Untersuchungen zum Vorkommen und molekularen Mechanismus der Biofilm-Bildung bei Enterokokken aus verschiedenen klinischen Bereichen INAUGURAL – DISSERTATION zur Erlangung des akademischen Grades eines Doktors der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.) im Fachbereich 18 – Naturwissenschaften der Universität Kassel vorgelegt von Susanne Schlüter aus Brilon Kassel, im Dezember 2008 Inhaltsverzeichnis I I Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung........................................................................................................................... 1 1.1 Charakteristika, medizinische Relevanz & Pathogenität von Enterokokken..................... 3 1.2 Virulenzfaktoren bei E. faecalis und E. faecium ................................................................... 6 1.2.1 Enterococcal surface protein (Esp) .............................................................................. 6 1.2.2 Aggregationssubstanzen .............................................................................................. 7 1.2.3 Cytolysin ....................................................................................................................... 8 1.2.4 Gelatinase und fsr Locus .............................................................................................. 9 1.2.5 Adhesin of collagen from E. faecalis (Ace)................................................................. 11 1.2.6 Weitere Virulenzfaktoren ............................................................................................ 12 1.3 Biofilm-Bildung bei E. faecalis und E. faecium................................................................... 14 1.3.1 Allgemeine Charakteristika von Biofilmen und Biofilm-Bildung .................................. 14 1.3.2 Weltweites Vorkommen und klinische Bedeutung der Biofilm-Bildung bei Enterokokken ........................................................................................................ 17 1.3.3 Biofilm-Bildung beeinflussende Faktoren ................................................................... 19 1.3.4 Molekulare Mechanismen der Biofilm-Bildung bei Enterokokken .............................. 20 1.4 Die Bakterielle Vaginose: das Enigma und die Biofilm-Bildung....................................... 31 1.4.1 Krankheitsbild der Bakteriellen Vaginose ................................................................... 31 1.4.2 Diagnose und Therapie .............................................................................................. 32 1.4.3 Ätiologie und Pathogenese der Bakteriellen Vaginose .............................................. 33 2 Ziele der Arbeit................................................................................................................ 36 3 Material und Methoden................................................................................................... 37 3.1 Geräte und Zubehör............................................................................................................... 37 3.2 Verbrauchsmaterial................................................................................................................ 38 3.3 Chemikalien ............................................................................................................................ 38 3.4 Nährmedien und Zusätze ...................................................................................................... 39 3.4.1 Fertignährmedien........................................................................................................ 39 3.4.2 Medien für spezielle Nachweise ................................................................................. 39 3.4.3 Zusätze und sonstige Materialien............................................................................... 40 3.5 Antibiotika............................................................................................................................... 40 3.6 Puffer und Lösungen............................................................................................................. 41 3.6.1 Elektrophoresen und Gel-Färbelösungen................................................................... 41 3.6.2 Gesamt-DNA-, Plasmid-DNA- und Gesamt-RNA-Isolierung...................................... 42 3.6.3 Sonstige Puffer und Lösungen ................................................................................... 43 3.7 Kits und sonstige kommerziell erhältliche Materialien...................................................... 44 3.8 Enzyme, PCR-Reagenzien und Primer................................................................................. 44 3.9 Bakterienstämme und Zellen ................................................................................................ 48 3.9.1 Kollektiv der Enterokokken-Isolate ............................................................................. 49 3.9.2 Herstellung der Biofilm-Mutantenstämme .................................................................. 50 Inhaltsverzeichnis II 3.10 Mikrobiologische Kultur- und Standardmethoden ............................................................. 51 3.10.1 Isolierung, Kultivierung und Stammhaltung der Stämme ........................................... 51 3.10.2 Biochemische Identifizierung...................................................................................... 51 3.10.3 Antibiotikaresistenzbestimmungen ............................................................................. 52 3.10.4 Verwertung verschiedener Substrate ......................................................................... 52 3.10.5 Wachstumsverhalten .................................................................................................. 53 3.11 Methoden zum phänotypischen Nachweis von Virulenzfaktoren & Biofilm-Bildung ..... 53 3.11.1 Gelatinase-Produktion ................................................................................................ 53 3.11.2 β-Hämolyse................................................................................................................. 53 3.11.3 Verklumpung............................................................................................................... 53 3.11.4 DNase-, Lipase- und H2O2-Produktion ....................................................................... 54 3.11.5 Bacteriocin-Bildung..................................................................................................... 54 3.11.6 Biofilm-Bildung............................................................................................................ 55 3.11.7 Primäre Anheftung an abiotische Oberflächen........................................................... 55 3.11.8 Hydrophobizität der Zelloberfläche............................................................................. 56 3.11.9 Adhärenz an HeLa-Zellen........................................................................................... 56 3.12 Molekularbiologische Methoden .......................................................................................... 57 3.12.1 Präparation der Gesamt-DNA zum Einsatz in die PCR ............................................. 57 3.12.2 Gesamt-DNA-Extraktion ............................................................................................. 57 3.12.3 Präparation von Plasmid-DNA.................................................................................... 58 3.12.4 Restriktion von Plasmid-DNA ..................................................................................... 58 3.12.5 Photometrische Konzentrationsbestimmung von DNA .............................................. 59 3.12.6 Nachweis spezifischer Gen-Abschnitte mittels PCR .................................................. 59 3.12.7 Methoden zur Typisierung von Bakterienstämmen .................................................... 65 3.12.8 Agarose-Gelelektrophorese zum Nachweis von DNA................................................ 68 3.12.9 DNA-Sequenzierung................................................................................................... 69 3.12.10 Gesamt-RNA-Extraktion ............................................................................................. 69 3.12.11 Photometrische Konzentrationsbestimmung von RNA .............................................. 70 3.12.12 Formamid-Gelelektrophorese zum Nachweis von RNA............................................. 70 3.12.13 RT-PCR ...................................................................................................................... 70 3.13 Proteinbiochemische Methoden........................................................................................... 71 3.13.1 Extraktion von Zellwand-assoziierten Proteinen......................................................... 71 3.13.2 Konzentrationsbestimmung von Proteinen................................................................. 72 3.13.3 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese ...................................................................... 72 3.13.4 Identifizierung von Proteinen mittels Massenspektrometrie ....................................... 73 3.14 Mikroskopie ............................................................................................................................ 74 3.14.1 Rasterelektronen-Mikroskopie .................................................................................... 74 3.14.2 Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie ..................................................................... 75 3.15 Statistische Auswertung und sonstige verwendete Computer-Software ........................ 76 Inhaltsverzeichnis III 4 Ergebnisse....................................................................................................................... 77 4.1 E. faecalis isoliert aus verschiedenem klinischen Material............................................... 77 4.1.1 Phänotypischer und genotypischer Nachweis von Virulenzfaktoren.......................... 77 4.1.2 Vorkommen von Biofilm-Bildung ................................................................................ 79 4.1.3 Zusammenhang von Biofilm-Bildung mit bestimmten Virulenzfaktoren ..................... 80 4.2 E. faecium isoliert aus verschiedenem klinischen Material .............................................. 84 4.3 E. faecalis isoliert von Patientinnen mit dem Krankheitsbild Bakterielle Vaginose ....... 85 4.3.1 Phänotypischer und genotypischer Nachweis von Virulenzfaktoren.......................... 85 4.3.2 Vorkommen von Biofilm-Bildung ................................................................................ 86 4.3.3 Zusammenhang von Biofilm-Bildung mit bestimmten Virulenzfaktoren ..................... 88 4.4 Vergleich der E. faecalis Stämme aus Vaginalabstrichen mit Isolaten anderer klinischer Herkunft ............................................................................. 92 4.5 Charakterisierung von E. faecalis Biofilm-Mutantenstämmen.......................................... 95 4.5.1 Herstellung und Typisierung von E. faecalis Biofilm-Mutantenstämmen ................... 95 4.5.2 Charakterisierung der E. faecalis Biofilm-Mutantenstämme ...................................... 98 5 Diskussion..................................................................................................................... 115 5.1 E. faecalis isoliert aus verschiedenem klinischen Material............................................. 115 5.1.1 Phänotypischer und genotypischer Nachweis von Virulenzfaktoren........................ 115 5.1.2 Biofilm-Bildung und Zusammenhang mit bestimmten Virulenzfaktoren................... 118 5.2 E. faecium isoliert aus verschiedenem klinischen Material ............................................ 121 5.3 E. faecalis isoliert von Patientinnen mit dem Krankheitsbild Bakterielle Vaginose ..... 123 5.3.1 Phänotypischer und genotypischer Nachweis von Virulenzfaktoren........................ 123 5.3.2 Biofilm-Bildung und Zusammenhang mit bestimmten Virulenzfaktoren................... 124 5.4 Vergleich der E. faecalis Stämme aus Vaginalabstrichen mit Isolaten anderer klinischer Herkunft ........................................................................... 126 5.5 Charakterisierung von E. faecalis Biofilm-Mutantenstämmen........................................ 127 5.5.1 Untersuchung der E. faecalis Stämme 1.3 und 1.3.7............................................... 128 5.5.2 Untersuchung der E. faecalis Stämme 1.10 und 1.10.16......................................... 131 5.5.3 Untersuchung der E. faecalis Stämme 2.11 und 2.11.8........................................... 135 6 Zusammenfassung ....................................................................................................... 138 7 Ausblick ......................................................................................................................... 140 8 Literaturverzeichnis...................................................................................................... 141 9 Anhang........................................................................................................................... 153 Abkürzungsverzeichnis IV II Abkürzungsverzeichnis °C Grad Celsius µ… Mikro… 16S rDNA ribosomale DNA der kleinen Untereinheit (16S) A. bidest Aqua bidestillata aacA-aphD Gen für Aminoglykosid-Resistenz mittels AAC(6’)-APH(2’’) Ab Antibiotikum Abb. Abbildung Abs/r Sensitivität/Resistenz gegenüber Antibiotikum amu atomic mass unit AMV Avian Myeloblastosis Virus AP-PCR arbitrarily primed PCR AS Aminosäure oder Aggregationssubstanz ATCC American Type Culture Collection ATP Adenosintriphosphat Bap Biofilm associated protein von Staphylococcus aureus bee Gen-Cluster, biofilm enhancer in Enterococcus BF Biofilm BHI Brain Heart Infusion bp Basenpaare BSA bovine serum albumin BV Bakterielle Vaginose ca. circa cDNA complementary DNA CFU Colony Forming Unit CLSM Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie CRBSI intravascular-catheter-related bloodstream infection DEPC Diethylpyrocarbonat DNA desoxyribonucleic acid, Desoxyribonukleinsäure DNase Deoxyribonuklease dNTP Desoxy-Nukleosid-5'-Triphosphat DSMZ Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen E Extinktion E. Enterococcus ECM extrazelluläre Matrix; extracellular matrix EDTA Ethylendiamintetraessigsäure EMS enhanced mass spectrometry (full scan) ermB Gen für erythromycin resistance methylase B esp Gen für das Enterococcal surface protein Esp espfm Gen für das Enterococcal surface protein Esp bei E. faecium et al. et alii EtBr Ethidiumbromid EtOH Ethanol Abkürzungsverzeichnis V FA Formamid for forward (Primer) fsr QS-kontrollierter Genlocus fsr (E. faecalis regulator) G. Gardnerella g Erdbeschleunigung (9,81 m/s²) g Gramm GelE-/+ Gelatinase-positiv/negativ GBAP gelatinase biosynthesis-activating pheromone h hour / hours, Stunde / Stunden HIV Humanes Immundefizienz-Virus HLR high level resistance HMW high molecular weight kb Kilobasen kDa Kilodalton l Liter L. Lactobacillus log logarithmisch Lsg. Lösung LTA lipoteichoic acid M Marker M Molarität m... milli... min Minute / Minuten MG Molekulargewicht MLST Multilocus Sequence Typing MLVA Multilocus Variable-Number Tandem-Repeat Analysis MO Mikroorganismus / Mikroorganismen MOPS 3-Morpholinopropansulfonsäure NCCLS National Commitee on Clinical Laboratory Standards nm Nanometer oc open circular (Plasmide) OD595 optische Dichte bei 595 nm orf open reading frame p.a. per analysis PA Polyacrylamid PAGE Polyacrylamidgelelektrophorese PAI Pathogenitätsinsel PBP Penicillin-bindendes-Protein PBS phosphate buffered saline PCR polymerase chain reaction, Polymerasekettenreaktion PFGE Pulsed Field Gel Electrophoresis, Pulsfeldgelelektrophorese PID Pelvic Inflammatory Disease PMN polymorphonukleare Leukozyten PMSF Phenyl-Methyl-Sulfonyl-Fluorid Abkürzungsverzeichnis VI PS Polystyrol PUM phosphate urea magnesium (Puffer) QS Quorum Sensing RAPD random amplified polymorphic DNA REM Rasterelektronen-Mikroskopie rep-PCR PCR basierend auf repetitiven Genom-Sequenzen rev revers (Primer) RKI Robert Koch Institut RNA Ribonucleicacid, Ribonukleinsäure RNase Ribonuklease rpm rotations per minute RT Raumtemperatur RT Reverse Transkription s Sekunde S. Staphylococcus SDS sodium dodecyl sulfate Tab. Tabelle TAE Tris acetate acid EDTA Taq Thermus aquaticus TBE Tris boric acid EDTA TEM Transmissionselektronen-Mikroskopie TEMED N,N,N',N'-Tetramethylethan-1,2-diamin tetK Gen für Tetracyclin-Resistenz über aktiven Efflux tetM Gen für Tetracyclin-Resistenz über Targetveränderung THB Todd Hewitt Broth TMB Tetramethylbenzidin Tn Transposon Tris Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan TSB Trypton-Soja-Bouillon (Trypticase Soy Broth) TSBG Trypton-Soja-Bouillon + 1% Glucose U Unit (Einheit Enzyme) ÜN über Nacht UPGMA Unweighted Pair Group Method with Arithmetic mean UTI urinary tract infection, Harnwegsinfektion VF Virulenzfaktor / -faktoren V Volt VNTR Variable-Number Tandem-Repeat VRE Vancomycin-resistente Enterokokken vs versus v/v volume / volume VT Volumenteile w/v weight / volume wt Wildtyp Z Zentralwert (Median) Abbildungsverzeichnis VII III Abbildungsverzeichnis Abb. 1 Strukturelle Ähnlichkeit des Esp-Proteins von E. faecalis mit dem Bap-Protein von S. aureus ......................................................................................... 6 Abb. 2 Modell zum Mechanismus der fsr Aktivierung ....................................................................... 10 Abb. 3 Dynamische Struktur eines Biofilms (schematisch)............................................................... 16 Abb. 4 Struktureller Aufbau des bee Operons von E. faecalis (schematisch) .................................. 25 Abb. 5 Struktureller Aufbau des ebp Operons von E. faecalis (schematisch) .................................. 27 Abb. 6 Zusammenhang zwischen Biofilm-Bildung und dem Vorkommen des esp Gens bei E. faecalis verschiedener klinischer Herkunft........................................... 81 Abb. 7 Zusammenhang zwischen Biofilm-Bildung und dem Vorkommen der Gelatinase-Produktion bei E. faecalis verschiedener klinischer Herkunft ....................... 81 Abb. 8 Zusammenhang zwischen Biofilm-Bildung und dem Vorkommen des asa1 Gens bei E. faecalis verschiedener klinischer Herkunft......................................... 82 Abb. 9 Zusammenhang zwischen Biofilm-Bildung und dem Vorkommen von esp und/oder der Gelatinase-Produktion bei E. faecalis verschiedener klinischer Herkunft ....................... 83 Abb. 10 Zusammenhang zwischen Biofilm-Bildung und dem Vorkommen von esp und/oder asa1 bei E. faecalis verschiedener klinischer Herkunft .......................................... 83 Abb. 11 Zusammenhang zwischen Biofilm-Bildung und dem Vorkommen des esp Gens bei E. faecalis aus Vaginalabstrichen............................................................. 88 Abb. 12 Zusammenhang zwischen Biofilm-Bildung und dem Vorkommen von Gelatinase-Produktion bei E. faecalis aus Vaginalabstrichen ........................................ 89 Abb. 13 Zusammenhang zwischen Biofilm-Bildung und dem Vor-kommen des asa1 Gens bei E. faecalis aus Vaginalabstrichen........................................................... 89 Abb. 14 Zusammenhang zwischen Biofilm-Bildung und dem Vorkommen von esp und/oder GelE bei E. faecalis aus Vaginalabstrichen .............................................. 90 Abb. 15 Zusammenhang zwischen Biofilm-Bildung und dem Vorkommen von esp und/oder asa1 bei E. faecalis aus Vaginalabstrichen .............................................. 91 Abb. 16 Vergleich der Inzidenzen bestimmter Virulenzfaktoren bei E. faecalis Stämmen unterschiedlicher Herkunft ............................................................. 92 Abb. 17 Vergleich bzgl. der Biofilm-Bildungsfähigkeit der untersuchten E. faecalis Stämme verschiedener Herkunft.......................................................................... 93 Abb. 18 Dendrogramm zur Typisierung der E. faecalis Wildtyp- und BF-Mutantenstämme mittels PFGE ....................................................................................... 96 Abb. 19 Biofilm-Assay der Wildtyp- und BF-Mutantenstämme ........................................................... 97 Abb. 20 Wachstumscharakteristik der E. faecalis Wildtyp- und BF-Mutantenstämme ....................... 97 Abb. 21 CLSM der Stämme 1.3 und 1.3.7 .......................................................................................... 98 Abb. 22 CLSM der Stämme 1.10 und 1.10.16 .................................................................................... 99 Abb. 23 CLSM der Stämme 2.11 und 2.11.8 ...................................................................................... 99 Abb. 24 REM der Stämme 1.3 (a) und 1.3.7 (b)................................................................................ 100 Abb. 25 REM der Stämme 1.10 (a,b) und 1.10.16 (c,d).................................................................... 101 Abb. 26 REM der Stämme 2.11 (a,b,c,d) und 2.11.8 (e,f)................................................................. 102 Abb. 27 Dendrogramm der Ergebnisse des API®50 CH von Wildtyp- und BF-Mutantenstämmen .. 103 Abb. 28 Primäre Anheftung an abiotische Oberflächen bei Wildtyp- und Biofilm-Mutantenstämmen ............................................................................................ 105 Abbildungsverzeichnis VIII Abb. 29 Hydrophobizität der Zelloberflächen von Wildtyp- und Biofilm-Mutantenstämmen ............. 106 Abb. 30 Nachweis von Plasmiden der E. faecalis Wildtyp- und Biofilm-Mutantenstämmen............. 107 Abb. 31 Proteinexpressionsmuster der E. faecalis Wildtyp- und Biofilm-Mutantenstämme ............. 108 Abb. 32 RT-PCR-Analysen von Bereichen des bee Locus der Stämme 1.10 und 1.10.16.............. 112 Abb. 33 Untersuchte Abschnitte des bee Locus der E. faecalis Stämme 1.10 und 1.10.16 mittels PCR und RT-PCR (schematisch)............................................................................. 113 Abb. 34 Vergleich der abgeleiteten Aminosäuresequenzen eines Teilbereichs der Sortase-1 des bee Locus der E. faecalis Stämme 1.10, 1.10.16 und E99.................... 114 Abb. 35 Alignment der Sequenzen verschiedener Pili-Proteine: Vergleich und Identifizierung konservierter Motive bei den Proteinen Bee-1, Bee-2 und Bee-3 ....................................... 132 Abb. 36 Wachstumskurven der E. faecalis Wildtyp- und Biofilm-Mutantenstämme ......................... 167 Abb. 37 Dendrogramm der BOXA2R-PCR zur Typisierung der E. faecalis Wildtyp- und Biofilm-Mutanten ........................................................................................................... 167 Abb. 38 Dendrogramm (schematisches Cluster) der PFGE-Fingerprintmuster zur Typisierung der E. faecalis Wildtyp- und Biofilm-Mutantenstämme .................................... 168 Abb. 39 Modell der Biogenese von Pili (Mandlik et al., 2008)........................................................... 168 Abb. 40 Vergleich der DNA-Sequenzen eines Teilbereichs der Sortase-1 des bee Locus der E. faecalis Stämme 1.10, 1.10.16 und E99 ................................................................... 169 Tabellenverzeichnis IX IV Tabellenverzeichnis Tab. 1 Ergebnisse verschiedener Studien zum Vorkommen der Biofilm-Bildung bei Enterokokken in unterschiedlichen Ländern und Kontinenten der Welt .......................... 17 Tab. 2 Derzeit bekannte genetische Determinanten, die an der Biofilm-Bildung bei E. faecalis beteiligt sind.................................................................................................... 21 Tab. 3 Score-System nach Nugent et al. (1991) zur Bewertung Gram-gefärbter Vaginalsekrete.... 33 Tab. 4 Verwendete Antibiotika .......................................................................................................... 40 Tab. 5 Verwendete Antibiotikatestblättchen...................................................................................... 40 Tab. 6 Verwendete Primer ................................................................................................................ 45 Tab. 7 Verwendete Primer (Fortsetzung).......................................................................................... 46 Tab. 8 Verwendete Primer (Fortsetzung).......................................................................................... 47 Tab. 9 Verwendete Bakterienstämme und Zellen............................................................................. 48 Tab. 10 Übersicht zu Anzahl und Herkunft untersuchter Enterokokken-Isolate ................................. 49 Tab. 11 Ergebnisse der Nachweise von Virulenzfaktoren bei E. faecalis verschiedener klinischer Herkunft.......................................................................................... 78 Tab. 12 Vorkommen von Biofilm-Bildung bei E. faecalis verschiedener klinischer Herkunft.............. 80 Tab. 13 Ergebnisse der Nachweise von Virulenzfaktoren bei E. faecalis aus Vaginalabstrichen...... 86 Tab. 14 Vorkommen von Biofilm-Bildung bei E. faecalis aus Vaginalabstrichen................................ 87 Tab. 15 Vergleich des Vorkommens von Bioflm-Bildung bei den untersuchten E. faecalis Stämmen verschiedener Herkunft........................................................................ 94 Tab. 16 Phänotypische und genotypische Nachweise verschiedener Virulenzfaktoren bei den E. faecalis Wildtyp- und BF-Mutantenstämmen...................................................... 104 Tab. 17 Mittels Massenspektrometrie identifizierte, differentiell exprimierte Proteine der E. faecalis Wildtyp- und Biofilm-Mutantenstämme ........................................................ 110 Tab. 18 Mittels Massenspektrometrie identifizierte, differentiell exprimierte Proteine der E. faecalis Wildtyp- und Biofilm-Mutantenstämme (Fortsetzung).................................. 111 Tab. 19 Vorkommen von Biofilm-Bildung bei E. faecalis Stämmen aus verschiedenem Material ... 119 Tab. 20 Daten E. faecalis Isolate aus verschiedenem klinischen Material – Virulenzfaktoren......... 153 Tab. 21 Daten E. faecalis Isolate aus verschiedenem klinischen Material – VF (Fortsetzung)........ 154 Tab. 22 Daten E. faecalis Isolate aus verschiedenem klinischen Material – VF (Fortsetzung)........ 155 Tab. 23 Zusätzliche Daten E. faecalis Isolate aus verschiedenem klinischen Material – Antibiogramme und Antibiotikaresistenzgen-Nachweise..................................................... 156 Tab. 24 Zusätzliche Daten E. faecalis Isolate aus verschiedenem klinischen Material – Antibiogramme und Antibiotikaresistenzgen-Nachweise (Fortsetzung) .............................. 157 Tab. 25 Zusätzliche Daten E. faecalis Isolate aus verschiedenem klinischen Material – Antibiogramme und Antibiotikaresistenzgen-Nachweise (Fortsetzung) .............................. 158 Tab. 26 Daten E. faecium aus verschiedenem klinischen Material – Virulenzfaktoren .................... 159 Tab. 27 Daten E. faecium aus verschiedenem klinischen Material – VF (Fortsetzung) ................... 160 Tab. 28 Zusätzliche Daten E. faecium Isolate aus verschiedenem klinischen Material – Antibiogramme und Antibiotikaresistenzgen-Nachweise..................................................... 161 Tab. 29 Zusätzliche Daten E. faecium Isolate aus verschiedenem klinischen Material – Antibiogramme und Antibiotikaresistenzgen-Nachweise (Fortsetzung) .............................. 162 Tab. 30 Daten E. faecalis Isolate aus Vaginalabstrichen - BV positiv .............................................. 163 Tab. 31 Zusätzliche Daten E. faecalis Isolate aus Vaginalabstrichen – BV positiv .......................... 164 Tab. 32 Daten E. faecalis aus Vaginalabstrichen – BV negativ........................................................ 165 Tab. 33 Zusätzliche Daten zu den E. faecalis Isolaten aus Vaginalabstrichen – BV negativ........... 166 Einleitung 1 1 Einleitung Enterokokken sind kommensale Besiedler des Intestinaltrakts sowie des weiblichen Genitaltrakts von Menschen und verschiedenen Tieren. Andererseits gehören die beiden häufig vorkommenden Spezies dieser Gattung Enterococcus (E.) faecalis und E. faecium zu den bedeutsamsten humanpathogenen Erregern verschiedener, mitunter lebensbedrohlicher Infektionen. Bei der Behandlung der von Enterokokken verursachten, v.a. nosokomialen Infektionen stellen sich insbesondere die hohe Anpassungsfähigkeit an die jeweilige Umwelt und zunehmende Antibiotikaresistenzen dieser opportunistisch pathogenen Bakterien als problematisch dar. Untersuchungen zu der Kommensale-Pathogen-Dynamik dieser Erreger haben bisher einige bakterien- und wirtsspezifische Faktoren identifiziert, die zur Entstehung und Entwicklung enterokokkaler Infektionen beitragen, der genaue Mechanismus der Pathogenese dieser Erkrankungen ist allerdings weitgehend unbekannt (Gilmore et al., 2002; Baldassarri et al., 2005). Eine Eigenschaft der Enterokokken sowie anderer Infektionserreger, die in den letzten Jahren immer stärker in den Fokus der Untersuchungen zur Virulenz getreten ist, ist die Fähigkeit dieser Bakterien zur Biofilm-Bildung. Ein Biofilm ist eine sessile Gemeinschaft von Mikroorganismen, die charakterisiert ist durch die Anheftung an ein bestimmtes Substrat, eine Grenzfläche oder aneinander sowie die Einbettung in eine von den Mikroorganismen produzierten Matrix aus extrazellulären, polymeren Substanzen (EPS). Die in einem Biofilm formierten Zellen zeigen einen veränderten Phänotyp bzgl. der Wachstumsrate und Gentranskription (Donlan & Costerton, 2002). Wissenschaftlichen Schätzungen zufolge sind bei ca. 60 % aller mikrobiellen Infektionen Biofilme involviert. Vorteile für die Mikroorganismen in der Ausbildung eines Biofilms umfassen u.a. den Schutz gegenüber spezifischer Wirtsabwehr und Antibiotika sowie eine erhöhte Verfügbarkeit von Nährstoffen aufgrund der Möglichkeit zur Besiedlung nährstoffreicher Habitate (Jefferson, 2004). Die Bakterielle Vaginose (BV) ist die häufigste mikrobielle Störung (Dysbiose) des Vaginalmilieus der geschlechtsreifen Frau und u.a. charakterisiert durch eine Konzentrationsverschiebung der Normalflora zu einem breiten Spektrum von verschiedenen, anaeroben Keimen. Die eindeutige Krankheitsursache und –entstehung ist bis heute noch ungeklärt und aktueller Gegenstand intensiver medizinischer Forschung. Die Hypothese der polymikrobiellen Störung steht dabei der Annahme gegenüber, dass Gardnerella vaginalis der spezifische ätiologische Keim dieser Erkrankung ist. Neuste vaginalmikrobiologische Untersuchungen implizieren auch hier, dass Biofilme eine Rolle während dieser oft rezidivierenden Erkrankung spielen (Swidsinski et al., 2005). Enterokokken werden als natürliche Flora der Vagina angesehen, dennoch bestehen Anhaltspunkte auf eine mögliche Beteiligung dieser Bakteriengattung an der Entstehung der Bakteriellen Vaginose (Kelly et al., 2003). Der Untersuchung der Inzidenz von Virulenzfaktoren und Biofilm-Bildung bei Einleitung 2 vaginalen Enterokokken-Stämmen wurde bislang wenig Bedeutung beigemessen, so dass kaum Daten vorliegen und mögliche Zusammenhänge nicht erfasst werden konnten. Die Therapie einer BV wie auch von anderen Infektionen, bei denen Biofilme beteiligt sind, wird offenbar dadurch erschwert, dass in einem Biofilm organisierte Bakterien eine erhöhte Resistenz insbesondere gegenüber Antibiotika aufweisen (Swidsinski et al., 2008). Daher wäre die Entwicklung neuer therapeutischer Wirkstoffe wichtig, die die Biofilm-Bildung der Infektionserreger hemmen und als Alternative oder Ergänzung zur Antibiotikagabe eingesetzt werden könnten. Hierzu sind Kenntnisse über die molekularen Mechanismen der Biofilm- Bildung dieser Erreger eine unabdingbare Voraussetzung, um neue Angriffspunkte spezieller Wirkstoffe abzuleiten. Die Erforschung der Biofilm-Bildung und deren molekularer Mechanismen bei Enterokokken ist erst Ende der 90er Jahre in den Blickpunkt der Wissenschaft gerückt. Die Prävalenz variiert weltweit, allerdings scheinen bisherigen Untersuchungen zufolge insgesamt betrachtet E. faecalis Stämme eine höhere Fähigkeit zur Biofilm-Bildung aufzuweisen als E. faecium Isolate (Mohamed & Huang, 2007). Mit Hilfe von verschiedensten molekularbiologischen Methoden sind in jüngster Zeit mehrere genetische Determinanten entdeckt worden, die die Biofilm-Bildung bei Enterokokken beeinflussen, wodurch erkennbar wurde, dass es sich hierbei scheinbar um einen multifaktoriellen Prozess handelt. Zu den ersten beschriebenen Faktoren bei E. faecalis gehört das insbesondere von Toledo-Arana et al. (2001) und Tendolkar et al. (2004, 2006) untersuchte Entercoccal surface protein (Esp). Diese sowie mehrere andere Studien haben den Einfluss dieses Oberflächenproteins auf die Biofilm-Bildung bei E. faecalis und kürzlich auch bei E. faecium gezeigt (Van Wamel et al., 2007). Dennoch scheinen Esp-unabhängige Mechanismen der Biofilm-Bildung zu existieren (Kristich et al., 2004; Mohamed et al., 2004; Di Rosa et al., 2006). Auch wurde gezeigt, dass das Quorum Sensing-kontrollierte, Zwei-Komponenten-Signaltransduktions- system fsr (Mohamed et al., 2004, 2006; Pillai et al., 2004; Hancock & Perego, 2004) sowie die davon positiv regulierte Zinkmetalloprotease Gelatinase (Kristich et al., 2004; Mohamed et al., 2004; Hancock & Perego, 2004) die Biofilm-Bildung bei E. faecalis beeinflussen. Die Beschreibung zusätzlicher Faktoren, z.B. von Pili (Nallapareddy et al., 2006), den durch den bee Locus codierten, putativen Zellwandproteinen (Tendolkar et al., 2006) oder bestimmten Transkriptionsregulatoren (Hufnagel et al., 2004; Bourgogne et al., 2007) verdeutlichen die Komplexität dieses Vorgangs, der bis heute noch nicht vollkommen aufgeklärt ist. Hierzu sind weiterführende Untersuchungen erforderlich, insbesondere zur Erforschung der Rolle der bereits bekannten genetischen und umweltbedingten Faktoren auf die Regulation der Biofilm-Bildung sowie zur Identifizierung neuer einflussnehmender Determinanten. Einleitung 3 1.1 Charakteristika, medizinische Relevanz & Pathogenität von Enterokokken Enterokokken sind Gram-positive, fakultativ anaerobe Bakterien, die als Kokken einzeln, in Paaren oder kurze Ketten auftreten und den Intestinaltrakt des Menschen und verschiedener Tiere besiedeln. Sie wurden früher zu den Streptokokken gezählt, nach heutiger Systematik werden sie nunmehr aufgrund biochemischer und vor allem basierend auf modernsten molekularbiologischen Methoden in der eigenen Gattung Enterococcus und der Familie Enterococcaceae innerhalb der Ordnung der Lactobacillales (Milchsäurebakterien) zusammengefasst. Allgemeine Eigenschaften zur Charakterisierung von Enterokokken sind das Wachstum bei 10°C und 45°C, das Wachstum bei einem pH-Wert von bis zu 9,6 und in Anwesenheit von 6,5 % NaCl, das Überleben einer thermischen Behandlung bei 60°C für 30 min sowie das Wachstum in Anwesenheit von 40 % Galle. Des Weiteren besitzen alle Spezies das spezifische Antigen der Lancefield-Gruppe D (Lipoteichonsäure) auf ihrer Oberfläche und sind, bis auf wenige Ausnahmen, in der Lage Pyrrolidonyl-β-naphthylamid zu hydrolysieren (Nachweis von PYRase). Sie besitzen keine Oxidase- oder Katalase-Aktivität aufgrund fehlender Cytochrome. Wenige Spezies, z.B. E. gallinarum und E. casseliflavus, sind motil, auch kommt Pigmentierung vor (E. casseliflavus, E. mundtii u.a.). Bedeutsames Merkmal dieser Gattung ist außerdem die Fähigkeit zur Hydrolyse von Äskulin (Facklam et al., 2002). Das Hauptreservoir von Enterokokken ist der Magen- und Darmtrakt höherer Wirbeltiere sowie des Menschen. Weiterhin sind sie physiologische Kommensalen des weiblichen Genitaltrakts. Enterokokken sind Bestandteil der Intestinalflora vieler Vogelarten, inklusive Nutzgeflügel, sowie von Reptilien und Insekten und können ebenso im Boden, auf Pflanzen und in Gewässern gefunden werden. Manche Spezies dieser Gattung sind hauptsächlich mit einem bestimmten Habitat assoziiert, während die Arten E. faecalis und E. faecium weit verbreitet sind (Aarestrup et al., 2002). Enterokokken sind natürlich resistent gegenüber allen Cephalosporinen, semisynthetischen β-Laktamen (Isoxazolylpenicilline), Monobactamen und Polymyxinen. Gegen Aminoglycoside besteht eine Resistenz auf niedrigem Niveau (low-level), begründet durch die verminderte Aufnahme der Antibiotika in die Zelle sowie bei einzelnen Spezies durch die Produktion einer Acetyltransferase vom AAC(6´)-I Typ. E. faecalis ist außerdem unempfindlich gegenüber Lincosamiden und Streptograminen aufgrund des Besitzes eines natürlichen ABC- Transporters. Die Spezies E. gallinarum, E. casseliflavus und E. flavescens sind intrinsisch resistent gegen Vancomycin (low-level: 2–32 µg/ml). Diese chromosomal codierte Resistenz wird als VanC-Phänotyp bezeichnet und wird vermittelt durch die Produktion einer Ligase, die die Bildung eines D-Alanyl-D-Serin-Dipeptids katalysiert. Während der Biosynthese des Peptidoglycans ergibt der Einbau dieses Zellwandbestandteils eine modifizierte Einleitung 4 Aminosäuren-Seitenkette, was das Bindungsvermögen von Vancomycin an diesen Angriffspunkt reduziert (Cetinkaya et al., 2000; Facklam et al., 2002; Klare et al., 2003). Von den derzeit mehr als 30 beschriebenen Spezies haben lediglich E. faecalis und E. faecium größere medizinische Bedeutung erlangt. Mit einer Häufigkeit von ca. 12 % stellen sie die zweit- bis drittwichtigste Bakteriengattung bei nosokomialen Infektionen dar (Facklam et al., 2002; Klare et al., 2003). E. faecalis ist für 80-90 % aller von Enterokokken verursachten Infektionen beim Menschen verantwortlich (Jones et al., 2004), wobei die Anteile regional und zwischen einzelnen Krankenhäusern deutlich zugunsten von E. faecium verschoben sein können (Treitman et al., 2005). Für gewöhnlich wird Enterokokken keine vergleichbar hohe Virulenz zugeschrieben wie anderen Gram-positiven Bakterien, z.B. Staphylococcus (S.) aureus, Pneumokokken oder Streptokokken der Gruppe A. In der Regel verursachen sie Infektionen bei entsprechender Prädisposition wie z.B. einer Immunschwäche des Patienten. Ausgewählte Stämme werden sogar bei der Herstellung von Lebensmitteln und als Probiotika therapeutisch eingesetzt. Einige Virulenzfaktoren sind jedoch auch bei Enterokokken beschrieben, obwohl deren Relevanz bzgl. der Pathogenese bestimmter Krankheiten häufig nicht klar ist (Koch et al., 2004). Typische von Enterokokken verursachte Infektionen sind komplizierte bzw. nosokomiale Harnwegsinfektionen (meist E. faecalis), Endokarditiden (meist E. faecalis) und Bakteriämien/Sepsen. Außerdem ist eine Beteiligung von E. faecium und E. faecalis an polymikrobiellen Wundinfektionen, Peritonitiden und Infektionen der oberen Atemwege möglich, wobei bislang unklar ist, welchen Anteil sie dabei als Infektionserreger oder vielmehr als begleitende Flora spielen (Malami et al., 2002). Gründe für die zunehmende Bedeutung dieser opportunistisch pathogenen Bakterien als nosokomiale Infektionserreger sind höchstwahrscheinlich auf mehrere Faktoren und deren Interaktion zurückzuführen (Malami et al., 2002; Mascini & Bonten, 2005). Ein wichtiger Risikofaktor ist der durch Cephalosporingabe ausgelöste Selektionsdruck aufgrund der intrinsischen Resistenz dieser Infektionserreger gegen Cephalosporine. Neben dem breiten Spektrum an natürlichen Antibiotikaresistenzen sind Enterokokken außerdem zum Erwerb weiterer Resistenzen in der Lage, beispielsweise gegen Tetrazykline, Makrolide oder Aminoglycoside (high-level). Die zunehmend auftretenden erworbenen Resistenzen gegenüber Glycopeptiden und Ampicillin sind besonders problematisch, und auch gegen die zwei neuartigen, bakteriostatisch wirkenden Antibiotika Quinupristin-Dalfopristin und Linezolid wurden bereits Resistenzen beschrieben (Bonten et al., 2001). Dadurch wird das therapeutische Spektrum insbesondere bei häufig multiresistenten E. faecium und Vancomycin-resistenten Enterokokken (VRE) erheblich eingeschränkt (Werner et al., 2007). Einleitung 5 Der Vorgang, wie Enterokokken vom „harmlosen Kommensalen“ zum lebensbedrohenden Pathogen werden, ist bisher kaum verstanden. Es wird angenommen, dass sie durch die Entwicklung von Fähigkeiten zur Besiedlung neuer Nischen und/oder durch das Ausnutzen eines geschwächten Immunsystems zur Translokation vom Intestinaltrakt in den Blutstrom des Wirtsorganismus in der Lage sind. Weitere Infektionsquellen stellen intravenöse, Urin- oder Gallen-Katheter dar sowie der Urinaltrakt, operative Wunden oder die Mundhöhle. Außerdem können Enterokokken über Hände von Krankenhauspersonal, klinische Instrumente oder von Patient zu Patient übertragen werden (Gilmore et al., 2002). Die genetische Plastizität, somit ihre schnelle Anpassungs- und Überlebensfähigkeit unter extremen Bedingungen sowie das Potenzial zur Weitergabe von Resistenz- und Virulenzdeterminanten an andere pathogene Mikroorganismen zeigt die Wichtigkeit der Forschung nach alternativen Vorsorge- und Behandlungsmöglichkeiten, z.B. die Entwicklung von Impfstoffen basierend auf bestimmten Oberflächenantigenen der Enterokokkenzelle wie Kapselpolysacchariden oder anderen Virulenzfaktoren (Koch et al., 2004). Die Pathogenese der von Enterokokken verursachten Infektionen ist bislang nur ansatzweise aufgeklärt, allerdings wird hierbei die Biofilm-Bildung bei Enterokokken, ebenso wie bei Staphylokokken (insbesondere S. aureus und S. epidermidis), Pseudomonas aeruginosa und anderen Gram-negativen Erregern, immer mehr als ein weiteres, wichtiges virulentes Merkmal angesehen. Mehrere Studien haben die Fähigkeit von E. faecalis und E. faecium zur Adhärenz an verschiedene Biomaterialien sowie zur Biofilm-Bildung in vitro gezeigt und in Korrelation mit der Pathogenese bestimmter Infektionen gebracht (Baldassarri et al., 2005a). Neuste Ansätze der medizinischen Forschung basieren daher auf der Entwicklung von antimikrobiellen Wirkstoffen, die die Biofilm-Bildung bei bedeutsamen Infektionserregern hemmen. Als Alternative zur Antibiotikagabe könnten Medikamente in der Therapie zum Einsatz kommen, die beispielsweise in spezifische Abläufe des Quorum Sensings (QS) eingreifen und diesen Vorgang somit inhibieren. QS wird die für manche Erreger beschriebene Fähigkeit von Bakterien genannt, in Abhängigkeit ihrer Zelldichte die Genexpression zu regulieren. Biofilm-Bildung ist einer von vielen Phänotypen und Virulenzfaktoren, die über QS-Systeme kontrolliert werden (Kjelleberg & Molin, 2002). Derzeit sehr ausführlich untersuchte QS-Systeme und deren regulatorische Effekte auf die Biofilm-Bildung sind die von S. aureus und S. epidermidis. Diese zeigen allerdings, dass die Entwicklung neuer antimikrobieller Wirkstoffe, die auf die Interferenz mit QS-kontrollierten Systemen beruhen, bei jedem spezifischen Pathogen und der Art von Infektion aufgrund der Diversität und Komplexität dieser regulatorischen Systeme eingehender Untersuchungen bedarf (Otto, 2004). Insofern ist die Untersuchung molekularer Mechanismen der Biofilm- Bildung als Basis zur Entwicklung neuer Therapie-Möglichkeiten auch bei Enterokokken von großer Bedeutung. Einleitung 6 1.2 Virulenzfaktoren bei E. faecalis und E. faecium 1.2.1 Enterococcal surface protein (Esp) Shankar et al. (1999) identifizierten und beschrieben das Zellwand-assoziierte Protein Esp (Enterococcal surface protein) bei E. faecalis, dessen Vorkommen in klinischen Isolaten (29 % esp+ bei Blut-Isolaten und 42 % esp+ bei Endokarditis-Isolaten) signifikant erhöht war im Vergleich zu kommensalen Faeces-Isolaten (3 %). Waar et al. (2002a) konnten das esp Gen allerdings auch in höherer Anzahl (40 %) in E. faecalis aus Faeces gesunder Menschen nachweisen. Die strukturelle Analyse von Esp des Stammes E. faecalis MMH594 ergab, dass das Protein eine molekulare Masse von ca. 202 kDa aufweist und aus 1873 Aminosäuren besteht. Es enthält charakteristische Strukturen anderer Zellwand- lokalisierter Proteine Gram-positiver Bakterien wie eine Transportsignalsequenz am Anfang des N-Terminus und ein Zellwand-Ankermotiv am C-Terminus, was bei Esp in leicht abgewandelter Form zum konservierten LPxTG-Motiv vorliegt. Auffallend ist die aus mehreren, hochkonservierten Tandemsequenzwiederholungen (A- und C-Repeats) bestehende Kernregion des Proteins, die bei verschiedenen Stämmen als Folge homologer Rekombination in ihrer Anzahl variieren (siehe Abb. 1). Die Anzahl dieser Sequenz- wiederholungen in einem Isolat, die bei den meisten untersuchten Stämmen bei ein bis drei A-Repeats und sieben C-Repeats lag, erwies sich außerdem als stabil. Es konnte des Weiteren gezeigt werden, dass alle Stämme, die das esp Gen besitzen, das Protein an ihrer Zelloberfläche exprimieren (Shankar et al., 1999). Esp weist strukturelle Ähnlichkeit mit Bap (Biofilm associated protein) von Staphylococcus aureus auf (Toledo-Arana et al., 2001), was erste Hinweise auf eine Beteiligung von Esp an der Biofilm-Bildung bei Enterokokken (Abb. 1) und damit einhergehend auf eine Rolle als Virulenzfaktor gab. In E. faecium konnte eine Variante des Espfm beschrieben werden, die Abb. 1 Strukturelle Ähnlichkeit des Esp-Proteins von E. faecalis mit dem Bap-Protein von S. aureus Dargestellt ist die Struktur des Esp-Proteins des Stamms E. faecalis MMH594 und die des Bap-Proteins des Stamms S. aureus V329 mit den entsprechenden prozentualen Angaben der Ähnlichkeiten der verschiedenen Regionen dieser Proteine (N-Terminus, C-Repeats). Zahlen geben die Aminosäuren bzw. deren Position an (Toledo-Arana et al., 2001). SP, Signalpeptid; MA, Membrananker; D, Region D; B, B-Repeats Einleitung 7 gehäuft in epidemischen vancomycin-resistenten Stämmen nachgewiesen werden konnte (Willems et al., 2001; Eaton & Gasson, 2002). Andere Studien konnten eine Unabhängigkeit des Espfm von der Vancomycin-Resistenz zeigen, dennoch stehen diese beiden Faktoren unter Selektionsdruck vermutlich miteinander in Verbindung (Woodford et al., 2001; Harrington et al., 2004). Espfm weist 89 % Identität (Gen und Protein) mit Esp von E. faecalis auf, so dass eine ähnliche Funktion zu vermuten ist (Eaton & Gasson, 2002). Das esp Gen ist chromosomal codiert und wurde innerhalb einer 150 kb großen Pathogenitätsinsel (PAI) des klinischen Isolats E. faecalis MMH594 in Nähe des Cytolysin- Operons gefunden, was auf eine synergistische Funktionsweise dieser beiden Virulenzfaktoren hindeutet. Neben diesen und verschiedenen anderen Genen mit vermutlicher Virulenzfunktion codiert die PAI mehrere Gene für Transposasen und Rekombinasen, mit Hilfe derer es höchstwahrscheinlich zu Umstrukturierungen innerhalb der PAI kommen kann. Dies erlaubt dem Bakterium eine hohe Anpassungsfähigkeit seiner Virulenz unter bestimmten Umweltbedingungen (Shankar et al., 2002). In E. faecium ist espfm ebenfalls Bestandteil einer PAI, die jedoch stark von der in E. faecalis beschriebenen PAI abweicht (Leavis et al., 2004). Die Fähigkeit zum Transfer des esp Gens konnte für E. faecalis und E. faecium in Konjugationsexperimenten gezeigt werden (Oancea et al., 2004). Im Maus-Modellversuch konnte nachgewiesen werden, dass Esp als Adhäsin die Bindung von E. faecalis an Blasen-Uroepithelzellen und somit die Kolonisation erleichtert, was zur Persistenz der Bakterien während einer Harnwegsinfektion beiträgt (Shankar et al., 2001). Dies erklärt höchstwahrscheinlich auch hohe Inzidenzraten von Esp bei Harnwegsinfektionen (66,7 % bzw. 72,2 %; Creti et al., 2004; Seno et al., 2005). Eine erhöhte Fähigkeit zur Kolonisation an Intestinalzellen und Translokation in mesenteriale Lymphknoten bei Anwesenheit von Esp konnte hingegen nicht beobachtet werden (Pultz et al., 2005). 1.2.2 Aggregationssubstanzen Aggregationssubstanzen (AS) sind auf Pheromon-induzierbaren Plasmiden codierte, Oberflächen-lokalisierte Proteine, die eine Bindung von bakteriellen Donorzellen an Plasmid- freie Rezipientenzellen vermitteln und somit einen sehr effektiven konjugativen Plasmid- Transfer ermöglichen. Annähernd 20 Plasmide dieser Familie wurden bisher beschrieben, wobei pCF10, pAD1 und pPD1 die am besten charakterisierten Plasmide darstellen. Die Gene, die die entsprechenden AS (Asc10, Asa1, Asp1) codieren, zeigen über 90 % Homologie bzgl. ihrer Aminosäuresequenzen, wovon sich die AS Asa373 jedoch signifikant unterscheidet (Hirt et al., 1996). Wie Zellwandproteine anderer Gram-positiver Bakterien besitzen auch AS eine Signalpeptid-Sequenz, eine Oberflächen-exponierte Region sowie die Zellwand durchdringende und in der Cytoplasmamembran verankerte Domänen. Des Einleitung 8 Weiteren konnten bei diesen Proteinen zwei N-terminale Arg-Gly-Asp (RGD) Motive identifiziert werden, die eine Bindung zu Integrinen an der Oberfläche von Wirtszellen vermitteln (Clewell & Dunny, 2002). Die Erhöhung der Virulenz von E. faecalis durch die Expression von AS erfolgt auf mehreren Stufen. Zum einen kann dieser plasmid-codierte Virulenzfaktor leicht innerhalb der Spezies auf andere Stämme übertragen werden. Des Weiteren sind AS Adhäsine, die die Adhärenz von E. faecalis an Epithelzellen und somit deren Kolonisation fördern (Kreft et al., 1992). Außerdem begünstigen sie die Internalisierung (Vanek et al., 1999) und das Überleben des Enterokokken-Stamms in intestinalen Makrophagen und PMNs nach Phagozytose (Rakita et al., 1999), woraus eine Resistenz gegenüber der Immunabwehr des Wirts resultiert. Zudem konnte gezeigt werden, dass die Expression von AS die Internalisierung durch intestinale Epithelzellen (Olmsted et al., 1994) sowie die Adhärenz an extrazelluläre Matrixproteine wie Fibronektin, Thrombospodin, Vitronectin und Kollagen Typ I fördert (Rozdzinski et al., 2001). Sexpheromon-Plasmide wurden ebenfalls in E. faecium beschrieben, wobei sie in dieser Spezies häufig assoziiert mit einer Vancomycin-Resistenz auftraten (Magi et al., 2003). 