Universität Kassel-Witzenhausen Fachbereich Ökologische Agrarwissenschaften Fachgebiet biologisch-dynamische Landwirtschaft Ermittlung geeigneter Methoden zur Differenzierung und Qualitätsbeurteilung unterschiedlicher Milchqualitäten aus verschiedenen on-farm-Experimenten Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades eines Doktors der Agrarwissenschaften (Dr. agr.) vorgelegt von: Dipl. Ing. agr. Jenifer Wohlers 1. Gutachter: Prof. Dr. Ton Baars 2. Gutachter: Priv. Doz. Dr. habil. Johannes Kahl Disputation: Witzenhausen, 21.2.2011 2 Dieses Dokument ist archiviert unter: KOBRA https://kobra.bibliothek.uni-kassel.de/ Fachbereich 11 / Ökologische Agrarwissenschaften / Nutztierwissenschaften / Fachgebiet Biologisch Dynamische Landwirtschaft / Dissertationen Zusammenfassung Zusammenfassung Ziel der Arbeit war ein Methodenvergleich zur Beurteilung der Milchqualität unterschiedlicher Herkünfte. Am Beispiel von Milchproben aus unterschiedlicher Fütterung sowie an Milchproben von enthornten bzw. horntragenden Kühen wurde geprüft, welche der angewendeten Methoden geeignet ist, die Vergleichsproben zu unterscheiden (Differenzierungsfähigkeit der Methoden) und inwieweit eine Qualitätsbeurteilung möglich ist (hinsichtlich Milchleistung, Fett-, Eiweiß-, Lactose- (=F,E,L), Harnstoff-gehalt und Zellzahl (=SCC), Säuerungseigenschaften (=SE), Fettsäuremuster (=FS-Muster), Protein- und Metabolit-Zusammensetzung (=Pr&M), Fluoreszenz-Anregungs-Spektroskopie- Eigenschaften (=FAS) und Steigbild-Merkmalen). Zusätzlich wurde vorab die Steigbildmethode (=SB-M) für das Produkt Rohmilch standardisiert und charakterisiert, um die Reproduzierbarkei der Ergebnisse sicherzustellen. Die Untersuchungen zur SB-M zeigten, dass es Faktoren gibt, die einen deutlichen Einfluß auf die Bildmerkmals-Ausprägung aufweisen. Dazu gehören laborseitig die Klimabedingungen in der Kammer, die Verdünnungsstufe der Probe, die Standzeiten der Vorverdünnung (Reaktionen mit der Luft, Alterung usw.), und tagesspezifisch auftretende Effekte, deren Ursache unbekannt ist. Probenseitig sind sehr starke tierindividuelle Effekte auf die Bildmerkmals-Ausprägung festzustellen, die unabhängig von Fütterung, Alter, Laktationsstadium und Genetik auftreten, aber auch Fütterungsbedingungen der Kühe lassen sich in der Bildmerkmals-Ausprägung wiederfinden. Die Art der Bildauswertung und die dabei berücksichtigten Bildmerkmale ist von großer Bedeutung für das Ergebnis. Die im Rahmen dieser Arbeit untersuchten 46 Probenpaare (aus den Fütterungsvergleichen (=FV) und zur Thematik der Hörner) konnten in 91% der Fälle korrekt gruppiert werden. Die Unterschiede konnten benannt werden. Drei FV wurden auf drei biologisch-dynamischen Höfen unter Praxis-Bedingungen durchgeführt (on-farm-Experimente). Es wurden jeweils zwei vergleichbare Gruppen à mindestens 11 Kühen gebildet, die im Cross-Over-Design gefüttert wurden, mit Probennahme am 14. und 21. Tag je Periode. Es wurden folgende FV untersucht: A: Wiesenheu vs. Kleegrasheu (=KG-Heu), B: Futterrüben (=FuR) vs. Weizen (Ergänzung zu Luzernegrasheu ad lib.), C: Grassilage vs. Grasheu. Bei Versuch A sind die Futtereffekte am deutlichsten, Gruppeneffekte sind gering. Die Milch der Wiesenheu-Variante hat weniger CLA’s und n3- FS und mehr mittellangkettige FS (MCT-FS), das Pr&M-Muster weist auf „Gewebereifung und Ausdifferenzierung“ vs. bei KG- Heu „Nährstoff-fülle, Wachstum und Substanz-Einlagerung und die SB zeigen fein ausdifferenzierte Bildmerkmale. Bei Versuch B sind die Futtereffekte ähnlich groß wie die Gruppeneffekte. Bei vergleichbarer Milchleistung weist die Milch der FuR-Variante höhere F- und E-Gehalte auf, sie säuert schneller und mehr, das FS-Muster weist auf eine „intensive“ Fütterung mit vermehrt MCT- FS, und die Pr&M-Untersuchungen charakterisieren sie mit „Eisentransport und Fetttröpfchenbildung“ vs. bei Weizen „mehr Abwehr-, Regulations- und Transportfunktion“ /. „mehr Lipidsynthese“. Die SB charakterisieren mit „große, kräftige Zusammenfassung 4 Formen, verwaschen“ vs. „kleine, ausdifferenzierte Bildmerkmal“ für FuR vs. Weizen. Die FAS charakterisiert sie mit „Saftfutter-typisch“ vs. „Samentypisch“. Versuch C weist die geringsten Futtereffekt auf, und deutliche Gruppen- und Zeiteffekte. Milchleistung und F,E,L-Gehalte zeigen keinen Futtereffekt. Die Milch der Heu- Variante säuert schneller, und sie weist mehr SCT und MCT- FS auf. Pr&M-Untersuchungen wurden nicht durchgeführt. Die SB charakterisieren bei Heumilch mit „fein, zart, durchgestaltet, hell“, bei Silagemilch mit „kräftig, wäßrig-verwaschen, dunkler“. Die FAS kann keine konsistenten Unterschiede ermitteln. Der Horn-Einfluß auf die Milchprobe wurde an 34 Probenpaaren untersucht. Von 11 Höfen wurden je zwei möglichst vergleichbare Gruppen zusammengestellt, die sich nur im Faktor „Horn“ unterscheiden, und im wöchentlichen Abstand drei mal beprobt. F,E,L, SCC und SE der Proben sowie die FAS-Messungen weisen keine konsistenten signifikanten Unterschiede zwischen den Horn-Varianten auf. Pr&M weisen bei den untersuchten Proben (von zwei Höfen) auf Horneffekte hin: bei Eh eine Erhöhung von Immun-Abwehr-Funktionen, sowie einer Abnahme phosphorylierter C3- und C6-Metabolite und Beta-Lactoglobulin. Mit den SB ließen sich für die gewählten Merkmale (S-Größe und g.B.-Intensität) keine Horneffekte feststellen. FS, Pr&M-Muster sowie Harnstoffgehalt und SB (und z.T. Milchleistung) zeigten je FV ähnliche Effekt-Intensitäten für Futter-, Gruppen- und Zeiteffekte, und konnten die Cross- Over-Effekte gut wiedergeben. F- und E-Gehalte konnten neben tierindividuellen Effekten nur in FV B auch Futtereffekte aufzeigen. In FV C zeigten die SE der Proben den deutlichsten Futtereffekt, die anderen Methoden zeigten hier vorrangig Gruppen-Effekte, gefolgt von Futter- und Zeiteffekten. Die FAS zeigte den SB vergleichbare Ergebnisse, jedoch weniger sensibel reagierend. Die Interpretation von Qualitätsaspekten war bei konsistent differenzierbaren Proben (FV A, B, C) am fundiertesten mit Hilfe der FS möglich, da über die Synthese von FS und beeinflussende Faktoren schon vielfältige Erkenntnisse vorliegen. Das Pr&M-Muster war nach einer weiteren Methodenentwicklung bei der Deutung von Stoffwechselprozessen sehr hilfreich. Die FAS konnte z.T. eine zu der Fütterungsvariante passende Charakterisierung liefern. Für die SB-M fehlt es noch an Referenzmaterial, um Angaben zu Qualitätsaspekten zu machen, wenngleich Probenunterschiede aufgezeigt und Proben-Eigenschaften charakterisiert werden konnten. Zusammenfassung 5 Summary Milksamples from three different feeding regimes and from dehorned vs. horn-bearing cows were analyzed to evaluate whether the used laboratory methods are able to differentiate among pairs of samples, and if the quality of the samples could be characterized. The following quality parameters were examined: milk-yield, lipid-, protein-, lactose-, and urea-content, somatic cell count, spontaneous acidification, fatty acid composition, protein- and metabolite-pattern, delayed luminescence (=FAS) and chromatography (Steigbild-) characteristics. To ensure reproducible results, the Steigbild- method was first of all standardized and characterized. Investigations in the Steigbild-method show that there are many factors influencing the picture-characteristic shape. Influences by laboratory factors such as climatic situation in the chamber, time of reaction of the sample with the air (aging effects) and day-specific effects with unknown reasons were obvious. The strongest sample-induced differences were caused by cow-individual effects without obvious reason (independent from feeding, age, lactation status and genetic background). However, the age of the sample and feeding-situation of the cows are also visible in the picture-characteristic shape. It is of great importance for the results to identify, which picture-characteristics are examined and in which way the analysis is done. 91% of the 46 pairs of samples in this thesis (from the feeding-comparisons (=FC) and the horn-context) could be grouped correctly and the differences could be named. Three FCs were arranged on three bio-dynamic farms under praxis-circumstances (on-farm- experiments). Two comparable groups were established per farm, with at least 11 cows per group, and fed in a cross-over design. Sampling took place the 14th and 21st day per period. The feeding comparisons were: A: field dried pasture-hay vs. inside dried clover-grass-hay, B: fodder beet vs. wheat (added to lucerne-grass-hay), C: grass-silage vs. grass-hay. In FC A, feeding-effects are strongest, group-effects little. The milk of the pasture-hay- feeding has less CLA’s and n3-fatty acids (more MC-fatty acids), the protein- and metabolite- pattern characterizes the samples with “maturation of tissue and differentiation” (vs. “plenty of nutrients, growth, and storage of substances”), and the Steigbild shows fine and precisely differentiated characteristics. In FC B, feeding-effects are nearly as strong as group-effects. Milk-yield is not affected by feeding, but lipid- and protein-content are higher in fodder beet, natural acidification is greater and faster, and a higher yield of MC-fatty acids was found. Protein- and metabolite- pattern characterizes the milk from the fodder beet feeding with “iron transport and fat drop building” while for the wheat-feeding group, there is “more defense, regulation and transport- functions”. The Steigbilder can be characterized with “big, strong forms, but washed-out” vs. “little, well differentiated forms” for the beet group vs. the wheat group. The FAS characterizes the samples with “typical for juicy samples” vs. “typical for seeds”. Zusammenfassung 6 In FC C, only minor feeding-effects can be found, but group- and time-effects are obvious. There are no effects on milk-yield or fat, protein or lactose content. Natural acidification occurs more quickly in the hay-milk , and it has more SC and MC fatty acids. Protein- and metabolite-patterns were not investigated. The Steigbilder of the hay-milk can be characterized with “fine, tender, featherly, precisely formed, light” compared to “forceful, watery-washed-out, darker” for the pictures from the silage-milk. The FAS show no consistent differences. Effects of the horn status on the milk were examined in 34 pairs of samples. Two groups as comparable as possible were established on 11 farms, with “horn-bearing” as the only difference. Sampling took place three times per farm, at 7-day intervals. Horn-related effects were not visible in lipid-, protein-, lactose-content or SCC, nor in natural acidification, fatty aid pattern or FAS-measurements, nor in the criteria used for classification of the Steigbilder (S-size and g.B-intensity). Only the protein- and metabolite-pattern of five samples from two selected farms show some effects: these were more immune-defense- functions and less phosphorylated C3- and C6-metabolites and less beta-lactoglobuline in the milk of the dehorned cows. In the comparison of methods feeding-, group- and time-effects as well as cross-over-effects could be well described by fatty acid composition, protein- and metabolite-pattern, urea content and Steigbild (and sometimes milk production per day). Lipid- and protein-content showed mainly individual animal effects and, only in FC B, feeding-effects were also present. In FC C, natural acidification showed the best results from feeding-effects, while the other methods showed more group- and time-effects. The differentiation based on FAS were comparable to the Steigbild-method, although less identifiable. An interpretation of quality aspects was possible after samples were differentiated, and interpretation was best based on aspects of fatty acid patterns, due to the fact that much is known about synthesis and influencing factors. The protein- and metabolite-patterns were, from a methodological standpoint, very useful to interpret metabolic processes of the cows. For the Steigbild-method, reference-pictures are missing for quality interpretation, but sample differentiation and characterization was possible. Dank 7 Dank Ich möchte mich für das große Vertrauen, die konstruktiven Ideen und die kritischen Nachfragen bedanken, die mir von Ton Baars entgegengebracht wurden. Ich danke Ingo König für die große Rücksichtnahme und Unterstützung hinsichtlich der kraft- und zeitaufwändigen Probennahmen und Untersuchungen, und ich danke meiner Tochter Antonia für die produktive Mitarbeit (schlafen oder spielen), ohne die eine Reihe der vorgenommenen Untersuchungen nicht möglich gewesen wären... . Außerdem meiner Mutter, die wiederholt die Kinderbetreuung übernahm. Weiterhin bin ich Johannes Kahl für die Korrekturen und Hinweise zu den methodischen Steigbild-Untersuchungen sehr dankbar, und Stephan Mosler für seine Ausarbeitungen der Protein- und Metabolit-Daten – und das persönliche vertraute Gesprächsklima mit ihm. Ein großer Dank an die Götter, die mit ihrem Walten und Wirken das eine und andere bewirkten. – Dank an Jürgen Strube für seine hingebungsvolle Bearbeitung der FAS-Ergebnisse und die Gespräche darüber. Auch Dank an Dorian Schmidt, der verständnisvoll und sorgend die Arbeit begleitete. Und nicht zu vergessen alle anderen, die beim Proben-nehmen, Untersuchen und Auswerten mehr oder weniger im Hintergrund mitwirkten: angefangen bei den Landwirten und den Kühen, die bereit waren, bei den Versuchen mitzuwirken und Zeit und Kraft dafür investierten, Katja, die beim Probennehmen half, Karin Rübesam und Daniel Kusche für FG-interne Unterstützungen, Sabine Ahlers und Gabi Mergardt für Labor-Ratschläge usw., Dré Nierop und Boris Kulig für statistische Beratung, und alle anderen.... – auch ihnen danke ich! Für Kraft, Mut und Zuversicht! Inhalt 8 Inhaltsverzeichnis – Übersicht Zusammenfassung ...............................................................................3 Summary ...............................................................................................5 Dank .........................................................................................................7 Inhaltsverzeichnis – Übersicht.............................................................8 Inhaltsverzeichnis – Ausführlich .......................................................10 1. Einleitung, Problemstellung, Ziel und Hypothesen .................17 1.1. Einleitung.............................................................................................................17 1.2. Ziele dieser Arbeit ...............................................................................................19 1.3. Stand der Forschung und Problemstellung ......................................................20 1.4. Hypothesen .........................................................................................................31 