmec IIIA Stämme ein ermA-Signal, jedoch nur ca 80 % der SCCmec III-Stämme und 60 % der SCCmec II-Stämme. TetK ließ sich bei ca. der Hälfte der SCCmec III-Stämme nachweisen. Mögliche Ursache für den nicht erfolgten Gen-Nachweis, könnten Umstrukturierungen oder Mutationen in den integrierten beweglichen Elementen sein. Diese Veränderungen könnten bei in vorliegender Arbeit nicht genauer definierbaren Subtypen des SCCmec vorkommen. Die Deutlichkeit der Unterschiede der SCCmec-Typen bzgl. ihrer Austattung mit Antibiotikaresistenz- und Toxingenen, wie sie sich in Abb. 44 zeigt, muss etwas relativiert werden, da auch hier wieder die sehr unterschiedlich großen Anzahlen der SCCmec-Typen berücksichtigt werden müssen. So fällt zwar auf, dass nur bei SCCmec II alle untersuchten Resistenzgene vorkommen und dies auch in hohen Anteilen von über 20 %, mit Ausnahme von aacA-aphD. Da aber nur neun SCCmec II-Stämme insgesamt vorkamen sind diese Häufigkeiten entsprechend zu betrachten. Dies gilt auch für SCCmec III und SCCmec IIIA. Betrachtet man die neun SCCmec II-haltigen Stämme einzeln, so stellt man fest, dass diese wenige Gemeinsamkeiten außer dem SCCmec-Typ und dem Vorkommen von ccrA2 haben. Drei der Stämme sind aus KKS-99, einer aus 2002, Schwalmstadt Ziegenhain und zwei aus 2003, Klinikum Kassel und Homberg. Die restlichen drei Stämme gehören KKS – 04 an. Selbst die SCCmec II aus dem gleichen Jahr zeigen keine nennenswerten Gemeinsamkeiten. Bei den 13 SCCmec III-Stämmen die alle aus dem Klinikum Kassel (sieben aus 1999, sechs aus 2001) stammen, lassen sich ebenfalls keine bemerkenswerten Gemeinsamkeiten feststellen. DISKUSSION 168 Anders ist dies bei den SCCmec IIIA-haltigen MRSA. Diese stellen eine recht homogene Gruppe dar, wie man auch Tab. 15 entnehmen kann. Es gibt zwar auch hier kleinere Schwankungen bei einzelnen Eigenschaften, aber die Übereinstimmung ist insgesamt größer. Besonders bemerkenswert ist, dass alle Stämme sea positiv sind und fünf der sechs Stämme über nur ein kleines Plasmid verfügen. Tab. 15 SCCmec IIIA-haltige MRSA-Stämme und deren wichtigste in vorliegender Arbeit ermittelte Eigenschaften. X = postiv / vorhanden, ° = negativ / nicht vorhanden, G = großes Plasmid, K = kleines Plasmid, n.b. = nicht bestimmt. SC C T yp dr us cc rA aa cA -a ph D er m A er m C te tK te tM va tA va tB se a se b se c se d se e se g se h se i se j ts t lu k Pl as m id Pl as m id ty p KKS-99-6 IIIA 11 3 ° X ° ° X ° ° X ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° K n.b. KKS-99-17 IIIA 11 3 X X ° ° ° ° ° X ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° K n.b. KKS-99-18 IIIA 11 3 X X ° ° X ° ° X ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° K n.b. KKS-99-27 IIIA 11 2 X X X ° X ° ° X ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° K n.b. KKS-99-28 IIIA 11 3 X X ° ° X ° ° X ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° K n.b. KKS-99-58 IIIA 7 3 X X ° ° X ° ° X ° ° ° ° ° ° ° ° X ° G n.b. Bei der ebenfalls eher kleinen Gruppe der SCCmec IA-haltigen Isolate (n =14), die zur Hälfte aus KKS-99 und zur Hälfte aus dem Jahr 2001 (sechs KKS, einer extern) stammen, sind die Gemeinsamkeiten wiederum weniger ausgeprägt. Die kleine Gruppe der acht Stämme umfassenden MRSA mit SCCmec IVA zeigt neben Gemeinsamkeiten auch einige Besonderheiten. Die Gemeinsamkeiten bestehen neben dem bereits oben erwähnten durchweg negativen Ergebnis der dru- PCR darin, dass die Stämme nur ermA und/oder ermC besitzen. Drei der Stämme, die aus KKS-02 stammen, verfügen über sea und seb, beides eher selten vorkommende Toxingene. Bei den fünf restlichen Stämmen, wovon zwei aus KKS-01 und drei aus dem Jahr 2002 aus Fritzlar stammen, trat eine Besonderheit auf. Diese Stämme zeigten kein Fragment beim mecA-Primer des Primersets der Multiplex-PCR zum SCCmec-Nachweis, sondern nur bei dem an einer anderen Stelle greifenden mecA-Primer aus der Antibiotikaresistenz-PCR, s. 5.1.1.1. Als Gruppen mit großen Anzahlen bleiben somit nur noch SCCmec I und SCCmec IV. Diese unterscheiden sich sowohl im Vorkommen von Antibiotikaresistenzgenen als auch im Vorhandensein von Toxingenen deutlich. Bei den Resistenzgenen wird dies besonders beim Vorkommen von aacA-aphD, ermA DISKUSSION 169 und ermC deutlich. Während die ersteren beiden bei SCCmec I bei über der Hälfte der Stämme vorkamen und bei SCCmec IV noch nicht mal bei einem Viertel, verhält sich dies bei ermC umgekehrt. Deutlichster Unterschied in Bezug auf das Vorkommen von Toxingenen ist der Gehalt an sec-positiven Stämmen der bei SCCmec IV mehr als doppelt so hoch ist wie bei SCCmec I. Beim hier definierten SCCmec IA/II zeigt sich bei den Resistenzgenen eher eine Ähnlichkeit zu SCCmec II durch das ebenso geringe Vorkommen von aacA-aphD. Bei den Toxingenen ließen sich hingegen weder zu SCCmec I bzw. SCCmec IA noch zu SCCmec II deutliche Gemeinsankeiten feststellen. SCCmec I und IA gegenüber ist das Vorkommen von sed und sej deutlich erhöht, während es sich gegenüber SCCmec II vor allem dadurch unterscheidet, dass der Anteil an sed-positiven Stämmen sehr viel höher ist. Fraglich beim Betrachten dieser Zusammenhänge ist allerdings, ob sie wirklich auf den verschiedenen SCCmec-Typen selbst beruhen oder eher ein Effekt der Zeit sind und unabhängig vom SCCmec-Typ. Beim Auftreten von Antibiotikaresistenzgenen kommt ein solcher Effekt der Zeit sicherlich zu tragen, da das Auftreten von Resistenzgenen nachweisbar in einem Zusammenhang mit dem Einsatz von Antibiotika steht [Dziekan u. Daschner, 1997]. Veränderungen von MRSA mit einem bestimmten SCCmec-Element im Laufe der Zeit konnten in der vorliegenden Arbeit beobachtet werden. Dies sind die Veränderungen von SCCmec IV bzgl. des Vorkommens von Antibiotikaresistenz- und Toxingenen, sowie die des Gehalts von Plasmiden die in Abb. 67 bis Abb. 69 dargestellt und in 5.9 diskutiert werden. Die vorliegende Arbeit legt nahe, dass ein Zusammenhang zwischen SCCmec-Typen und dem Vorkommen bestimmter genetischer Eigenschaften, die nicht unbedingt mit SCCmec selber assoziiert sind, vorhanden ist. Ob ein solcher Zusammenhang zwischen dem Vorkommen von Toxingenen und SCCmec-Typen besteht, wurde in der Literatur häufig kontrovers diskutiert. So zeigten Schmitz et al. [1997] bei der Untersuchung des Vorkommens von Enterotoxin A-D und TSST-1, bei MRSA und MSSA, dass es keinen signifikanten Unterschied in der Toxinproduktion zwischen MRSA und MSSA gibt. Im gleichen Jahr belegten Wichelhaus et al. mit ihren Daten in einer mit den gleichen Nachweismethoden arbeitenden und ähnlich aufgebauten DISKUSSION 170 Studie, dass es einen engen Zusammenhang zwischen dem Genotyp und der Toxinproduktion eines Stammes gibt [Wichelhaus et al., 1997]. Ein solcher Zusammenhang wurde z.B. auch von Melter et al. [2003] beschrieben, die einen neuen tschechischen Klon beschrieben, der interessanterweise zumeist SEA produzierte. Auch in Großbritannien wurde die Zunahme von sea-assozierten invasiven Infektionen aufgrund eines MRSA-Klones beschrieben [Peackock et al., 2002]. Ebenfalls stellten Ghebremedhin et al. [2005] einen klaren Zusammenhang zwischen dem Vorkommen von Toxingenen und dem SCCmec- bzw. agr-Typ der untersuchten MRSA fest. Bei einer Untersuchung von tst-positiven Stämmen in Frankreich konnte festgestellt werden, dass 26 % davon MRSA waren, wovon 93 % dem gleichen agr-Typ angehörten und auch bzgl. des SCCmec sehr große Ähnlichkeit bestand. Fast alle tst-positiven Isolate besaßen SCCmec IV, die Ausnahme bildeteten ein Stamm mit einem abgewandelten SCCmec IV und zwei Stämmen die mittels der PCR nach Oliveira u. Lencastre [2002] nicht typisierbar waren. [Durand et al., 2006] Die in der vorliegenden Arbeit untersuchten tst-positiven MRSA zeigten allerdings keine Korrelation mit einem bestimmten SCCmec-Typ. Kim et al. [2006] zeigten in einer koreanischen Studie, dass MRSA-Stämme häufiger Toxingene tragen als MSSA-Stämme und es eine Kopplung zwischen bestimmten Toxingenen und einem SCCmec-Typ gibt. Ein Vergleich mit den in der vorliegenden Arbeit erhobenen Daten ist aufgrund der großen geographischen Unterschiede kaum möglich. Dennoch sei erwähnt, dass Kim et al. [2006] bei 77,3 % der SCCmec II Isolate eine Kopplung von sec und tst, bei 48,8 % der SCCmec III-Stämme eine Kopplung von sea und see und bei 46,9 % der SCCmec IV-haltigen Isolate ein gemeinsames Vorkommen von sea und seb nachweisen konnten. Unterschiede im Vorkommen von Toxingenen und dem Verhalten gegenüber Antibiotika bei MRSA mit SCCmec II und SCCmec IV wurden bei einer Untersuchung von Nasenabstrichen von nicht institutionalisierten Personen im Zusammenhang mit der NHANES (National Health and Nutrition Examination Survey) Studie in den USA in 2001-2002 festgestellt [Graham et al., 2006]. Hierbei war zunächst interessant, dass 31,6 % der Personen mit S. aureus kolonisiert waren, davon 0,84 % mit MRSA. Toxingene wurden bei diesen MRSA wie folgt nachgewiesen: sea 8 %, seb 9,3 %, sec 2,7 %, sed 57,3 %, seh 1,3 %, tst 6,7 % und PVL 8 %. Diese bei nicht aus dem Krankenhaus stammenden MRSA ermittelten Werte weichen nahezu vollkommen DISKUSSION 171 von den in der vorliegenden Arbeit ermittelten ab. Die MRSA der amerikanischen Studie besaßen zu