1.2.3 Cytolysin Das Toxin Cytolysin, welches von manchen E. faecalis Stämmen sekretiert wird, ist ein bakterielles Bateriocin und gehört der Klasse der Lantibiotika an. Das aktive Cytolysin weist sowohl hämolytische wie auch bakterizide Aktivität auf und besteht aus zwei nicht- identischen strukturellen Untereinheiten (CylLL und CylLS), welche ribosomal als Vorläufer synthetisiert und posttranslational verändert werden. Genetisch codiert wird das Toxin durch ein komplexes Operon, das aus acht Genen (cylR2, cylR1, cylLL, cylLS, cylM, cylB, cylA und cylI) besteht, und sowohl chromosomal innerhalb einer PAI als auch auf großen Pheromonplasmiden (z.B. pAD1) lokalisiert sein kann. Nach der Modifizierung werden beide Untereinheiten mittels des ATP-bindenden CylB-Transporters durch die Cytoplasmamembran sekretiert und von der Serinprotease CylA jeweils mittels der Abspaltung von sechs Aminosäuren extrazellulär aktiviert. Das Operon scheint des Weiteren über einen neuartigen QS-Mechanismus mittels Autoinduktion reguliert zu werden, wobei ein bestimmter Schwellenwert der sekretierten und aktivierten Untereinheit CylLS´´ (Autoinduktor) erreicht sein muss (Coburn & Gilmore et al., 2003). Außerdem sind ebenfalls die beiden regulatorischen Einheiten CylR1 und CylR2 an der Aktivierung der Genexpression beteiligt (Coburn et al., 2004). Cytolysin weist eine breite toxische Aktivität gegenüber verschiedenen Zelltypen auf, darunter eine Vielzahl Gram-positiver Bakterien, humane und bovine Erythrozyten sowie humane intestinale Epithelzellen (Cox et al., 2005). Dieser Faktor trägt durch eine direkte Einleitung 9 Gewebeschädigung zur Pathogenität von E. faecalis bei. Des Weiteren profitiert der Cytolysin-produzierende Stamm durch die Lyse der Zellen von Nährstoffen, die für nicht- Cytolysin-produzierende Stämme unzugänglich sind. Fast alle Infektionsmodelle, von Caenorhabditis elegans bis hin zu Kaninchen, haben gezeigt, dass Cytolysin zur Virulenz von E. faecalis beiträgt, die genauen Mechanismen der Pathogenität sind allerdings bisher meist spekulativ. Aufgrund von Ergebnissen, die bei der gemeinsamen Expression von Cytolysin und Aggregationssubstanz eine achtfach erhöhte Letalität in einem Endokarditis- Modell im Vergleich zur Expression von nur einem Faktor demonstrierten (Chow et al., 1993), wurde ein Synergismus dieser beiden Determinanten (wobei vermutlich ebenfalls Esp beteiligt ist) bzgl. der Virulenz von E. faecalis postuliert (Coburn & Gilmore et al., 2003). 1.2.4 Gelatinase und fsr Locus Bakterielle Proteasen können direkte sowie indirekte Schädigungen des Wirtsgewebes hervorrufen. Mögliche Auswirkungen dieser Enzyme können u.a. die indirekte Degradation von Bindegewebe des Wirts durch die Aktivierung von wirtseigenen Matrix-Metalloproteasen (Okamoto et al., 1997), die direkte Degradation des Bindegewebes sowie von Gewebsproteinen oder die Deregulation bestimmter Komponenten des Wirtsabwehrsystems durch die Degradierung von Immunoglobulinen sein (Prokesova et al., 1992). Die von Enterokokken sekretierte Gelatinase ist eine Zink-Metalloprotease, welche Gelatine, Kollagen, Casein, Lactoglobulin und andere biologisch aktive Proteine zu hydrolysieren vermag. Bei E. faecalis wird dieses Enzym durch das gelE Gen codiert, dessen Expression vom fsr Locus (E. faecalis Regulator) in Abhängigkeit von der Zelldichte positiv reguliert wird. In Abb. 2 wird ein schematisches Diagramm des vermeintlichen Mechanismus der fsr Aktivierung und dessen Effekt auf die Synthese der Gelatinase GelE und Serinprotease SprE dargestellt (Gilmore et al., 2002). Der Autoinduktor GBAP (gelatinase biosynthesis-activating pheromone), ein C-terminales Peptid (ein zyklisches Lacton) des FsrB-Proteins, wird sekretiert und interagiert mit dem membrangebundenen Signaltransduktor FsrC. Wahrscheinlich gibt dieser das Signal über Phosphorylierung an den Regulator FsrA weiter, welcher die Transkription von fsrB/fsrC sowie gelE/sprE induziert (Qin et al., 2000, 2001). Genetische Analysen von fsrA-, fsrB- und fsrC-Disruptionsmutanten ließen somit vermuten, dass es sich hier um ein QS-abhängiges Zwei-Komponenten-Regulatorsystem handelt (Nakayama et al., 2001; Qin et al., 2000, 2001). Mittlerweile wurde dieses Modellsystem zum Teil revidiert, da ein weiterer Locus fsrD innerhalb von fsrB identifiziert wurde, welcher für das GBAP-Propeptid codiert (Nakayama et al., 2006). Einleitung 10 Abb. 2 Modell zum Mechanismus der fsr Aktivierung Die fsr Produkte autoregulieren vermutlich ihre Gene über einen zelldichte-abhängigen Mechanismus und regulieren somit die Expression von Gelatinase und Serinprotease. In diesem Modell interagiert der sekretierte Autoinduktor GBAP (gelatinase biosynthesis- activating pheromone) mit dem membrangebundenen Signaltransduktor FsrC. Dieser gibt das Signal mittels Phosphorylierung an den Regulator FsrA weiter, welcher wiederum die Transkription von fsrB/C und gelE/sprE induziert. Pa, Pb, Pe, aktive Promotoren (Gilmore et al., 2002). Die Gelatinase, welche als reifes Enzym eine Masse von ca. 33 kDa aufweist, wird somit als Präproenzym synthetisiert und durch C-terminales Processing aktiviert (Del Papa et al., 2007). Zeng et al. (2005) konnten zeigen, dass die Gelatinase-Produktion ein wichtiger Faktor für die erfolgreiche Translokation von E. faecalis durch Monolayer von humanen Kolon-Karzinomzellen (T84) in vitro darstellt. Im Maus-Peritonitismodell zeigte sich eine signifikante Abschwächung der Virulenz bei allen drei Mutanten (fsrA, fsrB, fsrC), die weder Gelatinase- noch Serinprotease-Produktion aufwiesen, im Vergleich zum Wildtypstamm OG1RF. Allerdings konnten aufgrunddessen keine Aussagen über unabhängige Rollen der drei Loci gemacht werden (Qin et al., 2000). Eine vorige Studie konnte feststellen, dass eine gelE-Disruptionsmutante von OG1RF eine signifikante Verzögerung des Todeszeitpunkts sowie leicht erhöhte LD50-Werte im Maus- Peritonitismodellversuch bewirkte (Singh et al., 1998), jedoch bestand Unsicherheit über einen unabhängigen Einfluss der Gelatinase auf die Virulenz aufgrund des gleichzeitigen Verlusts der Serinprotease-Produktion. Die Untersuchung einer sprE-Mutante zeigte dann allerdings eine unabhängige Rolle bei der Infektion in diesem Modell (Qin et al., 2000). Folgestudien stellten eine verminderte Virulenz bei fsrA-, fsrB-, fsrC-, gelE- und sprE- Mutanten von OG1RF sowohl im Maus-Peritonitismodell als auch im Nematodenmodell (Caenorhabditis elegans) fest (Sifri et al., 2002) sowie für eine fsrB-Mutante ebenfalls im Kaninchen-Endophthalmitismodellversuch (Mylonakis et al., 2002; Engelbert et al., 2004), was die Rolle dieses QS-Systems und der beiden Proteasen für die Virulenz von E. faecalis verdeutlichte. Ergebnisse von Engelbert et al. (2004) liessen allerdings vermuten, dass Einleitung 11 möglicherweise zusätzliche pleiotrophe Effekte auf die Expression anderer Virulenzeigenschaften die Pathogenität von E. faecalis im Endophthalmitismodell beeinflussen. Schließlich konnten auch Bourgogne et al. (2006) mittels Microarray- Technologie zeigen, dass das FsrABC-System eine große Anzahl weiterer Gene sowohl positiv wie auch negativ zu regulieren vermag. 1.2.5 Adhesin of collagen from E. faecalis (Ace) Eine bakterielle Infektion wird initiiert durch die Bindung der Bakterienzelle an die Wirtszelle und/oder an extrazelluläre Matrixsubstanzen (ECM). Diese Fähigkeit zur Bindung an verschiedene ECM-Bestandteile, z.B. an Kollagene oder Glykoproteine wie Laminine, Fibronektin und Vitronektin, wurde in verschiedenen Studien für E. faecalis und E. faecium beschrieben (Zareba et al., 1997; Xiao et al., 1998; Styriak et al., 1999). Zum Teil waren die Ergebnisse jedoch wenig konform, was wahrscheinlich auf unterschiedliche Versuchs- durchführungen in vitro (Teststämme, Wachstumsbedingungen, Wahl der Methode etc.) zurückzuführen war (Gilmore et al., 2002). Einige Untersuchungen bezeichnen E. faecalis und E. faecium als wenig oder nicht adhärent bzgl. Fibronektin (Zareba et al., 1997; Xiao et al., 1998). Auch für Vitronektin (7,4 % für E. faecalis und 8 % für E. faecium), Laktoferrin (11,3 % und 12,2 %) und Thrombosporin (12,5 % und 9,8 %) ergaben sich relativ geringe Werte (Zareba et al., 1997). Unter Stressbedingungen (z.B. nach Wachstum bei 46°C) konnte eine Studie hingegen eine bis zu 40fache Erhöhung der Bindungsfähigkeit mehrerer getesteter E. faecalis Stämme an Kollagen Typ I und Typ IV sowie Laminin nachweisen (Xiao et al., 1998). Von sieben identifizierten putativen Adhäsinen im Genom von E. faecalis V583 (Paulsen et al., 2003), die die strukturelle Organisation von MSCRAMM (microbial surface component recognizing adhesive matrix molecules) aufweisen (Sillanpää et al., 2004), wurde u.a. das Ace (Adhesin of collagen from E. faecalis) bisher am eindringlichsten untersucht. Dieses 74 kDa große Protein zeigt signifikante strukturelle Ähnlichkeiten mit dem Kollagen- Bindeprotein Cna von S. aureus und ist in E. faecalis weit verbreitet (Nallapareddy et al., 2000a), während das cna Gen in nur ca. 38 – 56 % der S. aureus nachgewiesen werden konnte (Gilmore et al., 2002). Das Ace-Protein besteht aus einer N-terminalen Signalsequenz (31 Aminosäuren), einer nicht-repetitiven A-Domäne, einer B-Domäne, die aus 2,4 – 5,4 Tandemrepeats aufgebaut ist, gefolgt von einer Zellwanddomäne, die die Konsensussequenz LPxTG enthält, einer hydrophoben Transmembranregion sowie dem cytoplasmatischen C-Terminus. Aufgrund der variablen B-Domäne tritt das Ace in vier unterschiedlichen Formen auf, wobei die Funktion der B-Domäne noch ungeklärt ist (Nallapareddy et al., 2000a). In Proteinextrakten verschiedener E. faecalis Stämme konnte mittels Westernblot-Analysen Ace in den bei 46°C kultivierten Zellen nachgewiesen werden, Einleitung 12 während das Protein in den meisten bei 37°C angezogenen Kulturen nicht detektiert werden konnte. Außerdem ergab die Korrelation der in vitro Produktion des Ace mit der Fähigkeit zur Bindung an Kollagen Typ I und IV sowie Laminin (Nallapareddy et al., 2000b) und Dentin (Kowalski et al., 2006), dass das Protein die Adhäsion der Bakterienzellen an diese ECM- Proteine vermittelt. Quantitative RT-PCR-Analysen zeigten des Weiteren, dass die Transkription von ace durch die Anwesenheit von Kollagen Typ I und Typ IV sowie Serum im Medium scheinbar erhöht wird und somit eine Liganden-abhängige Signalinduktion vorliegt (Nallapareddy & Murray, 2006). Ein Einfluss des ace von E. faecalis auf die primäre Anheftung an Polystyrol (PS) sowie die Biofilm-Bildung konnte nicht detektiert werden (Mohamed et al., 2004). In E. faecium wurde ein homologes Protein Acm identifiziert, das eine wichtige Rolle bei der Adhäsion des Bakteriums an Kollagen Typ I spielt (Nallapareddy et al., 2003) und vornehmlich in klinischen Isolaten, insbesondere in zu dem Krankenhaus-assoziierten klonalen Komplex 17 (CC-17) gehörenden Stämmen, nachgewiesen wurde (Nallapareddy et al., 2008a). Im Ratten- bzw. Maus-Modellversuch konnte Acm in Verbindung mit der Pathogenese von Endokarditis, jedoch nicht mit Peritonitis, gebracht werden (Nallapareddy et al., 2008b). 1.2.6 Weitere Virulenzfaktoren Enterokokken besitzen offensichtlich weitere, z.T. wenig untersuchte Virulenzfaktoren, deren exakte Rolle während einer Infektion noch überwiegend ungeklärt ist. Die Hyaluronidase ist ein degradierendes Enzym, dessen Substrat der Bindegewebsbestandteil Hyaluronsäure (ein Mucopolysaccharid) darstellt. Durch Depolymerisation des Mucopolysaccharids kommt es zu Gewebeschädigungen, was die Invasion des Bakteriums begünstigt. Eine weitere Rolle des Enzyms stellt die Versorgung mit Nährstoffen (Disaccharide) für das Bakterium dar, welche durch die Spaltung der Hyaluronsäure entstehen. Zusätzlich zur Zerstörung, die vom Enzym selbst ausgeht, könnte die Aktivität der Hyaluronidase gewebeschädigende Effekte anderer bakterieller Toxine begünstigen. Hyaluronidase wird als potentieller Virulenzfaktor in verschiedenen Gram-positiven Bakterien angesehen, u.a. Streptococcus pneumoniae und Streptococcus pyogenes (Hynes & Walton, 2000). In E. faecium wurde das hyl Gen überwiegend in klinischen Isolaten (Rice et al., 2003) und insbesondere in solchen E. faecium Stämmen nachgewiesen, die dem epidemisch-virulenten klonalen Komplex 17 (CC-17) angehören (Klare et al., 2005). In E. faecalis sind zwei putative Hyaluronidase- Gene, hylA (ef3023) und hylB (ef0818) bekannt, die potentielle Virulenzfaktoren darstellen (Nallapareddy et al., 2005; Tsigrelis et al., 2007). Die Superoxid-Produktion von neutrophilen Granulozyten und anderen phagozytischen Zellen des menschlichen Abwehrsystems ist essentiell für die Bekämpfung von Einleitung 13 Mikroorganismen. Superoxid-Anionen (O2-) können aber auch als Nebenprodukte des Metabolismus bei Enterokokken entstehen, wobei es unter bestimmten Bedingungen über verschiedene radikalische Reaktionen zur Bildung des zell- und gewebeschädigenden Wasserstoffperoxids (H2O2) kommen kann. Der Metabolismus der Superoxid-Produktion ist von Huycke et al. (2001) beschrieben worden. Zuvor wiesen Huycke et al. (1996) eine signifikant erhöhte extrazelluläre Superoxid-Produktion im Vergleich zu Stämmen aus Faeces gesunder Versuchspersonen bei E. faecalis Isolaten nach, die mit Endokarditis oder Bakteriämie assoziiert waren. Die Erkenntnis eines eindeutigen Zusammenhangs der Superoxid-Produktion mit der Enterokokken-Virulenz erfordert jedoch bislang weitere Studien. Enterokokken sind außerdem in der Lage Bacteriocine zu prodzieren. Diese antimikrobiellen und ribosomal synthetisierten Peptide der Enterokokken werden als Enterocine bezeichnet und weisen für gewöhnlich eine inhibierende Aktivität gegenüber nah verwandten Spezies auf. Einige von E. faecium, E. faecalis und E. mundtii produzierte Enterocine, wie Enterocin A oder Mundticin, sind bereits sehr gut charakterisiert, andere zeichnen sich allerdings durch eine ungewöhnliche strukturelle oder genetische Eigenschaft aus, so dass Franz et al. (2007) ein vereinfachtes Klassifizierungsschema ausgearbeitet haben. Dieses gruppiert die Enterocine wie folgt: Klasse I Enterocine (Lantibiotika), Klasse II Enterocine (kleine, nicht-lantibiotische Peptide), Klasse III Enterocine (zyklische Enterocine) und Klasse IV Enterocine (große Proteine). Enterocin-Produktion ist eine weit verbreitete Fähigkeit der Enterokokken. Häufig ist ein Stamm in der Lage, mehrere Enterocine gleichzeitig zu bilden (De Vuyst et al., 2003). Als Teil einer natürlichen Flora oder während einer Infektion kann die Bildung von Bacteriocinen den Enterokokken einen kompetitiven Vorteil gegenüber anderen Bakterienspezies oder –gattungen am jeweiligen Standort verschaffen und so zur eigenen Kolonisierung und Etablierung beitragen. Manche Bacterocine, die von Milchsäurebakterien produziert werden, weisen sogar ein breites Aktivitätsspektrum gegenüber verschiedenen Gram-positiven pathogenen Bakterien auf, z.B. Listeria spp. oder Staphylococcus spp. (Franz et al., 2007). Lowe et al. (1995) beschreiben ein immunodominantes Antigen (EfaA, E. faecalis Antigen A), das aus Seren von Patienten mit einer von E. faecalis verursachten Endokarditis isoliert wurde. Auch in einem Maus-Peritonitismodell konnte bei Tieren, die mit einer efaA- Disruptionsmutante des Stamms OG1RF infiziert wurden, eine moderate, aber signifikant reduzierte Sterblichkeitsrate im Vergleich zum Wildtypstamm festgestellt werden (Singh et al., 1998). Die präzise Rolle von EfaA in der Pathogenese enterokokkaler Infektionen ist bisher jedoch unklar. Ein weit verbreitetes Gencluster bei E. faecalis, das an der Biosynthese eines Polysaccharid- Antigens beteiligt ist, wurde von Xu et al. (1998) beschrieben. Dieses epa (enterococcal Einleitung 14 polysaccharide antigen) Gencluster besteht aus 17 benachbarten Genen (orfde1 bis orfde16 sowie orfde5_6). Die Charakterisierung dieses Clusters (Xu et al., 2000) erbrachte eine Identifizierung mehrerer potentieller Ribosomen-Bindestellen, und mittels weiterer genetischer Analysen sowie insbesondere anhand von Transposon-Mutagenesen konnten zwei Transkripte (orfde4 – orfde5 und orfde6 – orfde10) verifiziert werden. Die orfde4- und orfde6-Mutanten des Stamms OG1RF zeigten sowohl eine Abschwächung der Virulenz in Maus-Peritonitismodellen als auch eine erhöhte Anfälligkeit zur Phagozytose, was auf eine Rolle als Virulenzfaktor bei Enterokokken hinweist, allerdings ebenfalls weiterer Studien zur genauen Spezifizierung bedarf. Zusammenfassend kann dargestellt werden, dass die Virulenz von Enterokokken insbesondere basiert auf die Fähigkeit der Bakterien • zur Adhäsion und Kolonisation mittels Aggregationssubstanzen oder anderen Oberflächenproteinen, • zur Resistenz gegenüber der wirtseigenen Abwehr mit Hilfe von Aggregationssubstanzen, • zur Inhibierung anderer Bakterien mittels der Produktion von Cytolysin und / oder anderer Bacteriocine sowie • zur Gewebeschädigung durch Bildung von extrazellulären Superoxiden, Gelatinase, Hyaluronidase und Cytolysin. 1.3 Biofilm-Bildung bei E. faecalis und E. faecium 1.3.1 Allgemeine Charakteristika von Biofilmen und Biofilm-Bildung Biofilme spielen in vielen natürlichen, insbesondere aquatischen Ökosystemen eine bedeutende Rolle. Erste Entdeckungen und Beschreibungen von Biofilm-Bildung auf Zähnen („Plaque“) gehen bis ins 17. Jahrhundert zurück. Mittlerweile haben mikroskopische und quantitative Techniken gezeigt, dass nahezu alle Bakterien die Fähigkeit zur Biofilm-Bildung auf einer Vielzahl verschiedenster Oberflächen besitzen. Einer der ersten Bereiche, in denen Biofilm-Bildung als Problem erkannt wurde, sind industrielle (Ab)wassersysteme, wo bakterielle Biofilme kostenintensive Beschädigungen an verschiedenen Rohrleitungen durch Ansiedlung an deren Wände verursachen. Nachfolgend zeigte sich, dass auch solche Bakterien, die chronische Infektionen in Verbindung mit diversen medizinischen Gerätschaften oder Hilfsmitteln (z.B. Katheter) hervorrufen, in Biofilmen auf diesen Materialien zu wachsen vermögen (Donlan & Costerton, 2002; Raad et al., 2005). Ein Biofilm ist definiert als eine sessile mikrobielle Lebensgemeinschaft, deren Zellen an ein Substrat, eine Grenzfläche oder aneinander angeheftet sind, in ein Gerüst von Einleitung 15 extrazellulären, polymeren Substanzen (EPS) eingebettet sind und einen modifizierten Phänotyp bzgl. Wachstumsrate und Gentranskription im Vergleich zu planktonisch wachsenden Zellen aufweisen. Zu einem Biofilm formierte Zellen weisen eine höhere Resistenz gegenüber antimikrobiellen Substanzen wie Antibiotika (Foley & Gilbert, 1997), Desinfekionsmitteln und Germiziden auf. Dies liegt entweder an der verminderten Penetration der antimikrobiellen Substanz durch die Biofilm-Matrix, der veränderten Wachstumsrate der MO im Biofilm oder an anderen physiologischen Modifizierungen als Folge der Repression oder Induktion spezifischer Gene, z.B. nach Synthese von Sigma- Faktoren (Donlan & Costerton, 2002; Jefferson, 2004). Außerdem sind Bakterien in einem Biofilm resistent gegen Phagozytose, was die Möglichkeit zur Bekämpfung der Bakterien durch die wirtseigene Abwehr stark erschwert (Lewis, 2001). Speziell für E. faecalis konnte des Weiteren gezeigt werden, dass Biofilm-produzierende Stämme eine längere Zeit (> 24 h) in Makrophagen überleben können als solche Stämme, die keine extrazellulären Polysaccharid-ähnlichen Substanzen bilden (Baldassarri et al., 2001). Die Bildung eines Biofilms ist ein komplexer, mehrstufiger Prozess (Dunne, 2002). Er beginnt mit der Adhäsion planktonischer Zellen an eine biotische (Zelle, Gewebe etc.) oder abiotische Oberfläche. Diese erste Phase wird primäre Anheftung genannt, an der u.a. bestimmte Mediatoren wie Zelloberflächenmoleküle beteiligt sind. Der zweite Abschnitt der Biofilm-Entwicklung ist gekennzeichnet durch die Formation von sog. Mikrokolonien, die durch die Interaktion der MO mit der Oberfläche und zwischen einzelnen Zellen zustande kommen. Dieser Vorgang kann ebenfalls von spezifischen Oberflächenkomponenten beeinflusst werden, z.B. Adhäsinen wie dem PIA (Polysaccharide intercellular adhesin) von S. epidermidis (Mack et al., 1996). In der dritten Phase findet die „Reifung“ des Biofilms statt, die charakterisiert ist durch die Umstellung des Metabolismus (Beloin & Ghigo, 2005) und somit zur Produktion verschiedener extrazellulärer Substanzen (Polysaccharide, Proteine u.a.) zur Entstehung einer Umgebungsmatrix, in der die Zellen eingebettet sind. Der entstandene Biofilm mit umgebenden Matrixstrukturen ist ein hoch viskoelastisches Gebilde, das schließlich in einer „gummiartigen“ Weise auf äußere Belastungen reagiert (Donlan & Costerton, 2002). Im letzten Stadium der Biofilm-Bildung kommt es ggf. zu einer Ablösung einzelner planktonischer Zellen oder Fragmente des Biofilms, so dass die Besiedlung anderer Oberflächen möglich ist (Costerton et al., 1999). Biofilme, die in einer Umwelt mit geringen Scherkräften gebildet wurden, weisen eine geringe Spannungsstärke auf und brechen daher leicht, wohingegen solche, die in einer Umgebung mit starken Scherkräften entstanden sind, extrem widerstandsfähig gegenüber mechanischer Zerstörung sind (Donlan & Costerton, 2002). Betrachtungen lebender Biofilme in situ, was insbesondere durch die Technik der Konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie (CLSM) möglich wurde, zeigten zunächst, dass ein Biofilm kein Einleitung 16 starres Gebilde, sondern ein vielschichtiges, in Zeit und Raum heterogenes Konstrukt ist, und dass die Mikrokolonie die strukturelle Basiseinheit darstellt (Lawrence et al., 1991). Lebende, vollhydrierte Biofilme bestehen aus ca. 15 % Zellen und ca. 85 % Matrix-Material. Die Zellen sind in matrix-eingebetteten „Türmen“ oder „pilzartigen Strukturen“ angeordnet, und offene Wasserkanäle durchziehen die Zwischenräume dieser Mikrokolonien (Abb. 3). Das durchfliessende Wasser verursacht somit eine konvektive Strömung (Donlan & Costerton, 2002). Diese dynamische Basisstruktur eines Biofilms ist universell, allerdings existieren geringe Variationen in Abhängigkeit verschiedenster Faktoren wie Umwelteinflüsse etc. (Branda et al., 2005). Abb. 3 Dynamische Struktur eines Biofilms (schematisch) Die in der Biofilm-Matrix eingebetteten Zellen bilden Mikrokolonien, die als „Türme“ oder „pilzartige Strukturen“ angeordnet sind. Deren Zwischenräume werden von offenen Wasserkanälen durchzogen. Das durchfliessende Wasser (hier mittels blauer Pfeile dargestellt) verursacht eine konvektive Strömung und beeinflusst somit die dynamische Struktur das Biofilms (Donlan & Costerton, 2002). Eine Untersuchung der Ultrastruktur von E. faecalis Biofilmen zeigte, dass die Biofilm- Bildung dieser Spezies auf verschiedenen Substraten stark variiert (Erlandsen et al., 2004). Mittels Rasterelektronen-Mikroskopie (REM) konnten die Autoren offensichtliche qualitative Unterschiede erkennen zwischen unter statischen Bedingungen gebildeten Biofilmen, die auf Polystyrol-Oberflächen gewachsen waren, und solchen, die auf für Nieren-Dialyse verwendeten Zellulose-Kathetern entstanden sind. Auf dem PS-Substrat wiesen die im Biofilm formierten Zellen des Stamms E. faecalis OG1RF größere interzelluläre Zwischenräume auf, während die Bakterien auf den Zellulose-Kathetern sehr dicht gepackt waren. Des Weiteren lagen in nicht-kolonisierten Zwischenräumen die Zellen auf dem PS- Untergrund als kleinere Aggregate verteilt vor, während auf dem Zellulose-Material größere, mehrschichtige Zellcluster zu sehen waren. Herausragend war auch die Entdeckung von Exopolysaccharid-ähnlichen Substanzen, die als interzelluläre Verbindungen sowie zwischen den Zellen und dem Substrat zu erkennen waren. Diese Substanzen konnten zum einen auf Einleitung 17 der gesamten Zelloberfläche mit Ausnahme des Septums beoachtet werden, zum anderen zeigten sie sich in größerem Maße bei dem auf den Zellulose-Kathetern gewachsenen Biofilm. Letzteres lässt vermuten, dass diese Oberfläche die Produktion der extrazellulären Substanz stimuliert hat, und dieser Vorgang von den Umgebungsfaktoren wie der Beschaffenheit des Substrats beeinflusst wird (Erlandsen et al., 2004). 1.3.2 Weltweites Vorkommen und klinische Bedeutung der Biofilm-Bildung bei Enterokokken In den letzten Jahren konnten vermehrt Fälle von Enterokokken-Infektionen registriert werden, bei denen offensichtlich die Fähigkeit zur Biofilm-Bildung eine bedeutsame Rolle bei der Pathogenese gespielt (Peciuliene et al., 2000; Raad et al., 2005; Seno et al., 2005; Mohamed et al., 2004; Baldassarri et al., 2006) und somit das Interesse insbesondere in der medizinischen Forschung forciert hat. Mehrere klinische Studien berichten allerdings von verhältnismäßig unterschiedlichen Ergebnissen bzgl. der Prävalenz der Biofilm-Bildung bei E. faecalis und E. faecium in verschiedenen Ländern und Kontinenten der Welt (Tab. 1). Tab. 1 Ergebnisse verschiedener Studien zum Vorkommen der Biofilm-Bildung bei Enterokokken in unterschiedlichen Ländern und Kontinenten der Welt E. fc, E. faecalis; E. fm, E. faecium; --, keine Isolate von E. faecium untersucht Land Anzahl untersuchter Isolate insgesamt Prävalenz E. fc Prävalenz E. fm Herkunft der Isolate Referenz Spanien 152 E. fc 57,2% -- Hospitalisierte Patienten Toledo-Arana et al., 2001 Italien 73 E. fc 24 E. fm 79,5% 48,0% Infektionen, Gesunde, Umweltproben Baldassarri et al., 2001 Italien 52 E. fc 96,2% -- Orthopädische Infektionen Baldassarri et al., 2006 Italien 83 E. fc 45 E. fm 95,2% 28,8% Infektionen, Intestinalflora, Umweltproben Di Rosa et al., 2006 Italien 15 E. fc 32 E. fm 86,7% 15,6% Diverse klinische Proben Dupre et al., 2003 UK 70 E. fc 38 E. fm 100% 42,1% Blutkulturen Sandoe et al., 2003 USA 163 E. fc 92,6% -- Endokarditis und andere klinische Proben Mohamed et al., 2004; 2005 Japan 352 E. fc 100% -- Urintrakt-Infektionen Seno et al., 2005 Polen 108 E. fc 35 E. fm 59,2% 8,6% Diverse klinische Proben Dworniczek et al., 2005 Indien 171 E. fc 25 E. fm 26,0% 0,0% Diverse klinische Proben Prakash, 2005 Einleitung 18 Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass zum einen eine höhere Anzahl der E. faecalis Stämme im Vergleich zu E. faecium fähig sind Biofilme zu bilden, zum anderen scheint diese Fähigkeit unter den Isolaten weltweit zu variieren. Mehrere Studien haben die Fähigkeit von E. faecalis und E. faecium zur Adhärenz an verschiedene Biomaterialien wie Katheter (Joyanes et al., 1999; 2000) sowie zur Biofilm- Bildung (Baldassarri et al., 2001) in vitro gezeigt. Weiterhin wurde das Vermögen von Enterokokken zur Bindung an medizinische Utensilien wie Gallen-Stents (Dowidar et al., 1991), Harnröhren-Stents (Keane et al., 1994), intravaskuläre Katheter (Sandoe et al., 2003) und gastrostomische Silikongeräte (Dautle et al., 2003) sowie an intraokulares Linsenmaterial (Kobayakawa et al., 2005) beobachtet und mit der Fähigkeit zur Biofilm- Bildung in Korrelation gebracht. Die Fähigkeit zur Biofilm-Bildung auf abiotischen Oberflächen scheint sogar unter nicht-optimalen physiologischen Bedingungen zwar mit reduzierter Effizienz, aber dennoch vorhanden zu sein (Lleo et al., 2007). Auch sind einige Stämme in der Lage, an verschiedene eukaryotische Zelllinien in vitro zu adhärieren (Archimbaud et al., 2002; Dupre et al., 2003). Dies lässt vermuten, dass mittels dieser Adhäsionsfähigkeit solche Stämme auch in vivo im Wirtsorganismus persistieren und eine Infektion hervorrufen können. Wenn sich die Erreger zudem in einem Biofilm formieren, kann dies zu einer begrenzten Therapierbarkeit der bakteriellen Infektion mit Antibiotika führen. Verschiedene epidemiologische Studien lassen auf einen Zusammenhang zwischen Biofilm- Bildung und Pathogenese bei von Enterokokken verursachten Infektionen schliessen. Ergebnisse von Mohamed et al. (2004) belegten, dass alle untersuchten 79 E. faecalis Isolate, die eine Endokarditis verursacht haben, Biofilm-Bildner waren. Außerdem fanden die Autoren in dieser Gruppe häufiger starke Biofilm-Bildner (39 %) im Vergleich zu Isolaten aus anderem klinischen Material (6 %), woraus sich ein Beitrag der Biofilm-Bildung zur Pathogenese der Endokarditis vermuten ließe. Baldassarri et al. (2006) konnten zeigen, dass E. faecalis Stämme, die von mit orthopädischen Geräten (70 % von Implantaten) assoziierten Infektionen isoliert wurden, eine erhöhte Fähigkeit zur Biofilm-Bildung hatten. Dies impliziert einen Zusammenhang zwischen der Biofilm-Bildung und Enterokokken- Infektionen, die mit Biomaterialien assoziiert sind. Dies unterstützen auch Resultate von Sandoe et al. (2003) und Raad et al. (2005), welche eine Korrelation zwischen von Enterokokken verursachten Bakteriämien, bei denen intravaskuläre Katheter zum Einsatz kamen (CRBSI), und erhöhter Fähigkeit dieser Blutkultur-Isolate zur Biofilm-Bildung zeigten. Auch scheinen Harnwegsinfektionen (UTI) vorwiegend von Biofilm-bildenden Enterokokken- Isolaten verursacht zu werden, da alle 352 von Seno et al. (2005) untersuchten E. faecalis Stämme aus UTI Biofilme bilden konnten. Einleitung 19 1.3.3 Biofilm-Bildung beeinflussende Faktoren Bei E. faecalis wird die Produktion von Biofilm durch den Zusatz von 1 % Glukose in Trypton-Soja-Bouillon (TSB) im Vergleich zum Wachstum in TSB ohne Glukose stark erhöht (Baldassarri et al., 2001). Pillai et al. (2004) konnten eine Glukose-abhängige Erhöhung der Biofilm-Bildung beim Stamm E. faecalis OG1RF feststellen, welche im Gegensatz dazu bei einer fsrA-Insertionsmutante sowie einer gelE-Insertionsmutante bei einem Wachstum in Gegenwart von 1 % Glukose nicht auftrat. Dies ließ vermuten, dass zum einen der fsr Locus unter der Kontrolle eines Glukose-abhängigen Transkriptionsregulators steht, zum anderen kontrolliert fsr die Biofilm-Bildung durch die Produktion einer oder durch beide assoziierte Proteasen. Im Gegensatz dazu scheinen geringe Konzentrationen von Glukose (0,2 %) die Menge an Biofilm bei E. faecalis zu verringern (Kristich et al., 2004). Welchen Einfluss der Transkriptionsregulator bopD (siehe 1.3.4.5) hierbei hat, ist weitgehend unbekannt. Auch konnte bei Studien zum Einfluss von Esp auf die Biofilm-Bildung bei E. faecalis gezeigt werden, dass bei Anwesenheit von 0,5 % oder mehr Glukose im Medium die Biofilm-Bildung bei esp-positiven Stämmen erhöht ist (Tendolkar et al., 2004; 2006). Die Untersuchung der Biofilm-Bildungsfähigkeit von verschiedenen esp-negativen Stämmen demonstrierte außerdem den Einfluss unterschiedlicher Medien. Während die Biofilm- Bildung des Stamms OG1RF in TSB, M17 und M9YE nach ca. 6-8 h eine Plateau-Phase erreichte, wurde die Biofilm-Produktion dagegen in THYE und BHI nach ca. 4 h eingestellt und die Menge des Biofilms nahm sogar ab (Kristich et al., 2004). Einen weiteren Faktor stellt die Salzkonzentration im Medium dar. In derselben Studie wurde eine signifikante Reduktion der Biofilm-Bildung von OG1RF in Gegenwart von 2-3 % NaCl bei unbeeinflusstem Wachstum festgestellt (Kristich et al., 2004). Auch die Eliminierung von Eisen im Medium ist entscheidend (Baldassarri et al., 2001). Der Zusatz von Serum im Medium kann ebenfalls die Fähigkeit zur Biofilm-Bildung beeinflussen (Mohamed et al., 2006; siehe auch 1.3.4.5). Somit scheinen bestimmte Umweltbedingungen die Biofilm-Bildung bei E. faecalis zu regulieren, was auch Untersuchungen anderer Bakterien gezeigt haben (Branda et al., 2005; Donlan & Costerton, 2002). Insbesondere bestimmte Nährmedien-Komponenten wie Glukose oder Serum, die Verfügbarkeit von Eisen oder CO2 sowie andere Faktoren (Temperatur, Osmolarität, pH-Wert) können die Biofilm-Bildung beeinflussen. Den initialen Schritt im mehrstufigen Prozess der Biofilm-Bildung stellt die Adhäsion an abiotische oder biotische Oberflächen dar. Diese Interaktion kann in sehr spezifischen Bindungsstellen (z.B. aufgrund von bestimmten Proteinen der Zelloberfläche) begründet sein oder auch nicht-spezifischer Natur sein, welche von der gesamten Zelloberfläche ausgehen. Beide werden von grundlegenden physiko-chemischen Kräften wie Lifshitz-Van der Waals- Kräften, elektrostatischen Kräften und Lewis-Säure-Base-Interaktionen vermittelt (Van Einleitung 20 Loosdrecht et al., 1987). Da unter physiologischen Bedingungen fast alle biologischen Oberflächen eine negative Netto-Ladung aufweisen, sind elektrostatische Interaktionen bei der bakteriellen Adhäsion meist abstoßend, so dass die o.g. Kräfte zunächst überwunden werden müssen. In heterogenen Kulturen von E. faecalis konnte mittels Messung von Zeta- Potentialen eine veränderte Ladung der Zelloberflächen (van Merode et al., 2006b) festgestellt werden, welche in einer erhöhten Anheftung der Zellen an Polystyrol und folglich einer gesteigerten Biofilm-Bildungsfähigkeit im Vergleich zu homogenen Kulturen resultierte (van Merode et al., 2006a). Heterogene Kulturen sind Reinkulturen eines Stammes, die sich durch Subpopulationen auszeichnen, welche Zellen mit Unterschieden in bestimmten Merkmalen enthalten (z.B. bzgl. der Zellgröße). Die Heterogenität einer Kultur ist eine stabile Eigenschaft, die unabhängig vom verwendeten Medium, der Kohlenstoffquelle, der Wachstumsphase oder der Anwesenheit von Esp oder Aggregationssubstanz sowie Plasmiden ist. Kultur-Heterogenität scheint eine verbreitete Eigenschaft bei E. faecalis Stämmen zu sein, da 13 von 29 untersuchten Isolaten (45 %) aus Faeces von gesunden Menschen sowie von Patienten mit verschiedenen Infektionen Heterogenität in ihren Zeta- Potentialen zeigten (van Merode et al., 2006b). Somit stellt dieses Merkmal einen weiteren Aspekt bei Überlegungen zu Einflussfaktoren der Biofilm-Bildung bei Enterokokken dar. 1.3.4 Molekulare Mechanismen der Biofilm-Bildung bei Enterokokken Aufgrund einer größeren Anzahl verfügbarer molekularbiologischer und proteinbiochemischer Methoden sowie deren erhöhter Sensitivität konnten insbesondere in den letzten vier bis fünf Jahren bei E. faecalis mehrere genetische Determinanten, die bei der Biofilm-Bildung von Enterokokken eine Rolle spielen, identifiziert und charakterisiert werden (Tab. 2). Dies hat v.a. verdeutlicht, dass es sich hierbei um einen komplexen Vorgang handelt, der von einer Reihe von Faktoren beeinflusst wird. Nichtsdestotrotz ist der Prozess der Biofilm-Bildung bei E. faecalis und E. faecium keineswegs im Gesamten verstanden und weitere Forschungsarbeiten sind erforderlich, die die Zusammenhänge zwischen den einzelnen Faktoren in vitro und in vivo untersuchen. Auch lassen bestimmte Resultate vermuten, dass es sich um unterschiedliche molekulare Mechanismen bei der Ausprägung eines schwachen im Vergleich zur Bildung eines starken Biofilms handelt (Hufnagel et al., 2004). Im Folgenden werden derzeit bekannte Einflussfaktoren und entsprechende Zusammenhänge zur Biofilm-Bildung beschrieben, wobei auf die für diese Arbeit besonders relevanten Faktoren detaillierter eingegangen wird. Einleitung 21 Tab. 2 Derzeit bekannte genetische Determinanten, die an der Biofilm-Bildung bei E. faecalis beteiligt zu sein scheinen Aufgeführt sind Gene bzw. Genloci und von ihnen codierte Proteine mit entsprechenden Referenzangaben (modifiziert nach Mohamed & Huang, 2007) Gen / Genlocus Protein / Funktion Referenz espfc espfm Enterococcal surface protein: Oberflächenprotein Toledo-Arana et al. (2001) Tendolkar et al. (2004, 2006) Heikens et al. (2007) fsrA, fsrB, fsrC E. faecalis regulator: Zwei-Komponenten Quorum Sensing Signaltransduktionssystem, das die Expression von Gelatinase und Serinprotease reguliert Mohamed et al. (2004) Mohamed & Murray (2006) Pillai et al. (2004) Hancock & Perego (2004) gelE Sekretorische Zinkmetalloprotease Gelatinase E Mohamed et al. (2004) Kristich et al. (2004) Hancock & Perego (2004) atn Autolysin Mohamed et al. (2004) epa (orfde4) Enterococcal polysaccharide antigen: putative Glycosyltransferase, die in die Polysaccharid-Synthese involviert ist Mohamed et al. (2004) etaR enterococcal two-component system regulator Mohamed et al. (2004) bopD Biofilm on plastic surface: putativer Zucker-bindender Transkriptionsregulator Hufnagel et al. (2004) bee1, bee2, bee3 Biofilm enhancer in Enterococcus: putative Zellwandproteine Tendolkar et al. (2006) dltA D-Alanine Lipoteichoic Acid: D-Alanin-D-Alanyl-Transportprotein-Ligase Fabretti et al. (2006) salA, salB Secretory antigen-like A; Secretory antigen-like B: Zellhülle Mohamed et al. (2006) ebpA, ebpB, ebpC Endocarditis and biofilm-associated pili Nallapareddy et al. (2006) srtC Sortase C: Enzym, das Oberflächenproteine in der Zellwand verankert Nallapareddy et al. (2006) ebpR Transkriptionsregulator von ebpABC Bourgogne et al. (2007) 1.3.4.1 Enterococcal surface protein (Esp) Esp (Shankar et al., 1999) ist einer der ersten Virulenzfaktoren gewesen, die in Verbindung mit der Biofilm-Bildung bei E. faecalis gebracht werden konnten. Toledo-Arana et al. (2001) entdeckten zunächst einen Zusammenhang der beiden Eigenschaften, da 93,5 % aller esp- positiven Isolate zur Biofilm-Bildung befähigt waren, wohingegen keiner der esp-negativen Stämme Biofilm produzierte. Die insertionelle Inaktivierung des esp Gens bei zwei Mutanten bewirkte eine verminderte Biofilm-Bildung, allerdings nicht bei einer weiteren esp-Mutante, deren Wildtypstamm die Fähigkeit zur sehr starken Biofilm-Bildung hatte. Daraus ließ sich schließen, dass Esp die primäre Anheftung und die Biofilm-Bildung auf abiotischen Oberflächen erhöht, aber insbesondere bei einem Phänotyp mit sehr starker Biofilm- Bildungsfähigkeit weitere Faktoren bei der Abwesenheit von Esp beteiligt sein müssen. Weitere genetische Analysen konnten einen Einfluss von Esp auf die Biofilm-Bildung bei E. faecalis bestätigen. Die Transformation und erfolgreiche Expression von Esp bei zwei Einleitung 22 genetisch gut charakterisierten, esp-negativen Stämmen (FA2-2 und OG1RF) resultierte in einer signifikanten Erhöhung der Biofilm-Bildung im Vergleich zu den Wildtypstämmen (Tendolkar et al., 2004). Außerdem konnte mittels Generierung von Deletionsmutanten gezeigt werden, dass allein die N-terminale Domäne des Proteins für eine Erhöhung der Biofilm-Bildung ausreicht. Zudem hatte die Expression von Esp in heterologen Wirten (E. faecium und Lactococcus lactis) keinen Anstieg der Biofilm-Bildung in diesen Stämmen zur Folge, was auf eine notwendige Interaktion von Esp mit anderen E. faecalis-spezifischen Faktoren zur Erhöhung der Biofilm-Bildung schließen ließ (Tendolkar et al., 2005). Das zum beschriebenen Protein in E. faecalis homologe Espfm in E. faecium (Willems et al., 2001; Eaton & Gasson, 2002) konnte in folgenden Studien ebenfalls mit der Fähigkeit zur Biofilm-Bildung in Verbindung gebracht werden. Die Höhe der Expression von Espfm auf der Zelloberfläche verschiedener klinischer E. faecium Isolate korrelierte stark mit der Fähigkeit der Stämme zur primären Anheftung und zur Biofilm-Bildung (Van Wamel et al., 2007). Außerdem hing die Höhe der Espfm-Expression stark von den Wachstumsbedingungen ab. Bei fünf von sechs espfm-positiven Stämmen konnte eine signifikante Erhöhung bei einer Kultivierung bei 37°C im Vergleich zu 21°C nachgewiesen werden. Drei von sechs Stämmen zeigten außerdem eine signifikante Erhöhung der Espfm-Expression nach Anzucht unter anaeroben Bedingungen. Die Autoren hielten diesen variierenden Expressionsgrad für eine mögliche Erklärung der z.T. gegensätzlichen Ergebnisse anderer Arbeitsgruppen zur Rolle des Espfm bei der Biofilm-Bildung (Van Wamel et al., 2007). Durch die Erzeugung einer espfm-Mutante eines klinischen E. faecium Isolats, die Espfm nicht mehr exprimierte und eine signifikant verminderte Fähigkeit zur primären Anheftung und zur Biofilm-Bildung hatte, konnte bestätigt werden, dass Espfm auch bei E. faecium eine essentielle Rolle bzgl. der Biofilm-Bildung spielt (Heikens et al., 2007). Im Gegensatz dazu existieren mehrere Studien, die eine Fähigkeit zur Biofilm-Bildung bei E. faecalis unabhängig von der Anwesenheit von Esp belegen. Kristich et al. (2004) untersuchten u.a. den gut charakterisierten Biofilm-bildenden Stamm OG1RF, der esp- negativ ist. Die Autoren stellten die Biofilm-Bildung bei E. faecalis als einen komplexen Vorgang dar, der von verschiedenen Umweltbedingungen abhängig und hierzu die Expression von Esp nicht erforderlich sei. Durch die Untersuchung eines Kollektivs bestehend aus 163 E. faecalis Isolaten konnten Mohamed et al. (2004) ebenfalls zeigen, dass die Anwesenheit von esp zwar nicht notwendig zur Ausprägung eines Biofilms ist, allerdings wurde ein deutlicher Zusammenhang zwischen esp und einer erhöhten Biofilm- Bildung bei esp-positiven Stämmen gefunden. Auch andere Berichte konnten aus ihren Ergebnissen keine Assoziation von esp mit der Fähigkeit zur Biofilm-Bildung bei E. faecalis und E. faecium ableiten (Sandoe et al., 2003; Dupre et al., 2003; Ramadhan & Hegedus, 2005; Dworniczek et al., 2005; Raad et al., 2005; van Merode et al., 2006b; Di Rosa et al., Einleitung 23 2006). Eine jüngste Studie belegte die Involvierung von esp am Vorgang der Biofilm-Bildung, erkannte dem Faktor aber eine volle Kontrolle während dieses Prozesses ab (Arciola et al., 2008). Dementsprechend ist der genaue Mechanismus, wie esp die Biofilm-Bildung bei Enterokokken beeinflusst, immer noch nicht geklärt. 1.3.4.2 fsr Locus und Gelatinase Der Einfluss des regulatorischen Locus fsr auf die Biofilm-Bildung bei E. faecalis wurde erstmals von Mohamed et al. (2004) beschrieben. In dieser Studie zeigte sowohl die fsrA- als auch die fsrB- und fsrC-Mutante des Wildtypstamms OG1RF eine verminderte Fähigkeit zur Biofilm-Produktion von ca. 28 – 32 %. Pillai et al. (2004) konnten diese Ergebnisse durch weitere Untersuchungen dieser Mutanten bestätigen. Zeitnah war es einer anderen Arbeitsgruppe möglich zu zeigen, dass die Biofilm-Produktion von fsrA-, fsrB-, fsrC- und gelE-Insertionsmutanten signifikant erniedrigt war, und dass dieses QS-System die Biofilm- Bildung über die Expression der assoziierten Gelatinase kontrolliert (Hancock & Perego, 2004). Allerdings scheint der fsr Locus auch unabhängig von der Produktion der Gelatinase die Biofilm-Bildung zu beeinflussen, da eine Gelatinase/Serin-Protease-Doppelmutante eine etwas höhere Biofilm-Bildung zeigte als die drei fsr-Mutanten (Mohamed et al., 2004). Eine Folgestudie belegte den Einfluss, da das Einbringen des fsr Locus in einen starken Biofilm- Bildner (fsr, gelE-, esp-, GelE-) eine Reduktion der Biofilm-Bildung um 41 % im Vergleich zum Wildtyp bewirkte, und ein ähnlicher Effekt auch für einen mittelmäßig starken Biofilm- bildenden Stamm erzielt werden konnte (Mohamed & Murray, 2006). Mohamed et al. (2004) untersuchten ebenfalls gelE- und sprE-Mutanten des Stamms OG1RF. Eine Insertionsmutante (GelE-, SprE-) und eine Deletionsmutante (GelE-, SprE+) zeigten eine Abnahme der Biofilm-Bildung um 46 % bzw. 37 % im Vergleich zum Wildtyp, wohingegen eine sprE-Mutante (GelE+, SprE-) eine zu OG1RF vergleichbare Menge an Biofilm bildete. Die Autoren schlussfolgerten, dass vornehmlich die Gelatinase und nicht die Serin-Protease wichtig für die Biofilm-Bildung bei E. faecalis zu sein scheint (Mohamed et al., 2004). Eine andere Untersuchung unterstützte diese Ergebnisse durch Experimente, in denen ein Biofilm-fördernder Effekt (4,5fach erhöht) bei einem schwachen Biofilm-Bildner (E. faecalis JH2; esp-, GelE-) während der Anzucht in einem Medium, dem 20 % des Kulturüberstandes des Gelatinase-Produzenten OG1RF zugesetzt wurde, resultierte (Kristich et al., 2004). Überstände einer sprE-Mutante (GelE+, SprE-) erzielten einen ähnlichen Effekt, währenddessen die einer gelE-Mutante (GelE-, SprE+) keine Biofilm-fördernde Wirkung zeigten. Eine folgende Klonierung von gelE in E. faecalis JH2 brachte einen moderaten Anstieg der Biofilm-Bildung, was ebenfalls auf eine Erhöhung der Biofilm-Bildung durch die Gelatinase schließen ließ (Kristich et al., 2004). Auch der Zusatz aufgereinigter, aktiver Gelatinase zum Kulturmedium des E. faecalis Stamms FA2-2 (GelE-, SprE-) bewirkte eine Zunahme der Biofilm-Bildungsfähigkeit (Hancock & Perego, 2004). Einleitung 24 Der genaue Mechanismus, wie die Gelatinase zu einer Erhöhung der Biofilm-Bildung beiträgt, ist nicht bekannt. Ein Modell zur Funktion von Gelatinase wäre, dass das Enzym an der Produktion eines extrazellulären Signalpeptids beteiligt ist, welches durch eine proteolytische Spaltung seines sekretierten Vorläufer-Peptids in seine aktive Form prozessiert wird und dann als Signal für einen biofilm-fördernden Faktor agiert (Kristich et al., 2004). Andererseits könnten durch die proteolytische Aktivität des Enzyms andere Oberflächenproteine aktiviert werden, die in bestimmter Weise in die Regulation oder den Vorgang der Biofilm-Bildung involviert sind, z.B. an der Sekretion extrazellulärer Substanzen beteiligte Proteine. Für diese Hypothese der proteolytischen Prozessierung inaktiver Exoprotein-Vorläufer würde die bereits bekannte Gelatinase-Funktion der Aktivierung einer Zellwand-Hydrolase (Autolysin) während der Zellseparation von E. faecalis (Waters et al., 2003) sprechen (Kristich et al., 2004; Hancock & Perego, 2004). Im Gegensatz zu den Erkenntnissen aus den genetischen Experimenten konnte allerdings ein Zusammenhang zwischen der Gelatinase-Produktion und der Biofilm-Bildung in mehreren epidemiologischen Studien nicht bestätigt werden (Mohamed & Murray, 2005; Seno et al., 2005; Baldassarri et al., 2006; Di Rosa et al., 2006). Aufgrund der Beobachtung, dass in einer Gruppe von esp-negativen E. faecalis Isolaten die Biofilm-Bildung bei der Subgruppe der GelE-positiven Stämme leicht erhöht war (Mohamed & Murray, 2005), schlussfolgerten die Autoren, dass die Gelatinase jedoch bei Abwesenheit von esp zur Biofilm-Bildung beitragen könnte. Somit ist bisher unklar, ob bzw. wie die Gelatinase- Expression Einfluss auf die Biofilm-Bildung bei Enterokokken nimmt. 1.3.4.3 Biofilm enhancer in Enterococcus (bee Locus) Mittels Tn917-basierter Transposonmutagenese konnten Tendolkar et al. (2006) einen weiteren Genlocus in E. faecalis identifizieren, der die Fähigkeit zur Bildung eines starken Biofilms vermittelt. Dieser ist höchstwahrscheinlich auf einem ca. 80 kb großen, konjugativen Plasmid lokalisiert und kann mit hoher Frequenz (4 x 10-2/Rezipient) transferiert werden, was durch die Entdeckung von putativen Transposase- und Resolvasegenen downstream dieses Locus zu vermuten war. Die Charakterisierung eines erzeugten Mutantenstammes (P101D12) mit einer um > 70 % verminderten Fähigkeit zur Biofilm-Bildung im Vergleich zum Wildtyp E99 zeigte die Insertion des Tn917 in ein Operon, das aus drei putativen Strukturgenen sowie zwei putativen Sortase-Genen besteht (Abb. 4). Dieses wurde von den Autoren bee Locus (Biofilm enhancer in Enterococcus) genannt (Sequenz-Datenbank Akzessionsnummer DQ137124). Einleitung 25 Abb. 4 Struktureller Aufbau des bee Operons von E. faecalis (schematisch) Der bee Locus besteht aus drei Genen, bee-1, bee-2 und bee-3, die putative Zellwandproteine codieren. Downstream dieser Gene codieren zwei orf (srt-1 und srt-2) für putative Sortasen. Oberhalb sind die Längen in bp der entsprechenden Gene angegeben, die Linien-Pfeile unterhalb stellen die putativen Transkriptionseinheiten dar (Tendolkar et al., 2006). Weitere Analysen der Mutante P101D12 ergaben die Insertion des Tn917 innerhalb des zweiten Strukturgens bee-2. RT-PCR Analysen zeigten, dass bee-1, bee-2 und bee-3 sowie srt-1 und srt-2 kotranskribiert werden, hingegen bee-3 und srt-1 nicht transkriptionell verlinkt sind. Komplementierungsexperimente mit einem Plasmid, das die konstitutive Expression von bee-2 und bee-3 in dieser Mutante bewirkt, demonstrierten die Bedeutung beider Proteine für die Biofilm-Bildung. Die Fähigkeit zur Biofilm-Bildung konnte hierdurch in der komplementierten Mutante wiederhergestellt werden, allerdings nicht in dem Maße, wie es bei dem Wildtyp E99 zu beobachten war. Eine Zerstörung der optimalen stöchiometrischen Interaktion der drei Proteine mit Folge einer inkorrekten Konformation durch die Überexpression ist denkbar, der exakte Mechanismus zum Beitrag an der Biofilm-Bildung bleibt allerdings zu bestimmen. Die abgeleiteten Aminosäure-Sequenzen von Bee-1, Bee-2 und Bee-3 lassen konservierte LPxTG-Motive gefolgt von einer hydrophoben Domäne erkennen, welche für gewöhnlich am C-Terminus von Zellwandproteinen in Gram-positiven Bakterien lokalisiert sind. Auch die Sequenzhomologien der zwei putativen Sortase-Gene mit anderen Sortase-ähnlichen Enzymen Gram-positiver Bakterien lassen darauf schließen, dass es sich um einen für Zellwand-Proteine codierenden Locus handelt, und dass diese Proteine über einen für sie spezifischen Sortase-abhängigen Mechanismus in der Zellwand verankert werden. Sortasen sind membrangebundene Transamidasen, die die Peptidbindung der Oberflächenproteine zwischen dem Threonin und dem Glycin des LPxTG-Motivs enzymatisch spalten und die Bildung einer Amino-Bindung (-NH-) zwischen der Carboxyl-Gruppe des Threonin und der Amino-Gruppe der Peptidbindung der Zellwandquervernetzung katalysiert (Marraffini et al., 2006). Außerdem haben Vergleiche mit Streptococcus agalactiae und Corynebacterium diphtheriae mittels Immunogold-Elektronenmikroskopie ergeben, dass die Proteine, die die Substrate dieser Sortasen darstellen, Pili-ähnliche Strukturen an der Zelloberfläche dieser Mikroorganismen bilden (Lauer et al., 2005; Ton-That & Schneewind, 2003). Somit müssen bee-1 bee-2 bee-3 srt-1 srt-2 3252 bp 732 bp 1488 bp 1197 bp 1122 bp Einleitung 26 weitere Untersuchungen zeigen, ob der bee Locus ein ähnliches Gencluster darstellt, das an der Expression von Pilus-Strukturen beteiligt ist. Tendolkar et al. (2006) konnten dieses Gencluster allerdings nur bei 5 % (zwei von 40) der untersuchten, geographisch unabhängigen klinischen E. faecalis Stämme nachweisen. Auch das Genom des E. faecalis V583 enthält diesen Locus nicht. 