1.5. Zur Chronologie der Untersuchungen...............................................................32 2. Material und Methoden ..............................................................33 2.1. Probenherkunft (Material) „Fütterungssystemvergleiche“ ..............................33 2.2. Probenherkunft (Material) „Hörner“...................................................................44 2.3. Vorgehensschritte zur Standardisierung und Charakterisierung der Steigbildmethode für Milchproben ....................................................................48 2.4. Vorgehensschritte zum Vergleich verschiedener Methoden miteinander ......49 2.5. Angewandte Methoden zur Qualitätsbestimmung............................................50 2.6. Statistische Auswertungen ................................................................................54 3. Ergebnisse und Diskussion: Standardisierung und Charakterisierung der Steigbildmethode für Milchproben......57 3.1. Standardisierung: Die einzelnen Prozeßschritte der Steigbildmethode .........57 3.2. Charakterisierung: Mögliche Einflußfaktoren auf das Ergebnis der Steigbildmethode ................................................................................................84 3.3. Charakterisierung: laborseitige Einflüsse auf Bildmerkmals-Ausprägung ....87 3.4. Charakterisierung: Proben-spezifische, Proben-verursachte Einflüsse auf die Bildmerkmals-Ausprägung...............................................................................151 Inhalt 9 3.5. Fazit aus den Untersuchungen zur Charakterisierung: Einflußintensität der verschiedenen Effekte auf die Bildmerkmals-Ausprägung (Zusammenfassung) .........................................................................................186 3.6. Einfluss des Bildauswertungsverfahrens auf die Unterscheidbarkeit von Probenbildern....................................................................................................189 3.7. Zur Prüfung der Anwendbarkeit der Methode unter Standardbedingungen.198 4. Ergebnisse und Diskussion - Methodenvergleich.................200 4.1. Ergebnisse Fütterungssystemvergleich A: Einfluß von Wiesenheu und Kleegras-Ackerfutter-Heu auf verschiedene Parameter der Milch ................201 4.2. Diskussion Fütterungssystemvergleich A ......................................................213 4.3. Methodenvergleich Fütterungssystemvergleich A.........................................219 4.4. Ergebnisse Fütterungssystemvergleich B: Einfluß von Weizen und Futterrüben auf verschiedene Parameter der Milch .......................................221 4.5. Diskussion Fütterungssystemvergleich B ......................................................235 4.6. Methodenvergleich Fütterungssystemvergleich B.........................................241 4.7. Ergebnisse Fütterungssystemvergleich C: Einfluss von Wiesenheu und Silage auf verschiedene Parameter der Milch.................................................244 4.8. Diskussion Fütterungssystemvergleich C ......................................................257 4.9. Methodenvergleich Fütterungssystemvergleich C.........................................262 4.10. Ergebnisse zur Thematik „Hörner“..................................................................264 4.11. Diskussion zur Thematik „Hörner“ ..................................................................287 4.13. Methodenvergleich zum Thema „Hörner“ .......................................................298 5. Zusammenfassende, abschließende Diskussion der Ergebnisse aller Versuche ......................................................300 5.1. Zur Methodeneignung.......................................................................................300 5.2. Zur Charakterisierung der Probeneigenschaften ...........................................306 5.3. Zur Charakterisierung der Methodeneigenschaften.......................................309 5.4. Zur proteomischen und metabolomischen Markersuche...............................310 5.5. Zum Carry-Over-Effekt in den Fütterungssystemvergleichen .......................311 6. Literatur ....................................................................................312 7. Anhang......................................................................................322 Inhalt 10 Inhaltsverzeichnis – Ausführlich Zusammenfassung ...............................................................................3 Summary ...............................................................................................5 Dank .......................................................................................................7 Inhaltsverzeichnis.................................................................................8 1. Einleitung, Problemstellung, Ziel und Hypothesen .................17 1.1. Einleitung.............................................................................................................17 1.2. Ziele dieser Arbeit ...............................................................................................19 1.3. Stand der Forschung und Problemstellung ......................................................20 1.3.1. Qualitätsaspekte ökologischer Lebensmittel ...................................................20 1.3.2. Bedeutung der Fütterung für die Milchqualität .................................................21 1.3.3. Bedeutung der Hörner für die Milchqualität .....................................................23 1.3.4. Beurteilung von Lebensmittelqualität mit dem Verfahren der Steigbildmethod 24 1.3.5. Standardisierung – Charakterisierung – Validierung .......................................25 1.3.6. Aspekte zur Auswertung von Steigbildern .......................................................26 1.4. Hypothesen .........................................................................................................31 1.5. Zur Chronologie der Untersuchungen...............................................................32 2. Material und Methoden ..............................................................33 2.1. Probenherkunft (Material) „Fütterungssystemvergleiche“ ..............................33 2.1.1. Fütterungssystemvergleich A (Heuqualitäten): ................................................34 2.1.2. Fütterungssystemvergleich B (Futterrüben vs. Weizen): ................................38 2.1.3. Fütterungssystemvergleich C (Konservierungsverfahren): .............................41 2.2. Probenherkunft (Material) „Hörner“...................................................................44 2.2.1. Datengrundlage zur Frage „enthornt vs. horntragend“.....................................46 2.2.2. Datengrundlage zur Frage „nachträglich enthornt“ ..........................................46 2.3. Vorgehensschritte zur Standardisierung und Charakterisierung der Steigbildmethode für Milchproben ....................................................................48 2.4. Vorgehensschritte zum Vergleich verschiedener Methoden miteinander ......49 Inhalt 11 2.5. Angewandte Methoden zur Qualitätsbestimmung............................................50 2.5.1. Fett-, Eiweiß-, Lactose-, Harnstoff-gehalt, Zellzahl, pH-Wert...........................50 2.5.2. Gärprobe.........................................................................................................50 2.5.3. Fettsäuremuster (GC-MS)...............................................................................51 2.5.4. Proteomik (nLC-ESI-MS/MS) ..........................................................................51 2.5.5. Metabolomik (GC-TOF-MS) ............................................................................52 2.5.6. Fluoreszenz-Anregungs-Spektroskopie (FAS) ................................................53 2.5.7. Steigbildmethode nach Wala...........................................................................53 2.5.8. Milchmengenmessung ....................................................................................53 2.5.9. Futtermittel-Analysen ......................................................................................54 2.6. Statistische Auswertungen ................................................................................54 3. Ergebnisse und Diskussion: Standardisierung und Charakterisierung der Steigbildmethode für Milchproben......57 3.1. Standardisierung: Die einzelnen Prozeßschritte der Steigbildmethode .........57 3.1.1. Überblick.........................................................................................................57 3.1.2. Die Labor-Ausrüstung (Material) .....................................................................59 3.1.3. Der Laborprozess (Methode) ..........................................................................62 3.1.4. Dokumentation der Klimadaten .......................................................................67 3.1.5. Bildentwicklung / Belichtung............................................................................67 3.1.6. Bilder einscannen / aufbewahren ....................................................................67 3.1.7. Standardisiertes Vorgehen bei der Bildauswertung.........................................68 3.1.8. Angewandte Auswerteverfahren bei den verschiedenen Themengebieten ....70 3.1.9. Ausführliche Darstellung der einzelnen Auswerteverfahren.............................71 3.1.10. Angewandte Gruppierungs- und Klassifizierungs-Merkmale für die Proben ....79 3.1.10.1. Auffällige Bildmerkmale, die häufig zu einer Gruppierung beitragen ......79 3.1.10.2. Bild-Merkmale zur Klassifizierung für die Bilder des Fütterungssystemvergleiches C: „Wiesenheu vs. Silage“................................80 3.1.10.3. Bildmerkmale zur Klassifizierung der Bilder zur Thematik „Hörner“........81 3.1.10.4. Bild-Merkmale zur Klassifizierung der Bilder von verschiedenen Wirtschaftsstilen – Faktor „Heu vs. Silage“......................................................82 Inhalt 12 3.1.10.5. Bild-Merkmale zur Klassifizierung der Bilder von verschiedenen Wirtschaftsstilen – Faktor „konventionell vs. bio-dynamisch“...........................83 3.2. Charakterisierung: Mögliche Einflußfaktoren auf das Ergebnis der Steigbildmethode ................................................................................................84 3.2.1. Einflußfaktoren - zeitlich geordnet...................................................................84 3.2.2. Einflußfaktoren – thematisch geordnet............................................................86 3.3. Charakterisierung: laborseitige Einflüsse auf die Bildmerkmals-Ausprägng.87 3.3.1. Faktor 1: Konzentrationsstufe / Verdünnungsstufe..........................................88 3.3.2. Faktor 2: Klima................................................................................................90 3.3.2.1. Klima – punktuell variiert ...........................................................................92 3.3.2.2. Labor-Klima - gezielt variiert ....................................................................103 3.3.2.3. Standardbild-Variationen 2007 bis 2009 – Gruppierung und Ordnung der Bilder nach div. Merkmalen...........................................................................111 3.3.2.4. Standardbild-Variationen 2007 bis 2009 - Bonitur der Bildmerkmale und statistische Auswertung (Korrelationen) ........................................................118 3.3.3. Faktor 3: Trocknungszeiten...........................................................................123 3.3.4. Faktor 4: Probenvorbereitung, Probenaufbereitung.......................................126 3.3.4.1. Alterung der Vorverdünnung, Beginn der ersten Phase...........................126 3.3.4.2. Pipettierfehler ..........................................................................................132 3.3.5. Faktor 5: Steighöhe in 2. Phase ....................................................................138 3.3.6. Faktor 6: Alterung der Eisensulfat-Lösung ....................................................140 3.3.7. Faktor 7: Alterung der Silbernitrat-Lösung.....................................................146 3.3.8. Ursachen von Bildfehlern ..............................................................................149 3.3.9. Verwendung einer Standard-Probe...............................................................150 3.4. Charakterisierung: Proben-spezifische, Proben-verursachte Einflüsse auf die Bildmerkmals-Ausprägung...............................................................................151 3.4.1. Faktor 1: Probennahme ................................................................................151 3.4.1.1. Variation der Milchprobe bei wiederholter PrN.........................................151 3.4.1.2. Robustheit gegenüber PrN-Verfahren .....................................................157 3.4.1.3. Einzeltierprobe vs. Sammelprobe............................................................157 3.4.2. Faktor 2: Probenalterung ..............................................................................159 3.4.3. Faktor 3: Temperierung (Hitze / Kälte) ..........................................................162 3.4.3.1. Einfluß der Kühlung der Milch auf die Bildmerkmale................................162 Inhalt 13 3.4.3.2. Erhitzung / Abkühlung .............................................................................169 3.4.3.3. Erhitzung auf 100°C (kochen)..................................................................175 3.4.4. Faktor 4: Fettgehalt der Probe, Rahm vs. entrahmte Milch............................178 3.4.4.1. Rahm vs. Rohmilch .................................................................................180 3.4.4.2. Entrahmte Milch vs. Rohmilch .................................................................182 3.4.5. Faktor 5: Laktationsstadium, Milchleistung, Individualität... ...........................185 3.5. Fazit aus den Untersuchungen zur Charakterisierung: Einflußintensität der verschiedenen Effekte auf die Bildmerkmals-Ausprägung (Zusammenfassung) .........................................................................................186 3.6. Einfluss des Bildauswertungsverfahrens auf die Unterscheidbarkeit von Probenbildern....................................................................................................189 3.6.1. Triangeltest ...................................................................................................189 3.6.2. Profilprüfung und einfach beschreibende Prüfung.........................................191 3.6.3. Unterscheidung mehrerer Proben auf Grundlage einer einfachen Reihung vs. „Gruppierung aufgrund von vielfältiger Merkmals-Berücksichtigung“.............194 3.6.4. Statistische Absicherung