etwa gleichen Teilen SCCmec II und SCCmec IV. Dabei kam bei den SCCmec II-Stämmen häufiger sed vor und bei den SCCmec IV-Isolaten seb und PVL. Auch in Bezug auf Antibiotikaresistenzen existierten laut der Studie von Graham et al. [2006] Unterschiede bei den beiden SCCmec-Typen. SCCmec IV- Stämme waren nur resistent gegen Erythromycin (54 %) und Ciprofloxacin (16,2 %), während SCCmec II-Isolate nahezu vollkommen resistent gegen diese beiden Antibiotika waren und zusätzlich zu 63,2 % noch gegen Clindamycin. Gemeinsam war beiden SCCmec-Typen vollkommene Sensibilität gegenüber Trimethoprim- Sulfamethoxazol und Vancomycin. Auch Ito et al. [2001] beschrieben bereits, dass SCCmec III-Isolate, die sozusagen aus einer Zeit intensiver Antibiotikaanwendung und Multiresistenzentwicklung stammen, mehr Resistenzen besitzen als z.B. SCCmec II-Isolate die aus früheren Zeiten stammen. Auch der potentielle Einfluss eines Virulenzfaktors auf die Erhaltung eines SCCmec- Elementes und somit auch der Methicillin-Resistenz wurde bereits gezeigt. Dies erfolgte bei der Analyse zur Exzision von SCCmec IV-Elementen. Stämme die dazu nicht in der Lage waren, besaßen in unmittelbarer Nähe downstream von SCCmec auf dem Chromosom ein vermutlich mobiles genetisches Element, welches das seh Gen trug. Dieses seh-tragende mobile genetische Element schien zu einer Stabilisierung des mecA-Gen tragenden Bereiches geführt zu haben, indem es durch seine Inserierung die Mobilität von SCCmec störte. [Noto u. Archer 2006] Von besonderem Interesse war in den letzten Jahren auch die Diskussion, ob C- MRSA mit SCCmec IV häufiger mit PVL-Determinanten assoziiert sind oder nicht. In 2006 erfolgte die erste Beschreibung eines SCCmec V-Elementes mit PVL-Genen in Europa [Gerogianni et al., 2006]. Baba et al. [2002] sequenzierten das gesamte Genom eines C-MRSA Isolates aus North Dakota. Die Sequenzanalayse identifizierte einen SCCmec IVa und 19 Virulenzgene, inkl. Derer für SEC und SEH und PVL. Alle in der vorliegenden Arbeit gefundenen lukF-Gene kamen zwar bei SCCmec IV Isolaten vor, ihre Anzahl war mit sechs allerdings sehr gering. Eine Rolle bei der Betrachtung des Vorkommens von Toxingenen bei MRSA spielen auch immer die Eigenschaften von MSSA. Toxin-produzierende MSSA können die Pathogenität von MRSA durch den Transfer von Virulenzgenen über Plasmide oder andere mobile genetische Elemente erhöhen [Layer et al., 2006]. DISKUSSION 172 5.8 Plasmide 5.8.1 Methoden zur Plasmidpräparation Die einzige Problematik bei der Präparation von Plasmiden aus S. aureus stellt die Lyse der Zellen dar. Eine enzymatische Lyse der Zellen ist nur mit Hilfe der Endopeptidase Lysostaphin effektiv möglich. Lysostaphin spaltet die Glycin-Glycin- Peptidbindungen der Interpeptidbrücken des Peptidoglykans, welche für die Stabilität der Zellwand bei Staphylokokken verantwortlich sind [Ghuysen et al., 1966]. Die Anwendung von Lysostaphin ist aber sowohl zeit- als auch kostenaufwändig. Der Aufschluss der Zellen mittels des Fast Prep-Systems stellt eine interessante Alternative dar, da diese Methode einen wesentlich schnelleren Aufschluss als die enzymatische Lyse mit Lysostaphin bietet. Die erfolgreiche Kombination des Fast Prep-Sytems zum Aufschluss schwieriger Materialien mit einer Aufreinigung der DNA über Qiagen-Anionenaustauschersäulen wurde von Günther [2004] gezeigt, der diese Methode (FSG) als beste zur Gewinnung von DNA aus Bodenproben bewertete. Bei weiterer Optimierung der Fast Prep-Methode zur Präparation von Plasmid-DNA aus S. aureus könnten sicher noch bessere Qualitäten und Quantitäten an Plasmid- DNA erhalten werden, als das bisher der Fall war. Es konnte aber auch bei dem in der vorliegenden Arbeit angewandten Protokoll genügend Plasmid-DNA von guter Qualität für z.B. eine Restriktionsanalyse oder einen Transformationsansatz gewonnen werden. Die Methode der modifizierten Eckhardt-Lyse ist hingegen nur für ein schnelles Screening auf Plasmide geeignet, z.B. auch nach einem Transformations- oder Konjugationsexperiment. Die bei dieser Methode entstehenden Agarosegele sind sehr unsauber, d.h. sie weisen viel „Schmier“ aufgrund von Proteinresten u.ä. und dadurch Hintergrundleuchten auf. Vorteil dieser Methode, könnte der sein, dass durch sie die Präparation sehr großer Plasmide gelingen könnte, die bei anderen Präparationsverfahren durch auftretende Scherkräfte bei Zentrifugations- oder Pipettierschritten zerstört werden. Solche Plasmide mit weit über 60 kb Größe wurden bei S. aureus bereits beschrieben [Kawano et al., 2003], konnten aber in der vorliegenden Arbeit nicht nachgewiesen werden. DISKUSSION 173 5.8.2 Vorkommen von Plasmiden bei MRSA Bei 78,2 % der in der vorliegenden Arbeit untersuchten MRSA konnten Plasmide nachgewiesen werden. Diese wurden in vier Hauptgruppen wie unter 4.6 beschrieben und in Abb. 48 dargestellt aufgeteilt. Die Mehrzahl der MRSA zeigte dabei ein großes Plasmid (44,1 %), ein kleines Plasmid konnte bei 7,2 % der Stämme nachgewiesen werden, die Kombination aus beidem bei 25 % der Stämme. Mehrere Plasmide, also mehr als ein großes und ein kleines Plasmid, konnten nur bei 2 % der untersuchten MRSA präpariert werden. Hierzu ist anzumerken, dass die Aussagen über das Vorhandensein bzw. die Abwesenheit von Plasmiden stets etwas skeptisch betrachtet werden sollten. Das Vorhandensein von Plasmiden unterliegt häufig einem Selektionsdruck von z.B. Antibiotika, Schwermetallen o.ä. Dieser Selektionsdruck kann im Labor bei nicht vollständig bekannten Stämmen u.U. nicht sofort ab Beginn der Untersuchungen aufrechterhalten werden, so dass Plasmide evtl. verloren gehen können. Auch die sonstigen Wachstumsbedingungen und die dauerhafte Kultivierung im Labor können einen negativen Einfluss auf den Plasmidgehalt haben. Eine Minimierung dieser Faktoren wurde bei den vorliegenden Untersuchungen dadurch angestrebt, dass die Stämme sofort nach Erhalt in Dauerkultur gebracht wurden. Für Plasmidpräparationen und auch alle anderen Experimente war somit möglichst der „ursprüngliche Stamm“ vorhanden, der dann auch unter möglichst bekannten selektiven Bedingungen kultiviert werden konnte. Auch die Präparation an sich birgt Riskiken für den Erhalt eines Plasmides, besonders bei großen Plasmiden, die wie schon erwähnt leicht durch Scherkräfte zerstört werden können. Hinzu kommt bei großen Plasmiden, dass sie i.d.R. in niedriger Kopienzahl pro Zelle vorliegen, was die DNA-Ausbeute an sich verringert. In der Literatur gibt es sehr unterschiedliche Angaben zum Vorkommen von Plasmiden bei MRSA. Coia et al. [1988] verglichen den Plasmidgehalt von MSSA und MRSA und stellten dabei fest, dass alle MRSA aber nur die Hälfte der MSSA Plasmide besaßen. Der Großteil der Plasmide war dabei entweder 14-51 kb oder 2,9–5,8 kb groß. Besaß ein Stamm nur ein Plasmid, so handelte es sich dabei stets um ein großes. Restriktionsanalysen der Plasmide zeigten, dass die Plasmide aus MRSA weniger und homogenere Muster zeigten als die Plasmide aus MSSA. DISKUSSION 174 Auch Gaterman [1987] zeigte, dass von ihm untersuchte Plasmide aus MRSA aus Hamburg sich nahezu alle in ihren Restriktionsmustern ähnelten und die gleichen Resistenzdeterminanten enthielten. Zuccarelli et al. [1996] untersuchten 120 klinische und aus der Umgebung stammende MRSA südkalifornischer Krankenhäuser und MRSA aus der Stammsammlung der ATCC und stellten dabei fest, dass bei 4,2 % kein Plasmid nachweisbar war. Die Mehrzahl der Stämme besaß nur ein Plasmid, welches ohne Restriktionsanalyse kaum unterscheidbar war. 12,5 % besaßen zwei oder mehr Plasmide. Die Beobachtung der ohne Restringierung nicht unterscheidbaren großen Plasmide konnte auch in der vorliegenden Arbeit gemacht werden, bzgl. der Häufigkeit von Plasmiden besteht aber kaum eine Übereinstimmung mit Zuccarelli et al. [1996]. Zuccarelli et al. [1996] untersuchten die Stabilität der Plasmide bei epidemischen Stämmen über zwei Jahre und bei Isolaten von zehn Patienten während deren Krankenhausaufenthaltes. Dabei stellten sie fest, dass alle bis auf ein Plasmidprofil über drei Monate stabil erhalten blieben und bestimmte Restriktionsmuster in einem Krankenhaus über zwei Jahre lang nachweisbar waren. Udo et al. [2006] untersuchten 5644 MRSA der Jahre 1994 bis 2004 in Kuwaitischen Krankenhäusern und konnten dabei in allen Stämmen Plasmide nachweisen. Die gefundenen Plasmidgrößen waren dabei 1,9 kb, 2,8 kb, 3,0 kb, 4,4 kb, 27 kb und 38 kb. Alle Stämme besaßen ein 27 kb Plasmid und ein bis drei weitere. 60 % der Stämme hatten drei Plasmide, 30 % zwei und 10 % vier. Plasmide der Größe 38 kb konnten nur bei high level-Mupirocin-resistenten MRSA nachgewiesen werden. Kawano et al. [2003] untersuchten 24 MRSA von Patienten eines japanischen Krankenhauses und entdeckten dabei besonders große Mengen an teilweise außergewöhnlich großen Plasmiden. So beschrieben sie, dass alle Isolate Plasmide aufwiesen, die sich in zwölf Gruppen unterschiedlicher Größe unterteilen ließen. Diese Größen reichten von 2,4 bis 280 kb. Jedes Isolat zeigte in dieser Untersuchung zwei bis fünf Plasmide unterschiedlicher Größe, wobei alle ein Plasmid der Größe um 40 kb besaßen. Diese Ergebnisse unterstützende Aussagen sind laut der Recherchen zu der vorliegenden Arbeit in keiner anderen Literatur enthalten. Aber auch die in der vorliegenden Arbeit beschriebenen Ergebnisse konnten nicht exakt in der Literatur bestätigt werden, da die Anzahl gefundener Plasmide sowohl DISKUSSION 175 insgesamt als auch bei den einzelnen Stämmen niedriger war als in den meisten anderen vergleichbaren Untersuchungen. 