1.3.4.4 Endokarditis und Biofilm-assoziierte Pili (ebp Locus) Durch die Charakterisierung eines Operons, dessen Gene ursprünglich unter der Bezeichnung ef1091 bis ef1094 geführt wurden, konnten Nallapareddy et al. (2006) ein weiteres Gencluster im Stamm E. faecalis OG1RF identifizieren, das die Biofilm-Bildung bei dieser Spezies entscheidend beeinflusst. Mittels Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) von immunogold-markierten Zellen konnte demonstriert werden, dass die drei von diesem Locus codierten Proteine Bestandteile von Pili bei E. faecalis sind. Im Tierexperiment mit Ratten (endovaskuläres Infektionsmodell) zeigte sich außerdem ein Zusammenhang zur Entstehung von Endokarditis, so dass die Autoren das Operon ebp (Endocarditis and biofilm- associated pili) benannten. In Folgestudien konnte demonstriert werden, dass dieser Locus eine Bedeutung während der Pathogenese bei von E. faecalis verursachten, aszendierenden Harnwegsinfektionen hat. In einem Maus-Modellversuch zur Untersuchung der Rolle bei Peritonitis wurde jedoch kein Einfluss dieses Locus festgestellt (Singh et al., 2007). Nallapareddy et al. (2006) konnten bei allen der 408 untersuchten Isolate mittels Kolonie- Hybridisierungen die Anwesenheit des ebp Locus nachweisen, so dass dieser höchstwahrscheinlich einen Teil des Kerngenoms von E. faecalis darstellt. Vergleiche mit bisher verfügbaren Sequenzen des Genoms von E. faecium lassen zudem einen ähnlichen Locus mit gleicher Organisation der Gene auch in dieser Spezies vermuten. Eine weitere Studie konnte mit Hilfe von Hybridisierungsexperimenten unter insgesamt 55 E. faecalis und 36 E. faecium Isolaten klinischer und nicht-klinischer Herkunft (Gemüse, Obst, Gewässer, Boden) ebp Gene bei 94,6 % der E. faecalis Stämme und bei insgesamt 66,7 % der E. faecium Stämme nachweisen. Außerdem zeigten Sequenzanalysen Unterschiede in den ebp Genen von Stämmen unterschiedlicher Herkunft, so dass diese Variationen Anpassungen an spezifische Umgebungen sein könnten und somit möglicherweise die Fähigkeit zur Adhäsion beeinflussen (Cobo Molinos et al., 2008). Genetische Analysen von Deletions- bzw. Disruptionsmutanten von OG1RF, welche eine signifikant erniedrigte Fähigkeit zur Biofilm-Bildung und zur primären Anheftung aufwiesen, ergab die Identifizierung eines Operons bestehend aus vier Genen (Abb. 5). Weitere molekularbiologische Untersuchungen demonstrierten, dass die vier Gene ebpA, ebpB, ebpC und srtC (jetzt umbenannt in Biofilm and pilus-associated sortase (bps); Kemp et al., 2007) als polycistronisches Operon kotranskribiert werden. Zudem konnte zusätzlich ein Einleitung 27 Abb. 5 Struktureller Aufbau des ebp Operons von E. faecalis (schematisch) Der ebp Locus besteht aus drei Genen, ebpA, ebpB und ebpC, die Proteine pleomorpher Pili bei E. faecalis codieren. Downstream dieser Gene codiert ein orf (srtC) für eine Sortase, die für das Cross-Linking der drei Pili- Proteinuntereinheiten wichtig ist. Oberhalb sind die Längen in bp der entsprechenden Gene angegeben, die Linien-Pfeile unterhalb stellen die putativen Transkriptionseinheiten dar (Nallapareddy et al., 2006). Upstream von ebpA codiert ein orf für einen transkriptionalen Regulator (EbpR) von ebpABC (Bourgogne et al., 2007). unabhängiges Transkript von srtC in den ebpA- und ebpB-Disruptionsmutanten detektiert werden. Dieser unvollständige polare Effekt könnte durch identifizierte, mögliche Promoter- Sequenzen upstream von Startcodons der ebpA und srtC Gene erklärt werden. Proteinbiochemische Untersuchungen zeigten des Weiteren, dass die drei Ebp-Proteine einen SrtC-abhängigen, heteromerischen hochmolekularen Komplex (HMW) mit einer Masse von größer als 200 kDa bilden. Die Analysen ließen vermuten, dass die assoziierte Sortase C einen kovalent verbundenen HMW-Komplex aus den Monomeren von EbpA, EbpB und EbpC generiert, was bereits von Untersuchungen bei anderen gram-positiven Bakterien bzgl. der Formation von Pili-Strukturen bekannt ist (Mandlik et al., 2008). Zudem konnten konservierte Pili-Motive (Pilin-Motiv und E-box sowie LPxTG-Motiv) in den Proteinsequenzen von EbpA, EbpB und EbpC identifiziert werden, was zusammen mit TEM- Aufnahmen bestätigte, dass dieser Locus für Pili-Strukturen bildende Proteine codiert. Gleichzeitig zeigten die mikroskopischen Aufnahmen der peritrichen Pili, dass EbpA- Komponenten vorwiegend an der Pilus-Basis zu sehen waren, während die Markierung mit EbpB- und EbpC-Antikörpern über den gesamten Pilus-Schaft stattfand. Aufgrunddessen sowie der hohen Sequenzähnlichkeit von EbpC mit anderen Hauptkomponenten („major subunits“) der Pili Gram-positiver Bakterien ist es sehr wahrscheinlich, dass EbpC den Hauptbestandteil des Schafts dieser E. faecalis Pili bildet. Zusammenfassend lassen diese Beobachtungen vermuten, dass diese Pili durch den SortaseC-abhängigen Vorgang eines geordneten Cross-Linkings der drei Ebp-Monomere entstehen, was sehr starke Ähnlichkeit zu kürzlich beschriebenen Mechanismen des Zusammenbaus von Pili-Strukturen bei anderen Gram-positiven Bakterien aufweist, z.B. Corynebacterium diphtheriae (Ton-That et al., 2004; Mandlik et al., 2008). Interessanterweise konnten die Autoren diese anti-Ebp-angefärbten Pili nur in weniger als 20 % der in TSBG kultivierten Zellen und in weniger als 2 % der in BHI gewachsenen Zellen von OG1RF detektieren. Da gleichzeitig kein Unterschied in der Höhe der Transkription des 3432 bp 1431 bp 855 bp 1884 bp 1422 bp ebpR ebpA ebpB ebpC srtC Einleitung 28 ebp Locus festzustellen war, lag die Vermutung nahe, dass die Produktion von Pili auf posttranskriptionaler Ebene oder durch andere, bisher unbekannte Faktoren kontrolliert wird. Dies konnte durch die Identifizierung des transkriptionalen Regulators ebpR (ursprünglich ef1090; Bourgogne et al., 2007) bestätigt werden. ebpR-Deletionsmutanten von OG1RF zeigten eine verminderte Expression von ebpABC mit Folge des Verlusts der Pilus- Produktion sowie reduzierter Fähigkeit zur primären Anheftung und Biofilm-Bildung. Molekulare Regulationsanalysen ergaben zum einen, dass die Expression von ebpR Sigma A-unabhängig ist und ebpR autoaktiviert wird, zum anderen konnten aber trotz des Vorhandenseins eines funktionsfähigen ebpR bei der überwiegenden Anzahl der Zellen keine Pili an deren Oberfläche nachgewiesen werden. Somit wird vermutet, dass ebpR und/oder ebpABC durch andere regulatorische Wege beeinflusst werden und/oder diese selbst andere Faktoren beeinflussen. 1.3.4.5 Weitere an der Biofilm-Bildung beteiligte Faktoren Hufnagel et al. (2004) haben einen Zucker-bindenden Transkriptionsregulator identifiziert, der Bestandteil eines Operons ist, das bop (biofilm on plastic surfaces) genannt wurde. Der Regulator bopD ist Teil des Clusters, das aus vier Genen besteht (bopA-bopD). Aus dem starken Biofilm-Bildner E. faecalis Type 9 (T9) wurde mittels Transposonmutagenese eine bopB-Mutante (Stamm 10D5) generiert, die eine signifikant reduzierte Fähigkeit zur Biofilm- Bildung zeigte. REM-Aufnahmen demonstrierten, dass der Stamm 10D5 einschichtig auf Polystyrol-Flächen wuchs, jedoch die mehrschichtige Ausbildung eines Biofilms vermissen ließ. Somit schien diese Mutante einen Defekt zur Bildung von Mikrokolonien während der zweiten Phase der Biofilm-Bildung (sekundäre Anheftung) aufzuweisen. Außerdem könnte die zugeordnete Funktion (Zucker-bindender Transkriptionsregulator) des bopD-codierten Proteins die Abhängigkeit der Fähigkeit zur Biofilm-Bildung von spezifischen Kohlenhydrat- Quellen im Medium erklären. Das Gen bopD zeigt Sequenzhomologie mit dem ccpA Gen von E. faecalis, welches in den Kohlenhydratmetabolismus involviert ist. Von derartigen Katabolitrepressionsproteinen wie CcpA ist bekannt, dass sie die Transkription mehrerer Promotoren regulieren (Bruckner & Titgemeyer, 2002) und somit an der Regulation vieler Gene, die u.a. die Produktion von Biofilm-Bildung beeinflussen könnten, beteiligt sind. In derselben Studie (Hufnagel et al., 2004) wurde eine Deletionsmutante (T9-TDM) erzeugt, bei der ein Teil von bopA, das gesamte Gen bopB und ein Teil von bopC deletiert war. Im Gegensatz zu der Insertion bei der Transposon-Mutante erhöhte diese nicht-polare Deletion die Biofilm-Bildung signifikant im Vergleich zum Wildtyp OG1RF bei Wachstum in Gegenwart von 1 % Glukose. In Gegenwart von 1 % Maltose war die Transposon-Mutante hingegen in höherem Maße als der Wildtyp zur Biofilm-Bildung befähigt, während die Deletionsmutante einen Biofilm-negativen Phänotyp aufwies (Creti et al., 2006). Einleitung 29 Oberflächenmoleküle wie D-Alanin-Lipoteichonsäure (LTA) haben verschiedene Funktionen in Gram-positiven Bakterien, z.B. die Aufrechterhaltung kationischer Homöostase oder die Modulation autolytischer Aktivität (Neuhaus & Baddiley, 2003). Die Inaktivierung des dltA Gens, welches für eine D-Alanin-D-Alanyl-Ligase codiert, führte bei einem klinischen Isolat von E. faecalis zu einer signifikant reduzierten Fähigkeit zur Biofilm-Bildung sowie verminderter Adhäsionsfähigkeit an eukaryotischen Zellen (Fabretti et al., 2006). Dies war zurückzuführen auf einen Verlust von D-Alanin-Estern in der Teichonsäure, was in einer erhöhten negativen Gesamtladung der bakteriellen Oberfläche resultierte. In einer anderen Untersuchung hingegen konnte bei einer dltA-Mutante des Stamms OG1RF kein Unterschied in der Fähigkeit zur Biofilm-Bildung im Vergleich zum Wildtypstamm festgestellt werden (Mohamed et al., 2004). Dieselbe Studie, die als erstes den Einfluss mehrerer Gene auf die Biofilm-Bildung bei E. faecalis belegte, zeigte signifikante Unterschiede in der Fähigkeit zur Biofilm-Bildung sowie zur primären Anheftung bei Disruptionsmutanten von OG1RF, bei denen die Gene epa, atn, fsrA, fsrB, fsrC und gelE inaktiviert wurden. Außerdem ergab die Untersuchung mehrerer beschriebener Mutanten, bei denen bekannte Zwei-Komponenten- Regulationssysteme beeinflusst waren (Teng et al., 2002), bei fünf Stämmen keine veränderte Biofilm-Bildungsfähigkeit; allerdings zeigte eine etaR Mutante eine geringe (~ 8 %), aber dennoch signifikante Änderung diesbezüglich (Mohamed et al., 2004). Bei der Autolysin-Mutante (atn) konnte eine Reduzierung des gebildeten Biofilms um 30 % nachgewiesen werden. Die Mutante, bei der der open reading frame orfde4 als Bestandteil des epa (enterococcal polysaccharide antigen) Genclusters inaktiviert wurde, zeigte eine um 73 % verminderte Biofilm-Bildungsfähigkeit. Mohamed et al. (2006) stellten bei einer salB-Disruptionsmutante des Stamms OG1RF eine Reduzierung der Biofilm-Produktion in TSBG-Medium um 54 % fest, eine salA-Mutante zeigte ebenfalls eine geringe Abnahme (~ 8 %) im Vergleich zum Wildtyp. In elektronenmikroskopischen Aufnahmen war außerdem bei der Mutante mit Defekt im salB Gen (secretory antigen-like) eine abnormale Zellform und Zelloberfläche zu beobachten. Die beiden Gene wiesen Sequenzhomologie zu einem in E. faecium bekannten Gen (sagA) auf, welches für ein sekretiertes Antigen codiert, das die Fähigkeit zur Bindung an ein breites Spektrum von Proteinen der extrazellulären Matrix (ECM) vermittelt (Teng et al., 2003). Somit wurde eine ähnliche Funktion von salA und/oder salB in E. faecalis vermutet. Die salB- Mutante zeigte aber eine erhöhte Fähigkeit zur Bindung an Fibronektin (FN) und Kollagen Typ I (CI) sowie zur Biofilm-Bildung, wenn der Stamm in TSBG mit 10 % Pferdeserum oder mit Fibronektin angezogen wurde. Daher scheint zum einen die Abwesenheit von SalB die Fähigkeit zur Adhärenz an FN und CI sowie zur Biofilm-Bildung zu erhöhen, zum anderen scheint Serum und Fibronektin in der salB-Mutante eine starke Biofilm-Bildung auszulösen. Einleitung 30 Dieser Effekt war bei der salA-Mutante und beim Wildtyp OG1RF nicht zu beobachten. Folglich könnte unter bestimmten Bedingungen auch in vivo die salB-Expression herunter reguliert werden und die Anheftung an FN/CI ermöglichen sowie eine Serum-ausgelöste Erhöhung der Biofilm-Bildung nach sich ziehen. Ein weiterer Mechanismus, der möglicherweise die Biofilm-Bildung bei E. faecalis beeinflussen könnte, wird „positive Kooperativität“ genannt (Waar et al., 2002b). Dies bedeutet, dass die Adhäsion von Bakterienzellen die Wahrscheinlichkeit zur Adhäsion weiterer Bakterien in der Nähe dieser Zellen erhöht. Erklärungen hierzu basieren auf der Hypothese, dass die Stärke der Interaktionskräfte zwischen adhärierenden Zellen höher ist als die Kräfte zwischen adhärierenden Zellen und dem Substrat sowie zwischen Zellen in Suspension. Dieses Phänomen wurde z.B. bereits für Oral-Streptokokken beschrieben (Van der Mei et al., 1993). Die Autoren untersuchten die Kinetik der Adhäsion bestimmter E. faecalis Stämme an hydrophoben Materialien (Silikon, Fluoro-Ethylen-Propylen und Polyethylen) aus denen üblicherweise Drainageröhrchen für Gallenflüssigkeit bestehen. Es zeigte sich, dass die Stämme, die die Aggregationssubstanzen Asa1 und Asa373 exprimierten, in größerer Anzahl aufgrund von „positiver Kooperativität“ anhefteten. Stämme, die lediglich Esp-positiv waren, adhärierten ebenfalls, allerdings nicht mit Hilfe dieses Mechanismus, sondern als Resultat der starken Interaktionskräfte mit dem Substrat. Einleitung 31 1.4 Die Bakterielle Vaginose: das Enigma und die Biofilm-Bildung 1.4.1 Krankheitsbild der Bakteriellen Vaginose Die vaginale Normalflora der gesunden Frau besteht überwiegend (ca. 95 %) aus verschiedenen Lactobacillus (L.) spp., wie L. crispatus, L. gasseri, L. jensenii und L. iners (Tamrakar et al., 2007), die Wasserstoffperoxid (H2O2) und Milchsäure produzieren. Dadurch wird der pH-Wert des Scheidenmilieus auf unter 4,5 reduziert und einer Besiedlung durch pathogene Keime des Gastrointestinaltrakts vorgebeugt. Diese Flora wird nach dem deutschen Gynäkologen Albert S. G. Döderlein (1860-1941) auch als Döderlein-Flora, die Milchsäurebakterien (Lactobacillus spp.) entsprechend als Döderlein-Stäbchen bezeichnet. Die Bakterielle Vaginose (BV) ist die häufigste mikrobiologische Störung des Scheidenmilieus bei Frauen im geschlechtsreifen Alter, wobei die Prävalenz zwischen 5 % bei Frauen, die zur Vorsorgeuntersuchung kommen, und über 30 % bei Frauen liegt, die in einer Klinik für sexuell übertragene Erkrankungen betreut werden. In der Schwangerschaft beträgt die Häufigkeit der BV ca. 10-20 % (Eschenbach et al., 1988). Etwa die Hälfte der erkrankten Frauen klagen über charakteristische Symptome wie vermehrtem Fluor, der einen fischigen Geruch aufweist, wohingegen viele Patientinnen mit einer BV sich in ihrem Wohlbefinden nicht beeinträchtigt fühlen (Klebanoff et al., 2004). Anfänglich wurde der von Herman L. Gardner und Charles D. Dukes erstmals beschriebene Keim Haemophilus vaginalis, inzwischen umbenannt in Gardnerella (G.) vaginalis (Greenwood & Pickett, 1980), als alleinige Ursache der BV angesehen, da dieser Keim bei 92 % aller Frauen mit dieser Erkrankung nachweisbar ist (Gardner & Dukes, 1955). Mittlerweile ist jedoch bekannt, dass dieses Bakterium bei bis zu 40 % asymptomatischer Frauen nachgewiesen werden kann. Eine Übertragung des Keims durch Geschlechtsverkehr gilt als wahrscheinlich (Elsner & Hartmann, 1987). G. vaginalis ist je nach Umweltbedingungen ein kokkoides bis langgestrecktes Gram-variables, anaerobes Stäbchen, das als einzige Art dieser Gattung nur beim Menschen (Vagina, gelegentlich in Urethra des Mannes und im Darm) in geringen Keimzahlen als Kommensale vorkommt. Die BV ist charakterisiert durch eine pH-Wert-Erhöhung sowie durch eine deutliche Verschiebung der Vaginalflora zu anaeroben Mikroorganismen, wie Bacteroides spp., Prevotella spp., Mobiluncus spp. und Peptostreptokokken unter Reduzierung der Anzahl der fakultativ anaeroben Flora, insbesondere der Lactobacillus spp. Es kommt somit zu einer charakteristischen Konzentrationsveränderung der in der Vagina vorhandenen Keime. G. vaginalis lässt sich mit etwa 107/ml Vaginalsekret nachweisen, im Vergleich zu 105/ml bei nicht erkrankten Frauen. Andere anaerobe Keime vermehren sich sogar von 104/ml auf 107/ml. H2O2-produzierende Lactobacillus spp. haben bei Frauen mit BV nur noch einen Anteil von 10 %, während der Anteil anaerober, nicht H2O2-produzierender Stämme dagegen 40 % beträgt (Eschenbach et al., 1989). Auch Mycoplasma hominis tritt häufiger und in Einleitung 32 höherer Konzentration bei Frauen mit BV auf. Ein weiterer Keim, der offensichtlich eine entscheidende Rolle bei der BV spielt, ist der Gram-positive, kokkenförmige Anaerobier Atopobium vaginae (Rodriguez-Jovita et al., 1999), da dieses Bakterium in mitunter neusten, molekularen Untersuchungen auffällig häufig zusammen mit G. vaginalis bei BV nachgewiesen wurde (Fredricks et al., 2005; Bradshaw et al., 2006; De Backer et al., 2007). Vermehrte Leukozytenzahlen und nennenswerte Infektionszeichen der Vagina fehlen allerdings, so dass keine Kolpitis vorliegt. Somit handelt es sich bei der BV um eine mikrobiologische Dysbalance, auch Dysbiose genannt. 1.4.2 Diagnose und Therapie Die Diagnose BV gilt in der gynäkologischen Praxis als gesichert, wenn mindestens drei der folgenden vier Befunde erhoben werden können (nach Amsel et al., 1983): • Auftreten von dünnflüssigem, homogenen grau-weißen Fluor • pH-Wert des Vaginalsekrets > 4,5 • Positiver „Whiff“-Test (Amin-Geruch nach Alkalisierung durch Zugabe von 10 %iger KOH-Lösung) • Beobachtung von „Schlüsselzellen“ (Clue Cells) bei mindestens 20 % der Epithelzellen im Nativpräparat des Vaginalsekrets Clue Cells sind abgeschilferte Vaginalepithelzellen, an die Bakterien der Scheidenflora adhäriert sind. G. vaginalis gilt lediglich als Leitkeim der BV, da er in der überwiegenden Anzahl der Erkrankungen nachgewiesen werden kann. Zusätzlich sollte die Diagnose einer BV nach Nugent et al. (1991) mit Hilfe eines Gram- Präparats der Scheidenflüssigkeit gestellt werden. Hierbei wird bei 1000facher Vergrößerung die Anzahl der Lactobacillus spp., der Gram-negativen bis Gram-variablen kurzen Stäbchen (G. vaginalis, Prevotella spp., Bacteroides spp. etc.) sowie der Gram-negativen, kommaförmigen Mobiluncus spp. bewertet und als bestimmter Score angegeben (Tab. 3). Dabei wird ein Gesamt-Score von 0-3 als Normalflora und ein Score von 7-10 als Bakterielle Vaginose bewertet. Die Bedeutung des unscharf definierten, intermediären Scores von 4-6 ist klinisch unklar, stellt aber möglicherweise ein Vorstadium einer BV oder anderer Störungen des Scheidenmilieus dar (Mendling et al., 2006). Einleitung 33 Tab. 3 Score-System nach Nugent et al. (1991) zur Bewertung Gram-gefärbter Vaginalsekrete Die Bewertung erfolgt anhand der durchschnittlichen Anzahl der bei 1000facher Vergrößerung (Ölimmersion) pro Gesichtsfeld gezählten Bakterienzellen. Dabei gilt: 0 = nicht nachweisbar; 1+ = Anzahl < 1; 2+ = Anzahl 1-4; 3+ = Anzahl 5-30; 4+ = Anzahl >30. Der Gesamt-Score zur Bewertung errechnet sich durch die Addition der Scores der aufgeführten Morphotypen. Gram-negative, kommaförmige Stäbchen gehen dabei weniger stark in die Berechnung des Gesamt-Scores ein. Score Gram-positive lange Stäbchen: Lactobacillus spp. Gram-negative bis Gram-variable kurze Stäbchen: Gardnerella spp. Bacteroides spp. Prevotella spp. Gram-negative kommaförmige Stäbchen: Mobiluncus spp. 0 4+ 0 0 1 3+ 1+ 1+ oder 2+ 2 2+ 2+ 3+ oder 4+ 3 1+ 3+ 4 0 4+ Die an BV erkrankten Frauen werden i.d.R. je nach individuell gelagertem Fall mit Metronidazol oder Clindamycin als Vaginalcreme bzw. oral in Tablettenform behandelt. Für die Wirksamkeit sonstiger Therapien, wie z.B. die Döderlein-Lyophilisat-Anwendung, gibt es keinen eindeutigen wissenschaftlichen Beleg und somit keine verfügbare Indikation. Auch für die routinemäßige Mitbehandlung des Sexualpartners gibt es keine ausreichende wissenschaftliche Basis (Martius & Hoyme, 2006). Allerdings scheint die zusätzliche Gabe eines Präparats aus zwei probiotischen Lactobacillus Stämmen nach erfolgreicher Therapie das Rekurrenz-Risiko signifikant zu erniedrigen (Larsson et al., 2008). 1.4.3 Ätiologie und Pathogenese der Bakteriellen Vaginose: neuste Erkenntnisse und mögliche Zusammenhänge Ein großes Problem bei der medizinischen Behandlung der BV ist, dass die Krankheit trotz korrekter Therapie häufig rezidiviert, was wiederum ein Hinweis auf ein begrenztes Verständnis der Ätiologie und Pathogenese dieser Erkrankung darstellt. Des Weiteren resultiert das Interesse am Verständnis der Krankheitsursachen und –entstehung aus Anzeichen auf die Assoziation der BV mit einem erhöhten Risiko zu anderen Erkrankungen oder Komplikationen. Der Zusammenhang zwischen BV und postoperativen gynäkologischen Infektionen, z.B. nach Hysterektomie oder Interruptio, scheint wissenschaftlich gesichert zu sein, währenddessen ein erhöhtes Risiko für entzündliche Beckenerkrankungen (PID; Endometritis, Salpingitis, Oophoritis) sowie für spontane Aborte fraglich ist (Larsson et al., 2005). In der Schwangerschaft erhöht die BV allerdings über eine aszendierende Infektion das Risiko für einen vorzeitigen Blasensprung, vorzeitige Wehen oder eine Frühgeburt (Martius & Hoyme, 2006). Außerdem besteht eine erhöhte HIV- Ansteckungs- und Übertragungsgefahr (Losikoff et al., 2007). Einleitung 34 Ob die BV eine sexuell übertragbare Krankheit, also eine exogene Infektion, oder endogenen Ursprungs ist, ist heute noch absolut ungeklärt. Scheinbar tragen mehrere, verschiedene Risikofaktoren zur Entstehung und Entwicklung dieser Erkrankung bei (Cherpes et al., 2008). Neuere Ergebnisse belegen den direkten Zusammenhang zwischen BV und Interleukin-1β- Werten, so dass durch genetisch bedingte Unterschiede in der Immunreaktion die mikrobielle Kolonisation der Vagina beeinflusst werden könnte (Macones et al., 2004). Durch die Anwendung der relativ neuen, kulturunabhängigen molekularen Methode der PCR-DGGE (Denaturierende Gradientengelelektrophorese), mit Hilfe derer die Identifizierung einer großen Anzahl an Bakterien-Spezies in einem komplexen Ökosystem und somit die Untersuchung dessen Zusammensetzung möglich ist, konnte die Diversität der vaginalen Mikroflora während einer BV gezeigt werden. Devillard et al. (2005) fanden bei einer Frau mit rezidivierender BV in einem Untersuchungszeitraum von sechs Wochen hauptsächlich pathogene Enterobacteriaceae (Escherichia coli, Morganella morganii u.a.), Staphylococcus epidermidis und Candida albicans. Die von Anukam & Reid (2007) durchgeführte Analyse der Vaginalfloren von 34 Frauen mit BV ergab die Identifizierung von Mycoplasma hominis in 35 % aller Proben sowie verschiedene andere Spezies wie unkultivierbare Streptococcus spp. In beiden Studien wurden Keime wie G. vaginalis, Prevotella spp. oder Mobiluncus spp., die regelmäßig mit BV assoziiert gefunden werden, nicht detektiert. In einer weiteren umfangreichen Studie wurde mittels Erstellung von 16S rDNA-Klon-Bibliotheken ebenfalls gezeigt, dass in der Vaginalflora der Frauen mit BV eine große Diversität von Mikroorganismen vorherrscht, u.a. wurden neben den häufig in Verbindung mit BV gebrachten Spezies auch zahlreiche unbekannte Bakterien entdeckt (Fredricks et al., 2005). Auch Swidsinski et al. (2005) konnten mittels FISH (Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung) mit 34 verschiedenen familien-, gattungs- und speziesspezifischen Sonden ein größeres Keimspektrum sowie höhere Konzentrationen bestimmter Bakterien bzw. Bakteriengruppen bei 20 untersuchten Frauen mit BV beschreiben. Herausragend war allerdings die Entdeckung eines adhärenten Biofilms, der nur bei den mit BV erkrankten Frauen auftrat und G. vaginalis als Hauptbestandteil (60–95 %) dieses Biofilms zeigte, was diesen Keim wieder mehr in den Fokus der Überlegungen zur Pathogenese der BV rückte. Somit scheint auch bei dieser häufigen Erkrankung die Biofilm-Bildung eine bedeutsame Rolle zu spielen. Unterstützt werden diese Beobachtungen von Untersuchungen, die eine Toleranz von G. vaginalis Biofilmen gegenüber einer fünffach erhöhten Konzentration an H2O2 und einer bis zu achtfach höheren Konzentration an Milchsäure im Vergleich zu einer planktonischen Kultur zeigten (Patterson et al., 2007). Folglich trägt die Biofilm-Bildung scheinbar zum Überleben von G. vaginalis bei gleichzeitiger Anwesenheit von Lactobacillus spp. bei. Auch im Hinblick auf die Therapie der BV wäre dies ein wichtiger Aspekt, denn eingesetzte Einleitung 35 Medikamente müssten demzufolge ebenfalls den Biofilm während der BV bekämpfen können (Swidsinski et al., 2008). Wie dieser Biofilm entsteht und welche Bakterien der Vaginalflora daran beteiligt sind, ist bisher unbekannt. Swidsinski et al. (2005) fanden neben G. vaginalis, Atopobium vaginae, Prevotella spp. und anderen Anaerobiern auch Staphylokokken, Streptokokken und Enterokokken, letztere in insgesamt 25 % der BV-positiven Proben. Enterokokken werden in der gesunden Vaginalflora als natürliche Kommensalen betrachtet und somit bei routinemäßigen diagnostischen Untersuchungen von Vaginalabstrichen regelmäßig isoliert. Ob sie auch in einer gestörten Flora nur ein kommensaler Bestandteil sind oder aber bei der Entstehung einer mikrobiellen Störung des Scheidenmilieus aufgrund ihrer opportunistischen Pathogenität eine Rolle spielen, wurde bisher kaum untersucht. Auch können Enterokokken die Ursache vaginaler Infektionen (Vaginitis) sein, deren Ausgangspunkt möglicherweise eine vaginale Dysbiose ist. Ein möglicher Einfluss von Enterokokken auf die Vaginalflora und somit eine potenzielle Bedeutung für die Pathogenese der BV wurde jedoch von Kelly et al. (2003) durch die Isolierung eines E. faecium Stammes, der eine Lactobacillus spp. inhibierende, bacteriocin-ähnliche Substanz produziert, postuliert. Die Autoren halten es für möglich, dass bacteriocin-produzierende Enterokokken-Stämme antagonistisch auf das Wachstum vaginaler Lactobacillus spp. wirken und somit zur Etablierung der BV-assoziierten Mikroflora beitragen, insbesondere nach antibiotischer Behandlung mit Clindamycin, die zu einer Persistenz und vermehrtem Wachstum v.a. der intrinsisch resistenten E. faecalis führt. Auch von De Kwaadsteniet et al. (2006) konnte ein Bacteriocin, produziert von einem aus Vaginalsekret isolierten E. faecium Stamm, charakterisiert werden, das Aktivität gegenüber eines Lactobacillus spp. Isolats zeigte. Des Weiteren existieren nur vereinzelt Erkenntnisse über die Inzidenz von Virulenzfaktoren und Biofilm-Bildung bei vaginalen Enterokokkenstämmen (z.B. Creti et al., 2004) im Vergleich zu Isolaten aus Faeces oder anderem Untersuchungsmaterial, so dass potentielle Zusammenhänge bislang nicht erfasst werden konnten. Ziele der Arbeit 36 2 Ziele der Arbeit In der vorliegenden Arbeit wurden Enterokokken-Stämme aus unterschiedlichen klinischen Bereichen auf ihre Fähigkeit zur Biofilm-Bildung und das Vorhandensein von verschiedenen Virulenzfaktoren untersucht. Einen Schwerpunkt bildete die Erforschung eines Kollektivs bestehend aus einer größeren Anzahl an E. faecalis Isolaten aus Vaginalabstrichen. Insbesondere sollten erstmals Stämme untersucht werden, die von Patientinnen mit positivem Befund bzgl. der Krankheit Bakterielle Vaginose stammten. Hauptziele dieser Arbeit waren • der Nachweis und der Vergleich des Vorkommens von Biofilm-Bildung und bestimmten Virulenzfaktoren bei Isolaten aus verschiedenem klinischen Material, insbesondere bei E. faecalis aus Vaginalabstrichen, • der Vergleich von E. faecalis Stämmen, die aus Vaginalabstrichen von Patientinnen mit der Diagnose der Bakteriellen Vaginose kultiviert wurden, und Isolaten von Patientinnen mit negativem Befund bzgl. der Bakteriellen Vaginose, sowie • die Untersuchung der Korrelation von Biofilm-Bildungsfähigkeit der Isolate und dem Vorkommen bestimmter Virulenzfaktoren, um Rückschlüsse zum Einfluss dieser Faktoren auf den Prozess der Biofilm-Bildung und dessen molekularen Mechanismus zu ziehen. Basierend auf im Verlauf der Arbeit gewonnenen Ergebnissen, die mit denen anderer Forschergruppen übereinstimmen, wurde deutlich, dass mehrere Faktoren an der Bildung von Biofilmen bei E. faecalis beteiligt sind und folglich verschiedene molekulare Mechanismen existieren müssen. Daher sollte in einem zweiten Teil der vorliegenden Arbeit mittels der Erzeugung von Spontanmutanten die Identifizierung neuer, potenzieller Einflussfaktoren auf die Biofilm-Bildung bei E. faecalis ermöglicht werden. Material und Methoden 37 3 Material und Methoden 3.1 Geräte und Zubehör Autoklaven und Sterilisaton / Trocknung Laborautoklav DANN 4-5-6 Zirbus, Osterode / Harz Tisch-Autoklav DANN 250 Zirbus, Osterode / Harz Trocknungschrank UE300 Memmert GmbH, Schwabach Inkubation Brutschrank Modell 500 Memmert GmbH, Schwabach Brutschrank Typ U30 Memmert GmbH, Schwabach Brutraum Kälte-Hunke, Bonn Wasserbad Thermo Haake, Karlsruhe Thermoblock Thermolyne/Sybron (Dubuque, USA) Anaerobentopf (GasPak®System) BD Diagnostics, Heidelberg Kühlung und Gefrieren Kühlzelle Typ 60/215 Viessmann, Hof /Saale Gefrierschrank öko super Liebherr-Hausgeräte, Ochsenhausen Kühlschrank Liebherr-Hausgeräte, Ochsenhausen Stickstoffbehälter Messer, Griesheim (Abteilung Genetik) Zentrifugen Kühlzentrifuge Sigma 3K30 Sigma Laborzentrifugen, Osterode / Harz Tischzentrifuge Sigma Laborzentrifugen, Osterode / Harz Untertischzentrifuge Beckmann Coulter, Unterschleißheim PCR-Cup Minizentrifuge ABImed, Langenfeld Thermocycler Primus 25 MWG Biotech, Ebersberg Primus 96 plus MWG Biotech, Ebersberg Geldokumentation UV-Transilluminator TFL-35M Appligene, Illkirch (Frankreich) Kamera Intas, Göttingen PC incl. Software Intas, Göttingen Drucker Modell P93DW Mitsubishi Electric Corporation Elektrophorese Minigel-Elektrophoresekammer Renner, Dannstadt Horizontalgel-System Eigenbau Abt. Mikrobiologie RTF Trennstelltrafo LTS 002 VEB, Thalheim Power Supply A011 H. Hölzel, Dorfen SDS-Gelsystem Mini PROTEAN 3 Cell Bio-Rad Laboratories, München Power Supply PowerPac 300 Bio-Rad Laboratories, München Sonstige Geräte Gilson-Pipetten (5 ml, 1000 µl, 200 µl, 20 µl, 10 µl) ABImed, Langenfeld Multipipette DV8-200 (200 µl; 8-Kanal) ABImed, Langenfeld Analysewaage BA 110 S Sartorius, Göttingen Präzisionswaage BA 610 Sartorius, Göttingen pH-Meter WTW, Weilheim Spektralphotometer Uvikon 930 Kontron Instruments, Eching Material und Methoden 38 Phasenkontrastmikroskop BH 2 Olympus, Hamburg Sicherheitswerkbank ASW-UP IV-1906 Bleymehl Reinraumtechnik, Inden Eismaschine Ziegra, Isernhagen Magnetrührer IKAMAG REO IKA Labortechnik, Staufen ELISA-Washer Sigma, Deisenhofen FastPrep FP120 Bio101 Savant Instruments, New York SpeedVac UniVapo 100H Concentrator UniEquip, Martinsried Vortex VF 2 IKA Labortechnik, Staufen Schüttler: Mixer 5432 Eppendorf, Hamburg Tisch-Rundschüttler Infors AG, Bottmingen (Schweiz) Mikrowelle Lloyds 3.2 Verbrauchsmaterial Petrischalen (steril) Sarstedt, Nümbrecht 96well Mikrotiterplatten (PS, steril, mit Deckel) Sarstedt, Nümbrecht Reaktionsgefäße (1,5 ml, 2 ml) Sarstedt, Nümbrecht Pipettenspitzen (1000 µl, 200 µl, 10 µl) Sarstedt, Nümbrecht PCR Tubes (DNase-/RNase-frei; 200 µl) Sarstedt, Nümbrecht PCR Filter-Tips (1000 µl, 100 µl, 10 µl; DNase-/RNase-frei) Sarstedt, Nümbrecht Schraubdeckelröhrchen (50 ml, 15 ml; steril) Sarstedt, Nümbrecht Silicatperlen (Ø 0,17-0,18 mm) B. Braun, Melsungen Sterilfilter (Porengröße 0,2 µm) Sarstedt, Nümbrecht Spritzen Terumo, Eschborn Kanülen Sarstedt, Nümbrecht Einmal-Küvetten Sarstedt, Nümbrecht Mikro-Schraubröhrchen (2 ml; steril; PP) Sarstedt, Nümbrecht Einmal-Impfösen (10 µl, 1 µl) Sarstedt, Nümbrecht Infusionswasser (A. ad iniectabilia, steril) B. Braun, Melsungen HyPureTM Molecular Biology Grade Water HyClone, Utah (USA) 3.3 Chemikalien Acridinorange AppliChem, Darmstadt Agarose NEEO Ultra Qualität Roth, Karlsruhe APS (Ammoniumpersulfat) Sigma-Aldrich, Taufkirchen Bromphenolblau Sigma-Aldrich, Taufkirchen BSA (bovine serum albumin) Serva, Heidelberg Coomassie Brilliant Blue G250 / R250 Sigma-Aldrich, Taufkirchen EDTA Roth, Karlsruhe Ethidiumbromid Sigma-Aldrich, Taufkirchen DEPC AppliChem, Darmstadt D-Glucose Sigma-Aldrich, Taufkirchen Glutardialdehyd Roth, Karlsruhe Kristallviolett AppliChem, Darmstadt MOPS Roth, Karlsruhe Osmiumtetroxid Roth, Karlsruhe PMSF Serva, Heidelberg RNase-ExitusPlus-Lösung AppliChem, Darmstadt SDS (sodium dodecyl sulfate) Roth, Karlsruhe TEMED Roth, Karlsruhe Alle übrigen Chemikalien wurden in p.a. Qualität von Merck (Darmstadt) bezogen. Material und Methoden 39 3.4 Nährmedien und Zusätze Sofern nicht anders angegeben wurden Substanzen oder Zusätze zur Herstellung von (speziellen) Nährmedien von der Firma Roth (Karlsruhe) bezogen. 3.4.1 Fertignährmedien Die Zusammensetzung folgender verwendeter Fertignährmedien (Granulate) sind den Angaben des Herstellers zu entnehmen, sie wurden diesen entsprechend zubereitet. Brain-Heart-Infusion (BHI) Merck, Darmstadt / Roth, Karlsruhe Columbia-Blutagar BD Diagnostics, Heidelberg Iso-Sensitest-Medium Oxoid, Wesel Kanamycin-Äsculin-Azid-Agar Merck, Darmstadt Man-Rogosa-Sharpe-Medium (MRS) Roth, Karlsruhe / AppliChem, Darmstadt Mueller-Hinton-Medium Merck, Darmstadt Phenolrot-Bouillon Merck, Darmstadt TSB BD Diagnostics, Heidelberg THB Roth, Karlsruhe 3.4.2 Medien für spezielle Nachweise Gelatinase-Agar Hefe-Extrakt 2,0 g/l Pepton aus Casein 5,0 g/l NaCl 5,0 g/l Gelatine 30,0 g/l Agar-Agar 15,0 g/l Eingewogene Komponenten mit A. bidest versetzen und unter Rühren bei 50°C im Wasserbad vollständig lösen, den pH-Wert auf 7,4 ± 0,2 einstellen und autoklavieren (121°C, 15 min). Platten innerhalb einer Woche verwenden. TMB-Medium (Eschenbach et al., 1989) Basis: MRS-Agar 1 l TMB 250 mg/l Horseradish Peroxidase 10 mg/l Tributyrat-Agar Fleischpepton 2,5 g/l Caseinpepton 2,5 g/l Hefe-Extrakt 3,0 g/l Agar-Agar 12,0 g/l Tributyrat 10 ml/l Den pH-Wert auf 7,5 ± 0,2 einstellen und Medium autoklavieren (121°C, 15 min). Danach unter ständigem Rühren auf 50°C abkühlen, so dass das Tributyrat vor dem Giessen gut gelöst ist und die Platten eine gleichmäßige Trübung aufweisen. Material und Methoden 40 3.4.3 Zusätze und sonstige Materialien α-Methyl-Glucopyranosid Sigma-Aldrich, Taufkirchen Agar-Agar AppliChem, Darmstadt Defibriniertes Pferde- oder Schafblut Oxoid, Wesel D-Ribose Sigma-Aldrich, Taufkirchen Anaerocult© C Merck, Darmstadt Gelatine BD Diagnostics, Heidelberg Horseradish Peroxidase Sigma-Aldrich, Taufkirchen L-Arabinose Sigma-Aldrich, Taufkirchen L-Sorbose Sigma-Aldrich, Taufkirchen TMB (3,3´-5,5´-Tetramethylbenzidin) Sigma-Aldrich, Taufkirchen Tributyrin Acros Organics, Geel (Belgien) 3.5 Antibiotika Alle Antibiotika (Tab. 4) wurden mit Ausnahme von Teicoplanin (Sanofi-Aventis, Frankfurt/Main) von der Firma Sigma-Aldrich (Taufkirchen) bezogen. Die jeweils hergestellten Antibiotika-Stammlösungen wurden sterilfiltriert und den abgekühlten Medien nach dem Autoklavieren in entsprechender Konzentration zugesetzt. Alle Antibiotikatestblättchen (Tab. 5) wurden von der Firma Oxoid (Wesel) bezogen. Tab. 4 Verwendete Antibiotika Name Abkürzung Breakpiont- Konzentration [µg/ml] Ampicillin AMP 2 / 8 Ciprofloxacin CIP 1 / 2 Erythromycin E 1 / 4 Gentamycin GM 500 (HLR) Streptomycin SM 1000 (HLR) Teicoplanin TEC 8 / 16 Tetracyclin TC 1 / 4 Vancomycin VA 4 / 8 Tab. 5 Verwendete Antibiotikatestblättchen Name Abkürzung Konzentration [µg] Ampicillin AMP 10 Ciprofloxacin CIP 5 Doxycyclin DO 30 Erythromycin E 15 Ofloxacin OFX 5 Synercid (Quinupristin/Dalfopristin) QD 15 Rifampicin RD 2 Teicoplanin TEC 30 Vancomycin VA 30 Material und Methoden 41 3.6 Puffer und Lösungen 3.6.1 Elektrophoresen und Gel-Färbelösungen TAE-Puffer (50 x) Tris-Base 242 g/l Eisessig 57,1 ml/l EDTA-Lösung (0,5 M, pH 8,0) 100 ml/l TBE-Puffer (10 x) Tris-Base 108 g/l Borsäure 55 g/l EDTA-Lösung (0,5 M, pH 8,0) 40 ml/l DNA-Probenladepuffer Glycerin 50 % (v/v) Bromphenolblau 0,2 % (w/v) EDTA-Lösung (0,5 M, pH 8,0) 15 % (v/v) MOPS-Puffer (10 x, pH 7,0) MOPS 200 mM NaCH3COO x 3 H2O 50 mM EDTA 10 mM Mit DEPC-behandeltem A. bidest ansetzen und lichtgeschützt bei 4°C aufbewahren. RNA-Probenladepuffer (5 x) MOPS-Puffer (10 x) 40 % (v/v) Glycerin 20 % (v/v) EDTA (0,5 M, pH 8,0) 0,8 % (v/v) Formaldehyd (37 %) 7,2 % (v/v) Formamid 30,84 % (v/v) Bromphenolblau 0,2 % (w/v) Mit DEPC-behandeltem A. bidest die entsprechende Menge auffüllen, ca. 3 Monate bei 4°C haltbar. DEPC-behandeltes Wasser 0,1 % (v/v) DEPC in A. bidest geben, stark schütteln und ÜN bei RT inkubieren, am folgenden Tag zur Inaktivierung von DEPC autoklavieren. Ethidiumbromid-Färbelösung 1 mg/l Ethidiumbromid in A. bidest, lichtgeschützt lagern. SDS-Elektrophoresepuffer (1 x) Tris-Base 25 mM Glycin 192 mM SDS 0,1 % (w/v) Material und Methoden 42 SDS-Trenngelpuffer (4 x, pH 8,8) Tris/HCl 1,5 M SDS 0,8 % (w/v) SDS-Sammelgelpuffer (4 x, pH 6,8) Tris/HCl 0,5 M SDS 0,8 % (w/v) Acrylamid-Stammlösung (30 %) Acrylamid 29,2 % (w/v) N,N-Methylen-Bisacrylamid 0,8 % (w/v) Lösung bei 4°C lichtgeschützt maximal 30 Tage aufbewahren. SDS-Probenladepuffer (4 x, pH 6,8) Tris-Base 0,25 M SDS 8 % Glycerin 50 % β-Mercaptoethanol 10 % EDTA 4 mM Bromphenolblau 0,01 % Coomassie-Färbelösung (kolloidal) Coomassie Brilliant Blue R250 0,1 % (w/v) H3PO4 (85 %) 2,0 % (v/v) AlSO4 x 18 H2O 5 % (w/v) 23,5 ml Phosphorsäure und 50 g Aluminiumsulfat in 800 ml A. bidest lösen. 1 g Coomassie Brilliant Blue R250 in 20 ml A. bidest lösen und 30 min rühren, diese Lösung dann langsam zur Aluminiumsulfat-Lösung tropfen und auf 1 l auffüllen. Färbelösung nicht filtrieren. Vor Anfärbung die PA-Gele gut wässern (90 s in A. bidest erhitzen, 10 min bei RT inkubieren). Die Färbelösung ist mehrmals verwendbar, wenn sie nicht erhitzt wurde. So angefärbte PA- Gele müssen nicht entfärbt werden. 3.6.2 Gesamt-DNA-, Plasmid-DNA- und Gesamt-RNA-Isolierung Natriumphosphat-Puffer (0,1 M, pH 8,0, 200 ml) Na2HPO4 x 2 H20 (0,2 M) 94,7 ml NaH2PO4 (0,2 M) 5,3 ml A. bidest 100 ml TE-Puffer (pH 8,0) Tris/HCl 10 mM EDTA 1 mM RNase A 10 mg/ml in TE-Puffer (pH 8,0) lösen und zur Inaktivierung von DNasen 15 min kochen, bei -20°C lagern. Material und Methoden 43 TERMLS-Puffer (Resuspensions- und Lyse-Puffer, 10 ml) Tris/HCl (100 mM, pH 8,0) 2,5 ml EDTA (0,5 M, pH 8,0) 0,2 ml D-Saccharose 2 g Lysozym 0,15 g Mutanolysin 1000 U RNase A (10 mg/ml) 25 µl A. bidest 7,3 ml Puffer P2 (Lyse-Puffer) NaOH 200 mM SDS 1 % (w/v) Puffer P3 (Neutralisationspuffer, pH 5,5) KCH3COO 3 M Puffer QBT (Äquilibrierungspuffer, pH 7,0) NaCl 750 mM MOPS 50 mM Isopropanol 15 % (v/v) Triton X-100 0,15 % (v/v) Puffer QC (Waschpuffer, pH 7,0) NaCl 1M MOPS 50 mM Isopropanol 15 % (v/v) Puffer QF (Elutionspuffer, pH 8,5) NaCl 1,25 M Tris/HCl 50 mM Isopropanol 15 % (v/v) 3.6.3 Sonstige Puffer und Lösungen PBS-Puffer (10 x, pH 7,4) NaCl 80,0 g/l KCl 2,0 g/l Na2HPO4 x 2 H2O 17,8 g/l KH2PO4 2,4 g/l PUM-Puffer (pH 7,1) K2HPO4 x 3 H2O 22,2 g/l KH2PO4 7,26 g/l Urea 1,8 g/l MgSO4 x 7 H2O 0,2 g/l Hucker´s Crystal Violet-Färbelösung (100 ml, 2 %) Lösung 1: 20 ml Kristallviolett-Lösung (10 % in 96%igem EtOH) Lösung 2: 80 ml Ammoniumoxalat-Lösung (1 % in A. bidest) 48 h vor Gebrauch Lösung 1 und Lösung 2 mischen. Material und Methoden 44 Bradford-Reagenz Coomassie Brilliant Blue G250 10 % EtOH (95 %) 5 % H3PO4 (85 %) 10 % Coomassie Brilliant Blue G250 in EtOH lösen, Phosphorsäure zugeben und 1 h bei RT rühren. Reagenz filtrieren und im Dunkeln bei 4°C aufbewahren. Soerensen-Puffer (100 ml, pH 7,2) KH2PO4 (1 M) 2,74 ml Na2HPO4 x 2 H2O (1 M) 7,26 ml A. bidest 90 ml 3.7 Kits und sonstige kommerziell erhältliche Materialien Plasmid Midi Isolation Kit Qiagen, Hilden PCR Purification Kit Qiagen, Hilden Wizard® SV Gel and PCR Clean-up System Promega, Mannheim Wizard® SV Total RNA Isolation Kit Promega, Mannheim AccessQuick™ RT-PCR System Promega, Mannheim McFarland Standard System bioMérieux, Nürtingen API®50 CH System bioMérieux, Nürtingen Gram-Färbung Set Merck, Darmstadt DNA-Längenstandards MBI Fermentas, St. Leon-Rot GeneRulerTM DNA Ladder Mix (100-10000 bp) GeneRulerTM 1kb DNA Ladder (250-10000 bp) GeneRulerTM 50bp DNA Ladder (50-1031 bp) GeneRulerTM 100bp DNA Ladder plus (100-3000 bp) Protein-Längenstandards MBI Fermentas, St. Leon-Rot Prestained Molecular Weight Marker (19-117 kDa) PageRulerTMProtein Ladder (10-200 kDa) Precision Plus ProteinTMStandard (10-250 kDa) Bio-Rad Laboratories, München 3.8 Enzyme, PCR-Reagenzien und Primer dNTPs (je 100 µM Stock-Lösung) Roth, Karlsruhe; Invitrogen, Karlsruhe MgCl2 (25 mM) MBI Fermentas, St. Leon-Rot Taq-Puffer mit KCl (10 x, ohne MgCl2) MBI Fermentas, St. Leon-Rot Zusammensetzung: 100 mM Tris/HCl (pH 8,8) 500 mM KCl 0.8 % (v/v) Nonidet P40 Taq-Puffer (Standard, MgCl2-frei) New England Biolabs, Frankfurt a. M. Zusammensetzung: 100 mM Tris/HCl 500 mM KCl (pH 8,3) Taq-Polymerase MBI Fermentas, St. Leon-Rot; New England Biolabs, Frankfurt a. M.; eigene Aufreinigung (Engelke et al., 1990; Pluthero, 1993) Material und Methoden 45 Lysozym AppliChem, Darmstadt Mutanolysin Sigma-Aldrich, Taufkirchen DNase I (RNase-frei) MBI Fermentas, St. Leon-Rot RNase A Sigma-Aldrich, Taufkirchen Restriktionsendonukleasen MBI Fermentas, St. Leon-Rot; New England Biolabs, Frankfurt a. M. Primer (Tab. 6) Synthese von Invitrogen, Karlsruhe Tab. 6 Verwendete Primer Zielgen Primer Sequenz 5´Æ 3´ Position Referenz aacA-aphD1 TAA TCC AAG AGC AAT AAG GGC 2144–2164 aacA- aphD aacA-aphD2 GCC ACA CTA TCA TAA CCA CTA 2371–2350 Strommenger et al., 2003 aceB-for AAA ATG TGG AAA TGC CAA CAG AAG AAA GTC 986-1015 ace aceB-rev ATT TAA TTT TTG AAT TGG TTC ACT AAG CAG 1896-1867 Nallapareddy et al., 2000a ASA11 GCA CGC TAT TAC GAA CTA TGA 3205-3225 asa1 ASA12 TAA GAA AGA ACA TCA CCA CGA 3582-3562 Vankerckhoven et al., 2004; Galli et al., 1990 asa373-for GGA CGC ACG TAC ACA AAG CTA C 3094-3115 asa373 asa373-rev CTG GGT GTG ATT CCG CTG TTA 3713-3693 Creti et al., 2004 bee1 P101D12-2-for GAA CTC GAT TCT GAT ACG AAT GTC TTT AA 3114-3142 bee2 Bee12-for CGG ACA AAG AAT TAG CTA CCG TTC AC 3980-4005 bee3 P101D12-1-rev CAA GAT AAG CAT CTG TTA CAT CAT AGG CTG 4511-4482 Tendolkar et al., 2006 bee1- for2267 TAC TGT TTC TCT CAA AGA AGA G 2267-2288 bee1 bee1- rev3282 CAT CTT TTT GTT CTT TCC CAT C 3282-3261 diese Arbeit bopD-for GGC TTC CTC GTT GAT GGC TTC 736-756 bopD bopD-rev ACG GCA CGG AAT TTG GGT AAA C 862-839 Hufnagel et al., 2004 boxA BOXA2R ACG TGG TTT GAA GAG ATT TTC G 10-31 Malathum et al., 1998; Koeuth et al., 1993 CYT-I ACT CGG GGA TTG ATA GGC 425-442 cylA CYT-IIb GCT GCT AAA GCT GCG CTT 1112-1095 Vankerckhoven et al., 2004; Coque et al., 1995 E.fc-for ATC AAG TAC AGT TAG TCT TTA TTA G 98-123 ddlE.fc E.fc-rev ACG ATT CAA AGC TAA CTG AAT CAG T 1038-1014 Kariyama et al., 2000 Material und Methoden 46 Tab. 7 Verwendete Primer (Fortsetzung) Zielgen Primer Sequenz 5´Æ 3´ Position Referenz E.fm-for TTG AGG CAG ACC AGA TTG ACG 310-330 E.fm spezifisch E.fm-rev TAT GAC AGC GAC TCC GAT TCC 967-947 Kariyama et al., 2000; Cheng et al., 1997 EF1091MF1 AAT GTG TTA AAC CAT CAA GGG AAT 577-600 ebpA EF1091MR1 ACT CCT TTT TGA ACT TCA CCA ATC 878-855 Nallapareddy et al., 2006 EF0591-for CGG AAG TAT TGC GTT TGG TGG G 99-120 ef0591 EF0591-rev CGT CTG CTT TAA TAG ACC CCA G 1003-982 Creti et al., 2004 ESP12R AAT TGA TTC TTT AGC ATC TGG 1341-1362 (E.fc) 1455-1476 (E.fm) esp ESP14F AGA TTT CAT CTT TGA TTC TTG G 1851-1831 (E.fc) 1965-1945 (E.fm) Vankerckhoven et al., 2004 esp46 TTA CCA AGA TGG TTC TGT AGG CAC 2256-2279 espA esp47 CCA AGT ATA CTT AGC ATC TTT TGG 3192-3169 esp2 CAG ATG GAT CAT CTG ATG AAG T 3254-3275 espCfc esp5 GTA ACG TTA CTG TTA CAT CTG C 5359-5338 Shankar et al., 1999 TE98 AAA TCT GAC GCT GAC AAA TAT AAT CC 3433-3458 espCfm TE103 CTA TCA CTT TTG TCC CTG CCT C 5806-5785 Eaton & Gasson, 2002 ermB1 CAT TTA ACG ACG AAA CTG GC 836-855 ermB ermB2 GGA ACA TCT GTG GTA TGG CG 1260-1241 Jensen et al., 1999 GEL11 TAT GAC AAT GCT TTT TGG GAT 1145-1165 gelE GEL12 AGA TGC ACC CGA AAT AAT ATA 1357-1337 Vankerckhoven et al., 2004 HYLn1 ACA GAA GAG CTG CAG GAA ATG 1026-1046 hyl HYLn2 GAC TGA CGT CCA AGT TTC CAA 1301-1281 Vankerckhoven et al., 2004 rrs-for GGA TTA GAT ACC CTG GTA GTC C 796-817 16S rDNA rrs-rev TCG TTG CGG GAC TTA ACC CAA C 1117-1096 Kariyama et al., 2000 tetM1 AGT GGA GCG ATT ACA GAA 301–318 tetM tetM2 CAT ATG TCC TGG CGT GTC TA 459–440 Strommenger et al., 2003 Material und Methoden 47 Tab. 8 Verwendete Primer (Fortsetzung) Zielgen Primer Sequenz 5´Æ 3´ Position Referenz Sor1L-for GCC AAA GAT CCG GGT AAA GCC TAT TAT AAA GAG 6135-6167 Sor1R-rev CGG ACT AAG GTA AAA GTC ACG CCT GCT TTG GG 6784-6753 srt-1 (bee Locus) P101D12- 11-for CCC AAA GCA GGC GTG ACT TTT ACC TTA GTC CG 6753-6784 srt-2 (bee Locus) Sor2R-rev GCC CAA TTT CAA ACG ATA GCA ATC CCC TGG 8032-8003 Tendolkar et al., 2006 VanA-for CAT GAA TAG AAT AAA AGT TGC AAT A 130-154 vanA VanA-rev CCC CTT TAA CGC TAA TAC GAT CAA 1159-1136 Kariyama et al., 2000; Clark et al., 1993 VanB1/3-for AAG CTA TGC AAG AAG CCA TG 148-167 vanB VanB1/3-rev CCG ACA ATC AAA TCA TCC TC 683-664 Elsayed et al., 2001 VanC1-for GGT ATC AAG GAA ACC TC 246-272 vanC1 VanC1-rev CTT CCG CCA TCA TAG CT 1067-1051 Kariyama et al., 2000; Dutka-Malen et al., 1995 VanC2/3-for CGG GGA AGA TGG CAG TAT 350-367 (vanC2) 343-360 (vanC3) vanC2/3 VanC2/3-rev CGC AGG GAC GGT GAT TTT 833-816 (vanC2) 826-809 (vanC3) Kariyama et al., 2000; Satake et al., 1997 VNTR1-for CTG TGA TTT GGA GTT AGA TGG VNTR-1 VNTR1-rev CAT TGT CCA GTA GAA TTA GAT TTG VNTR2-for GAT GCT TAT TTC CAC TGC TTG TTG VNTR-2 VNTR2-rev GTT TTA CCC TCT CTT TTA AGG TCA ATG VNTR7-for CTA TCA GTT TCA GCT ATT CCA TC VNTR-7 VNTR7-rev CTG GTA CGA ATC AAA TCA AGT G VNTR8-for GGG GAG TGG CAA AAA ATA GTG TG VNTR-8 VNTR8-rev CAG ATC ATC AAC TAT CAA CCG CTG VNTR9-for CTG CAT CTA ATA ACA AGG ACC CAT G VNTR-9 VNTR9-rev ACA TTC CGA TTA ACG CGA AAT AAG VNTR10-for CCT ACA GAA AAT CCA GAC GG VNTR-10 VNTR10-rev TTT TTT CCA TCC TCT TGA ATT G jeweils VNTR- spezifische flankierende Region Top et al., 2004 Material und Methoden 48 3.9 Bakterienstämme und Zellen In Tab. 9 sind verwendete Referenz- bzw. Indikatorstämme sowie deren für diese Arbeit wichtigen Eigenschaften und Verwendungszwecke aufgeführt. Des Weiteren wurden zur Untersuchung der 80 E. faecalis Isolate aus Vaginalabstrichen bzgl. hemmender Effekte auf Milchsäurebakterien (siehe 3.11.5) neun Lactobacillus spp. Wildtypstämme, die aus Vaginalabstrichen isoliert wurden, verwendet. Tab. 9 Verwendete Bakterienstämme und Zellen Bakterienstamm / Zelllinie Eigenschaft / Verwendungszweck Referenz / Herkunft E. faecalis V583 Vanr, vanB+, GelE+, Genom vollständig sequenziert Sahm et al., 1989; Paulsen et al., 2003; Tendolkar et al., 2003 E. faecalis MMH594 esp+, cylA+, asa1+, gelE+, GelE+ Huycke et al., 1991; Shankar et al., 2002 E. faecalis DSM 2570 (ATCC 29212) Kontrollstamm Antibiotikaresistenzprüfung DSMZ Braunschweig E. faecalis DSM 12956 (ATCC 51299) Kontrollstamm Antibiotikaresistenzprüfung, HLR-Gm, HLR-Sm; vanB+ DSMZ Braunschweig, Swenson et al., 1995 E. faecalis JH2-2 Indikatorstamm Bacteriocin-Produktion; Plasmid-frei, Rifr, Fusr Jacob & Hobbs, 1974 E. faecalis OG1X Negativkontrolle Verklumpung, Pheromonproduzent, Smr, GelE- Ike et al., 1983 E. faecalis OG1X:pAD1 Positivkontrolle zum Nachweis des asa1 Gens und Verklumpung Tomich et al., 1979; Francia et al., 2001 E. faecalis OG1X:pAM373 Positivkontrolle zum Nachweis des asa373 Gens und Verklumpung Clewell et al., 1985 E. faecalis OG1RF starker BF-Bildner, Kontrollstamm BF-Assay, Plasmid-frei, Rifr, Fusr Dunny et al., 1978 E. faecalis T9 asa1 +, esp+, gelE+, sehr starker BF- Bildner, Kontrollstamm BF-Assay Maekawa et al., 1992; Hufnagel et al., 2004 E. faecium BM4147 Vanr, vanA+, Prototyp Tn1546 Arthur et al., 1993 E. faecium E155 Kontrollstamm MLVA Bonten et al., 1996; Van Wamel et al., 2007 E. faecium E734 Positivkontrolle zum Nachweis des hyl Gens, Kontrollstamm MLVA Bonten et al., 1996; Willems et al., 2001; Leavis et al., 2004 E. faecium 64/3 Indikatorstamm Bacteriocin-Produktion; Plasmid-frei, Rifr, Fusr RKI, Wernigerode L. acidophilus DSM 20079T (ATCC 4356) Indikatorstamm Bacteriocin- Produktion DSMZ Braunschweig, Johnson et al., 1980 L. crispatus DSM 20584T (ATCC 33820) Indikatorstamm Bacteriocin- Produktion DSMZ Braunschweig S. aureus DSM 1104 (ATCC 25923) Positivkontrolle DNase- und Lipase- Produktion DSMZ Braunschweig HeLa DSM ACC 57 (ATCC CCL 2) Epithelzellen Cervix-Karzinom; Zellkultur Adhärenz-Assay DSMZ Braunschweig, Scherer et al., 1953 Material und Methoden 49 3.9.1 Kollektiv der Enterokokken-Isolate Die in dieser Arbeit untersuchten Enterokokken-Stämme wurden aus klinischem Probenmaterial isoliert, das zur Untersuchung den bakteriologischen Abteilungen des Zentrallabors des Klinikums Kassel, eines medizinischen Diagnostiklabors in Kassel oder eines Labors in Göttingen zugesandt wurden. Diese Einrichtungen beziehen täglich eine Anzahl von mehreren hundert Proben nicht nur von Krankenhäusern, von niedergelassenen Ärzten, Betriebsmedizinern und Behörden aus dem Stadtgebiet Kassel bzw. Göttingen, sondern erhalten auch Material von Auftraggebern aus einem großen nord- und mittelhessischen sowie niedersächsischen Einzugsgebiet. Insgesamt wurden 150 E. faecalis und 78 E. faecium aus verschiedenem humanen Probenmaterial sowie weitere 80 Isolate aus Vaginalabstrichen (40 Patientinnen mit BV und 40 Patientinnen ohne BV) untersucht, so dass ein möglichst breites Spektrum von Enterokokken-Isolaten aus unterschiedlichen klinischen Bereichen hinsichtlich der Fähigkeit zur Biofilm-Bildung getestet und miteinander verglichen werden konnte. 36 der insgesamt 64 untersuchten Stämme aus humanen Faeces wurden aus einem bestehenden Kollektiv der Arbeitsgruppe (Pairan, 2001) übernommen. Ferner wurden Isolate aus diversen Umweltproben in die Versuche integriert. Die Tab. 10 gibt eine Übersicht über alle in dieser Arbeit untersuchten Enterokokken-Stämme, weitere Angaben zur Herkunft oder zum Probenmaterial befinden sich in den Tab. 20 bis Tab. 33 des Anhangs. Tab. 10 Übersicht zu Anzahl und Herkunft untersuchter Enterokokken-Isolate Probenmaterial E. faecalis E. faecium Faeces 37 27 Urin 44 10 Wunden 26 6 Invasiv 1) 19 21 Umwelt 2) 4 11 Divers 3) 20 3 Vagina 4) 80 - 1) Aszites (6 Isolate), Abszess (2), Bauchpunktat (1), Bauchhöhle (operativ, 2), Blut (10), Galle (1), Hüftgewebe (operativ, 1), Liquor (1), Milz (1), Pankreas (1), Peritonitis (4), Pericard (1), Pleura (1), Perikutane endoskopische Gastrostomie (PEG, 2), Serom (1), Venenkatheterspitze (5) 2) Boden (2), Geflügelkot (8), Rattenkot (2), Rinderkot (1), Gewässer (2) 3) Penis (1), Vulva (1), Cervix (1), Rachen (1), Zahnabszess (1), Dialysewasser (1), Hoden (1), Vagina, unspezifisch (12), Gewebe (1), Totalendoprothese (TEP, 1), Trachealsekret (2) 4) 40 Stämme von Patientinnen mit BV + 40 Stämme von Patientinnen ohne BV (Vergleichsgruppe) Die Vaginalabstriche, aus denen die 80 in dieser Arbeit untersuchten E. faecalis isoliert wurden, wurden vom Diagnostiklabor routinemäßig auf das Vorhandensein von anderen aeroben Keimen, Anaerobiern, Pilzen, Mycoplasmen und Ureaplasmen sowie von Döderlein- Flora qualitativ bzw. semi-quantitativ untersucht (siehe Tab. 31 und Tab. 33 im Anhang). Die Diagnose der Bakteriellen Vaginose erfolgte gemäß den Kriterien nach Amsel et al. (1983; siehe 1.4.2). Zusätzlich wurde der kulturelle Nachweis einer verringerten Anzahl von H2O2-produzierenden Lactobacillus spp. (TMB-Medium) zur Diagnose der BV herangezogen. Material und Methoden 50 Der Nachweis von Gardnerella vaginalis galt als zusätzliches Anzeichen der Erkrankung, war für eine positive Diagnosestellung aber nicht zwingend erforderlich, da hierzu allein die oben angeführten Kriterien ausschlaggebend sind (siehe 1.4.2). Die Vergleichsgruppe setzte sich aus Enterokokken-Isolaten aus Vaginalabstrichen zusammen, deren Untersuchung einen negativen Befund bzgl. BV und allen anderen kulturellen Nachweisen (aerobes/anaerobes Wachstum, Pilze, Mycoplasmen/Ureaplasmen) lieferte, jedoch E. faecalis mäßig oder reichlich nachgewiesen wurden. Bei der überwiegenden Anzahl der Vergleichsgruppen- Proben konnte außerdem eine Döderlein-Flora nicht oder nur stark vermindert nachgewiesen werden. 