von „Gruppierungen“ .............................................196 3.7. Zur Prüfung der Anwendbarkeit der Methode unter Standardbedingungen.198 4. Ergebnisse und Diskussion - Methodenvergleich.................200 4.1. Ergebnisse Fütterungssystemvergleich A: Einfluß von Wiesenheu und Kleegras-Ackerfutter-Heu auf verschiedene Parameter der Milch ................201 4.1.1. Milchleistung .................................................................................................201 4.1.2. Gehalte von Fett, Eiweiß, Lactose, Harnstoff und Zellzahl ............................201 4.1.3. Fettsäuremuster............................................................................................202 4.1.4. Proteomik (MOSLER UND WOHLERS) ..............................................................204 4.1.5. Metabolomik (MOSLER UND WOHLERS) ..........................................................206 4.1.6. Steigbilder.....................................................................................................208 4.2. Diskussion Fütterungssystemvergleich A ......................................................213 4.2.1. Zur Probenherkunft .......................................................................................213 4.2.2. Milchleistung und Gehalte von Fett, Eiweiß, Lactose, Harnstoff und Zellzahl 213 4.2.3. Fettsäuremuster............................................................................................214 4.2.4. Proteomik......................................................................................................214 4.2.5. Metabolomik .................................................................................................217 4.2.6. Steigbilder.....................................................................................................218 Inhalt 14 4.3. Methodenvergleich Fütterungssystemvergleich A.........................................219 4.4. Ergebnisse Fütterungssystemvergleich B: Einfluß von Weizen und Futterrüben auf verschiedene Parameter der Milch .......................................221 4.4.1. Milchleistung und Gehalte von Fett, Eiweiß, Lactose, Harnstoff und Zellzahl 221 4.4.2. Gärprobe.......................................................................................................222 4.4.3. Fettsäuremuster............................................................................................223 4.4.4. Proteomik (MOSLER UND WOHLERS) ..............................................................226 4.4.5. Metabolomik (MOSLER UND WOHLERS) ..........................................................228 4.4.6. FAS-Untersuchungen....................................................................................230 4.4.7. Steigbilder.....................................................................................................231 4.5. Diskussion Fütterungssystemvergleich B ......................................................235 4.5.1. Milchleistung und Gehalte von Fett, Eiweiß, Lactose, Harnstoff und Zellzahl 235 4.5.2. Gärprobe.......................................................................................................235 4.5.3. Fettsäuremuster............................................................................................236 4.5.4. Proteomik (MOSLER UND WOHLERS) ..............................................................237 4.5.5. Metabolomik (MOSLER UND WOHLERS) ..........................................................238 4.5.6. FAS-Untersuchungen....................................................................................239 4.5.7. Steigbilder.....................................................................................................239 4.6. Methodenvergleich Fütterungssystemvergleich B.........................................241 4.7. Ergebnisse Fütterungssystemvergleich C: Einfluss von Wiesenheu und Silage auf verschiedene Parameter der Milch.................................................244 4.7.1. Milchleistung und Gehalte von Fett, Eiweiß, Lactose, Harnstoff und Zellzahl 244 4.7.2. Gärprobe.......................................................................................................244 4.7.3. Fettsäuremuster............................................................................................246 4.7.4. FAS-Untersuchungen....................................................................................249 4.7.5. Steigbilder.....................................................................................................251 4.8. Diskussion Fütterungssystemvergleich C ......................................................257 4.8.1. Zur Probenherkunft .......................................................................................257 4.8.2. Milchleistung und Gehalte von Fett, Eiweiß, Lactose, Harnstoff und Zellzahl 257 4.8.3. Gärprobe.......................................................................................................258 4.8.4. Fettsäuremuster............................................................................................258 4.8.5. FAS-Untersuchungen....................................................................................260 Inhalt 15 4.8.6. Steigbilder.....................................................................................................260 4.9. Methodenvergleich Fütterungssystemvergleich C.........................................262 4.10. Ergebnisse zur Thematik „Hörner“..................................................................264 4.10.1. Datenstruktur – Zur Vergleichbarkeit der Gruppen ........................................264 4.10.2. Milchleistung, Fett, Eiweiß, Lactose, Harnstoff, Zellzahl................................265 4.10.3. Gärprobe.......................................................................................................266 4.10.4. Fettsäuremuster............................................................................................266 4.10.5. Proteomik (MOSLER UND WOHLERS, 2010).....................................................271 4.10.6. Metabolomik (MOSLER UND WOHLERS, 2010).................................................275 4.10.7. FAS-Untersuchungen....................................................................................281 4.10.8. Steigbilder.....................................................................................................284 4.11. Diskussion zur Thematik „Hörner“ ..................................................................287 4.11.1. Datenstruktur ................................................................................................287 4.11.2. Milchleistung, Fett-, Eiweiß- und Lactose-Gehalt ..........................................287 4.11.3. Gärprobe.......................................................................................................288 4.11.4. Fettsäuremuster............................................................................................288 4.11.5. Proteomik (MOSLER UND WOHLERS, 2010).....................................................289 4.11.6. Metabolomik (MOSLER UND WOHLERS, 2010).................................................291 4.11.7. FAS-Untersuchungen....................................................................................293 4.11.8. Steigbilder.....................................................................................................293 4.11.9 Proben zur Frage „nachträglich enthornt“......................................................295 4.13. Methodenvergleich zum Thema „Hörner“ .......................................................298 5. Zusammenfassende, abschließende Diskussion der Ergebnisse aller Versuche ......................................................300 5.1. Zur Methodeneignung.......................................................................................300 5.2. Zur Charakterisierung der Probeneigenschaften ...........................................306 5.3. Zur Charakterisierung der Methodeneigenschaften.......................................309 5.4. Zur proteomischen und metabolomischen Markersuche...............................310 5.5. Zum Carry-Over-Effekt in den Fütterungssystemvergleichen .......................311 6. Literatur ....................................................................................312 7. Anhang......................................................................................322 Inhalt 16 7.1. Abbildungsverzeichnis .....................................................................................322 7.2. Tabellen-Verzeichnis.........................................................................................325 7.3. Abkürzungsverzeichnis ....................................................................................333 7.4. Definitionen .......................................................................................................336 7.5. Anhang Teil A bis Teil G - Inhaltsverzeichnis .................................................337 Einleitung 17 1. Einleitung, Problemstellung, Ziel und Hypothesen 1.1. Einleitung Es gibt eine Reihe von Studien, die gezeigt haben, dass sich die Milchqualität aus ökologischer Erzeugung von derjenigen aus konventioneller Erzeugung unterscheiden kann (KUSCHE et al. 2010, BLOKSMA et al. 2008, EHRLICH 2006; MOLKENTIN et al. 2006; SLOTS et al. 2006; WEIß et al. 2006, DEWHURST et al. 2003a und b, KRAFT et al. 2003). Vor allem die Analyse des Fettsäuremusters wird bei diesen Untersuchungen als relevante Methode angewendet. Es fällt jedoch auf, dass z.T. auch weitere Methoden genutzt wurden, um die Unterschiede der Qualität darzustellen. Ein solcher „umfassenderer“ Ansatz findet sich z.B. in BAARS et al. (2005), oder auch in BLOKSMA et al. (2001) (FQH -Projekt), jedoch hier nicht an Milch, sondern an pflanzlichen Produkten. Hier wurden Äpfel und Möhren verschiedener Herkunft (konventionell / ökologisch) und verschiedener Qualitätseigenschaften mit mehreren Methoden miteinander verglichen, um zu ermitteln, ob und in welcher Ebene der Qualitätsbetrachtung / -bestimmung die Methoden aussagekräftig sind. BAARS et al. (2005) konnten mit vier von fünf Methoden nachweisen, dass sich Tankmilchproben aus verschiedenen Anbausystemen wiederholt differenzieren und charakterisieren lassen. Interessant ist, dass neben wissenschaftlich gut entwickelten analytischen Methoden auch solche angewendet wurden, die bis jetzt im wissenschaftlichen Kontext wenig berücksichtigt wurden, aber vermehrt von Interesse zu sein scheinen (z.B. Biokristallisation: KAHL 2007, MERTEN UND LAGONI 1958). Die vereinzelte Anwendung solcher Methoden (z.B. Steigbild, Biokristallisation) auf Milchproben zeigte, dass Produkte aus unterschiedlicher Herkunft unterschieden werden können (BAARS et al. 2005, BALZER-GRAF UND BALZER 1991). Aufgrund dieses Tatbestandes scheinen diese Methoden ein gewisses Potential hinsichtlich der Differenzierungs-Fähigkeit für Proben dieser Herkunftsarten aufzuweisen. Jedoch sind diese Methoden nur teilweise validiert bzw. charakterisiert (Biokristallisation (KAHL et al. 2006), Steigbildmethode in Anwendung auf Produkte pflanzlicher Herkunft (ZALECKA 2006)) und bedürfen einer Prüfung ihrer Aussagefähigkeit für Milchqualität. Auf der Suche nach einer Milch, die möglichst auch von Kindern mit allergischen, atopischen Symptomen vertragen werden kann, hat das Fachgebiet biologisch-dynamische Landwirtschaft der Universität Kassel eine breit angelegte Milchstudie organisiert, die aus drei Teilprojekten besteht: (1) Eine doppelblinde placebokontrollierte Studie in Zusammenarbeit mit einer Allergie-Klinik, bei der eine definierte Demeter-Rohmilch getestet wird, (2) Ermittlung wirtschaftsstiltypischer Faktoren1, die den Einfluss des Hofes, der Bewirtschaftungs-Intensität und der –Art (konventionell / ökologisch) auf die Milchqualität darstellt, und 1 Vergleiche: VAN DER PLOEG (2003) Einleitung 18 (3) Experimentelle Prüfung zweier Einflussfaktoren auf die Milchqualität: der Einfluss der Fütterung und der der Hörner. Die Milchproben aller drei Teilprojekte werden mit einer Vielzahl von verschiedenen Methoden untersucht – wobei in allen Teilprojekten dieselben Methoden angewendet werden, so dass a) ein direkter Bezug untereinander herstellbar wird, und b) die Eignung der Methoden (zur Differenzierung und Charakterisierung) je Vergleich geprüft werden kann („Pilotstudie“). In dieser Dissertation wird der Teil 3 ausgearbeitet. Die Fragen, die in dieser Dissertation bearbeitet werden, sind nicht nur im Rahmen des genannten Projektes von Interesse. Sie sind auch innerhalb der biologisch-dynamischen Landwirtschaft von Bedeutung und es wird von den untersuchten Faktoren (namentlich die Frage der Fütterung von Heu und Fütterrüben sowie die Bedeutung der Hörner für die Kühe) ein positiver Effekt auf die Milchqualität erhofft. Im Hinblick auf die Untersuchungsmethoden ist die Steigbildmethode ebenfalls eine der im biologisch-dynamischen Kontext Beachtung findenden Methoden, deren Anwendbarkeit auf Milchproben jedoch noch einer Prüfung bedarf. WOHLERS (2003) stellte in einer Herde den reproduzierbaren Effekt der Hörner fest – die Steigbildmethode konnte hier die deutlichsten Effekte zeigen. Aufgrund dieser Ergebnisse soll in dieser Dissertation daran angeschlossen werden. Die Anwendbarkeit der Steigbildmethode soll in der vorliegenden Arbeit im Vorfeld auf die Untersuchungen geprüft werden. Insofern gliedert sich die Arbeit in zwei Teile: Teil A: Die Entwicklung und Prüfung der Anwendbarkeit der Steigbildmethode für Milchproben Teil B: Die inhaltlichen Untersuchungen zur Milchqualität mit dem damit verbundenen Methodenvergleich. Der Fokus der Untersuchungen liegt auf dem Methodenvergleich und der Prüfung, welche der Methoden geeignet ist, die Vergleichsproben zu differenzieren und verschiedene Effekte (Futter-, Gruppen- und Zeit-Effekte) wiederzugeben. Die Proben entstammen verschiedenen on-farm-Experimenten, welche auf bestmögliche Weise verschiedene Wirtschaftsweisen wiedergeben sollten, so dass es sich bei der Probenherkunft um multifaktorielle Systemvergleiche handelt und nicht um kontrollierte ein- oder zweifaktorielle Versuche. Einleitung 19 1.2. Ziele dieser Arbeit 1. Standardisierung der Steigbildmethode für die Anwendung auf Milchproben. 2. Einfluss des Fütterungssystems auf verschiedene Qualitätsparameter der Milch ermitteln. Fütterungsvarianten im Systemvergleich: i. Verschiedene Heuqualitäten (Kleegrasheu vs. Wiesenheu) ii. Verschiedene Konservierungsverfahren (Grassilage vs. Wiesenheu) iii. Verschiedene Ergänzungsfutter (Futterrüben vs. Weizen) Qualitätsparameter / Methoden: a) Fett-, Eiweiß-, Lactose- Harnstoff-gehalt, Zellzahl b) Säuerungs-Eigenschaften (Gärprobe) c) Fettsäuremuster d) Protein-Zusammensetzung (Proteomik) e) Metabolit-Zusammensetzung (Metabolomik) f) Fluoreszenz-Anregungs-Spektroskopie (FAS) g) Steigbilder 3. Einfluss der Hörner bzw. der Enthornung der Kühe auf verschiedene Qualitätsparameter der Milch (s.o.) ermitteln. 