5.8.2.1 Plasmide in den Kollektiven KKS-99 bis KKS-04 Auffallend bei der Betrachtung des Vorkommens von Plasmiden in den Kollektiven aus dem Klinikum Kassel (s. Abb. 49) ist vor allem, dass das Vorkommen eines großen Plasmides alleine zu den jüngeren Kollektiven hin abnimmt. Hierbei erfolgt anscheinend eine Verschiebung hin zum Vorkommen des Typs „ein großes und ein kleines Plasmid“. Der Gesamtanteil der plasmidhaltigen Stämme liegt mit 70,7 % bis 87,7 % stets in einem ähnlich hohen Bereich, auch der Anteil der Stämme mit nur einem kleinen nachweisbaren Plasmid verhält sich mit 7,4 % bis 12,9 % so. Eine Ausnahme bildet hier nur KKS - 02 in dem der Anteil der Isolate mit einem kleinen Plasmid bei Null liegt. Das Vorkommen mehrerer Plasmide bei einem Stamm ist in allen Kollektiven mit 1,2 % bis 3,9 % eher selten. Somit findet die deutlichste Veränderung beim Plasmidgehalt der untersuchten MRSA-Stämme über die Jahre hin in Form des vermehrten Auftretens von Stämmen mit „einem kleinen und einem großen Plasmid“ statt, einhergehend mit dem seltener werden des Vorkommens von Stämmen mit nur einem großen Plasmid. Konnte bei Stämmen aus KKS - 99 noch ein Anteil von Stämmen mit einem großen Plasmid von 74,1 % nachgewiesen werden, so sinkt dieser Anteil über 50,0 % in 2001 und 48,7 % in 2002 auf 25,8 % in 2003 und 34,6 % in 2004. Noch deutlicher nimmt der Anteil der Stämme mit einem großen und einem kleinen Plasmid über die Jahre hin zu, von 0 % in 1999, über 12,1 % in 2001, 7,7 % in 2002, 29,0 % in 2003 auf 44,4 % in 2004. Betrachtet man das Vorkommen der nach Oliveira u. Lencastre [2002] ermittelten SCCmec-Typen (s. Abb. 24) und den Zusammenhang zwischen Vorkommen von Plasmiden und diesen SCCmec-Typen (s. Abb. 59) so lässt sich schlussfolgern, dass die oben beschriebene Veränderung des Plasmidgehaltes sich vor allem durch das beobachtete vermehrte Auftreten des SCCmec IV bedingen. Bei SCCmec IV ist der Anteil von Stämmen mit „einem großen und einem kleinen Plasmid“ mit 31,3 % am höchsten. Nahezu ebenso hoch ist er bei SCCmec IA/II mit 26,2 % und bei SCCmec III mit 23,1 %. Stämme mit SCCmec IA/II kamen in KKS – 99 nur zu 3,5 %, solche mit SCCmec III zu 12,0 % vor und SCCmec IV war hier im Gegensatz zu allen anderen Kollektiven mit 15,5 % nur sehr selten vertreten. Besonders stark vertreten in KKS - 99 war DISKUSSION 176 hingegen SCCmec I (39,7 %), bei dessen Stämmen sich zu 59,1 % ein großes Plasmid nachweisen ließ. Somit lässt sich die Veränderung des Plasmidgehalts im Laufe der Zeit mit der Veränderung des Vorkommens von SCCmec-Typen in Zusammenhang bringen und begründen. Mehr als zwei Plasmide kamen in allen Kollektiven sehr selten vor, in KKS - 99 gar nicht. Der Gesamtanteil von plasmidhaltigen Stämmen in den Kollektiven des Klinikums hat sich im Laufe der Jahre nur wenig geändert. Er bewegte sich von 86,2 % in 1999, über 70,7 % in 2001, 80,3 % in 2002, 71,0 % in 2003 auf 87,7 % im letzten Untersuchungsjahr 2004. Im Schnitt lag er während des Untersuchungszeitraums von fünf Jahren bei 80,9 %. Mit in der Literatur beschriebenen Werten stimmen diese Werte wie bereits oben beschrieben nur bedingt überein. 5.8.2.2 Vergleich der Kollektive des Klinikums Kassel mit denen anderer Probenahmeorte Beim Vergleich des Vorkommens von Plasmiden bei Stämmen des gesamten Probenzeitraumes von 1999-2004 aus dem Klinikum Kassel mit solchen aus Kliniken außerhalb Kassels, anderen Kliniken in Kassel und Stämmen von niedergelassenen Ärzten u.ä. (s. Abb. 55, Abb. 56) lässt sich feststellen, dass der Plasmidgehalt in allen Gruppen in etwa gleich hoch ist: Er bewegt sich zwischen 73,0 % und 80,6 %. Auch die Anteiligkeiten der definierten Plasmidgruppen sind bei allen Probenahmeorten in etwa gleich, lediglich beim Vorkommen von mehreren Plasmiden bei einem Stamm gibt es Unterschiede. Solche Stämmen ließen sich nur bei Proben aus dem Klinikum Kassel und bei solchen aus Kliniken außerhalb Kassels feststellen, jedoch nur mit sehr geringen Anteilen von 2,0 % bzw. 3,0 %. 5.8.2.3 Zusammenhang von SCCmec-Typ und Plasmidgehalt Wie bereits unter 5.8.2.1 erwähnt zeigt sich dieser Zusammenhang recht deutlich bei den vorliegenden Untersuchungen. Hierbei muss berücksichtigt werden, dass bedingt durch das seltene Vorkommen einiger SCCmec-Typen wie z.B. SCCmec II (9 Stämme) und SCCmec IIIA (6 Stämme) sich über deren typischen Plasmidgehalt nur bedingt Aussagen machen lassen. Dennoch lassen sich bei den SCCmec-Typen deutliche Unterschiede bzgl. des Plasmidgehaltes feststellen, so wie der bereits beschriebene zwischen SCCmec I und SCCmec IV. DISKUSSION 177 Auffällig ist, dass der in der vorliegenden Arbeit neu beschriebene Typ SCCmec IA/II in Bezug auf die vorkommenden Plasmidtypen ein ebenso eigenständiges Bild wie beim Vergleich anderer Merkmale liefert. SCCmec IA/II-Stämme besitzen ähnlich häufig ein großes Plasmid wie SCCmec I-, SCCmec IA- und SCCmec II-MRSA. Stämme mit einem kleinen Plasmid kommen ebenfalls ähnlich häufig vor, mit Ausnahme von SCCmec IA bei dem solche Stämme gar nicht vorkommen. Deutlich erhöht gegenüber SCCmec I, SCCmec IA und SCCmec II ist jedoch der Anteil an Stämmen mit einem großen und einem kleinen Plasmid, dafür ist der Teil der plasmidfreien Stämme geringer. In der Literatur ließen sich nur wenige verwertbare Aussagen zum Vorkommen von Plasmiden bei bestimmten SCCmec-Typen finden. Caddick et al. [2005] stellten fest, dass multiresistente H-MRSA zumeist keine Plasmide tragen (s.5.8.3) und SCCmec II besitzen. Somit korrelierten Caddick et al. [2005] den SCCmec II-Typ mit der Abwesenheit von Plasmiden. Von den neun in der vorliegenden Arbeit dem Typ SCCmec III zugeordneten Stämmen besaß allerdings nur einer kein Plasmid, einer hingegen sogar mehr als zwei. Auch von den 42 SCCmec IA/II-Isolaten der vorliegenden Arbeit, deren SCCmec Struktur eine Verwandtschaft zu SCCmec II nahe legt, besitzen nur drei kein Plasmid. Tenover et al. [2006] konnten bei der Untersuchung von Stämmen eines in den USA weit verbreiteten C-MRSA-Typs feststellen, dass diese zumeist den gleichen Plasmidtyp besaßen. Diese MRSA-Stämme zeigten zu 60 % ein ca. 30 kb großes Plasmid mit blaZ und msrA. 93 % der Isolate besaßen ein kryptisches 3,1 kb großes Plasmid. Somit hatte ein großer Teil der Stämme ein großes und ein kleines Plasmid, wie auch viele der in vorliegernder Arbeit beschriebenen MRSA. Weiterführende Untersuchungen von Tenover et al. [2006] in dieser Studie zeigten, dass der untersuchte weit verbreitete MRSA-Typ sein Antibiotikaresistenzgen-Profil durch die bei ihm vorkommenden Plasmide erhält. Dies zeigt die Bedeutsamkeit von Plasmiden für die genetischen Eigenschaften von MRSA-Stämmen. 5.8.3 Zusammenhang zwischen Grad der Multiresistenz bzw. „Multitoxizität“ und dem Plasmidgehalt Da bei MRSA wie auch bei anderen Staphylokokken ein großer Teil der Antibiotikaresistenzgene auf Plasmiden kodiert sind, war zu erwarten, dass sich bei Stämmen mit mehreren Resistenzgenen auch verstärkt Plasmide nachweisbar sind. Diese Annahme wurde, wie man auch in Abb. 57 erkennen kann, bestätigt. Während DISKUSSION 178 bei Stämmen ohne eines der untersuchten Resistenzgene 34,0 % der Stämme keine Plasmide besaßen, gab es unter denen mit vier oder mehr der betrachteten Resistenzgene keine plasmidfreien mehr. Dieser Zusammenhang von Multiresistenz und dem Vorkommen von Plasmiden wurde auch von den meisten Forschergruppen beschrieben [Coia et al., 1988; Lyon et al., 1983; Morton et al., 1995]. Eine Studie aus jüngerer Zeit führte jedoch zu dem Ergebnis, dass Plasmide zwar eine wichtige Rolle für die Antibiotikaresistenz bei nicht-multiresistenten MRSA und C-MRSA spielen, aber bei multiresistenten H- MRSA anscheinend keine Kopplung zwischen dem Vorkommen von Antibiotikaresistenzgenen und Plasmiden besteht und solche H-MRSA-Stämme sogar eher durch die Abwesenheit von Plasmiden gekennzeichnet sind [Caddick et al., 2005]. Auch bzgl. des Zusammenhangs von Plasmidgehalt und dem Vorkommen von Toxingenen lässt sich ähnliches beobachten. Der Anteil der Stämme ohne nachweisbares Plasmid nimmt mit dem Grad der „Multitoxizität“ ab. Die Anteile der anderen Gruppen verändern sich in ähnlich bleibenden Relationen. 