3.9.2 Herstellung der Biofilm-Mutantenstämme Die Erzeugung von Biofilm-Mutantenstämmen erfolgte in Anlehnung an eine von Christensen et al. (1987) beschriebene Methode zur kulturellen Selektion von Variantenstämmen von S. epidermidis. Bei dieser Bakterienspezies wurde mittels dieser Vorgehensweise ein stabiler, schwach Biofilm-bildender Stamm (RP62A-NA) aus einem pathogenen, sehr starken BF-Produzenten (RP62A, ATCC 35984) isoliert. Ein isolierter Stamm der zweiten Generation (RP62A-NAR) erlangte die Fähigkeit zur BF-Bildung zurück. In der vorliegenden Arbeit wurde daher erstmals diese Methodik angewandt, um Biofilm- Mutanten von E. faecalis herzustellen. Hierzu wurden aus dem vorliegenden Enterokokken- Kollektiv mehrere Isolate ausgewählt, die sich in bereits untersuchten Merkmalen bzgl. der genetischen Ausstattung und der Biofilm-Bildungsfähigkeit möglichst stark unterschieden. Biofilm-negative Isolate wurden in 5 ml TSBG (TSB + 1 % Glukose) ÜN bei 37°C im Reagenzglas kultiviert. Am folgenden Tag wurde die Kultur verworfen, das Gefäß dreimal vorsichtig mit 5 ml sterilem PBS-Puffer gewaschen und das mit frischem Medium befüllte Reagenzglas wiederum ÜN inkubiert. Dieses Vorgehen wurde täglich wiederholt, so dass nach mehreren Tagen ein Biofilm, der sich an der Wand des Reagenzglases gebildet hatte, zu erkennen war. Zur Überprüfung auf eine veränderte Biofilm-Bildungsfähigkeit wurde nach dem Waschschritt mit einem Glasstab etwas Bakterienmaterial von der Wand des Reagenzglases abgenommen und auf Blutagarmedium kultiviert. Nach erfolgter Inkubation (ÜN, 37°C) wurden gut separierte Einzelkolonien auf eine erhöhte Biofilm-Bildungsfähigkeit im Vergleich zum Wildtyp mittels Biofilm-Assays (siehe 3.11.6) untersucht. Zur Erzeugung von Stämmen, die eine verringerte Fähigkeit zur Biofilm-Bildung hatten als der Wildtyp, wurden Isolate in 5 ml TSB ÜN bei 37°C im Reagenzglas inkubiert, am Folgetag bei geringer Geschwindigkeit zentrifugiert (500 g, 10 min) und aus dem Überstand 10 µl der Kultur in frisches Medium überimpft (ÜN, 37°C). Dieses Vorgehen wurde ebenfalls täglich wiederholt. Um den jeweiligen Stamm schließlich auf eine veränderte Fähigkeit zur Biofilm- Bildung hin zu überprüfen, wurde im Anschluss an die Zentrifugation ein Aliquot des Material und Methoden 51 Kulturüberstands auf Blutagarmedium ausplattiert, ÜN inkubiert und am darauf folgenden Tag gut separierte Einzelkolonien mittels Biofilm-Assays (siehe 3.11.6) gescreent. Die täglich überimpften Kulturansätze wurden in Abständen von jeweils ca. 7 Tagen auf veränderte Biofilm-Bildungsfähigkeit überprüft. Wenn solche Stämme isoliert werden konnten, wurden diese zunächst auf ihre Stabilität bezüglich der veränderten Fähigkeit zur Biofilm-Bildung untersucht, indem sie täglich erneut auf Blutagarmedium überimpft (mindestens 20mal) und im Anschluss nochmals mittels Biofilm-Assay getestet wurden. 3.10 Mikrobiologische Kultur- und Standardmethoden 3.10.1 Isolierung, Kultivierung und Stammhaltung der Stämme Zur Isolierung von Enterokokken-Isolaten aus Faeces-Proben wurde etwas Stuhl-Material mit einer Einmal-Impföse auf KAA-Medium aufgebracht und ÜN bei 37°C inkubiert. Stämme aus anderem klinischen Material (Vaginalsekret, Urin, Wunden, Blut, Gewebe und andere Proben) wurden von den jeweiligen diagnostischen Laboren isoliert und in Abstrichtupfern oder auf Blutagarmedium zur Untersuchung im Rahmen dieser Arbeit zur Verfügung gestellt. Isolierte Enterokokken-Stämme wurden auf Blut- oder BHI-Agarplatten so oft (i.d.R. mehr als dreimal) überimpft, bis eine Reinkultur vorlag. Zur Stammhaltung wurden von jedem Enterokokken-Isolat Dauerkulturen hergestellt, indem eine sich in der späten log-Phase befindende Kultur in BHI-Bouillon 1:1 mit steriler Glycerin-Lösung (100 %) gemischt und bei -70°C bzw. -20°C gelagert wurde. Isolate, die momentan untersucht wurden, wurden auf Blut- oder BHI-Agarplatten ÜN bei 37°C kultiviert, bei +4°C gelagert und spätestens nach vier Wochen erneut überimpft bzw. aus den angelegten Dauerkulturen angezogen. Lactobacillus spp. wurden auf MRS-Agarplatten oder in MRS-Bouillon bei 37°C und 5 % CO2 im Anaerobentopf isoliert und kultiviert. 3.10.2 Biochemische Identifizierung Die überwiegende Anzahl der aus dem verschiedenen Probenmaterial isolierten Enterokokken-Stämme wurde mit Hilfe des WalkAway96-Systems (Dade Behring) im Zentrallabor des Klinikums Kassel oder mittels des Vitek-Systems (bioMérieux, Nürtingen) im medizinisch-diagnostischen Labor Hülsmann-Becker (Kassel) identifiziert sowie deren Antibiotikaresistenzspektren erstellt. Diese Stämme wurden zur Bestätigung der Ergebnisse ggf. zunächst mittels Gram-Färbung u.a. biochemischer Tests und dem Identifizierungsschema nach Manero & Blanch (1999) untersucht. Mit Hilfe der Anwendung einer spezifischen PCR nach Kariyama et al. (2000; siehe 3.12.6.1) konnte die Genus- bzw. Spezies-Zugehörigkeit der Isolate bestimmt werden. Antibiotikaresistenzen wurden ggf. wie unter 3.10.3 beschrieben überprüft. Material und Methoden 52 3.10.3 Antibiotikaresistenzbestimmungen 3.10.3.1 Agardiffusion Resistenzbestimmungen mittels Agardiffusionsverfahren wurden nach der DIN-Vorschrift 58940 (Teil 3 mit Beiblatt 1) durchgeführt. Hierzu wurde eine Suspension des Teststämmes in 0,9 %iger NaCl-Lösung entsprechend der Trübung eines McFarland Standards 0,5 hergestellt, diese 1:100 verdünnt und damit eine Iso-Sensitest- bzw. Mueller-Hinton- Agarplatte inokuliert (1-5 x 106 KBE / ml). Nach Auflegen der Ab-Blättchen wurden die Platten 18 ± 2 h bei 36 ± 1°C bebrütet und durch Bestimmung der Hemmhofdurchmesser resistentes, intermediäres oder sensibles Verhalten des Isolats gegenüber getesteten Antibiotika ermittelt. Die Grenzwerte der Hemmhofdurchmesser zur Beurteilung des Resistenzverhaltens wurden der entsprechenden DIN-Vorschrift bzw. den Herstellerangaben (Oxoid, Wesel) entnommen. Als Kontrollstämme dienten E. faecalis ATCC 29212 und E. faecalis ATCC 51299. 3.10.3.2 Mikrodilution Die Durchführung des Mikrodilutionsverfahrens erfolgte nach der DIN-Vorschrift 58940 (Teil 4 mit Beiblatt 1, Teil 8). 100 µl des Ab-haltigen Mediums in der Vertiefung einer Mikrotiterplatte wurden mit einer mittels McFarland Standard hergestellten Teststamm- Suspension angeimpft (Inokulum: 1-5 x 105 KBE / ml) und 20 ± 2 h bei 36 ± 1°C bebrütet. Beurteilung von resistentem, intermediärem oder sensiblem Verhalten des Isolats gegenüber getesteten Antibiotika erfolgte gemäß der in der entsprechenden DIN-Vorschrift aufgeführten Grenzwerte. E. faecalis ATCC 29212 und E. faecalis ATCC 51299 wurden stets als Kontrollstämme mitgeführt. 3.10.4 Verwertung verschiedener Substrate Die hergestellten Biofilm-Mutanten und ihre Wildtypstämme wurden mittels API 50 CH- Testsystem nach Angaben des Herstellers auf die Verwertung von 49 verschiedenen Kohlenhydratsubstraten untersucht, um eventuelle Unterschiede in deren stoffwechselphysiologischen Eigenschaften zu erkennen. Die mit Bakteriensuspension beimpfen Teststreifen wurden nach 24 h und nach 48 h Inkubation bei 37°C ausgewertet und die Ergebnisse mittels BioNumerics Software 2.5 (MRI, Karlsruhe) ausgewertet. Die Analyse zur Gruppierung (Clustern) der Isolate erfolgte mittles des Dice-Koeffizienten. Material und Methoden 53 3.10.5 Wachstumsverhalten Um mögliche Auswirkungen der Mutation auf das Wachstumsverhalten zu untersuchen, wurden Wachstumskurven der hergestellten Biofilm-Mutanten und ihrer Wildtypstämme erstellt. Dazu wurden die Teststämme aus einer Vorkultur in 50 ml TSBG angeimpft (Startinokulum OD600 ~ 0,05) und bei 37°C und 100 rpm inkubiert. In einem Zeitraum von 8,5 h wurde in Abständen von 20 min die OD600 bestimmt. 3.11 Methoden zum phänotypischen Nachweis von Virulenzfaktoren und Biofilm-Bildung 3.11.1 Gelatinase-Produktion Der Nachweis, ob die Teststämme die Fähigkeit zum Gelatine-Abbau besitzen, wurde mittels einer Methode nach Vergis et al. (2002) erbracht. Hierzu wurden die Isolate auf die klaren Gelatine-Agarplatten strichförmig aufgeimpft und 24 h bei 37°C bebrütet. Die bewachsenen Platten wurden am nächsten Tag für ca. 3 h bei 4°C gekühlt und anschließend ausgewertet. Gelatinase-Produktion zeigt sich durch Bildung eines trüben Hofs um die Wuchszone. Als Positivkontrollen dienten die Stämme E. faecalis MMH594 oder E. faecalis V583, Negativkontrolle war E. faecium 64/3. 3.11.2 β-Hämolyse Die Fähigkeit zum vollständigen Abbau von Erythrozyten wurde untersucht, indem die Isolate strichförmig auf Blutagarplatten (5-10 % Pferdeblut) aufgeimpft und für 48 h bei 37°C und 8-10 % CO2-Gehalt im Anaerobentopf bebrütet wurden. β-Hämolyse zeigt sich durch Aufhellung des Agars um die Wuchszone. Als Positivkontrolle diente E. faecalis ATCC 29212, Negativkontrolle war E. faecium 64/3. 3.11.3 Verklumpung Der phänotypische Nachweis von Aggregationssubstanz wurde nach Dunny et al. (1978) durchgeführt. Der Überstand einer ÜN-Kultur (50 ml THB, 37°C) des Pheromonproduzenten E. faecalis OG1X wurde autoklaviert (15 min) und im Verhältnis 1:5 mit frischem THB- Medium verdünnt. 2,5 ml dieses pheromonhaltigen Mediums wurden dann mit 25 µl (1 %) einer ÜN-Kultur des Teststamms (THB, 37°C) angeimpft, bei 37°C und ca. 80 rpm inkubiert und stündlich auf Aggregat-Bildung kontrolliert. Als Negativkontrolle wurde E. faecalis OG1X, als Positivkontrolle OG1X:pAD1 verwendet, außerdem wurde von jedem Stamm ein weiterer Ansatz als Kontrolle auf konstitutive Verklumpung in THB-Medium ohne pheromonhaltigem Überstand angeimpft. Material und Methoden 54 3.11.4 DNase-, Lipase- und H2O2-Produktion Der Nachweis zur Produktion von DNase wurde entsprechend den Herstellerangaben mittels DNase-Agar der Firma BD Diagnostics (Heidelberg) geführt. Nach punktförmiger Beimpfung der Teststämme wurden die Platten für 48 h bei 37°C bebrütet, dann mit 1 M HCl beflutet und ca. 5 min bei RT inkubiert. DNase-Produktion zeigt sich im trüb gewordenen Agar durch klare Höfe um die Beimpfungszone, da die im Agar noch vorhandene DNA durch Behandlung mit Salzsäure ausfällt. Als Positivkontrolle diente S. aureus ATTC 25923. Lipase-Produktion wurde durch strichförmiges Aufimpfen der Teststämme auf Tributyrat- Agar nachgewiesen. Nach bis zu fünftägiger Inkubation bei 37°C zeigt sich eine Lipolyse als klarer Hof um den Teststammausstrich. Die Platten wurden täglich begutachtet, da bereits nach einem Tag bei positivem Ergebnis Aufhellung beobachtet werden kann. Als Positivkontrolle wurde stets S. aureus ATCC 25923 mitgeführt. Die Produktion von Wasserstoffperoxid wurde mittels Ausstrich der Teststämme auf TMB- Medium nach Eschenbach et al. (1989) getestet. Nach Inkubation für 48 h bei 37°C und 5 % CO2 zeigen H2O2-produzierende Stämme auf dem hell-cremigen Agar dunkelblaue Kolonien. Dies ist auf einen blauen Farbkomplex zurückzuführen, der sich durch Umwandlung des TMB (chromogenes Substrat der Peroxidase) bildet, wenn die im Agar ebenfalls enthaltene Peroxidase in Anwesenheit von H2O2 TMB oxidiert. Da die Peroxidase sehr instabil ist, müssen die Platten spätestens 48 h nach der Herstellung verwendet werden. Als Positivkontrolle diente E. faecalis OG1RF. 3.11.5 Bacteriocin-Bildung Zur Untersuchung von Bacteriocin-Bildung der Enterokokken gegenüber den zwei Indikatorstämmen E. faecalis JH2-2 und E. faecium 64/3 wurde eine Kolonie des Teststammes auf eine BHI-Agarplatte, die zuvor mit einer Suspension des Indikatorstammes beimpft worden war, punktförmig aufgetragen und nach einer Inkubation von 24 h bei 37°C entstandene Hemmhof beurteilt. Die Indikatorstämme wurden zuvor in 5 ml BHI-Bouillon für 2 h bei 37°C angezogen, in 0,9 %iger NaCl-Lösung 1:100 verdünnt und auf eine BHI- Agarplatte gegeben. Die entstandenen Hemmhöfe wurden mit + (≤ 1 mm), ++ (2-4 mm) und +++ (> 4 mm) beurteilt (Klare et al., 2005; RKI, persönliche Mitteilung). Die Untersuchung hemmender Effekte von Enterokokken aus Vaginalabstrichen gegenüber Lactobacillus spp. wurde in Anlehnung an Mayr-Harting et al. (1972) durchgeführt. Hierzu wurden 2 µl einer ÜN-Kultur (MRS, 37°C) der E. faecalis Teststämme auf eine MRS- Agarplatte gegeben. Nach kurzem Einziehen der Bakteriensuspension wurde die beimpfte Platte mit 5 ml MRS-Weichagar (0,8 %), dem 100 µl einer ÜN-Kultur des Lactobacillus spp. Indikatorstammes zugegeben wurde, übergossen und nach Aushärtung 24 h bei 37°C und 5 % CO2 inkubiert. Material und Methoden 55 3.11.6 Biofilm-Bildung Die Fähigkeit der Enterokokken-Isolate, Biofilme auf abiotischen Oberflächen zu bilden, wurde mittels eines semi-quantitativen Assays nach Christensen et al. (1985) untersucht. Hierzu wurden 20 µl einer ÜN-Kultur des Teststamms in TSBG zu 180 µl frischem Medium (1:10 Verdünnung) in eine Vertiefung einer 96well-Mikrotiterplatte gegeben und für 18 h bei 37°C in einer Plastikwanne mit feuchten Zellstofftüchern (Verdunstungsschutz) inkubiert. Danach wurde das Medium entfernt und der Biofilm vorsichtig dreimal mit PBS-Puffer mit Hilfe eines ELISA-Washers (Sigma, Deisenhofen) gewaschen, um alle freien Zellen zu entfernen. Zur Fixierung des Biofilms wurde eine Trocknung bei 60°C für 1 h durchgeführt. Es folgte eine Anfärbung des Biofilms für 3 min mit 100 µl Hucker´s Crystal Violet-Lösung (2 %). Die Platten wurden unter fließendem Leitungswasser gut abgespült und 10 min bei 60°C getrocknet (Baldassarri et al., 2001). Anschließend erfolgte eine OD-Messung des angefärbten Biofilms bei 595 nm (Fusion α, Packard Biosciences, jetzt Perkin-Elmer; Abteilung Biochemie / Universität Kassel). Der Assay wurde pro Teststamm mindestens dreimal mit jeweils vier Replikaten durchgeführt und die Mittelwerte berechnet. Diese wurden wie folgt bewertet: OD595 < 0,120 kein BF-Bildner 0,120 ≤ OD595 ≤ 0,240 schwacher BF-Bildner OD595 > 0,240 starker BF-Bildner Auf jeder Platte wurden stets die Stämme E. faecalis T9 (sehr starker BF-Bildner, OD595 = 1,20 ± 0,230; Baldassarri et al., 2005b), E. faecalis OG1RF (starker BF-Bildner, OD595 ~ 0,3) und E. faecium 64/3 (kein BF-Bildner, OD595 ~ 0,003) sowie Negativwerte (nur Medium) als Kontrollen mitgetestet. 3.11.7 Primäre Anheftung an abiotische Oberflächen Zur Untersuchung der Wildtyp- und BF-Mutantenstämme wurde deren Fähigkeit zur primären Anheftung an abiotische Oberflächen getestet (Van Wamel et al., 2007; Hufnagel et al., 2004). Eine ÜN-Vorkultur des Teststamms (TSBG, 37°C) wurde auf eine OD595 = 0,1 in Medium eingestellt und 200 µl dieser Bakteriensuspension in jeweils eine Vertiefung einer 96well-Mikrotiterplatte gegeben. Nach einer Inkubation für 1 h bei 37°C wurde das Medium entfernt, die Wells vorsichtig dreimal mit PBS-Puffer gewaschen, fixiert und angefärbt wie unter 3.11.6 beschrieben, sowie anschließend mittels OD595-Messung (Fusion α; Abteilung Biochemie / Universität Kassel) ausgewertet. Der Assay wurde pro Teststamm in unabhängigen Ansätzen fünfmal mit je zwölf Replikaten wiederholt. Material und Methoden 56 3.11.8 Hydrophobizität der Zelloberfläche Mittels eines Hydrophobizitätstests (Tendolkar et al., 2005) unter Verwendung von n-Hexadecan wurde untersucht, ob sich die Zelloberflächen von Wildtyp- und BF- Mutantenstämmen in ihrer Hydrophobizität unterscheiden. Hierzu wurden die Teststämme in 5 ml TSBG ÜN bei 37°C angezogen, im Verhältnis 1:50 in Medium verdünnt und 4 h bis zum Erreichen der log-Phase der Kultur inkubiert. Nach Zentrifugation wurden die Zellen zweimal mit PUM-Puffer gewaschen und auf eine OD400 = 1,0 eingestellt. Zu 3 ml dieser eingestellten Zellsuspension wurden 300 µl n-Hexadecan (1:10) zugegeben und 10 min bei 37°C inkubiert. Im Anschluss wurden die Ansätze ca. 2 min gut durchmischt (Vortex) und 15 min bei RT stehengelassen, bis eine vollständige Phasentrennung eingetreten war. Mit einer Kanüle wurde vorsichtig, ohne eine Kontamination durch die organische obere Phase zu erhalten, ein Teil der unteren wässrigen Phase abgezogen, in eine Einmalküvette überführt und die OD400 gegen PUM-Puffer gemessen. Die Berechnung der Hydrophobizität erfolgte nach: % Hydrophobizität = [1 - OD400 Endwert / OD400 Startwert (ca. 1,0)] x 100 Der Assay wurde pro Teststamm viermal in unabhängigen Ansätzen wiederholt. 3.11.9 Adhärenz an HeLa-Zellen Um zu untersuchen, ob sich die Eigenschaft zur Anheftung an eukaryontische Zellen zwischen Wildtyp- und BF-Mutantenstämmen verändert hat, wurde ein Adhärenz-Assay durchgeführt (Baldassarri et al., 2005b; Sartingen et al., 2000). Hierzu wurden HeLa-Zellen, welche Epithelzellen eines humanen Cervix-Karzinoms sind (Scherer et al., 1953), verwendet, da die Wildtypstämme von E. faecalis aus Vaginalabstrichen isoliert wurden. HeLa-Zellen wachsen in Monolayern und erreichen schnell Konfluenz. Die HeLa-Zellen wurden in 24well-Zellkulturplatten (BD Diagnostics, Heidelberg) in Medium (Dulbecco’s Modified Eagle’s medium (DMEM) + 10 % Fetal Calf Serum (FCS), PAA Laboratories) mehrere Tage bei 37°C und 5 % CO2 angezogen, bis eine Zellzahl von ca. 105 pro Vertiefung erreicht war. Die Anzucht dieser Zellen erfolgte in der Abteilung Biochemie / Universität Kassel. Jeder Teststamm wurde in TSBG bei 37°C angezogen, für 15 min bei ca. 2000 rpm abzentrigugiert, in PBS-Puffer gewaschen und die Zellzahl in DMEM + FCS photometrisch auf 107 Bakterien / ml eingestellt. Nach Entfernen des Mediums wurde 1 ml der eingestellten Bakteriensuspension in Zellkulturmedium in je ein Well mit HeLa-Zellen gegeben (Ratio 100:1) und 1 h bei 37°C inkubiert. Die exakte Bakterienzellzahl der Inokula wurde durch Ausplattieren auf BHI-Agarplatten nach Anlegen von Verdünnungsreihen in PBS- Puffer bestimmt (je drei Replikate). Nach der Inkubation wurde die Bakteriensuspension Material und Methoden 57 entfernt und der Monolayer dreimal mit sterilem PBS-Puffer (pH 7,4) gewaschen, um alle nicht an die HeLa-Zellen adhärierten Bakterien zu entfernen. Nach Zugabe von 1 ml Lyse- Puffer (PBS + 0,5 % Triton X-100) und Inkubation für 10 min bei 37°C wurden die lysierten Zellen gut aus den Vertiefungen abgelöst, jeweils Verdünnungsreihen in PBS-Puffer angelegt, entsprechende Verdünnungsstufen auf BHI-Agar ausplattiert und ÜN bei 37°C bebrütet. Der Anteil an adhärierten Bakterien wurde wie folgt berechnet: % Adhärenz = (KBE adhärierte Bakterien x 100) / KBE Inokulum Es wurden drei unabhängige Ansätze mit jeweils drei Replikaten pro Teststamm durchgeführt. 3.12 Molekularbiologische Methoden 3.12.1 Präparation der Gesamt-DNA zum Einsatz in die PCR Die Extraktion der Gesamt-DNA wurde in Anlehnung an Top et al. (2004) durchgeführt. Hierzu wurden 3 – 4 Kolonien des Teststamms in 20 µl eines Lyse-Puffers (0,25 % SDS, 0,05 M NaOH) suspendiert und für 5 min bei 95°C erhitzt. Nach anschließender Zugabe von 150 µl Tris/HCl-Puffer (10 mM, pH 8,5) wurde der Ansatz für 5 min bei 16 000 g abzentrifugiert, um die Zelltrümmer zu pelletieren. Der Überstand wurde bis zur Verwendung bei -20°C gelagert. Von dieser DNA-Lösung wurde jeweils 2,5 µl pro 25 µl PCR-Ansatz eingesetzt. 3.12.2 Gesamt-DNA-Extraktion 2 ml einer ÜN-Kultur des Teststamms wurden abzentrifugiert (12 000 g, 4°C, 5 min) und 0,5 g Silicatperlen (Ø 0,17-0,18 mm) sowie 500 µl Natriumphosphat-Puffer und 100 µl SDS- Lösung (10 %) zum Pellet gegeben. Im Anschluss an den mechanischen Zellaufschluss (FastPrep: 35 s, 5 m/s) wurde die Probe zur Pelletierung von Zelltrümmern abzentrifugiert (12 000 g, 4°C, 10 min) und der Überstand bzw. die obere wässrige Phase im Verhältnis 1:1 mit Chloroform-Isoamylalkohol-Lösung (24:1) zur Entfernung von Proteinen versetzt, kurz geschüttelt und zentrifugiert (12 000 g, 4°C, 2 min). Dieser Schritt wurde dreimal wiederholt, nach der ersten Reinigung wurde 1 µl RNase A (10 mg/ml) zugegeben und für 30 min bei 37°C inkubiert. Zur Fällung wurde der DNA-haltige Überstand mit 2,5 VT EtOH (100 %) und 0,1 VT Natriumacetat-Lösung (3 M, pH 5,5) versetzt und ÜN bei -20°C gelagert. Am folgenden Tag wurde das Präzipitat zentrifugiert (12 000 g, 4 °C, 15 min), das DNA-Pellet getrocknet (Speed-Vac, 10 min) und in 50 µl Tris/HCl-Lösung (10 mM, pH 8,0) gelöst. Die DNA-Lösung wurde bei -20°C gelagert. Material und Methoden 58 3.12.3 Präparation von Plasmid-DNA Die Extraktion von Plasmid-DNA zur Untersuchung der Biofilm-Mutantenstämme erfolgte mittels des Plasmid Isolation Midi Kits (Qiagen, Hilden) nach Angaben des Herstellers mit folgenden Modifikationen. Der Teststamm wurde in 100 ml MRS-Bouillon angeimpft (1 %) und für 20 h bei 37°C inkubiert. Die Kultur wurde 15 min bei 3000 g zentrifugiert und das Pellet mit 20 ml Puffer (TE + 0,5 % NaCl) gewaschen. Nach Resuspension des Pellets in 4 ml TERMLS-Puffer erfolgte zur Zell-Lyse eine Inkubation bei 37°C für ca. 2 h. Anschließend wurden 4 ml P2-Puffer zugegeben, durch vier- bis sechsmaliges, vorsichtiges Invertieren der Probe gemischt und bei RT für 5 min inkubiert. Nach Zugabe von 4 ml gekühltem Puffer P3 und kurzem Mischen wurde der Ansatz 15 min auf Eis gelagert und schließlich 30 min bei 20 000 g und 4°C zentrifugiert. Der Überstand wurde nochmals in ein neues Gefäß überführt und erneut bei 20 000 g zentrifugiert (15 min). Nachdem eine Qiagen- Midi-Säule (Tip 100) mit 4 ml QBT-Puffer äquilibriert wurde, konnte der Plasmid-DNA-haltige Überstand zur Reinigung sofort auf die Säule gegeben werden. Die beladenen Säulen wurden zweimal mit 10 ml QC-Puffer gewaschen und die Plasmid-DNA schließlich in 5 ml auf 50°C vorgewärmten Puffer QF eluiert. Nach Zugabe von 0,7 VT Isopropanol erfolgte die Fällung der Plasmid-DNA während einer Zentrifugation bei 15 000 g für 45 min (4°C). Der Überstand wurde vorsichtig dekantiert, das Pellet mit 70 %igem EtOH (3 ml, 15 min) gewaschen und schließlich bei RT getrocknet. Nach Lösen des Pellets in 50 µl Tris/HCl (10 mM, pH 8,0) wurde die Plasmid-DNA bei 4°C gelagert. 3.12.4 Restriktion von Plasmid-DNA Die präparierte Plasmid-DNA der Wildtyp- und Mutantenstämme wurde zur Analyse mittels Restriktionsendonukleasen des Typs II in spezifische Fragmente gespalten. Restriktionsenzyme dieser Art erkennen spezifische, palindromische Sequenzen (Tetra- bis Hexanukleotide) und katalysieren eine hydrolytische Spaltung des DNA-Phosphatgerüsts innerhalb dieser Erkennungssequenz, so dass dabei charakteristische 3´- oder 5´- Überhänge („sticky ends“) oder glatte Enden („blunt ends“) entstehen können. In Abhängigkeit von der DNA-Menge sollte dem Ansatz 1 U des Enzyms pro 1 µg DNA sowie die entsprechende Menge des spezifischen, den für das Enzym die optimale Salzkonzentration einstellenden Spaltungspuffers zugegeben werden. Die Inkubation erfolgt bei der für das jeweilige Enzym empfohlenen Temperatur. Bei Restriktionen mehrerer Enzyme pro Ansatz müssen Puffer- und Inkubationsbedingungen entsprechend angepasst werden. Material und Methoden 59 Es wurde eine Doppelrestriktion der Plasmid-DNA mit den zwei Enzymen EcoRI (Erkennungssequenz: GAATTC) und HindIII (Erkennungssequenz: AAGCTT) nach folgendem Ansatz durchgeführt: Ansatz je 20 µl Plasmid-DNA 5-10 µg EcoRI und HindIII (10 U/µl) je 0,5-1 µl Puffer (MBI, 10 x) 2 µl DNase- / RNase-freies Wasser ad 20 µl Inkubation: 37°C / 3 h 3.12.5 Photometrische Konzentrationsbestimmung von DNA Zur Bestimmung der DNA-Konzentration wurde ein Aliquot der Lösung in eine Quarzküvette überführt und die Extinktion bei 260 nm gemessen, da die einzelnen Nukleotide der DNA Absorptionsmaxima zwischen 253 nm und 271 nm (pH 7,0) aufweisen. Folgende Näherungswerte lagen der Konzentrationsbestimmung zugrunde: 1 E260 dsDNA entspricht 50 μg/ml 1 E260 ssDNA entspricht 33 μg/ml Verunreinigungen wurden durch Messung der Extinktion bei 260 nm und 280 nm mit anschließender Bildung des Quotienten E260 / E280 festgestellt. Dabei gelten die Richtwerte (Mülhardt, 2003): E260 / E280 < 1,8: mögliche Kontamination mit Proteinen und aromatischen Substanzen E260 / E280 < 2,0: mögliche Kontamination der Probe mit RNA 3.12.6 Nachweis spezifischer Gen-Abschnitte mittels PCR Mittels der Polymerase-Kettenreaktion (polymerase chain reaction, PCR) können gezielt einzelne DNA-Fragmente amplifiziert werden. Somit bietet diese Methode die Möglichkeit, bestimmte Gene im Genom eines zu untersuchenden MO nachzuweisen. Das Enzym DNA- Polymerase initiiert die Elongation am 3’-Ende einer kurzen Nukleotidsequenz (Primer), die mit der Ziel-DNA (Template) hybridisiert. Die Ziel-DNA dient somit als Matrize während der PCR, in der die DNA-Polymerase in Anwesenheit von Desoxynucleosidtriphosphaten (dNTPs) das von den Primern (forward und revers) flankierte DNA-Fragment synthetisiert. Bei Ablauf der PCR wird in mehreren Zyklen zunächst bei ca. 95°C die DNA in Einzelstränge getrennt (denaturiert), so dass dann die Primer bei einer für sie spezifischen Temperatur mit der Ziel-Sequenz hybridisieren können (Annealing) und schließlich die Synthese des zu amplifizierenden DNA-Strangs bei 72°C erfolgen kann (Elongation). Material und Methoden 60 Wird anstelle von nur einem mit mehreren Primerpaaren gearbeitet (Multiplex-PCR), ist es insbesondere wichtig, die verwendeten Primer so zu designen, dass sie nicht miteinander hybridisieren können, die Annealing-Temperaturen annähernd gleich sind und die nachzuweisenden Zielsequenzen nicht überlagern. Die in dieser Arbeit durchgeführten Multiplex-PCRs (Kariyama et al., 2000; Vankerckhoven et al., 2004) sind bereits etablierte Verfahren, die von den Autoren in ihrer Durchführung optimiert wurden. Die hier angewandten PCRs wurden zunächst unter in der Literatur angegebenen Bedingungen auf Funktionalität und Reproduzierbarkeit mittels Referenzstämmen getestet. Alle PCR-Nachweise dieser Arbeit wurden zur Vermeidung von Kontaminationen unter sterilen Bedingungen und mit gefilterten Pipettenspitzen in DNase-/RNase-freien Reaktionsgefäßen durchgeführt. Jeder PCR-Ansatz beinhaltete eine Positivkontrolle sowie eine Negativkontrolle (ohne DNA-Template). Zum Einsatz kamen vornehmlich verschiedene kommerziell verfügbare Taq-Polymerasen sowie eine nach etablierten Protokollen (Engelke et al., 1990; Pluthero, 1993) in der Arbeitsgruppe selbst hergestellte Taq-Polymerase, die keinerlei Nachteile gegenüber kommerziell erhältlichen Enzymen zeigte und deren Anwendung zuvor jeweils in mehreren Testläufen geprüft wurde. Als Template wurden pro PCR-Ansatz entweder 100 ng der wie unter 3.12.2 beschriebenen aufgereinigten Gesamt- DNA verwendet oder 2,5 µl der Schnellpräparation (3.12.1). 3.12.6.1 Multiplex-PCR der Vancomycin-Resistenzgene Zum Nachweis verschiedener Vancomycin-Resistenzgene wurde eine von Kariyama et al. (2000) beschriebene Multiplex-PCR durchgeführt, bei der Primerpaare zum Einsatz kommen, mittels derer der gleichzeitige Nachweis von vanA, vanB, vanC1 und vanC2/C3 möglich ist. Des Weiteren sind Spezies-spezifische Primerpaare zum Nachweis von E. faecalis (ddlE.fc Gen, welches für eine spezifische D-Alanin-D-Alanin Ligase codiert) und E. faecium (Cheng et al., 1997) im Ansatz vorhanden. Gleichzeitig liefert die Detektion von vanC1 bzw. vanC2 den Spezies-spezifischen Nachweis für E. gallinarum bzw. E. casseliflavus. Außerdem beinhaltet der Ansatz Primer zur Amplifikation eines konservierten Bereiches der 16S rRNA (rrs) zur internen PCR-Kontrolle, was sich in früheren Studien (Rosenstraus et al., 1998; Dutka-Malen et al., 1995) für die Zuverlässigkeit der Ergebnisse als sehr wichtig erwiesen hat. Der Nachweis von vanB wurde allerdings mit von Elsayed et al. (2001) verbesserten Primerpaaren, die alle Subtypen (vanB1, vanB2, vanB3) detektieren, sowie daraufhin optimierten Primer-Konzentrationen im Ansatz durchgeführt. Als Positivkontrollen wurden E. faecium BM4147 (vanA), E. faecalis ATCC 51299 (vanB) sowie Wildtypstämme von E. gallinarum und E. casseliflavus (Pairan, 2001) mitgeführt. Material und Methoden 61 PCR-Ansatz 25 µl PCR-Cyclerprogramm Puffer (MBI) 1x initiale Denaturierung 94°C 5 min dNTPs je 0,2 mM 94°C 1 min MgCl2 1,5 mM 35 Zyklen 54°C 1 min Primer-Mix* 0,05-0,5 µM 72°C 1 min Taq-Polymerase 0,625 U finale Elongation 72°C 10 min Elektrophorese: 1,5 %iges Agarosegel (TAE) *je 0,5 µM: VanA-for/VanA-rev (1031 bp), E.fc-for/E.fc-rev (941 bp) und je 0,1 µM: VanC1-for/VanC1-rev (822 bp), VanC2/3-for/VanC2/3-rev (484 bp), rrs-for/rrs-rev (320 bp) und je 0,05 µM: VanB1-3-for/VanB1-3-rev (536 bp), E.fm-for/E.fm-rev (658 bp) 3.12.6.2 Multiplex-PCR der Virulenzfaktoren-Gene Diese von Vankerckhoven et al. (2004) entwickelte und optimierte Multiplex-PCR ist ein einfaches und schnelles Verfahren zum gleichzeitigen Nachweis von fünf Genen, die wichtige Virulenzfaktoren bei E. faecalis bzw. E. faecium codieren. Der Primer-Mix enthält Primerpaare zur Amplifikation bestimmter Abschnitte der Gene für das Cytolysin (Aktivator, cylA), die Aggregationssubstanz Asa1 (asa1), das Enterococcal Surface Protein (esp), die Hyaluronidase (hyl) und die Gelatinase (gelE). Mittels des hier eingesetzten Primerpaars für das esp Gen wird ein konservierter Bereich, der für den N-Terminus des Proteins codiert, amplifiziert, so dass der Nachweis sowohl für E. faecalis als auch für E. faecium angewandt werden kann. Als Positivkontrollen dienten E. faecalis MMH594 (cylA+, asa1+, esp+, gelE+) und E. faecium E734 (esp+, hyl+). PCR-Ansatz 25 µl PCR-Cyclerprogramm Puffer (MBI) 1x initiale Denaturierung 95°C 5 min dNTPs je 0,2 mM 94°C 1 min MgCl2 2,5 mM 30 Zyklen 56°C 1 min Primer-Mix* 0,1-0,2 µM 72°C 1 min Taq-Polymerase 2,5 U finale Elongation 72°C 10 min Elektrophorese: 2 %iges Agarosegel (TAE) *je 0,1 µM: ASA11/ASA12 (375 bp), GEL11/GEL12 (213 bp), HYLn1/HYLn2 (267 bp) und je 0,2 µM: CYT-I/CYT-IIb (688 bp), ESP14F/ESP12R (510 bp) 3.12.6.3 PCR-Nachweis der Gene asa373 und ef0591 Mittels spezifischer Primerpaare wurde ein Bereich des für die Aggregationssubstanz Asa373 codierenden Gens (asa373) gemäß dem PCR-Protokoll (Creti et al., 2004) in der unten aufgeführten Tabelle amplifiziert. Gleiche Durchführung wurde zum Nachweis des Gens ef0591 (Paulsen et al., 2003) verwendet, welches für ein noch nicht charakterisiertes, putatives Oberflächenprotein codiert (Creti et al., 2004). Als Positivkontrollen wurden E. faecalis OG1X:pAM373 (asa373+) und E. faecalis MMH594 (ef0591+) mitgeführt. Material und Methoden 62 PCR-Ansatz 25 µl PCR-Cyclerprogramm Puffer (MBI) 1x initiale Denaturierung 95°C 5 min dNTPs je 0,2 mM 94°C 1 min MgCl2 2 mM 30 Zyklen 58°C 1 min Primer* je 0,4 µM 72°C 1 min Taq-Polymerase 1 U finale Elongation 72°C 10 min Elektrophorese: 1,5 %iges Agarosegel (TAE) *asa373-for/asa373-rev (619 bp) bzw. EF0591-for/EF0591-rev (844 bp) 3.12.6.4 PCR-Nachweis des Gens ebpA Die Amplifikation von ebpA, welches ein Gen des ebp Operons ist und für ein Pili-Protein bei E. faecalis codiert (Nallapareddy et al., 2006), wurde nach dem unten angegebenen PCR- Protokoll durchgeführt. Dieses Primerpaar wurde ebenfalls für den entsprechenden Nachweis des Transkripts mittels RT-PCR verwendet (siehe 3.12.13). Positivkontrolle war der Stamm E. faecalis OG1RF. PCR-Ansatz 25 µl PCR-Cyclerprogramm Puffer (MBI) 1x initiale Denaturierung 95°C 5 min dNTPs je 0,2 mM 94°C 1 min MgCl2 2,5 mM 30 Zyklen 57°C 1 min Primer* je 0,4 µM 72°C 1 min Taq-Polymerase 1 U finale Elongation 72°C 10 min Elektrophorese: 2,5 %iges Agarosegel (TAE) *EF1091MF1/EF1091MR1 (302 bp) 3.12.6.5 PCR-Nachweis der Gene des bee Locus Die 150 E. faecalis aus verschiedenen klinischen Bereichen (siehe 4.1.1) sowie die 80 Stämme aus Vaginalabstrichen (siehe 4.3.1) wurden auf die Anwesenheit des bee Locus mit Hilfe der PCR unter Verwendung der Primer P101D12-1-for und P101D12-2-rev (bee1-3) nach Tendolkar et al. (2006) wie folgt tabellarisch aufgeführt untersucht. PCR-Ansatz 25 µl PCR-Cyclerprogramm Puffer (MBI) 1x initiale Denaturierung 95°C 5 min dNTPs je 0,2 mM 94°C 1 min MgCl2 2,5 mM 30 Zyklen 53°C 1 min Primer* je 0,5 µM 72°C 2 min Taq-Polymerase 1 U finale Elongation 72°C 10 min Elektrophorese: 1 %- bzw. 2 %iges Agarosegel (TAE) *P101D12-2-for/P101D12-1-rev (1398 bp) oder Bee12-for/P101D12-1-rev (539 bp) Zur Analyse des Stamms E. faecalis 1.10 und dessen BF-Mutante 1.10.16 wurden weitere PCR- und RT-PCR-Nachweise (3.12.13) sowie nachfolgende Sequenzierungen (3.12.9) bzgl. dieses Locus durchgeführt. Hierbei kamen zum einen eigens designte Primer zur Amplifizierung eines Teilbereichs des bee1 Gens (bee1-for2267 / bee1-rev3182 (1016 bp), PCR-Ansatz wie oben mit 54°C Annealing-Temperatur) zum Einsatz, zum anderen wurden Material und Methoden 63 verschiedene Primerkombinationen zur PCR bestimmter Bereiche der srt-1 und srt-2 Gene verwendet (Sor1L-for / Sor1R-rev (650 bp), PCR-Ansatz wie oben mit 58°C Annealing- Temperatur und 1 min Elongation; P101D12-11-for / Sor2R-rev (1280 bp) und Sor1L- for / Sor2R-rev (1898 bp), beide PCR-Ansätze wie oben mit 58°C Annealing). 3.12.6.6 PCR-Nachweis des Gens ace Diese PCR diente zum einen des Nachweises des ace Gens, zum anderen der Bestimmung der Anzahl der Tandemrepeats der B-Domäne (Nallapareddy et al., 2000a). Bei der Durchführung gemäß unten aufgeführter Tabellenangaben dienten die Stämme E. faecalis OG1RF (5,4 B-Repeats), E. faecalis JH2-2 (2,4 B-Repeats) oder E. faecalis V583 (4,4 B-Repeats) als Positivkontrollen. PCR-Ansatz 25 µl PCR-Cyclerprogramm initiale Denaturierung 94°C 4 min Puffer (MBI) 1x 94°C 30 s dNTPs je 0,2 mM 15 Zyklen TD 70°C–1°C 1 min MgCl2 1,5 mM 72°C 2 min 30 s Primer* je 0,5 µM 94°C 30 s Taq-Polymerase 1 U 25 Zyklen 55°C 1 min 72°C 2 min 30 s finale Elongation 72°C 5 min Elektrophorese: 1,5-1,8 %iges Agarosegel (TAE) *aceB-for/aceB-rev (bp variabel) 3.12.6.7 PCR-Nachweis der A- und C-Repeats des esp Gens Anzahl der A-Repeats des esp Gens von E. faecalis und E. faecium Nach Shankar et al. (1999) bzw. Eaton & Gasson (2002) wurde die Anzahl der A-Repeats des esp Gens bei E. faecalis und E. faecium wie nachfolgend tabellarisch aufgeführt bestimmt. Als Kontrollstämme wurden stets E. faecalis MMH594 (3 A-Repeats) bzw. E. faecium E155 (3 A-Repeats) mitgetestet. PCR-Ansatz 25 µl PCR-Cyclerprogramm Puffer (MBI) 1x initiale Denaturierung 95°C 5 min dNTPs je 0,2 mM 94°C 2 min MgCl2 2,5 mM 30 Zyklen 63°C 1 min Primer* je 0,2 µM 72°C 2 bzw. 3 min Taq-Polymerase 2 U finale Elongation 72°C 8 min Elektrophorese: 1 %iges Agarosegel (TAE) *esp46/esp47 (bp variabel) Material und Methoden 64 Anzahl der C-Repeats des esp Gens von E. faecalis Gemäß dem unten dargestellten PCR-Protokoll (Shankar et al., 1999) wurde die C-Repeat- Region des esp Gens bei E. faecalis amplifiziert und deren Anzahl bestimmt. Positivkontrolle bei jeder Amplifikation war der Stamm E. faecalis MMH594 (7 C-Repeats). PCR-Ansatz 25 µl PCR-Cyclerprogramm Puffer (MBI) 1x initiale Denaturierung 95°C 5 min dNTPs je 0,2 mM 94°C 2 min MgCl2 2,5 mM 30 Zyklen 64°C 1 min Primer* je 0,2 µM 72°C 3 min 30 s Taq-Polymerase 2 U finale Elongation 72°C 8 min Elektrophorese: 1 %iges Agarosegel (TAE) *esp2/esp5 (bp variabel) Anzahl der C-Repeats des esp Gens von E. faecium Die Bestimmung der Anzahl von C-Repeats des esp Gens bei E. faecium wurde in Anlehnung an ein PCR-Protokoll nach Eaton & Gasson (2002) wie nachfolgend beschrieben durchgeführt. PCR-Ansatz 25 µl PCR-Cyclerprogramm Puffer (MBI) 1x initiale Denaturierung 95°C 5 min dNTPs je 0,2 mM 95°C 2 min MgCl2 3 mM 30 Zyklen 60°C 1 min Primer* je 0,5 µM 72°C 3 min 30 s Taq-Polymerase 2 U finale Elongation 72°C 8 min Elektrophorese: 1 %iges Agarosegel (TAE) *TE98/TE103 (bp variabel) 3.12.6.8 PCR-Nachweis von Antibiotikaresistenzgenen Ergänzend zum phänotypischen Nachweis von Antibiotikaresistenzen wurden entsprechende Gene mittels PCR nachgewiesen, die Enterokokken-Stämmen eine Tetrazyklin- (tetM), Aminoglykosid- (aac(6´)-Ie-aph(2´´)-Ia) bzw. Erythromycin-Resistenz (ermB) vermitteln. Die Durchführung erfolgte gemäß dem unten aufgeführten PCR-Protokoll nach Strommenger et al. (2003) bzw. Jensen et al. (1999). Als Positivkontrollen wurden E. faecalis V583 (ermB, aac(6´)-Ie-aph(2´´)-Ia) und E. faecium BM4147 (tetM) eingesetzt. PCR-Ansatz 25 µl PCR-Cyclerprogramm Puffer (MBI) 1x initiale Denaturierung 94°C 3 min dNTPs je 0,2 mM 94°C 30 s MgCl2 4 mM 30 Zyklen 55°C 30 s Primerpaar* 0,1 µM bzw. 0,05 µM 72°C 30 s Taq-Polymerase 1 U finale Elongation 72°C 4 min Elektrophorese: 2,5 %iges Agarosegel (TAE) *je 0,1 µM: tetM1/tetM2 (158 bp); aacA-aphD1/aacA-aphD2 (227 bp) je 0,05 µM: ermB1/ermB2 (425 bp) Material und Methoden 65 3.12.7 Methoden zur Typisierung von Bakterienstämmen 3.12.7.1 Typisierung mittels rep-PCR von boxA Sequenzen Zur Typisierung der Wildtyp- und hergestellten BF-Mutantenstämme wurde eine rep-PCR mit dem Primer BOXA2R durchgeführt nach Malathum et al. (1998). Das Prinzip einer rep-PCR besteht darin, dass mittels eines an spezifische, repetitive Sequenzen bindenden Primers intergenetische Regionen amplifiziert werden, wenn diese Primer-Bindung in der richtigen Orientierung und optimalen Distanz im Genom auftritt. Somit werden PCR-basierte DNA- Fingerprints generiert, die zur Typisierung von Bakterien auf Spezies- oder Subspezies- Ebene verwendet werden können. Diese Methode stellt somit eine stark diskriminierende molekular-epidemiologische Technik dar (Olive & Bean, 1999; Tyler et al., 1997). Mehrere repetitve palindromische Genom-Sequenzen sind mittlerweile bei Gram-negativen sowie Gram-positiven Bakterien bekannt. BOX-Elemente bestehen aus drei DNA-Sequenzen (boxA, boxB und boxC) und sind erstmals in Streptococcus pneumoniae beschrieben worden (Martin et al., 1992). Die Durchführung dieser Fingerprint-PCR erfolgte nach dem in folgender Tabelle dargestellten Protokoll. Die digitalisierten Bilder der entstandenen Fingerprint-Bandenmuster wurden normalisiert und mittels BioNumerics Software (MRI, Karlsruhe; siehe 3.15) ausgewertet. Die Analyse zur Gruppierung (Clustern) der Isolate erfolgte mittels des Korrelationskoeffizienten nach Pearson (Produkt-Moment-Korrelation) und des UPGMA (Unweighted Pair Group Method with Arithmetic mean) Cluster-Algorithmus. PCR-Ansatz 25 µl PCR-Cyclerprogramm Puffer (NEB) 1x initiale Denaturierung 95°C 7 min dNTPs je 0,6 mM 94°C 30 s MgCl2 2,5 mM 35 Zyklen 40°C 1 min Primer BOXA2R 2 µM 65°C 8 min Taq-Polymerase (NEB) 2,5 U DNA 100 ng finale Elongation 65°C 16 min Elektrophorese: 1,5 %iges Agarosegel (TBE) 3.12.7.2 Pulsfeld-Gelelektrophorese Um Kontaminationen während der täglichen selektiven Subkultivierung zur Herstellung von BF-Mutanten auszuschliessen, wurden die isolierten E. faecalis-Mutanten sowie ihre Wildtypstämme mittels Pulsfeld-Gelelektrophorese (PFGE) typisiert. Diese Arbeiten wurden im Max-Rubner-Institut (Karlsruhe) nach einer modifizierten Methode nach Graves & Swaminathan (2001) durchgeführt. Material und Methoden 66 Die PFGE von Gesamt-DNA wird, auch für Enterokokken, aufgrund der sehr guten interlaboratorischen Reproduzierbarkeit und hohen Diskriminierungskraft als der „Gold- Standard“ der Typisierungsmethoden angesehen. Nachteilig ist allerdings der relativ hohe Zeitaufwand, der je nach Durchführung etwa vier Tage beträgt. Die Zellen der zu untersuchenden Stämme werden in Agarose eingebettet, zu Blöckchen gegossen und einer (enzymatischen) Zell-Lyse unterzogen. Anschließend wird die Gesamt-DNA je nach Teststamm mit einem selten schneidenden Enzym restringiert und mittels einer Elektrophorese, während der die Polarität des Laufs in bestimmten Intervallen wiederholt geändert wird, separiert. Somit ermöglicht die PFGE eine klare Auftrennung von hochmolekularen DNA-Fragmenten der Größe von 10-800 kb (Olive & Bean, 1999). Die Stämme wurden ÜN in 10 ml MRS-Bouillon bei 37°C angezogen. 4 ml dieser Kulturen wurden bei 10 000 g für 10 min abzentrifugiert, die Zellen mit 4 ml TE-Puffer gewaschen und das Pellet schließlich in 2 ml dieses Puffers gelöst. Diese Zellsuspensionen wurden mit TE- Puffer so verdünnt, dass eine OD610 von 1,87 bis 2,00 erreicht war. Zur Lyse wurden 180 µl der so eingestellten Zellsuspensionen mit jeweils 60 µl Lysozym-Lösung (100 mg/ml), 9 µl Mutanolysin-Lösung (1000 U/ml) und 51 µl TE-Puffer gemischt und für 45 min bei 37°C inkubiert. Zur Vorbereitung der Herstellung von Agarose-Blöckchen wurde eine entsprechende Menge einer PSP-Lösung, bestehend aus 890 µl einer 1,2 %igen InCert- Agarose-Lösung (Cambrex), 100 µl 10 %iger SDS-Lösung und 10 µl Proteinase K-Lösung (20 mg/ml), gemischt und bis zur Zugabe der lysierten Zellen bei 54°C warm gehalten. 300 µl dieser PSP-Lösung wurden schließlich mit je 300 µl der Zellsuspensionen gemischt, in spezielle Formkammern gegossen und die Blöckchen zur Auspolymerisation mindestens 10 min bei 4°C gelagert. Zur weiteren Zell-Lyse in den Agarose-Blöckchen wurden diese ÜN in 4 ml Lyse-Puffer (50 mM Tris, 10 mM EDTA, 1,05 % N-Laurylsarkosin; pH 8,0) mit 30 µl Proteinase K-Lösung (20 mg/ml) bei 54°C bei leichtem Schütteln inkubiert. Danach wurden die Blöckchen zweimal in 15 ml auf 54°C vorgewärmtem sterilen A. bidest für 10 min, und im Anschluss zweimal mit 15 ml vorgewärmten TE-Puffer für 15 min bei 54°C gewaschen. Die so behandelten Blöckchen können dann in TE-Puffer bei 4°C bis zu sechs Monate gelagert werden. Zur enzymatischen Behandlung werden die Blöckchen zuvor je 1 h in frischem TE- Puffer gewaschen und 1 h im jeweiligen Restriktionspuffer äquilibriert. Die Blöckchen wurden anschließend in einem 150 µl-Restriktionsansatz (1 x Restriktionspuffer, 40 U SmaI) im Thermomixer bei 37°C für 27 h inkubiert. Nach Entfernen des Restriktionsansatzes wurden die Blöckchen für 1 h in 0,5 x TBE-Puffer bei RT gespült und schließlich der Pulsfeldgelelektrophorese unterzogen. Diese erfolgte für 28 h bei einer Pulszeit von 1 s- 10 s in einem 1,2 %igem Low-Melt-Agarosegel. Die verwendete Elektrophorese-Apparatur sowie Zubehör (PFGE CHEF-DR III System) wurden von der Firma Bio-Rad Laboratories (München) bezogen. Nach Beendigung der Elektrophorese wurde das Gel 1 h in einer Material und Methoden 67 1 %igen EtBr-Lösung gefärbt, 30 min in A. bidest entfärbt und mittels eines UV- Transilluminators dokumentiert. Die digitalisierten Bilder der entstandenen Fingerprint- Bandenmuster wurden normalisiert und mittels BioNumerics Software (MRI, Karlsruhe; siehe 3.15) ausgewertet. Die Analyse zur Gruppierung (Clustern) der Isolate erfolgte mittlels des Dice-Koeffizienten und des UPGMA (Unweighted Pair Group Method with Arithmetic mean) Cluster-Algorithmus. Nach dem von Tenover et al. (1995) entwickelten standardisierten System zur Interpretation von PFGE-Ergebnissen sind zwei Isolate mit identischen PFGE- Bandenmustern dieselben Stämme, bei Unterschieden von ein bis drei Banden sind die Isolate sehr nah verwandt. 3.12.7.3 Multilocus Variable-Number Tandem-Repeat Analyse bei E. faecium Die aus verschiedenen klinischen Bereichen isolierten E. faecium Stämme wurden zusätzlich zur Untersuchung von Virulenzeigenschaften mit Hilfe einer VNTR-Methode (Variable- Number Tandem-Repeat) nach Top et al. (2004) charakterisiert. Diese Typisierung basiert auf der variablen Anzahl von Tandemrepeats mehrerer bestimmter Loci im Bakterienchromosom, die schnell und leicht mittels spezifischen, diese Regionen flankierenden Primern über PCR detektiert werden können. Im Gegensatz zu verschiedenen anderen Typisierungsmethoden stellt die MLVA (Multilocus Variable-Number Tandem- Repeat Analyse) daher ein gut reproduzierbares und kostengünstiges Verfahren dar, wobei somit ein Datenaustausch auch zwischen einzelnen Forschungslaboren möglich ist. Top et al. (2004) entwickelten ein Typisierungsschema für E. faecium, das auf sechs verschiedenen Tandemrepeat-Loci (VNTR 1, VNTR 2, VNTR 7, VNTR 8, VNTR 9 und VNTR 10) basiert. Jeder Genotyp (MLVA-Typ, MT) besteht somit aus einer Zahlenfolge, die die Anzahl der Tandemrepeats dieser sechs Loci beschreibt (MLVA-Profil). Die Anwendung ermöglicht die Identifizierung wirtsspezifischer Genotypen und Gruppierungen. Eine Web- basierte Datenbank (http://www.mlva.umcutrecht.nl) erlaubt außerdem einen internationalen Vergleich von E. faecium Isolaten. Die Durchführung erfolgte nach den PCR-Ansätzen und Cyclerprogrammen der unten aufgeführten Tabellen in Anlehnung an Top et al. (2004) sowie entsprechende auf der Homepage angegebene Änderungen. Als Kontrollstämme dienten E. faecium E155 (Typ 1: 5-7-3-3-2-3) und E. faecium E734 (Typ 16: 5-6-3-2-2-3). PCR-Ansatz 25 µl PCR-Cyclerprogramm Puffer (MBI) 1x initiale Denaturierung 95°C 15 min dNTPs je 0,2 mM 94°C 30 s MgCl2 1,5 mM 35 Zyklen 52°C 30 s Primer* je 0,5 µM 72°C 1 min Taq-Polymerase 1 U finale Elongation 72°C 5 min Elektrophorese: 2 %iges Agarosegel (TAE) *VNTR1-for/VNTR1-rev (bp variabel) Material und Methoden 68 PCR-Ansatz 25 µl PCR-Cyclerprogramm VNTR2 VNTR7/8/9/10 initiale Denaturierung 95°C 15 min 95°C 15 min Puffer (MBI) 1x 94°C 30 s 94°C 30 s dNTPs je 0,2 mM 10 Zyklen TD 70°C–1°C 30 s 65°C–1°C 30 s MgCl2 1,5 mM 72°C 4 min 72°C 4 min Primer* je 0,5 µM 94°C 30 s 94°C 30 s Taq-Polymerase 1 U 30 Zyklen 60°C 30 s 55°C 30 s 72°C 4 min 72°C 4 min finale Elongation 72°C 5 min 72°C 5 min Elektrophorese: 1 %iges Agarosegel (TAE) *VNTR2-for/VNTR2-rev bzw. VNTR7-for/VNTR7-rev bzw. VNTR8-for/VNTR8-rev bzw. VNTR9-for/VNTR9-rev bzw. VNTR10-for/VNTR10-rev (bp jeweils variabel) 3.12.8 Agarose-Gelelektrophorese zum Nachweis von DNA DNA-Fragmente als negativ geladene Makromoleküle aufgrund ihres Zucker-Phosphat- Rückgrats werden mit Hilfe von Agarosegelen elektrophoretisch aufgetrennt, wobei die Wanderungsgeschwindigkeit im Gel abhängig vom Molekulargewicht, der DNA-Konformation (supercoiled oder linear), der Porengröße des Gels sowie der angelegten Spannung ist. Die Laufstrecke linearer, doppelsträngiger DNA verhält sich innerhalb eines bestimmten Größenbereichs umgekehrt proportional zum Logarithmus ihres Molekulargewichts bzw. ihrer Länge in Kilobasen (kb). Zur Herstellung der Gele wurde die entsprechende Menge Agarose im jeweiligen Elektrophoresepuffer (TAE oder TBE) durch Aufkochen in der Mikrowelle gelöst und nach Abkühlen auf ca. 50°C in den mit einem Gelkamm versehenen Gelträger gegossen, so dass die Gele eine Schichtdicke von ca. 3-8 mm hatten. Die Agarose-Konzentration des Gels betrug je nach Größe der aufzutrennenden Fragmente 0,8 - 2,5 %. Dabei gilt, je kleiner das Fragment, desto höher die Agarose-Konzentration. Nach Polymerisation des Gels und Entfernen des Kamms wurde dieses in der Elektrophoresekammer mit Puffer überschichtet und die mit Ladepuffer versetzten Proben sowie geeignete DNA-Größenmarker in die Taschen gegeben. Im Vergleich zum TAE- ist TBE-Puffer aufgrund der entstehenden, geringeren Porengröße des Gels besser geeignet zur Auftrennung von Fragmenten < 1 kb, außerdem besitzt TBE-Puffer eine höhere Pufferkapazität. Die Gel-Elektrophorese erfolgte bei einer Spannung von ca. 80 V (Minigele, ca. 10 x 8 cm) bzw. ca. 120 V (Maxigele, ca. 30 x 20 cm). Nach Beendigung der Elektrophorese wurde die DNA mit dem interkalierenden Farbstoff Ethidiumbromid (1 mg/l Lösung) ca. 10 min angefärbt, im Anschluss etwa 10 min zur Entfernung von Hintergrund-Färbung in A. bidest gewässert. Die Detektion erfolgte unter UV-Licht auf einem Transilluminator, die Auswertung und Dokumentation des Gels mit Hilfe eines geeigneten Kamera- und Softwaresystems. Material und Methoden 69 3.12.9 DNA-Sequenzierung Zur Sequenzierung bestimmter PCR-Fragmente wurde der Service der Firma GATC (Konstanz) in Anspruch genommen. Die Amplifikate wurden mit Hilfe eines PCR Purification Kits (Qiagen, Hilden oder Promega, Mannheim) nach Angaben des Herstellers aufgereinigt, und die Lösung auf eine Konzentration von ca. 50 ng/µl eingestellt. Von diesen Fragmenten wurde mit Hilfe des jeweiligen Primers mittels Fluoreszenz-Technik die Sequenz bestimmt und mittels entsprechender PC-Software (siehe 3.15) ausgewertet. 3.12.10 Gesamt-RNA-Extraktion Im Umgang mit RNA muss stets auf eine RNase-freie Arbeitsumgebung geachtet werden, da Ribonukleasen als sehr stabile und aktive Enzyme, die zu ihrer Funktion i.d.R. keine Co- Faktoren benötigen, extrahierte RNA schnell und effizient zerstören. Hände und Staubpartikel, die Bakterien und Pilze tragen können, sind die häufigsten Quellen von RNase-Kontaminationen. RNasen sind allerdings schwer zu inaktivieren, so dass neben der Vermeidung des RNase-Eintrags durch steriles Arbeiten und dem Tragen von Handschuhen auch eine besondere Vorbehandlung der verwendeten Geräte und Verbrauchsmaterialien zur Entfernung von RNasen notwendig ist. Daher wurde bei diesen Arbeiten stets auf die Benutzung von DNase-/RNase-freien und gefilterten Pipettenspitzen, der Verwendung von DEPC-behandeltem Wasser bei der Herstellung bestimmter Lösungen sowie dem sorgfältigen Reinigen von Glaswaren und Elektrophoresekammern (SDS-Lösung, EtOH und H2O2-Lösung) geachtet. Die Gesamt-RNA wurde mit Hilfe des SV Total RNA Isolation Kits nach Anleitung des Herstellers mit Änderungen bzgl. der Zell-Lyse extrahiert. Die Teststämme wurden 1:100 aus einer Vorkultur in 3 ml TSBG bei 37°C bis zu einer OD600 ~ 0,8 inkubiert (mittlere bis späte log-Phase) und 1 ml der Kultur als Ausgangsmaterial für die Gesamt-RNA-Isolierung eingesetzt. Nach Zentrifugation wurde das Pellet (ca. 1x109 Zellen) in TE-Puffer mit Mutanolysin (0,04 mg/ml) und Lysozym (3 mg/ml) resuspendiert und bei 37°C für 1,5 h inkubiert. Alle weiteren Schritte erfolgten nach Anweisung des Herstellers. Die RNA-Lösung wurde zur Lagerung bis zu drei Monate bei -70°C aufbewahrt. Vor Analyse mittels RT-PCRs wurde ein Aliquot der RNA-Lösung mindestens dreimal einer enzymatischen Behandlung mit DNase I (MBI Fermentas) gemäß den Herstellerangaben unterzogen. Nach der Inkubation wurde 1 µl EDTA-Lösung (25 mM; MBI Fermentas) zur Stabilisierung der RNA während eines folgenden DNase I-Inaktivierungsschritts für 10 min bei 65°C zugegeben. Von der so behandelten RNA-Lösung wurde 1 µl pro 25 µl RT-PCR- Ansatz eingesetzt. Material und Methoden 70 3.12.11 Photometrische Konzentrationsbestimmung von RNA Die Extinktion eines Aliquots der RNA-Lösung wurde bei 260 nm und 280 nm gemessen. Zur Konzentrationsbestimmung lag folgender Richtwert zugrunde: 1 E260 ssRNA entspricht 40 µg/ml Hochreine RNA lag bei einem Quotienten E260 / E280 ≥ 2,0 vor. Werte < 2,0 wiesen auf eine Verunreinigung der Probe mit Proteinen und aromatischen Substanzen hin (Mülhardt, 2003). 3.12.12 Formamid-Gelelektrophorese zum Nachweis von RNA Zur Durchführung der Formamid-Gelelektrophorese wurde Agarose (1,5 %) in MOPS-Puffer aufgekocht, nach dem Abkühlen Formaldehyd (37 %; Endkonzentration in Gel: 0,66 M) zugegeben und in einen Gelträger gegossen. Die Beladung des Gels erfolgte mit wie in der unten dargestellten Tabelle behandelten Proben. Ansatz 30 µl RNA 10 µg MOPS-Puffer (10 x) 3 µl deionisiertes Formamid 10 µl Formaldehyd (37 %) 4 µl DEPC-H20 ad 30 µl Inkubation: 65°C / 5 min Die Proben wurden 5 min bei 65°C denaturiert, auf Eis gekühlt und 3 µl RNA-Ladepuffer zugegeben. Nach Auspolymerisation des FA-Gels und Auftragen der Proben wurde die Elektrophorese bei ca. 60 V in MOPS-Puffer durchgeführt. Das mit EtBr gefärbte Gel (10 min) wurde dann ÜN in DEPC-H2O zur Entfernung der Hintergrundfärbung gewässert und zur Dokumentation auf einem UV-Transilluminator betrachtet. 