4. Die Ergebnisse der verschiedenen Methoden miteinander vergleichen. Begründung zur Wahl der Methoden: Die Methoden b), c), f) (und Kristallisation / g) konnten schon bei Bloksma et al. (2008) erfolgreich bei Milch angewendet werden, s.a. Adriaansen-Tennekes et al. (2005). Begründung zur Wahl der Faktoren: Demeter ist der einzige Verband, der Tiere innerhalb des Betriebskreislaufs vorschreibt. Der Demeter-Verband geht von der Integrität der Tiere aus (VERHOOG et al. 2007), wobei die Tiere nicht verstümmelt werden dürfen. Dem Demeter-Verband ist die Produktqualität sehr wichtig (DEMETER-PRESSEMITTEILUNG 2007) und deswegen können heutzutage eher mehr traditionelle Rationen gefüttert werden, wie Wiesenheu oder Futterrüben, ohne dass bekannt ist, was davon für die Produktqualität von Bedeutung ist. Für die weitere Entwicklung und Positionierung der biologisch-dynamischen Demeter - Landwirtschaft ist es wichtig, mögliche Unterschiede in der Produktqualität zu kennen und deren Ursachen zu verstehen. Einleitung - Stand der Forschung 20 1.3. Stand der Forschung und Problemstellung 1.3.1. Qualitätsaspekte ökologischer Lebensmittel Produktqualität ist für ökologische Lebensmittel grundlegend wichtig (ALFÖLDI et al. 2006), und insbesondere Produkte aus biologisch-dynamischer Produktion erheben für sich den Anspruch der Qualitätsführerschaft (DEMETER-PRESSEMITTEILUNG 2007). Die höchsten Anforderungen an die Prozessqualität*2 der Milch werden vom Demeter-Verband gestellt (DEMETER-BUND 2004). Kriterien für die Produktqualität von Milch sind jedoch ziemlich rar – sowohl im ökologischen wie im konventionellen Bereich (FINK-KESSLER 2002). Neben Aspekten als Lebens- / Nahrungsmittel, aber auch Verarbeitungsprodukt (Butter, Käse..) oder als „Marker“ für Prozess-Bedingungen (Harnstoffwerte und Zellzahlen als Gesundheits- oder Fütterungsparameter der Kühe) sind Eigenschaften von Bedeutung, die z.B. Hinweis auf das Produktionsverfahren (ökologisch vs. konventionell) geben. Aktuell sind vor allem Substanzen im Blickfeld der Forschung, von denen man vermutet oder nachgewiesen hat, dass sie ernährungsphysiologisch wertvoll sein könnten und dadurch die Milchqualität steigern. Hierzu zählen z.B. das Verhältnis von Omega-3 zu Omega-6-Fettsäuren und der Gehalt an CLA’s (conjugated linoleic acids), aber auch das allergene Potential der Milch sowie bakterizide oder blutdrucksenkende Proteine sind Gegenstand der Forschung (SCHUBERT UND JAHREIS, 1999). Eine ganz andere Ebene der Milchqualität wird von Seiten der Demeter-Produzenten berücksichtigt: die ganzheitliche3 Produktqualität. Sie soll mit Hilfe der bildschaffenden Methoden (z.B. Steigbild (BALZER-GRAF UND BALZER 1991) oder Biokristallisation (KAHL et al. 2006)) dargestellt werden (genaueres siehe Kapitel 3). Im Bereich der Produktqualität ist insbesondere das Fettsäuremuster der Milch ziemlich ausgiebig untersucht, umso weniger ist über die Eiweiß- und Metabolit- Zusammensetzung und die ganzheitliche Qualität der Milch bekannt. 2 Demeter-Milch darf z.B. nicht homogenisiert werden (DEMETER 2009). 3 Mit „ganzheitlicher Qualität“ ist die Gesamtheit aller Eigenschaften gemeint, die dem Produkt immanent sind. Es geht um mehr als die Summe der Einzelteile. Auch deren Beziehungen zueinander und zu der Umwelt sind von Bedeutung. Die gefügehafte Totalität aller Teile und die Gesamtheit der Eigenschaften und Beziehungen wird betrachtet. Einleitung - Stand der Forschung 21 1.3.2. Bedeutung der Fütterung für die Milchqualität Eine intensive Fütterung mit Maissilage und hohem Kraftfutteranteil ist auf Biohöfen seltener anzutreffen als auf konventionellen Betrieben und hat deutlich Nachteile hinsichtlich der Fettsäurezusammensetzung im Vergleich zu Grassilage- oder Wiesenheumilch: Heumilch hat deutlich mehr CLA’s und a-Linolensäure als Silage-Kraftfutter-Milch (KUSCHE et al. 2010, NOZIERE et al. 2006, LEIBER et al. 2005, SHINGFELD et al. 2005). Den nachteiligen Effekt von erhöhter Kraftfuttergabe aus nicht-ölhaltigen Grundstoffen auf die Milchqualität zeigten z.B. DEWHURST et al. (2003a und b) im Fettsäuremuster und JOHANNSON-PIESCHL (1996) mit bildschaffenden Methoden. Weidehaltung und artenreiche Grünlandzusammensetzung wirken sich positiv auf das Fettsäuremuster der Milch aus (KUSCHE et al. 2010, WESTERMAIER 2006). In der Winterfütterung muss jedoch auf Heu oder Silage zurückgegriffen werden. Aus Sicht der Käserei ist eine Heufütterung für die Hartkäseproduktion von Vorteil: Heu-Milch hat deutlich weniger Chlostridiensporen als Silage-Milch (GINZINGER 2005). Auch die botanische Zusammensetzung des Heues hat einen Einfluss auf die Käsequalität (VERDIER-METZ et al. 2000). SCHUBERT UND JAHREIS (1999) führen aus, dass bei Rationen mit hohem Kräuter- und Faseranteil und geringem Kraftfuttereinsatz mehr langkettige ungesättigte Fettsäuren als Ausgangsmaterial für die Bildung von CLA’s zur Verfügung stehen bzw. die Aktivität von Butyrivibrio fibrisolvens im Pansen höher ist und mehr CLA’s produziert werden, die sich zum Teil dann in der Milch wieder finden und somit zu einer erhöhten Milchqualität führen (s.a. COLLOMB et al. 2002b). Einen wirklichen Vergleich von Heu- vs. Grassilage-Fütterung mit bzw. ohne Kraftfutter führten GRAVES et al. (1938) durch und konstatieren, dass die Heufütterung zu höherer Milch- und Butterfettleistung führt als Silagefütterung (bei gleichem Kraftfutterniveau). KERR UND BROWN (1963a und b) stellen fest, dass Heufütterung (mit erhöhtem Kraftfuttergehalt) zu mehr Trockenmasse-Aufnahme führt, Butterfettgehalt und – Menge waren bei Silagefütterung jedoch höher – möglicherweise hat die Kraftfuttergabe bei der Heu-Variante den Pansen-pH-Wert reduziert, so dass die Rohfasern durch die Bakterien nur ineffizient genutzt werden konnten. Die Ergebnisse von SHINGFIELD et al. (2005) weisen auf positive Effekte der Heufütterung hinsichtlich des Fettsäuremusters hin (erhöhte Werte für n-3 und n-6, trotz geringerer Aufnahme aus dem Futter, kein Effekt auf den CLA-Gehalt). NOZIERE et al. (2006), LEIBER (2005) und HURTAUD et al. (2002) konnten zeigen, dass eine reine Heufütterung zu erhöhtem Gehalt an langkettigen einfach und mehrfach ungesättigten Fettsäuren führt im Vergleich zu (Mais-) Silage-Kraftfutter-Fütterung. Auch EHRLICH (2006) und BAARS et al. (2005) konnten im Betriebsvergleich die als qualitätsmindernd einzustufenden Einflüsse von vor allem Maissilage auf z.B. die Fettsäurezusammensetzung der Milch zeigen. Es gibt nur wenige Studien, die sich mit dem Eiweiß-Muster, den Eiweiß-Strukturen oder der Metabolit-Zusammensetzung der Milch befassen. D’AURIA et al. (2005) stellten die Ähnlichkeit bzw. Unterschiede zwischen verschiedenen Säugern dar, MARLETTA et al. (2007) analysierten Eselmilch im Hinblick auf phänotypische Variationen im Proteinmuster. COULON Einleitung - Stand der Forschung 22 et al. (2001) stellten fest, dass sich die Eiweiß-Menge und Zusammensetzung von Kuhmilch weder vom Fütterungsniveau (Energie- und Stickstoffgehalt) noch von unterschiedlicher genetischer Veranlagung deutlich beeinflussen lässt, dass jedoch trotzdem große tierindividuelle Unterschiede in den Verkäsungseigenschaften festzustellen waren. Die Ursachen hierfür sind nicht hinreichend geklärt, der Tatbestand muß jedoch bei weiteren Untersuchungen berücksichtigt werden. Der Einfluss von Futterrüben auf die Milchqualität wurde u.a. von FERRIS et al. (2003) und ERIKSSON et al. (2004) untersucht - sie konnten keinen milchleistungssteigernden Effekt durch Futterrüben feststellen, bei zusätzlichem Einsatz guter Silage trat eher ein negativer Effekt auf die Milchleistung auf. EHRLICH (2006) und JANS (1983) stellten einen Effekt auf die n-3 bzw. (kurzkettigen) SFA fest – diese treten bei Futterrüben-gabe vermehrt in der Milch auf. Welchen Einfluss die Futterrüben auf weitere Qualitätsparameter der Milch haben wie z.B. das Fettsäuremuster oder die Eiweißzusammensetzung war jedoch bei Beginn der Untersuchungen noch nicht bekannt. Mittlerweile liegt von RENNA et al. (2010) ein Bericht vor, demzufolge die Futterrüben zu erhöhten CLA-tr7cis,9, CLA-tr10,tr12 und CLA-tr10,cis12 (und geringer delta9-desaturase) führen (bei gleichzeitigem Weidegang), der gesamte CLA- Gehalt ist unbeeinflusst. Einige Demeter-Landwirte sind der Meinung, dass eine Winterfütterung aus (kräuterreichem) Heu, Futterrüben und einer geringen Menge an (Hafer-) Schrot besonders vorteilhaft sei. Das Heu könnte aufgrund der oben angeführten Ergebnisse tatsächlich zu einer Qualitätsverbesserung führen. Hafer als fettreichstes Getreide kann z.B. beim Menschen die Omega-3-Gehalte erhöhen. Die Futterrüben sind nicht direkt erklärbar, sondern nur aus dem anthroposophischen Weltbild heraus zu verstehen: In der biologisch-dynamischen Wirtschaftsweise wird neben den Inhaltsstoffen der Ration auf die ‚Vitalqualität’4 der Futterprodukte geachtet. Heu von alten Grünlandvegetationsflächen kann nach VAHLE (2004) als eine an Lichtenergie reiche Nahrung für Kühe aufgefasst werden, und auch die Futterrüben (und der Hafer) werden als „reich an Licht und Wärme“ angesehen und sollen auf diese Weise die Milchqualität positiv beeinflussen. Für die Praxis der biologisch-dynamischen Landwirte ist somit von Interesse, wie sich diese speziellen Futtermittel (Futterrüben, Heu, kräuterreiches Dauergrünland) auf die Milchqualität auswirken. 4 synonym zu „innere Qualität“ oder „ganzheitliche Qualität“ – Beschreibt Eigenschaften von Lebensmitteln, die mit herkömmlichen Methoden nicht direkt zu erfassen sind. Z.B. die bildschaffenden Methoden versuchen, diesen Qualitätsaspekt wiederzugeben (FIBL 2006). Einleitung - Stand der Forschung 23 1.3.3. Bedeutung der Hörner für die Milchqualität Die Enthornung wird in Laufställen durchgeführt, um die Verletzungsgefahr für Mensch und Tier zu reduzieren. Den Untersuchungen von WAIBLINGER et al. (2000) zufolge besteht jedoch bei gutem Mensch-Tier-Kontakt keine erhöhte Gefahr durch hörnertragende Kühe. In der biologisch- dynamischen Wirtschaftsweise wird sogar gefordert, dass die Kühe nicht enthornt werden (DEMETER-BUND 2004). Einerseits aus Gründen des Tierschutzes und aus Respekt vor dem Tierwesen (Tierintegrität (VERHOOG et al. 2007, Unversehrtheit des Tieres / Schmerz –TASCHKE 1995), andererseits mit dem Argument, dass die Hörner für die biologisch- dynamischen Präparate benötigt werden. Im Rahmen einer Diplomarbeit (WOHLERS 2003) konnte jedoch mit der Steigbildmethode festgestellt werden, dass es wiederholbare Unterschiede gibt in der Milchqualität zwischen horntragenden und enthornten Kühen. Die Kupferchlorid- Kristallisation ergab nicht so deutliche Ergebnisse. Einer Goetheanistischen Studie zufolge (SEELBACH 1992) könnten die Hörner mit der Stoffwechselintensität des Rindes in Beziehung stehen, weil die bei der Pansenverdauung entstehenden Gase bis in die Horn-Hohlräume gelangen. Dadurch könnte die Verdauung und letztendlich die Milchqualität beeinflusst werden (s.a. LEIBER 2008). Weiterhin wird von RATH (1998) auf die Funktion der Hörner bei der Thermoregulierung hingewiesen: eine hornlose Kuh könnte zu vermehrtem Abhecheln der Wärme neigen, was sich in einer Speichelreduktion äußern könnte, gefolgt von veränderter Pansen-Physiologie (Acidose) – somit auch hier ein Effekt auf den Stoffwechsel. Um das instrumentelle Enthornen der Kälber zu vermeiden wird vermehrt auf genetische Hornlosigkeit gezüchtet. In der Zuchtwertschätzung können genetisch hornlose Bullen mittlerweile mit Horn-Vererbern konkurrieren (GOEPEL 2007), der Eiweißgehalt der Milch scheint jedoch etwas geringer zu sein (ROSENBERGER UND ROBEIS 2005). Die Hörner scheinen keinen Einfluss auf die Milchleistung zu haben – über andere Qualitätsaspekte wurde bisher kaum berichtet. Diesen Andeutungen zufolge soll der Frage nach dem Einfluss der Hörner (bzw. der Hornlosigkeit) auf die Milchqualität nachgegangen werden. Einleitung - Stand der Forschung 24 1.3.4. Beurteilung von Lebensmittelqualität mit dem Verfahren der Steigbildmethode Die Grundzüge der Steigbildmethode wurden im Jahre 1923 entwickelt - in der Zusammenarbeit von R. Steiner und L. Kolisko entstand die Idee zu den grundsätzlichen Prozeßschritten (abgeleitet von der Chromatographie), um die „Gestaltungskräfte“ in den Untersuchungsgegenständen sichtbar zu machen (vergl. auch ZALECKA 2006, S. 9). In den 50er Jahren wurde von WALA die Methode leicht variiert (s.a. HIRSCHBERGER 2004, S. 11ff). BALZER-GRAF setzte die Steigbildmethode meistens in Kombination mit den zwei anderen Bildschaffenden Methoden (Kupferchlorid-Kristallisation und Rundfilter-Chromatogramme) ein (FIV 1999, BALZER-GARF UND BALZER 1991 und 1987). Das Grundprinzip der chromatographischen Methode ist ein dreiphasiger vertikaler Steigprozeß in Filterpapier von Probenlösung und Reagenzien. Die daraus entstehenden Bilder können auf verschiedene Weise ausgewertet werden (vergl. ZALECKA 2006, S. 13ff, und Kapitel 3.5). Anwendung findet die Methode in vielerlei Zusammenhängen: medizinisch (z.B. KAELIN 1965), zur Qualitätsbestimmung von Lebensmitteln / Heilmitteln bzw. Klassifizierung nach Anbausystem (biologisch vs. konventionell) (FRITZ et al. 2007, DORN 2006, ZALECKA 2006, GEIER 2005, ANDERSEN et al. 2004, HIRSCHBERGER 2004, FLECK et al. 2002, BLOKSMA et al. 2001, BALZER-GRAF 2001 und 1991, JOHANNSON-PIESCHL 1996, MANDERA 1995), zur Wirkung von biologisch-dynamischen Präparaten (FRITZ et al. 2009, ENGQVIST 1978), zum Einfluß von Konstellationen auf Pflanzen (FYFE 1978, ZAVESKY 1987). Aufgrund dieser Sachlage wird vermutet, dass mit Hilfe der Steigbildmethode ein Aspekt der Probenqualität erfaßt werden kann, der Auskunft über z.B. den Einfluß vom Wirtschaftsstil (biologisch oder konventionell) gibt. Deshalb wird diese Methode im Rahmen dieser Arbeit als Ergänzung zu den analytischen Methoden gewählt. Aufgrund der Ergebnisse aus der Diplomarbeit von WOHLERS (2003) zum Thema „Auswirkung der Enthornung auf die Milchqualität“ erscheint es hinsichtlich dieser Fragestellung plausibel, sich auf die Steigbild-Methode zu konzentrieren. Bis auf die Untersuchungen von ZALECKA sind jedoch die Methoden der Bildentstehung und Bildauswertung nicht ausführlich dokumentiert bzw. nicht oder nur geringgradig standardisiert. Für eine Anwendung im wissenschaftlichen Kontext ist dieses jedoch Voraussetzung. ZALECKA (2006) konnte im Rahmen einer in-house-Validierung (und in Zusammenarbeit mit zwei weiteren Laboratorien) eine Charakterisierung der Steigbildmethode für Möhren- und Weizenproben durchführen und die Reproduzierbarkeit und Wiederholbarkeit der Methodenergebnisse testen, zur Differenzierung und Klassifizierung von Proben aus verschiedener