5.8.4 Restriktionsanalyse der präparierten MRSA-Plasmide Agarosegele mit unverdauter Plasmid-DNA bieten nicht mehr als eine erste Vergleichsmöglichkeit der Isolate und ihrer Plasmide. Zur genaueren Analyse der Plasmid-DNA muss eine Restriktionsanalyse dieser erfolgen, nicht nur aus dem Grund, dass sich Plasmide ähnlicher Größe sonst nur schwer unterscheiden lassen. Beachtet werden muss bei der Betrachtung von Agarosegelen unverdauter nicht restringierter Plasmide auch, dass dort verschiedene Banden eines einzigen Plasmides zu sehen sein können, die auf seine unterschiedlichen topoisomerischen Formen zurückführbar sind. Diese Topoisomere besitzen unterschiedliche Mobilität im Agarosegel und erzeugen somit diskrete Banden. Die offene Ringform (OC = open circular) eines Plasmides besitzt die geringste Mobilität, während die superspiralisierte (CCC = covalent closed circular) die höchste besitzt. Je nach Präparationsart kann es sein, dass auf dem Gel z.B. nur die OC-Form sichtbar ist, diese läuft bei den hier vorliegenden ca. 30 kb großen Plasmide im Bereich um 50 kb. Somit könnte man ohne eine Restriktionsanalyse isolierter Plasmid-DNA zu irrigen Annahmen bzgl. der Größe der Replikons kommen. DISKUSSION 179 Die in dieser Arbeit entdeckten großen Plasmide ließen sich mittels Restriktionsanalysen in fünf Hauptgruppen (pFL35-1, pFL35-2, pFL35-2’, pFL35-3 und pFL35-4) unterteilen, die bereits in einer früheren Arbeit definiert wurden [Janusch, 2000]. Die Restriktionsanalysen mit HindIII, EcoRI, PstI und HincII erzeugten unterscheidbare reproduzierbare Muster, aufgrund derer die Plasmide den definierten Gruppen zugeordnet wurden. Allerdings konnten aufgrund des Umfangs der Untersuchungen und des Aufwandes der Präparation quantitativ ausreichender Plasmid-DNA nicht alle Plasmide sicher zugeordnet werden. Ferner wurden die Plasmide aus Stämmen mit mehreren Plasmiden häufig nicht genauer untersucht, da dazu Aufreinigungen der DNA aller Plasmide aus einem Stamm aus Agarosegelen nötig gewesen wären. Aufgrund des hohen Aufwandes wurden diese nur in begrenztem Maße durchgeführt, so dass diese Ergebnisse aufgrund ihrer Unvollständigkeit hier nicht dargestellt wurden. Nur die als aufgrund genügend abgesicherter Daten definierten Plasmidtypen wurden in Tab. 21 angegeben. Auch die erfolgten Größenbestimmungen unterliegen noch gewissen Unsicherheiten, wie aus der errechneten z.T. recht großen Standardabweichung der gemittelten Fragmentgrößen (s. Tab. 11 - Tab. 12) deutlich wird. Die wichtigsten Unterschiede der Plasmidtypen sind Tab. 11 - Tab. 12 zu entnehmen. Der am häufigsten vorkommende Plasmidtyp war pFL35-1 mit sechs EcoRI, zehn HindIII, fünf PstI und elf HincII Fragmenten. Plasmide des Typs pFL35-2, pFL35-2’ und pFL35-3 zeigen zwar große Ähnlichkeit zum Typ pFL35-1, besitzen aber einige von diesem Typ abweichende Restriktionsfragmente. Im HindIII-Muster zeigen sich die Unterschiede von pFL35-2 zu pFL35-1 z.B. durch das Vorhandensein eines zusätzlichen ca. 2,3 kb großen Fragmentes. pFl35-2’ besaß wiederum gegenüber pFL35-2 ein weiteres ca. 1,5 kb großes HindIII- Fragment. Auch pFL35-3 zeigt zum am häufigsten vorkommenden Typ pFL35-1 Ähnlichkeiten in den Restriktionsmustern. So zeigt sich im HindIII-Ansatz gegenüber pFL35-1 ein zusätzliches Fragment von ca. 3,2 kb, während sich im EcoRI-Ansatz nicht die Anzahl, sondern nur die Größe einiger Fragmente unterscheidet. Völlig eigenständige Muster bei allen verwendeten Restriktionsenzymen besitzt hingegen pFL35-4. Besonders deutlich wird dies bei HindIII-Analysen wo Plasmide dieses Typs nur vier Fragmente zeigen, während die anderen zehn bis elf besitzen. DISKUSSION 180 Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Plasmidtypen pFL35-1, pFL35-2, pFL35-2’ und pFL35-3 nah verwandt sind, während pFL35-4 einen anderen Plasmidtyp darstellt. Restriktionsanalysen mit weiteren Restriktionsenzymen bestätigten die eigenständigen Muster der Plasmidtypen. Abb. 71 zeigt durch die EcoRI-PstI- Restriktionenanalysen ermittelte mögliche Restriktionskarten der Plasmide pFL35-1, pFL35-2, pFL35-2’ und pFL35-3. Ahand dieser Restriktionskarten lässt sich erkennen, dass pFL35-1 Ähnlichkeit mit pFL35-2 besitzt. Weniger deutlich wird die anhand der reinen Fragmentgrößen vermutete Ähnlichkeit von pFL35-2’ zu pFL35-2. Da die Fragmentgrößenbestimmung aber einen nicht unerheblichen Fehler enthält und dieser auch in der Berechnung der Lage der Schnittstellen der Enzyme untereinander einfließt, sind die Restriktionskarten eher als Skizzen zu betrachten. Es lassen sich aus ihnen dennoch Unterschiede und auch Gemeinsamkeiten des Aufbaus der Plasmide erkennen. EcoRI PstI pFL35-1 pFL35-3 pFL35-2 pFL35-2‘ Abb. 71 Skizzen von EcoRI-PstI-Restriktionskarten in vorliegender Arbeit beschriebener Plasmide. Die potentiellen Restriktionskarten wurden mit DNAMAN Version 6 (Lynnon Corporation) unter der Annahme eines Fehlers von bis zu 12 % in der Fragmentgrößenbestimmung erstellt. Die Unterschiede der nah verwandten Plasmide beruhen wahrscheinlich auf durch mobile genetische Elemente verursachte Ereignisse der Veränderung der Gensequenzen, so z.B. die Insertion oder Deletion von Transposons oder DISKUSSION 181 Insertionselementen wie sie vielfältig für S. aureus beschrieben werden [Skurray u. Firth,1997]. Bereits in früheren Arbeiten [Janusch, 2000] wurde vermutet, dass die isolierten Plasmide Abkömmlinge von β-Laktamase-Plasmiden sind, welche ähnliche EcoRI Muster aufweisen, sich aber von diesen u.a. durch den Erwerb weiterer Resistenzdeterminanten oder aber durch Transposon oder IS-Elemente beeinflusste Umstrukturierungen unterscheiden. Neue Sequenzabschnitte in Plasmiden durch Transposons und Insertionselemente entstehen dadurch, dass diese in nicht-homologe Bereichen inserieren und dort auch als Loci für weitere Umstrukturierungen wie Deletionen und Inversionen dienen. Vermittelt werden diese Vorgänge durch site-spezifische Rekombinationssysteme. Unterliegen solche veränderten DNAs dann der normalen zelleigenen homologen Rekombination, führt dies zu weiteren Umstrukturierungen, besonders Deletionen und Verdoppelungen. Dies wurde auch für die β-Laktamase kodierende Region von zwei β-Laktamase Plasmiden, pI524 und pI258, gezeigt [Murphy u. Novick, 1980]. Die EcoRI-Fragmente dieser Plasmide stimmen mit denen der in der vorliegenden Arbeit ermittelten in etwa überein. Das Plasmid pI524 besitzt sechs EcoRI Fragmente der Größe 10,3 – 9,7 – 6,3 – 2,4 – 2,1 – 1,0 kb, worin sich deutlich Ähnlichkeit vor allem zu pFL35-1, aber auch pFL35-2, pFL35-2’ und pFL 35-3 sehen lässt. Die Ähnlichkeit zu pI258 welches vier EcoRI Fragmente der Größe 12,8 – 7,0 – 6,3 – 2,1 kb besitzt zu pFl 35-4 mit 10,8 – 8,7 – 6,3 – 5,1 kb ist weniger deutlich aber dennoch gegeben. pI524 und pI258 besitzen eine scheinbar unveränderliche Region von 8,4 kb, die auch bei weiteren Penicillinase-Plasmiden der Inkompatibiltätsgruppe I und II vorkommt [Novick et al., 1979; Shalita et al., 1980]. Zwei wesentliche Unterschiede zwischen pI524 und pI258 sind, dass pI258 das mit Erythromycin-Resistenz assoziierte Tn554 (5,2 kb) trägt [Novick et al., 1979], während pI524 nahe des bla- Locus eine 2,2 kb große invertierbare Sequenz besitzt, welche von einem Paar 650 bp inverted repeats flankiert wird [Murphy u. Novick, 1979]. Murphy u. Novick [1980] zeigten den Einfluss dieser IR-Sequenz mittels site-spezifischer intermolekularer Rekombination auf die Umstrukturierung des β-Laktamase-Bereichs von pI524 und pI258 mittels eines Rekombinationsereignisses. Sie folgerten aus ihren Untersuchungen, dass Transposon-abhängige Umstrukturierungen ein Hauptgrund der Diversität in der molekularen Evolution von Plasmiden sind. DISKUSSION 182 Auch bei folgend zum Vergleich mit den Ergebnissen dieser Arbeit erwähnten Ergebnissen anderer Arbeitsgruppen ist erkennbar, dass in jüngeren Untersuchungen Plasmide isoliert wurden, deren Restriktionsmuster denen der oben vor einigen Jahren beschriebenen ähneln. Die in der vorliegenden Arbeit ermittelten EcoRI-Muster stimmen mit denen von Udo et al. [2006] bei kuwaitischen MRSA ermittelten annährend überein. Udo et al. [2006] zeigten, dass die Restriktionsanalyse der 27 kb großen Plasmide mit EcoRI zwei eng verwandte Typen mit je sechs Fragmenten ergaben, die sich nur in der Größe von zwei Fragmenten unterschieden. Der erste Typ besaß dabei Fragmente der Größe 10,4 – 6,4 – 4,1 – 2,6 – 2,3 – 1,3 kb, während beim zweiten Typ das größte Fragment 11,5 kb und das viertgrößte Fragment 3,5 kb groß waren. Auch die in vorliegender Arbeit ermittelten EcoRI Muster ergaben sechs Fragmente, die teilweise sehr ähnliche Größen aufwiesen. Die Größen der kleinsten drei Fragmente die bei allen definierten Plasmidtypen der vorliegenden Arbeit nahezu gleich waren, stimmen mit den von Udo et al. [2006] ermittelten überein. Auch die größten Fragmente liegen in sehr ähnlichen Bereichen, sie betrugen in vorliegender Arbeit 10,3 bis 11,1 kb. Unterschiede bestehen allerdings beim viert- und fünftgrößten Fragment. Die in vorliegender Arbeit ermittelten lagen im Bereich von 8,5 bis 9,5 kb und sind somit eindeutig größer als die der kuwaitischen Studie. In dieser wurden die Resistenzmuster als ähnlich zu denen von MRSA aus südostasiatischen Ländern und als unterschiedlich zu denen klassischer in den 60er und 70er Jahren isolierter MRSA beschrieben [Grubb et al., 1986; Grubb, 1999; Gillespie et al., 1990]. Zuccarelli et al. [1996] ermittelten bei der Untersuchung 120 klinischer und aus der Umgebung Südkaliforniens stammender MRSA 37 unterschiedliche EcoRI-Muster. Das am häufigsten bei 45 % der Stämme und in allen Krankenhäusern vorkommende zeigte dabei im Gegensatz zu den von Udo et al. [2006] beschriebenen nur vier Fragmente der Größe 10,0 – 7,6 – 5,6 – 5,0 kb. Zu den in vorliegender Arbeit ermittelten Mustern besteht eine