3.12.13 RT-PCR Zum Nachweis der Transkription bestimmter Gen-Loci wurde das AccessQuick™ RT-PCR System nach Anleitung des Herstellers verwendet. Mit Hilfe dieses Kits können beide Reaktionen einer RT-PCR, Reverse Transkription und PCR-Amplifikation, in einem Ansatz durchgeführt werden („One-Step RT-PCR“). Im zweifach-konzentrierten Master-Mix sind Tfl- DNA-Polymerase, dNTPs, MgCl2 und Reaktionspuffer enthalten, so dass zum Ansatz lediglich Primer, RNA-Template und AMV-Reverse Transkriptase zugegeben werden müssen. Die zur Synthese von cDNA eingesetzte Reverse Transkriptase wird als RNA- abhängige DNA-Polymerase aus dem Vögel befallenden Myoblastose-Virus (Retrovirus AMV, “Avian Myeloblastosis Virus“) isoliert und besitzt zusätzlich eine für RNA-DNA- Heteroduplexmolekule spezifische Ribonuklease-H-Aktivität. Die separate Haltung des AMV- Enzyms ist insbesondere notwendig zur Durchführung der wichtigen Kontrollreaktionen, bei Material und Methoden 71 denen gleichzeitig zur jeweiligen RT-PCR ein weiterer, identischer Ansatz ohne Reverse Transkriptase mitgetestet wird, um etwaige DNA-Kontaminationen auszuschliessen. Mit Hilfe der nach unten aufgeführter Tabelle beschriebenen RT-PCR-Ansätze wurde die Transkription verschiedener Virulenzfaktoren-Gene bei den Wildtyp- und BF- Mutantenstämmen untersucht, die jeweiligen Primer und Cyclerprogramme sind den Ausführungen unter Abschnitt 3.12.6 zu entnehmen. Bei jeder RT-PCR wurden stets Kontrollreaktionen ohne AMV-Enzym mitgeführt. RT-PCR-Ansatz 50 µl RT-PCR-Cyclerprogramm Master-Mix 1x Reverse Transkription 45°C 45 min Primer-for 0,5 µM initiale Denaturierung Primer-rev 0,5 µM RNA ca. 100 ng PCR-Zyklen AMV-Enzym 5 U finale Elongation abhängig vom eingesetzten Primerpaar Elektrophorese: abhängig vom nachzuweisenden Fragment, 1-2,5 %iges Agarosegel (TAE) 3.13 Proteinbiochemische Methoden 3.13.1 Extraktion von Zellwand-assoziierten Proteinen Um eventuelle Unterschiede in der Expression Biofilm-assoziierter Zellwandproteine bei Wildtyp- und BF-Mutantenstämmen festzustellen, wurden eine Extraktionsmethode in Anlehnung an Nallapareddy et al. (2006) durchgeführt. Die Teststämme wurden in 50 ml TSBG-Medium bei 37°C und ca. 100 rpm inkubiert, bis die Kulturen die späte log-Phase (OD600 ~ 0,8) erreicht hatten. Nach Abzentrifugieren der Kulturen für 15 min bei 3750 rpm wurden die Zellen zweimal mit 15 ml sterilem Puffer W (0,02 M Tris/HCl (pH 7,0), 0,01 M MgSO4) gewaschen und das Pellet in 750 µl Puffer W aufgenommen. Die in diesem Puffer enthaltenen Kat- und Anionen tragen zur Stabilisierung der Proteine bei. Nach Zugabe von 1 mM des Protease-Inhibitors PMSF und 3 mg/ml Lysozym folgte eine Inkubation für 1 h bei 37°C. Es folgte eine Zentrifugation bei 12 000 g und 4°C für 10 min, danach wurde der proteinhaltige Überstand abgenommen und einer Aufkonzentrierung mittels Aceton-Fällung unterzogen. Hierzu wurde ein Aliquot des Überstands mit 3 VT Aceton (100 %) versetzt und mindestens 4 h bei -20°C gefällt. Nach Zentrifugation (12 000 g, 4°C, 15 min) wurde das Protein-Pellet bei RT getrocknet und in sterilem A. bidest (1/5 VT, 45-60 µl) gelöst, davon wurden gemäß Konzentrationsbestimmung (siehe 3.13.2) jeweils gleiche Mengen (ca. 15 µl) auf ein PA-Gel aufgetragen. Material und Methoden 72 3.13.2 Konzentrationsbestimmung von Proteinen Zur Bestimmung der Proteinkonzentration in einer Lösung wurde die Methode nach Bradford (1976) angewandt. Der Farbstoff Coomassie Brilliant Blue reagiert mit basischen Aminosäuren. Dabei verschiebt sich das Absorptionsmaximum der rötlich-braunen Form von 465 nm hin zu 610 nm bei der blauen Form des Farbstoffs, wobei die Differenz der beiden Formen bei 595 nm am größten ist und somit die optimale Wellenlänge zur OD-Messung des Farbstoff-Protein-Komplexes darstellt. Durch die Messung der Absorption bei dieser Wellenlänge kann die Konzentration einer unbekannten Proteinlösung einfach bestimmt werden. Rinderserumalbumin (BSA) hat sich als international anerkannter Standard für die Erstellung einer Eichgeraden durchgesetzt. Zur Ermittlung der in einer Probe enthaltenen Gesamtproteinmenge wurde 100 µl Probenvolumen (evtl. verdünnt) mit 1 ml Bradford- Reagenz gut gemischt, 10 min bei RT inkubiert und dann die OD595 gegen eine Blindprobe gemessen. Durch Vergleich mit der mittels BSA erstellten Eichgerade (0,025 - 0,2 mg/ml) konnte eine Konzentrationsbestimmung der Proteine in der Probe erfolgen. 3.13.3 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese Zur Analyse von Proteingemischen ermöglicht das diskontinuierliche System nach Lämmli eine schnelle Bestimmung der Molekulargewichte. Während der SDS-Polyacrylamid- Gelelektrophorese (SDS-PAGE) werden im elektrischen Feld Proteine unter denaturierenden Bedingungen in Abhängigkeit von ihrer Größe aufgetrennt, was dadurch ermöglicht wird, dass das im Puffer und Polyacrylamidgel enthaltene SDS in konstantem Verhältnis an die Proteine bindet. Somit erhalten die Proteine eine gleichartige negative Ladung pro Masseeinheit (1,4 g SDS pro g Protein), wodurch die Eigenladung des Proteins unerheblich wird. Das anionische Detergenz SDS führt außerdem zur Auflösung von Tertiär- und Quartärstrukturen. Dieses sogenannte Tris-Glycin-System bewirkt eine Konzentrierung an der Übergangsstelle zwischen Sammel- und Trenngel, so dass zum einen gut definierte Banden entstehen, und zum anderen die Aggregation und Präzipitation der Proben während des Eintritts in die Gelmatrix verhindert wird. Polyacrylamidgele sind durch die Kopolymerisation von Acrylamid und dem quervernetzenden N,N-Methylen-Bisacrylamid chemisch inert und besonders stabil, wobei sich die Porengröße der Gele durch das Verhältnis der Konzentration an Acrylamid bestimmt. Um große Proteine aufzutrennen, werden Gele mit geringem Acrylamid-Anteil benutzt (Rehm, 2002). Die Komponenten des Trenngels wurden gemäß der unten aufgeführten Tabelle (ausreichend für zwei Gele) zusammengegeben, die Lösung nach Zugabe von APS zwischen die Spacer-Platten gefüllt und mit Isopropanol (100 %) überschichtet, so dass eine glatte Gelfront entstanden ist. Nach Polymerisation des Trenngels wurde die Front mit A. bidest gespült und das Sammelgel in gleicher Weise über das Trenngel gegossen. Zu Material und Methoden 73 untersuchende Protein-Proben wurden mit SDS-Probenpuffer im Verhältnis 1:4 gemischt, für 5 min bei 95°C denaturiert und im Anschluss nach Auftrag auf das Gel bei 100 V der Elektrophorese unterzogen. Stammlösungen Trenngel (12%, 10 ml) Sammelgel (6%, 5 ml) Trenn- bzw. Sammelgelpuffer (4 x) 2,5 ml 1,25 ml Acrylamidlösung (30%) 4 ml 1 ml TEMED 10 µl 5 µl APS-Lösung (100 mg/ml) 100 µl 50 µl A. bidest 3,39 ml 2,7 ml Da die Größe der Zellwandproteine, die bei den Wildtyp- und BF-Mutantenstämmen von Interesse waren, im MG-Bereich von > 85 kDa lag, wurden die Proben zusätzlich auf einem kommerziell erwerblichen SDS-Gradientengel (NuPAGE® Novex; Invitrogen, Karlsruhe) mit einer Konzentration von 4 – 12 % analysiert. Die Anfärbung der Gele erfolgte mittels Coomassie-Färbelösung (kolloidal, siehe 3.6.1). 3.13.4 Identifizierung von Proteinen mittels Massenspektrometrie Die Durchführung der eindimensionalen Gradienten-Gelelektrophorese sowie die Identifizierung differentiell exprimierter Proteinen bei Wildtyp- und BF-Mutantenstämme mittels Massenspektrometrie erfolgten in der Abteilung Biochemie / Universität Kassel nach Gesellchen et al. (2006). Massenspektrometrie ist eine Analysentechnik zur Bestimmung der Molekülmasse freier Ionen im Hochvakuum, wobei die Empfindlichkeit dieses Verfahrens bis in den femto- (10-15) bis subfemtomolaren Bereich geht (Lottspeich & Engels, 2006). Ein Massenspektrometer besteht aus einer Ionenquelle, einem Massenanalysator, der die Ionen bzgl. des Masse/Ladungs-Quotienten (m/z) auftrennt, und einem Detektor. Bei dem hier verwendeten Massenspektrometer handelt es sich um eine lineare Hybrid-Tripelquadrupol- Ionenfalle, welche aus einer nano-Elektrospray-Ionisierungsquelle (nano-ESI, Ionenquelle) und einem linear angeordneten Tripelquadrupol (Massenanalysator) besteht. Die vorherige Auftrennung des Peptidgemisches erfolgte mittels RP-HPLC (reversed phase high performance liquid chromatography, Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromato- graphie). Nach elektrophoretischer Auftrennung der Proteine wurden diejenigen Banden aus dem zuvor in Wasser äquilibrierten SDS-Gradientengel herausgeschnitten, die in Wildtyp- und Mutantenstamm jeweils Unterschiede aufwiesen. Die in den ausgeschnittenen Banden enthaltenen Proteine wurden nach einem Verfahren nach Rosenfeld et al. (1992) mit Unterlassung aller Vorwaschschritte einer Protein-In-Gel-Restriktion mit Trypsin unterzogen. Hierzu wurden die Gel-Blöckchen mittels Zentrifugation (16 000 g) durch eine 10 µl Pipettenspitze zu sehr kleinen Stücken reduziert und nach Zugabe von jeweils 25 µl Puffer (50 mM NH4HCO3) und 10 ng/µl Trypsin (Promega, Mannheim) 1 h bei 50°C inkubiert. Die Material und Methoden 74 Überstände wurden mit 40 µl HCOOH verdünnt und anschließend mittels nanoLC-ESI- MS/MS analysiert. Dies erfolgte mit Hilfe des nanoLC-Ultimate HPLC-Systems (LC Packings, Dionex), das mit einem linearen Ion-Trap-Massenspektrometer (4000QTRAPTM, Applied Biosystems) verbunden war. Jede Probe (5 µl) wurde in zwei konsekutiven Durchläufen analysiert. Nach einem positiven MS Full Scan (EMS) im linearen Ion-Trap-Modus (400-1400 amu) erfolgte ein Enhanced Resolution Scan (ER) der vier intensivsten Signale des EMS Scans. Der Ladungsstatus, der aus dem ER hervorging, definierte die Kollisionsenergie für den anschließenden Enhanced Product Ion Scan (EPI, 100-1700 amu). Ein Abgleich der MS/MS Spektra mit einer Sequenzdatenbank (MSDB) erfolgte unter Zuhilfenahme der PC- Software MASCOT (Matrix Science, Version 1.9.05). Ein Probendurchgang dauerte ca. 80 min, die Zyklenzeit der MS- und MS/MS-Scans betrug 3,7 sec. Die Identifizierung von Proteinen wurde als gesichert angesehen, wenn die Analyse einen Gesamt-Score von über 50 und mindestens zwei Peptide mit einem minimalen Peptid-Score von 10 ergeben hatte. Die Identifizierung der Proteine jeder Bande wurde mindestens zweimal durchgeführt. 3.14 Mikroskopie 3.14.1 Rasterelektronen-Mikroskopie Die Rasterelektronen-Mikroskopie (REM) ist eine wichtige Methode zur Oberflächen- strukturanalyse, bei der ein sehr fein gebündelter Elektronenstrahl zeilenweise über die Objektoberfläche geführt wird. Die dabei durch die Primärelektronen im Objekt erzeugten Wechselwirkungsprodukte (Sekundärelektronen etc.) werden erfasst und zur Bilddarstellung verwendet. Somit können Strukturen mit einem Auflösungsvermögen von nur wenigen Nanometern mit einer gegenüber dem Lichtmikroskop 1000fach größeren Schärfentiefe untersucht werden. Das REM besteht prinzipiell aus folgenden Komponenten: einem Elektronenstrahlenerzeuger, einem Linsensystem, Ablenkelementen, einem Detektor und dem Bildgebungssystem. Die Sekundärelektronen werden von dem seitlich schräg über der Probe angebrachten Detektor aufgefangen. Dadurch entsteht u.a. die Plastizität der Objekte, da durch die schräge Anordnung dem Detektor zugewandte Details heller erscheinen als abgewandte Strukturen. Des Weiteren ist die Intensität der Sekundärstrahlung vom Neigungswinkel der Objektoberfläche abhängig. Mittels REM können nur leitende Oberflächen dargestellt werden, so dass die zu untersuchenden Proben speziell präpariert müssen werden. Da die Abtastung mit dem Elektronenstrahl im Hochvakuum stattfindet, müssen die Objekte zunächst so präpariert werden, dass sie absolut wasserfrei sind. Im Anschluss daran werden durch Aufdampfen eines Metallfilmes (i.d.R. Platin oder Gold) die Oberflächen der biologischen Objekte leitend gemacht. Dabei ist darauf zu achten, dass nicht zu stark bedampft wird, da sonst die feinen Strukturen des Objekts abgedeckt werden. Material und Methoden 75 Das hohe Auflösungsvermögen dieser Methode steht dem großen apparativen und präparativen Aufwand gegenüber, sowie dem Nachteil, dass Untersuchungen an lebenden biologischen Objekten nicht möglich sind (Reimer, 1998; Lottspeich & Engels, 2006). Eine ÜN-Kultur der zu untersuchenden Stämme wurde 1:10 in TSBG verdünnt und auf einem runden Glasdeckgläschen bei 37°C für 18 h bzw. 4 h angezogen. Als Schutz vor Verdunstung erfolgte dies in einer mit einigen Tropfen A. bidest befüllten Petrischale, so dass eine sog. feuchte Kammer hergestellt wurde. Nach der Inkubation wurde das Medium entfernt, die am Gläschen adhärierten Zellen dreimal mit Soerensen-Puffer (pH 7,2) gewaschen und mindestens 2 h bei RT mit Glutardialdehyd-Lösung (2,5 %) fixiert. Es folgten dreiminütige Waschschritte jeweils mit Soerensen-Puffer, mit Soerensen-Puffer (50 %) und A. bidest, bevor die Zellen mit Osmiumtetroxid-Lösung (1 %) für mindestens 2 h postfixiert wurden. Anschließend wurden die Proben einmal mit A. bidest gewaschen und dann durch die Behandlung mit Ethanol entwässert. Hierzu wurde jeweils 8 min mit Ethanol von aufsteigender Konzentration (30 %, 50 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 94 %, 97 %, 100 %) gewaschen. Gegebenenfalls wurden die Proben ÜN in Ethanol (100 %) gelagert. Im Anschluss konnten die Proben einer Trocknung über den Kritischen Punkt unterzogen werden, wobei in mehreren Zyklen das Ethanol bei 10°C und ca. 60 bar gegen flüssiges CO2 ausgetauscht wurde. Die so getrockneten Proben wurden mittels spezieller selbstklebender, leitender Folie auf Mikroskophalterungen aufgebracht und anschließdend mit Platin bedampft. Die Durchführung der Mikroskopie erfolgte bei einer Spannung von 10 kV mit einem REM Hitachi S-4000 in der Abteilung Zellbiologie / Universität Kassel. Die REM der Zellen, die für 18 h angezogen wurden, wurde insgesamt zweimal in unabhängigen Ansätzen durchgeführt. 3.14.2 Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie Konfokale Laser-Scanning-Mikroskope (confocal laser scanning microscope, CLSM) ermöglichen dreidimensionale Abbildungen von Strukturen, da sie in der Lage sind, optische Schnitte von Proben aufzunehmen, die mittels Software zu einem dreidimensionalen Bildstapel zusammengefügt werden. CLSM werden vornehmlich im Fluoreszenzmodus betrieben, da spezifische Probenbestandteile durch verschiedene Techniken selektiv angefärbt und dargestellt werden können. Als Lichtmikroskop hat ein CLSM ein deutlich geringeres Auflösungsvermögen im Vergleich zu einem Elektronenmikroskop, hat aber den großen Vorteil, dass Untersuchungen oder quantitative Messungen von Prozessen zerstörungsfrei im Inneren von Objekten, also auch an lebenden Objekten möglich sind. Das konfokale Prinzip beruht darauf, dass durch die in konjugierten Ebenen zur Fokusebene des Objektives „kon“-„fokal“ platzierte Anregungs- und Detektionslochblende das Laserlicht nur aus einem sehr kleinen Probenbereich auf den Detektor gelangt. Zur Abbildung einer Material und Methoden 76 kompletten Objektebene wird die Probe mittels einer Rasteroptik in x-y-Richtung gescannt und so Punkt für Punkt ein Bild erzeugt, das einem optischen Schnitt durch eine frei wählbare Ebene des Objekts entspricht. Dies kann zur Darstellung weiterer Objektebenen für verschiedene axiale Koordinaten wiederholt werden. Als Anregungslichtquelle dienen Laser, aus denen über einen speziellen Filter selektiv die Laserlinien ausgewählt werden, mit der die Probe beleuchtet werden soll (Lottspeich & Engels, 2006). Zur Betrachtung „lebender“ Biofilme wurden Enterokokken-Stämme mittels konfokaler Laser- Scanning-Technik mikroskopiert. Hierzu wurde eine ÜN-Kultur des Teststamms 1:100 in TSBG verdünnt und in einer mittels eines Silikonrings hergestellten Kammer auf einem Glasobjektträger für 18 h bei 37°C angezogen. Nach dreimaligem Waschen mit PBS-Puffer wurden die Zellen mit einer Acridinorange-Lösung (100 µg/ml) für 10 min bei RT angefärbt. Im Anschluss an einen wiederholten dreimaligen Waschschritt wurden die Biofilme während der Mikroskopie mit 2 ml PBS-Puffer hydriert gehalten. Die Darstellung erfolgte mittels eines CLSM (Leica TCS SP, Abt. Zellbiologie / Universität Kassel) mit einer Anregungswellenlänge von 488 nm, wobei eine Emission bei ca. 520 nm durch Interkalierung des Farbstoffs in DNA und bei ca. 650 nm durch Komplexbildung des Farbstoffs mit RNA detektiert wird. Die Mikroskopie wurde insgesamt zweimal in unabhängigen Ansätzen durchgeführt. 3.15 Statistische Auswertung und sonstige verwendete Computer-Software Statistische Analysen wurden mit dem PC-Programm Prism 4.03 (GraphPad Software: LaJolla, CA) durchgeführt (Abt. Biochemie / Universität Kassel). Der Vergleich und die Alignments von DNA- und Proteinsequenzen und deren Auswertung erfolgte mit dem Programm BioEdit 7.0.8 (Ibis Biosciences, Carlsbad, CA) sowie MegAlign 7.0 (DNASTAR Lasergene Software; MRI Karlsruhe). Die Darstellung und Interpretation von rep-PCR- und PFGE-Bandenmuster (DNA-Fingerprints) erfolgte mittels BioNumerics Software 2.5 (Applied Maths, Kortrijk, Belgien; MRI Karlsruhe). Primer-Design wurde mit Hilfe des Programms GeneFisher 2.0 (BiBiServ, Technische Fakultät / Universität Bielefeld) durchgeführt. Ergebnisse 77 4 Ergebnisse Im Rahmen dieser Arbeit stellte zunächst die Untersuchung des Vorkommens verschiedener Virulenzfaktoren und der Biofilm-Bildung bei Enterokokken aus unterschiedlichem klinischen Isolierungsmaterial einen Schwerpunkt dar. Insgesamt wurden 150 E. faecalis Stämme (siehe 4.1) und 78 E. faecium Isolate (siehe 4.2) sowie 80 E. faecalis aus Vaginalabstrichen (siehe 4.3) charakterisiert. Zur Identifizierung der Spezies wurden zunächst biochemische Tests mittels kommerzieller Nachweisverfahren angewandt (siehe 3.10.2). Alle Stämme wurden zusätzlich mit Hilfe einer Multiplex-PCR (siehe 3.12.6) auf Spezies-Ebene identifiziert. Ferner wurden Antibiogramme der Isolate erstellt (siehe Tab. 23 und Tab. 28 im Anhang). Ein weiterer Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit stellte die Charakterisierung von Biofilm- Spontanmutanten von E. faecalis Isolaten dar (siehe 4.5). Diese Stämme (1.3 und 1.3.7, 1.10 und 1.10.16 sowie 2.11 und 2.11.8) wurden mittels phänotypischer und molekularbiologischer Methoden untersucht, um potenzielle neue Einflussfaktoren der Biofilm-Bildung bei E. faecalis zu identifizieren. 4.1 E. faecalis isoliert aus verschiedenem klinischen Material 4.1.1 Phänotypischer und genotypischer Nachweis von Virulenzfaktoren Die Tab. 11 stellt die Ergebnisse der Nachweise bestimmter Virulenzfaktoren bei den 150 untersuchten E. faecalis verschiedener Herkunft dar. Die Betrachtung der Gesamtinzidenzen zeigte, dass von diesen Stämmen 46,0 % zur Gelatinase-Expression und 24,0 % zur β-Hämolyse befähigt waren. Bei 38,7 % wurde das cylA Gen, bei 52,7 % das esp Gen, bei 72,0 % das asa1 Gen und bei 82,0 % das gelE Gen nachgewiesen. Außerdem wurde dieses Kollektiv auf das Vorkommen des Genlocus ef0591 gescreent, welcher für ein noch nicht charakterisiertes putatives Zellwandprotein codiert (Creti et al., 2004). Dieses Gen fand sich insgesamt lediglich bei 18,7 % der 150 Isolate. Bei Auswertung dieser Inzidenzen in Hinblick auf Isolate, die aus Faeces, Urin, Wunden und invasiver Herkunft stammten, ergaben sich nur in wenigen Fällen geringe Unterschiede in dem prozentualen Auftreten unter den Gruppen. So waren 38,6 % der Urin-Stämme zur Gelatinase-Produktion befähigt, während dieser Nachweis bei 52,6 % der Stämme invasiver Herkunft positiv ausfiel. β-Hämolyse zeigte sich nur bei 10,5 % und 16,2 % der Isolate invasiver Herkunft bzw. Faeces, wohingegen Urin-Stämme zu 29,5 % und Wund-Isolate zu 30,8 % hämolysierend waren. Das Auftreten des cylA Gens variierte zwischen ca. 32 % (E. faecalis aus Faeces und invasiver Herkunft) über 40,9 % (Urin-Isolate) und 50,0 % (Stämme aus Wunden). Der Nachweis des esp Gens ergab bei allen der vier Gruppen eine Häufigkeit von ca. 53 %, das Vorkommen des asa1 Gens lag zwischen 67,6 % und 77,3 %. Das gelE Ergebnisse 78 Gen konnte in fast allen Gruppen zu ca. 84 % nachgewiesen werden, lediglich bei den Faeces-Isolaten trat das Gen etwas weniger häufig auf (73,0 %). Eine statistische Analyse der Inzidenzen bei den E. faecalis, die aus Faeces, Urin, Wunden und invasiver Herkunft isoliert wurden, erbrachte allerdings in keinem der Fälle signifikante Unterschiede zwischen den Verteilungen der Virulenzfaktoren in diesen vier Gruppen (χ 2 -Test, P < 0,05). Tab. 11 Ergebnisse der Nachweise von Virulenzfaktoren bei E. faecalis verschiedener klinischer Herkunft GelE, Gelatinase-Produktion; β-Häm, β-Hämolyse-Nachweis; cylA, esp, asa1, gelE, Nachweis der Gene; Details zur Herkunft und einzelnen Ergebnissen der Isolate siehe 3.9.1 und Anhang; *, Anzahl enthält die aufgeführten Stämme sowie Isolate aus Umweltproben (4 Stämme) und diversem Probenmaterial (20 Stämme); χ2-Test zur Feststellung signifikanter Unterschiede zwischen den Verteilungen in den Gruppen Faeces, Urin, Wunden und invasive Herkunft; ns, nicht signifikant. Herkunft Anzahl Stämme GelE β-Häm cylA esp asa1 gelE 15 6 12 20 25 27 Faeces 37 40,5% 16,2% 32,4% 54,1% 67,6% 73,0% 17 13 18 23 34 37 Urin 44 38,6% 29,5% 40,9% 52,3% 77,3% 84,1% 11 8 13 14 19 22 Wunden 26 42,3% 30,8% 50,0% 53,8% 73,1% 84,6% 10 2 6 10 14 16 Invasiv 19 52,6% 10,5% 31,6% 52,6% 73,7% 84,2% 69 36 58 79 108 123 Insgesamt 150* 46,0% 24,0% 38,7% 52,7% 72,0% 82,0% χ 2-Test bzgl. der Gruppen Faeces, Urin, Wunden und Invasive Herkunft P-Wert 0,7726 0,2053 0,4749 0,9984 0,8094 0,5387 Signifikanz (P < 0,05) ns ns ns ns ns ns Der Genlocus ef0591 konnte am häufigsten in Faeces- und Wund-Isolaten detektiert werden (27,0 % und 30,8 %), in Stämmen aus Urin zu 15,9 % und von invasiver Herkunft lediglich zu 5,3 %, wodurch sich eine Gesamtinzidenz von 18,7 % ergab. Auch hier konnte allerdings kein signifikanter Unterschied (P = 0,1168) zwischen den einzelnen Gruppen errechnet werden. Darüber hinaus wurde das Vorkommen des asa373 Gens, das lediglich in einem (Isolat 1.8) von 150 analysierten Stämmen nachgewiesen werden konnte, und des bee Locus (bee1-3) untersucht. Letzterer kam in acht von 150 E. faecalis Isolaten vor (5,3 %), unter diesen fanden sich sieben starke und ein mäßiger (Isolat 5.4) Biofilm-Bildner. Ergänzend wurde die Fähigkeit zur Lipase-Produktion getestet, welche bei keinem der Stämme nachgewiesen werden konnte. Ferner wurden drei Stämme positiv auf die Bildung Ergebnisse 79 von DNase getestet. Das ace Gen konnte bei allen Isolaten über den Nachweis der B- Repeats detektiert werden, wobei die überwiegende Anzahl der E. faecalis 2,4 (23,3 %), 3,4 (29,3 %) oder 4,4 (42,0 %) Tandemrepeats der B-Domäne aufwies. Ferner wurde die Anzahl der A- und C-Repeats der esp-positiven Stämme bestimmt. Hierbei kamen bei der Mehrheit der esp-positiven Isolate zwei (57,0 %) oder drei (30,4 %) A-Repeats sowie entweder sechs (20,2 %), sieben (32,9 %) oder acht (22,8 %) C-Repeats vor. 4.1.2 Vorkommen von Biofilm-Bildung Die unter 4.1.1 aufgeführten 150 E. faecalis aus Faeces, Urin, Wunden, invasiver Herkunft, der Umwelt sowie diversem Probenmaterial wurden des Weiteren auf ihre Fähigkeit zur Biofilm-Bildung untersucht. Die Tab. 12 gibt eine Zusammenfassung der Ergebnisse in Hinblick auf das Auftreten von Stämmen, die keinen, einen mäßigen oder einen starken Biofilm (BF) bilden können. Außerdem sind die jeweils berechneten arithmetischen Mittelwerte sowie Mediane einer Herkunftsgruppe aufgeführt. Der Median (oder Zentralwert Z) halbiert die nach der Größe geordnete Folge der Einzelwerte, so dass die gleiche Anzahl an Messwerten (50 %) unterhalb und oberhalb von Z liegen (Köhler et al., 2002). Von den insgesamt 150 untersuchten E. faecalis Isolaten waren etwa die Hälfte (48,0 %) keine BF-Bildner und jeweils ca. ein Viertel mäßige (23,3 %) und starke (28,7 %) BF- Produzenten. Diese Aufteilung variierte allerdings stark unter den jeweiligen Gruppierungen nach Isolierungsmaterial. So fanden sich unter den Stämmen aus Urin sowie aus invasiver Herkunft um die 40 % (38,6 % bzw. 42,1 %) starke BF-Bildner und zu ca. jeweils 30 % mäßige und keine BF-Produzenten (29,5 % und 31,8 % bzw. 26,3 % und 31,6 %). Entsprechend wurden hier auch höhere Mittelwerte (0,318 und 0,455) und Mediane (0,166 und 0,190) im Vergleich zu den anderen Herkunftsgruppen errechnet. Im Gegensatz dazu konnten unter den Isolaten aus Faeces und Wunden jeweils ca. 60 % (56,8 % und 61,5 %) E. faecalis ausgemacht werden, die keinen BF bildeten, und zu je etwa 20 % solche Stämme, die eine mäßige (24,3 % und 19,2 %) oder starke (18,9 % und 19,2 %) BF- Bildungsfähigkeit besaßen. Die arithmetischen Mittelwerte der Isolate aus Faeces- und Wunden lagen bei 0,210 und 0,163, die Mediane bei 0,104 und 0,090. Ergebnisse 80 Tab. 12 Vorkommen von Biofilm-Bildung bei E. faecalis verschiedener klinischer Herkunft OD595 < 0,120, kein BF-Bildner; 0,120 ≤ OD595 ≤ 0,240, mäßige BF-Bildner; OD595 > 0,240, starker BF-Bildner; OD595 > 0,5, sehr starker BF-Bildner, diese Stämme sind in der Kategorie der starken BF-Bildner (OD595 > 0,240) ebenfalls enthalten; Details zur Herkunft der Isolate siehe 3.9.1 und Anhang; *, Anzahl enthält die aufgeführten Stämme sowie Isolate aus Umweltproben (4 Stämme) und diversem Probenmaterial (20 Stämme). Herkunft Anzahl Stämme OD595 < 0,120 0,120 ≤ OD595 ≤ 0,240 OD595 > 0,240 davon OD595 > 0,500 Mittel- wert / Median 21 9 7 2 Faeces 37 56,8% 24,3% 18,9% 5,4% 0,210 / 0,104 14 13 17 7 Urin 44 31,8% 29,5% 38,6% 15,9% 0,318 / 0,166 16 5 5 1 Wunden 26 61,5% 19,2% 19,2% 3,8% 0,163 / 0,090 6 5 8 3 Invasiv 19 31,6% 26,3% 42,1% 15,8% 0,455 / 0,190 72 35 43 16 Insgesamt 150* 48,0% 23,3% 28,7% 10,7% 0,320 / 0,127 4.1.3 Zusammenhang von Biofilm-Bildung mit bestimmten Virulenzfaktoren Auf Grundlage der in 4.1.1 und 4.1.2 dargestellten Ergebnisse konnten mittels statistischer Auswertung Zusammenhänge zwischen der Menge an gebildetem BF und dem Vorkommen bestimmter Virulenzfaktoren erfasst werden, die in den Abb. 6 bis Abb. 10 dargestellt werden. Dies sollte Aufschluss über den Einfluss eines bestimmten oder mehrerer bekannter Virulenzfaktoren auf die Biofilm-Bildungsfähigkeit bei E. faecalis geben. In Abb. 6 ist der Vergleich von Stämmen, die das esp Gen tragen, mit solchen Isolaten, die esp-negativ sind, in Abhängigkeit von der jeweils produzierten Menge an BF graphisch dargestellt. Die statistische Analyse mittels Mann-Whitney Test (P < 0,05) ergab, dass sich die Mediane der beiden Gruppen signifikant unterscheiden (P = 0,0019). Der Median der Gruppe der esp-positiven Stämme (Z = 0,1720) war somit signifikant höher als der Wert der esp-negativen Stämme (Z = 0,0970). Dennoch konnten in beiden Gruppen sowohl Isolate ausgemacht werden, die keinen oder nur sehr gering zur Biofilm-Bildung befähigt waren, als auch solche, die seinen sehr starken BF (OD595 > 0,5) produzierten. Die Gegenüberstellung von Gelatinase-positiven und -negativen Stämmen (Abb. 7) zeigte hingegen keinen signifikanten Unterschied (P = 0,6428) der Mediane der beiden Gruppen (Mann-Whitney Test, P < 0,05). Auch hier fanden sich in beiden Gruppen sehr starke BF- Bildner wie auch E. faecalis, die keinen BF in vitro produzieren konnten. Die Mediane wiesen sogar annähernd gleiche Werte auf (0,1270 vs 0,1230). Entsprechendes wurde auch beim Vergleich von asa1-positiven und -negativen Stämmen beobachtet (Abb. 8; P = 0,3410). Allerdings lag der Median der Isolate mit asa1 Gen leicht über dem der asa1-negativen Stämme (0,1035 vs 0,1280). Ergebnisse 81 esp- esp+ 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 O D 59 5 Abb. 6 Zusammenhang zwischen Biofilm-Bildung und dem Vorkommen des esp Gens bei E. faecalis verschiedener klinischer Herkunft Dargestellt sind die ermittelten BF-Werte (OD595-Mittelwerte, y-Achse) der insgesamt 150 untersuchten E. faecalis aus Faeces, Urin, Wunden, invasiver Herkunft, der Umwelt und diversem Probenmaterial in Korrelation zur Anwesenheit des esp Gens (x-Achse). Rote Linien zeigen den Medianwert Z der OD595-Werte der jeweiligen Gruppe an (esp-, Z = 0,0970; esp+, Z = 0,1720). *, signifikant; durchgezogene schwarze Linie, OD595 = 0,240; gestrichelte schwarze Linie, OD595 = 0,120 GelE- GelE+ 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 O D 59 5 Abb. 7 Zusammenhang zwischen Biofilm-Bildung und dem Vorkommen der Gelatinase-Produktion bei E. faecalis verschiedener klinischer Herkunft Dargestellt sind die ermittelten BF-Werte (OD595-Mittelwerte, y-Achse) der insgesamt 150 untersuchten E. faecalis in Korrelation zur Expression von Gelatinase (x-Achse). Rote Linien zeigen den Medianwert Z der OD595-Werte der jeweiligen Gruppe an (GelE-, Z = 0,1270; GelE+, Z = 0,1230). Die Medianwerte sind nicht signifikant unterschiedlich (Mann-Whitney Test, P < 0,05). Durchgezogene schwarze Linie, OD595 = 0,240; gestrichelte schwarze Linie, OD595 = 0,120 * Ergebnisse 82 asa- asa+ 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 O D 59 5 Abb. 8 Zusammenhang zwischen Biofilm-Bildung und dem Vorkommen des asa1 Gens bei E. faecalis verschiedener klinischer Herkunft Dargestellt sind die ermittelten BF-Werte (OD595-Mittelwerte, y-Achse) der insgesamt 150 untersuchten E. faecalis in Korrelation zur Anwesenheit des asa1 Gens (x-Achse). Rote Linien zeigen den Medianwert Z der OD595-Werte der jeweiligen Gruppe an (asa1-, Z = 0,1035; asa1+, Z = 0,1280). Die Medianwerte sind nicht signifikant unterschiedlich (Mann-Whitney Test, P < 0,05). Durchgezogene schwarze Linie, OD595 = 0,240; gestrichelte schwarze Linie, OD595 = 0,120 Die Aufstellung von Korrelationen zwischen der Biofilm-Bildung und dem Vorkommen des esp Gens und/oder der Gelatinase-Expression (Abb. 9) zeigte ebenfalls, dass sich die vier Gruppen auf globaler Ebene nicht deutlich voneinander unterscheiden (Kruskal-Wallis Test mit anschließendem Dunn´s Multiple Comparison Test, beides mit P < 0,05). Dennoch wiesen die beiden Gruppen, die die esp-positiven Stämme umfassen, höhere Mediane (0,1735 bei esp+/GelE- und 0,1490 bei esp+/GelE+) im Vergleich zu den Gruppen esp-/GelE- und esp-/GelE+ auf (0,0850 und 0,1075). Die statistische Analyse zum Zusammenhang zwischen der Biofilm-Bildung und der Anwesenheit des esp Gens und/oder des asa1 Gens (Abb. 10) ergab hingegen signifikante Unterschiede der Medianwerte der Gruppen esp+/asa1+ und esp-/asa1- (0,1620 vs 0,0710) sowie esp+/asa1- und esp-/asa1- (0,1720 vs 0,0710). Somit konnte auch in dieser Gegenüberstellung erkannt werden, dass die beiden Gruppen der esp-positiven Stämme die höheren Medianwerte aufwiesen im Vergleich zu den esp-negativen Isolaten. Ergebnisse 83 es p-/ Ge lE- es p-/ Ge lE+ es p+ /G elE - es p+ /G elE + 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 O D 59 5 Abb. 9 Zusammenhang zwischen Biofilm-Bildung und dem Vorkommen von esp und/oder der Gelatinase-Produktion bei E. faecalis verschiedener klinischer Herkunft Dargestellt sind die ermittelten BF-Werte (OD595-Mittelwerte, y-Achse) der insgesamt 150 untersuchten E. faecalis in Korrelation zur An- bzw. Abwesenheit des esp Gens und der Gelatinase-Produktion (x-Achse). Rote Linien zeigen den Medianwert Z der OD595-Werte der jeweiligen Gruppe an (esp-/GelE-, Z = 0,0850; esp-/GelE+, Z = 0,1075; esp+/GelE-, Z = 0,1735; esp+/GelE+, Z = 0,1490). Zwischen keiner der vier Gruppen konnte ein signifikanter Unterschied festgestellt werden (P < 0,05). Durchgezogene schwarze Linie, OD595 = 0,240; gestrichelte schwarze Linie, OD595 = 0,120 es p+ /as a1 + es p+ /as a1 - es p-/ as a1 + es p-/ as a1 - 0 .0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 O D 59 5 Abb. 10 Zusammenhang zwischen Biofilm-Bildung und dem Vorkommen von esp und/oder asa1 bei E. faecalis verschiedener klinischer Herkunft Dargestellt sind die ermittelten BF-Werte (OD595-Mittelwerte, y-Achse) der insgesamt 150 untersuchten E. faecalis in Korrelation zur An- bzw. Abwesenheit des esp Gens und des asa1 Gens (x-Achse). Rote Linien zeigen den Medianwert Z der OD595-Werte der jeweiligen Gruppe an (esp+/asa1+, Z = 0,1620; esp+/asa1-, Z = 0,1720; esp-/asa1+, Z = 0,1115; esp-/asa1-, Z = 0,0710). Angeführt sind jeweils signifikante Unterschiede (P < 0,05) zwischen bestimmten Gruppen, bei keiner Angabe besteht kein signifikanter Unterschied; *, signifikant; durchgezogene schwarze Linie, OD595 = 0,240; gestrichelte schwarze Linie, OD595 = 0,120 * * Ergebnisse 84 4.2 E. faecium isoliert aus verschiedenem klinischen Material Im Rahmen dieser Arbeit wurden insgesamt 78 E. faecium Stämme aus unterschiedlichem klinischen Material auf das Vorkommen von Virulenzfaktoren und Biofilm-Bildung untersucht. Dabei handelte es sich um Isolate aus Faeces (n = 27), Urin (n = 10), Wunden (n = 6), invasiver Herkunft (n = 21), der Umwelt (n = 11) sowie diversem Probenmaterial (n = 3). Das esp Gen konnte in 33,3 % der Faeces-Isolate nachgewiesen werden, wohingegen sich ein höheres Vorkommen bei Stämmen anderer Herkunft gezeigt hat (90,0 %, 66,7 % und 42,9 % bei E. faecium aus Urin, Wunden bzw. invasiver Herkunft). Dieser Virulenzfaktor wurde bei keinem Isolat aus der Umwelt detektiert. Es ergab sich eine Gesamtinzidenz von 43,6 % für espfm. Ergänzend wurde ebenfalls die Anzahl der A- und C-Repeats des esp Gens bestimmt. Hier wies die Mehrzahl der Isolate vier A-Repeats (73,5 %) und sechs C-Repeats (97,0 %) auf. Das Auftreten des Hyaluronidase-Gens (hyl) konnte insgesamt bei 42,3 % der E. faecium festgestellt werden. Auch hier zeigten sich deutliche Unterschiede zwischen der Häufigkeit bei Faeces-Stämmen (14,8 %) und solchen aus Urin, Wunden und invasiver Herkunft (80,0 %, 100,0 % bzw. 66,7 %). Auch dieser Virulenzfaktor konnte bei keinem der E. faecium aus der Umwelt nachgewiesen werden. Weiterhin zeigte kein Isolat DNase-, Lipase-, Gelatinase-Produktion oder β-Hämolyse. Ein hemmender Effekt auf den Indikatorstamm E. faecalis JH2-2 wurde bei insgesamt 34,2 % der E. faecium festgestellt. Der Indikatorstamm E. faecium 64/3 wurde insgesamt von nur 7,7 % der Stämme gehemmt, wobei dies allesamt Faeces-Isolate waren (Bacteriocin-Test). Biofilm-Bildung konnte lediglich bei einem (1,3 %; Isolat 5.7) der 78 untersuchten E. faecium Stämme nachgewiesen werden (mäßiger BF-Bildner; esp+, hyl+). Ergebnisse 85 4.3 E. faecalis isoliert von Patientinnen mit dem Krankheitsbild Bakterielle Vaginose 4.3.1 Phänotypischer und genotypischer Nachweis von Virulenzfaktoren Alle Enterokokken-Stämme, die aus Vaginalabstrichen isoliert wurden, konnten mittels biochemischer und molekularbiologischer Untersuchung als E. faecalis identifiziert werden, außerdem traten keine Vancomycin-Resistenzen auf. In Tab. 13 sind die Ergebnisse der Nachweise verschiedener Virulenzfaktoren für die 80 untersuchten E. faecalis aus Vaginalabstrichen dargestellt. Gelatinase-Produktion und β-Hämolyse wurden bei 57,5 % bzw. 12,5 % der von insgesamt 40 BV-positiven Patientinnen isolierten Stämme nachgewiesen und bei 37,5 % bzw. 30,0 % der aus 40 Patientinnen der Kontrollgruppe isolierten Stämme. Die Gesamthäufigkeit bei 80 untersuchten Isolaten betrug 47,5 % bzgl. der Gelatinase-Produktion und 21,3 % bzgl. der β-Hämolyse. Alle getesteten Stämme von BV-positiven Frauen waren zur Wasserstoffperoxid-Bildung befähigt, während H2O2- Produktion bei 85,0 % der E. faecalis der Kontrollgruppe festgestellt wurde. Damit waren 92,5 % der 80 getesteten Isolate aus Vaginalabstrichen H2O2-Produzenten. Die Untersuchung zur Bacteriocin-Produktion ergab, dass 42,5 % bzw. 25,0 % der Isolate von Patientinnen mit BV eine wachstumshemmende Wirkung auf den Indikatorstamm E. faecium 64/3 bzw. E. faecalis JH2-2 ausübten. Diese Eigenschaft war im Vergleich dazu ebenfalls bei 42,5 % bzw. 35,0 % der Stämme der Kontrollgruppe zu erkennen. Insgesamt hemmten somit 42,5 % aller vaginalen Isolate den Indikatorstamm E. faecalis JH2-2 und 30,0 % den Stamm E. faecium 64/3. Das Vorkommen der Virulenzfaktorengene gelE, cylA, esp und asa1 lag bei 85,0 % bzw. 42,5 %, 52,5 % und 65,0 % bei E. faecalis von BV-positiven Frauen und bei 72,5 % bzw. 52,5 %, 55,0 % und 75,0 % bei Stämmen der Kontrollgruppe. Insgesamt trugen 78,8 % der 80 Stämme das gelE Gen, 47,5 % das cylA Gen, 53,8 % das esp Gen und 70,0 % das asa1 Gen. Eine statistische Analyse zum Vergleich der Isolate von Patientinnen mit BV und der E. faecalis von Patientinnen der Kontrollgruppe wurde in einem Vierfeldertest mittels Fisher´s Exact Test vorgenommen. Hiermit wird getestet, ob signifikante Unterschiede zwischen den nachgewiesenen Häufigkeiten der Virulenzfaktoren der beiden Gruppen vorliegen (signifikante Abweichung der im Versuch beobachteten Häufigkeitsverteilung von der theoretisch erwarteten Häufigkeitsverteilung; Köhler et al., 2002). Die Auswertung ergab, dass bei keiner der untersuchten Virulenzeigenschaften mit Ausnahme der H2O2-Produktion ein signifikanter Unterschied zwischen E. faecalis Stämmen von Patientinnen mit BV und Isolaten von Frauen der Kontrollgruppe festgestellt werden konnte. Ergebnisse 86 Tab. 13 Ergebnisse der Nachweise von Virulenzfaktoren bei E. faecalis aus Vaginalabstrichen BV positiv, E. faecalis Stämme aus Abstrichen mit kulturellem Nachweis von G. vaginalis und Clue Cells; BV negativ, Kontrollgruppe (siehe 3.9.1); GelE, Gelatinase-Produktion; β-Häm, β-Hämolyse-Nachweis; gelE, cylA, esp, asa1, Nachweis der Gene; H2O2, H2O2-Produktion (schwach und stark); E.fm 64/3, E.fc JH2-2, Bacteriocin- Produktion (Hemmhöfe > 2 mm) gegenüber des Indikatorstamms E. faecium 64/3 bzw. E. faecalis JH2-2; ns, nicht signifikant; *, signifikanter Unterschied zwischen den Gruppen BV positiv und BV negativ Herkunft Anzahl Stämme GelE gelE β-Häm cylA esp asa1 E.fm 64/3 E.fc JH2-2 H2O2 23 34 5 17 21 26 17 10 40 BV positiv 40 57,5% 85,0% 12,5% 42,5% 52,5% 65,0% 42,5% 25,0% 100% 15 29 12 21 22 30 17 14 34 BV negativ 40 37,5% 72,5% 30,0% 52,5% 55,0% 75,0% 42,5% 35,0% 85,0% 38 63 17 38 43 56 34 24 74 Insgesamt 80 47,5% 78,8% 21,3% 47,5% 53,8% 70,0% 42,5% 30,0% 92,5% Fisher´s Exact Test bzgl. der Gruppen BV positiv und BV negativ P-Wert 0,1165 0,2742 0,0993 0,5021 1,0000 0,4647 1,0000 0,4647 0,0255 Signifikanz (P < 0,05) ns ns ns ns ns ns ns ns * Bei keinem der Isolate konnten Lipase-Produktion oder das Vorhandensein des hyl Gens nachgewiesen werden. Der bee Locus wurde lediglich bei einem Stamm (BV20) detektiert. Der DNase-Nachweis war bei nur sechs Isolaten positiv (7,5 %; BV38, BV123, BV146, BV151, BV154, BV165; siehe Tab. 30 und Tab. 32 im Anhang). Außerdem konnte mittels Bacteriocin-Tests bei keinem Isolat eine hemmende Wirkung gegenüber neun Lactobacillus spp. (Wildtypstämme) sowie gegenüber L. acidophilus DSM 20079 oder L. crispatus DSM 20584 festgestellt werden. 4.3.2 Vorkommen von Biofilm-Bildung In Tab. 14 werden die Anzahlen der E. faecalis Isolate aufgeführt, die von insgesamt 80 untersuchten Stämmen nicht zur Bildung eines BF befähigt sind, einen mäßigen oder starken BF bilden können, sowie die daraus jeweils berechneten arithmetischen Mittelwerte und Medianwerte. Von 40 untersuchten E. faecalis Stämmen, isoliert von Patientinnen mit BV, waren 27,5 % nicht in der Lage, einen Biofilm in vitro zu bilden (Tab. 14). Bei 20,0 % dieser Isolate handelte es sich um mäßige BF-Bildner, 52,5 % produzierten einen starken Biofilm. Unter den 21 starken BF-Bildnern konnten 6 Isolate (15,0 % aller 40 Stämme dieser Gruppe) einen sehr starken Biofilm bilden, wobei sich ein Medianwert von Z von OD595 = 2,339 ergab. Bzgl. der Stämme der Kontrollgruppe wurden 20,0 % als Nicht-BF-Bildner eingestuft, 27,5 % als mäßige BF-Produzenten und 52,5 % als starke BF-Bildner. Unter den starken BF- Bildnern waren 17,5 % der E. faecalis zur Bildung eines sehr starken Biofilms in vitro befähigt, wobei ein Medianwert Z von OD595 = 0,641 resultierte. Ergebnisse 87 Insgesamt konnten von 80 getesteten E. faecalis isoliert aus Vaginalabstrichen 23,8 % keinen, 23,8 % einen mäßigen und 52,5 % einen starken Biofilm bilden. Als sehr starke BF- Produzenten erwiesen sich 16,3 % aller untersuchten Stämme aus Vaginalabstrichen. Ein signifikanter Unterschied zwischen der Anzahl der E. faecalis von Patientinnen mit BV und den Isolaten der Kontrollgruppe konnte in keiner BF-Kategorie (kein, mäßiger oder starker BF-Bildner) mittels statistischer Auswertung (Fisher´s Exact Test, P < 0,05) festgestellt werden. Tab. 14 Vorkommen von Biofilm-Bildung bei E. faecalis aus Vaginalabstrichen BV positiv, E. faecalis Stämme aus Abstrichen mit kulturellem Nachweis von G. vaginalis und Clue Cells; BV negativ, Kontrollgruppe (siehe 3.9.1); OD595 < 0,120, kein BF-Bildner; 0,120 ≤ OD595 ≤ 0,240, mäßige BF-Bildner; OD595 > 0,240, starker BF-Bildner; OD595 > 0,5, sehr starker BF-Bildner, diese Stämme sind in der Kategorie der starken BF-Bildner (OD595 > 0,240) ebenfalls enthalten; ns, nicht singifikant; nb, nicht bestimmt Herkunft Anzahl Stämme OD595 < 0,120 0,120 ≤ OD595 ≤ 0,240 OD595 > 0,240 davon OD595 > 0,500 11 8 21 6 BV positiv 40 27,5% 20,0% 52,5% 15,0% Mittelwert 0,079 0,191 0,895 2,326 Median Z 0,076 0,191 0,352 2,339 8 11 21 7 BV negativ 40 20,0% 27,5% 52,5% 17,5% Mittelwert 0,086 0,199 0,468 0,942 Median Z 0,097 0,208 0,414 0,641 19 19 42 13 insgesamt 80 23,8% 23,8% 52,5% 16,3% Fisher´s Exact Test bzgl. der Gruppen BV positiv und BV negativ P-Wert 0,6001 0,6001 1,0000 nb Signifikanz (P < 0,05) ns ns ns nb Ergebnisse 88 4.3.3 Zusammenhang von Biofilm-Bildung mit bestimmten Virulenzfaktoren Die statistische Auswertung zum Zusammenhang zwischen der Menge an gebildetem Biofilm und dem Vorkommen von esp bei den 80 untersuchten E. faecalis Stämmen aus Vaginalabstrichen ergab, dass ein signifikanter Unterschied (P < 0,05) zwischen den Medianwerten der esp- und esp+ Isolate besteht (Abb. 11). Mittels Mann-Whitney Test wurde ein P-Wert von 0,0003 ermittelt. Demnach war bei den Stämmen, bei denen das esp Gen nachgewiesen werden konnte (esp+), ein signifikant erhöhter Median der OD595-Werte der Biofilm-Bildung festzustellen (0,195 vs 0,330). Stellt man hingegen Stämme, die Gelatinase produzieren, den Gelatinase-negativen Isolaten gegenüber (Abb. 12), so ergibt sich ein nicht signifikanter Unterschied zwischen den Medianwerten der beiden Gruppen (P = 0,1728). Auch die Betrachtung der Korrelation von Biofilm-Bildung und der Anwesenheit des asa1 Gens (Abb. 13) erbrachte keinen signifikanten Unterschied (P = 0,4158) der Medianwerte nach statistischer Analyse mittels Mann-Whitney Test (P < 0,05). esp- esp+ 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 3.5 4.5 O D 59 5 Abb. 11 Zusammenhang zwischen Biofilm-Bildung und dem Vorkommen des esp Gens bei E. faecalis aus Vaginalabstrichen Dargestellt sind die ermittelten BF-Werte (OD595-Mittelwerte, y-Achse) der 80 untersuchten E. faecalis aus Vaginalabstrichen in Korrelation zur Anwesenheit des esp Gens (x-Achse). Rote Linien zeigen den Medianwert Z der OD595-Werte der jeweiligen Gruppe an (esp-, Z = 0,195; esp+, Z = 0,330). *, signifikant; durchgezogene schwarze Linie, OD595 = 0,240; gestrichelte schwarze Linie, OD595 = 0,120 * Ergebnisse 89 GelE- GelE+ 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 3.5 4.5 O D 59 5 Abb. 12 Zusammenhang zwischen Biofilm-Bildung und dem Vorkommen von Gelatinase-Produktion bei E. faecalis aus Vaginalabstrichen Dargestellt sind die ermittelten BF-Werte (OD595-Mittelwerte, y-Achse) der 80 untersuchten E. faecalis aus Vaginalabstrichen in Korrelation zur Gelatinase-Produktion (x-Achse). Rote Linien zeigen den Medianwert Z der OD595-Werte der jeweiligen Gruppe an (GelE-, Z = 0,2985; GelE+, Z = 0,2180). Die Medianwerte sind nicht signifikant unterschiedlich (Mann- Whitney Test, P < 0,05). Durchgezogene schwarze Linie, OD595 = 0,240; gestrichelte schwarze Linie, OD595 = 0,120 asa- asa+ 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 3.5 4.5 O D 59 5 Abb. 13 Zusammenhang zwischen Biofilm-Bildung und dem Vorkommen des asa1 Gens bei E. faecalis aus Vaginalabstrichen Dargestellt sind die ermittelten BF-Werte (OD595-Mittelwerte, y-Achse) der 80 untersuchten E. faecalis aus Vaginalabstrichen in Korrelation zur Anwesenheit des asa1 Gens (x-Achse). Rote Linien zeigen den Medianwert Z der OD595-Werte der jeweiligen Gruppe an (asa1-, Z = 0,2985; asa1+, Z = 0,2430). Die Medianwerte sind nicht signifikant unterschiedlich (Mann- Whitney Test, P < 0,05). Durchgezogene schwarze Linie, OD595 = 0,240; gestrichelte schwarze Linie, OD595 = 0,120 Ergebnisse 90 Nach Gruppierung der Isolate bzgl. der An- bzw. Abwesenheit von zwei Virulenzfaktoren und der Menge an produziertem Biofilm ergaben sich Korrelationen, die in Abb. 14 und Abb. 15 dargestellt werden. Zur statistischen Auswertung wurde zunächst jeweils ein Kruskal-Wallis Test zur Feststellung eines globalen signifikanten Unterschieds (P < 0,05) zwischen den vier untersuchten Medianen durchgeführt. Eine Analyse der Unterschiede (Differenzen) in den Rangsummen (Dunn´s Multiple Comparison Test) zeigte anschließend, welche Gruppen sich signifikant unterscheiden (P < 0,05). Bei Vergleich der Stämme in Bezug zum Vorkommen des esp Gens und/oder der Gelatinase-Produktion (Abb. 14) ergab sich nach der Feststellung eines signifikanten Unterschieds (P = 0,0040) zwischen den vier analysierten Medianen, dass sich die Rangsummen der Gruppen esp-/GelE+ und esp+/GelE- sowie der Gruppen esp-/GelE+ und esp+/GelE+ signifikant unterscheiden. Der Vergleich der Rangsummen anderer Gruppierungen (esp-/GelE- vs esp-/GelE+; esp-/GelE- vs esp+/GelE-; esp-/GelE- vs esp+/GelE+; esp+/GelE- vs esp+/GelE+) erbrachte keine signifikanten Unterschiede. es p-/ Ge lE- es p-/ Ge lE+ es p+ /G elE - es p+ /G elE + 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 3.5 4.5 O D 59 5 Abb. 14 Zusammenhang zwischen Biofilm-Bildung und dem Vorkommen von esp und/oder GelE bei E. faecalis aus Vaginalabstrichen Dargestellt sind die ermittelten BF-Werte (OD595-Mittelwerte, y-Achse) der 80 untersuchten E. faecalis aus Vaginalabstrichen in Korrelation zur An- bzw. Abwesenheit des esp Gens und der Gelatinase-Produktion (x-Achse). Rote Linien zeigen den Medianwert Z der OD595-Werte der jeweiligen Gruppe an (esp-/GelE-, Z = 0,1635; esp-/GelE+, Z = 0,1950; esp+/GelE-, Z = 0,3140; esp+/GelE+, Z = 0,3520). Angeführt sind jeweils signifikante Unterschiede (P < 0,05) zwischen bestimmten Gruppen, bei keiner Angabe besteht kein signifikanter Unterschied; *, signifikant; durchgezogene schwarze Linie, OD595 = 0,240; gestrichelte schwarze Linie, OD595 = 0,120 * * Ergebnisse 91 es p+ /as a1 + es p+ /as a1 - es p-/ as a1 + es p-/ as a1 - 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 3.5 4.5 O D 59 5 Abb. 15 Zusammenhang zwischen Biofilm-Bildung und dem Vorkommen von esp und/oder asa1 bei E. faecalis aus Vaginalabstrichen Dargestellt sind die ermittelten BF-Werte (OD595-Mittelwerte, y-Achse) der 80 untersuchten E. faecalis aus Vaginalabstrichen in Korrelation zur An- /Abwesenheit des esp Gens und des asa1 Gens (x-Achse). Rote Linien zeigen den Medianwert Z der OD595-Werte der jeweiligen Gruppe an (esp+/asa1+, Z = 0,2770; esp+/asa1-, Z = 0,3905; esp-/asa1+, Z = 0,1980; esp-/asa1-, Z = 0,1730). Angeführt sind jeweils signifikante Unterschiede (P < 0,05) zwischen bestimmten Gruppen, bei keiner Angabe besteht kein signifikanter Unterschied; *, signifikant; durchgezogene schwarze Linie, OD595 = 0,240; gestrichelte schwarze Linie, OD595 = 0,120 Die untersuchten Isolate wurden ebenfalls nach der An- bzw. Abwesenheit des esp und asa1 Gens gruppiert und einer statistischen Analyse unterzogen (Abb. 15). Hierbei zeigte sich mittels Durchführung des Kruskal-Wallis Tests wiederum auf globaler Ebene ein signifikanter Unterschied (P = 0,0020) zwischen den untersuchten Medianen. Die anschließende Analyse der Differenz in den Rangsummen ergab einen signifikanten Unterschied zwischen den Gruppen esp+/asa1- und esp-/asa1+ sowie esp+/asa1- und esp-/asa1-. Die Bewertung der Differenz der Rangsummen anderer Gruppierungen erbrachte keine signifikanten Unterschiede. * * Ergebnisse 92 4.4 Vergleich der E. faecalis Stämme aus Vaginalabstrichen mit Isolaten anderer klinischer Herkunft Die Untersuchung der Inzidenzen der Virulenzfaktoren bei E. faecalis aus verschiedenen klinischen Bereichen ergab keine signifikanten Unterschiede im Vorkommen der nachgewiesenen Gene bzw. phänotypischen Eigenschaften unter den jeweiligen Herkunftsgruppen (Faeces, Urin, Wunden, invasive Herkunft; siehe 4.1.1). Die Abb. 16 stellt zusätzlich einen Vergleich dieser Stämme mit den 80 charakterisierten Isolaten aus Vaginalabstrichen (siehe 4.3.1) bzgl. des Vorkommens von Virulenzfaktoren dar. Dies verdeutlichte ebenfalls, dass keine erkennbaren Unterschiede zwischen den jeweiligen Herkunftsgruppen hinsichtlich des Auftretens von Virulenzfaktoren nachgewiesen werden konnten. Lediglich die Häufigkeiten von cylA und β-Hämolyse bei Isolaten aus Faeces und invasiver Herkunft zeigten sich im Vergleich als leicht erniedrigt, was allerdings keinen signifikanten Unterschied darstellte (siehe 4.1.1). 