Herkunft, u.a. Sorte, Düngungsintensität oder konventionellem vs. ökologischem Wirtschaftssystem. Für Milchproben wurde die Methode bis jetzt nur vereinzelt angewendet (z.B. Diplomarbeiten WOHLERS 2003, JOHANNSON- PIESCHL 1996), und es besteht keine standardisierte Methode dafür. Deshalb soll in dieser Arbeit aufbauend auf den Untersuchungen von ZALECKA (2006) die Methode für Milchproben standardisiert und auf ihre reproduzierbare Anwendbarkeit geprüft werden. Einleitung - Stand der Forschung 25 1.3.5. Standardisierung – Charakterisierung – Validierung: Abgrenzung voneinander und Grundlagen Um das Ergebnis eines Laborprozesses in seiner Gültigkeit zu prüfen wird üblicherweise eine sogenannte Validierung durchgeführt, auf Grundage der europäische ISO-Norm 17025:2000, in der die „Allgemeinen Anforderungen an die Kompetenz von Prüf- und Kalibrier-Laboratorien“ dargestellt werden. Die Validierung dient der Prüfung, ob eine Methode geeignet ist, eine bestimmte Frage zu beantworten (KROMIDAS 2000). Eine Validierung, d.h. Prüfung der Eignung, kann nur durchgeführt werden, wenn die Prozesse der Methode standardisiert sind und die tatsächlichen Methodeneigenschaften, d.h. Verfahrensmerkmale der Methode (incl. laborspezifischer Einflüsse wie Temperatur usw.) bekannt, d.h. charakterisiert sind (KROMIDAS 2000). Im Rahmen einer Validierung wäre der erste Schritt die Ermittlung der gewünschten Eigenschaften, der zweite Schritt (und die meiste Arbeit) wäre ein Ermitteln der charakteristischen Eigenschaften der Methode (d.h. Charakterisierung), und der letzte Schritt wäre die Prüfung, ob die gefundenen den gewünschten Eigenschaften entsprechen. Die Charakterisierung ist für die Methodenanwendung von besonderer Bedeutung, da hier die Fähigkeiten und Schwachpunkte der Methode ermittelt werden. Die Standardisierung einer Methode ist die Voraussetzung dafür, dass überhaupt eine Charakterisierung (und darauf aufbauende Validierung) durchgeführt werden kann. Erst durch dokumentierte, eindeutig festgelegte Prozesse bekommt eine Methode ihren „wissenschaftlichen Charakter“, wird lern- und lehrbar und personen-ungebunden anwendbar. Die Durchführung der Charakterisierung, die auch als „Bestimmung der Verfahrensmerkmale“ bezeichnet werden kann, ist auf verschiedene Weise bzw. mit verschiedenen Instrumenten möglich, die auch kombiniert verwendet werden können (Kahl 2007, S. 18, nach ISO 17025, S. 29). 1. Kalibrierung mit Bezugsnormalen oder Referenzmaterialien 2. Vergleich mit Ergebnissen, die mit anderen Verfahren erzielt wurden 3. Vergleich zwischen Laboratorien 4. Systematische Beurteilung der Faktoren, die das Ergebnis beeinflussen 5. Beurteilung der Ergebnisunsicherheit auf der Grundlage wissenschaftlichen Verstehens oder theoretischen Grundlagen des Verfahrens und praktischer Erfahrung. Für diese Arbeit wird das Verfahren / das Instrument Nr. 4 „Charakterisierungsmethode zur systematischen Beurteilung der Faktoren, die das Ergebnis beeinflussen können“ (nach KROMIDAS 2000, S.21, erste Charakterisierungsmethode) verwendet, wie dies von ZALECKA (2006) und KAHL (2007) auch angewendet wurde. Dazu Einleitung - Stand der Forschung 26 werden sämtliche Einflussfaktoren auf das Ergebnis ermittelt und aufgelistet. Die Faktoren mit dem größten Einfluss sollten als erstes geprüft werden. Für ganzheitliche Methoden sind nach KAHL (2007, S. 21f) in einer Methoden- Charakterisierung nicht alle Parameter sinnvoll anzuwenden und zu prüfen, die jedoch für analytische Methoden angewendet werden können. Von besonderer Bedeutung für ganzheitliche Methoden sind folgende Verfahrensmerkmale: a) Methodenpräzision a) „Wiederholbarkeit“ der Ergebnisse (unter Standard-Bedingungen, alle Faktoren gleich, d.h. gleiche Person, gleicher Tag....) b) „Reproduzierbarkeit“ der Ergebnisse (einige Faktoren variieren, d.h. andere Person, anderer Tag...) b) Robustheit : Störanfälligkeit der Ergebnisse durch variierende Bedingungen Das Ziel ist, zu zeigen bzw. zu prüfen, ob die Ergebnisse / die Unterschiede probenspezifisch sind und nicht aufgrund von Laboreffekten auftreten. 1.3.6. Aspekte zur Auswertung von Steigbildern Im Rahmen der Forschung werden gewöhnlich Proben aus einem Experiment dem Untersuchungslabor zur Untersuchung gegeben. Es handelt sich meistens um zwei oder mehrere Proben, die miteinander verglichen werden sollen. Dabei treten bei der Auswertung folgende Fragen auf: 1) Unterscheiden sich die Produkte verschiedener Behandlung in einer oder mehrfacher Hinsicht? 2) Wie groß ist der Unterschied und ist er gesichert? 3) Wenn der Unterschied als gesichert angesehen werden kann, welche Wirkungen kommen darin zum Ausdruck? (PETTERSSON 1967). Zur Beantwortung der ersten Frage können Kriterien bestimmt werden, nach denen die Proben beurteilt werden. Weil bei den Steigbilduntersuchungen üblicherweise mit Doppelproben gearbeitet wird, kann daran, dass die Merkmalsausbildung bei den Doppelproben ähnlicher ist als zwischen zwei Probenvarianten, beurteilt werden, ob sich die Proben unterscheiden. Zur Beurteilung der Stärke des Unterschiedes ist eine geeignete Skala notwendig, mit deren Hilfe die einzelne Resultate verglichen werden können. Dazu können z.B. Formgrößen oder Farbintensitäten dienen, die bonitiert und statistisch ausgewertet werden können. Einleitung - Stand der Forschung 27 Die dritte Frage zielt auf eine Bewertung der Ergebnisse hin. In diesem Schritt muss der Zusammenhang der Ergebnisse mit den Versuchsbedingungen wieder hergestellt werden. Zur Durchführung der zwei ersten Schritte kommen im Hinblick auf die Steigbildauswertung verschiedene Verfahren in Betracht. In ZALECKA (2006) werden einige Prüfverfahren (aus der Sensorik) aufgeführt, die sich alle zur Anpassung an die Auswertung von Steigbildern eignen (siehe Tab 1, ZALECKA S. 42). Je nach der beabsichtigten Aussage kann die eine oder andere Methode geeigneter erscheinen. Prüfverfahren Kurzbeschreibung 1) Paarweiser Vergleich Vorlage identischer oder abweichender Probenpaare 2) Dreieckstest / Triangeltest Vorlage einer oder mehrerer gleichzeitig gereichter Dreierprobengruppen, wobei zwei Proben immer identisch sind 3) Rangordnungs- Prüfung Vorlage von drei oder mehreren Proben in beliebiger Reihenfolge, die auf ein vorgegebenes Kriterium in eine geordnete Reihenfolge zu bringen sind 4) Einfach beschreibende Prüfung Beschreibung sensorischer Eigenschaften mit frei gewählten positiven oder negativen beschreibenden Ausdrücken 5) Profilprüfung Lebensmittel werden nach Art, Intensität und Reihenfolge der wahrnehmbaren Sinneseindrücke beschrieben 6) Bewertende Prüfung mit Skala Vorlage einer oder gleichzeitig mehrere Proben, die anhand von Skalen zu bewerten sind Tab 1. Prüfverfahren, die (nach Anpassung) zur Auswertung von Steigbildern geeignet erscheinen. Auszug aus amtlicher Sammlung § 64 LFBG (2005) Um den ersten Punkt von PETTERSSON zu klären, können bis auf die Methode „einfach beschreibende Prüfung“ alle anderen fünf Verfahren genutzt werden. Die Größe des Unterschiedes (Punkt 2) kann mit Rang-, Profil- und bewertender Prüfung beantwortet werden (alle beruhen auf einer Skalierung der Ergebnisse), und ob die These / Folgerung aus Punkt 3 (mit der Frage, welche Wirkung in dem Unterschied zum Ausdruck kommt) richtig ist, könnte mit einer Klassifizierung geprüft werden, welche wiederum aufgrund einer Profilprüfung, bewertenden oder Rangordnungs-Prüfung vorgenommen werden kann. Eine Klassifizierung beruht darauf, dass Objekte auf Grundlage einer Mustererkennung in (vorgegebene) Gruppen bzw. Klassen eingeordnet werden. Sollte sich das angewendete Muster als „falsch“ oder „ungenügend“ erweisen, wird die Klassifizierung danach auch nicht möglich sein. Insofern könnte als grundlegendes Auswertungsprinzip genannt werden: 1) Es ist zu prüfen, ob sich die Bilder unterscheiden (Differenzierung), mit Hilfe von z.B. Triangel-Test oder Profil-Prüfung. Einleitung - Stand der Forschung 28 2) Die Unterschiede müssen benannt werden (Charakterisierung / Bildmerkmals- Ausprägung darstellen), und möglichst in ihrer Stärke erfaßt werden (z.B. mit Hilfe der Profilprüfung). 3) Der vermutete Zusammenhang der Bildmerkmals-Ausbildung mit speziellen Einflußfaktoren kann mit Hilfe einer Klassifizierung ermittelt bzw. überprüft werden. Die Besonderheit der Steigbildmethode ist die, dass die Bilder üblicherweise visuell und meist personengebunden individuell ausgewertet werden. Ein Überblick der verschiedenen Ansätze ist z.B. in KAHL (2007) und in ZALECKA (2006) zu finden. Dabei kommen Bildkriterien in Betracht, die sich folgenden vier Ebenen zuordnen lassen (s.a. KAHL 2007, WALDBURGER 2005): 1) Quantifizierbare, einzelne morphologische und lokale Merkmale (z.B. Schalentiefe). 2) Qualitative, mit den einzelnen morphologischen Merkmalen verbundene Merkmale (z.B. Regelmäßigkeit). 3) Qualitative, übergeordnete Merkmale, die das ganze Bild beschreiben (z.B. Integration, Koordination). 4) Qualitative, aus einem Training an vielen Bildern definierter Herkunft erfahrene Eindrücke in Bezug zu pflanzenphysiologischen Bedingungen (z.B. Reife, wurzeltypisch). Für eine standardisierte, personen-ungebundene visuelle Auswertung sind Merkmale der Ebene 1 und 2 besonders gut geeignet, da sie sich gut quantifizieren lassen. Es ist ebenso denkbar, eine computergestützte Auswertung dazu zu entwicklen. KRETSCHMER (2003, zit. in KAHL 2007) entwickelte ein Verfahren, um Kristallisationsbilder in einer Profilprüfung zu charakterisieren (und klassifizieren), v.a. mit Hilfe von Merkmalen der 1. und 2. Ebene. ZALECKA (2006) stellt für Steigbilder ein Bild-Bonitur-Schema zur Charakterisierung und Klassifizierung von Steigbildern von Weizen- und Möhren-Proben vor. In WOHLERS (2003) werden eine Vielzahl von Merkmalen zur Bonitur von Milch-Steigbildern verwendet (mit Merkmalen der Ebene 1 und 2), die noch ergänzbar sind. Es bestehen also grundlegende Arbeiten, auf denen in gewisser Weise aufgebaut werden kann. Die Merkmale der Ebene 1 und 2 können als „Grundlage“ für die Merkmale der Ebene 3 und 4 aufgefaßt werden – obgleich in diesen wiederum mehr zum Tragen kommen kann als die „Summe der Teile“ aus Ebene 1 und 2. Die Merkmale der 3. und 4. Ebene werden von langjährig mit der Methode arbeitenden, erfahrenen Menschen zur Beurteilung und Charakterisierung von Bildern verwendet (als umfassende beschreibende Merkmale, als Grundlage für Klassifizierungen...), und sollten mit Hinblick auf eine „ganzheitliche“ Bildbetrachtung mit berücksichtigt werden. Sie bedürfen jedoch viel Erfahrung und innerer Referenzen, um sie sicher anwenden zu können. Einleitung - Stand der Forschung 29 Zur praktischen Bildauswertung ist zu vermerken, dass die Steigbilder (nach WALA) üblicherweise in drei Zonen unterteilt werden, in denen sich verschiedene Bildmerkmale ausbilden: die Basiszone (oder auch Sockel genannt), die Schalenzone (oder auch Tropfen- oder Mittelzone genannt), und die Fahnenzone (deren oberer Bereich z.T. als „Tropfenzone“ bezeichnet wird) - siehe Beispielbilder in Abb. 1:. Je nach Probenmaterial können die Bildmerkmale sehr unterschiedlich aussehen. Insofern ist für jede Substanzgruppe (z.B. Kuhmilch, Molke, Weizen, Möhrensaft / Apfelsaft) eine eigene Liste mit Bildmerkmalen zu definieren, nach denen das Bild beschrieben wird (wie z.B. bei einer Profilprüfung). Abb. 1: a) Steigbild aus verdünntem Möhrensaft, einige Bildmerkmale hervorgehoben (aus: ZALECKA 2006). b) Steigbild aus verdünnter Kuhmilch, einige Bildmerkmale hervorgehoben (aus: WOHLERS 2003). c) Steigbild aus Weizen-Extrakt (eigen). d) Steigbild aus Molke (eigen). Bei der Interpretation werden die Bilder in der Praxis oft auch nach Pflanzenorgan- Bildtypen (vergleiche dazu z.B. MANDERA 1995, GEIER UND FRITZ (unveröff), FRANK 2008) oder anderen Referenz-Bild-Charakteristika (z.B. Reife) beschrieben. Milchbilder werden als Bilder von „kolloidalem“ Charakter (JOHANNSON-PIESCHL 1995) beschrieben. Es lassen sich aber auch Bildmerkmale von z.B. Weizenproben (Samen-Typ) in der Schalenzone finden, oder frucht- bis blütenhafte Merkmale in der Fahnenzone. a) b) c) d) Einleitung - Stand der Forschung 30 Üblicherweise werden für jede Probe Bilder in unterschiedlichen Konzentrationsstufen erstellt, um ein gewisses „Spektrum“ der Merkmalsausprägung abzubilden. Im Rahmen dieser Arbeit werden auch immer je Probe Bilder in mehreren Konzentrationsstufen angefertigt. Bei der Auswertung werden diese Bilder normalerweise untereinander gelegt und wie ein Gesamtbild der Probe betrachtet. Bei der Bonitur zur Profilprüfung jedoch wird z.T. nur die eine Konzentrationsstufe berücksichtig. Einleitung 31 1.4. Hypothesen Zu Ziel 1 (Standardisierung der Steigbildmethode): Der Einfluss verschiedener laborseitiger Faktoren (Probenhandhabung, Tag…) auf die Bildmerkmale der Steigbilder kann abgeschätzt werden. Probenspezifische Eigenschaften spiegeln sich in den Bildmerkmalen wieder. Die Steigbildmethode kann zur Differenzierung, Charakterisierung und Klassifizierung von Milchproben verschiedener Herkunft (Fütterungsunterschiede, horntragende vs. enthornte Kühe) eingesetzt werden. Zu Ziel 2 (Einfluss der Fütterung): Rohmilchproben aus unterschiedlicher Fütterung können mit folgenden Kriterien unterschieden werden: a. Haupt-Milchinhaltsstoffe (Fett-, Eiweiß-, Lactose-, Harnstoffgehalt) b. Fettsäuremuster c. Eiweiß-Zusammensetzung d. Metabolit-Zusammensetzung e. Steigbild Zu Ziel 3 (Einfluss der Hörner): Rohmilchproben von Kühen mit bzw. ohne Hörner können mit folgenden Kriterien unterschieden werden: - Fettsäuremuster - Eiweiß-Zusammensetzung - Metabolit-Zusammensetzung - Steigbild Zu Ziel 4 (Methodenvergleich): Die verschiedenen Methoden führen zu ähnlichen Ergebnissen - hinsichtlich der Unterscheidbarkeit der Proben, - hinsichtlich der Intensität verschiedener Effekte (Futter-, Gruppen- und Zeit- Effekte) - und hinsichtlich der Qualitätsbeurteilung / Charakterisierung. Einleitung – Zur Chronologie der Untersuchungen 32 1.5. Zur Chronologie der Untersuchungen Die Untersuchungen wurden in folgender Reihenfolge durchgeführt: 1) Ermittlung der Faktoren bei der Steigbildmethode, die einen Einfluss auf die Bildmerkmale haben könnten. 2) Bearbeitung eines Teiles dieser Faktoren an Proben, die gezielt dafür genommen wurden. 3) Von zwei Höfen werden Proben zum Thema „Hörner“ genommen und untersucht (2007). Diese Proben dienen gleichzeitig weiteren methodischen Untersuchungen mit der Steigbildmethode. 4) Der Fütterungssystemvergleich A wird durchgeführt – die Proben werden so weit standardisiert untersucht, wie die beeinflussenden Faktoren bekannt sind. Weitere methodische Untersuchungen werden durchgeführt. 5) Erste Proben zum Thema „Wirtschaftsstile“ werden untersucht. 6) Verschiedene Bildauswertungsverfahren werden ausprobiert. Klassifizierungsmerkmale werden gesucht für „horn – enthornt“ und für die vier Wirtschaftsstile. 