sehr große Ähnlichkeit zu dem des selten vorkommenden Typs pFL 35-4, dieser besaß Fragmente der Größe 10,8 – 8,7 – 6,3 – 5,1 kb. EcoRI-Muster mit sechs Fragmenten konnten Zuccarelli et al. [1996] nur zwei verschiedene ermitteln, dies bei jeweils einem Isolat. Das eine dieser Muster weicht in den Größen sehr stark sowohl von den in der vorliegenden Arbeit ermittelten als auch von denen bei Udo et al. [2006] ab. Das zweite zeigt jedoch mit DISKUSSION 183 Fragmenten von 10,8 – 8,9 – 7,8 – 6,4 – 2,8 – 2,4 kb, zumindest bis auf das drittgrößte Fragment welches 6,4 kb aufweist, eine gewisse Ähnlichkeit. Lässt man dieses Fragment außer Acht, so stimmen die restlichen Größen deutlich überein, allerdings besitzen sowohl die Plasmide der vorliegenden Arbeit als auch die von Udo et al. [2006] noch ein weiteres kleines Fragment um 1 kb Größe. Tab. 16 bis Tab. 20 fassen den obigen Vergleich von den in vorliegender Arbeit ermittelten Restriktionsfragmenten mit denen ähnlicher Plasmide aus der Literatur noch einmal zusammen. Weitere Übereinstimmungen von Plasmiden der vorliegenden Arbeit zu in der Literatur beschriebenen konnten nicht entdeckt werden. Tab. 16 Vergleich der in vorliegender Arbeit ermittelten EcoRI- Restriktionsmuster mit pI524 [Murphy u. Novick, 1980]. Angaben in kb. Fett gedruckt die größten Übereinstimmungen einzelner Fragmente. pI524 pFL35-1 pFL35-2 pFL35-2’ pFL35-3 10,3 10,3 11,1 10,8 10,2 9,7 8,5 9,0 9,5 9,2 6,3 7,3 7,8 7,3 7,3 2,4 2,6 2,7 2,6 2,6 2,1 2,2 2,3 2,2 2,3 1,0 1,1 1,1 1,1 1,2 Tab. 17 Vergleich der in vorliegender Arbeit ermittelten EcoRI- Restriktionsmuster mit von Udo et al. [2006] bei einem MRSA-Plasmid ermittelten. Angaben in kb. Fett gedruckt die größten Übereinstimmungen einzelner Fragmente. Udo 1 pFL35-1 pFL35-2 pFL35-2’ pFL35-3 10,4 10,3 11,1 10,8 10,2 6,4 8,5 9,0 9,5 9,2 4,1 7,3 7,8 7,3 7,3 2.6 2,6 2,7 2,6 2,6 2,3 2,2 2,3 2,2 2,3 1,3 1,1 1,1 1,1 1,2 Tab. 18 Vergleich der in vorliegender Arbeit ermittelten EcoRI- Restriktionsmuster mit von Udo et al. [2006] bei einem MRSA-Plasmid ermittelten. Angaben in kb. Fett gedruckt die größten Übereinstimmungen einzelner Fragmente. Udo 2 pFL35-1 pFL35-2 pFL35-2’ pFL35-3 11,5 10,3 11,1 10,8 10,2 6,4 8,5 9,0 9,5 9,2 4,1 7,3 7,8 7,3 7,3 3,5 2,6 2,7 2,6 2,6 2,3 2,2 2,3 2,2 2,3 1,3 1,1 1,1 1,1 1,2 DISKUSSION 184 Tab. 19 Vergleich der in vorliegender Arbeit ermittelten EcoRI- Restriktionsmuster mit von Zucarelli et al. [1996] bei einem MRSA-Plasmid ermittelten. Angaben in kb. Fett gedruckt die größten Übereinstimmungen einzelner Fragmente. Zucarelli 1 pFL35-1 pFL35-2 pFL35-2’ pFL35-3 10,8 10,3 11,1 10,8 10,2 8,9 8,5 9,0 9,5 9,2 7,8 7,3 7,8 7,3 7,3 6,4 2,8 2,6 2,7 2,6 2,6 2,4 2,2 2,3 2,2 2,3 1,1 1,1 1,1 1,2 Tab. 20 Vergleich der in vorliegender Arbeit ermittelten EcoRI- Restriktionsmuster von pFL35-4 mit pI258 [Murphy u. Novick, 1980] und einem von Zucarelli et al. [1996] bei MRSA ermittelten. Angaben in kb. Fett gedruckt die größten Übereinstimmungen einzelner Fragmente. pI258 pFL35-4 Zuccarelli 2 12,8 10,8 10 7,0 8,7 7,6 6,3 6,3 5,6 2,1 5,1 5 Die Diversität der ermittelten EcoRI-Muster legt nahe, dass Mechanismen wie Konjugation, Transduktion, Transposition und site-spezifischer Rekombination einen erheblichen Einfluss auf die Struktur von Plasmiden haben. Umstrukturierungen eines bei MRSA vorkommenden β-Laktamase-kodierenden Plasmides plP1066 wurden auch von Derbise et al. [1995] beschrieben. Diese beschrieben in diesem Zusammenhang ein Tn552-ähnliches putatives Transposon Tn5404, das über Insertion nahe der regulatorischen ß-Laktamase-Gene ein 3,5 kb großes invertierbares Segment erzeugte. Auch vom etb-kodierenden Plasmid pRW001 ist z.B. bekannt, dass es sich im Laufe der Zeit weiterentwickelt hat, so dass mittlerweile Subtypen von ihm wie pETB bekannt sind [Yamaguchi et al., 2001; Navaratna et al., 1999]. DISKUSSION 185 5.9 Entwicklung von MRSA mit SCCmec IV im Zeitraum von 1999 bis 2004 Da SCCmec IV in allen Kollektiven bis auf das älteste des Jahres 1999 am stärksten vertreten war, lässt sich an ihm die Entwicklung der anderen untersuchten Eigenschaften im Laufe der Zeit beschreiben. Das SCCmec-Element als Haupteigenschaft zu betrachten unterliegt natürlich einer gewissen Willkür, ebenso könnte man ein bestimmtes Antibiotikum, einen Plasmidtyp oder eine andere Eigenschaft als Leitmotiv wählen. Aber zum einen behandelt die vorliegende Arbeit primär MRSA und zum anderen ist das Vorhandensein eines SCCmec-Elementes in einem S. aureus eine sehr bedeutende, den Stamm prägende und seine Möglichkeiten beeinflussende Eigenschaft. Betrachtet man die soeben diskutierte Eigenschaft des Vorkommens von Plasmiden, so lässt sich bei SCCmec IV-Stämmen eine deutliche Veränderung im Laufe der Zeit feststellen (s. Abb. 67). Während sich der Anteil der plasmidhaltigen Stämme im Laufe der Jahre mit 77,8 % in 1999, 64,3 % in 2001, 81,2 % in 2002, 74,1 % in 2003 und 88,1 % in 2004 eher geringfügig änderte, so lassen sich bei der Zusammensetzung dieser Stämme durchaus Änderungen feststellen. Besonders auffällig ist die des stark gesteigerten Vorkommens von Stämmen mit einem großen und einem kleinen Plasmid im Laufe der Zeit, dieser Wert steigt von 0 % in 1999 auf 50,8 % in 2004. Dagegen ist das Vorkommen von Stämmen mit nur einem Plasmid in dieser Zeit von 55,5 % auf 28,4 % rückläufig. Es gab also in Bezug auf die plasmidäre Ausstattung der SCCmec IV-Stämme einen deutlichen Wandel im Laufe der Zeit. Dieser lässt sich evtl. auch in Zusammenhang setzen mit dem Vorhandensein von Antibiotikaresistenzgenen, welches sich im Laufe der Jahre ebenfalls deutlich änderte. Am auffälligsten ist hierbei die Veränderung des Vorkommens von aacA-aphD von 66,7 % in 1999, 7,1 % in 2001, 12,5 % in 2002, 25,9 % in 2003 und 13,4 % in 2004. Das Vorkommen von ermA zeigt einen dem ähnlichen Verlauf. Das andere MLS-Resistenzgen ermC kommt hingegen in den Kollektiven ab 2001 in steigender Anzahl vor, in Isolaten aus 1999 hingegen gar nicht. Dieses Vorkommen von ermC lässt sich evtl. in Zusammenhang mit dem veränderten Vorkommen von Plasmiden erklären, denn ermC liegt zumeist auf einem kleinen Plasmid wie pE194. Ein solches kleines Plasmid könnte somit der eine Teil DISKUSSION 186 der hier beschriebenen Plasmidgruppe „ein großes und ein kleines Plasmid“ sein, deren Vorkommen im Laufe der Jahre stark zunimmt. Auch beim Vorkommen von Toxingenen lassen sich bei den SCCmec IV-Stämmen Unterschiede feststellen, die deutlichsten auch hier jedoch zwischen denen des Jahres 1999, wobei deren Anzahl nur neun beträgt, und denen der späteren Jahre. Diese ähneln sich vor allem bzgl. des Vorkommens von sec, seg und sei, wovon ersteres z.B. bei Stämmen aus 1999 gar nicht nachweisbar war. Sea und see kommen nur bei SCCmec IV-Isolaten aus 1999 und 2003 vor, solche mit dem lukF Gen nur in 2002. Interessant ist auch der Vergleich der Diagramme zum Vorkommen von Antibiotikaresistenz- und Toxingenen der gesamten Kollektive mit denen von SCCmec IV. Hier wird zum einen der erhebliche Einfluss des primär vorkommenden SCCmec IV deutlich, zum anderen aber auch, welche Eigenschaften anscheinend nicht durch den Kassettenchromosomtyp bedingt sind. Beim Vergleich der Toxingene fällt dabei z.B. auf, dass bei den Isolaten aus 2002 und 2004 das Vorkommen von sed und sej nicht durch SCCmec IV Stämme verursacht werden kann. Auch beim Vergleich der Diagramme zum Vorkommen von Antibiotikaresistenzgenen zeigen sich bei einem derartigen Vergleich Unterschiede aus denen auf den Einfluss von SCCmec IV geschlossen werden kann. Insgesamt lässt sich sagen, dass sich MRSA mit SCCmec IV in der Zeit von 1999 bis 2004 geändert haben, dies vor allem bzgl. des Vorhandenseins von Plasmiden, was wiederum das Vorkommen von Resistenz- und Toxingenen beeinflussen kann. Auch Ghebremedhin et al. [2007] konnten Unterschiede von SCCmec IV-Isolaten eines begrenzten Gebietes der Jahre 2002 bis 2004 feststellen. Sie untersuchten 42 Isolate des Barnim-Epidemiestammes (ST22-MRSA-IV), die in diesem Zeitraum im Universitätsklinikum Magdeburg gesammelt wurden und konnten neben vier unterschiedlichen Antibiotikaresistenzmustern feststellen, dass alle Isolate sec-positiv waren und ein gleiches Toxingenprofil besaßen. Typisierungsmethoden wie PFGE ergaben unterschiedliche Profile für die Isolate, so dass diese Studie zeigte, dass eine Diversität des Barnim-Epidemiestammes innerhalb der Klinik besteht und somit eine Mikroevolution des Barnim-Klones stattgefunden hat. Auch die in der vorliegenden Arbeit ermittelten Ergebnisse weisen auf eine Evolution von SCCmec IV-Stämmen in der nordhessischen Region hin. ZUSAMMENFASSUNG 187 6 Zusammenfassung Die vorliegende Arbeit liefert erstmals einen umfassenden Überblick über die molekulare Epidemiologie von MRSA eines nordhessischen Krankenhauses inklusive seines Umfeldes und deren Entwicklung in einem Zeitraum von fünf Jahren. Von besonderer Bedeutung ist, dass die MRSA-Stämme hierfür nicht nur anhand ihrer SCCmec-Region typisiert wurden, sondern eine weitergehende Charakterisierung auf Grund der Bestimmung des Vorkommens von Antibiotikaresistenz- und Toxingenen, sowie Plasmiden erfolgte. Dabei wurde ein neuer SCCmec-Typ entdeckt und charakterisiert