0% 20% 40% 60% 80% 100% Faeces 32,4% 54,1% 67,6% 73,0% 40,5% 16,2% Urin 40,9% 52,3% 77,3% 84,1% 38,6% 29,5% Wunde 50,0% 53,8% 73,1% 84,6% 42,3% 30,8% Invasiv 31,6% 52,6% 73,7% 84,2% 52,6% 10,5% Vagina 47,5% 53,8% 70,0% 78,8% 47,5% 21,3% cylA esp asa1 gelE Gelatinase β-Hämolyse Abb. 16 Vergleich der Inzidenzen bestimmter Virulenzfaktoren bei E. faecalis Stämmen unterschiedlicher Herkunft Dargestellt sind die Häufigkeiten der Virulenzeigenschaften in der jeweiligen Herkunftsgruppe. Gesamtanzahl der aufgeführten Stämme n = 206 (Faeces, n = 37; Urin, n = 44; Wunde, n = 26; Invasive Herkunft, n = 19; Vaginalabstriche, n = 80); cylA, esp, asa1, gelE, Nachweis der Gene; Gelatinase, Nachweis der Gelatinase-Produktion; β-Hämolyse, Nachweis der β-Hämolyse-Aktivität. Ergebnisse 93 Ein Unterschied zwischen den E. faecalis Stämmen, die aus Vaginalabstrichen von Patientinnen mit BV isoliert wurden, und solchen der Kontrollgruppe bzgl. ihrer Fähigkeit zur Biofilm-Bildung konnte nicht festgestellt werden (siehe 4.3.2). Werden allerdings alle 80 untersuchten E. faecalis aus Vaginalabstrichen (4.3.2) mit Isolaten aus anderem klinischen Material (4.1.2) hinsichtlich dieses Merkmals gegenübergestellt (Abb. 17), so wurde deutlich, dass die Gruppe der Vaginalabstrich-Isolate den höchsten Median der OD595- Werte (Z = 0,2500) im Vergleich zu den Stämmen aus Faeces (Z = 0,1040), Urin (Z = 0,1665), Wunden (Z = 0,0905) und invasiver Herkunft (Z = 0,1900) aufwiesen. Die statistische Auswertung mittels Kruskal-Wallis Test (Unterschiede der Mediane) mit anschließender Bewertung der Rangsummen-Differenzen der jeweiligen Gruppen (Dunn´s Multiple Comparison Test) ergab einen signifikanten Unterschied (P < 0,05) zwischen den Stämmen aus Faeces und Vaginalabstrichen sowie den Isolaten aus Wunden und Vaginalabstrichen. Faeces Urin Wunde Invasiv Vaginal 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 O D 59 5 Abb. 17 Vergleich bzgl. der Biofilm-Bildungsfähigkeit der untersuchten E. faecalis Stämme verschiedener Herkunft Dargestellt sind die ermittelten BF-Werte (OD595-Mittelwerte, y-Achse) der untersuchten E. faecalis aus Faeces (n = 37, schwarze Punkte), Urin (n = 44, rot), Wunden (n = 26, grün), inivasiven Infektionen (n = 19, blau) und Vaginalabstrichen (n = 80, violett). Rote Linien zeigen den Medianwert Z der OD595-Werte der jeweiligen Gruppe an (Faeces, Z = 0,1040; Urin, Z = 0,1665; Wunde, Z = 0,0905; Invasiv, Z = 0,1900; Vaginal, Z = 0,2500). Aufgeführt sind jeweils signifikante Unterschiede (P < 0,05) zwischen bestimmten Gruppen, bei keiner Angabe besteht kein signifikanter Unterschied; *, signifikant. * * Ergebnisse 94 Werden die Verteilungen der Stämme bzgl. der BF-Kategorien (kein, mäßiger und starker bzw. sehr starker BF-Bildner) bei den untersuchten E. faecalis Isolaten unterschiedlicher Herkunft verglichen (Tab. 15), so wurde ebenfalls ein sichtbarer Unterschied erkennbar. Während bei den Stämmen aus Urin und invasiver Herkunft zu jeweils ca. 30 % keine sowie mäßige BF-Produzenten und etwa zu 40 % starke BF-Bildner vorkamen, bildeten unter den Faeces- und Wund-Isolaten ca. 60 % der Stämme keinen BF sowie zu jeweils ca. 20 % einen mäßigen bzw. starken BF. Im Gegensatz dazu waren bei den Isolaten aus Vaginalabstrichen insgesamt zu ca. einem Viertel jeweils keine und mäßige sowie etwa zur Hälfte starke BF-Bildner zu verzeichnen. Außerdem wurden unter den Stämmen aus Urin, invasiver Herkunft sowie Vaginalabstrichen je zu ca. 15 % sehr starke BF-Produzenten nachgewiesen, bei Faeces- und Wund-Isolaten lediglich zu 5,4 % bzw. 3,8 %. Tab. 15 Vergleich des Vorkommens von Bioflm-Bildung bei den untersuchten E. faecalis Stämmen verschiedener Herkunft OD595 < 0,120, kein BF-Bildner; 0,120 ≤ OD595 ≤ 0,240, mäßige BF-Bildner; OD595 > 0,240, starker BF-Bildner; OD595 > 0,5, sehr starker BF-Bildner, diese Stämme sind in der Kategorie der starken BF-Bildner (OD595 > 0,240) ebenfalls enthalten. Herkunft Anzahl Stämme OD595 < 0,120 0,120 ≤ OD595 ≤ 0,240 OD595 > 0,240 davon OD595 > 0,500 Faeces 37 56,8% 24,3% 18,9% 5,4% Urin 44 31,8% 29,5% 38,6% 15,9% Wunden 26 61,5% 19,2% 19,2% 3,8% Invasiv 19 31,6% 26,3% 42,1% 15,8% Vagina 80 23,8% 23,8% 52,5% 16,3% Ergebnisse 95 4.5 Charakterisierung von E. faecalis Biofilm-Mutantenstämmen 4.5.1 Herstellung und Typisierung von E. faecalis Biofilm-Mutantenstämmen Von den zuvor untersuchten E. faecalis Isolaten wurden mehrere Stämme, die sich in ihren bereits bekannten Eigenschaften hinsichtlich ihrer Biofilm-Bildungsfähigkeit und des Vorkommens von Virulenzfaktoren unterschieden, zur Anwendung der unter 3.9.2 beschriebenen Methodik ausgewählt, um von diesen Stämmen BF-Mutanten herzustellen. Die Isolate wurden insgesamt über 42 Tage in der dargestellten Weise kultiviert und jeweils im Abstand von ca. 7 Tagen auf einen veränderten BF-Phänotyp hin untersucht. Letztendlich konnten vier Stämme isoliert werden, die entweder eine erhöhte Fähigkeit zur BF-Bildung im Vergleich zum Wildtyp aufwiesen (Stamm 1.3.7, Wildtyp 1.3) oder eine Verringerung der BF- Produktion (Stamm 1.4.6, Wildtyp 1.4; Stamm 1.10.16, Wildtyp 1.10; Stamm 2.11.8, Wildtyp 2.11) zeigten. Zunächst wurde die Stabilität des veränderten BF-Phänotyps dieser isolierten Mutantenstämme überprüft. Nach 20 Subkultivierungen zeigten die erzeugten Mutantenstämme eine quantitativ stabile Erhöhung (1.3.7) bzw. Abnahme (1.4.6, 1.10.16, 2.11.8) der BF-Bildungsfähigkeit. Da diese Langzeit-Subkultivierung zur Erzeugung von BF-Mutantenstämmen eine erhöhte Gefahr von Kontaminationen in sich birgt, musste vor Beginn weiterer Untersuchungen die Identität der Stämme gesichert werden. Deshalb wurden die Isolate mittels verschiedener Typisierungsverfahren untersucht. Die Stämme wurden zunächst mittels einer rep-PCR mit dem Primer BOX2AR typisiert (Abb. 37 im Anhang). Die Auswertung dieser Typisierung zeigte, dass jeweils Wildtyp- und BF-Mutantenstämme eine Gruppe bilden (clustern), so dass zunächst davon ausgegangen werden konnte, dass es sich hier bei allen vier Stämmen um Klone des Ursprungsisolats handelte. Das Fingerprint-Muster des Stamms 1.4 wies allerdings eine deutliche Bande auf, die dem BF-Mutantenstamm 1.4.6 fehlte, so dass bzgl. dieser Isolate mittels der rep-PCR keine endgültige Aussage über deren Identität getroffen werden konnte. Daher wurden die Stämme ebenfalls mit Hilfe der hochdiskriminierenden PFGE typisiert. Ergebnisse 96 10 0 50 1.4.6 2.11.8 2.11 1.4 1.10 1.10.16 1.3 1.3.7 Abb. 18 Dendrogramm zur Typisierung der E. faecalis Wildtyp- und BF-Mutantenstämme mittels PFGE Auswertung der digitalisierten Bilder der entstandenen PFGE-Fingerprint-Bandenmuster mittels BioNumerics Software; Analyse zum Clustering der Isolate mittels des Dice-Koeffizienten und UPGMA Algorithmus (MRI, Karlsruhe). Die Untersuchung der Stämme mittels PFGE (Abb. 18 sowie Abb. 38 im Anhang) zeigte schließlich, dass das Isolat 1.4 nicht mit dem zugehörigen BF-Mutantenstamm gruppiert. Dies konnte auch durch eine weitere Typisierung der Stämme mittels RAPD-PCR mit dem Primer M13 (Huey & Hall, 1989; Daten nicht dargestellt) bestätigt werden. Auch die Untersuchung der stoffwechselphysiologischen Eigenschaften der Stämme (siehe 4.5.2.3) unterstützt dieses Resultat. Aufgrund dieser Ergebnisse wurden drei E. faecalis BF- Mutantenstämme (1.3.7, 1.10.16, 2.11.8) zur weiteren Untersuchung herangezogen. Deren Wildtypstämme (1.3, 1.10, 2.11) sind im Jahr 2005 aus Vaginalabstrichen isoliert worden. Das E. faecalis Isolat 1.3 ist kein BF-Produzent, dessen Mutantenstamm bildet einen starken Biofilm. Die Isolate 1.10 und 2.11 produzieren einen starken Biofilm, deren hergestellte Mutanten sind schwache BF-Bildner (siehe Abb. 19). Diese phänotypische Veränderung der BF-Bildungsfähigkeit war nicht auf ein verringertes bzw. beschleunigtes Wachstum zurückzuführen, was mittels der Untersuchung des Wachstumsverhaltens erkennbar wurde (siehe Abb. 36 im Anhang). Im weiteren Verlauf dieser Arbeit wurden diese Stämme mittels verschiedener Methoden charakterisiert, um jeweils die genetische Ursache der Spontanmutation und deren Auswirkung auf den Phänotyp zu untersuchen. Ergebnisse 97 Stamm OD595 Stamm OD595 Stamm OD595 1.3 0,012 ±0,005 1.10 0,943 ±0,129 2.11 4,046 ±0,093 1.3.7 0,521 ±0,170 1.10.16 0,159 ±0,069 2.11.8 0,156 ±0,053 Abb. 19 Biofilm-Assay der Wildtyp- und BF-Mutantenstämme Biofilme nach Anzucht über 18 h in 96well-Mikrotiterplatte (PS), angefärbt mit Hucker´s Crystal Violet-Lösung (siehe 3.11.6); OD595-Mittelwerte errechnet aus jeweils vier Replikaten von drei ÜN-Vorkulturen pro Teststamm. Phänotypisch fielen zunächst Unterschiede in der Wachstumscharakteristik der E. faecalis Stämme bei der Kultivierung ÜN in TSBG (Biofilm-Medium, siehe 3.11.6) auf (Abb. 20). Die Isolate 1.10 und 2.11 aggregierten unter diesen Bedingungen in so starkem Maße, dass die Zellen im Kulturgefäß zu Boden sanken. Beim Stamm 2.11 konnten relativ große Aggregate beobachtet werden. Die Mutantenstämme hingegen zeigten eine gleichmäßige Trübung des Mediums und bildeten nur leichten Bodensatz. Bzgl. der Stämme 1.3 und 1.3.7 wurden kaum Unterschiede sichtbar, beide Isolate wuchsen homogen unter diesen Bedingungen und wiesen eine gleichmäßige Trübung des Mediums ohne starke Aggregation auf. Abb. 20 Wachstumscharakteristik der E. faecalis Wildtyp- und BF-Mutantenstämme Dargestellt sind ÜN-Kulturen der Isolate 1.3 und 1.3.7 (links), 1.10 und 1.10.16 (Mitte) sowie 2.11 und 2.11.8 (rechts) in TSBG (5 ml) bei 37°C. Ergebnisse 98 4.5.2 Charakterisierung der E. faecalis Biofilm-Mutantenstämme 4.5.2.1 Darstellung der Biofilme mittels CLSM Mit Hilfe der Konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie (CLSM) wurden die lebenden Zellen und die von diesen auf Glasobjektträgern gebildeten Biofilme der Wildtyp- und BF- Mutantenstämme betrachtet. Die Abb. 21 bis Abb. 23 zeigen beispielhaft repräsentative CLSM-Bilder der Isolate jeweils in der Aufsicht (z-Achse; Bilder a und c) sowie im Querschnitt (x-y-Achse; Bilder b und d). Hierbei wurden zum einen Unterschiede jeweils zwischen Wildtyp- und Mutantenstamm beobachtet, zum anderen konnten aber auch Besonderheiten in der Struktur der gebildeten Biofilme festgestellt werden. a) b) c) d) Abb. 21 CLSM der Stämme 1.3 und 1.3.7 Isolate kultiviert in TSBG für 18 h auf Glasobjektträgern, angefärbt mit Acridinorange, während der Mikroskopie mittels PBS-Puffer hydriert gehalten (siehe 3.14.2); a), b), Stamm 1.3; c), d), Stamm 1.3.7; a), c), Darstellung in z-Achsen-Richtung (Aufsicht); b), d), Darstellung in x-y-Achsen-Richtung (Durchsicht); Bildgröße jeweils 50 µm x 50 µm. Der Stamm 1.3, welcher kein BF-Bildner ist, produzierte dementsprechend keinen Biofilm auf der Glasoberfläche, so dass in der CLSM nur einzelne Zellen zu beobachten waren, von denen nur wenige an das Trägermaterial adhäriert zu sein schienen (siehe Abb. 21 a,b). Die Mutante 1.3.7 bildete einen starken Biofilm, der sich sowohl in der Aufsicht (z-Achse, Abb. 21 c) als auch im Durchsichtsquerschnitt (Abb. 21 d) als sehr dicht und kompakt mit lediglich kleineren, zellfreien Zwischenräumen darstellte. Außerdem schienen die Zellen stark an der Glasoberfläche anzuheften (Abb. 21 d). Die Dicke dieses Biofilms an Stellen mit jeweils maximaler Höhe betrug durchschnittlich etwa 25 µm. Im Vergleich dazu zeigte die Betrachtung des starken BF-Bildners 1.10, dass dessen Einzelzellen weniger dicht angeordnet, größere Zwischenräume im Biofilm zu erkennen waren, und somit dessen Biofilm insgesamt eine eher lockere Struktur aufwies (siehe Abb. 22 a,b). Der Biofilm besaß eine maximale Dicke von ca. 28 µm. Die Zellen der Mutante 1.10.16 bildeten auf der Glasoberfläche lediglich eine dünne Schicht (ca. ein bis zwei Lagen), in der ebenfalls Zwischenräume zu erkennen waren (siehe Abb. 22 c,d). Die CLSM-Darstellung des sehr starken BF-Bildners 2.11 ergab, dass dieser Stamm einen zum Isolat 1.3.7 beinahe ähnlichen, kompakten Biofilm auf dem Glasobjektträger produzierte (siehe Abb. 23 b). Allerdings konnten hier im Vergleich deutlich größere Zwischenräume, die kanalähnliche Strukturen aufwiesen, in dem dichten, mehrschichtigen Biofilm beobachtet Ergebnisse 99 werden (siehe Abb. 23 a). Die Dicke dieses Biofilms betrug durchschnittlich etwa 24 µm. Die Betrachtung der Mutante 2.11.8 zeigte ein fast identisches Bild zum Stamm 1.10.16 (vgl. Abb. 22 c,d mit Abb. 23 c,d). Es war lediglich ein dünne Zellschicht auf dem Objektträger mit größeren Zwischenräumen zu erkennen (Abb. 23 c,d). a) b) c) d) Abb. 22 CLSM der Stämme 1.10 und 1.10.16 Isolate kultiviert in TSBG für 18 h auf Glasobjektträgern, angefärbt mit Acridinorange, während der Mikroskopie mittels PBS-Puffer hydriert gehalten (siehe 3.14.2); a), b), Stamm 1.10; c), d), Stamm 1.10.16; a), c), Darstellung in z-Achsen-Richtung (Aufsicht); b), d), Darstellung in x-y-Achsen-Richtung (Durchsicht); Bildgröße jeweils 50 µm x 50 µm. a) b) c) d) Abb. 23 CLSM der Stämme 2.11 und 2.11.8 Isolate kultiviert in TSBG für 18 h auf Glasobjektträgern, angefärbt mit Acridinorange, während der Mikroskopie mittels PBS-Puffer hydriert gehalten (siehe 3.14.2); a), b), Stamm 2.11; c), d), Stamm 2.11.8; a), c), Darstellung in z-Achsen-Richtung (Aufsicht); b), d), Darstellung in x-y-Achsen-Richtung (Durchsicht); Bildgröße jeweils 50 µm x 50 µm. 4.5.2.2 Darstellung der Biofilme mittels REM Die Zellen bzw. Biofilme der E. faecalis Wildtyp- und Mutantenstämme wurden des Weiteren mittels Rasterelektronen-Mikroskopie (REM) betrachtet. Hierzu wurden die Stämme auf Glasobjektträgern für 18 h angezogen, um die einzelnen Zellen sowie die gebildeten Biofilme in ihrer Form und Struktur zu analysieren (siehe 3.14.1). Mittels REM konnten keine Unterschiede in der Zellmorphologie der Stämme 1.3 und 1.3.7 festgestellt werden (Abb. 24 a,b). Bei beiden Isolaten erschien die Zelloberfläche glatt, und es war die für Enterokokken typische Anordnung der Zellen in Form von Diplokokken zu beobachten. Der Biofilm des Stamms 1.3.7 konnte im Gegensatz zur CLSM präparationsbedingt (häufige Wasch- und Fixierungsschritte) mittels REM wiederholt nicht deutlich dargestellt werden. Die Zellen lagen lediglich einschichtig auf dem Objektträger vor, was auf eine geringere Stabilität des Biofilms des Isolats 1.3.7 im Vergleich zu den sehr Ergebnisse 100 beständig erscheinenden Biofilmen der Stämme 1.10 und 2.11 hinwies (vgl. Abb. 25 a,b und Abb. 26 a,b,c). Ebenfalls präparationsbedingt wurden bei allen Abbildungen Rückstände (helle Ablagerungen) sichtbar, die sowohl auf den Zellen als auch auf dem Untergrund zu erkennen waren. a) b) Abb. 24 REM der Stämme 1.3 (a) und 1.3.7 (b) Isolate kultiviert in TSBG für 18 h auf Glasobjektträgern, nach Präparation mit Platin bedampft, Mikroskopie bei 10 kV (siehe 3.14.1); a) Stamm 1.3; b), Stamm 1.3.7; Vergrößerung und Längenangabe [µm] sind jeweils unterhalb des Bildes aufgeführt. Bzgl. der Stämme 1.10 und 1.10.16 konnten ebenfalls keine Unterschiede in der Zelloberfläche oder Zellform beobachtet werden, in der REM erschien die Oberfläche der Zellen beider Isolate glatt (siehe Abb. 25 b,d). Der Biofilm des Stamms 1.10 stellte sich als mehrschichtiges Gebilde mit zum Teil größeren Zwischenräumen dar (Abb. 25 a). Auch bei den Stämmen 2.11 und 2.11.8 wurden keine sichtbaren Unterschiede zwischen der Zelloberfläche von Wildtyp und Mutante erkennbar, allerdings erschien bei beiden Isolaten die Zellhülle im Gegensatz zu den anderen betrachteten Stämmen zum Teil rau (vgl. Abb. 26 d,e). Ein markanter Unterschied im Vergleich zu den Isolaten 1.3 und 1.3.7 sowie 1.10 und 1.10.16 konnte in der Beobachtung von extrazellulären Substanzen an einigen Stellen der Präparate des Stamms 2.11 erkannt werden, wobei diese Strukturen auch in sehr geringer Menge bei der Mutante 2.11.8 zu sehen waren (vgl. Abb. 26 e,f). Ergebnisse 101 a) b) c) d) Abb. 25 REM der Stämme 1.10 (a,b) und 1.10.16 (c,d) Isolate kultiviert in TSBG für 18 h auf Glasobjektträgern, nach Präparation mit Platin bedampft, Mikroskopie bei 10 kV (siehe 3.14.1); a,b) Stamm 1.10; c,d), Stamm 1.10.16; Vergrößerung und Längenangabe [µm] sind jeweils unterhalb des Bildes aufgeführt. Um mögliche Unterschiede in der Beschaffenheit der Zelloberfläche oder anderer Strukturen der Stämme in der exponentiellen Wachstumsphase im Vergleich zu den Zellen, die für 18 h angezogen wurden, zu erkennen, wurde eine REM außerdem von Kulturen durchgeführt, die vier Stunden auf Glasobjektträgern gewachsen waren. Hier konnten allerdings keine Unterschiede in der Beschaffenheit der Zelloberfläche zwischen Wildtyp- und Mutantenstamm festgestellt werden. Im Vergleich zu den Zellen, die für 18 h gewachsen waren, wiesen die BF-Bildner 1.10 und 2.11 auf den Glasobjektträgern lediglich einen dünnen Bewuchs mit wenigen Zellschichten auf. Bei dem Isolat 1.3.7 konnten nur einzelne oder in Ketten angeordnete Zellen einschichtig beobachtet werden. Extrazelluläre Substanzen wurden bei Stamm 2.11 und 2.11.8 kaum entdeckt (Bilder nicht dargestellt). Ergebnisse 102 a) b) c) d) e) f) Abb. 26 REM der Stämme 2.11 (a,b,c,d) und 2.11.8 (e,f) Isolate kultiviert in TSBG für 18 h auf Glasobjektträgern, nach Präparation mit Platin bedampft, Mikroskopie bei 10 kV (siehe 3.14.1); a,b,c,d) Stamm 2.11; e,f), Stamm 2.11.8; Vergrößerung und Längenangabe [µm] sind jeweils unterhalb des Bildes aufgeführt. Ergebnisse 103 4.5.2.3 Stoffwechselphysiologische Eigenschaften und Antibiotikaresistenzen Die erzeugten BF-Mutanten und deren Wildtypstämme wurden auf ihre Fähigkeiten zur Verstoffwechselung bestimmter Kohlenhydratsubstrate mittels des API®50 CH-Testsystems untersucht. Die Abb. 27 stellt die Ergebnisse schematisch in einem Dendrogramm dar. Die Stämme 1.3 und 1.3.7, 1.10 und 1.10.16 sowie 2.11 und 2.11.8 zeigten jeweils ein gleiches Verwertungsmuster, so dass bzgl. dieser Eigenschaften kein Unterschied jeweils zwischen Wildyp- und BF-Mutantenstamm zu erkennen war. Der Stamm 1.4 konnte ein Substrat (Kaliumglukonat, Nr. 47) im Gegensatz zum Stamm 1.4.6 nicht verwerten, so dass die beiden Isolate nicht zusammen gruppierten (siehe auch 4.5.1). 10 0 9896949290 G LY ER Y D AR A LA R A R IB D XY L LX YL AD O ß M # G AL G LU FR U M aN So r R H A D U L IN O M AN 1 SO R 1 M an no si d G lu ko si d G lu ko sa m in AM Y AR B ES C SA L C EL M AL LA C M EL SA C TR E IN U M eL e R AF Am i G LY co Xy L G EN D TU R D LY X D TA G D FU C LF U C D AR LA R N aT 2K # G lu ko na t 5K # G lu ko na t 1.4.6 2.11 2.11.8 1.4 1.3.7 1.3 1.10.16 1.10 Abb. 27 Dendrogramm der Ergebnisse des API®50 CH von Wildtyp- und BF-Mutantenstämmen ■, positive Reaktion / Verwertung des Substrats; □, negative Reaktion / keine Verwertung des Substrats. Des Weiteren wurden die Antibiotikaresistenzen und Antibiotikaresistenzgene der Stämme überprüft. Im Mikrodilutions- bzw. Agardiffusionsverfahren konnte jeweils kein Unterschied zwischen Wildtyp- und Mutantenstamm bzgl. der Antibiotika Vancomycin, Teicoplanin, Ampicillin, Tetrazyklin, Erythromycin, HLR-Gentamicin, HLR-Streptomycin, Oflocaxin, Ciprofloxacin, Rifampicin sowie Chloramphenicol festgestellt werden. Auch der Nachweis der Antibiotikaresistenzgene erbrachte keine Unterschiede (1.3 / 1.3.7, ermB+, aac-aph-, tetM+; 1.10 / 1.10.16, ermB-, aac-aph-, tetM-; 2.11 / 2.11.8, ermB-, aac-aph-, tetM+). Ergebnisse 104 4.5.2.4 Virulenzfaktoren Die Wildtyp- und BF-Mutantenstämme wurden phänotypisch und genotypisch auf das Vorkommen von verschiedenen Virulenzfaktoren untersucht. Bzgl. der Gelatinase-Bildung, β-Hämolyse und Bacteriocin-Produktion sowie des Vorhandenseins der Gene gelE, cylA, esp (incl. der Anzahl von A- und C-Repeats), asa1, aceB und des bee Locus konnten keine Unterschiede festgestellt werden (Tab. 16). Offensichtliche Differenzen zwischen Wildtyp- und BF-Mutantenstämmen zeigten sich jedoch beim phänotypischen Test auf Aggregation (Verklumpung, Agg). Hier reagierte der Stamm 1.3 negativ, während dessen Mutante 1.3.7 eine deutliche Verklumpung in Anwesenheit von Pheromonen des Produzenten E. faecalis OG1X aufwies. Die Prüfung auf konstitutive Verklumpung in THB-Medium fiel bei allen Isolaten negativ aus. Tab. 16 Phänotypische und genotypische Nachweise verschiedener Virulenzfaktoren bei den E. faecalis Wildtyp- und BF-Mutantenstämmen +, positiver Nachweis bzw. Anwesenheit des Gens; -, negativer Nachweis bzw. Gen nicht vorhanden; GelE, Gelatinase-Produktion; β-Häm, β-Hämolyse-Nachweis; gelE, cylA, esp, asa1, aceB, espA, espC, bee1-3, Nachweis der Gene bzw. der Anzahl der Tandemrepeats; E.fm 64/3, E.fc JH2-2, Bacteriocin-Produktion gegenüber des Indikatorstamms E. faecium 64/3 bzw. E. faecalis JH2-2 (+, Hemmhof ≤ 1 mm; ++, Hemmhof 2-4 mm); Agg, Aggregation in Anwesenheit von Pheromonen des Stamms E. faecalis OG1X. Stamm GelE β-Häm E.fm 64/3 E.fc JH2-2 gelE cylA esp asa1 aceB espA espC bee1-3 Agg 1.3 - + ++ ++ - + - + 3,5 - - - - 1.3.7 - + ++ ++ - + - + 3,5 - - - + 1.10 + - - - + - + + 2,5 1 4 + + 1.10.16 + - - - + - + + 2,5 1 4 + + 2.11 + + + + + + - + 4,5 - - - - 2.11.8 + + + + + + - + 4,5 - - - - Außerdem konnte bei keinem der Wildtyp- und BF-Mutantenstämme DNase- oder Lipase- Produktion nachgewiesen werden. Alle Stämme produzierten H2O2. Des Weiteren wurde mittels PCR bei allen Isolaten das efaAfc Gen detektiert (MRI, Karlsruhe) und bei keinem Stamm das asa373 Gen, so dass auch bzgl. dieser Eigenschaften kein Unterschied festzustellen war. Ergebnisse 105 4.5.2.5 Primäre Anheftung an abiotische Oberflächen Die E. faecalis Wildtyp- und BF-Mutantenstämme wurden auf ihre Fähigkeit zur primären Anheftung an abiotische Oberflächen (Polystyrol) untersucht. Alle Mutantenstämme zeigten hierbei einen signifikanten Unterschied zum jeweiligen Wildtyp (siehe Abb. 28). Die Fähigkeit zur primären Anheftung an PS hat sich bei dem Isolat 1.3.7 im Vergleich zum Wildtyp 1.3 um beinahe das Zweifache erhöht (OD595 = 0,110 vs OD595 = 0,063; P = 0,0197, t-Test mit P < 0,05). Bei dem Mutantenstamm 1.10.16 konnte eine signifikante Verringerung (P = 0,0009) der Fähigkeit zur primären Anheftung verglichen mit dem starken BF-Bildner 1.10 festgestellt werden (OD595 = 0,090 vs OD595 = 0,192). Auch der starke BF-Produzent 2.11 zeigt gegenüber der Mutante 2.11.8 eine leichte, aber dennoch signifikante Abnahme (P = 0,0214) dieser Eigenschaft. 0,000 0,050 0,100 0,150 0,200 0,250 O D 59 5 Wildtyp 0,063 0,192 0,095 Mutante 0,110 0,090 0,067 1.3 / 1.3.7 1.10 / 1.10.16 2.11 / 2.11.8 Abb. 28 Primäre Anheftung an abiotische Oberflächen bei Wildtyp- und Biofilm- Mutantenstämmen Ermittelt auf Polystyrol-Oberfläche (siehe 3.11.7); *, signifikanter Unterschied zwischen den Stämmen 1.3 und 1.3.7 (P = 0,0197) sowie den Stämmen 2.11 und 2.11.8 (P = 0,0214); ***, hoch signifikanter Unterschied zwischen den Stämmen 1.10 und 1.10.16 (P = 0,0009); statistische Analyse mittels t-test (P < 0,05), bei 1.3 / 1.3.7 und 2.11 / 2.11.8 mit Welch´s Korrektur. * * *** Ergebnisse 106 4.5.2.6 Hydrophobizität der Zelloberfläche Unterschiede in der Hydrophobizität der Zelloberfläche der E. faecalis Wildtyp- und Mutantenstämme wurden mit Hilfe eines Tests untersucht, bei dem die Verteilung der Bakterienzellen in einer wässrigen und organischen Phase (n-Hexadecan) ermittelt wird. Bzgl. der Stämme 1.3 und 1.3.7 konnte keine Änderung in der Hydrophobizität der Zellen festgestellt werden, beide Isolate zeigten eine etwa gleich hohe Hydrophobizität von 32,94 % bzw. 34,19 %. Der Wildtypstamm 1.10 wies hingegen einen signifikanten Unterschied (P = 0,0053, t-Test mit P < 0,05) zur Mutante 1.10.16 auf, hier wurde eine etwa zweifach höhere Hydrophobizität der Zellen (43,72 %) im Vergleich zum Mutantenstamm (21,78 %) nachgewiesen. Auch die Zellen des Isolats 2.11 zeigten signifikante Unterschiede (P = 0,0004) in der Zellhydrophobizität gegenüber der Mutante 2.11.8 (68,01 % vs 13,42 %; siehe Abb. 29). 0 10 20 30 40 50 60 70 80 H yd ro ph ob iz itä t [ % ] Wildtyp 32,94 43,72 68,01 Mutante 34,19 21,78 13,42 1.3 / 1.3.7 1.10 / 1.10.16 2.11 / 2 11.8 Abb. 29 Hydrophobizität der Zelloberflächen von Wildtyp- und Biofilm-Mutantenstämmen Ermittelt unter Verwendung von n-Hexadecan (siehe 3.11.8); **, signifikanter Unterschied (P = 0,0053) zwischen den Stämmen 1.10 und 1.10.16; ***, hoch signifikanter Unterschied (P = 0,0004) zwischen den Stämmen 2.11 und 2.11.8 (t-Test, P < 0,05; bei 2.11 / 2.11.8 mit Welch´s Korrektur); zwischen den Stämmen 1.3 und 1.3.7 lag kein signifikanter Unterschied vor. 4.5.2.7 Adhärenz an HeLa-Zellen In weiteren Untersuchungen wurden die E. faecalis Wildtyp- und Mutantenstämme bzgl. ihrer Fähigkeit zur Adhärenz an eukaryotische Zellen, speziell HeLa-Zellen, verglichen. Hier konnte lediglich bei dem starken BF-Bildner 2.11 und dessen Mutante 2.11.8 ein signifikanter Unterschied (P = 0,0006; t-Test mit P < 0,05) festgestellt werden (27,01 ± 4,20 % vs 2,73 ± 0,86 %). Alle anderen getesteten Stämme zeigten sehr geringe Adhärenz an HeLa-Zellen, wobei kein signifikanter Unterschied zwischen Wildtyp- und Mutantenstamm vorlag. Bzgl. der Stämme 1.3 und 1.3.7 konnte eine Adhärenz von 3,93 ± 0,75 % bzw. 3,19 ± 0,87 % nachgewiesen werden, hinsichtlich der Isolate 1.10 und 1.10.16 hefteten sich 4,05 ± 0,10 % bzw. 2,93 ± 1,70 % an die HeLa-Zellen im Adhärenz-Assay an. *** ** Ergebnisse 107 4.5.2.8 Nachweis von Plasmid-DNA Die Präparation von Plasmiden sollte eventuelle Unterschiede im Vorkommen von Plasmiden bei den E. faecalis Wildtyp- und BF-Mutantenstämmen aufdecken. Die Plasmid- Isolierung mit anschließender Restriktion mit Hilfe der Enzyme EcoRI und HindIII ergab bzgl. der Stämme 1.3 und 1.3.7 (siehe Abb. 30, Bahn 1,2,7,8) sowie 1.10 und 1.10.16 (siehe Abb. 30, Bahn 3,4,9,10) keine Unterschiede jeweils zwischen Wildtyp und Mutante, was insbesondere anhand der identischen Restriktionsmuster deutlich wurde. Bei den Stämmen 1.3 und 1.3.7 konnte jeweils ein großes Plasmid (ca. 60 kb) nachgewiesen werden. Bzgl. der Stämme 1.10 und 1.10.16 wurde wiederholt ein Muster detektiert, was auf ein Vorkommen mehrerer Plasmide schließen ließ, die höchstwahrscheinlich in unterschiedlichen Formen (oc-Form oder supercoiled) vorlagen. Die Präparationen der Isolate 2.11 und 2.11.8 (siehe Abb. 30, Bahn 5,6,11,12) hingegen ließen vermuten, dass bei der Mutante im Vergleich zum Wildtyp ein Plasmidverlust aufgetreten war. Hierbei handelte es sich scheinbar um ein Plasmid der Größe von etwa 60 kb, möglicherweise enthielt der Stamm 2.11 weitere Plasmide, die sich in der Agarose-Gelelektrophorese in unterschiedlichen Konformationen darstellten. Abb. 30 Nachweis von Plasmiden der E. faecalis Wildtyp- und Biofilm-Mutantenstämmen Bahn 1-6, Plasmide, keine Restriktion; Bahn 7-12, Fragmentmuster nach Restriktion der Plasmide mit EcoRI/HindIII; Bahn 1,7, Stamm 1.3; Bahn 2,8, Stamm 1.3.7; Bahn 3,9, Stamm 1.10; Bahn 4,10, Stamm 1.10.16; Bahn 5,11, Stamm 2.11; Bahn 6,12, Stamm 2.11.8; M1, Marker pAD1 (*, 59,3 kb); M2, Marker 2 (pUC19, 2,686 kb); M3, 500-8000 bp DNA Marker (Bio-Rad Laboratories; **, 5000 bp); Chr, chromosomale DNA; 1% TBE Agarosegel M1 1 2 3 4 5 6 M2 M3 7 8 9 10 11 12 M3 ** * Chr Ergebnisse 108 4.5.2.9 Massenspektrometrische Identifizierung von Zellwandproteinen Proteinextraktionen aus Kulturen der E. faecalis Isolate, die in TSBG bis zum Erreichen der späten log-Phase angewachsen waren, ergaben zum Teil prägnante Unterschiede in dem Proteinexpressionsmuster zwischen Wildtyp- und BF-Mutantenstämmen insbesondere im hochmolekularen kDa-Bereich (siehe Abb. 31). Einige dieser sehr markanten, auf einem SDS-Gradientengel aufgetrennten, differentiell exprimierten Proteine wurden mittels LC/MS identifiziert. Die Proteinprofile aller Stämme erschienen hingegen im Massenbereich < ca. 85 kDa kaum verschieden. Abb. 31 Proteinexpressionsmuster der E. faecalis Wildtyp- und Biofilm-Mutantenstämme Pfeile markieren die Banden, deren Proteine mittels Massenspektrometrie identifiziert wurden (siehe Tab. 17); Zellaufschluss mittels Lysozym (siehe 3.13.1; eine Durchführung des Zellaufschlusses mittels Mutanolysin zeigte keine hinreichenden Ergebnisse); Elektrophorese mittels SDS-Gradientengel (4-12%); Bahn 1, Stamm 1.3; Bahn 2, Stamm 1.3.7; Bahn 3, Stamm 1.10; Bahn 4, Stamm 1.10.16; Bahn 5, 2.11; Bahn 6, 2.11.8; M1, Marker 1, Unstained Precision Plus ProteinTM Standards (Bio-Rad Laboratories); M2, Marker 2, PageRulerTM Protein Ladder (Bio-Rad Laboratories); *, ebenfalls bearbeitete Bande (siehe Text). Bei den Stämmen 1.3 (Wildtyp, kein BF-Bildner) und 1.3.7 (Mutante, starker BF-Bildner) zeigten sich insbesondere zwei Proteinbanden, die bei dem Mutantenstamm nach der SDS- Gradienten-Gelelektrophorese stärker erschienen als beim Wildtyp (siehe Abb. 31, Bahn 1 und 2). Die massenspektrometrische Identifizierung (Tab. 17, Banden 1.1, 1.2, 2.1, 2.2) ergab zum einen, dass bei beiden Stämmen und auch beiden untersuchten Banden (ca. 300 kDa und ca. 180 kDa) die drei Proteine des ebp Locus (EbpA, EbpB, EbpC; siehe auch 1.3.4.4) nachgewiesen werden konnten. Außerdem wurden bei beiden Stämmen das Surface Exclusion Protein der Aggregationssubstanz PrgB (PrgA) detektiert sowie zwei a) 1.3 / 1.3.7 b) 1.10 / 1.10.16 c) 2.11 / 2.11.8 M1 1 2 M2 3 4 M1 5 6 Å 1.1 / 2.1 Å 1.2 / 2.2 Å 3.1 / 4.1 Å 3.2 / 4.2 Å 5.1 / 6.1 Å 5.2 / 6.2 Å 5.3 / 6.3 Å 5.4 / 6.4 250 150 150 200 250 150 kDa kDa kDa 75 75 85 100100 * * * * 25 Ergebnisse 109 bisher uncharakterisierte Proteine (EF2505, putatives Zellwand-assoziiertes Protein; EF0109). Damit konnte ein Unterschied bei den Stämmen 1.3 und 1.3.7 nur bzgl. der Stärke der untersuchten Proteinbanden festgestellt werden. Die Proteinexpressionsprofile der Stämme 1.10 (Wildtyp, sehr starker BF-Bildner) und 1.10.16 (Mutante, schwacher BF-Bildner) zeigten insbesondere zwei unterschiedliche Banden, und zwar eine sehr breite Bande mit der molekularen Masse von ca. 250 kDa, die beim Wildtyp 1.10 stärker erschien, und eine Bande (ca. 180 kDa), die bei der Mutante stärker zu erkennen war (siehe Abb. 31, Bahn 3 und 4). Hinsichtlich dieser Stämme zeigte die Identifizierung der Proteine (siehe Tab. 17 und Tab. 18) eindeutig, dass in beiden untersuchten Banden (ca. 250 kDa und ca. 180 kDa) beim Wildtyp die drei Proteine des bee Locus (Bee-1, Bee-2, Bee-3; siehe auch 1.3.4.3) nachgewiesen werden konnten (Banden 3.1 und 3.2), wohingegen in beiden Banden das Protein Bee-2 bei der Mutante nicht detektiert wurde (Banden 4.1 und 4.2). Ferner wurde in beiden untersuchten Proteinbanden des Stamms 1.10.16 die putative Aggregationssubstanz EF0149 sowie das Surface Exclusion Protein der Aggregationssubstanz PrgB identifiziert (Banden 4.1 und 4.2). Der Unterschied im Proteinexpressionsmuster der Stämme 2.11 (Wildtyp, sehr starker BF- Bildner) und 2.11.8 (Mutante, schwacher BF-Bildner) war sehr markant (siehe Abb. 31, Bahn 5 und 6). Hier wurden insbesondere vier, zum Teil sehr stark erscheinende Banden des Wildtyps mittels Massenspektrometrie untersucht, die bei der Mutante nur höchst schwach zu erkennen waren. Bei Stamm 2.11 wurden in den analysierten Banden 5.2 und 5.3 die putative Aggregationssubstanz EF0149 identifiziert sowie in den Banden 5.3 und 5.4 das Surface Exclusion Protein Sea1 (siehe Tab. 18), wobei in Bande 5.4 ebenfalls das Surface Exclusion Protein der Aggregationssubstanz PrgB (PrgA) eindeutig detektiert wurde (Gesamt-Score 1084 mit 46 identifizierten Peptiden). Bei Stamm 2.11.8 konnte die Aggregationssubstanz EF0149 hingegen nicht nachgewiesen werden (Banden 6.1, 6.2, 6.3, 6.4). Lediglich das Surface Exclusion Protein PrgA wurde identifiziert (Bande 6.4). Überwiegend wurden Proteine des ebp Locus, die teilweise beim Wildtyp 2.11 ebenfalls detektiert wurden (Bande 5.2), sowie das uncharakterisierte, putative Zellwand-assoziierte Protein EF2505 nachgewiesen. Die Analyse einer weiteren Bande (*, ca. 300 kDa) brachte keine signifikanten Identifzierungen (Daten nicht aufgeführt). Des Weiteren wurde eine Identifizierung mehrerer Proteinbanden (*) im Massenbereich von 20 – 30 kDa der Stämme 1.10 und 1.10.16 durchgeführt, um möglicherweise das Protein Bee-2 bei dem Mutantenstamm 1.10.16 einzeln nachzuweisen, d.h. nicht in dem HMW-Bee- Komplex vorliegend. Hierbei wurde eine große Anzahl verschiedenster Proteine (überwiegend Enzyme bestimmter Stoffwechselwege u.a.) identifiziert, Bee-2 konnte jedoch weder beim Wildtyp- noch beim Mutantenstamm detektiert werden (Daten nicht aufgeführt). Ergebnisse 110 Tab. 17 Mittels Massenspektrometrie identifizierte, differentiell exprimierte Proteine der E. faecalis Wildtyp- und Biofilm-Mutantenstämme Angegeben sind Proteine mit signifikanter Übereinstimmung nach Datenbankabgleich (siehe 3.13.4); aufgeführt sind die Akzessionsnummern der NCBI-Datenbank der jeweils codierenden DNA-Sequenz; PrgA, Surface Exclusion Protein der Aggregationssubstanz PrgB; Sea1, Surface Exclusion Protein der Aggregationssubstanz Asa1; PepA, Glutamyl-Aminopeptidase; CarB, Carbamoyl-Phosphat-Synthase (große Untereinheit); IleS, Isoleucyl-tRNA Synthetase. Stamm Bande ca. kDa- Bereich SDS-Gel Identi- fizierte Proteine Akzessionsnr. Gensequenz Anzahl identi- fizierter Peptide Gesamt- Score Molekulare Masse (kDa) EbpA AAO80891 13 362 122,6 PrgA AAO83101 17 493 98,1 EbpC AAO80893 9 227 67,9 EbpB AAO80892 5 129 53,3 1.3 1.1 300 EF2505 AAO82221 6 119 182,7 EF2505 AAO82221 16 683 182,7 EbpA AAO80891 16 737 122,6 EF0109 AAM75312 3 98 206,7 EbpC AAO80893 14 654 67,9 Sea1 AAO83047 4 128 98,1 1.3 1.2 180 EbpB AAO80892 4 164 53,3 EbpA AAO80891 29 754 122,6 EbpC AAO80893 32 660 67,9 EbpB AAO80892 9 235 53,3 EF2505 AAO82221 6 195 182,7 1.3.7 2.1 300 PrgA AAO83101 6 170 98,1 EF2505 AAO82221 7 272 182,7 EbpA AAO80891 7 270 122,6 EF0109 AAM75312 8 330 206,7 1.3.7 2.2 180 EbpC AAO80893 3 151 67,9 Bee-3 AAZ68039 91 1544 53,1 Bee-1 AAZ68037 30 842 117,9 1.10 3.1 250 Bee-2 AAZ68038 4 102 26,8 Bee-3 AAZ68039 48 1083 53,1 Bee-1 AAZ68037 26 769 117,9 PepA AAO82720 15 224 39,1 1.10 3.2 180 Bee-2 AAZ68038 9 214 26,8 Ergebnisse 111 Tab. 18 Mittels Massenspektrometrie identifizierte, differentiell exprimierte Proteine der E. faecalis Wildtyp- und Biofilm-Mutantenstämme (Fortsetzung) *, wiederholte nicht hinreichende Identifizierung, erweiterter Datenbank-Abgleich durchgeführt, der zu keiner Übereinstimmung führte. Stamm Bande ca.kDa- Bereich SDS-Gel Identifi- zierte Proteine Akzessionsnr. Gensequenz Anzahl identifi- zierter Peptide Gesamt- Score Molekulare Masse (kDa) Bee-3 AAZ68039 37 896 53,1 EF0149 AAO80023 14 285 142,8 PrgA AAO83101 7 211 98,1 1.10.16 4.1 250 Bee-1 AAZ68037 5 107 117,9 EF0149 AAO80023 15 359 142,8 PrgA AAO83101 8 242 98,1 PepA AAO82720 3 94 39,1 Bee-3 AAZ68039 3 93 53,1 1.10.16 4.2 180 Bee-1 AAZ68037 4 56 117,9 2.11 5.1 160 EF0109* AAM75312 1* 70* 206,7 EF0149 AAO80023 6 424 142,8 EbpA AAO80891 2 90 122,6 2.11 5.2 140 EF2505 AAO82221 2 57 182,7 EF0149 AAO80023 76 1006 142,8 2.11 5.3 130 Sea1 AAO83047 2 118 98,1 PrgA AAO83101 46 1084 98,1 Sea1 AAO83047 53 835 98,1 2.11 5.4 100 CarB AAO81492 9 146 116,6 EbpA AAO80891 18 281 122,6 EbpB AAO80892 3 129 53,3 EbpC AAO80893 5 115 67,9 2.11.8 6.1 160 EF2505 AAO82221 5 91 182,7 EbpA AAO80891 13 170 122,6 2.11.8 6.2 140 EF2505 AAO82221 12 156 182,7 EbpA AAO80891 9 69 122,6 2.11.8 6.3 130 EbpB AAO80892 1 71 53,3 IleS AAO80809 3 247 105,8 CarB AAO81492 5 203 116,6 2.11.8 6.4 100 PrgA AAO83101 4 89 98,1 Ergebnisse 112 4.5.2.10 RT-PCR-Analysen Die erzeugten E. faecalis BF-Mutanten und deren Wildtypstämme wurden darüber hinaus mittels RT-PCR-Analysen auf eine veränderte Transkription verschiedener, für die Biofilm- Bildung bedeutsamer Gene untersucht. Bei den Stämmen 1.3 und 1.3.7, 1.10 und 1.10.16 sowie 2.11 und 2.11.8 konnte mittels RT-PCR kein Unterschied (qualitativ) in der Expression auf transkriptioneller Ebene bzgl. der Gene ebpA, asa1, gelE, esp, cylA und bopD nachgewiesen werden. Aufgrund der Ergebnisse massenspektrometrischer Untersuchungen bzgl. der Stämme 1.10 und 1.10.16 (siehe 4.5.2.9) wurden bei diesen Isolaten weitere PCR- und RT-PCR- Nachweise der Gene des bee Locus inkl. der assoziierten Sortase-Gene (siehe auch 1.3.4.3) durchgeführt. Mit Hilfe von Primer Bee12-for und Primer P101D12-1-rev wurde ein Bereich des Gentranskripts von bee2 und bee3 (539 bp, Abb. 32 a, Bahn 1 und 2), mittels des Primerpaars bee1-for2267 / bee1-rev3182 ein Teilbereich (1016 bp) des bee1 Transkripts (Abb. 32 a, Bahn 3 und 4) sowie mittels der Primer P101D12-2-for und P101D12-1-rev Bereiche des bee1, bee2 und bee3 Transkripts (1395 bp, Abb. 32 a, Bahn 5 und 6) amplifiziert. Die Abb. 33 verdeutlicht schematisch die Primerpositionen und amplifizierten Bereiche des bee Locus. Abb. 32 RT-PCR-Analysen von Bereichen des bee Locus der Stämme 1.10 und 1.10.16 a), RT-PCRs von Teilbereichen der bee-1, bee-2 und bee-3 Gene; Bahn 1,3,5, Stamm 1.10; Bahn 2,4,6, Stamm 1.10.16; Bahn 1,2, 539 bp Fragment mittels Primerpaar Bee12-for/P101D12-1-rev; Bahn 3,4, 1016 bp Fragment mittels Primerpaar bee1-for2267/bee1-rev3182; Bahn 5,6, 1395 bp Fragment mittels Primerpaar P101D12-2- for/P101D12-1-rev; b), RT-PCRs von Teilbereichen der srt-1 und srt-2 Gene des bee Locus; Bahn 1,4,7, Stamm 1.10; Bahn 2,5,8, Stamm 1.10.16; Bahn 1,2, 650 bp Fragment mittels Primerpaar Sor1L-for/Sor1R-rev; Bahn 4,5, 1898 bp Fragment mittels Primerpaar Sor1L-for/Sor2R-rev; Bahn 7,8, 1280 bp Fragment mittels Primerpaar P101D12-11-for/Sor2R-rev; M, Marker (GeneRulerTM DNA Ladder Mix, MBI Fermentas); NK,K, Negativkontrollen; *, 1000 bp Fragment des Markers. a) b) 1 2 3 4 M 5 6 7 1 2 3 M 4 5 6 7 8 9 * * Ergebnisse 113 Abb. 33 Untersuchte Abschnitte des bee Locus der E. faecalis Stämme 1.10 und 1.10.16 mittels PCR und RT-PCR (schematisch) Der bee Locus besteht aus drei Genen, bee-1, bee-2 und bee-3, die putative Zellwandproteine codieren, sowie aus zwei Genen (srt-1 und srt-2) für putative Sortasen. Oberhalb sind die Primerpositionen der untersuchten Gen- bzw. Transkriptabschnitte angegeben. Die Linien-Pfeile unterhalb stellen die putativen Transkriptionseinheiten dar (Tendolkar et al., 2006). Außerdem wurde mit Hilfe der Primerkombination Sor1L-for / Sor1R-rev ein Bereich des srt-1 Gentranskripts untersucht (650 bp, Abb. 32 b, Bahn 1 und 2), mittels des Primerpaars Sor1L-for / Sor2R-rev (1898 bp, Abb. 32 b, Bahn 4 und 5) sowie P101D12-11-for / Sor2R-rev (1280 bp, Abb. 32 b, Bahn 7 und 8) weitere Bereiche des srt-1 und srt-2 Gentranskripts. Keine dieser RT-PCR-Analysen ergab somit einen Unterschied zwischen dem starken BF- Bildner 1.10 und dessen Mutante 1.10.16 in der Transkription der untersuchten Genabschnitte des bee Locus. 4.5.2.11 DNA-Sequenzierungen und Alignments Da massenspektrometrische Untersuchungen Zellwand-assoziierter Proteine bei den Stämmen 1.10 und 1.10.16 auf eine Mutation in Verbindung mit dem bee Locus hinwiesen, mittels RT-PCR-Analysen allerdings keine Veränderung auf transkriptioneller Ebene nachgewiesen werden konnte, wurden Teilbereiche dieser Gene beider Stämme sequenziert. Die DNA-Sequenzierungen der PCR-Fragmente, die mit den Primerpaaren P101D12-2-for / P101D12-1-rev (bee1-3, 1395 bp) und bee1-for2267 / bee1-rev3182 (bee1, 1016 bp) generiert wurden, ergaben vollkommen identische Basenabfolgen jeweils bei Wildtyp und Mutante. Ebenso konnte eine identische DNA-Sequenz des Fragments des srt2 Gens, das mit der Primerkombination P101D12-11-for / Sor2R-rev (1280 bp) amplifiziert wurde, bei beiden Stämmen nachgewiesen werden (Daten nicht dargestellt). Die DNA-Sequenzierung des 650 bp großen Fragments des srt 1 Gens (Primerpaar Sor1L- for / Sor1L-rev) mittels des Primers Sor1L-for zeigte hingegen den Austausch einer Base an Position 751 des srt1 Gens (G Æ T) bei der Mutante 1.10.16 im Vergleich zum Wildtyp 1.10. bee-1 bee-2 bee-3 srt-1 srt-2 ◄ S or 1L -fo r ◄ P 10 1D 12 -1 1- fo r b zw . S or 1R -r ev ◄ S or 2R -r ev ◄ b ee 1- fo r2 26 7 ◄ P 10 1D 12 -2 -fo r ◄ b ee 1- re v3 18 2 ◄ B ee 12 -fo r ◄ P 10 1D 12 -1 -r ev Ergebnisse 114 Alignments dieser DNA-Sequenzen (siehe Abb. 40 im Anhang) und Translation in die Aminosäuresequenz des Enzyms Sortase-1 (MegAlign 7.0, DNASTAR Lasergene Software; MRI Karlsruhe) ergaben schließlich, dass diese G Æ T Punktmutation zu einem Austausch der Aminosäure Glutaminsäure (AS 251) in ein Stopp-Codon (siehe Abb. 34) und somit in den Abbruch der Translation resultierte. Diese Punktmutation wurde durch weitere drei unabhängige Sequenzierungen (unterschiedliche DNA-Extraktionen und PCR-Ansätze) bestätigt. Abb. 34 Vergleich der abgeleiteten Aminosäuresequenzen eines Teilbereichs der Sortase-1 des bee Locus der E. faecalis Stämme 1.10, 1.10.16 und E99 Stopp-Codon an Position 251 bei der Mutante 1.10.16; erkennbar sind weitere Unterschiede zur publizierten Sequenz des Stamms E. faecalis E99 (Tendolkar et al., 2006), die jedoch sowohl im Wildtyp 1.10 und der Mutante 1.10.16 auftraten; Alignment durchgeführt mit Hilfe der Software MegAlign 7.0 (DNASTAR Lasergene Software; MRI Karlsruhe); dunkle Balken, Übereinstimmung der Sequenz bei allen drei analysierten Stämmen; helle Balken, Sequenzübereinstimmung bei zwei von drei analysierten Stämmen. Diskussion 115 5 Diskussion In den letzten Jahren ist das Interesse v.a. der medizinischen Forschung an der Untersuchung der Biofilm-Bildung bei den opportunistisch pathogenen Enterokokken stark gestiegen, da diese Fähigkeit als eine wichtige Eigenschaft für die Pathogenese von Infektionen, die die klinisch relevanten Spezies E. faecalis und E. faecium verursachen, erkannt wurde. Einige Virulenzfaktoren konnten bei Enterokokken in Verbindung mit dem Vorgang der Biofilm-Bildung gebracht werden, dennoch sind die daran beteiligten molekularen Mechanismen bislang weitgehend ungeklärt. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Enterokokken-Stämme verschiedener Herkunft auf ihre Biofilm-Bildungsfähigkeit untersucht und Korrelationen mit phänotypisch und genotypisch nachgewiesenen Virulenzfaktoren erstellt, um mögliche Zusammenhänge und die Bedeutung der einzelnen Faktoren am Vorgang der Biofilm-Bildung zu ergründen. Ein Schwerpunkt lag auf der Untersuchung von E. faecalis Isolaten aus Vaginalabstrichen von Patientinnen, die an Bakterieller Vaginose litten, da neuste Ergebnisse auch bzgl. der Pathogenese dieses Krankheitsbildes der Biofilm- Bildung eine entscheidende Bedeutung zumessen. Inwieweit Enterokokken Einfluss auf die Biofilm-Bildung im Fall der Bakteriellen Vaginose nehmen, ist unklar. Im Rahmen dieser Arbeit sollte daher das Vorkommen von Virulenzfaktoren und Biofilm-Bildung bei Enterokokken aus Vaginalabstrichen analysiert werden. 5.1 E. faecalis isoliert aus verschiedenem klinischen Material 5.1.1 Phänotypischer und genotypischer Nachweis von Virulenzfaktoren Mehrere Studien wurden bislang zur Erforschung des Vorkommens von Virulenzfaktoren bei E. faecalis wie auch E. faecium durchgeführt, mit denen die in der vorliegenden Arbeit erzielten Ergebnisse über die Häufigkeit der Gene esp, asa1, gelE, cylA sowie der Gelatinase-Expression und β-Hämolyse bei Stämmen unterschiedlicher Herkunft (siehe 4.1.1, Tab. 11) im Folgenden verglichen werden. Das esp Gen wurde mit einer Gesamtinzidenz von 52,7 % in dieser Arbeit in etwa gleicher Häufigkeit in jeder Gruppe der E. faecalis Stämme verschiedener Herkunft nachgewiesen (52,3 % der Urin-Isolate und 54,1 % der Faeces-Stämme). Dieses Ergebnis korreliert relativ gut mit beobachteten Gesamtinzidenzen bei E. faecalis von Mohamed et al. (2004; 45,0 %), Di Rosa et al. (2006; 43,4 %) oder Dworniczek et al. (2005; 57,4 %). Auch bestärkten die erhaltenen Daten die Ergebnisse anderer Autoren (Eaton & Gasson, 2002; Waar et al., 2002a; Creti et al., 2004; Di Rosa et al., 2006), die eine Verbreitung von esp bei E. faecalis Isolaten aus den unterschiedlichsten Bereichen (Infektionen, Normalflora, Umwelt etc.) beschrieben. Dies steht im Gegensatz zum Espfm, das fast ausschließlich mit E. faecium Stämmen klinischer Herkunft assoziiert ist (siehe auch 5.2). Die Untersuchungen von Diskussion 116 Creti et al. (2004), Seno et al. (2005) und Mohamed et al. (2004) ergaben, dass 66,7 %, 72,2 % bzw. 59,0 % der Stämme aus Harnwegsinfektionen (UTI) esp+ waren, was die Ergebnisse einer Studie von Shankar et al. (2001) bzgl. der Rolle von Esp als Kolonisationsfaktor bei UTI unterstützte. Im Vergleich zu den nachgewiesenen Inzidenzen dieser Arbeit (52,3 %) zeigten die Daten dieser Autoren ein etwas höheres Vorkommen von esp bei Urin-Stämmen, was in regionalen Unterschieden begründet sein kann. Die nachgewiesene Gesamthäufigkeit des gelE Gens (82,0 %) war ähnlich zum Auftreten, das andere Autoren beschrieben (74,3 %; Creti et al., 2004). Des Weiteren stellten Creti et al. (2004) sowie Seno et al. (2005) die im Vergleich zu Stämmen anderer Herkunftsbereiche durchschnittlich höchsten Inzidenzen bei E. faecalis Isolaten aus UTI fest (90,9 % bzw. 86,9 %), was ebenfalls gut mit den in der vorliegenden Arbeit erzielten Ergebnissen korrelierte (84,1 %). Allerdings exprimierten ca. die Hälfte der E. faecalis Stämme, bei denen das gelE Gen detektiert wurde, das Enzym Gelatinase nicht. Diese sogenannten „stillen Gene“ sind bei der überwiegenden Anzahl der Isolate in einer häufig auftretenden, 23,9 kb-großen Deletion des fsr Genclusters begründet, wodurch ein GelE- Phänotyp resultiert (Nakayama et al., 2002; Roberts et al., 2004). In der vorliegenden Untersuchung wurde die Produktion der Gelatinase insgesamt bei 46,0 % der E. faecalis Isolate nachgewiesen, wobei 38,6 % der Stämme aus Urin, 52,6 % der Isolate invasiver Herkunft und 40,5 % der Faeces-Isolate GelE+ waren. Creti et al. (2004) stellten bei 45,5 % der Stämme aus invasiven Infektionen und 33,3 % der Urin- Isolate Gelatinase-Produktion fest. Coque et al. (1995) konnten eine Gelatinase-Expression bei 53,0 % der untersuchten Urin-Isolate und 62,0 % der Faeces-Isolate bei hospitalisierten Patienten sowie 27,0 % der Faeces-Stämme gesunder Personen nachweisen. Auch in einer Studie von Di Rosa et al. (2006) waren lediglich 16,7 % der E. faecalis Intestinaltrakt- Stämme GelE+. Seno et al. (2005) detektierten eine Gelatinase-Produktion bei 47,4 % der von den Autoren untersuchten 352 Urin-Stämme. Somit waren insbesondere die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit bzgl. der Stämme aus Faeces (40,5 % GelE+) nur bedingt übereinstimmend mit denen anderer Autoren (Coque et al., 1995; Di Rosa et al., 2006), was vermutlich auf die stark heterogene Zusammensetzung der E. faecalis dieser Gruppe (stationär und ambulant behandelte Patienten, unterschiedliche Erkrankungen etc.) zurückzuführen war. Das cylA Gen wurde im Rahmen dieser Arbeit bei 40,9 % der E. faecalis aus Urin, 31,6 % bei Stämmen invasiver Herkunft und insgesamt bei 38,7 % der Isolate nachgewiesen. Ähnliche Ergebnisse erzielten Seno et al. (2005; 46,6 % cylA+ von 352 Urin-Isolaten) und Creti et al. (2004; 41,7 % cylA+ der Urin-Stämme, 23,0 % der Isolate aus invasiven Infektionen). Im Vergleich dazu wurde β-Hämolyse in nicht allen Stämmen, bei denen das cylA Gen nachgewiesen wurde, beobachtet, was wiederum in nicht detektierten Mutationen Diskussion 117 innerhalb des Cytolysin-Operons oder regulatorischen Effekten begründet sein kann. β-Hämolyse zeigte sich in der vorliegenden Arbeit in einer erhöhten Anzahl von Urin- (29,5 %) und Wund-Isolaten (30,8 %) im Vergleich zu Stämmen aus Faeces (16,2 %) und von invasiver Herkunft (10,5 %). Dies war vergleichbar mit Ergebnissen von Dworniczek et al. (2005), die bei 19,4 % von 36 E. faecalis Isolaten aus Faeces β-Hämolyse nachwiesen, sowie denen von Creti et al. (2004; 11,5 % der Isolate aus invasiven Infektionen und 25,0 % der UTI-Stämme β-hämolysierend). Coque et al. (1995), Seno et al. (2005) und Dworniczek et al. (2005) konnten allerdings β-Hämolyse lediglich bei 13,0 %, 17,8 % bzw. 15,0 % der Urin-Isolate detektieren. Das asa1 Gen wurde in der vorliegenden Untersuchung in allen Herkunftsgruppen in etwa ähnlicher Häufigkeit nachgewiesen, wobei 67,6 % der Faeces-Isolate und 77,3 % der Urin- Stämme diesen Virulenzfaktor besaßen. Coque et al. (1995) und Creti et al. (2004) beobachteten leicht geringere Inzidenzen bei E. faecalis Isolaten aus Urin von 67,0 % bzw. 66,7 %, Seno et al. (2005) detektierten das asa1 Gen hingegen in 82,7 % der Stämme. Die im Rahmen dieser Arbeit nachgewiesene Häufigkeit von ef0591 von insgesamt 18,7 % stimmte gut mit dem Ergebnis von Creti et al. (2004; 16,2 %) überein, allerdings ist diesem Faktor aufgrund seines relativ geringen Vorkommens vermutlich eine tendenziell eher untergeordnete Rolle als Virulenzfaktor beizumessen. Dies scheint ebenfalls für die untersuchten Virulenzeigenschaften Lipase- und DNase-Produktion sowie das asa373 Gen zuzutreffen, die bei keinem Stamm bzw. lediglich bei drei Isolaten sowie einem Isolat detektiert wurden. Auch wenn zum Teil differierende Inzidenzen eines Virulenzfaktors in den jeweiligen Herkunftsgruppen zu verzeichnen waren, konnten in der statistischen Analyse keine signifikanten Unterschiede ausgemacht werden. Somit konnte in dieser Arbeit kein Virulenzfaktor eindeutig in Verbindung mit einer bestimmten Herkunft bzw. einem bestimmten Entnahmeort gebracht werden, so dass auch keine Mutmaßungen in Bezug auf Korrelationen zu Infektionsgeschehen möglich waren. Es sind leichte Trends erkennbar, z.B. dass E. faecalis Stämme aus Urin bzw. Wunden bzgl. bestimmter untersuchter Merkmale (β-Hämolyse, cylA) höhere Inzidenzwerte im Vergleich zu Faeces-Isolaten und zu Stämmen invasiver Herkunft aufwiesen. Dies würde tendenziell Ergebnissen von Creti et al. (2004) sowie Seno et al. (2005) entsprechen, die auf eine Akkumulation von Virulenzgenen bei Isolaten des Herkunftsbereichs Urin hindeuten und somit eine allgemein erhöhte Virulenz dieser Stämme impliziert. Im Hinblick auf gewisse untersuchte Faktoren (esp, asa1, GelE) könnte ein vermehrtes Auftreten daher mit einer erhöhten Fähigkeit von Isolaten bestimmter Herkunftsbereiche zur Anheftung sowie Kolonisation entsprechender Gewebe und folgedessen auch Biofilm-Bildung an diesen verbunden sein. Diskussion 118 5.1.2 Biofilm-Bildung und Zusammenhang mit bestimmten Virulenzfaktoren Auch hinsichtlich der Biofilm-Bildung liegen mehrere Studien vor, die das Vorkommen dieser Fähigkeit bei E. faecalis Stämmen aus unterschiedlichsten Bereichen untersucht haben (siehe auch 1.3.2). Der zugrunde liegende molekulare Mechanismus hingegen ist bisher nur ansatzweise verstanden. In der vorliegenden Arbeit wurden die 150 untersuchten E. faecalis Isolate daher auf ihre Fähigkeit zur Biofilm-Bildung mittels eines Biofilm-Assays überprüft und diese Ergebnisse mit dem Vorkommen bestimmter Virulenzfaktoren in Korrelation gebracht. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass unter den 150 untersuchten E. faecalis Isolaten aus verschiedenen Bereichen insgesamt 48,0 % keine, 23,3 % mäßige und 28,7 % starke Biofilm-Bildner waren, wobei sich diese Verteilung zwischen den einzelnen Herkunftsgruppen deutlich unterschied (siehe Tab. 12). Bei den Stämmen aus Urin und invasiver Herkunft kamen zu jeweils ca. 30 % keine sowie mäßige BF-Produzenten vor und etwa zu 40 % starke BF-Bildner (insgesamt ca. 70 % BF-Bildner), worunter jeweils ca. 15 % sehr starke BF-Produzenten nachgewiesen werden konnten. Im Gegensatz dazu bildeten unter den Faeces- und Wund-Isolaten ca. 60 % der Stämme keinen BF sowie zu jeweils ca. 20 % einen mäßigen bzw. starken BF (insgesamt ca. 40 % BF-Bildner), wobei nur wenige sehr starke BF-Produzenten (ca. 5 %) zu verzeichnen waren. Die Ergebnisse bzgl. der Urin- Isolate (ca. 70 % BF-Bildner) stimmen relativ gut mit anderen Studien (Mohamed et al., 2004; Seno et al., 2005; siehe Tab. 19) überein und implizieren somit eine Bedeutung der BF-Bildung bei E. faecalis Stämmen dieser Herkunft. Das erhöhte Auftreten von BF-Bildnern bei Isolaten invasiver Herkunft könnte ebenfalls in eingeschränktem Maße mit dem Ergebnis von Mohamed et al. (2004) verglichen werden, da in dieser Studie Endokarditis-Isolate signifikant häufiger zur BF-Bildung befähigt waren als Nicht-Endokarditis-Stämme. Beispiele von in der Literatur vorhandenen Daten zum Vorkommen von BF-Bildung bei E. faecalis Stämmen (Tab. 19 sowie Tab. 1) ließen zum Teil auffällige Unterschiede zwischen einzelnen Studien erkennen. So waren in Studien von Baldassarri et al. (2001), Di Rosa et al. (2006) und Mohamed et al. (2004) ca. 80 %, 95,2 % bzw. 78,5 % aller E. faecalis Stämme, isoliert aus unterschiedlichstem Material (Infektionen, Umwelt, Normalflora) BF-Bildner, während bei Dworniczek et al. (2005) ca. zwei Drittel der Stämme keinen BF bildeten. Des Weiteren zeigten insbesondere Ergebnisse von Mohamed et al. (2004), dass Unterschiede bei Isolaten verschiedener Herkunft bestanden (siehe Tab. 19). Diese Differenzen sind zum einen sicherlich auf regional bedingte Verschiedenheiten der Stämme zurückzuführen, da diese Studien in Ländern weltweit durchgeführt wurden und somit auch epidemiologische Faktoren eine Rolle spielen könnten. Zum anderen wurde die Bestimmung der Menge an gebildetem Biofilm zum Teil mittels unterschiedlicher Methodik durchgeführt. Während Toledo-Arana et al. (2001) oder Mohamed et al. (2004) einen modifizierten Assay Diskussion 119 nach O´Toole & Kolter (1998) durchführten, bei dem das Kristallviolett vor der OD-Messung in Ethanol-Aceton gelöst wird, kam bei Baldassarri et al. (2001) oder Di Rosa et al. (2006) eine modifizierte Methode nach Christensen et al. (1985) zum Einsatz. Dies führt daher dazu, dass die Studien untereinander zwar tendenziell miteinander verglichen werden können, absolute Gegenüberstellungen jedoch schwierig sind. Bzgl. der Bestimmung der Biofilm-Bildung bei Enterokokken fehlen bisher ausführliche, systematische Vergleiche der verschiedenen Methoden, wie sie z.B. bei S. epidermidis (Deighton et al., 2001) oder S. aureus (Knoblauch et al., 2002) vorliegen. Tab. 19 Vorkommen von Biofilm-Bildung bei E. faecalis Stämmen aus verschiedenem Material Prozentuale Werte und Klassifizierung der Menge an gebildetem Biofilm (kein/wenig BF, mäßiger BF, starker BF) nach jeweils angegebener Literaturstelle, überwiegend gerundete Werte; *, Produktion von keinem und wenig BF; **, Produktion von wenig BF, restliche Stämme kein BF; ***, mäßige und starke BF-Bildner. Herkunft Anzahl Stämme kein/wenig BF mäßiger BF starker BF Referenz Land Endokarditiden 79 9%* 52% 39% Urin 22 22%* 77% 0% Faeces Hospitalisierte 15 47%* 47% 7% Faeces Gesunde 16 25%* 63% 13% insgesamt 163 21,5%* 56,4% 22,1% Mohamed et al. (2004) USA Urin 40 30,0%** 25,0% 2,5% Faeces 36 32,5%** 12,5% 2,5% insgesamt 108 37,0%** 20,3% 1,8% Dworniczek et al. (2005) Polen Infektionen (UTI u.a.) 55 96,3%*** Intestinalflora 12 100,0%*** insgesamt 83 95,2%*** Di Rosa et al. (2006) Italien insgesamt 73 20% 14% 66% Baldassarri et al. (2001) Italien Urin (UTI) 352 37,5% 44,3% 18,2% Seno et al. (2005) Japan In dieser Arbeit wurde die Methodik des Biofilm-Assays entsprechend einer von Baldassarri et al. (2001) modifizierten Durchführung nach Christensen et al. (1985) angewandt, welche bereits für andere Gram-positive Bakterien (z.B. S. epidermidis) optimiert wurde. Dieser Assay erwies sich im Rahmen der Etablierung zur Anwendung in der vorliegenden Arbeit als sehr zuverlässig, was u.a. durch die Mitführung von Referenzstämmen zur Kontrolle bei jedem Ansatz (siehe 3.11.6) gezeigt werden konnte. Somit ließ die Bestimmung der produzierten BF-Menge einen Vergleich der getesteten Isolate untereinander sowie die Erstellung von Korrelationen mit nachgewiesenen Virulenzfaktoren uneingeschränkt zu. Diskussion 120 Hierbei ergab sich, dass kein signifikanter Unterschied zwischen der Biofilm-Bildung (gemessen an dem zugehörigen Medianwert) bei GelE-- und GelE+-Isolaten (Abb. 7) sowie bei asa1-- und asa1+-Stämmen (Abb. 8) nachgewiesen werden konnte, wohingegen sich esp--Stämme signifikant von esp+-Isolaten hinsichtlich der Menge an gebildeten Biofilm unterschieden (Abb. 6). Somit scheint das Vorhandensein des Esp-Proteins einen bedeutsamen Faktor für die Fähigkeit von E. faecalis Stämmen zur Biofilm-Bildung darzustellen. Im Gegensatz dazu scheint allein die Anwesenheit des asa1 Gens oder die Produktion von Gelatinase keine erhöhte Biofilm-Bildungsfähigkeit zu bewirken. Eine Gesamtbetrachtung dieser Einzelergebnisse ließe in Übereinstimmung mit dem derzeitigen Stand der Forschung (siehe auch 1.3.4) daher den Schluss zu, dass insbesondere esp eine entscheidende Voraussetzung für diese Fähigkeit bei E. faecalis ist, da dieses Zellwandprotein v.a. den ersten Schritt der Biofilm-Bildung, die primäre Anheftung an ein Substrat, fördert (Toledo-Arana et al., 2001). Ohne diesen initialen Vorgang kann die Entstehung eines Biofilms nicht vonstatten gehen. Aggregationssubstanzen wie dem Asa1- Protein fördern währdend des Vorgangs der Biofilm-Bildung hingegen die Entstehung von Mikrokolonien durch die interzelluläre Interaktion (Galli & Wirth, 1991; Budznik & Schneewind, 2006). Bei der Untersuchung der E. faecalis Stämme wurden aber auch starke und sehr starke BF- Bildner gefunden, die kein esp Gen besaßen (siehe Abb. 6). Dies deutete zum einen darauf hin, dass die Anwesenheit von esp nicht als alleiniger Faktor zur Biofilm-Bildung führt, zum anderen müssen bei manchen Stämmen andere Determinanten vorhanden sein, insbesondere solche, die Einfluss auf die primäre Anheftung nehmen. Dies bestätigte somit Ergebnisse verschiedener Studien, v.a. Kristich et al. (2004), Mohamed et al. (2004) oder Mohamed & Murray (2005), dass bei E. faecalis Mechanismen einer esp-unabhängigen Biofilm-Bildung existieren müssen. Daher wurde weitergehend die Menge an gebildetem Biofilm der untersuchten 150 E. faecalis Isolate in Korrelation von jeweils zwei dieser Faktoren gebracht. Hier zeigte sich kein signifikanter Unterschied bzgl. der Menge an produziertem Biofilm jeweils zwischen den Gruppen esp-/GelE-, esp-/GelE+, esp+/GelE- und esp+/GelE+ (Abb. 9), was konform war zu Daten von Di Rosa et al. (2006). Die Autoren konnten ebenfalls keinen statistischen Zusammenhang zwischen der Anwesenheit von esp und Gelatinase mit der Höhe der Biofilm-Bildung erkennen. In der vorliegenden Arbeit wurden sogar in der Gruppe esp-/GelE- mäßige und starke BF-Bildner detektiert, so dass dies den Schluss zuließ, dass weder das esp Gen noch die Gelatinase-Expression bei bestimmten Stämmen zur Produktion eines Biofilms erforderlich zu sein scheint. Diskussion 121 Weiterhin wurde in der vorliegenden Arbeit eine Korrelation der beiden Faktoren esp und asa1 mit der Biofilm-Bildung bei E. faecalis erstellt. Hierzu ergab die statistische Analyse signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen esp+/asa1+ und esp-/asa1- sowie esp+/asa1- und esp-/asa1- bzgl. der Menge an gebildetem Biofilm (Abb. 10). Die beiden Gruppen der esp+ Stämme (esp+/asa1+ und esp+/asa1-) wiesen außerdem die höchsten ermittelten Medianwerte im Vergleich zu den zwei Gruppen der esp- Isolate (esp-/asa1+ und esp-/asa1-) auf. Somit scheint die Anwesenheit von esp und asa1 die Fähigkeit zur Biofilm-Bildung unter den hier getesteten Bedingungen deutlich zu erhöhen. Aber auch bei alleiniger Präsenz von esp ist dieser Zustand im Vergleich zu Stämmen, denen beide betrachtete Faktoren fehlen, zu erkennen. Dies steht wiederum im Einklang mit den o.g. Ausführungen zum Einfluss des Esp-Proteins. Dennoch wurden auch hier in der Gruppe esp-/asa1- mäßige und starke BF- Bildner ausgemacht, was erneut die Hypothese des Vorhandenseins mehrerer verschiedener Mechanismen zur Biofilm-Bildung bei dieser Spezies untermauerte. 5.2 E. faecium isoliert aus verschiedenem klinischen Material Im Rahmen dieser Arbeit wurden 78 E. faecium Stämme verschiedener Herkunft auf das Vorkommen von Biofilm-Bildung und Virulenzfaktoren untersucht. Das espfm Gen wurde bei insgesamt 43,6 % aller getesteten Stämme nachgewiesen, wobei sich Unterschiede bzgl. der Herkunft zeigten (33,3 % bei Faeces-, 90,0 % bei Urin-, 66,7 % bei Wund-Isolaten oder 42,9 % und 0,0 % bei Isolaten invasiver Herkunft bzw. Umwelt). Sehr ähnliche Inzidenzen konnten ebenfalls von anderen Forschungsgruppen nachgewiesen werden. Dworniczek et al. (2005) detektierten das espfm Gen in insgesamt 48,6 % der untersuchten Stämme, wobei 63,6 % der Urin- und 27,8 % der Faeces-Isolate esp+fm waren. Werner et al. (2008) wiesen das espfm Gen zu 66,7 % bei E. faecium Stämmen nach, die in deutschen Krankenhäusern auftraten. In Untersuchungen von Rice et al. (2003) waren insgesamt 33,4 % der E. faecium Isolate esp+fm, wobei das Gen überwiegend in klinischen Stämmen auftrat, die nicht aus Faeces isoliert wurden (84 %). Harrington et al. (2004) wiesen dieses Gen bei 51,7 % und Raad et al. (2005) bei 53,0 % der untersuchten E. faecium Stämme nach, die eine Bacteriämie hervorgerufen hatten. Auch Eaton & Gasson (2002) sowie Woodford et al. (2001) erkannten ein erhöhtes Vorkommen von espfm bei klinischen Isolaten (68,0 % bzw. 63,0 %), insbesondere bei Stämmen aus Urin (80,0 % bzw. 85,2 %). Das hyl Gen konnte insgesamt bei 42,3 % der E. faecium detektiert werden, wobei sich auch hier Unterschiede der Inzidenzen bei Faeces-Stämmen (14,8 %) und Isolaten aus Urin, Wunden und invasiver Herkunft (80,0 %, 100,0 % bzw. 66,7 %) zeigten. Auch bzgl. dieses Faktors wurden übereinstimmende Inzidenzen in Untersuchungen anderer Arbeitsgruppen festgestellt. In einer Studie von Werner et al. (2008) wurde das hyl Gen insgesamt bei 39,2 % von 51 untersuchten E. faecium Isolaten nachgewiesen, die in Krankenhäusern in Diskussion 122 Deutschland auftraten. Rice et al. (2003) detektierten das hyl Gen in 17,7 % aller 577 getesteten Isolate, jedoch dominierte der Faktor in klinischen Stämmen, die nicht aus Faeces kultiviert wurden (91 %). In Übereinstimmung mit den Ergebnissen anderer Forschungsgruppen wurde auch in der vorliegenden Arbeit das espfm Gen sowie das hyl Gen mit einer erhöhten Häufigkeit in Urin- und Wund-Isolaten sowie in E. faecium Stämmen invasiver Herkunft im Vergleich zu Faeces- und Umwelt-Isolaten detektiert, was die Bedeutung von Espfm und Hyaluronidase als Virulenzfaktoren bei dieser Spezies hervorhebt. Insbesondere das hohe Vorkommen von espfm in Urin- und Wund-Isolaten (90,0 % und 66,7 %), vergleichbar mit Daten von Eaton & Gasson (2002; 80,0 % und 80,0 %), könnte mit der Fähigkeit der E. faecium Stämme zur BF- Bildung assoziiert sein. Mehrere Studien aus unterschiedlichen Ländern konnten die Fähigkeit zur BF-Bildung auch in dieser Spezies nachweisen (siehe 1.3.2), wobei die Häufigkeiten auch hier stark variierten (0,0 % bis 48,0 %). Dies kann in einer regional bedingten Verschiedenheit der Stämme begründet sein, zum Teil möglicherweise auch in den bereits unter 5.1 beschriebenen Einflussfaktoren. In der vorliegenden Arbeit wurde lediglich ein Isolat (1,3 %) als schwacher BF-Bildner charakterisiert, welches auch Träger des espfm und hyl Gens war (siehe 4.2). Daher kann neben der generellen Erkenntnis, dass eine geringere Anzahl an E. faecium Stämmen im Vergleich zu E. faecalis Isolaten zur BF- Bildung befähigt sind, auch die Aussage getroffen werden, dass die Fähigkeit zur BF-Bildung bei E. faecium Stämmen in der hier untersuchten Region unter den beschriebenen Bedingungen kaum nachgewiesen werden konnte. Dennoch scheinen einige E. faecium Isolate diese Eigenschaft zu besitzen, die daran beteiligten Faktoren sind jedoch weitgehend unbekannt. Lediglich bzgl. des Espfm-Proteins liegen Untersuchungen vor (Van Wamel et al., 2007; Heikens et al., 2007), die den Einfluss dieses Faktors aufgrund der Erhöhung der Fähigkeit zur primären Anheftung an abiotische Oberflächen (Polystyrol) auf das BF- Bildungsvermögen dieser Spezies belegen. Van Wamel et al. (2007) konnten auch zeigen, dass die Expression von espfm stark von den Wachstumsbedingungen (Temperatur, Sauerstoffzufuhr) der Stämme abhing. Somit bedarf es zukünftig weiterführender Forschung, ob und welche anderen Virulenzfaktoren und Umweltbedingungen die BF-Bildung bei dieser Spezies beeinflussen. Diskussion 123 5.3 E. faecalis isoliert von Patientinnen mit dem Krankheitsbild Bakterielle Vaginose Im Gegensatz zu einer relativ guten Datenbasis, die bzgl. des Vorkommens von Virulenzfaktoren und Biofilm-Bildung bei E. faecalis und E. faecium aus verschiedenen klinischen Bereichen (Infektionen, Faeces hospitalisierter Patienten etc.) in der Literatur vorliegt, sind diese Untersuchungen hinsichtlich Enterokokken aus Vaginalabstrichen kaum oder nur vereinzelt vorhanden (z.B. Creti et al., 2004; diese Studie enthielt zwei E. faecalis Isolate aus Vaginalinfektionen). Interessant ist hierbei der klinische Aspekt, dass scheinbar die Biofilm-Bildung bei der Bakteriellen Vaginose (BV) eine Rolle zu spielen scheint (Swidsinski et al., 2005), die Pathogenese dieser Erkrankung jedoch noch weitestgehend unklar ist. Daher wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit u.a. ein Schwerpunkt auf den Nachweis verschiedener Virulenzfaktoren bei Enterokokken der Vaginalflora gelegt, die von Patientinnen mit Bakterieller Vaginose isoliert wurden. 5.3.1 Phänotypischer und genotypischer Nachweis von Virulenzfaktoren Mittels statistischem Vergleich der Ergebnisse zum Nachweis von Virulenzfaktoren bei insgesamt 40 E. faecalis Stämmen, die von Patientinnen mit Bakterieller Vaginose isoliert wurden, mit 40 Isolaten von Frauen mit negativem Befund bzgl. BV konnten hinsichtlich aller getesteten Merkmale, mit Ausnahme der H2O2-Produktion, keine signifikanten Unterschiede festgestellt werden (vgl. Tab. 13). Letztere Differenz schien in der Betrachtung der absoluten Zahlen hingegen als eher weniger von Bedeutung, da die Produktion von H2O2 bei allen Isolaten aus BV-positiven Vaginalabstrichen detektiert wurde, bei Stämmen von Patientinnen ohne BV hingegen zu 85 %. Somit konnte in dieser Studie keiner der untersuchten Virulenzfaktoren eindeutig bei E. faecalis Stämmen, die mit dem Krankheitsbild der Bakteriellen Vaginose assoziiert waren, bestimmt werden. Ein erkennbarer, wenn auch nicht signifikanter Unterschied ließ sich jedoch in der Gelatinase-Produktion feststellen. In Bezug auf diese Eigenschaft wurden 57,5 % positive Isolate bei Vaginalabstrichen von Frauen mit BV nachgewiesen, hingegen bei Patientinnen ohne BV lediglich 37,5 %. Hierzu müssten weitere, spezifische Untersuchungen zur Rolle dieses Virulenzfaktors sowie beteiligter E. faecalis Stämme bzgl. dieses Krankheitsgeschehens durchgeführt werden. Des Weiteren konnte bei keinem Isolat eine hemmende Wirkung gegenüber neun Lactobacillus spp. (Wildtypstämme aus Vaginalabstrichen) sowie gegenüber L. acidophilus (DSM 20079) oder L. crispatus (DSM 20584) mittels Bacteriocin-Tests festgestellt werden. Eine phänotypische Charakterisierung dieser Wildtypstämme ergab, dass alle Isolate Gram- positive, homofermentative Stäbchen waren, die DL-Laktat produzierten und H2O2 bildeten. Von Kelly et al. (2003) wurde ein möglicher Einfluss von Enterokokken auf die Vaginalflora und somit eine potenzielle Bedeutung für die Pathogenese der BV für möglich gehalten. Die Diskussion 124 Autoren konnten die Beeinflussung des Scheidenmilieus auf die von den Enterokokken produzierten Bacteriocine oder bacteriocin-ähnlichen Substanzen zurückführen, die antagonistisch auf das Wachstum vaginaler Lactobacillus spp. wirken und damit zur Etablierung einer BV-assoziierten Mikroflora beitragen. Hierzu müsste diese Hemmung insbesondere auf in der Vaginalflora vorherrschende, Wasserstoffperoxid-produzierende Lactobacillus spp. wirken, um das mikrobiologische Gleichgewicht des Scheidenmilieus zu beeinflussen. Die in dieser Arbeit durchgeführten Bacteriocin-Tests zum Nachweis einer hemmenden Wirkung der E. faecalis Stämme gegenüber einer geringen Auswahl an H2O2- produzierenden Wildtypisolaten konnten diese von Kelly et al. (2003) aufgestellte Annahme zunächst nicht unterstützen. Überdies ist bei der Interpretation der gewonnenen Ergebnisse zu beachten, dass die hier verwendete Vergleichsgruppe zwar aus E. faecalis Isolaten zusammengestellt wurde, die aus Vaginalabstrichen von Patientinnen mit negativem Befund bzgl. BV stammten, diese Frauen jedoch nicht vollends symptomatisch unauffällig und beschwerdefrei waren. Ob und wenn ja an welchen anderen, nicht betrachteten Erkrankungen der Vaginalflora diese Frauen litten, war nicht bekannt und aus datenschutzrechtlichen Gründen nicht zu erfassen gewesen. Deshalb wurde diese Vergleichsgruppe gemäß der zusätzlichen mikrobiologischen Befunde der Vaginalabstriche (siehe Tab. 33 im Anhang) zumindest so ausgewählt, dass keine sonstigen Erregernachweise (Mycoplasmen / Ureaplasmen, Pilze etc.) vorlagen. Dennoch ließ die Erfassung der Döderlein-Flora darauf schließen, dass eine mehr oder weniger starke Störung des Scheidenmilieus bei diesen Frauen bestand. Bzgl. einer absoluten Aussage des Vorkommens von Virulenzfaktoren bei Enterokokken assoziiert mit BV wäre eine Kontrollgruppe mit Isolaten von gesunden Frauen besser geeignet, die Erstellung dieser Stammsammlung würde allerdings einen mit medizinischen Studien verbundenen, erheblichen Aufwand darstellen. Nichtsdestotrotz können die in dieser Arbeit erstmals bei einer größeren Anzahl von Isolaten erhobenen Daten, v.a. die hinsichtlich des Vorkommens bestimmter Virulenzfaktoren und des Auftretens von Biofilm-Bildung gewonnenen Ergebnisse (siehe 5.4), als Ausgangspunkt für Folgestudien dienen. 5.3.2 Biofilm-Bildung und Zusammenhang mit bestimmten Virulenzfaktoren Der Vergleich zum Vorkommen von Biofilm-Bildung bei den untersuchten 80 E. faecalis Isolaten aus Vaginalabstrichen ergab, dass ebenfalls kein signifikanter Unterschied zwischen der Anzahl der Stämme von Patientinnen mit BV und den Isolaten der Vergleichsgruppe in den einzelnen BF-Kategorien (kein, mäßiger, starker BF-Bildner) bestand (siehe Tab. 14). Insofern konnte auch in Bezug auf dieses Merkmal keine Aussage zum Unterschied von E. faecalis Isolaten von Frauen mit BV und Stämmen von Patientinnen, deren Befund negativ bzgl. BV war, getroffen werden. Dennoch bestanden Auffälligkeiten bzgl. der Diskussion 125 Gesamtinzidenzen beim Vergleich dieser Daten mit den Ergebnissen der Stämme aus anderen klinischen Bereichen (siehe Tab. 15 und 5.4). Die statistischen Analysen zur Korrelation bestimmter Virulenzfaktoren mit der Menge an gebildetem Biofilm bei den E. faecalis Isolaten aus Vaginalabstrichen zeigten, dass ein signifikanter Unterschied zwischen esp- und esp+ Stämmen bestand (siehe Abb. 11), wohingegen keine signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen GelE- und GelE+ (siehe Abb. 12) sowie asa1- und asa1+ (siehe Abb. 13) zu verzeichnen waren. Die Medianwerte der Gruppen GelE- und asa1- wiesen sogar jeweils einen höheren Wert auf als die der Gruppen, bei denen der Virulenzfaktor detektiert wurde. Dieses Ergebnis ist somit konform mit den erzielten Resultaten hinsichtlich der E. faecalis Stämme aus verschiedenem anderen Material (siehe 4.1.3) und untermauert die hierzu dargestellten Ausführungen (siehe 5.1.2). Bei Vergleich der Stämme in Bezug zum Vorkommen des esp Gens und / oder der Gelatinase-Produktion (siehe Abb. 14) ergab sich ein signifikanter Unterschied zwischen den Gruppen esp-/GelE+ und esp+/GelE- sowie der Gruppen esp-/GelE+ und esp+/GelE+, wobei die beiden Gruppen der esp+ Isolate die höchsten Medianwerte im Verhältnis zu den beiden esp- Gruppen aufwiesen. Außerdem ergab die statistische Analyse signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen esp+/asa1- und esp-/asa1+ sowie esp+/asa1- und esp-/asa1-, wobei ebenfalls wiederum die zwei Gruppen der esp+ Isolate die höchsten Medianwerte zeigten (siehe Abb. 15). Die Gruppen, bei denen keine der beiden Determinanten detektiert wurde (esp-/GelE- und esp-/asa1-), wiesen jeweils stets die geringsten Medianwerte auf, was für einen gewissen Einfluss der Virulenzfaktoren sprach. Andererseits konnten aber wiederum auch in diesen Gruppen Isolate gefunden werden, die starke oder sogar sehr starke BF- Produzenten waren. Gleichfalls gab es aber auch Stämme, bei denen beide Faktoren detektiert wurden, die keine BF-Bildung unter den getesteten Bedingungen zeigten. Anhand dieser wie auch der Auswertung der Korrelationen bei den E. faecalis Stämmen aus verschiedenen anderen Bereichen (siehe Abb. 9 und Abb. 10 sowie 5.1.2) wurde unmissverständlich deutlich, dass das Vorhandensein der untersuchten Faktoren, insbesondere des Esp-Proteins, die Wahrscheinlichkeit einer verstärkten Biofilm-Bildung bei E. faecalis Isolaten erhöhte. Jedoch scheinen auch andere als die betrachteten Determinanten zur Ausprägung eines Biofilms beizutragen, so dass unterschiedliche Mechanismen zur Biofilm-Bildung bei E. faecalis existieren müssen. Diskussion 126 5.4 Vergleich der E. faecalis Stämme aus Vaginalabstrichen mit Isolaten anderer klinischer Herkunft Die Gegenüberstellung der Nachweise von Virulenzfaktoren bei den 80 E. faecalis Isolaten aus Vaginalabstrichen mit denen aus anderen Herkunftsbereichen (siehe Abb. 16) ließ keine sichtbaren Unterschiede erkennen. Somit konnte kein bestimmter Virulenzfaktor mit einem Herkunftsbereich in Zusammenhang gebracht werden. Im Umkehrschluss bedeutet dies aber auch, dass die aus Vaginalabstrichen isolierten E. faecalis Stämme im Durchschnitt eine gleich hohe Anzahl an Virulenzfaktoren aufwiesen wie Isolate aus anderen klinischen Bereichen, was ein entsprechend hohes Virulenzpotential implizierte. Da es sich bei den Isolaten um Stämme aus auf unterschiedlichste Weise und in unterschiedlichstem Maße gestörten Vaginalfloren handelte, wäre ein Vergleich bzgl. des Vorkommens von Virulenzfaktoren mit Stämmen eines gesunden Scheidenmilieus interessant. Bei E. faecalis Isolaten der vaginalen Normalflora könnte der Nachweis einer geringeren Anzahl an Virulenzfaktoren vermutet werden, zumal einige Studien dieses Ergebnis zumindest für die humane Intestinalflora gesunder Probanden belegen (Coque et al., 1995; Mohamed et al., 2004; Di Rosa et al., 2006). Auffällig war weiterhin, dass die Gruppe der Vaginalabstrich-Isolate im Vergleich mit den untersuchten E. faecalis Stämmen aus anderem klinischen Material den höchsten Median der OD595-Werte zur Bestimmung der Menge an gebildetem Biofilm zeigte (siehe Abb. 17). Die statistische Auswertung ergab diesbezüglich außerdem einen signifikanten Unterschied zwischen den Stämmen aus Faeces und Vaginalabstrichen sowie den Isolaten aus Wunden und Vaginalabstrichen. Damit wiesen die Stämme aus Vaginalabstrichen mit solchen E. faecalis Isolaten aus Urin und invasiver Herkunft Ähnlichkeit bzgl. der Fähigkeit zur BF- Bildung auf. Auch die Betrachtung der Verteilung der Stämme hinsichtlich der BF-Kategorien (kein, mäßiger, starker BF-Bildner) zeigte, dass die Häufigkeiten bei den Vaginalabstrich- Isolaten eher vergleichbar waren mit denen von Stämmen aus Urin und invasiver Herkunft als mit denen von Faeces- oder Wund-Isolaten (siehe Tab. 15). Auch aufgrund des Ergebnisses, dass die E. faecalis Isolate aus Vaginalabstrichen eine ähnlich hohe Anzahl an Virulenzfaktoren wie die Stämme aus anderem klinischen Material aufwiesen, könnte dies zum einen auf eine Herkunft und Besiedlung der derzeitig gestörten Vaginalflora mit Enterokokken aus anatomisch angrenzenden Körperbereichen (Harntrakt bei gleichzeitiger Harnwegsinfektion oder Anus der Frau) hinweisen. Um diesen Zusammenhang und den vermeintlichen Übertragungsweg nachzuweisen, könnten Typisierungen der Stämme aus den besagten Bereichen zur Feststellung klonaler Verwandtschaftsverhältnisse Aufschluss geben. Zum anderen schien die Fähigkeit zur Biofilm-Bildung bei den untersuchten Isolaten der Vaginalflora verstärkt verbreitet zu sein, was auf eine Bedeutung dieses Merkmals für Stämme aus diesem Körperbereich hinwies. Denkbar wäre ein daraus entstehender Diskussion 127 Standortvorteil, möglicherweise aufgrund erhöhter Adhäsionseigenschaften oder symbiontischer Beziehungen zu anderen Stämmen der Vaginalflora. Abschließend ist unbedingt in Betracht zu ziehen, dass die gesunde wie auch die gestörte Vaginalflora ein sehr komplexes Ökosystem darstellt, bestehend aus mehreren Bakterienstämmen, zum Teil aus Vertretern verschiedener Gattungen (Eschenbach et al., 1989; Tamrakar et al., 2007). Insofern gestalten sich Analysen zum Verständnis der auftretenden Wechselwirkungen in diesem System stets schwierig, dennoch können wie in der vorliegenden Arbeit durchgeführte Untersuchungen einzelner Isolate Anhaltspunkte oder Hinweise auf mögliche Zusammenhänge bieten. 5.5 Charakterisierung von E. faecalis Biofilm-Mutantenstämmen Die vorherigen Untersuchungsergebnisse dieser Arbeit zeigten, dass bei E. faecalis mehrere Faktoren an der Biofilm-Bildung beteiligt zu sein scheinen und daher verschiedene molekulare Mechanismen existieren müssen. Jüngste Forschungen ließen die Komplexität dieses Vorgangs bei Enterokokken erst erkennen und somit vermuten, dass im E. faecalis Genom weitere, noch nicht identifizierte Determinanten enthalten sein müssen. Ein weiterer Teil der vorliegenden Arbeit konzentrierte sich deshalb auf die Herstellung und Charakterisierung von E. faecalis Biofilm-Spontanmutanten, um weitergehende Erkenntnisse über den Vorgang der Biofilm-Bildung zu erhalten und eventuell neue, potenzielle Einflussfaktoren bei E. faecalis zu identifizieren. Mehrere Forschergruppen (z.B. Hufnagel et al., 2004) wandten bereits konventionelle Methoden zur Mutagenese mit Hilfe von Transposons (Tn916 oder Tn917) an, um neue Faktoren der Biofilm-Bildung bei E. faecalis zu identifizieren. Diese Transposon-basierten Verfahren können jedoch Nachteile bei Analysen aufweisen, die das gesamte Genom betreffen. Diese zeigen sich beispielsweise in stark präferierten Insertionsstellen und verhindern somit ein zufälliges Ereignis einer Mutation im Genom (Scott et al., 1994; Garsin et al., 2004). Daher erfolgte in der vorliegenden Arbeit die Herstellung von Spontanmutanten mittels einer selektiven Langzeitkultivierung, was auf eine höhere Wahrscheinlichkeit einer zufällig auftretenden Mutation in noch uncharakterisierten Genen oder Genloci hoffen ließ. Als überaus wichtig erwies sich die anfängliche Typisierung der isolierten BF-Mutanten mit unterschiedlichen Methoden. Die Anwendung von rep- oder RAPD-PCR-Verfahren kann in einigen Fällen in Abhängigkeit von der zu untersuchenden Spezies, aber auch von einer Vielzahl methodischer Faktoren (Tyler et al., 1997; Malathum et al., 1998) anderen Typisierungsmethoden deutlich überlegen sein, insbesondere hinsichtlich der Einfachheit der Durchführbarkeit, Zeit- und Kostenintensität sowie Diskriminierungsfähigkeit (Olive & Bean, 1999). Nachteile können jedoch intra- sowie interlaboratorische Vergleichbarkeit und Reproduzierbarkeit der Anwendungen darstellen, da die Interpretation v.a. schwacher oder Diskussion 128 inkonsistent auftretender Banden problematisch sein kann (Tyler et al., 1997). Dies konnte Malathum et al. (1998) bei wenigen E. faecalis Isolaten ebenfalls für die in dieser Arbeit durchgeführte BOXA2R-PCR beobachten und verwies in solchen Fällen auf die Anwendung einer PFGE zur Verifizierung der mittels rep-PCR erhaltenen Resultate. Auch andere Studien zeigten für Enterokokken eine gute Korrelation von rep-PCR Ergebnissen mit denen der PFGE (Barbier et al., 1996), dennoch generell mit einer leicht geringeren Diskriminierungs- fähigkeit, so dass geringe Unterschiede / Mutationen zuverlässiger mittels einer PFGE detektiert werden können (Liu & Wu, 1997). Die Durchführung dieser beiden Methoden im Rahmen der vorliegenden Arbeit ergab schließlich, dass drei stabile E. faecalis Spontanmutanten hergestellt werden konnten, die darauf folgend mittels phänotypischer und molekularbiologischer Verfahren charakterisiert wurden. Der Vergleich von Wildtyp- und Mutantenstämmen bzgl. der Verwertung verschiedener Kohlenhydratsubstrate und des Vorhandenseins von Antibiotikaresistenzen bzw. Resistenzgenen (siehe 4.5.2.3) zeigte keine Unterschiede, ebenso wie der Nachweis bestimmter Virulenzfaktorengene und weiterer phänotypischer Virulenzeigenschaften mit Ausnahme der Verklumpung hinsichtlich der Stämme 1.3 und 1.3.7 (siehe 4.5.2.4 und 5.5.1). Somit konnte in Bezug auf diese Merkmale geschlossen werden, dass die vorhandenen Mutationen keine Beeinflussung dieser Eigenschaften der Isolate bewirkten. 5.5.1 Untersuchung der E. faecalis Stämme 1.3 und 1.3.7 Die Stämme 1.3 (kein BF-Bildner) und 1.3.7 (starker BF-Bildner) zeigten nach Kultivierung ÜN in TSBG keine sichtbaren Unterschiede der Wachstumscharakteristik, da bei beiden Stämmen eine gleichmäßige Trübung der Bouillon beobachtet werden konnte (siehe Abb. 20). Dies ließ annehmen, dass im Gegensatz zu den anderen zwei untersuchten Mutantenstämmen die erhöhte BF-Bildungsfähigkeit des Isolats 1.3.7 nicht oder nur in sehr geringem Maße auf veränderte Mechanismen der (Auto-) Aggregation unter diesen Bedingungen zurückzuführen war. Die Ergebnisse des Tests auf primäre Anheftung (4.5.2.5) zeigten hingegen, dass der Stamm 1.3.7 eine signifikant erhöhte Fähigkeit zur Adhärenz an abiotische Oberflächen (PS) im Vergleich zum Wildtyp aufwies. Allerdings schien diese Eigenschaft nicht mit einer stärkeren Hydrophobizität der Zelloberfläche der Mutante einherzugehen (siehe 4.5.2.6). Eine erhöhte Zelloberflächen-Hydrophobizität resultiert in höheren Anziehungskräften, in erhöhtem Maße zur Adhäsion (Van Loosdrecht et al., 1987; Marín et al., 1997) und kann somit zu einer erhöhten Fähigkeit der Biofilm-Bildung führen. Daraus kann geschlossen werden, dass Faktoren bei der hier stattgefundenen Mutation betroffen waren, die die Hydrophobizität und damit die Netto-Ladung der Oberfläche nicht grundlegend beeinflusst haben. Diskussion 129 Im CLSM stellte sich der vom Stamm 1.3.7 produzierte Biofilm als sehr dicht und kompakt mit lediglich kleineren, zellfreien Zwischenräumen dar (siehe Abb. 21), woraus geschlossen werden könnte, dass eine erhöhte Fähigkeit zur Zell-Zell-Interaktion bei der Mutante vorliegen könnte. Diese interzellulären Verbindungen schienen jedoch von geringer Stärke zu sein, da insbesondere bei der Durchführung der REM (siehe 4.5.2.2) deutlich wurde, dass der Biofilm im Vergleich zu den Biofilmen der anderen zwei untersuchten Stämme sehr viel leichter beschädigt werden konnte (Waschschritte etc.). Die massenspektrometrischen Analysen der Isolate 1.3 und 1.3.7 ergaben, dass bei beiden Stämmen und in beiden untersuchten Banden die Proteine des ebp Locus (EbpA, EbpB, EbpC; siehe auch 1.3.4.4) exprimiert wurden (siehe Tab. 17). Dieser Locus codiert für Pili- Proteine bei E. faecalis, wobei die großen und kleinen Pili-Untereinheiten zu einem High- Molecular-Weight (HMW)-Komplex polymerisiert werden (Nallapareddy et al., 2006; siehe auch 1.3.4.4). Dieser kovalent verknüpfte Komplex war somit im hochmolekularen Bereich des SDS-Gels (ca. 300 kDa, siehe Abb. 31, Bande 1.2) sichtbar. Ebenfalls sehr deutlich identifiziert wurde bei beiden Stämmen ein putatives Zellwand-assoziiertes Protein (EF2505, 182,7 kDa). Dieses war ebenso in der Bande der Masse von ca. 300 kDa zu finden, was eventuell durch Dimer-Bildung des Proteins zu erklären war. Die Identifizierung des Surface Exclusion Proteins PrgA (Masse des reifen Proteins: 98,1 kDa) der Aggregationssubstanz PrgB in Banden dieses Massenbereichs war vermutlich auf den hohen Gehalt an kleinen Aminosäureresten (Glycin, Prolin, Alanin) zurückzuführen, welcher eine langsame Migration im SDS-Gel bewirken (Kao et al., 1991). Die Surface Exclusion Proteine PrgA und Sea1 spielen in der Bildung von Aggregaten keine direkte Rolle, sie verhindern ein Self-Mating der Donorzellen und werden konstitutiv exprimiert (Dunny et al., 1985; Galli et al., 1992). Das Vorkommen von PrgA und Sea1 ließ jedoch auf die Anwesenheit der Sexpheromon-Plasmide pCF10 (ca. 67,6 kb; Kao et al., 1991) und / oder pAD1 (ca. 59,3 kb; Tomich et al., 1979) schließen, was in Übereinstimmung mit den Resultaten der Plasmid-Isolierung stände (siehe Abb. 30, Bahn 1 und 2). Der Gehalt von zwei bis drei Sexpheromon-Plasmiden ist bei E. faecalis sehr verbreitet (Wirth, 1994). In Bezug auf die Identifizierung mittels der massenspektrometrischen Analyse der von Sexpheromon-Plasmiden codierten Aggregationssubstanzen Asa1, Asp1 (Plasmid pPD1) und PrgB (Asc10) sowie der Surface Exclusion Proteine Sea1, Sep1 und PrgA (Galli & Wirth, 1991; Galli et al., 1992; Hirt et al., 1996; siehe auch 1.2.2) kann es wegen der hohen Sequenzhomologien jedoch beim Datenbankabgleich zu mehrfachen Übereinstimmungen kommen, insbesondere wenn nur wenige für das jeweilige Protein spezifische Peptide gefunden wurden. Daher sind bei der Auswertung dieser Daten nicht nur der Gesamt-Score, sondern auch einzelne Peptid-Scores eines identifizierten Proteins zu beachten. Diskussion 130 Somit bestand ein Unterschied zwischen Wildtyp- und Mutantenstamm scheinbar lediglich in der Expressionsstärke der detektierten Proteine. Die Untersuchungen der vorliegenden Arbeit ließen bis hierher vermuten, dass die Regulation des ebp Locus von der Mutation beim Stamm 1.3.7 betroffen sein könnte. Das könnte andeuten, dass der Mutantenstamm im Vergleich zum Wildtyp in erhöhtem Maße Ebp-Pili an seiner Oberfläche bildete. In diesem Zusammenhang wäre vermutlich insbesondere der kürzlich beschriebene positive Regulator von ebpABC (Bourgogne et al., 2007) von Bedeutung. Die regulatorischen Wege sowie die Signale, die ebpR beeinflussen oder die von ebpR beeinflusst werden, sind jedoch noch vollkommen unklar. Interessant war auch die Identifizierung des putativen Zellwandproteins EF2505, dessen Expression ebenfalls betroffen sein könnte. Dieses bisher uncharakterisierte Protein könnte entweder direkten Einfluss auf die Biofilm-Bildung des Stamms genommen haben oder eventuell sogar in Verbindung mit der Funktion des ebpR bzw. des ebp Locus stehen. Denkbar als Ursache der erhöhten BF-Bildungsfähigkeit des E. faecalis Stamms 1.3.7 wäre auch die (zusätzliche) Beeinflussung der Regulation einer Aggregationssubstanz, worauf die starke Verklumpungsreaktion des Isolats nach Induzieren mit Pheromonen hingewiesen hat (siehe 4.5.2.4). Der Wildtyp zeigte die Verklumpung nicht oder nur in sehr geringem, nicht wahrnehmbaren Maße. Der Sexpheromon-Plasmidtransfer bei E. faecalis ist ein hoch kompliziertes System, wobei viele Faktoren an dessen Kontrolle involviert sind. Das Phänomen der Verklumpung beruht darauf, dass Donorzellen von Rezipienten ins Medium entlassene Sexpheromone wahrnehmen und als Reaktion darauf die plasmid-codierte, Zelloberflächen-assoziierte Aggregationssubstanz synthetisieren. Dieses Adhäsin vermittelt den Kontakt zur Rezipientenzelle zum konjugativen Plasmidtransfer. Nach der Übertragung wird die Synthese des Adhäsins gestoppt, und die Zellaggregate zwischen Donor und Rezipient lösen sich auf (Wirth, 1994). Eine Verklumpung zeigt sich nicht, wenn beide Stämme einzeln inkubiert werden, die Zellen sind dann gleichmäßig im Medium verteilt. Der Verklumpungs-Assay (siehe 3.11.3) stellt den phänotypischen Nachweis von Aggregationssubstanz dar, allerdings ist die Erkennung insbesondere sehr kleiner Mating- Aggregate nicht immer einfach, so dass der molekularbiologische Nachweis der AS- codierenden Gene meist zuverlässiger ist (Waar et al., 2002a). Diese Schlussfolgerungen aus den Ergebnissen, insbesondere der massen- spektrometrischen Analyse, sind jedoch bis hierher eher von hypothetischer Natur und bedürfen weiterer Untersuchungen bzw. Verifizierungen. Insofern bietet die Herstellung und grundlegende Charakterisierung dieses E. faecalis BF-Mutantenstamms überaus interessante Ansatzpunkte mit hohem Potenzial zur Erkenntnis weiterer, essentieller Mechanismen der Biofilm-Bildung dieser Bakterienspezies. Diskussion 131 5.5.2 Untersuchung der E. faecalis Stämme 1.10 und 1.10.16 Die massenspektrometrische Identifizierung differentiell exprimierter Zellwandproteine sowie molekularbiologische Untersuchungen der Stämme 1.10 (sehr starker BF-Bildner) und der Mutante 1.10.16 (schwacher BF-Bildner) ließen den Schluß zu, dass beim Isolat 1.10.16 vermutlich eine Punktmutation im srt-1 Gen des bee Locus zu dessen herabgesetzten Fähigkeit zur BF-Bildung im Vergleich zum Wildtyp 1.10 führte (siehe 4.5.2.9 und 4.5.2.11). Die Ursache der verminderten BF-Bildung der Mutante lag somit höchstwahrscheinlich darin, dass aufgrund des Defekts in der Produktion der Sortase-1 die drei Bee-Proteine nicht korrekt zu einem hochmolekularen Zellwandprotein-Komplex verknüpft werden konnten. Dennoch wurden offensichtlich die Proteine Bee-1 und Bee-3 miteinander verlinkt, was sich in dem Auftreten einer deutlichen Bande von geringerer Masse (ca. 180 kDa) bei der Mutante zeigte und mittels der massenspektrometrischen Analyse der Proteine des Stamms 1.10.16 nachgewiesen wurde (siehe Abb. 31 b, Bande 4.2 und Tab. 18). Somit schien die Verknüpfung dieser beiden Proteine vermutlich nicht beeinflusst zu sein. Im Rahmen dieser Arbeit lieferte die LC/MS-Analyse erstmals den phänotypischen Nachweis eines hochmolekularen Bee-Komplexes bestehend aus den drei Proteinen Bee-1, Bee-2 und Bee-3 (siehe Abb. 31 b, Bande 3.1) beim Stamm 1.10. Tendolkar et al. (2006) gaben zwar eine erste molekularbiologische Beschreibung des bee Operons (siehe auch 1.3.4.3), jedoch keine weiterführenden proteinbiochemischen Erkenntnisse bzgl. dieses Locus. Die Autoren hielten es für möglich, dass aufgrund des Aufbaus des bee Operons, vergleichbar mit dem bereits charakterisierten ebp Locus, die codierten Proteine Pilus-ähnliche Strukturen darstellen. Pili-Strukturen spielen bei vielen Bakterien eine entscheidende Rolle im Prozess der Biofilm-Bildung, was beispielsweise auch für Streptococcus pyogenes (Manetti et al., 2007) oder Oral-Streptokokken bekannt ist (Kolenbrander, 2000). Aufgrund der in der vorliegenden Arbeit zuvor erzielten Ergebnisse wurde daher des Weiteren ein Sequenzvergleich der Bee-Proteine durchgeführt (MegAlign 7.0, DNASTAR Lasergene Software, ClustalW alignment; MRI Karlsruhe), um konservierte Motive bei Pilus-Proteinen Gram-positiver Bakterien zu identifizieren und so die Vermutung zu untermauern, dass auch die vom bee Locus codierten Proteine Pilus-Strukturen bilden (siehe Abb. 35). Neben den konservierten LPxTG-Motiven im C-Terminus der Zellwand-Proteine Gram-positiver Bakterien (Marraffini et al., 2006), die ebenfalls bei den drei Bee-Proteinen detektiert wurden (Tendolkar et al., 2006), enthalten Pili-Proteine weitere zwei Motive. Dies sind die sogenannte E-Box (YxLxETxAPxGY) mit konservierter Glutaminsäure (E) sowie das Pilin- Motiv (WxxxVxVYPKN), das ein konserviertes Lysin (K) enthält (Mandlik et al., 2008). Diese konnten in der vorliegenden Arbeit erstmals in den Bee-Proteinen mittels Sequenzvergleichen identifiziert werden (siehe Abb. 35), sodass hiermit weitere Ergebnisse Diskussion 132 a) E-Box-Motiv Bee-1 (AAZ68037) 972 SDTNVFKFTGLKPGEYELIETVTPDGY Bee-3 (AAZ68039) 401 DDKGELKVIGLKNGDYQLEEKATSSDKY EbpB (AAO80892) 374 NQAGEFSVKGLKDGQYFLEEISAPKGY EbpC (AAO80893) 529 TADGLVDITGLKYGTYYLEETVAPDDY RrgB (A7KT25) 540 NTDGQFQISGLAAGTYKLEEIKAPEGF RrgC (A7KT26) 311 GKDGRFRVEGLEYGTYYLWELQAPTGY Consensus XXXGXXXXXGLKXGTYXLEEXXAPXG b) Pilin-Motiv Bee-1 (AAZ68037) 394 VQETTTYFPYYKINVPYGKVGNF Bee-2 (AAZ68038) 174 DKELATVHLYPKNVGTIVEKPVT Bee-3 (AAZ68039) 175 DTINTNVQVYPKNETKTDKKEVA EbpC (AAO80893) 176 TEELAVVHIYPKNVVANDGSLKK SpaA (CAE50544) 179 DGWLQDVHVYPKHQALSEPVKTA Consensus DXELXXVHXYPKNV Abb. 35 Alignment der Sequenzen verschiedener Pili-Proteine: Vergleich und Identifizierung konservierter Motive bei den Proteinen Bee-1, Bee-2 und Bee-3 Konservierte Glutaminsäurereste (E) in E-Box-Motiven (a; E-Box: YxLxETxAPxGY) und Lysinreste (K) in Pili- Motiven (b; Pilin-Motiv: WxxxVxVYPKN) wurden ebenfalls in den Bee-Proteinen des Stamms E. faecalis E99 (Tendolkar et al., 2006) identifiziert. Ähnliche Motive beinhalten die Pilus-bildenden Spa-Proteine bei Corynebacterium diphtheriae NCTC13129 (Ton-That & Schneewind, 2003), Rrg-Proteine bei Streptococcus pneumoniae TIGR4 (LeMieux et al., 2006) und Ebp-Proteine von E. faecalis OG1RF (Nalladareddy et al., 2006). In Klammern sind jeweilige Akzessionsnummern angegeben. Konservierte Aminosäuren sind in fettgedruckten Buchstaben dargestellt sowie schwarz unterlegt, diese wurden mittels ClustalW Alignment (MRI Karlsruhe) identifiziert. dieser Arbeit und damit die Hypothese untermauert wurden, dass der bee Locus Pili-Proteine codiert. Damit würde der bee Locus neben dem bereits charakterisierten ebp Gencluster bei E. faecalis ein zweites Pili-Operon darstellen. Auch bei anderen Gram-positiven Bakterien konnten mehrere verschiedene Gencluster und damit Pili-Strukturen entdeckt werden, z.B. sind bei Corynebacterium diphtheriae (spaABC, spaDEF, spaHIG; Swierczynski & Ton-That, 2006). Allerdings müssten diese Resultate mittels weiterer Experimente bestätigt werden, die auf den phänotypischen Nachweis der Pili-Strukturen abzielen (z.B. mit Hilfe der TEM nach Immunogold-Markierung). Sortasen verankern Zellwandproteine an deren LPxTG-Motiv über einen spezifischen Mechanismus kovalent mit den Peptidoglykan-Querverbindungen der Zellwand (siehe auch 1.3.4.3). Die Sortase A (SrtA), auch Housekeeping-Sortase genannt, wurde bisher mit wenigen Ausnahmen in allen vollständig sequenzierten Genomen Gram-positiver Bakterien gefunden. Sortasen der Klasse C-Familie sind zusammen mit ihren Substraten im jeweiligen Gencluster codiert und an der Bildung von Pili-Strukturen bei vielen pathogenen Bakterien Diskussion 133 beteiligt (Pili-spezifische Sortasen; Marraffini et al., 2006). Bei einigen Bakterien, u.a. Corynebacterium diphtheriae, sind bereits genauere Mechanismen der Pili-Bildung sowie der Aufbau der Pili bekannt, wenn auch noch nicht vollständig geklärt (Mandlik et al., 2008). Für E. faecalis sind die spezifischen molekularen Mechanismen der Zellwandverankerung und Pili-Biogenese an der Zellwand für die Ebp-Proteine nicht bekannt, die Proteinsequenzen und die Struktur des Operons geben jedoch Hinweise hierzu (Nallapareddy et al., 2006). In der vorliegenden Arbeit konnte erstmals beschrieben werden, dass vermutlich aufgrund des Verlusts von Bee-2 innerhalb des HMW-Bee-Komplexes die Sortase-1 spezifisch dieses Protein mit Bee-1 und / oder Bee-3 verlinkt. Unklar bleibt die Funktion von Sortase-2, jedoch wäre denkbar, dass aufgrund des Vorkommens des E-Box-Motivs Bee-1 und Bee-3 Substrate dieser Sortase darstellen und somit ein ähnlicher Mechanismus vorliegt wie im Falle der SpaDEF-Pili bei Corynebacterium diphtheriae (Gaspar & Ton-That, 2006). Außerdem könnte das Bee-2 Protein aufgrund seiner geringen Größe (ca. 27 kDa) homolog zu EbpB sein, welches die kleine Pili-Untereinheit darstellt, wohingegen Bee-1 und Bee-3 Schaft und Spitze der Pili bilden würden (siehe auch Abb. 39). Dies müsste in Folgestudien verifiziert werden. Überaus wichtig wären dabei zunächst Komplementierungsexperimente des srt-1 Gens, um eindeutig den veränderten Phänotyp (reduzierte BF-Bildungsfähigkeit) des Stamms 1.10.16 auf die Mutation in diesem Gen und somit auf den Verlust der Sortase- 1 zurückzuführen. Dies ist insofern von Bedeutung, dass es sich bei der Erzeugung dieser Mutantenstämme nicht um eine gerichtete Mutagenese gehandelt hat. Somit ist derzeit nicht absolut auszuschliessen, dass auch weitere Mutationsereignisse während der Subkultivierung stattgefunden haben, die Einfluss auf den veränderten Phänotyp nehmen. Unterschiedliche vergleichende Untersuchungen von Wildtyp und Mutante zeigten verschiedenste Auswirkungen der Mutation auf den Phänotyp des Stamms 1.10.16. Zunächst wurde mittels REM (siehe 4.5.2.2, Abb. 25) und CLSM (siehe 4.5.2.1, Abb. 22) der vom Wildtyp 1.10 gebildete Biofilm als ein festes, mehrschichtiges Gebilde mit einer eher lockeren, flockigen Struktur dargestellt, die größere Zwischenräume enthielt. Die Mutation schien somit die Fähigkeit der Zellen zu verringern, sich auf diese Art zusammenzulagern. Extrazelluläre Substanzen konnten jedoch nicht entdeckt werden, so dass deutlich wurde, dass es sich hier im Vergleich zu dem Biofilm des untersuchten Stamms 2.11 um eine andere Form von Biofilm und damit um einen anderen Mechanismus der BF-Bildung handeln musste. Anhand der Wachstumscharakteristik in TSBG-Flüssigkultur nach einer ÜN-Inkubation wurde deutlich, dass die Zellen des Stamms 1.10.16 offensichtlich in sehr viel geringerem Maße eine Bildung von Zellaggregaten zeigten als der Wiltyp 1.10 (Abb. 20). Dies implizierte eine Rolle des Bee-Proteinkomplexes für die Biofilm-Bildung evtl. aufgrund von Autoaggregation Diskussion 134 und Zell-Zell-Interaktionen. Eine ähnliche Funktion wurde für Pilus-Strukturen anderer Bakterien schon beschrieben (Tomich & Mohr, 2003; Schembri et al., 2001). Auch schien der Bee-Komplex signifikant die initiale Anheftung an abiotische Oberflächen zu beeinflussen (siehe 4.5.2.5). Dennoch war der Stamm 1.10.16 nicht gänzlich negativ bzgl. der BF- Bildungsfähigkeit (siehe 4.5.1), was vermutlich auf das Vorhandensein anderer Faktoren zurückzuführen war. Beispielsweise wurde bei Wildtyp und Mutante das esp Gen nachgewiesen, welches die primäre Anheftung des Stamms beeinflusst haben könnte (Toledo-Arana et al., 2001). Ebenso könnten die Fähigkeit zur Gelatinase-Produktion und die Aggregationssubstanz Asa1 zu einer schwachen BF-Bildung der Mutante beigetragen haben (siehe 4.5.2.4). Des Weiteren zeigte der Stamm 1.10.16 eine im Vergleich zum Wildtyp verringerte, aber nicht vollkommen herabgesetzte (ca. 22 %) Hydrophobizität der Zelloberfläche (siehe 4.5.2.6), was in Einklang stand mit den Ergebnissen der verminderten Fähigkeit zur primären Anheftung. Somit könnte die Mutation im srt-1 Gen und folglich der Verlust des Bee-2 Proteins in dem HMW-Bee-Komplex auch die Hydrophobizität der Zelloberfläche zu erniedrigen, andere Faktoren wie das Esp-Protein beeinflussen jedoch möglicherweise ebenfalls diese Eigenschaft. So konnten Tendolkar et al. (2004) zeigen, dass die Expression von Esp bei zwei E. faecalis Stämmen deren Hydrophobizität der Zelloberfläche signifikant erhöhte. Dies stand allerdings nicht in einem proportionalen Verhältnis zur Menge an produziertem Biofilm, sodass die Autoren eine nicht alleinige Beeinflussung der BF-Bildung durch esp schlussfolgerten. Die Gesamtinzidenz des bee Locus bei den 150 getesteten E. faecalis Isolaten lag bei 5,3 % (acht von 150), was mit Ergebnissen von Tendolkar et al. (2006) übereinstimmt (5,0 % bei geographisch unabhängigen Stämmen). Sieben der bee+ Isolate der vorliegenden Arbeit bildeten einen starken Biofilm, ein Stamm war ein mäßiger BF-Bildner (siehe Tab. 20 im Anhang). Außerdem konnte bei diesen Isolaten ein dem Stamm 1.10 sehr ähnliches Plasmid-Muster (Abb. 30, Bahn 3) beobachtet werden (Daten nicht aufgeführt). Dieses war höchstwahrscheinlich auf unterschiedliche Konformationen (oc-Form, supercoiled) eines 80 kb-großen, konjugativen Plasmids zurückzuführen, auf dem u.a. der bee Locus lokalisiert ist (Tendolkar et al., 2006). Somit ist das Vorkommen des bee Locus im Vergleich zum ubiquitär auftretenden ebp Operon insgesamt als sehr gering anzusehen. Allerdings waren nach Ergebnissen von Nallapareddy et al. (2006) bei nur ca. 20 % aller Zellen des Stamms OG1RF Ebp-markierte Pili zu beobachten. Dies ist vermutlich auf den Einfluss des Transkriptionsregulators ebpR zurückzuführen (Bourgogne et al., 2007; siehe auch 1.3.4.4). Dieser stark BF-bildende Phänotyp sowie das Potenzial des bee Locus zum Transfer auf andere Stämme mit einer hohen Frequenzrate (Tendolkar et al., 2006) impliziert trotz des geringen Vorkommens des bee Locus eine wichtige Rolle als Virulenzfaktor. Diskussion 135 5.5.3 Untersuchung der E. faecalis Stämme 2.11 und 2.11.8 Der E. faecalis Stamm 2.11 (Wildtyp, sehr starker BF-Bildner) zeigte nach einer ÜN- Inkubation in TSBG im Gegensatz zu seiner Mutante 2.11.8 (schwacher BF-Bildner) einen sehr stark aggregierenden Phänotyp (siehe Abb. 20). Insofern ließ sich allein aufgrund dieser Beobachtung vermuten, dass die die veränderte BF-Bildungsfähigkeit verursachende Mutation einen Faktor betrifft, der die Aggregation / Zell-Zell-Interaktion der Zellen während des Prozesses der Biofilm-Bildung beeinflusst. Die Ergebnisse des Tests auf primäre Anheftung verdeutlichen zwar eine leicht signifikante Erniedrigung zwischen den Stämmen 2.11 und 2.11.8 (siehe Abb. 28), im Vergleich zu den anderen untersuchten starken bzw. sehr starken BF-Bildnern zeigte sich die Fähigkeit zur initialen Anheftung beim Stamm 2.11 jedoch weniger ausgeprägt. Somit konnte geschlussfolgert werden, dass die Fähigkeit zur BF-Bildung bei diesem Stamm vornehmlich auf seiner Eigenschaft der starken Aggregation beruht. In der CLSM zeigte sich der Biofilm des Isolats 2.11 als ein zum Isolat 1.3.7 fast ähnlicher, kompakter Biofilm (siehe Abb. 23 b), der allerdings im Vergleich deutlich größere Zwischenräume und kanalähnliche Strukturen in dem mehrschichtigen Biofilm aufwies (siehe Abb. 23 a). Diese Strukturen waren in der REM ebenfalls zu erkennen (Abb. 26 a,c), ebenso wie extrazelluläre Substanzen an einigen Stellen der Präparate des Stamms 2.11, welche auch in sehr geringer Menge bei der Mutante 2.11.8 zu sehen waren (vgl. Abb. 26 e,f). Diese Beobachtungen ließen den Schluss zu, dass es sich bei diesem Stamm um eine, von den anderen untersuchten Isolaten sich grundlegend unterscheidende Gestalt des Biofilms und damit um einen andersartigen Prozess der Biofilm-Bildung handelte. Diese Schlussfolgerung betraf insbesondere die Entdeckung von extrazellulärem Material, allerdings schien diese Fähigkeit zumindest qualitativ durch die Mutation beim Stamm 2.11.8 nicht beeinflusst worden zu sein. Ferner könnte die insgesamt eher spärliche Beobachtung dieser extrazellulären Strukturen im REM präparationsbedingt gewesen sein (Waschschritte etc.), was nachdrücklich den Nachteil dieser mikroskopischen Methode widerspiegelt. Über die Art der Substanzen (Exopolysaccharide o.