7) Die grundlegenden methodischen Untersuchungen mit der Steigbildmethode sind abgeschlossen – ein definiertes Verfahren zur Erstellung von Bildern wird ab jetzt angewendet. Vereinzelt werden weitere methodische Fragen bearbeitet, ohne dass es zu Veränderungen des Verfahrens für die zu vergleichenden Proben kommt. 8) Der Fütterungssystemvergleich B wird durchgeführt (Jan-März 2008). 9) Ab dem Frühjahr 2008 werden die Proben fast durchgängig gesondert codiert. 10) Proben zum Thema „Hörner“ (2008) und vom Fütterungssystemvergleich C werden untersucht. 11) Die Klassifizierungsmerkmale zum Thema „Hörner“ und zum Fütterungssystemvergleich C werden ermittelt. 12) Die Bilder zum Thema „Hörner“ werden allesamt neu codiert und daraufhin gruppiert und klassifiziert. 13) Die Bilder von Fütterungssystemvergleich C wurden ausgewertet. 14) Die analytischen Ergebnisse (Milchinhaltsstoffe und Fettsäuremuster) werden ausgewertet. 15) Die proteomischen und metabolomischen Untersuchungsergebnisse werden ergänzt 16) Die Ergebnisse werden zusammengestellt und diskutiert. Material und Methoden – Probenherkunft Fütterungsystemvergleich A 33 2. Material und Methoden 2.1. Probenherkunft (Material) „Fütterungssystemvergleiche“ Zur Frage der verschiedenen Fütterungsfaktoren wurden experimentell 3 Systemvergleiche (on-farm-Experimente) auf 3 verschiedenen biologisch-dynamisch wirtschaftenden Betrieben durchgeführt mit folgenden Varianten: System- vergleich Futter A Ackerfutter-Heu (Kleegras)  Wiesen-Heu (kräuterreiches Dauergrünland) B Weizenschrot  Futterrüben C Wiesen-Heu  Gras-Silage Tab 2. Übersicht über die durchgeführten Fütterungssystemvergleiche und angewendeten Vergleichsrationen. Die Fütterungssystemvergleiche wurden im Winter 2007/2008 (A und B) und 2008/2009 (C) durchgeführt. Die Herden wurden jeweils in zwei „gleiche“ (balanced) Gruppen (mit mind. 11 Tieren je Gruppe) geteilt. Dabei wurde Rasse, Alter, Laktationsstadium und Eutergesundheit berücksichtigt. Z.T. wurden diese Gruppen nochmals in vier Klein-Gruppen unterteilt – wiederum unter Berücksichtigung von Rasse, Alter und Laktationsstadium für möglichst „gleiche“ Gruppen. Die Futter-Varianten wurden im Cross-Over-Design gefüttert mit 2 Tagen Übergangsfütterung, 14 Tagen Futter-Umstellungszeit und anschließend zwei PrN je Periode im Abstand von 1 Woche (ca. 14. und 21. Tag je Fütterungsperiode) Es wurden je PrN-Termin Poolproben je Gruppe (proportional zur Milchleistung) gebildet und untersucht. Z.T. wurden für die Steigbilduntersuchungen die Poolproben unterschiedlich zusammengestellt Die genaue Probenzusammenstellung und Handhabung ist je Fütterungssystemvergleich dargestellt (s.u.). Material und Methoden – Probenherkunft Fütterungsystemvergleich A 34 2.1.1. Fütterungssystemvergleich A (Heuqualitäten): Versuchsbedingungen und Probennahme-Verfahren a) Versuchsbedingungen Der Versuch wurde im Nov. und Dez. 2007 auf einem biologisch-dynamischen Milchviehbetrieb in Norddeutschland durchgeführt. Es wurden 24 Kühe (Angler) für den Versuch ausgewählt und paarweise nach Alter und Laktationsstadium zwei Gruppen zugeteilt. Die Gruppenzusammensetzung ist der Tab 3 zu entnehmen. Bei keinem der dargestellten Werte liegt ein signifikanter Gruppenunterschied vor (p>0,05)– nominal könnte Gruppe „L“ (KG – W) als mit einem etwas höheren Fett- und Eiweiß-Gehalt als Gruppe „R“ (W – KG) eingestuft werden. Es sind Kühe der 1. bis 6. bzw. 8. Laktation in beiden Gruppen vertreten. In der Gruppe „L“ (KG – W) gibt es drei nicht gedeckte Kühe, in der Gruppe „R“ (W – KG) fünf. Von diesen Gesichtspunkten aus sind die Gruppen als „vergleichbar“ zu bezeichnen. Laktationen Lakt.-Tage Milch kg Fett % Eiweiß % Harnstoff Zellzahl Gruppe „L“ (KG–W) 2,67 ± 1,67 140 ± 98 13,45 ± 4,41 5,49 ±1,11 4,06 ± 0,67 217 ± 32 119 ±117 Gruppe „R“ (W–KG) 3,00 ± 2,04 119 ± 94 14,22 ± 4,99 5,11 ± 0,60 3,76 ± 0,44 206 ± 30 96 ± 87 Tab 3. Gruppenzusammensetzung (Alter in Laktationen, Laktationsphase, Milchleistung in kg/Tag, Fett %, Eiweiß %, Harnstoff in ppm, Zellzahl in Tsd.). Mittlere Werte je Fütterungs-Gruppe und Streuung der Werte (± Standardabweichung), am 30.10.07 (MLP) b) Fütterung Die Fütterung erfolgte im Cross-Over-Design. Die Gruppe „L“ (KG – W) wurde erst mit Kleegras-(Ackerfutter-)Heu gefüttert, Gruppe „R“ (W – KG) mit Wiesen-Heu. Danach wurde die Fütterung gewechselt, so dass Gruppe „L“ (KG – W) Wiesen-Heu bekam, und Gruppe „R“ (W – KG) Kleegras-Heu. Gruppe „L“ (KG – W) Gruppe „R“ (W – KG) 1. und 2. PrN (9.-30. Nov. 07) Kleegras-Heu Wiesen-Heu 3. und 4. PrN (1.-15. Dez. 07) Wiesen-Heu Kleegras-Heu Tab 4. Übersicht über die Fütterungsvarianten je Versuchsphase und Gruppe. Die Kühe erhielten Heu ad libitum, mehrfach nachgelegt (ca. 1/3 vom 2. Schnitt, 2/3 vom 1. Schnitt). Zusätzlich zum Heu erhielt jede Kuh individuell entsprechend der Milchleistung etwas gequetschtes Getreide als Ergänzungsfutter (ca. 2,5 kg je Tier und Tag im Herdenmittel). Es konnte Stroh aus der Einstreu aufgenommen werden. Die Futter-Mengen wurden nur annähernd erfaßt. Der Landwirt berichtete, dass das Kleegrasheu lieber und mehr gefressen würde als das Wiesenheu, und dass v.a. bei der Futterumstellung von Kleegrasheu auf Wiesenheu die Kühe die ersten Mahlzeiten sehr Material und Methoden – Probenherkunft Fütterungsystemvergleich A 35 wenig gefressen hätten (bei 3 Mahlzeiten Übergangs-Fütterung). Dann hätten sie sich daran gewöhnt. Das hofeigene Kleegras-Heu war vorrangig vom 1. und 2. Schnitt, sehr kleereich und schön grün, lose in der Heutrocknung getrocknet und auf der einen Seite des Stalles gelagert. Das hofeigene Wiesenheu (kräuterreiches Dauergrünland) war ebenfalls vom 1. und 2. Schnitt, aus Bodentrocknung, in Rundballen gepreßt und in der Scheune gelagert. Der 1. Schnitt war gelb und recht stengelig, was sich in den Analysenwerten wiederspiegelt (z.B. ein Energiegehalt von nur 5,6 NEL, und nur 110g XP/kgTM), der 2. Schnitt schön grün und fein-blättrig – und mit höheren Energie- und Eiweiss-gehalten als der 1. Schnitt. Die Analysewerte der einzelnen Futtermittel können der Tab 5 entnommen werden. Wie zu erwarten, ist im Kleegras-Heu etwas mehr Protein vorhanden, dafür im Wiesenheu mehr Rohfaser (höherer Strukturwert) und sehr viel mehr Zucker. Die RNB ist beim Wiesenheu negativ, der Energiegehalt etwas nieriger als beim Kleegras. PrN Nov 07 Dez 07 Dez 07 Nov 07 Dez 07 Nov 07 Dez 07 Futtermittel Kleegrasheu, kleereich, 1. Schnitt Kleegrasheu, kleereich, 2. Schnitt Wiesenheu, grün, fein, 2. Schnitt Wiesenheu, gelb, stengelig, 1. Schnitt Ø Ø Ø T 910 870 890 910 890 910 900 890 844 867 XA 81,7 86,2 83,95 61,3 82,3 72,4 77,35 87 84,5 85,75 XP 140 169,7 154,85 113,7 127,7 115,6 121,65 130,7 89,4 110,05 XF 229 232 230,5 253,3 296,7 196,8 246,75 336,3 276,7 306,5 XL 17,8 19,1 18,45 19,6 20,5 23,8 22,15 14 15,7 14,85 XZ 144,3 96 120,15 172,7 106,7 172,3 139,5 37 155 96 OADF 282,3 293,3 287,8 263,3 308,7 205,7 257,2 371 296 333,5 ONDF 423,7 412 417,85 506 631,7 409,5 520,6 681 540,3 610,65 ADL 59,1 60,9 60 37,4 38,4 45,2 41,8 25,4 34,9 30,15 NFE 531 493 512 552 472 551 511,5 432 533 482,5 NFC 336,3 313 324,65 299,3 317 317,3 317,15 87,3 26,94 57,12 MJ 10,56 10,39 10,48 11,18 9,56 11,55 10,56 8,83 10,23 9,53 MNEL 6,33 6,21 6,27 6,75 5,62 7,05 6,34 5,12 6,1 5,61 NXP 136,84 139,56 138,2 139,55 123,96 145,64 134,8 116,46 125,37 120,92 RNB 0,51 4,87 2,69 -4,09 0,65 -2,98 -1,17 2,33 -5,82 -1,75 SW 2,82 2,86 2,84 3,14 3,72 2,65 3,19 4,24 3,45 3,85 Tab 5. Analyseergebnisse der verwendeten Futtermittel im Versuch A: „Wiesenheu vs. Kleegrasheu“, je kg TM Material und Methoden – Probenherkunft Fütterungsystemvergleich A 36 Futtermittel (kg TM) je Ration: "Wiesenheu" "Kleegrasheu" Wiesenheu, gelb, grobstengelig 8,82 Wiesenheu, grün, fein 4,95 Kleegrasheu, 1. Schnitt 9,79 Kleegrasheu, 2. Schnitt 3,18 Hafer 0,44 0,44 Gerste 0,44 0,44 Roggen 0,44 0,44 Werte der Rationen "Wiesenheu" "Kleegrasheu" Futteraufnahme (kg TM) 14,6 14,3 XA (g) 1161 1053 XP (g) 1658 2050 dXP (%) 70 70 XF (% TM) 27 22 XL (g) 264 282 XZ (g) 1349 494 ADF (% TM) 31 23 NDF (% TM) 50 42 ADL (% TM) n.b. 5,36 NfE (g) 7241 7492 NEL (MJ) 87 93 nXP (g) 1858 2004 RNB -27,06 26,68 Strukturwert 53 37 Milcherzeugungswert (kg Milch aus NEL) 12,49 13,92 Tab 6. Theoretische Zusammenstellung der Rationen und daraus ermittelte Werte der Rationen für den Fütterungssystemvergleich A „Wiesenheu vs. Kleegrasheu“. Den Beobachtungen zufolge fraßen die Kühe die Kleegrasration lieber – und nahmen somit vermutlich mehr Futter auf als die Vergleichsgruppe mit Wiesenheu. c) Probennahme und Probenzusammenstellung sowie Analysen Milchproben wurden am 14. und 21. Versuchstag sowie nach Futterwechsel am 14. und 16. Tag genommen, jeweils vom Abendgemelk. Die Milchmenge wurde je Tier erfaßt. Die Proben wurden für die Analysen je Fütterungsgruppe proportional zur Milchleistung gepoolt, sowie zu Kleingruppen à 3 Tieren zusammengefasst, so dass vier unabhängige Wiederholungsproben entstehen (Probenzusammenstellung und Analysenplan in Tab 7). Die 8 Poolproben (je Fütterungsgruppe und Fütterungsperiode zwei Proben) wurden auf das Fettsäurenmuster und die Hauptmilchinhaltsstoffe untersucht, sowie mit der Fluoreszenz-Anregungs-Spektroskopie und der Steigbildmethode. Für die Proteomik und Metabolomik wurden die Proben der 1. und 2. PrN sowie der 3. und 4. PrN nochmals gepoolt, so dass insgesamt 4 Proben untersucht wurden. Zusätzlich wurden die Proben der Klein-Gruppen auf die Milchinhaltsstoffe untersucht, die Milchleistung wurde je Kuh erfasst. Futterproben wurden an denselben Tagen wie die Milchproben genommen. Material und Methoden – Probenherkunft Fütterungsystemvergleich A 37 Gruppe „R“ Gruppe „L“ Angewandte Methoden bei PrN Futter PrN 1 + 2: Wiesenheu PrN 3 + 4: Kleegrasheu PrN 1 + 2: Kleegrasheu PrN 3 + 4: Wiesenheu Poolprobe je Fütterungs- Gruppe R 1. und 2. PrN: 12 Kühe 3. PrN: 11 Kühe (Kuh 12 trocken) 4. PrN: 10 Kühe (Kuh 12 und 1 trocken) L 1. und 2. PrN: 12 Kühe 3. und 4. PrN: 11 Kühe (Kuh 21 trocken) F, E, L FS Prot / Metab FAS SB 1,2,3,4 1,2,3,4 (1+2),(3+4) n.b. 1,2,3,4 Klein- Gruppe R1 R2 R3 R4 L1 L2 L3 L4 F, E, L… 1,2,3,4 Kuh-Nr 1, 2, 3 4, 5, 6 7, 8, 9 10, 11, 12 13, 14, 15 16, 17, 18 19, 20, 21 22, 23, 24 Milchleistung (je Kuh) 1,2,3,4 Tab 7. Probenzusammenstellung und angewandte Methoden bei Fütterungssystemvergleich A (Wiesenheu vs. Kleegrasheu) d) Probenhandhabung Zum Melken wurden die Kühe je Fütterungsgruppe in den Melkstand getrieben, vorgemolken, gereinigt und in 30-l-Kannen gemolken und Proben genommen. Nach dem Melken (auf dem Hof) wurde eine Poolprobe je Fütterungs-Variante erstellt. Diese Probe wurde für die Biophotonen- und Steigbild-Untersuchung direkt in die jeweils vorgesehenen Flaschen abgefüllt, der Rest (für F-E-L-, FS- und Rückstellproben) wurde wieder in eine Literflasche gefüllt und erst später im Labor endgültig abgefüllt. Die Proben wurden mit Eisakkus gekühlt ins Labor gebracht. Bei Ankunft im Labor (3h Fahrzeit) waren die Proben auf ca. 6-12°C runtergekühlt. Material und Methoden – Probenherkunft Fütterungsystemvergleich B 38 2.1.2. Fütterungssystemvergleich B (Futterrüben vs. Weizen): Versuchsbedingungen und Probennahme-Verfahren a) Versuchsbedingungen Der Versuch wurde im Februar und März 2008 auf einem biologisch-dynamisch wirtschaftenden Betrieb bei Frankfurt a.M. durchgeführt. 28 Kühe (Schwarzbunte alter Zuchtrichtung) wurden unter Berücksichtigung ihres lebenslangen Stall-Platzes in zwei Gruppen aufgeteilt, die hinsichtlich Alter, Laktationsphase, Milchleistung, Zellzahl, Harnstoff, Fett- und Eiweißgehalt vor Beginn der Untersuchung (MLP 8.2.08) vergleichbar waren (keine signifikanten Unterschiede bei p=0,05). Die eine Gruppe hat eine tendenziell etwas höhere Milchleistung als die andere. Anzahl Kühe Anzahl Laktationen Lakt.- Tage Milch kg Fett % Eiweiß % Zellzahl in Tsd. Harnstoff ppm Gruppe „d“ (FuR-W) 16 3,75 ± 2,06 166 ± 99 17,5 ± 6,0 3,9 ± 0,5 3,6 ± 0,4 191 ± 144 163 ± 41 Gruppe „LR“ (W-FuR) 12 4,17 ± 2,33 117 ± 86 22,1 ± 4,9 4,2 ± 0,5 3,4 ± 0,2 163 ± 124 177 ± 59 Tab 8. Gruppenzusammensetzung (Alter, Laktationsstadium, Milchleistung, Fett- und Eiweißgehalt, Zellzahl, Harnstoff), Mittelwerte der Gruppen und Streuung der Werte (±Standardabweichung). b) Fütterung Der Versuch ist im Cross-Over-Design angelegt. Alle Kühe erhielten das gleiche Grundfutter. Das Ergänzungsfutter der Gruppe „d“ (FuR-W) bestand im Februar aus Futterrüben (im Gruppenmittel 30kg FM je Tier), dasjenige der Gruppe „LR“ (W-FuR) aus 4 kg FM Weizen. Am 26. Feb. wurde die Fütterung der Gruppen gewechselt. Zusätzlich konnte Stroh aus der Einstreu aufgenommen werden. Gruppe „d“ (FuR-W) Gruppe „LR“ (W-FuR) 1. und 2. PrN (7.-25. Feb.) Futterrüben Weizen 3. und 4. PrN (26.Feb. – 20. März) Weizen Futterrüben Tab 9. Fütterungsvarianten der Gruppen je Füttterungsperiode. Die Futterrüben-Ration hat deutlich mehr Zucker sowie einen etwas höheren Strukturwert als die Weizen-Variante. Ansonsten sind die Fütterungen einander sehr ähnlich. Material und Methoden – Probenherkunft Fütterungsystemvergleich B 39 Futtermittel (kg TM) je Ration: "Weizen" "Futterrüben" Futterrüben 3,6 (= 30kg FM) Weizenschrot 3,52 (= 4kg FM) Luzerne-Gras-Heu 1. + 2. Schnitt 5,95 5,95 Luzernegrasheu, überständig 2,6 2,6 Luzernegrasheu, früh geerntet 1,76 1,76 Luzernegrasheu + Roggen 1,34 1,34 Wiesenheu 2. Schnitt (Grummet) 2,64 2,64 Wiesenheu 1. Schnitt 0,88 0,88 Werte der Rationen: "Weizen" "Futterrüben" Futteraufnahme (kg TM) 18,69 18,77 XA (g) 1290 1586 XP (g) 1912 1857 dXP (%) 73,76 72,75 XF (% TM) 26,61 27,27 XL (g) 364,43 332,83 XZ (g) 1060 2878 ADF (% TM) 30,87 31,5 NDF (% TM) 50,35 50,98 NfE (g) 10061 9887 NEL (MJ) 102,82 100,22 nXP (g) 2335 2281 RNB -59,11 -58,79 Strukturwert 55,12 59,08 Milcherzeugungswert (kg Milch aus NEL) 19,82 19,03 Tab 10. Theoretische Zusammenstellung der Rationen und daraus ermittelte Werte der Rationen für den Fütterungssystemvergleich B „Weizen vs. Futterrüben“. Auffällige Werte fett. Luzerne- Gras-Heu 1.