und weitere noch unbekannte SCCmec-Elemente beschrieben. Bei der Charakterisierung der MRSA-Kollektive konnten bzgl. aller untersuchten Eigenschaften im Laufe der Zeit signifikante Veränderungen beobachtet werden. Am deutlichsten waren diese Unterschiede zwischen dem ältesten Kollektiv aus 1999 und allen nachfolgenden Kollektiven. Die Kollektive aus 2001, 2002, 2003 und 2004 zeigten untereinander größere Ähnlichkeiten, aber dennoch gleichzeitig eine tendenziell divergente Entwicklung einzelner Eigenschaften. Besonders auffallend war das dominante Auftreten von SCCmec IV mit 63 - 87 % der Isolate eines Kollektivs ab 2001, gegenüber 16 % in 1999. Weiterhin erfolgte eine markante Veränderung im Vorkommen einzelner Antibiotikaresistenzgene von 1999 bis 2004. So waren aacA-aphD und ermA bei MRSA aus 1999 mit 84 % bzw. 90 % deutlich häufiger als in allen Kollektiven der folgenden Jahre (aacA-aphD: max. 32 %, ermA: max. 40 %). Wohingegen ermC ein stets zunehmendes Vorkommen von 3 % auf 67 % über den Untersuchungszeitraum zeigte. Unkontinuierliches aber statistisch relevant vermehrtes Auftreten von tetM konnte bei Isolaten aus 1999 (40 %) und 2004 (74 %) nachgewiesen werden. Auch bei Toxingenen zeigten sich deutliche Unterschiede in der zeitlichen Verteilung. Ab 2001 zeigten alle Isolate wesentlich höhere Anteile an sec, seg und sei verglichen mit den MRSA aus 1999. So konnte sec im Kollektiv aus 1999 gar nicht nachgewiesen werden, in denen der Folgejahre mit 54 - 77 %. Die Werte für seg und sei stiegen von 48 % bzw. 41 % in 1999 kontinuierlich auf über 90 % in 2004. Die Häufigkeit von MRSA sowohl mit mehreren Resistenzgenen als auch die mit mehreren Toxingenen nahm im Laufe der Zeit zu und korrelierte mit dem Vorkommen von Plasmiden ZUSAMMENFASSUNG 188 Bezüglich seiner Korrelation mit den vorkommenden Plasmiden zeigte SCCmec IV im Erhebungszeitraum besonders deutlich eine Veränderung. So nahm über den Zeitraum der Beobachtung die Anzahl der Stämme die zusätzlich zu einem großen Plasmid ein weiteres kleines Plasmid besaßen signifikant zu. Auch beim Vergleich der SCCmec-Typen der MRSA-Isolate konnten Unterschiede bzgl. aller weiteren untersuchten Eigenschaften dargestellt werden. So zeigten z.B. alle SCCmec IIIA das sea-Gen, während dies bei allen anderen in der vorliegenden Arbeit untersuchten SCCmec-Typen nur vereinzelt vorkam. SCCmec II-Stämme wiesen sowohl die meisten Antibiotikaresistenz- als auch Toxingene auf. Es wurde ferner gezeigt, dass Stämme mit vielen Resistenzgenen auch eine hohe Anzahl Toxingene besaßen und dies im Zusammenhang mit einem erhöhten Plasmidgehalt stehen könnte. Aus den MRSA-Kollektiven isolierte Plasmide konnten aufgrund von Restriktionsanalysen als verwandt zu β-Laktamase-Plasmiden des Grundtyps pI524 und pI258 beschrieben werden. Der in vorliegender Arbeit gezeigte Zusammenhang zwischen der Anzahl von dru in der HVR und dem SCCmec-Typ half den Unterschied zwischen SCCmec IV und SCCmec IVA, sowie die Sonderstellung des in vorliegender Arbeit erstmalig beschriebenen SCCmec IA/II darzustellen. Nicht alle Isolate konnten einem bekannten SCCmec-Typ zugeordnet werden, es handelt sich bei diesen Ausnahmen um weitere noch unbekannte und hier erstmalig beschriebene SCCmec-Typen. Aufgrund der vorliegenden Arbeit konnte ein neuer SCCmec-Typ definiert werden, namentlich der Typ SCCmec IA/II, der seit 1999 in der Region gehäuft vorkommt Die vorliegenden Untersuchungen zeigten somit, dass die Epidemiologie von MRSA der Region Nordhessen trotz bestehender Gemeinsamkeiten zur MRSA-Situation in ganz Deutschland auch Besonderheiten aufweist. Diese nun zu kennen kann einen Beitrag zur gezielten Verbesserung bisheriger Maßnahmen zur Ausbreitungskontrolle von MRSA in der nordhessischen Region leisten. AUSBLICK 189 7 Ausblick Die in der vorliegenden Arbeit durchgeführten grundlegenden Arbeiten zu MRSA der Region Nordhessen bieten einige interessante Ansatzpunkte zu weiterführenden Untersuchungen. So gibt es noch weitere Merkmale deren Untersuchung zur Unterscheidung der Isolate von Interesse ist. Dies sind im Besonderen weitere Resistenzdeterminanten, neben Antibiotika auch gegen Antiseptika (z.B. qacA, qacB, qacC) und gegen Schwermetalle. Letzteres wäre auch aus dem Grund interessant, da z.B. SCCmec III ein mer-Operon enthält, wie es auch in Transposons vorkommt. Ein Screening auf das Vorhandensein von Transposons und Insertionselementen kann weitere Schlüsse zur Entwicklung der MRSA-Stämme in Blick auf Herkunft der Resistenzdeterminanten, der Evolution der Plasmide und der SCCmec-Region ermöglichen und so zur weiteren Unterscheidung der Isolate dienen. Weitere vertiefende Untersuchungen der durchgeführten Arbeiten zur Klassifizierung der SCCmec-Region könnten zunächst über eine Restriktionsanalyse der dru- Elemente oder Hybridisierungen der HVR-Region erfolgen. Eine vertiefende Untersuchung der in vorliegender Arbeit neu beschriebenen SCCmec-Typen wäre von grundlegender Bedeutung für die Epidemiologie und Evolution der MRSA. Dies gilt besonders für die in der vorliegenden Arbeit erstmalig beschriebenen SCCmec-Typen. Von besonderem Interesse ist hierbei die genaue Analyse des aufgrund der vorliegenden Arbeit neu definierten Typs SCCmec IA/II, da dieser im Erhebungszeitraum gehäuft auftrat. Diese Analysen sollten auch DNA- Sequenzanalysen der SCCmec-Region beinhalten, um genaueren Aufschluss über die möglichen neuen Umstrukturierungen dieser Region zu erhalten. Ein anderer Ansatzpunkt für weiterführende Untersuchungen sind die in vorliegender Arbeit beschriebenen Plasmide der MRSA-Stämme. Bei diesen wurden Restriktionsmuster nachgewiesen die zwar große Ähnlichkeiten zu in der Literatur bekannten Plasmiden besitzen, aber auch signifikante Abweichungen in einzelnen Fragmenten zeigen. Auch der Vergleich der ermittelten Restriktionsmuster der Plasmide der vorliegenden Arbeit untereinander ergab, dass sich diese größtenteils in ihren Restriktionsmustern ähneln, jedoch Abweichungen in einzelnen Fragmenten zeigen. Durch weitere Untersuchungen auf Basis dieser Erkenntnisse könnten AUSBLICK 190 Schlüsse zur Evolution der Plasmidtypen und auch der MRSA-Stämme gezogen werden. Diese könnten auch hilfreich sein, die noch nicht abschließend geklärte Bedeutung von Plasmiden für MRSA-Stämme zu beurteilen. Auf diesem Wege könnten auch mögliche Ansätze gefunden werden ein weiteres sehr interessantes Phänomen der MRSA, nämlich den Umwandlungsmechanismus von normalen MRSA in small colony variants (SCV), weiter aufklären zu helfen. SCV- Varianten verändern Eigenschaften des Bakteriums hin zu einer schlechteren Identifizier- und Therapierbarkeit. Derart veränderte MRSA wären von erhöhter klinischer Bedeutung. Insgesamt bietet die MRSA-Thematik eine sehr große Vielfalt interressanter Fragestellungen, deren Beantwortung, wie die vorliegende Arbeit zeigt, gerade auch in einem regionalen Kontext zu aufschlussreichen Erkenntnissen führen kann DATENTABELLE 191 Tab. 21 Zusammenfassung der ermittelten Eigenschaften aller untersuchten Isolate. X = positiv, ° = negativ / nicht vorhanden, NN = SCC-Typ nicht genau zuordenbar, neg = kein SCC-Typ, -m = kein mecA Fragment in SCC-PCR, K – kleines Plasmid, G – großes Plasmid, B – kleines und großes Plasmid, M – mehrere Plasmide, n.b. = nicht bestimmt. SC C T yp dr us cc rA aa cA -a ph D er m A er m C te tK te tM va tA va tB se a se b se c se d se e se g se h se i se j ts t lu kF Pl as m id Pl as m id ty p KKS-99-1 IA 11 ° X X ° ° X ° ° ° ° ° ° ° X ° X ° ° ° ° ° KKS-99-2 IV 11 ° ° X ° ° ° ° ° X ° ° X ° ° ° ° X ° ° K n.b. KKS-99-3 IA 8 ° X X ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° X ° X ° ° ° ° ° KKS-99-4 I 8 ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° X ° X ° ° ° ° ° KKS-99-5 NN 11 ° X X ° ° X ° ° ° ° ° ° ° X ° X ° ° ° ° ° KKS-99-6 IIIA 11 3 ° X ° ° X ° ° X ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° K n.b. KKS-99-7 I 8 2 X X ° ° ° ° ° X ° ° X ° ° ° ° X ° ° G pFL35-2 KKS-99-8 IA 8 1 X ° ° ° ° ° ° X ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° G pFL35-1 KKS-99-9 IA 0 1 X X ° ° X ° ° X ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° G pFL35-2 KKS-99-10 IA 8 ° X X ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° X X X ° ° ° G pFL35-1 KKS-99-11 I 0 1 X X ° ° X ° ° X ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° G pFL35-2' KKS-99-12 I 8 ° X X ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° X ° X ° ° ° G pFL35-1 KKS-99-13 I 8 ° X X ° ° X ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° G pFL35-1 KKS-99-14 I 8 ° X X ° ° X ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° G pFL35-2 KKS-99-15 I 8 ° X X ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° X X X ° ° ° G pFL35-1 KKS-99-16 I 8 ° X X ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° X ° X ° ° ° G pFL35-1 KKS-99-17 IIIA 11 3 X X ° ° ° ° ° X ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° K n.b. KKS-99-18 IIIA 11 3 X X ° ° X ° ° X ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° K n.b. KKS-99-19 I 8 1 X X ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° KKS-99-20 IV 11 2 ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° X ° ° ° ° X ° ° G pFL35-2 KKS-99-21 