ä.) konnte keine Aussage getroffen werden, jedoch ist die Expression von Exopolysacchariden, welche verschiedene neutrale Hexosen enthalten, bei Enterokokken bekannt, z.B. Glukose-Glycerol-Phosphatpolymere (Huebner et al., 1999). Auch ein putatives Polysaccharid-Biosynthese Gencluster (Epa) wurde in E. faecalis beschrieben (Xu et al., 1998; siehe auch 1.2.6). Weiterführende Untersuchungen der Biofilm- Ultrastruktur des E. faecalis Stamms OG1RF von Erlandsen et al. (2004) beschrieben ebenfalls derartige Substanzen. Die Autoren mutmaßten, dass diese Strukturen Exopolysaccharide waren. Mittels diesen schienen sich die Zellen mit dem Substrat zu verankern, außerdem stellten die Autoren eine Abhängigkeit der Biofilm-Bildung von der Art des Substrats fest (siehe auch 1.3.1). In der vorliegenden Arbeit wurden die Biofilme mittels Diskussion 136 REM und CLSM durchführungsbedingt auf Glasobjektträgern dargestellt. Interessant wären auch hier experimentell aufwendigere Versuche, die auf die Untersuchung der Biofilm- Bildungsfähigkeit bzw. die Ultrastruktur der Biofilme der hergestellten E. faecalis Mutantenstämme im Vergleich zu ihren Wildtyp-Isolaten auf anderen Substraten abzielen. In der Analyse der differentiell exprimierten Proteine der Stämme 2.11 und 2.11.8 fielen mehrere starke Banden des Stamms 2.11 nach der Gradienten-Gelelektrophorese auf, die bei der Mutante 2.11.8 nicht oder nur äußerst schwach zu erkennen waren (siehe Abb. 31, Bahn 5 und 6). Die Identifizierung der Proteine ergab in jeweils zwei Banden des Stamms 2.11 die Anwesenheit der Aggregationssubstanz EF0149 sowie des Surface Exclusion Proteins Sea1, weiterhin wurde sicher das Surface Exclusion Protein PrgA der Aggregationssubstanz PrgB identifiziert (siehe Tab. 18). Diese Ergebnisse deuteten auf das Vorkommen der Plasmide pAD1 und pCF10 beim Stamm 2.11 hin. Das Protein EF0149 ist eine putative Aggregationssubstanz, die im Chromosom des Isolats E. faecalis V583 in einer Region identifiziert wurde, welche einen integrierten Plasmidrest enthält (Paulsen et al., 2003). Diese putative Aggregationssubstanz zeigt ebenfalls eine starke Homologie zu Asa1 (Burrus et al., 2002). Beim Stamm 2.11.8 konnte diese Aggregationssubstanz hingegen nicht nachgewiesen werden. Überwiegend wurden Proteine des ebp Locus, die zum Teil beim Wildtyp 2.11 ebenfalls detektiert wurden, sowie das uncharakterisierte, putative Zellwand- assoziierte Protein EF2505 nachgewiesen. Insofern schien bei dem Stamm 2.11.8 der Mechanismus der Aggregation durch die Mutation beeinflusst zu sein, die in diesem Fall vermutlich durch eine oder mehrere Aggregationssubstanzen vermittelt wurde. Mittels LC/MS-Analyse wurde die AS EF0149 nachgewiesen, bzgl. der anderen, vermeintlich involvierten Adhäsine (PrgB, Asa1) deren Surface Exclusion Proteine PrgA und Sea1. Somit wurden diese AS unter diesen Kulturbedingungen (nicht induziert) nicht synthetisiert (siehe auch 5.5.1), hingegen schien die AS EF0149 konstitutiv exprimiert zu werden. Dies könnte auch die Ursache des extrem stark klumpenden Phänotyps des Wildtyps 2.11 in TSBG (siehe Abb. 20) gewesen sein. Unklar war in diesem Zusammenhang allerdings die Reaktion der Stämme nach Induzieren mit Pheromonen, da hier die Verklumpungsreaktion zumindest augenscheinlich ausblieb (siehe Tab. 16). Die Mutante 2.11.8 zeigte im Vergleich zum Wildtypstamm 2.11 außerdem eine stark signifikant erniedrigte Oberflächen-Hydrophobizität (siehe Abb. 29) sowie Anheftung an HeLa-Zellen im Adhärenz-Assay (siehe 4.5.2.7). Diese Resultate wären ein zusätzlicher Hinweis auf den Verlust oder eine herabgesetzte Expression von Aggregationssubstanzen bei der Mutante, da bereits in mehreren Studien die Erhöhung der Adhärenz durch AS bei Diskussion 137 E. faecalis an unterschiedliche eukaryotische Zellen gezeigte werden konnte (Kreft et al., 1992; Sartingen et al., 2000; Süßmuth et al., 2000; siehe auch 1.2.2). Die Plasmid-Isolierungen der Stämme ergaben weiterhin, dass im Vergleich zum Wildtyp beim Stamm 2.11.8 keine Plasmide nachweisbar waren (siehe Abb. 30). Insofern konnte ein Verlust eines oder mehrerer Plasmide des Stamms 2.11, die diese Aggregationssubstanzen codieren, vermutet werden. Scheinbar wurde aber auch die chromosomal codierte AS EF0149 davon beeinflusst, da eine Expression bei der Mutante mittels LC/MS-Analyse ebenfalls nicht mehr nachgewiesen werden konnte. Zugrundeliegende Ursachen können bis hierher nur spekulativ betrachtet werden. Denkbar wäre, dass bei der Mutante a) ein genetisches Element vom Plasmid, ein gesamtes Plasmid oder eine andere mobile Sequenz (Transposon, IS-Element) in den Locus EF0149 oder an eine andere Stelle integriert hatte, die diesen Locus beeinflusst, und damit die Funktion der AS beeinträchtigte, b) der Genlocus EF0149 selbst aus dem Chromosom verloren gegangen war, da er auf einem mobilen genetischen Element codiert war (integrierter Plasmidrest), oder c) diese AS von Genen reguliert wurde, die auf dem / den verloren gegangenen Plasmiden lagen. Damit bietet auch diese hergestellte E. faecalis BF-Mutante interessante Ansatzpunkte, deren weiterführende Untersuchung insbesondere die Rolle von Aggregationssubstanzen bei der Biofilm-Bildung spezifizieren könnte (vgl. auch 1.3.4.5). Zusammenfassung 138 6 Zusammenfassung Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde eine größere Anzahl an E. faecalis Isolaten aus Vaginalabstrichen, erstmals insbesondere von Patientinnen, die an Bakterieller Vaginose litten, untersucht und mit 150 E. faecalis Stämme aus verschiedenen anderen klinischen Bereichen auf das Vorkommen von Virulenzfaktoren verglichen. Weiterhin wurden Korrelationen bestimmter Faktoren zu der Menge an produziertem Biofilm erstellt, um mögliche Zusammenhänge zum Mechanismus der Biofilm-Bildung zu erfassen. Mittels statistischer Analysen konnte hinsichtlich der 150 untersuchten E. faecalis Isolate nachgewiesen werden, dass keine signifikanten Unterschiede der Inzidenzen von Virulenzfaktoren (esp, asa1, gelE, GelE, cylA, β-Hämolyse) zwischen den Stämmen der verschiedenen Herkunftsbereiche bestanden. In Bezug auf das Auftreten von Biofilm-Bildung zeigte sich ein erhöhtes Vorkommen bei Stämmen aus Urin sowie invasiver Herkunft (insgesamt jeweils ca. 70 % mäßige und starke Biofilm-Bildner) im Vergleich zu E. faecalis Isolaten aus Wunden oder Faeces (je ca. 40 %). Statistische Auswertungen bzgl. des Zusammenhangs eines oder einer Kombination von Virulenzfaktoren mit der Menge an gebildetem Biofilm wiesen darauf hin, dass Isolate, die das esp Gen besaßen, in erhöhtem Maße zur Biofilm-Bildung befähigt waren. Dies zeigte einen gewissen Einfluss des Zellwandproteins auf die Fähigkeit zur Biofilm-Bildung bei E. faecalis. Allerdings wurden stets auch Stämme ausgemacht, die die Fähigkeit zur Biofilm-Bildung trotz des Fehlens der jeweils untersuchten genetischen Determinante bzw. der Determinanten aufwiesen, so dass auf das Vorhandensein weiterer, unbekannter Einflussfaktoren auf den Mechanismus der Biofilm-Bildung geschlossen werden konnte. Unter 78 untersuchten E. faecium Isolaten aus verschiedenen klinischen Bereichen konnte lediglich ein Stamm (1,3 %) als mäßiger Biofilm-Bildner charakterisiert werden, so dass diese Fähigkeit bei E. faecium Stämmen in der hier untersuchten Region unter diesen Bedingungen kaum nachgewiesen werden konnte. Einen weiteren Schwerpunkt dieser Arbeit bildete die Untersuchung zum Vorkommen von Virulenzfaktoren und Biofilm-Bildung bei E. faecalis Isolaten aus Vaginalabstrichen. Bzgl. des Auftretens von Virulenzfaktoren und Biofilm-Produktion konnte kein signifikanter Unterschied zwischen Stämmen assoziiert mit Bakterieller Vaginose und Isolaten einer Vergleichsgruppe festgestellt werden. Allerdings zeigte eine Gegenüberstellung mit den 150 untersuchten E. faecalis Stämmen aus anderen klinischen Bereichen, dass die 80 Isolate aus Vaginalabstrichen eine ähnlich hohe Anzahl an Virulenzfaktoren sowie eine mit den Isolaten aus Urin und invasiver Herkunft vergleichbar hohe Fähigkeit zur Biofilm-Bildung aufwiesen (ca. 75 % mäßige und starke Biofilm-Bildner). Dies deutete auf eine Verbreitung der Biofilm- Bildungsfähigkeit bei E. faecalis Stämmen der Vaginalflora und somit auf eine große Bedeutung der Eigenschaft für Isolate dieser Herkunft hin. Die statistische Auswertung der Zusammenfassung 139 Korrelationen von Virulenzfaktoren mit der Menge an gebildetem Biofilm war vergleichbar zu den Ergebnissen der Analysen bzgl. der 150 E. faecalis Isolate aus anderen klinischen Bereichen und untermauerte die Annahme, dass zusätzliche Faktoren zu den hier untersuchten Determinanten bei E. faecalis vorhanden sein müssen, die Einfluss auf den Mechanismus der Biofilm-Bildung nehmen. Deshalb konzentrierte sich ein weiterer Teil der vorliegenden Arbeit auf die Herstellung und Charakterisierung von E. faecalis Biofilm-Spontanmutanten, um bisher noch ungeklärte Mechanismen oder neue Faktoren zu erkennen, die Einfluss auf die Biofilm-Bildung bei E. faecalis nehmen. Die Untersuchung einer Mutante (1.10.16) und ihres Wildtypstamms lieferte erstmals einen phänotypischen Nachweis des HMW-Komplexes der drei Bee- Proteine sowie die Beschreibung konservierter Pili-Motive dieser Proteine. Des Weiteren schien die in diesem Cluster ebenfalls codierte Sortase-1 dasjenige Enzym zu sein, das höchstwahrscheinlich die Bindung des Proteins Bee-2 innerhalb dieses HMW-Komplexes katalysiert. Insofern lieferten diese Untersuchungen neue, konkrete Hinweise zur Rolle des bee Genclusters bei der Biofilm-Bildung von E. faecalis. Bei einem weiteren Biofilm-Mutantenstamm (1.3.7) konnte aufgrund veränderter Profile in der Proteinexpression vermutet werden, dass der veränderte Biofilm-Phänotyp auf eine beeinflusste Regulation der Expression des Pili-Genclusters ebp und / oder von Aggregationssubstanzen zurückzuführen war. Der Mechanismus der Aggregation schien auch bei einer anderen hergestellten Biofilm-Mutante (2.11.8) im Vergleich zu ihrem Wildtypstamm beeinflusst gewesen zu sein, was Hinweise auf die Rolle dieser Adhäsine für die Biofilm-Bildung bei E. faecalis lieferte. Ausblick 140 7 Ausblick Die vorliegende Arbeit bietet vielfältige interessante Ansatzpunkte zur Bearbeitung verschiedenster Aspekte, die zu weiterführenden Erkenntnissen bzgl. der Biofilm-Bildung und Virulenzeigenschaften bei Enterokokken beitragen könnten. Das im Rahmen dieser Arbeit zusammengestellte und charakterisierte Kollektiv von insgesamt 230 E. faecalis und 78 E. faecium Isolaten aus unterschiedlichsten klinischen Bereichen bietet für zukünftige Studien die Möglichkeit, eine große Anzahl von Stämmen auf das Vorkommen und die Verbreitung weiterer Merkmale in Verbindung mit der Virulenz und der Biofilm-Bildung zu überprüfen, um Zusammenhänge zu bestimmten Herkunftsbereichen oder andere Beziehungen zu untersuchen. Hinsichtlich der 80 untersuchten E. faecalis Isolate aus Vaginalabstrichen wäre zum einen der Vergleich des Vorkommens von Virulenzfaktoren und Biofilm-Bildung mit Stämmen interessant, die in einer gesunden Vaginalflora auftreten. Zum anderen könnten Typisierungen dieser E. faecalis Stämme sowie von Isolaten anderer Bereiche, insbesondere aus intestinaler Normalflora und Urin (Harnwegsinfektionen), Aufschluss über eventuelle klonale Verwandtschaftsbeziehungen und Herkunft der Stämme der Vaginalflora geben. Basierend auf den Ergebnissen dieser Arbeit bzgl. der Stämme 1.10 und 1.10.16 wären weitere Untersuchungen zum Mechanismus der Verknüpfung der einzelnen Bee-Proteine untereinander sowie der Verankerung mit der Zellwand interessant. Des Weiteren wären Experimente von Bedeutung, die die Bildung von Pili durch die vom bee Locus codierten Proteine eindeutig belegen. Hierzu sollten zunächst Komplementierungsversuche des srt-1 Gens zur zusätzlichen molekularbiologischen Verifizierung des Defekts der Sortase-1 bei dem Mutantenstamm durchgeführt werden. Weitere Analysen würden den Nachweis der drei Bee-Proteine mittels gegen sie gerichteter Antikörper und die Darstellung markierter Proteine an der Zelloberfläche im Transmissionselektronen-Mikroskop (TEM) erfordern. Bzgl. der E. faecalis Stämme 1.3 und 1.3.7 sowie 2.11 und 2.11.8 könnten weiterführende Untersuchungen zu bestimmten Genen / Genloci sinnvoll sein, zu denen die vorliegende Arbeit Hinweise auf mögliche Mutationsereignisse liefern konnte (quantitative Expressionsanalysen mittels real-time PCR, Konjugationsexperimente etc.). Viel- versprechend, jedoch methodisch aufwendig, könnte hinsichtlich aller der in dieser Arbeit hergestellten E. faecalis Biofilm-Mutantenstämme die Analyse mittels einer Differential- Display Methode sein (Shepard & Gilmore, 1999; Breton et al., 2007). Diese Anwendung würde die Möglichkeit bieten, durch die vergleichende Analyse von Wildtyp und Mutante Einblicke in die differentielle Genexpression des gesamten Genoms zu bekommen. Hiermit könnten die gegenseitige Beeinflussung verschiedener Faktoren, regulatorische Pfade und andere molekulare Zusammenhänge bzgl. des Mechanismus der Biofilm-Bildung bei E. faecalis erkannt werden. Literaturverzeichnis 141 8 Literaturverzeichnis Aarestrup F. M., Butaye P., Witte W. (2002) Nonhuman reservoirs of enterococci. In: Gilmore M. S., Clewell D. B., Courvalin P., Dunny G. M., Murray B. E., Rice L. B. (Eds.) The Enterococci – pathogenesis, molecular biology, and antibiotic resistance. ASM Press, Washington, DC: 55-100 Anukam K. C. & Reid G. (2007) Organisms associated with bacterial vaginosis in Nigerian women as determined by PCR-DGGE and 16S rRNA sequence. Afr Health Sci 7: 68-72 Amsel R., Totten P. A., Spiegel C. A., Chen K. C. S., Eschenbach D. A., Holmes K. K. (1983) Nonspecific vaginitis: Diagnostic criteria and microbial and epidemiologic associations. Am J Med 74: 14-22 Archimbaud C., Shankar N., Forestier C., Baghdayan A., Gilmore M. S., Charbonné F., Joly B. 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E. faecalis JH2-2, + (≤ 1 mm), ++ (2-4 mm), +++ (> 4 mm); BF, Biofilm-Bildung, angegeben als OD595-Mittelwerte aus mindestens drei Messungen mit jeweils vier Replikaten; K, Herkunft Krankenhaus; A, Herkunft niedergelassener Arzt; Umw, Herkunft Umwelt; S, Stuhl; U, Urin; Abz, Abszess; W, Wunde; Pan, Pankreas; V, Vagina; P, Penis- Abstrich; Vul, Vulva-Abstrich; Cer, Cervix; Dia, Dialysewasser; VKat, Venenkatheter; PEG, Perikutane endoskopische Gastrostomie; Rach, Rachenabstrich; H op, Hüftgewebe operativ; AbzZ, Zahnabszess; TEP, Totalendoprothese; Asc, Aszites; B op, Bauchhöhlenabstrich operativ; G, Geflügelkot; Ra, Rattenkot; Gew, Gewässer Isolat K/A/ Umw Ma- terial cylA esp asa1 gelE ef0591 bee espA espC aceB GelE β- Häm E.fc JH2-2 E.fm 64/3 BF 8 K S - - + - - - - - 1,5 - - - - 0,046 30 K S - + + + - - 2 4 3,5 - - + - 0,231 47 A S - + - + - - 2 6 2,5 - - - - 0,059 63 K S + + + - + - 3 7 3,5 - + + ++ 0,439 73 A S - - - + - - - - 5,5 + - - ++ 0,071 77 A S + - - + - - - - 2,5 - - - - 0,338 79 A S - + - + - - 2 6 2,5 - - - - 0,104 82 A S - - - + - - - - 3,5 + - - ++ 0,028 84 A S - - + - - - - - 2,5 - - - - 0,066 *2 K S - - + - - - - - 2,5 - - - - 0,081 *4 K S - - + + - - - - 4,5 + - - ++ 0,057 *5 K S - + + + - - 1 5 2,5 - - ++ - 0,440 *6 K S + + + + - - 2 5 4,5 + - + + 0,199 *7 K S + + + - + - 3 11 3,5 - + ++ ++ 0,080 *8 K U + + + + - - 2 8 4,5 + - + + 0,136 *9 K U - + + + + - 1 7 4,5 - - - - 0,253 *10 K U - - - + - - - - 3,5 + - - - 0,038 1.1 A V + - + + - - - - 3,5 + + + + 0,086 1.2 A W - - - + - - - - 3,5 + - - ++ 0,063 1.3 A V + - + - + - - - 3,5 - + ++ ++ 0,023 1.4 A P + + + + - - 2 8 4,5 + + + + 3,467 1.6 K W - + - + - - 2 8 3,5 - - + - 0,058 1.7 A Vul - + - + - - 1 7 2,5 - - + - 0,189 1.8 A V - - - + - - - - 4,5 + - - ++ 0,103 1.9 A V - + + + - - 2 6 4,5 + - - ++ 0,103 1.10 A V - + + + - + 1 4 2,5 + - - - 0,966 2.2 K W + + + + + - 3 7 5,5 - + - - 0,057 2.3 A Dia - - + + - - - - 2,5 + - - - 0,062 2.4 A W + - + + - - - - 4,5 + + + ++ 0,323 2.6 A U - + - + - - 2 8 4,5 + - - ++ 0,102 2.7 K U + - + + - - - - 4,5 + + + + 1,375 2.8 A U - - - + - + - - 2,5 + - - - 0,405 2.9 A U - - + + - - - - 2,5 + - - - 0,179 2.10 A U + + + + - - 2 8 4,5 + + ++ + 0,072 2.11 A V + - + + - - - - 4,5 + + + + 3,500 2.12 A V - - + + - - - - 4,5 + - - ++ 0,040 3.2 K U + + + + + - 3 7 3,5 - + ++ + 0,394 3.5 K U + + + + - + 2 7 2,5 - + ++ ++ 0,536 3.6 A U - - + + - - - - 4,5 + - - ++ 0,142 3.7 K U + + + + + - 3 7 3,5 - + ++ ++ 0,214 3.8 K U - - - + - + - - 2,5 - - - - 1,326 Anhang 154 Tab. 21 Daten E. faecalis Isolate aus verschiedenem klinischen Material – VF (Fortsetzung) Isolat K/A/ Umw Ma- terial cylA esp asa1 gelE ef0591 bee espA espC aceB GelE β- Häm E.fc JH2-2 E.fm 64/3 BF 3.9 A Cer - + + + - - 2 8 3,5 - - - - 0,070 3.10 A U - + + + - - 2 5 2,5 - - - - 0,115 3.14 K VKat - - + + - - - - 5,5 - - - - 0,083 4.1 A V - - - + - + - - 2,5 + - + + 0,496 4.2 K U + - + + - - - - 4,5 + - + + 0,224 4.3 K U - + + - - - 2 7 4,5 - - - - 0,125 4.4 K Abz - - + + - + - - 1,5 + - +++ +++ 0,250 4.5 K PEG - + - - - - 2 7 4,5 - - - - 0,360 4.6 A V + + + + - - 2 8 4,5 + + + + 0,226 4.7 K V - + - + - - 2 3 2,5 - - - - 0,172 4.8 A Rach + + + + - - 2 8 4,5 - + ++ ++ 0,097 4.9 A V - - + + - - - - 4,5 + - - ++ 0,111 4.10 K H op - - + + + - - - 4,5 + - - + 0,025 4.11 K W - + + + - - 2 6 2,5 - - ++ - 0,086 4.12 A AbzZ - - - + - - - - 2,5 + - ++ ++ 0,047 4.13 K W + - + + - - - - 4,5 + - + + 0,072 4.14 K W - - - + - - - - 4,5 + - - + 0,041 4.15 A W + + + - + - 3 7 3,5 - + ++ ++ 0,073 4.16 K VKat + + + + - - 4 7 4,5 + - + + 0,123 4.17 A W - - - + - - - - 4,5 + - - ++ 0,049 4.18 A Hoden + + + + - - 2 8 4,5 - + ++ ++ 0,319 4.19 A W + - + + + - - - 4,5 + - ++ + 0,105 4.20 A W + + + + + - 3 7 4,5 - + ++ +++ 0,067 4.22 A W - + - + - - 1 8 2,5 - - ++ - 0,118 4.23 K W - + + + - - 2 8 3,5 - - + - 0,056 4.24 A W + - + + - - - - 4,5 + - + + 0,130 4.25 K W - - + + - - - - 4,5 - - ++ - 0,095 4.26 K W - + + + - - 2 6 2,5 - - ++ - 0,193 4.27 K U + - + + - - - - 4,5 - + +++ ++ 0,037 4.28 A U - - + + - - - - 4,5 + - - - 0,065 4.29 K U - - + - - - - - 2,5 - - - - 0,300 4.30 A U + + + + - - 2 9 4,5 - - - - 0,443 4.31 A U - - - - - - - - 3,5 - - - - 0,051 4.32 A U - + + - - - - - 4,5 - - - - 0,175 4.33 K U + - + + - - - - 4,5 + - + + 0,140 4.34 K U + + + + - - 2 8 4,5 - + ++ ++ 1,525 4.35 K U + + + + + - 3 7 4,5 - + +++ ++ 0,263 4.36 A U + - + + - - - - 3,5 + + +++ ++ 0,110 5.2 K Gewebe + + + - - - 2 8 4,5 - - - - 0,065 5.4 K Blut - - + + - + - - 2,5 - - - - 0,127 5.5 K PEG - - + + - - - - 4,5 + - - - 0,190 5.6 K W + - + + - - - - 4,5 + - + + 0,122 5.10 K Blut + + + + - - 2 8 4,5 + (+) + ++ 0,198 5.11 K Pleura + + + + - - 3 9 4,5 + - + + 0,308 5.12 K Asc - + + + - - 2 6 3,5 - - - - 0,288 5.15 K Asc - - + - - - - - 2,5 - - - - 0,071 5.16 K Serom - + - + - - 2 6 2,5 - - - - 0,112 5.17 K Blut + - + + - - - - 4,5 + (+) + + 0,133 806 K S - + - + - - 2 1 4,5 - - - - 0,019 812 K S - + + - - - 2 8 2,5 - - - - 0,439 815 K S + + + + + - 3 7 3,5 + - - ++ 0,058 817 K S + - + + - - - - 3,5 - - ++ ++ 0,192 827 K S - - + + - + - - 2,5 + - - - 0,412 842 K S - + - + - - 2 9 3,5 - - ++ - 0,144 926 K S - + - + - - 2 1 3,5 + - - - 0,135 Anhang 155 Tab. 22 Daten E. faecalis Isolate aus verschiedenem klinischen Material – VF (Fortsetzung) Isolat K/A/ Umw Ma- terial cylA esp asa1 gelE ef0591 bee espA espC aceB GelE β- Häm E.fc JH2-2 E.fm 64/3 BF 927.3 K S - - - + - - - - 3,5 - - - - 0,096 941.2 K S - - + + - - - - 3,5 + - - - 0,097 950 K S + + + + + - 3 8 3,5 + - + + 0,127 951 K S - - + - - - - - 2,5 - - - - 0,100 964.2 K S + + + - + - 3 7 3,5 - + ++ ++ 0,083 968.2 K S + + + - + - 3 10 3,5 - + ++ ++ 1,295 975 K S - - - + + - - - 4,5 + - - - 0,086 981 K S + + + + - - 2 7 3,5 - + ++ ++ 0,114 982.1 K S - - + + + - - - 4,5 + - - - 0,123 983 K S + - - + - - - - 2,5 + + + - 0,070 986 K S - + - + - - 2 10 3,5 - - - - 1,348 988 K S - + + + - - 1 7 2,5 - - ++ - 0,235 996.2 K S - - + - - - - - 1,5 - - ++ - 0,048 999 K S + + + + + - 3 8 3,5 + - + ++ 0,039 1000 K S - + + + - - 2 6 4,5 + - - ++ 0,149 1001.1 K S - - + + + - - - 4,5 + - - - 0,112 1/3 Umw G - - - + - - - - 5,5 + - - - 0,071 2e Umw Gew - - - - - - - - 4,5 - - - - 0,051 R1 Umw Ra - + + + - - 3 - 3,5 + - - - 0,075 R2 Umw Ra - - - + - - - - 4,5 + - - - 0,076 6.3 K U + - + + - - nb nb 4,5 - + +++ ++ 0,036 6.4 K W - - + + - - nb nb 4,5 + - - ++ 0,086 6.5 K U - - + + + - nb nb 4,5 - - - - 0,577 6.6 K W + + + - + - 3 7 3,5 - + ++ ++ 0,051 6.8 K U - + - + - - 2 6 3,5 + - + ++ 1,738 6.9 K W - - + + - - nb nb 2,5 + - - ++ 0,146 6.12 K W + + + - + - 3 7 3,5 - + ++ ++ 0,073 6.14 K Galle - - + + - - nb nb 2,5 - - ++ - 0,085 6.15 K W + + + - + - 3 7 3,5 - + ++ ++ 0,129 6.16 K U - - + + - - nb nb 4,5 + - - - 0,294 6.17 K U + + + - + - 3 2 3,5 - + ++ ++ 0,047 6.18 K Blut - - - - - - nb nb 3,5 - - ++ + 0,080 6.19 K U - - + + - - nb nb 4,5 - - ++ - 0,364 6.20 K U - + + + - - 2 6 4,5 + - - ++ 0,053 6.21 K U - - + - - - nb nb 2,5 - - - - 0,145 6.23 K U - + - + - - 1 7 3,5 - - - - 0,191 6.25 K U + + + + - - 2 6 4,5 - - ++ - 0,521 6.26 K U - + + + - - 2 4 2,5 - - ++ ++ 0,138 6.27 K W - + - + - - 2 6 3,5 - - - - 1,009 6.29 K U - + + + - - 1 7 5,5 - - - - 0,060 6.30 K U - - - + - - nb nb 4,5 + - - - 0,143 6.31 K U + + + - + - 3 7 3,5 - + + ++ 0,097 6.32 K U - + + + - - 2 7 2,5 - - - - 0,363 6.33 K U + + + + - - 3 6 3,5 - + +++ ++ 0,247 6.34 K U - - - + - - nb nb 4,5 - - - - 0,158 6.36 K W + - + + - - nb nb 4,5 + - + + 0,361 6.37 K B op - + - + - - 2 8 4,5 + - - ++ 0,641 6.38 K W + + + + + - 3 7 4,5 - + ++ ++ 0,323 6.39 K W - + - + - - 2 6 2,5 - - ++ - 0,352 6.40 K TEP + + + + + - 3 7 4,5 + - + - 0,246 6.41 K Blut + + + + - - 2 6 3,5 + - + - 2,981 6.42 K Pericard - + - + - - 2 6 3,5 - - ++ - 2,130 6.45 K Asc + + + + - - 3 10 3,5 + - - + 0,468 S1 K U - - - + - - - - 3,5 + - - + 0,067 Anhang 156 Tab. 23 Zusätzliche Daten E. faecalis Isolate aus verschiedenem klinischen Material – Antibiogramme und Antibiotikaresistenzgen-Nachweise Alle Isolate VA und TEC sensibel, außer Isolat S1 (VA+, TEC+, vanA+); alle Isolate AMP sensibel, außer Isolate 982.1 und 1001.1 AMP(+). +, Ab-Resistenz bzw. Nachweis des Gens; -, Ab-Sensitivität bzw. kein Nachweis des Gens; (+), intermediäres Verhalten gegenüber dem Ab; K, Herkunft Krankenhaus; A, Herkunft niedergelassener Arzt; Umw, Herkunft Umwelt; TC, Tetrazyklin; E, Erythromycin; HLR-GM/SM, High-Level-Resistenz Gentamicin bzw. Streptomycin; CIP, Ciprofloxacin; OFX, Ofloxacin; RD, Rifampicin; ermB, aac-aph, tetM, Nachweis der Gene; S, Stuhl; U, Urin; Abz, Abszess; W, Wunde; Pan, Pankreas; V, Vagina; P, Penis-Abstrich; Vul, Vulva-Abstrich; Cer, Cervix; Dia, Dialysewasser; VKat, Venenkatheter; PEG, Perikutane endoskopische Gastrostomie; Rach, Rachenabstrich; H op, Hüftgewebe operativ; AbzZ, Zahnabszess; TEP, Totalendoprothese; Asc, Aszites; B op, Bauchhöhlenabstrich operativ; G, Geflügelkot; Ra, Rattenkot; Gew, Gewässer Isolat Herkunft Material TC E HLR-GM HLR- SM CIP OFX RD ermB aac- aph tetM 8 K S - - - - - (+) - - - - 30 K S + - - - - (+) + - - + 47 A S + + - - - - + + - + 63 K S + + + + - (+) + + + + 73 A S + + - - - (+) (+) + - + 77 A S + (+) - - - - - - - - 79 A S - + - - - (+) - + - - 82 A S + - - - - (+) (+) - - + 84 A S - - - - - (+) - - - - *2 K S - - - - - (+) - - - - *4 K S - (+) - - - + - - - - *5 K S - - - - - (+) - - - - *6 K S + + - + + + - + - + *7 K S + + + - - (+) - + + + *8 K U + + + + + + - + + + *9 K U + - - - - (+) - - - + *10 K U - - - - - (+) + - - - 1.1 A V - - - - - - - - - - 1.2 A W - - - - - - + - - - 1.3 A V + + - + - + + + - + 1.4 A P + - - - - - (+) - - + 1.6 K W + - - + - - + - - + 1.7 A Vul - - - - - + + - - - 1.8 A V + (+) - - - - + - - + 1.9 A V + - - - - - (+) - - + 1.10 A V - - - - - + - - - - 2.2 K W + + + + + + + + + + 2.3 A Dia - - - - - - (+) - - - 2.4 A W - + - - - - (+) + - - 2.6 A U + - - - - + (+) - - + 2.7 K U + - + + + + - - + + 2.8 A U - + - - - - (+) + - - 2.9 A U - - - - + + (+) - - - 2.10 A U + + + + + + - + + + 2.11 A V + - - - - - + - - + 2.12 A V + - - - - - + - - + 3.2 K U + + + + + + - + + + 3.5 K U + + - - - - - + - + 3.6 A U + - - - - - + - - + 3.7 K U + + + + + + - + + + 3.8 K U - - - - - - (+) - - - 3.9 A Cer + + - - - (+) - + - + 3.10 A U + - - - - - - - - + 3.14 K VKat + + - + + + + + - - 4.1 A V - - - - - (+) - - - - Anhang 157 Tab. 24 Zusätzliche Daten E. faecalis Isolate aus verschiedenem klinischen Material – Antibiogramme und Antibiotikaresistenzgen-Nachweise (Fortsetzung) Isolat Herkunft Material TC E HLR-GM HLR- SM CIP OFX RD ermB aac- aph tetM 4.2 K U + + + + + + - + + + 4.3 K U + (+) - - - - - - - + 4.4 K Abz + (+) - - - (+) - - - + 4.5 K PEG + (+) - + - (+) + - - + 4.6 A V + (+) - - - - - - - + 4.7 K V + - - - - (+) - - - + 4.8 A Rach + + + - + + - + + + 4.9 A V + (+) - - (+) + - - - + 4.10 K H op - (+) - - - + + - - - 4.11 K W - - - - - (+) - - - - 4.12 A AbzZ - - - - - (+) - - - - 4.13 K W + + + + + + - + + + 4.14 K W - - - - - + + - - - 4.15 A W + + + + - (+) - + + + 4.16 K VKat + + + + + + - + + + 4.17 A W + (+) - - - + + - - + 4.18 A Hoden + + + - + + - + + + 4.19 A W + + + - + + - + + + 4.20 A W + + - + + + - + - + 4.22 A W + - - - - (+) + - - + 4.23 K W + (+) - + - (+) - - - + 4.24 A W + + + + + + - + + + 4.25 K W - (+) - - - (+) - - - - 4.26 K W - - - - - - - - - - 4.27 K U + + - + + + - + - + 4.28 A U + (+) - - + + (+) - - + 4.29 K U - - - - - (+) - - - - 4.30 A U + (+) - - + + - - - + 4.31 A U + + - + - (+) - + - + 4.32 A U + (+) - - - (+) - - - + 4.33 K U + + + + + + - + + + 4.34 K U + + - - + + - + - + 4.35 K U + + - + + + - + - + 4.36 A U + (+) - - - - + - - + 5.2 K Gewebe + + - + + + + + - + 5.4 K Blut - - - - - - (+) - - - 5.5 K PEG + (+) - + + + + - - + 5.6 K W + + + + + + + + + + 5.10 K Blut + - - + - (+) + - - + 5.11 K Pleura + + + + + + + + + + 5.12 K Asc + - - + (+) + + - - - 5.15 K Asc - - - - - (+) + - - - 5.16 K Serom + - - - - - + - - + 5.17 K Blut + + + + + + + + + + 806 K S - - - - - (+) - - - - 812 K S + + - + + (+) (+) + - + 815 K S + + + + - + + + + + 817 K S + (+) - - - (+) - - - + 827 K S - (+) - - - (+) - - - - 842 K S + - - + - + - - - + 926 K S - - - - - + - - - - 927.3 K S - - - - - (+) + - - - 941.2 K S - - - - (+) + + - - - 950 K S + + + + (+) + + + + + Anhang 158 Tab. 25 Zusätzliche Daten E. faecalis Isolate aus verschiedenem klinischen Material – Antibiogramme und Antibiotikaresistenzgen-Nachweise (Fortsetzung) Isolat Herkunft Material TC E HLR-GM HLR- SM CIP OFX RD ermB aac- aph tetM 951 K S - (+) - - (+) + (+) - - - 964.2 K S + + + + - + + + + + 968.2 K S + + + + - (+) + + + + 975 K S - (+) - - - + + - - - 981 K S + + - - - (+) - + - + 982.1 K S - + - - + + (+) + - - 983 K S + + - - - (+) - + - + 986 K S - - - - - + + - - - 988 K S + (+) - - (+) + - - - + 996.2 K S - - - - - (+) - - - - 999 K S + + + + - + + + + + 1000 K S + (+) - - - (+) - - - + 1001.1 K S + + + + + + - + + + 1/3 Umw G + - - - - (+) + - - - 2e Umw Gew + - - - - - - - - + R1 Umw Ra - (+) - - - (+) + - - + R2 Umw Ra - (+) - - - (+) (+) - - - 6.3 K U + + - + + + - + - + 6.4 K W + - - - - - + - - + 6.5 K U + + + - + + + + + + 6.6 K W + + + - - (+) + + + + 6.8 K U + - - - - (+) + - - + 6.9 K W - - - - - - + - - - 6.12 K W + + - + - (+) + + - + 6.14 K Galle - - - - - - + - - - 6.15 K W + + - + - (+) + + - + 6.16 K U + + + - + + (+) + + + 6.17 K U + - - - - (+) + - - + 6.18 K Blut + + - + - (+) + + - - 6.19 K U + + + - + - (+) + + + 6.20 K U + - - - - (+) + 6.21 K U - - - - - (+) + - - - 6.23 K U + - - - - - + - - + 6.25 K U + + + - + + - + + + 6.26 K U + - - - - (+) + - - + 6.27 K W - - - - - (+) + - - - 6.29 K U (+) + + + + + + + + - 6.30 K U + - - - (+) (+) + - - + 6.31 K U + + + + - (+) + + + + 6.32 K U + - - - - (+) + - - + 6.33 K U + + + - - (+) + + + + 6.34 K U + + + - + + + + + + 6.36 K W + + + + + + + + + + 6.37 K B op + - - - - - + - - + 6.38 K W + + - + + + (+) + - + 6.39 K W - - - - - - + - - - 6.40 K TEP + + + - + + + + + + 6.41 K Blut + + - - + + + + - + 6.42 K Pericard + + - + - (+) + + - + 6.45 K Asc + + - - - - + + - + S1 K U + nb nb nb - nb + + - + Anhang 159 Tab. 26 Daten E. faecium aus verschiedenem klinischen Material – Virulenzfaktoren +, positiver Nachweis; -, kein Nachweis des Gens bzw. des Phänotyps; esp, hyl, Nachweis der Gene; espA, espC, Anzahl der A- bzw. C-Repeats des esp Gens; E.fm 64/3, E.fc JH2-2, Bacteriocin-Produktion gegenüber des Indikatorstamms E. faecium 64/3 bzw. E. faecalis JH2-2, + (≤ 1 mm), ++ (2-4 mm), +++ (> 4 mm); BF, Biofilm-Bildung, angegeben als OD595-Mittelwerte aus mindestens drei Messungen mit jeweils vier Replikaten; VNTR, Variable-Number Tandem-Repeat; nb, nicht bestimmt; nbb, nicht bestimmbar; MT, MLVA-Typ; K, Herkunft Krankenhaus; A, Herkunft niedergelassener Arzt; Umw, Herkunft Umwelt; S, Stuhl; U, Urin; Abz, Abszess; W, Wunde; Pan, Pankreas; V, Vagina; VKat, Venenkatheter; Per, Peritonitis; Asc, Ascites; Li, Liquor; PB, Punktat Bauch; B op, Bauchhöhlenabstrich operativ; Mi, Milz; TS, Trachealsekret; G, Geflügelkot; Ri, Rinderkot; B, Boden; Gew, Gewässer; Isolat K/A/ Umw Ma- terial esp hyl espA espC E.fc JH2-2 E.fm 64/3 BF VNTR 1-2-7-8-9-10 MT 5 K S - + - - - - 0,016 5 7 3 3 2 3 1 10 K S + - 6 6 - - 0,023 5 7 3 3 2 3 1 11 K S + + 4 6 - - 0,012 5 7 3 3 2 3 1 29 K S + - 6 6 - - 0,023 5 7 3 3 2 3 1 45 A S - - - - - - 0,032 3 6 1 4 1 1 86 72 A S - - - - - - 0,018 6 4 3 1 1 1 89 83 A S - - - - - - 0,011 3 5 1 4 1 3 292 85 A S - - - - +++ - 0,015 6 7 2 4 2 3 59 88 K S + - 6 6 - ++ 0,015 5 7 3 3 2 3 1 *11 K S + + 1 6 - - 0,011 5 7 3 2 2 3 5 *12 K S - + - - - - 0,031 5 7 3 3 2 3 1 *13 K S + - 4 5 +++ +++ 0,066 5 7 3 3 2 3 1 *14 K S + - 1 6 - - 0,013 5 7 3 2 2 3 5 *15 K S - - - - +++ ++ 0,038 5 6 6 2 1 3 nbb *16 K U + + 4 6 - - 0,019 5 7 3 3 2 3 1 *17 K Abz - + - - - - 0,016 5 7 3 3 2 3 1 1.5 K Blut - - - - +++ + 0,012 5 7 2 4 2 3 53 2.1 K W + + 4 6 +++ - 0,007 5 7 3 3 2 2 7 2.13 K Pan + - 4 6 - - 0,012 5 7 3 3 2 2 7 3.1 A U + - 4 6 +++ - 0,026 5 7 3 3 1 2 159 3.3 K V + + 4 6 +++ - 0,020 5 7 3 3 1 2 159 3.4 K U + + 4 6 +++ - 0,018 5 7 3 3 1 2 159 3.11 A U + + 4 6 +++ - 0,021 5 7 3 3 1 2 159 3.12 K U + - 4 6 +++ - 0,023 5 7 3 3 1 2 159 3.13 K VKat + + 4 6 +++ - 0,013 5 7 3 3 1 2 159 4.21 A W + + 6 6 - - 0,023 5 7 3 3 2 3 1 5.1 K VKat + + 4 6 + - 0,012 5 7 3 3 1 3 12 5.3 K Blut - - - - - - 0,015 5 7 3 3 2 3 1 5.7 K W + + 4 6 - - 0,237 5 7 3 3 2 3 1 5.8 K Per - + - - - - 0,021 5 7 3 3 2 3 1 5.13 K Blut + + 4 6 - - 0,012 5 7 3 3 1 2 159 5.14 K Asc + + 4 6 ++ - 0,015 5 7 3 3 1 2 159 5.18 K Blut + + 4 6 ++ - 0,020 5 7 3 3 1 2 159 814 K S - - - - - - 0,015 6 4 3 1 1 1 89 822 K S - - - - - - 0,032 5 7 3 3 2 3 1 853 K S - - - - - - 0,014 5 7 3 3 2 3 1 874 K S - - - - +++ ++ 0,012 6 7 5 4 1 3 58 888 K S + - - 6 +++ - 0,049 5 7 3 3 1 3 12 892 K S - - - - - - 0,026 5 4 1 3 1 2 121 894 K S - - - - +++ +++ 0,018 6 7 5 4 1 3 58 909 K S - - - - - - 0,054 5 7 3 3 2 3 1 913 K S - - - - - - 0,056 6 4 3 1 1 1 89 917.1 K S - - - - - - 0,017 5 7 3 3 2 3 1 947 K S + - - 6 +++ +++ 0,032 5 7 3 3 1 3 12 954 A S - - - - - - 0,031 6 4 3 1 1 1 89 984 K S - - - - - - 0,019 5 7 3 3 2 3 1 1/2 Umw G - - - - - - 0,013 5 7 5 6 1 3 nbb Anhang 160 Tab. 27 Daten E. faecium aus verschiedenem klinischen Material – VF (Fortsetzung) Isolat K/A/ Umw Ma- terial esp hyl espA espC E.fc JH2-2 E.fm 64/3 BF VNTR 1-2-7-8-9-10 MT 1/11 Umw G - - - - - - 0,016 3 nbb 4 2 1 3 nbb 2i Umw G - - - - - - 0,023 3 nbb 4 2 1 3 nbb 6K1 Umw Ri - - - - - - 0,008 3 nbb 4 2 1 2 nbb 6H2 Umw G - - - - - - 0,015 6 nbb 4 2 1 2 nbb 6H3 Umw G - - - - - - 0,015 3 nbb 4 2 1 2 nbb A(3) Umw B - - - - - - 0,014 5 nbb 7 3 1 5 nbb D(1) Umw B - - - - +++ - 0,038 nbb 6 5 4 2 4 nbb A(1) Umw G - - - - - - 0,022 5 8 4 2 1 1 nbb D(8) Umw G - - - - - - 0,013 5 4 2 1 1 nbb H(6) Umw Gew - - - - - - 0,014 5 7 5 5 1 3 nbb B3 K Asc - - - - - - 0,017 5 7 3 3 2 3 1 B4 K U - + - - +++ - 0,023 5 7 3 3 2 2 7 B5 K Asc - + - - +++ - 0,013 5 7 3 3 2 2 7 B7 K Li - - - - - - 0,089 5 7 3 3 2 2 7 T1 K Per - - - - - - 0,036 5 7 3 3 2 2 7 6.1 K U + + 4 6 ++ - 0,014 5 7 3 3 1 2 159 6.2 K Blut + + 5 6 - - 0,024 5 3 3 3 2 2 nbb 6.7 K PB + + 4 6 - - 0,016 5 7 3 3 1 2 159 6.10 K W - + nb nb - - 0,023 5 7 3 3 2 3 1 6.11 K B op + + 4 6 ++ - 0,012 5 7 3 3 1 2 159 6.22 K U + + 4 6 ++ - 0,022 5 7 3 3 1 2 159 6.24 K U + + 4 6 - - 0,022 5 7 3 3 1 2 159 6.35 K U + + 4 6 - - 0,021 5 7 3 3 2 2 7 6.43 K Mi - - - - - - 0,025 5 7 3 3 2 2 7 6.44 K Per - + - - - - 0,026 5 7 3 3 2 3 1 6.46 K Per - + - - - - 0,015 nb nb nb nb nb nb nb 6.47 K W + + 4 6 ++ - 0,018 5 7 3 3 2 2 7 B9 K VKat - + - - +++ + 0,012 5 7 3 3 2 2 7 S3 K W - + - - - - 0,010 nb nb nb nb nb nb nb S4 K TS + - 4 6 +++ - 0,010 nb nb nb nb nb nb nb S5 K TS + - 4 6 +++ - 0,013 nb nb nb nb nb nb nb Anhang 161 Tab. 28 Zusätzliche Daten E. faecium Isolate aus verschiedenem klinischen Material – Antibiogramme und Antibiotikaresistenzgen-Nachweise Nur Isolat S3 vanB+. +, Ab-Resistenz bzw. Nachweis des Gens; -, Ab-Sensitivität bzw. kein Nachweis des Gens; (+), intermediäres Verhalten gegenüber dem Ab; K, Herkunft Krankenhaus; A, Herkunft niedergelassener Arzt; U, Herkunft Umwelt; S, Stuhl; U, Urin; Abz, Abszess; W, Wunde; Pan, Pankreas; V, Vagina; VKat, Venenkatheter; Per, Peritonitis; Asc, Aszites; Li, Liquor; PB, Punktat Bauch; B op, Bauchhöhlenabstrich operativ; Mi, Milz; TS, Trachealsekret; G, Geflügelkot; Ri, Rinderkot; B, Boden; Gew, GewässerVA, Vancomycin; TEC, Teicoplanin; AMP, Ampicillin; TC, Tetrazyklin; E, Erythromycin; HLR-GM/SM, High-Level-Resistenz Gentamicin bzw. Streptomycin; CIP, Ciprofloxacin; OFX, Ofloxacin; QD, Quinupristin-Dalfopristin; RD, Rifampicin; vanA, ermB, aac-aph, tetM, Nachweis der Gene, +, positiver Nachweis des Gens, -, Gen nicht detektiert. Isolat K/A/ Umw Ma- terial VA TEC AMP TC E HLR- GM HLR- SM CIP OFX QD RD vanA ermB aac- aph tetM 5 K S - - + + + - - + + - + - + - + 10 K S - - + - + - + + + - (+) - + - - 11 K S - - + + + - + + + - + - + - + 29 K S - - + - + + + + + - + - + + - 45 A S + + + + + - + + + - + + + - + 72 A S + + + + (+) - - - - - - + - - + 83 A S - - - - (+) - - + + - + - - - - 85 A S - - - - (+) - - + + - + - - - - 88 K S - - + - + + - + + - (+) - + + - *11 K S - - + - + - + + + - - - + - - *12 K S - - + - + + + + + - + - + + + *13 K S - - + - + - - + + - (+) - + - - *14 K S - - + + + - - + + - - - - - + *15 K S - - - + (+) - + - + - - - - - + *16 K U - - + + + - + + + - + - + - + *17 K Abz - - + + + - + + + - + - + - + 1.5 K Blut - - - + + - - + (+) - + - - - + 2.1 K W - - + - + - - + + - + - + + - 2.13 K Pan - - + - + - - + + - + - + - - 3.1 A U - - + - + - + + + - - - + - - 3.3 K V - - + - + + + + + (+) + - + + - 3.4 K U - - + + + + + + + (+) + - + + + 3.11 A U - - + - + + + + + - - - + + - 3.12 K U - - + + + - + + + (+) + - + - - 3.13 K VKat - - + - + + + + + (+) + - + + - 4.21 A W - - + - + + + + + - + - - + + 5.1 K VKat - - + - + + + (+) + - + + - 5.3 K Blut - - + + + - - + + - - - - - + 5.7 K W + + + - + + - + + - + + + + - 5.8 K Per + + + - + - - + + - + + + - - 5.13 K Blut - - + - + + - + + (+) + - + + - 5.14 K Asc + + + - + + + + + - + + + + - 5.18 K Blut - - + - + + + + + (+) + - + + - 814 K S + + - + + - - - (+) (+) - + + - + 822 K S - - + - + - - + + - + - + - - 853 K S - - + - + - - + + - + - + - - 874 K S - - + + + - + (+) + (+) (+) - + - + 888 K S + + + + + - - + + - + + + - + 892 K S - - (+) - (+) - - (+) + (+) - - - - - 894 K S - - + + + - + (+) + (+) + - + - + 909 K S - - + - + - - + + - + - + - - 913 K S + + - + + - - - (+) (+) - + + - + 917.1 K S - - + - + - - + + - + - + - - 947 K S + + + + + - - + + - + + + - + 954 A S + + - + + - - - + (+) - + + - + 984 K S - - + - + - + (+) + (+) + - + - - Anhang 162 Tab. 29 Zusätzliche Daten E. faecium Isolate aus verschiedenem klinischen Material – Antibiogramme und Antibiotikaresistenzgen-Nachweise (Fortsetzung) Isolat K/A/ Umw Ma- terial VA TEC AMP TC E HLR- GM HLR- SM CIP OFX QD RD vanA ermB aac- aph tetM 1/2 Umw G - - - - (+) - - (+) (+) - + - - - - 1/11 Umw G - - - - (+) - - (+) + - - - - - - 2i Umw G - - - - (+) - - (+) + - - - - - - 6K1 Umw Ri - - (+) - (+) - - (+) (+) - - - - - - 6H2 Umw G - - - + (+) - - (+) (+) - - - - - + 6H3 Umw G - - - + - - - (+) + - - - - - + A(3) Umw B - - - - (+) - - - (+) - - - - - - D(1) Umw B - - - - (+) - - (+) + - + - - - - A(1) Umw G - - - - (+) - - (+) + - - - - - - D(8) Umw G - - - - (+) - - (+) + - - - - - - H(6) Umw Gew - - - - (+) - - (+) + - (+) - - - - B3 K Asc + + + - + - - + + - + + + - - B4 K U + + + - + + - + + - + + + + - B5 K Asc + + + - + + - + + - + + + + - B7 K Li + + + - + - - + + - + + + - - T1 K Per + + + - + - + + - + + + - - 6.1 K U - - + - + + + + + - + - + + - 6.2 K Blut - - + - (+) + - + + - + - - + - 6.7 K PB - - + - + - + + + (+) + - + - - 6.10 K W - - + + + + - + + - + - - + + 6.11 K B op - - + - + + + + + (+) + - + + - 6.22 K U - - + - + + + + + - + - + + - 6.24 K U - - + - - + + + + - + - - + - 6.35 K U - - + - + + + + + (+) + - + + - 6.43 K Mi - - + - + + + + + - + - + + + 6.44 K Per - - + + + + - + + - + - - + + 6.46 K Per - - + + + + + + + (+) + - + + + 6.47 K W - - + - + + + + + - + - + + - B9 K VKat + + + - + + - + + - + + + + - S3 K W + - + + nb nb nb + nb - + - + + + S4 K TS + + + + + nb nb + + - + + + + + S5 K TS + + + + + nb nb + + - + + + + + Anhang 163 Tab. 30 Daten E. faecalis Isolate aus Vaginalabstrichen - BV positiv Bei allen Stämmen wurde keine Lipase-Produktion oder der bee Locus (bee1-3) nachgewiesen. +, positiver Nachweis; -, kein Nachweis des Gens bzw. des Phänotyps; GelE, Gelatinase-Produktion; β-Häm, β-Hämolyse-Nachweis; gelE, cylA, esp, asa1, Nachweis der Gene; H2O2, H2O2-Produktion, +, schwach, ++, stark; E.fm 64/3, E.fc JH2-2, Bacteriocin-Produktion gegenüber des Indikatorstamms E. faecium 64/3 bzw. E. faecalis JH2-2, + (≤ 1 mm), ++ (2-4 mm), +++ (> 4 mm); BF, Biofilm-Bildung, angegeben als OD595-Mittelwerte aus mindestens drei Messungen mit jeweils vier Replikaten BV Nr. Labor-Code GelE β-Häm DNase E.fm 64/3 E.fc JH2-2 H2O2 cylA esp asa1 gelE BF 157 GB HC20 420 + - - + + + + + + + 4,033 163 GB HC26 361 + - - +++ +++ + + + + + 3,983 154 GB HCO6 496 + - + + + + + + + + 3,973 53 GB GF13 5273 - - - - - ++ - + - + 0,704 141 GB GH11 5188 - - - - - ++ - + + + 0,696 142 GB GJ17 5153 - - - + ++ + - - - - 0,568 152 GB HC01 33 - - - - - ++ - + + + 0,412 10 GB GF01 5272 - - - - + + - + - + 0,391 109 GB GG18 5141 + - - - - + + + + + 0,388 149 GB HB16 5049 - - - - - + - + + - 0,367 138 GB GH04 23 + - - + + ++ - + - + 0,352 153 GB HB26 587 + - - +++ + ++ + + + + 0,339 114 GB GG21 539 - - - - - ++ - + + - 0,330 147 GB GJ24 5161 - + - +++ +++ + + - + + 0,321 156 GB HC16 5263 - - - - + ++ - + + + 0,314 158 GB HC20 5002 - - - - - ++ - + - + 0,314 43 GB GF17 7 - + - +++ +++ ++ + - - + 0,293 123 GB GG26 538 - - + - - ++ - + + + 0,261 150 GB HB16 60 - + - +++ +++ ++ + + + - 0,257 12 GB GF01 5020 + - - + ++ + + - + + 0,257 161 GB HC22 31 + - + + ++ ++ + - + + 0,243 100 GB GG14 5280 + - - ++ + ++ + + + + 0,239 145 GB GJ23 456 + - - + + + + - + + 0,226 139 GB GH08 360 + - - ++ - ++ - - - + 0,203 146 GB GJ24 760 + - + +++ +++ ++ - - + + 0,195 151 GB HC01 569 + - - - + ++ - - - + 0,186 164 GB HF13 6005 - - - - - ++ - + - + 0,164 133 GB GG31 115 + - - ++ + ++ + - - + 0,160 160 GB HC21 5007 + - - ++ - ++ - + - + 0,157 132 GB GG28 316 - + - ++ +++ ++ + - + - 0,119 131 GB GG27 24 + - - ++ + ++ - - - + 0,119 165 GB HF19 6012 + - + - - ++ - - + + 0,115 162 GB HC26 223 + - - + + ++ + + + + 0,091 80 GB GG11 592 - - - - - ++ - - + + 0,078 75 GB GG10 629 + - - ++ - ++ - - + + 0,076 148 GB GJ27 433 + - - ++ + ++ + - + + 0,075 155 GB HCO6 839 + - - - - ++ - - - + 0,073 111 GB GG19 384 + - - ++ - ++ - - - + 0,057 140 GB GH08 310 - + - ++ ++ ++ + + + - 0,044 137 GB GH03 440 + - - ++ - ++ - - + + 0,025 Anhang 164 Tab. 31 Zusätzliche Daten E. faecalis Isolate aus Vaginalabstrichen – BV positiv G.vg, Gardnerella vaginalis; E.fc, E. faecalis; -, negativer Befund; +, vereinzelter Nachweis; ++, mäßiges Vorkommen; +++, reichliches Vorkommen; E. coli, Escherichia coli; M. morganii, Morganella morganii; E. aerogenes, Enterobacter aerogenes; K. pneumoniae, Klebsiella pneumoniae; U. urealyticum, Ureaplasma urealyticum; M. hominis, Mycoplasma hominis; C., Candida spp.; CC, Clue Cells Nr. BV Labor-Code an- aerob Döder- lein- Flora Anzahl E.fc Weitere MO aerob Mycoplasmen/ Ureaplasmen Pilze Mikro- skopie 157 GB HC20 420 G.vg - ++ - - - CC 163 GB HC26 361 G.vg - ++ Citrobacter spp. - - CC 154 GB HCO6 496 G.vg - + - - - CC 53 GB GF13 5273 G.vg + ++ - - - CC 141 GB GH11 5188 G.vg + ++ - - C. albicans CC 142 GB GJ17 5153 G.vg - ++ E. coli - - CC 152 GB HC01 33 G.vg + ++ - - - CC 10 GB GF01 5272 G.vg - ++ E. coli - C. glabrata CC 109 GB GG18 5141 G.vg - ++ - - - CC 149 GB HB16 5049 G.vg - ++ M. morganii - - CC 138 GB GH04 23 G.vg - ++ E. coli - - CC 153 GB HB26 587 G.vg - + - U. urealyticum - CC 114 GB GG21 539 G.vg - ++ - - C. albicans CC 147 GB GJ24 5161 G.vg + ++ - Mycoplasmen/ Ureaplasmen - CC 156 GB HC16 5263 G.vg - ++ - Mycoplasmen - CC 158 GB HC20 5002 G.vg - ++ - - - CC 43 GB GF17 7 G.vg - ++ - U. urealyticum - CC 123 GB GG26 538 G.vg - +++ E. coli - - CC 150 GB HB16 60 G.vg - ++ - - - CC 12 GB GF01 5020 G.vg - ++ E. aerogenes - - CC 161 GB HC22 31 G.vg - ++ - - - CC 100 GB GG14 5280 G.vg - ++ - - C. albicans CC 145 GB GJ23 456 G.vg - ++ - M. hominis - CC 139 GB GH08 360 G.vg - ++ E. coli - - CC 146 GB GJ24 760 - - ++ - U. urealyticum - CC 151 GB HC01 569 G.vg - ++ - U. urealyticum - CC 164 GB HF13 6005 G.vg - ++ - - - CC 133 GB GG31 115 G.vg - ++ E. coli - CC 160 GB HC21 5007 G.vg - ++ Citrobacter spp. - - CC 132 GB GG28 316 G.vg - ++ E. coli U. urealyticum - CC 131 GB GG27 24 G.vg - ++ E. coli - - CC 165 GB HF19 6012 G.vg - ++ - - - CC 162 GB HC26 223 G.vg - ++ E. coli - - CC 80 GB GG11 592 G.vg - ++ - - - CC 75 GB GG10 629 G.vg - ++ E. coli U. urealyticum - CC 148 GB GJ27 433 G.vg - ++ - - C. albicans CC 155 GB HCO6 839 G.vg - ++ - Mycoplasmen - CC 111 GB GG19 384 G.vg - ++ - - C. albicans CC 140 GB GH08 310 G.vg + ++ - - - CC 137 GB GH03 440 G.vg - ++ K. pneumoniae U. urealyticum C. albicans CC Anhang 165 Tab. 32 Daten E. faecalis aus Vaginalabstrichen – BV negativ Bei allen Stämmen wurde keine Lipase-Produktion nachgewiesen. +, positiver Nachweis; -, kein Nachweis des Gens bzw. des Phänotyps; GelE, Gelatinase-Produktion; β-Häm, β- Hämolyse-Nachweis; cylA, esp, asa1, gelE, bee, Nachweis der Gene/Loci; H2O2, H2O2-Produktion, +, schwach, ++, stark; E.fm 64/3, E.fc JH2-2, Bacteriocin-Produktion gegenüber des Indikatorstamms E. faecium 64/3 bzw. E. faecalis JH2-2, + (≤ 1 mm), ++ (2-4 mm), +++ (> 4 mm); BF, Biofilm-Bildung, angegeben als OD595-Mittelwerte aus mindestens drei Messungen mit jeweils vier Replikaten Nr. BV Labor-Code GelE β-Häm DNase E.fm 64/3 E.fc JH2-2 H2O2 cylA esp asa1 gelE bee BF 2 GB GE31 5298 - - - - - + - + - + - 0,641 3 GB GE31 5341 - - - - + + - + - + - 0,414 4 GB GE31 5058 - - - - - + - + - + - 2,001 6 GB GE31 358 - + - ++ ++ - + + + - - 0,076 11 GB GF01 5085 - - - - - ++ - + - + - 0,644 30 GB GF13 5 - - - - - - - - + + - 0,105 19 GB GF13 627 - + - ++ ++ ++ + + + - - 0,095 21 GB GF13 669 - - - - - ++ - + - + - 0,304 32I GB GF13 759 - + - ++ ++ ++ + + + - - 0,514 32II GB GF13 759 + - - + + - + + + + - 1,638 20 GB GF13 5019 + - - + ++ ++ + - + + + 0,574 52 GB GF13 5021 + - - - + ++ - - + + - 0,579 51 GB GF13 5198 - + - ++ ++ ++ + + + + - 0,212 50 GB GF13 5199 + - - ++ + + + - + + - 0,212 39 GB GF13 5217 - - - ++ + + + + + + - 0,277 34 GB GF13 5237 + - - ++ + ++ + - + + - 0,099 31 GB GF13 5267 - + - ++ ++ ++ + + + - - 0,225 33 GB GF13 5269 - - - - - + - - - + - 0,208 58 GB GF14 5204 + - - - - - - - + + - 0,172 44 GB GF17 5013 + - - ++ - ++ - + - + - 0,224 57 GB GF19 342 - + - ++ ++ ++ + + + - - 0,114 64 GB GF19 605 + - - - - + + - + + - 0,235 56 GB GF19 5007 + + - + + + + - + + - 0,389 55 GB GF19 5013 - - - - - ++ - + - - - 0,421 65 GB GF19 5026 + - - + + - + - + + - 0,176 29 GB GF21 5114 - - - - - ++ - - - + - 0,109 66 GB GF23 5058 + - - ++ ++ + + - + + - 0,354 41 GB GF27 5010 + + - + + - + - + + - 0,439 22 GB GF30 40 - + - ++ ++ ++ + + + - - 0,182 24 GB GG03 5006 - - - - - ++ - + + - - 0,140 25 GB GG03 5015 - + - ++ ++ + + - + + - 0,346 35I GB GG03 5215 - - - - ++ ++ - + - + - 0,390 35II GB GG03 5215 - - - - ++ ++ - + + + - 0,357 70 GB GG04 698 + - - ++ - ++ - - + + - 0,198 71 GB GG04 773 - - - - - + - + + - - 0,422 38 GB GG04 5006 - - + - + ++ - + + + - 0,268 36 GB GG04 5208 - + - ++ +++ + + + + - - 0,270 61 GB GG05 5253 + - - ++ + ++ + - + + - 0,243 15 GB GG06 607 - + - ++ ++ ++ + - + - - 0,048 17 GB GG06 5014 + - - - - ++ - - + + - 0,042 Anhang 166 Tab. 33 Zusätzliche Daten zu den E. faecalis Isolaten aus Vaginalabstrichen – BV negativ E.fc, E. faecalis; -, negativer Befund; +, vereinzelter Nachweis; ++, mäßiges Vorkommen; +++, reichliches Vorkommen Nr. BV Labor-Code an- aerob Döderlein- Flora Anzahl E.fc Weitere MO aerob Mycoplasmen/ Ureaplasmen Pilze Mikro- skopie 2 GB GE31 5298 - ++ ++ - - - - 3 GB GE31 5341 - + ++ - - - - 4 GB GE31 5058 - - ++ - - - - 6 GB GE31 358 - ++ ++ - - - - 11 GB GF01 5085 - + +++ - - - - 30 GB GF13 5 - + ++ - - - - 19 GB GF13 627 - + ++ - - - - 21 GB GF13 669 - + ++ - - - - 32I GB GF13 759 - + +++ - - - - 32II GB GF13 759 - + +++ - - - - 20 GB GF13 5019 - + ++ - - - - 52 GB GF13 5021 - + ++ - - - - 51 GB GF13 5198 - + ++ - - - - 50 GB GF13 5199 - + ++ - - - - 39 GB GF13 5217 - + ++ - - - - 34 GB GF13 5237 - + ++ - - - - 31 GB GF13 5267 - + +++ - - - - 33 GB GF13 5269 - + ++ - - - - 58 GB GF14 5204 - - +++ - - - - 44 GB GF17 5013 - + ++ - - - - 57 GB GF19 342 - - +++ - - - - 64 GB GF19 605 - + ++ - - - - 56 GB GF19 5007 - + +++ - - - - 55 GB GF19 5013 - - +++ - - - - 65 GB GF19 5026 - - ++ - - - - 29 GB GF21 5114 - + +++ - - - - 66 GB GF23 5058 - - +++ - - - - 41 GB GF27 5010 - - +++ - - - - 22 GB GF30 40 - + +++ - - - - 24 GB GG03 5006 - + +++ - - - - 25 GB GG03 5015 - - +++ - - - - 35I GB GG03 5215 - + +++ - - - - 35II GB GG03 5215 - + +++ - - - - 70 GB GG04 698 - - +++ - - - - 71 GB GG04 773 - - +++ - - - - 38 GB GG04 5006 - + +++ - - - - 36 GB GG04 5208 - - +++ - - - - 61 GB GG05 5253 - - +++ - - - - 15 GB GG06 607 - - +++ - - - - 17 GB GG06 5014 - + +++ - - - - Anhang 167 -1,8 -1,3 -0,8 -0,3 0,2 0 20 80 12 0 14 0 16 0 18 0 20 0 22 0 24 0 26 0 28 0 30 0 32 0 34 0 36 0 38 0 40 0 42 0 44 0 46 0 48 0 52 0 Zeit [min] lo g( O D 60 0) 1.3 1.3.7 1.10 1.10.16 2.11 2.11.8 1.3 1.3.7 1.10 1.10.16 2.11 2.11.8 µ [1/min] 0,013 0,013 0,014 0,014 0,011 0,011 td [min] 53,3 53,3 48,4 49,1 63,3 62,3 Abb. 36 Wachstumskurven der E. faecalis Wildtyp- und Biofilm-Mutantenstämme Halblogarithmische Darstellung der Wachstumskinetiken, ermittelt durch OD600-Messungen einer Kultur in TSBG, inkubiert bei 37°C und 100 rpm; µ, Wachstumskonstante; td, Generationszeit; µ und td jeweils berechnet aus linearem Abschnitt der exponentiellen Phase der Wachstumskurve. 10 0 90807060 1.3.7 1.3 1.10.16 1.10 2.11.8 2.11 1.4.6 1.4 ▲ Abb. 37 Dendrogramm der BOXA2R-PCR zur Typisierung der E. faecalis Wildtyp- und Biofilm- Mutanten Auswertung der digitalisierten Bilder der entstandenen Fingerprint-Bandenmuster mittels BioNumerics Software; Analyse zum Clustering der Isolate mittels des Korrelationskoeffizienten nach Pearson (Produkt-Moment- Korrelation) und des UPGMA Algorithmus (MRI, Karlsruhe); ▲, Hinweis auf eine deutliche Bande im Fingerprint- Muster des Stamms 1.4, die im Profil des 1.4.6 nicht auftrat. Anhang 168 10 0 50 1.4.6 2.11.8 2.11 1.4 1.10 1.10.16 1.3 1.3.7 Abb. 38 Dendrogramm (schematisches Cluster) der PFGE-Fingerprintmuster zur Typisierung der E. faecalis Wildtyp- und Biofilm-Mutantenstämme Auswertung der digitalisierten Bilder der entstandenen PFGE-Bandenmuster mittels BioNumerics Software; Analyse zum Clustering der Isolate mittels des Dice-Koeffizienten und des UPGMA Algorithmus (MRI, Karlsruhe). Abb. 39 Modell der Biogenese von Pili (Mandlik et al., 2008) Dargestellt am Beispiel der SpaABC-Pili bei Corynebacterium diphtheriae (Ton-That & Schneewind, 2003; Ton- That et al., 2004); Vorläufer der Pili-Proteine (SpaA, hellrot; SpaB, dunkelblau; SpaC, hellblau) werden im Cytoplasma synthetisiert und durch die Membran über den Sec-Komplex translokalisiert (Schritt 1); die Vorläufer bilden daraufhin Acyl-Enzym-Intermediate mit Housekeeping-Sortasen (grün, Schritt 2) oder Pili-spezifischen Sortasen (grau); diese Vorläufer können dann an Lipid II Vorläufern transferiert werden, so dass Pili-Monomere mit der Zellwand verankert werden (Schritt 3); Pili-spezifische Sortasen katalysieren die Pilus-Polymerisation (Schritt 4); die Pilus-Polymerisation endet mit dem Transfer auf Lipid II, was auf zwei verschiedenen Wegen vonstatten gehen kann: entweder wird das Pili-Polymer von der Sortase auf die Housekeeping-Sortase, die ein SpaA-Monomer bindet, übertragen (Schritt 5) und diese überträgt dann das Polymer auf das Lipid II (Schritt 6); oder die Pili-spezifische Sortase überträgt das Polymer direkt auf das Lipid II (nicht dargestellt); rote Quadrate stellen den D-Diaminopimelinsäure-Rest der Pentapeptide der Zellwand dar. Anhang 169 Abb. 40 Vergleich der DNA-Sequenzen eines Teilbereichs der Sortase-1 des bee Locus der E. faecalis Stämme 1.10, 1.10.16 und E99 Punktmutation an Position 751 (GÆT) bei der Mutante 1.10.16; erkennbar sind weitere Unterschiede zur publizierten Sequenz des Stamms E. faecalis E99 (Tendolkar et al., 2006), die jedoch sowohl im Wildtyp 1.10 und der Mutante 1.10.16 auftraten; Alignment durchgeführt mit Hilfe der Software MegAlign 7.0 (DNASTAR Lasergene Software; MRI Karlsruhe); dunkle Balken, Übereinstimmung der Sequenz bei allen drei analysierten Stämmen; helle Balken, Sequenzübereinstimmung bei zwei von drei analysierten Stämmen. Erklärung 170 Erklärung Hiermit versichere ich, dass ich die vorliegende Dissertation selbständig und ohne unerlaubte Hilfe angefertigt sowie keine anderen als die in der Dissertation angegebenen Hilfsmittel verwendet habe. Alle Stellen, die wörtlich oder sinngemäß anderen veröffentlichten oder unveröffentlichten Schriften entnommen sind, habe ich als solche kenntlich gemacht. Kein Teil dieser Arbeit ist in einem anderen Promotions- oder Habitilationsverfahren verwendet worden. Kassel, 20.12.2008 ___________________________________ Susanne Schlüter Tag der Disputation: 31.03.2009 1. Gutachter: Prof. Dr. F. Schmidt 2. Gutachter: Prof. Dr. K. Baczko Danksagung 171 Danksagung Ich danke Prof. Dr. Schmidt und Prof. Dr. Baczko für die Begutachtung dieser Dissertation sowie ihre freundliche und kooperative Unterstützung. Weiterhin möchte ich Dr. Seewald vom Institut für Labormedizin des Klinikums Kassel, der Laborgemeinschaft Hülsmann/Baczko/Becker in Kassel (jetzt MVZ Kassel) sowie PD Dr. Koch vom Labor WagnerStibbe in Göttingen gebührenden Dank für ihre Unterstützung zukommen lassen, durch die diese Arbeit ermöglicht wurde. Mein unsagbar großer Dank gilt PD Dr. Charles M.A.P. Franz (Max Rubner-Institut in Karlsruhe) für unzählige Anregungen und weiterführende Diskussionen, wertvolle Hilfestellungen und sonstige fachliche Unterstützung, durch die diese Arbeit immer wieder enorm vorangetrieben wurde. Bei Prof. Dr. Herberg (Abteilung Biochemie der Universität Kassel) möchte ich mich für die Unterstützung bedanken, die mir über die Förderung im Rahmen des Promotionskollegs Proteomics zugekommen ist. Insbesondere gilt mein Dank Dr. Frank Gesellchen für das fortwährende Interesse an meiner Arbeit und die fruchtbaren Diskussionen sowie seine große Hilfe bei statistischen Auswertungen. Ebenso danke ich Oliver Bertinetti für seine Hilfsbereitschaft zur Durchführung der massenspektrometrischen Analysen. Vielen Dank möchte ich ebenfalls Prof. Dr. Maniak und den Mitarbeitern der Abteilung Zellbiologie der Universität Kassel für ihre Unterstützung während der Durchführungen zur CLSM und REM aussprechen. Mein herzlicher Dank geht an alle Arbeitskollegen der Abteilung Mikrobiologie für die stets gute Kooperation und angenehme Arbeitsatmosphäre. Ganz besonders danke ich Dr. Cornelia Janusch, Christian Eichler, Sebastian Koch und Karsten Peters für ihre ständige Hilfs- und Diskussionsbereitschaft sowie freundschaftliche Zusammenarbeit. Ich bedanke mich von Herzen bei meiner Arbeitskollegin und Freundin Conny Pfeiffer, geb. Schniebs, die zwischenzeitlich leider verstorben ist. Niemals werde ich die Zeit, die ich mit ihr im Labor und privat verbringen konnte, ihre Herzlichkeit, positive Denkweise und überragende Stärke vergessen. Ein liebes Dankeschön gilt Frank und meiner Familie für ihre Hilfen jeglicher Art und ihr großes Verständnis, ermutigende Worte sowie zahlreiche Entbehrungen während dieser Zeit.