+2.Schnitt Luzerne-grasheu, überständig Luzerne-grasheu, früh geerntet Luzerne-grasheu + Roggen Wiesenheu 2. Schnitt (Grummet) Wiesenheu 1. Schnitt TS 916 866 880 892 879 882 XA 77 79 97 79 73 101 XP 95 96 150 100 80 128 XF 328 326 252 358 353 246 XL 16 20 32 24 17 24 Zucker 79 79 64 64 0 76 ADF 394 344 299 380 409 323 NDF 621 575 535 617 631 513 NfE 484 469 469 484 477 477 NEL 4,62 4,73 5,16 4,17 5,03 5,83 NXP 109 129 129 106 112 130 RNB -2,24 -2,15 3,30 -0,98 -4,70 -0,33 StW 3,90 2,96 2,96 4,27 4,21 2,88 Tab 11. Futteranalysenwerte der einzelnen Futtermittel vom Fütterungssystemvergleich „Weizen vs. Futterrüben“ (bezogen auf TM) Material und Methoden – Probenherkunft Fütterungsystemvergleich B 40 c) Probennahme, Probenzusammenstellung und Analysen Die Milchproben wurden am 15. und 20. Tag nach Beginn des Versuches bzw. nach Futterwechsel genommen. Es wurden Einzeltierproben vom Abendgemelk genommen, die einerseits zu Poolproben zusammengestellt wurden, aber auch als Einzeltierprobe untersucht wurden. Futterproben wurden an denselben Tagen genommen. Die Einzeltierproben wurden auf die Haupt-Milchinhaltsstoffe hin untersucht (Fett, Eiweiß, Lactose, Harnstoff, Zellzahl) sowie die Milchmenge je Abendgemelk erfaßt. Zusätzlich wurden Poolproben in zwei Stufen erstellt: für Stufe 1 wurden alle Proben der gesamten Fütterungsgruppe je PrN gepoolt. Für Stufe 2 wurden je Fütterungsgruppe vier Subgruppen gebildet, die zwischen 3 und 4 Einzeltierproben umfassten. In der Gruppe „d“ (W-FuR) wurden je Untergruppe je vier Kühe gepoolt, in der Gruppe „LR“ (FuR-W) wurden je Untergruppe drei Kühe gepoolt. Die Zusammenstellung erfolgte unter dem Gesichtpunkt, „ähnliche“ Gruppen zu bilden (nach Alter, Laktationsstadium usw). Die Poolproben der Stufe 1 (insgesamt 8 Proben) wurden mit allen angewendeten Methoden untersucht, die Poolproben der Stufe 2 wurden auf Fettsäuren, Haupt-Milchinhaltsstoffe (F-E-L) und mit der Steigbildmethode untersucht. Für die Proteomik wurden die Proben der 1. und 2. sowie 3. und 4. PrN nochmals gepoolt, so dass hier insgesamt 4 Proben analysiert wurden. Gruppe d (= „W – FuR“) Gruppe LR (= „FuR– W“) Angewandte Methoden bei PrN Futter PrN 1 + 2: Weizen PrN 3 + 4: Futterrüben PrN 1 + 2: Futterrüben PrN 3 + 4: Weizen Poolprobe je Fütterungs- Gruppe (Pool-Stufe 1) d- 1., 2., 4. PrN: 16 Kühe 3. PrN: 15 Kühe (Kuh 16 Mastitis) LR- 1. und 2. PrN: 12 Kühe 3. und 4. PrN: 11 Kühe (Kuh 28 trocken) F, E, L Gärprobe FS Prot / Metab FAS SB 1,2,3,4 1,2,3,4 1,2,3,4 (1+2),(3+4) 1,2,3,4 1,2,3,4 Unter- Gruppe (Pool-Stufe 2) d-1 d-2 d-3 d-4 LR-1 LR-2 LR-3 LR-4 F, E, L… Gärprobe (FS) SB 1,2,3,4 1,2,3,4 2, 4 1,2,3,4 Kuh-Nr (Einzeltier) 1, 2, 3, 4 5, 6, 7, 8 9, 10, 11, 12 13,14, 15, 16 17, 18, 19 20, 21, 22 23, 24, 25 26, 27, 28 Milchleistung F, E, L SB 1,2,3,4 2, 4 2, 4 Tab 12. Probenzusammenstellung und angewandte Methoden bei Versuch B (Futterrüben vs. Weizen) e) Probenhandhabung Die zu beprobenden Kühe wurden in Melkeimer gemolken, welche vor Beginn des Melkens mit Wasserdampf sterilisiert wurden. Nach Umrühren wurde eine 1l-Probe je Kuh abgefüllt und in Kühlboxen mit Eisakkus gestellt. Von den direkt nach dem Melken erstellen Poolproben je Fütterungsgruupe wurde ½ Liter für die FAS-Untersuchung abgefüllt, der Rest (ca. 2,5l) in Literflaschen abgefüllt und wie die Reste der Einzeltierproben in Kühlboxen mit Eisakkus kühlgestellt zum Labor transportiert (2,5h Fahrzeit, incl. Probenauslieferung der FAS-Proben). Bei Ankunft waren die Proben ca. 12°C kühl. Im Labor wurden die Proben für die verschiedenen Methoden abgefüllt, codiert und eingefroren bzw. kühlgestellt. Material und Methoden – Probenherkunft Fütterungsystemvergleich C 41 2.1.3. Fütterungssystemvergleich C (Konservierungsverfahren): Versuchsbedingungen und Probennahme-Verfahren a) Versuchsbedingungen Der Versuche wurde vom 10.2. bis 22.3.2009 auf einem biologisch-dynamisch wirtschaftenden Hof bei Alfeld a.d. Leine durchgeführt. Es wurden 22 Kühe (Angler / Harzer Rotvieh) ausgewählt und paarweise nach Alter und Laktationsstadium zwei Gruppen zugeteilt. Die Gruppen sind hinsichtlich Fett, Eiweiß, Harnstoff, Zellzahl, Milchleistung, Alter und Laktationsstadium vergleichbar (keine signifikanten Unterschiede). Anzahl Kühe Anzahl Laktationen Lakt.- Tage Milch kg Fett % Eiweiß % Harnstoff ppm Zellzahl in Tsd. Gruppe „G“ (S-H) 11 3,6 ± 3,3 156 ± 103 15,1 ± 3,8 5,8 ± 1,2 3,9 ± 0,4 188 ± 36 150 ± 77 Gruppe „W“ (H-S) 11 2,3 ± 1,7 176 ± 75 15,9 ± 3,6 5,5 ± 1,1 3,8 ± 0,6 161 ± 20 99 ± 66 Tab 13. Gruppenzusammensetzung (Alter, Laktationsphase, Milchleistung, Fett, Eiweiß, Harnstoff, ZZ). Mittlere Werte je Gruppe ± Standardabweichung am 8.2.09 (MLP). H=Heu, S=Silage b) Fütterung Gruppe „W“ (H-S) Gruppe „G“ (S-H) Datum der PrN 1. und 2. PrN (10.Feb. – 1.März 09) Wiesenheu Silage 22.2.09 und 1.3.09 3. und 4. PrN (2.März- 22.März 09) Silage Wiesenheu 16.3.09 u. 22.3.09 Tab 14. Fütterungsvariante je Gruppe und Fütterungsperiode für Versuch C. Gruppe „W“ (H-S) erhielt in der 1. Periode Heu, Gruppe „G“ (S-H) Silage. (ad libitum). Am 2. März wurde die Fütterung gewechselt. Das Futter wurde vor- und während des Melkens wiederholt nachgelegt. Zusätzlich wurde in beiden Gruppen 3kg TM Kleesilage zur Eiweißergänzung gefüttert. Es konnte Stroh aus der Einstreu aufgenommen werden. Das hofeigene Schrot wurde wie vor dem Versuchsbeginn weiterhin tierindividuell gefüttert, ohne Veränderung bei wechselnder Ration (3,5kg TM / Tag). Die Silagen sind hofeigenes Futter, das Wiesenheu wurde von einem ca. 50 km entfernten Biologisch-dynamischen-Betrieb zugekauft. - Das Wiesenheu (Bodenheu) stammt aus einem Wasserschutzgebiet in der Hildesheimer Börde. Es ist recht langstengelig aber auch blattreich, eher spät geerntet (in Blüte) 1. Schnitt, aber weist auch einen akzeptablen Blattanteil auf und ist eher grün als gelb. - Die Grassilagen sind von lehmig bis tonigen Böden eines Paralleltales zum Leinetal im Alfelder Bergland. Die Ernte fand zu Beginn des Blühens/Ende Ährenschiebens statt (3. Schnitt, GS stengelig)) bzw. mit Beginn des Ährenschiebens (1. Schnitt, GS fein), das Erntegut ist mäßig feucht, etwas braun. Material und Methoden – Probenherkunft Fütterungsystemvergleich C 42 - Die Kleesilage ist von eher magerem, teils mit Kalkschotter versetztem lehmig- tonigem Boden desselben Tales, kurz vor der Blüte geerntet (3. Schnitt), aber verhältnismäßig feucht und ziemlich braun. (Rotklee-Vermehrungsfläche). Die Futteranalysen zeigen, dass (wie zu erwarten) das Wiesenheu einen höheren Rohfaseranteil hat (später geerntet als die Silage), einen höheren Strukturwert, jedoch geringere Protein- und Fett-gehalte, sowie einen geringeren Energiegehalt als die Silagen. Die Futterwerte der einzelnen Futtermittel können der Tab 16 entnommen werden. Die Futtermengen konnten nur annähernd erfasst werden, genaue Messungen je Tier wurden nicht durchgeführt. Die Kühe fraßen aber offensichtlich das Wiesenheu sehr gerne, nachdem sie sich an die „andere Struktur“ (nach vorheriger Silage) gewöhnt hatten. Die Kleesilage wurde immer sehr gerne gefressen. c) Probenhandhabung, Probennahme, Proben-Zusammenstellung sowie Analysen Am 14. und 21. Versuchstag sowie nach Futterwechsel wiederum am 14. und 21. Versuchstag wurden von allen 22 Kühnen Proben genommen, jeweils vom Abendgemelk. Die Kühe wurden in der Anbindung in 30 l-Melkkannen gemolken, die vor dem Melkbeginn mit kochendem Wasser sterilisiert wurden und anschließend ohne auszuspülen für die nächste Kuh wieder verwendet wurden. Das Gemelk jeder Kuh wurde umgerührt und 1 l abgefüllt und zwischen Eisakkus kühlgestellt. Im Labor (1 h Fahrzeit) wurden die Proben für die verschiedenen Untersuchungen (F-E-L, Fettsäuren, Gärprobe, Biophotonen, Steigbilder) aufgeteilt und eine Poolprobe je Fütterungsvariante hergestellt (proportional zur Milchleistung). Für die Steigbilduntersuchungen wurden Poolproben auf verschiedene Weise zusammengestellt – siehe Tab 15. Gruppe W Gruppe G Angewandte Methoden bei PrN Futter PrN 1 + 2: Wiesenheu PrN 3 + 4: Silage PrN 1 + 2: Silage PrN 3 + 4: Wiesenheu „Normal-Misch“ 5(gepaart) - Poolprobe je Fütterungs- Gruppe Kuh 1 – 9 (+ 10 bei 1. PrN) Kuh 12 – 20 (+21 bei 1. PrN) F, E, L Gärprobe FS Prot / Metab FAS SB 1,2,3,4 1,2,3,4 1,2,3,4 n.b. 1,2,3,4 1,2,3,4 Kuh-Nr (Einzeltier) 1 – 11 12 – 22 Milchleistung F, E, L Gärprobe (SB) 1,2,3,4 1,2,3,4 1,2,3,4 1,2,3,4 Tab 15. Proben-Zusammenstellung und angewandte Methoden bei Versuch C (Wiesenheu vs. Silage) 5 Für die Steigbildmethode wurden folgende zwei weiteren Poolproben zusammengestellt, bei reduzierter (GuM) bzw. erhöhter (MaxM)Tieranzahl je Poolprobe. „Maxi-Misch“ (Max-M) Kuh 1 – 9 + 10 + 11 + 23 Kuh 12 – 20 + 21 + 22 Gärprobe SB 4 4 „Gute-Misch“ (GuM) Kuh 1 – 5 Kuh 12 - 16 Gärprobe SB 2,3 2,3 Material und Methoden 43 PrN 22.02.09 22.03.09 22.02.09 22.03.09 22.02.09 22.03.09 22.02.09 22.03.09 GS stengelig Ø GS fein Ø Klee 3. Schnitt Ø Wiesenheu Ø T 483,9 391,3 437,6 654,6 498,6 576,6 288,9 327,9 308,4 880 870 875 XA 88,3 85,5 86,9 96,4 109,3 102,85 124,4 88,7 106,55 66 76,7 71,35 XP 116,8 136,4 126,6 121,4 130,4 125,9 189,4 172,2 180,8 81,2 73,7 77,45 XF 254,5 299,1 276,8 223,1 246 234,55 172 262,2 217,1 367 383,3 375,15 XL 25,4 24,2 24,8 29,3 31,9 30,6 40,5 28,3 34,4 15,2 13,9 14,55 XZ 115,1 31,5 73,3 92,8 48,1 70,45 34,6 25,9 30,25 73,9 64,9 69,4 oADF 306 358,8 332,4 294,9 291,6 293,25 234,8 328,2 281,5 406 417 411,5 oNDF 451,5 461,8 456,65 431,7 435,7 433,7 295,7 392,6 344,15 649 690,3 669,65 ADL 65,4 81,7 73,55 71,6 63,1 67,35 57,1 80,8 68,95 54,1 63,5 58,8 pH 5,13 5,8 5,465 5,47 5,12 5,295 4,67 5,45 5,06 0 Gb 53,96 45,35 49,655 52,6 50,84 51,72 44,35 43,54 43,945 50,9 47,33 49,115 NfE 515 456 485,5 531 483 507 474 449 461,5 471 452 461,5 MJ ME 10,15 9,16 9,655 10,21 10,15 10,18 10,57 9,54 10,055 8,78 8,31 8,545 MJ NEL 6,04 5,35 5,695 6,1 6,07 6,085 6,4 5,62 6,01 5,07 4,76 4,915 nXP 128,75 120,99 124,87 130,12 130,86 130,49 144,55 130,66 137,61 108,31 102,02 105,165 RNB -1,88 2,4 0,26 -1,46 -0,14 -0,8 7,11 6,61 6,86 -4,37 -4,48 -4,425 SW 2,98 3,54 3,26 2,59 2,88 2,735 1,95 3,08 2,515 4,65 4,87 4,76 Tab 16. Analysewerte der verwendeten Futtermittel im Fütterungssystemvergleich C: „Wiesenheu vs. Silage“, je kg TM. GS=Grassilage Futtermittel (kg TM): "Wiesenheu" "Silage" Wiesenheu 11,35 GS stengelig 4,38 GS fein, trocken 5,77 KG 3. Schnitt 1,85 1,85 Gerste 1,76 1,76 Weizen 1,76 1,76 Werte der Rationen: "Wiesenheu" "Silage" Futteraufnahme (kg TM) 16,7 15,5 XA (g) 1091 1256 XP (g) 1579 1981 dXP (%) 60 62 XF (% TM) 28,8 19,9 XL (g) 327 447 XZ (g) 877 816 ADF (% TM) 21 26 NDF (% TM) 40 42 ADL (% TM) n.b. n.b. NfE (g) 8836 8656 NEL (MJ) 96 101 nXP (g) 2012 2118 RNB -70 -23 Strukturwert 59 35 Milcherzeugungswert (kg Milch aus NEL) 14,6 15,6 Tab 8. Theoretische Zusammenstellung der Rationen und daraus ermittelte Werte der Rationen für den Fütterungssystemvergleich C "Weizen vs. Futterrüben". Auffällige Werte fett. Material und Methoden – Probenherkunft „Hörner“ 44 2.2. Probenherkunft (Material) „Hörner“ a) Versuchsbedingungen Die Frage der Hörner wurde in Zusammenarbeit mit 11 Praxis-Betrieben bearbeitet, die sowohl horntragende als auch enthornte Kühe aufgestallt haben. Zu folgenden zwei Fragen werden gezielt Proben zusammengestellt: a) enthornt als Kalb vs. horntragend b) enthornt als Kalb vs. enthornt als Kuh (nachträglich) vs. horntragend Die Betriebe wurden großenteils mit Hilfe der Berater von Demeter Bayern Erzeugerring e.V., der Demeter-Beratung in Baden-Württemberg und dem Ökoring Niedersachsen ermittelt, zusätzlich wurden über persönliche Kontakte weitere Betriebe ermittelt. Es wurden alle Betriebe ausgewählt, bei denen je Gruppe mindestens 5 Tiere je Variante zum innerbetrieblichen Vergleich vorhanden waren. b) Fütterung Alle Proben wurden bei Sommerfütterung (frisches Gras, Weidegang) genommen. Auf einzelnen Höfen wurde ergänzend Silage oder Heu gefüttert, ergänzt durch Kraftfutter (leistungsabhängig). Die Fütterungsbedingungen je Hof sind im Anhang C im Zusammenhang mit den Steigbildergebnissen je Hof zu finden. c) Probennahme Die Proben zum Thema „Horn“ wurden während der Weidesaison 2007 und 2008 genommen. Ein Betrieb (Hof 4) wurde in beiden Jahren beprobt (wiederholt), jedoch bei veränderter Gruppenzusammenstellung. Je Betrieb wurden drei Wiederholungsproben genommen (im wöchentlichen Abstand). d) Probenzusammenstellung und Analysen Es wurde angestrebt, die Gruppen je Betrieb im gepaarten Design zusammenzustellen, wobei Rasse, Alter, Laktationsstadium und Eutergesundheit im Vordergrund standen. Eine Übersicht über die Höfe und die Gruppenzusammenstellung ist in Kapitel 3.2. im Anhang C zu finden. Es ist zu vermerken, dass einige Betriebe aufgrund der Umstellung auf biologisch-dynamische Wirtschaftsweise ab einem gewissen Zeitpunkt nicht mehr enthornt haben – somit ist auf einigen Betrieben dieser Alterseffekt vorhanden, der ein gepaartes Design nicht zuläßt. Es gibt aber auch Höfe, auf denen ein gepaartes Design möglich war. Die meisten Höfe haben ausschließlich eigene Nachzucht – vereinzelt wurden Zukäufe zur Aufstockung der Herde vorgenommen, dies v.a. auf Hof 5. Hof 2 bot die Möglichkeit, eine dritte Gruppe zu beproben (mit Kühen, die ca. 1 Jahr vor der Probennahme als Kuh enthornt wurden). Die genauen Umstände je Hof finden sich im Anhang, als Material und Methoden – Probenherkunft „Hörner“ 45 Vorspann zu den Steigbild-Ergebnissen je Hof. Um den Faktor „Alter“ in den Ergebnissen mit zu berücksichtigen wurden auf einem Betrieb zusätzliche Proben von jungen und alten horntragenden Kühen genommen. Die Milchproben wurden vom Einzeltier genommen und zur Analyse je Gruppe gepoolt (proportional zur Milchleistung), und z.T. auch als Einzeltierproben untersucht. Für die Steigbild-Untersuchungen wurden von einigen Höfen zusätzliche Poolproben gebildet, die leichte Variationen (meistens reduzierte Tieranzahl) im Vergleich zur primären Poolprobe aufwiesen. Dies wurde gemacht, um potentielle Mastitis-Fälle auszuschließen oder die Gruppen vergleichbarer zu machen. Dabei wurde in Kauf genommen, dass die tierindividuellen Eigenschaften (bei geringerer Tier-Anzahl je Pool) deutlicher hervortreten könnten. Die Poolproben wurden neben den Analysen auf Fettsäuremuster auch auf Fett, Eiweiß, Lactose, Harnstoff, Zellzahl, pH-Wert und Gefrierpunkt untersucht sowie mit der Steigbildmethode beurteilt und zum großen Teil auch mit der FAS-Methode untersucht. Zusätzlich wurden Proteom- und Metabolom-Analysen an ausgewählten Proben vorgenommen. e) Probenhandhabung Die zu beprobenden Kühe wurden in 30l Melkkannen gemolken und je ein Liter vom Gemelk in eine Glasflasche abgefüllt und sofort in Kühlboxen zwischen Eisakkus kühlgestellt. Der Transport zum Labor dauerte je nach Entfernung des Hofes zwischen ½ h und 35h (gekühlt). Im Labor wurden die Proben zu Poolproben zusammengestellt und untersucht bzw. an die untersuchenden Labore weitergegeben. Material und Methoden – Probenherkunft „Hörner“ 46 2.2.1. Datengrundlage zur Frage „enthornt vs. horntragend“ Auf jedem Hof wurden die zwei Gruppen „enthornt“ und „horntragend“ gebildet und beprobt. Die Hälfte der Betriebe hatte ältere enthornte Kühe und jüngere horntragende. Wenn gleichaltrige horntragende und enthornte Kühe vorhanden waren, so war dies meistens aufgrund von Tier-Zukäufen der Fall. Hof 6, Hof 7 und Hof 2 haben als einzige Betriebe vergleichsweise ähnlich alte Kühe beiderlei Varianten aus eigener Aufzucht. Genaueres zu den Umständen je Hof im Anhang C, im Vorspann zu den SB-Ergebnissen je Hof. Angewendete Methoden auf Poolproben (+ Einzeltierproben) Fett, Eiweiß, Lactose Fettsäure muster Proteomik / Metabolomik Steigbilder Fluoreszenz- Anregungs- Spektroskopie Hof 1 X (+ ET) X X (+ ET) X Hof 2 X X X X X Hof 3 X X X X Hof 4 (2007 + 2008) X X X X Hof 5 X X X X Hof 6 X (+ ET) X X (+ ET) X Hof 7 X X X X X Hof 8 X X X X Hof 9 X X X X Hof 10 X X X X Hof 11 X X X X (Hof 12)* X X X X X Tab 17. Angewandte Methoden bei den Proben zur Thematik “Horn”. + ET = zusätzlich Einzeltierproben untersucht. Für die proteomischen / metabolomischen Untersuchungen wurden nicht alle drei Wiederholungsproben untersucht. Bei Hof 2 wurde die Probe vom 17.6. (GuM) analysiert, für Hof 7 die Poolproben vom 12. und 19.7. gepoolt, und von Hof 12 die Poolproben vom 3. und 12.7. * Auf Hof 12 wurden die Gruppen „Enthornt“ mit „genetisch Hornlos“ verglichen. Im Methodenvergleich werden diese Proben nicht weiter verwendet, jedoch dienen sie bei den proteomischen und metabolomischen Untersuchungen als weitere Vergleichsproben. Nähere Angaben zu Probenmaterial und Ergebnissen im Anhang. 