IV 11 2 X X ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° X ° X ° ° ° ° ° KKS-99-22 IA 11 ° X X ° ° X ° ° X X ° ° ° ° ° ° ° ° ° G pFL35-1 KKS-99-23 NN 0 2 X X ° ° ° ° ° ° X ° ° ° ° ° ° ° ° ° G n.b. KKS-99-24 IV 11 2 ° ° ° ° ° ° ° ° X ° ° ° ° ° ° ° ° ° G pFL35-1 KKS-99-25 I 7 ° X X ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° X ° X ° ° ° G n.b. KKS-99-26 I 7 2 X X ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° X ° X ° ° ° G pFL35-1 KKS-99-27 IIIA 11 2 X X X ° X ° ° X ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° K n.b. KKS-99-28 IIIA 11 3 X X ° ° X ° ° X ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° K n.b. KKS-99-29 III 0 ° X X ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° X ° ° X ° ° G pFL35-3 KKS-99-30 II 0 2 ° ° ° ° ° ° ° ° x ° ° ° ° ° ° ° X ° G pFL35-1 KKS-99-31 II 0 2 X X ° ° X ° ° ° ° ° ° ° X ° X ° ° ° G pFL35-2 KKS-99-32 I 8 2 X X ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° X ° X ° ° ° G pFL35-1 KKS-99-33 I 8 ° X X ° ° X ° ° ° ° ° ° ° X ° X ° ° ° G pFL35-1 KKS-99-34 I 8 ° X X ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° X ° ° ° ° ° G n.b. KKS-99-35 I 8 1 X X ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° G pFL35-1 KKS-99-36 I 8 1 X X ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° G n.b. KKS-99-37 IA/II 0 2 X X ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° X ° ° ° ° ° G pFL35-2’ DATENTABELLE 192 SC C T yp dr us cc rA aa cA -a ph D er m A er m C te tK te tM va tA va tB se a se b se c se d se e se g se h se i se j ts t lu kF Pl as m id Pl as m id ty p KKS-99-38 I 8 2 X X ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° X ° X ° ° ° G pFL35-1 KKS-99-39 I 8 1 X X ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° X ° X X ° ° G pFL35-4 KKS-99-40 I 8 1 X X ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° X ° X ° ° ° G pFL35-1 KKS-99-41 III 10 3 X X X ° X ° ° X ° ° ° ° ° ° ° X ° ° G pFL-35-3 KKS-99-42 I 8 1 X X ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° X ° X ° ° ° G pFL35-1 KKS-99-43 IV 11 2 X X ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° X ° X ° ° ° G pFL-35-3 KKS-99-44 III 0 ° X X ° ° X ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° G pFL35-1 KKS-99-45 IV 11 2 X X ° ° X ° ° ° ° ° ° ° X ° X ° ° ° G pFL35-1 KKS-99-46 III 10 3 X X ° ° X ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° G n.b. KKS-99-47 IV 11 2 X X ° ° X ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° X ° G pFL35-1 KKS-99-48 IV 11 2 X X ° ° X ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° KKS-99-49 IV 0 2 X X ° ° X ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° G n.b. KKS-99-50 III 10 ° X X ° ° X ° ° ° ° ° X ° X ° ° ° ° ° G pFL35-4 KKS-99-51 II 11 2 ° X ° ° ° ° ° ° ° ° ° X X ° X ° ° ° G n.b. KKS-99-52 IA/II 0 2 ° X ° ° ° ° ° ° ° ° X ° X ° X X ° ° G pFL-35-1 KKS-99-53 I 8 2 X X ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° X ° X ° ° ° G n.b. KKS-99-54 I 0 2 X ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° G pFL35-1 KKS-99-55 I 8 2 X X ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° X ° X ° ° ° G n.b. KKS-99-56 III 10 3 X X ° ° X ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° G pFL35-1 KKS-99-57 III 10 3 ° X ° ° ° ° ° X ° ° ° ° ° ° ° ° X ° G pDL-35-2 KKS-99-58 IIIA 7 3 X X ° ° X ° ° X ° ° ° ° ° ° ° ° X ° G n.b. KKS-01-1 IA 11 1 X X ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° X ° X ° ° ° G pFL-35-1 KKS-01-2 III 7 3 X ° ° X X X ° ° ° ° ° ° X ° X ° ° ° G pFL-35-1 KKS-01-3 IV 0 ° ° ° X ° ° ° ° ° ° ° X ° X ° X X ° ° ° ° KKS-01-4 IV 11 2 ° ° ° ° ° ° ° ° ° X ° ° X ° X ° ° ° ° ° KKS-01-5 IV 11 2 ° ° ° ° ° ° ° ° ° X ° ° X ° X ° ° ° G pFL-35-3 KKS-01-6 IV 11 2 ° ° ° ° ° ° ° ° ° X ° ° X ° X ° ° ° G pFL-35-2’ KKS-01-7 IV 11 2 ° ° X ° ° ° ° ° ° X ° ° X ° X ° ° ° G pFL-35-1 KKS-01-8 NN 0 ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° X ° ° X ° X ° ° ° B n.b. KKS-01-9 NN 11 ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° X ° X ° X X ° ° B n.b. KKS-01-10 IV 11 2 ° ° ° ° ° ° ° ° ° X ° ° X ° X ° ° ° G pFL-35-1 KKS-01-11 IV 11 2 ° X X ° ° ° ° ° ° X ° ° X ° X ° ° ° G pFL-35-4 KKS-01-12 IV 11 2 ° ° ° ° ° ° ° ° ° X ° ° X ° X ° ° ° G pFL-35-3 KKS-01-13 IV 10 2 ° ° ° ° ° ° ° ° ° X ° ° X ° X ° ° ° ° ° KKS-01-14 IV 11 2 X ° X ° ° ° ° ° ° X ° ° ° ° ° ° ° ° G pFL-35-2 KKS-01-15 IV 11 2 ° X ° ° ° ° ° ° ° X ° ° X ° X ° ° ° ° ° KKS-01-16 IV 11 2 ° ° X ° ° ° ° ° ° X ° ° X ° X ° ° ° G pFL-35-1 KKS-01-17 IV 11 2 ° ° X ° ° ° ° ° ° X ° ° X ° X ° ° ° ° ° KKS-01-18 IV 11 2 ° ° ° ° ° ° ° ° ° X ° ° X ° X ° ° ° B n.b. KKS-01-19 IV 11 2 ° ° ° ° ° ° ° ° ° X ° ° X ° X ° ° ° G n.b. KKS-01-20 IV 10 2 ° ° ° ° ° ° ° ° ° X ° ° X ° X ° ° ° ° ° DATENTABELLE 193 SC C T yp dr us cc rA aa cA -a ph D er m A er m C te tK te tM va tA va tB se a se b se c se d se e se g se h se i se j ts t lu kF Pl as m id Pl as m id ty p KKS-01-21 IV 11 2 ° ° X ° ° ° ° ° ° X ° ° X ° X ° ° ° G n.b. KKS-01-22 IVA -m 0 ° ° X X ° ° ° ° ° ° ° X ° X ° X X ° ° G pFL-35-1 KKS-01-23 IA 11 1 X X ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° X ° X ° ° ° G pFL-35-1 KKS-01-24 III 7 3 X ° ° X X X ° ° ° ° ° ° X ° X ° ° ° B n.b. KKS-01-25 III 7 3 ° X ° X ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° G pFL-35-2 KKS-01-26 IV 11 2 ° ° ° ° ° ° ° ° ° X ° ° X ° X ° ° ° ° ° KKS-01-27 IV 0 ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° X ° X ° ° ° K n.b. KKS-01-28 IV 11 2 ° ° X ° ° ° ° ° ° X ° ° X ° X ° ° ° ° ° KKS-01-29 IV 11 2 ° ° ° ° ° ° ° ° ° X ° ° X ° X ° ° ° G pFL-35-3 KKS-01-30 IV 0 ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° X ° X ° ° ° K n.b. KKS-01-31 IV 10 2 ° ° ° ° ° ° ° ° ° X ° ° X ° X ° ° ° ° ° KKS-01-32 IV 11 2 ° X X ° ° ° ° ° ° X ° ° X ° X ° ° ° G pFL-35-4 KKS-01-33 IV 11 2 X ° X ° ° ° ° ° ° X ° ° ° ° ° ° ° ° G pFL-35-3 KKS-01-34 IV 0 ° ° ° X ° ° ° ° ° ° ° X ° X ° X X ° ° ° ° KKS-01-35 IV 11 2 ° X ° ° ° ° ° ° ° X ° ° X ° X ° ° ° ° ° KKS-01-36 IV 11 2 ° ° X ° ° ° ° ° ° X ° ° X ° X ° ° ° G pFL-35-1 KKS-01-37 IV 11 2 X ° X ° ° ° ° ° ° X ° ° ° ° ° ° ° ° X n.b. 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KKS-02-40 IV 11 2 ° ° X ° ° ° ° ° ° X ° ° X ° X ° ° ° ° ° KKS-02-41 IV 11 2 ° ° ° ° ° ° ° ° ° X ° ° X ° X ° ° ° G pFL-35-1 KKS-02-42 IV 11 2 ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° X ° X ° ° ° G pFL-35-1 KKS-02-43 IV 11 2 ° ° ° ° ° ° ° ° ° X ° ° X ° X ° ° ° ° ° KKS-02-44 IV 11 2 X ° ° ° ° ° ° ° ° X ° ° X ° X ° ° ° G n.b. DATENTABELLE 195 SC C T yp dr us cc rA aa cA -a ph D er m A er m C te tK te tM va tA va tB se a se b se c se d se e se g se h se i se j ts t lu kF Pl as m id Pl as m id ty p KKS-02-45 IV 11 2 ° ° ° ° ° ° ° ° ° X ° ° X ° X ° ° ° B n.b. KKS-02-46 IV 11 2 ° ° ° ° ° ° ° ° ° X ° ° X ° X ° ° ° B n.b. KKS-02-47 IV 11 2 ° ° ° ° ° ° ° ° ° X ° ° X ° X ° ° ° G pFL-35-4 KKS-02-48 IV 11 2 ° X ° ° ° ° ° ° ° X ° ° X ° X ° ° ° B n.b. KKS-02-49 IV 11 2 ° ° X ° ° ° ° ° ° X ° ° X ° X ° ° ° B n.b. KKS-02-50 neg 0 ° ° X ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° X ° X ° ° ° G pFL-35-3 KKS-02-51 NN 11 ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° KKS-02-52 IVA 0 2 ° ° ° ° ° ° ° X ° ° X X ° ° ° X ° ° G pFL-35-2 KKS-02-53 NN 0 ° ° X ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° X ° X ° ° ° G pFL-35-1 KKS-02-54 I 8 1 X X ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° G n.b. KKS-02-55 I 11 2 X X ° ° ° ° ° ° ° X ° ° X ° X ° ° ° G pFL-35-2 KKS-02-56 IA 11 2 X X ° ° ° ° ° ° X ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° KKS-02-57 IA/II 0 2 ° X ° ° ° ° ° ° ° ° X ° X ° X X ° ° G n.b. KKS-02-58 IA/II 0 2 ° X ° ° ° ° ° ° ° ° X ° X ° X X ° ° G pFL-35-1 KKS-02-59 IA/II 0 2 ° X ° ° ° ° ° ° ° ° X ° X ° X X ° ° G n.b. KKS-02-60 IV 11 2 ° X ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° X ° X ° ° X ° ° KKS-02-61 IV 11 2 ° ° ° ° ° ° ° ° ° X ° ° X X X ° ° ° G pFL-35-1 KKS-02-62 IV 11 2 ° ° ° ° ° ° ° ° ° X ° ° X ° X ° ° ° B n.b. KKS-02-63 IV 11 2 ° X X ° ° ° ° ° ° ° ° ° X ° X ° ° ° B n.b. KKS-02-64 IV 11 2 ° ° X ° ° ° ° ° ° X ° ° X ° X ° ° ° ° ° KKS-02-65 IV 11 2 ° ° ° ° ° ° ° ° ° X ° ° X ° X ° ° ° G pFL-35-2 KKS-02-66 IV 11 2 ° ° X ° ° ° ° ° ° X ° ° X ° X ° ° ° B n.b. KKS-02-67 IV 11 2 ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° X ° X ° ° ° G pFL-35-1 KKS-02-68 IV 11 2 ° ° ° ° ° ° ° ° ° X ° ° X ° X ° ° ° ° ° KKS-02-69 IVA 0 2 ° ° ° ° ° ° ° X ° ° X X ° ° ° X ° ° G n.b. KKS-02-70 IV 11 2 X ° ° ° ° ° ° ° ° X ° ° X ° X ° ° ° G pFL-35-1 KKS-02-71 IV 11 2 ° ° ° ° ° ° ° ° ° X ° ° X ° X ° ° ° B n.b. KKS-02-72 IV 11 2 ° ° ° ° ° ° ° ° ° X ° ° X ° X ° ° ° G n.b. KKS-02-73 IV 11 2 ° X ° ° ° ° ° ° ° X ° ° X ° X ° ° ° B n.b. KKS-02-74 IV 11 2 ° ° X ° ° ° ° ° ° X ° ° X ° X ° ° ° B pFL-35-2 KKS-02-75 NN 11 ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° KKS-02-76 NN 0 ° ° X ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° X ° X ° ° ° G n.b. KKS-03-1 IV 11 2 ° ° ° ° ° ° ° ° ° X ° ° X ° X ° ° ° K n.b. KKS-03-2 IV 11 2 ° X X ° ° ° ° ° ° X ° ° X ° X ° ° ° ° ° KKS-03-3 NN 0 2 X ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° KKS-03-4 IV 11 2 ° ° X ° ° ° ° ° ° X ° ° X ° X ° ° ° G pFL-35-3 KKS-03-5 IV 11 2 ° ° X ° ° ° ° ° ° X ° ° X ° X ° ° ° ° ° KKS-03-6 I 10 2 X X ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° X ° X ° ° ° ° ° KKS-03-7 IV 11 2 ° ° ° ° ° ° ° ° ° X ° ° X ° X ° ° ° G pFL-35-1 KKS-03-8 IV 11 2 X ° ° ° ° ° ° ° ° X ° ° ° ° ° ° ° ° B n.b. KKS-03-9 IV 11 2 ° X ° ° ° ° ° X ° ° ° X ° ° ° ° ° ° ° ° DATENTABELLE 196 SC C T yp dr us cc rA aa cA -a ph D er m A er m C te tK te tM va tA va tB se a se b se c se d se e se g se h se i se j ts t lu kF Pl as m id Pl as m id ty p KKS-03-10 IV 11 2 ° ° ° ° ° ° ° ° ° X ° ° X ° X ° ° ° ° ° KKS-03-11 IV 11 2 ° ° X ° ° ° ° ° ° X ° ° X ° X ° ° ° G pFL-35-1 KKS-03-12 IV 11 2 X ° X ° X ° ° ° ° X ° ° X ° X ° ° ° G pFL-35-1 KKS-03-13 IV 11 2 X X ° ° ° ° ° X ° ° ° X ° ° ° ° ° ° ° ° KKS-03-14 IV 11 2 X ° ° ° ° ° ° ° ° X ° ° X ° X ° ° ° B n.b. 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KKS-03-31 IV 11 2 ° ° ° ° ° ° ° ° ° X ° ° X ° X ° ° ° K n.b. KKS-04-1 I 7 2 ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° X ° X ° ° ° ° ° KKS-04-2 IV 11 2 ° X X ° ° ° ° ° ° ° ° ° X ° X ° ° ° B n.b. KKS-04-3 IV 11 2 ° X X ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° X ° ° ° K n.b. KKS-04-5 IV 11 2 ° ° X ° X ° ° ° ° ° ° ° X ° X ° ° ° B n.b. KKS-04-6 IV 11 2 ° ° X ° ° ° ° ° ° X ° ° X ° X ° ° ° K n.b. KKS-04-7 IV 11 2 ° X ° ° ° ° ° ° ° X ° ° X ° X ° ° ° ° ° KKS-04-8 IV 11 2 ° X X ° X ° ° ° ° X ° ° X ° X ° ° ° B n.b. KKS-04-9 IV 11 2 ° ° X ° ° ° ° ° ° X ° ° X ° X ° ° ° B n.b. KKS-04-10 IA/II 0 2 X X X X X X ° ° ° ° X ° X ° X X ° ° G pFL-35-1 KKS-04-11 IV 11 2 X X ° ° ° ° ° ° ° ° X X ° ° X X ° ° G pFL-35-2 KKS-04-12 IV 11 2 ° ° X ° X ° ° ° ° ° ° ° X ° X ° ° ° B n.b. KKS-04-13 IV 11 2 ° ° X ° X ° ° ° ° X ° ° ° ° X ° ° ° B n.b. KKS-04-14 IV 11 2 ° ° ° ° X X X ° ° ° ° ° X ° X ° ° ° G n.b. KKS-04-15 IV 11 2 ° ° ° ° X ° ° ° ° X ° ° X ° X ° ° ° G pFL-35-4 KKS-04-16 NN 0 2 X X ° X X X X ° ° ° X ° X ° X X ° ° G n.b. 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DIAKS-03-20 I 8 ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° DIAKS-03-21 I 11 1 ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° X ° X ° ° ° ° ° DIAKS-03-22 I 11 1 ° ° X ° ° ° ° ° ° X ° ° X ° X ° ° ° G pFL-35-3 DIAKS-03-23 IV 11 2 ° ° ° ° ° ° ° ° ° X ° ° X ° X ° ° ° K n.b. DIAKS-03-24 IV 11 2 ° ° ° X ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° X B n.b. DIAKS-03-25 IV 11 2 ° ° ° ° ° ° ° ° ° X ° ° X ° X ° ° ° B n.b. DIAKS-03-26 IA/II 0 2 ° X ° ° ° ° ° ° ° ° X ° X ° X X ° ° K n.b. DIAKS-03-27 IA/II 0 2 ° X ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° X ° X X ° ° ° ° DIAKS-03-28 IV 11 2 ° ° X ° ° ° ° ° ° ° ° ° X ° X ° X ° G pFL-35-1 DIAKS-03-29 IV 11 2 ° ° X ° ° ° ° ° ° X ° ° ° ° ° ° ° ° B n.b. DIAKS-03-30 IV 11 ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° X ° X ° ° ° ° ° DIAKS-03-31 IV 11 2 ° ° ° ° X ° ° ° ° ° X ° X ° X X ° ° B n.b. DIAKS-03-32 I 11 1 ° ° X ° ° ° ° ° ° X ° ° X ° X ° ° ° G pFL-35-3 DIAKS-03-33 IV 11 2 ° ° ° ° ° ° ° ° ° X ° ° X ° X ° ° ° ° ° DATENTABELLE 202 SC C T yp dr us cc rA aa cA -a ph D er m A er m C te tK te tM va tA va tB se a se b se c se d se e se g se h se i se j ts t lu kF Pl as m id Pl as m id ty p DIAKS-03-34 IV 11 2 ° ° X ° ° ° ° ° ° X ° ° X ° X ° ° ° K n.b. DIAKS-03-35 I 8 ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° DIAKS-03-36 I 11 1 ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° X ° X ° ° ° G pFL-35-1 ELKS-03-1 IV 11 2 ° X ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ELKS-03-2 IV 11 2 ° X ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° X ° X ° ° ° ° ° ELKS-03-3 IV 11 2 ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° G n.b. ELKS-03-4 IV 11 2 ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° X X X ° ° ° ° ° ELKS-03-5 IV 11 2 ° ° X ° ° ° ° ° ° X ° ° X X X ° ° ° G pFL-35-2 ELKS-03-6 neg 0 ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° X ° K n.b. ELKS-03-7 I 11 2 ° ° ° ° ° ° ° ° ° X ° ° X ° X ° ° ° K n.b. ELKS-03-8 IA/II 0 1 ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° B n.b. ELKS-03-9 IV 11 2 ° ° X ° ° ° ° ° ° X ° ° X ° X ° ° ° G n.b. ELKS-03-10 IV 11 2 ° X ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° X ° X ° ° ° B n.b. ELKS-03-11 IV 11 2 ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° X X X ° ° ° ° ° ELKS-03-12 IV 11 2 ° ° X ° ° ° ° ° ° X ° ° X X X ° ° ° G pFL-35-1 ELKS-03-13 IV 11 2 ° X ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° B n.b. ELKS-03-14 IV 11 2 ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° G n.b. ELKS-03-15 I 8 2 ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° X ° X ° ° ° ° ° ELKS-03-16 I 11 2 ° ° ° ° ° ° ° ° ° X ° ° X ° X ° ° ° G n.b. ELKS-03-17 IA/II 0 1 ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° B n.b. ELKS-03-18 IV 11 2 ° ° X ° ° ° ° ° ° X ° ° X ° X ° ° ° G pFL-35-2’ ELKS-03-19 I 8 2 ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° X ° X ° ° ° G n.b. ELKS-03-20 IV 11 2 ° X ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ELKS-03-21 IV 11 2 ° X ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° X ° X ° ° ° G pFL-35-1 ELKS-03-22 IV 11 2 ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° B n.b. ELKS-03-23 IV 11 2 ° ° X ° ° ° ° ° ° X ° ° X X X ° ° ° G pFL-35-2 ELKS-03-24 I 8 2 ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° X ° X ° ° ° G n.b. ELKS-03-25 I 11 2 ° ° ° ° ° ° ° ° ° X ° ° X ° X ° ° ° B n.b. ELKS-03-26 IA/II 0 1 ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ELKS-03-27 IV 11 2 ° ° X ° ° ° ° ° ° X ° ° X ° X ° ° ° G pFL-35-1 ELKS-03-28 IV 11 2 ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° X X X ° ° ° ° ° OKS-01-1 I 10 2 ° X ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° X ° X ° ° ° ° ° OKS-04-2 IV 11 2 ° ° X ° X ° ° ° ° X ° ° X ° X ° ° ° G n.b. BFKS-03-1 I 11 2 ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° BFKS-03-2 IV 11 2 ° ° X ° ° ° ° ° ° X ° ° X ° X ° ° ° G n.b. Externe EXT-01-1 IV 11 ° ° ° X ° ° ° ° ° ° X ° ° X ° X ° ° ° G n.b. EXT-01-2 IV 11 2 ° X X ° ° ° ° X ° X X ° ° ° ° X ° ° B n.b. EXT-01-3 IA 11 2 X X ° ° X ° ° ° X X ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° DATENTABELLE 203 SC C T yp dr us cc rA aa cA -a ph D er m A er m C te tK te tM va tA va tB se a se b se c se d se e se g se h se i se j ts t lu kF Pl as m id Pl as m id ty p EXT-01-4 IV 11 2 ° X X ° ° ° ° ° ° X ° ° X ° X ° ° ° G pFL-35-2’ EXT-02-5 IV 11 2 ° ° ° ° ° ° ° ° ° X ° ° X ° X ° ° ° ° ° EXT-02-6 neg 0 ° ° ° ° ° ° ° ° ° X ° ° ° X ° X ° ° ° ° ° EXT-03-7 IV 11 2 ° ° ° ° ° ° ° ° ° X ° ° X ° X ° ° ° K n.b. EXT-03-8 IV 11 2 ° ° X ° ° ° ° ° ° ° ° ° X ° X X ° ° G pFL-35-2 EXT-03-9 IV 11 2 ° ° X ° ° ° ° ° ° ° ° ° X ° X ° ° ° G n.b. EXT-03-10 NN 0 ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° EXT-03-11 IV 11 2 ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° K n.b. EXT-03-12 IV 11 2 ° ° ° ° ° ° ° ° ° X ° ° X ° X ° ° ° G n.b. EXT-03-13 IA/II 0 2 ° X ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° X ° X ° ° ° B n.b. EXT-03-14 IV 11 2 X ° X ° ° ° ° ° X ° ° ° ° ° ° ° X ° G pFL-35-1 EXT-03-15 IV 10 2 ° ° ° ° ° ° ° ° X ° ° ° ° ° ° ° ° ° G pFL-35-4 EXT-03-16 IA/II 0 2 ° X ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° X ° X X ° ° G n.b. EXT-03-17 IV 11 2 ° ° ° X ° ° ° ° ° ° ° ° X ° X ° ° ° B n.b. EXT-03-18 IV 11 2 ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° X ° X ° ° ° B n.b. EXT-03-19 IV 11 2 ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° X ° X ° ° ° ° ° EXT-03-20 IA 7 2 ° ° ° ° ° ° ° ° ° X ° ° X ° X ° X ° B n.b. EXT-03-21 IV 11 2 ° ° ° ° ° ° ° ° X ° ° ° X ° X ° ° ° ° ° EXT-03-22 IA/II 0 2 ° X ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° X ° X ° ° ° G pFL-35-2 EXT-03-24 IA/II 0 2 ° X ° ° ° ° ° ° ° ° X ° X ° X X ° ° K n.b. EXT-03-25 IV 11 2 ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° X ° X ° ° ° B n.b. EXT-03-26 IA/II 0 2 ° X ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° X ° X X ° ° G pFL-35-1 EXT-03-27 IV 11 2 ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° ° X ° ° ° ° G n.b. EXT-04-28 IV 11 2 ° X X ° X ° ° ° ° ° ° ° X ° X ° ° ° B n.b. EXT-04-29 IV 10 2 ° X X ° X ° ° ° ° X ° ° X ° X ° ° ° G pFL-35-1 EXT-04-30 IV 11 2 ° ° ° ° ° ° ° ° ° X ° ° X ° X ° ° ° ° ° EXT-04-31 IV 11 2 ° ° X ° X ° ° ° ° X ° ° X ° X ° ° ° G n.b. LITERATURVERZEICHNIS 204 Abb J. (2004) Frequency and diversity of molecular epidemiology of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) isolates from patients of a South West German teaching hospital. Journal of Hospital Infection 56: 232–235 Aboshkiwa M., Rowland G., Coleman G. (1995) Nucleotide sequence of the Staphylococcus aureus RNA polymerase rpoB gene and comparison of its predicted amino acid sequence with those of other bacteria. Biochimica et Biophysica Acta 1262: 73-78 Abramson M.A. u. Sexton D.J. (1999) Nosocomial methicillin-resistant and methicillin-susceptible Staphylococcus aureus primary bacteremia: at what costs? Infection Control and Hospital Epidemiology 20 (6): 408-411 Acar J.F. u. Goldstein F.W. (1997) Trends in bacterial resistance to fluoroquinolones. 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Alle Stellen, die wörtlich oder sinngemäß aus veröffentlichten oder unveröffentlichten Schriften entnommen sind, habe ich als solche kenntlich gemacht. Kein Teil dieser Arbeit ist in einem anderen Promotions- oder Habilitationsverfahren verwendet worden. Kassel, den Cornelia Janusch