2.2.2. Datengrundlage zur Frage „nachträglich enthornt“ Auf einem Hof (Hof 2) gab es die Möglichkeit, drei Varianten zum Thema „Horn“ zu untersuchen: Gruppe 1: als Kalb enthornt Gruppe 2: horntragend Gruppe 3: als Kuh enthornt, wobei evtl. ein Abstufungseffekt („Konzentrationseffekt“) auftreten könnte in der Art, dass eine Reihung von Gruppe 1, Gruppe 3, Gruppe 2 zu erwarten sein könnte. Es wäre auch ein „on/off“-Effekt denkbar, weil aber bei lebenden Organismen meistens eine gewisse Trägheit Material und Methoden – Probenherkunft „Hörner“ 47 in der Anpassung an neue Umstände vorliegt, erscheint dieses zweite Schema unwahrscheinlicher, wäre aber auch denkbar. Die Kühe der drei Hornstatus-Varianten wurden im gepaarten Desing auf die drei Gruppen aufgeteilt, so dass immer drei einander „vergleichbare“ Tiere je Hornstatus vorhanden waren (vergleichbar hinsichtlich Rasse, Alter, Laktationsstadium, Zellzahl, Milchleistung). Jede Gruppe bestand aus ca. n=8 Kühen (vereinzelt konnten Tiere nicht beprobt werden). Es wurden im Abstand von 7 Tagen 3x vom Abendgemelk Proben genommen und entsprechend der Milchleistung proportional gepoolt, so dass insgesamt 9 Proben analysiert wurden. Real war die Gruppe 3 (nachträglich enthornt) mit 3,4 Laktationen um 0,4 bzw. 0,6 Laktationen jünger als Gruppe 1 (enthornt) bzw. 2 (horntragend) (siehe Anhang Kapitel 3.2), sowie mit höherem Laktosegehalt (0,1% höher). Das Laktationsstadium liegt im Gruppenmittel zwischen 170 und 225 Tagen. Bei Gruppe 1 tritt bei der 1. und 3. PrN eine erhöhte ZZ auf (siehe Anhang Kapitel 3.3), deshalb wurde für die proteomischen und metabolomischen Untersuchungen nur die Probe vom zweiten PrN-Termin (17.6.) verwendet. Die Milchleistung ist in allen Gruppen sehr ähnlich (21 liter +/- 0,5l). . Material und Methoden: Methode 48 2.3. Vorgehensschritte zur Standardisierung und Charakterisierung der Steigbildmethode für Milchproben Entsprechend der Ausführungen von KROMIDAS (2000) zur Validierung von Labormethoden wird im Rahmen dieser Dissertation zur Standardisierung und Charakterisierung der Steigbildmethode für Milchproben das Verfahren „Charakterisierungsmethode zur systematischen Beurteilung von Faktoren, die das Ergebnis beeinflussen können“ (KROMIDAS 2000, S.21) angewendet. Folgende Schritte werden unternommen: 1) Standardisierung Das Vorgehen zur Standardisierung der Steigbildmethode für Milch umfaßt einerseits, dass alle Prozeßschritte so gestaltet werden, dass sie sich wiederholen lassen, und entsprechend genau beschrieben werden. Außerdem wird zur Überprüfung der gleichmäßigen Anwendung aller Prozeßschritte ein Standard verwendet, anhand dessen Messreihen mit ungewöhnlichen Bild-Merkmals-Ausbildungen aufgedeckt werden können. a. Genaue Beschreibung der Prozeßschritte (Kapitel 3.1). b. Verwendung einer Standard-Probe (destilliertes Wasser und UHT-Milch). 2) Charakterisierung Zur Ermittlung der möglichen Einflußfaktoren auf die Bildmerkmals-Ausprägung / das Ergebnis wird die Probe gedanklich von der Probennahme über die Bildererstellung bis zur Auswertung der Ergebnisse verfolgt und alle denkbaren Einflußfaktoren auf diesem Weg, die sich in der Bildmerkmals-Ausprägung bzw. bei der Auswertung der Bilder äußern könnten, werden aufgelistet. Dabei werden u.a. die Arbeiten von ZALECKA (2006) und STEFFEN (1983) sowie mündliche Mitteilungen (FRITZ 2008) berücksichtigt. a. Mögliche Einflußfaktoren auf das Ergebnis ermitteln (3.2). b. Prüfen der Einfluß-Intensität von laborprozeß-bedingten Faktoren auf das Ergebnis (durch Variation der Standardbedingungen) (Kapitel 3.3.1 - 3.3.7). c. Prüfen der Einfluß-Intensität verschiedener proben-verursachter Effekte auf das Ergebnis (durch Variation der Proben-Eigenschaften) (Kapitel 3.4). d. Beurteilung, welche der Einflußfaktoren bei der Anwendung der Methode besonders berücksichtigt werden müssen (Kapitel 3.5). e. Prüfen der Anwendbarkeit der Methode unter Standardbedingungen auf Milchproben (Kapitel 3.7). Material und Methoden: Methode 49 2.4. Vorgehensschritte zum Vergleich verschiedener Methoden miteinander Zum Vergleich der Ergebnisse verschiedener Methoden miteinander wird folgendermaßen vorgegangen: Je Probensatz (drei Fütterungssystemvergleiche und ein Probensatz zur Thematik „Hörner“) werden die Proben mit mehreren Methoden untersucht (genaueres siehe „Probenherkunft“ und „Angewandte Methoden zur Qualitätsbestimmung“), die Ergebnisse ausgewertet und diskutiert. Der Fokus liegt auf a) Differenzierungsfähigkeit der Methoden. b) Deutlichkeit des untersuchten Effektes im Vergleich zu anderen Effekten. c) Charakterisierungsfähigkeit der Probeneigenschaften und Charakterisierungsresultat. d) Plausibilität der Ergebnisse je Methode - aufgrund von Bestätigung in der Literatur bzw. Zusammenhang mit den Einflussfaktoren. e) Qualitativer Vergleich der Ergebnisse der verschiedenen Methoden untereinander – je Probensatz, mit Fokus auf Differenzierungsfähigkeit und vorgenommener Charakterisierung. Es wird dann von einer „ähnlichen Charakterisierung“ gesprochen, wenn die Beschreibungen der Probeneigenschaften von mehreren Methoden logisch miteinander in Beziehung zu bringen sind bzw. denselben Tatbestand / Sachverhalt mit verschiedenen Begriffen erläutern. Die Ergebnisse der vier Probensätze werden miteinander verglichen im Hinblick auf ähnliche Gruppierungen der Proben und auf ähnliche Charakterisierung, und die Eigenschaften der Methoden (welcher Art die Aussagen sind, zu welchen Probenaspekten eine Angabe gemacht wird) werden diskutiert. Material und Methode: Methoden 50 2.5. Angewandte Methoden zur Qualitätsbestimmung Folgende Milchqualitäts-Parameter wurden erfasst: - Fett-, Eiweiß-, Lactose-, Harnstoffgehalt, Zellzahl, pH-Wert (HVL Alsfeld) - Gärprobe (im Haus, J. Wohlers) - Fettsäuremuster (Uni Jena, Labor Jahreis / D. Kusche) - Proteomik (Proteome Factory Berlin, S. Mosler) - Metabolomik (Max-Planck-Institut Potsdam, S. Mosler) - Fluoreszenz-Anregungs-Spektroskopie (KWALIS, Dipperz) - Steigbilder nach Wala (im Haus, J. Wohlers) 2.5.1. Fett-, Eiweiß-, Lactose-, Harnstoff-gehalt, Zellzahl, pH-Wert Der Gehalt an Fett, Eiweiß, Lactose und Harnstoff sowie Zellzahl und der pH-Wert werden bestimmt, um die molkerei-üblichen Qualitätsparameter zu erfassen. Untersuchungs-Methode: Die Bestimmung erfolgt an frischen, gekühlten Proben beim HVL Alsfeld per Fourier Transform InfraRot Messung im MilkoScan FT6000, sowie per Durchfluss-Zytometrie mit spezifischer Fluoreszenz-Färbung zur Zählung des Gehaltes an somatischen Zellen mit Fossomatic 5500. 2.5.2. Gärprobe Mit der Gärprobe kann man sich einen Eindruck des „natürlichen Säuerungsverlaufs“ der Probe verschaffen. Der Prozeß kann auch als „spontaner Abbauprozeß“ bezeichnet werden. In der Käserei wurde früher damit geprüft, inwieweit die Probe „käsereitauglich“ war, also wie die Verkäsungseigenschaften sind. Da dieses einerseits von der mikrobiellen Besiedelung der Probe, aber auch den vorhandenen Nährstoffen für die Mikroorganismen und die Eiweiß-arten und ihrem Ausflockungsvermögen (u.a.) zusammenhängt, ist mit dieser Methode die „Ganzheit“ der Probe berücksichtigt, und insofern kann von einer „ganzheitlichen“ Methode gesprochen werden. Das Ergebnis ist einerseits der nach einiger Zeit erreichte pH-Wert, andererseits die äußere Gestalt, das Aussehen der Probe. Untersuchungs-Methode: Es wurden (Hausintern, vom Autor selber) 2x 17ml der Milchprobe in Glasfläschen abgefüllt, locker zugeschraubt, für 48h bei 37°-38°C im Wasserbad bebrütet und Gärtypus und pH-Wert bestimmt (s.a. SIENKIEWICZ UND KIRST, 2006). Material und Methode: Methoden 51 2.5.3. Fettsäuremuster (GC-MS) Das Fettsäuremuster wurde bestimmt, um eine analytisch-ganzheitliche Erfassung der Fettqualität zu erhalten. Es ist ein relativ gut erforschter Qualitätsparameter, Fütterungseinflüsse auf das Fettsäuremuster sind vielfach untersucht. Untersuchungs-Methode: Die Bestimmung erfolgte in der Universität Jena (Labor Jahreis, durch D. Kusche) an gefriergetrockneten Proben. Nach der Fettextraktion werden die FAME (Fatty acid methyl esters) mit zwei unterschiedlichen Gas-Chromatographie- Prozeduren (GC-17 V3; Shimatzu) analysiert, um die gesamten C-4 bis C-26-Fettsäuren zu identifizieren und deren Verteilung zu bestimmen und um die cis und trans-Isomere der 18:1- Fettsäure voneinander zu separieren. Eine genaue Darstellung der Prozedur findet sich in KRAFT et al. (2003). Auswertung: Die Daten werden auf Ausreißer geprüft. Die Fettsäuren, die sich aufgrund von a) flachen Peaks / geringen Mengen oder b) dicht aneinander liegenden Peaks nicht gut reproduzierbar bestimmen liessen, wurden a) entweder aus der Auswertung ausgeschlossen oder b) zusammengefasst als Summe mehrerer Fettsäuren in die weitere Auswertung aufgenommen (siehe Ergebnisse). 2.5.4. Proteomik (nLC-ESI-MS/MS) Die Eiweiß-Zusammensetzung wurde an ausgewählten Poolproben (explorativ) ermittelt. Sie war von Interesse, weil mit der Komplexität der Zusammensetzung von Milch ihre biologische Funktion, Lebensmittelqualität und gesundheitliche Bedeutung für den Konsumenten zusammenhängen. Bei der Proteomik werden zahlreiche Proteine für den quantitativen Vergleich zwischen verschiedenen Proben in einem Messgang erfasst. Bei diesem methodischen Ansatz, Mulitplexanalytik, werden die Änderungen des Gehaltes der detektierbaren Proteine als Gesamtheit erfasst (also eine Annäherung an Ganzheit). Die Gegenüberstellung solcher Profile ermöglicht, die Unterschiedlichkeit von Proben zu bemessen, die dafür maßgeblichen Bestandteile zu erkennen und nach systemisch- funktionellen Zusammenhängen zu suchen. Da es für die Milchproteomik noch keine Routineverfahren gibt, wurde die Aufgabe dem analytischen Dienstleister "Proteome Factory AG", Berlin, angetragen, die Herrn Dr. Mosler mit der Pilotierung beauftragte. Die anschließende Auswertung erfolgte in Zusammenarbeit mit Dr. Mosler. Untersuchungsmethode und Auswertung: Die bei -18° C eingefrorenen Milchproben (Pool-Proben) wurden aufgetaut. Nach zehnminütiger Zentrifugation bei 3000x g wurde Magermilch unter der gebildeten Fettschicht herauspipettiert und mit Ameisensäure angesäuert. Die ausgefallenen Caseine wurden bei 14000x g für 1 h abzentrifugiert. Fettreste im Überstand wurden durch eine synthetische Filtermemran abgetrennt. 400 µl geklärte Molke wurden bei 0° C mit 1600 µl 100% Methanol Material und Methode: Methoden 52 für 1 min auf einem Vortex gemischt. Nach 1 h bei -24° C wurden die präzipitierten Molkenproteine bei 14000x g für 1 h sedimentiert. Der Methanolüberstand wurde für die Metabolomik verwendet. Das Proteinsediment wurde in 6 M Urea/ 2 M Thiourea aufgelöst, in Aliquots von 50-100 µg Protein trypsiniert, entsalzt, die Carbonylgruppen acetyliert und die Schwefelgruppen reduziert. Anschließend wurden die tryptischen Peptide in Aliquots von ca. 10 µg in einem Vakuumkonzentrator eingetrocknet. Für die zwei Messungen jeder Probe wurden die Peptidsedimente in Trichloressigsäure gelöst, in einem Flüssigchromatographen (Proxeon nanoLC) aufgetrennt und durch Electrospray-Ionisierung in ein Tandemmassenspektrometer (Thermo Fisher LTQ) eingeleitet, das die intakten Peptide und deren Fragmentfamilien massenanalysierte. Aus den rohen Massenspektraldaten wurden mit der Software MS-Quant die Aminosäuresequenzen der erfassten Peptide bestimmt. Die Aminosäurenabfolge der zuverlässig sequenzierten Peptide wurden mittels der MASCOT- Suchmachine in der Proteindatenbank SwissProt Mammalia Rinderproteinen zugeordnet. Eine Proteinannotation wurde als zuverlässig betrachtet, wenn für mindestens ein spezifisches Peptid die Fehlerwahrscheinlichkeit p < 0,01 war. Die relative Quantifizierung beruhte auf der von MASCOT errechneten Proteinhäufigkeit in der Probe (emPAI, exponentially modified Protein Abundance Index), die auf die zu vergleichenden minoren Molkenproteine normalisiert wurde. Zum statistischen Probenvergleich wurden mittels der Software Multi-Experiment Viewer Hauptkomponentenanalyse, t-Test, Heatmapping und hierarchische Clusterung an logarithmierten mittelwertnormierten Datensätzen durchgeführt. 2.5.5. Metabolomik (GC-TOF-MS) Die Metabolit-Zusammensetzung der Proben wurde wie die Protein- Zusammensetzung an ausgewählten Poolproben (explorativ) ermittelt. Es sind dieselben Proben wie für die Protein-Analyse. Die Methode wurde aus denselben Gründen wie die Proteomik gewählt (siehe auch dort), nämlich durch Multiplexanalytik Zusammensetzungsunterschiede zu erfassen. Besonderes Interesse gilt der Frage, ob und inwieweit Haltungsfaktoren wie Futter und Hornstatus den Stoffwechsel von Milchkühen und damit auch die Milchzusammensetzung verändern. Metabolomische Profiluntersuchungen haben sich in den letzten Jahren an Pflanzen zunehmend bewährt, stellen aber hinsichtlich Milch methodisches Neuland dar. Mit der Pilotierung von Milchmetabolomik wurde wie bei der Proteomik Dr. Mosler beauftragt, der diese Messungen am MPIMP durchführte. Untersuchungsmethode und Auswertung: Die deproteinierten methanolischen Molkeextrakte wurden auf 4% des Ausgangsvolumens eingeengt. Aus diesem wässrigen Restvolumen wurde durch Zugabe des vierfachen Volumens 100%igen Methanols, das den internen Standard 13C-Sorbitol enthielt, und initialer Ultrabeschallung auf Eis die Laktose auskristallisiert. Für die Dreifachbestimmung jeder Probe wurden drei Aliqots von je 250 µl des Überstandes Material und Methode: Methoden 53 vollständig eingetrocknet. Zur Messung wurde jedes Sediment in Pyridin aufgenommen, trichlorsilyliert, methoxyaminiert und mit einer Mischung von acht Standardalkanen versetzt. An die gaschromathographische Auftrennung schloss sich die Fragmentierung und Erfassung in einem Flugzeitmassenanalysator an. Die Bearbeitung und Auswertung der Massenspektraldaten erfolgte mit der Software TagFinder. Zwecks Vergleichbarkeit wurden die Chromatogramme aller Proben mittels der Standardalkane synchronisiert (Retentionszeitindex), zeitgleich verlaufende Fragment-Peaks geclustert und für jedes Cluster auf einer einzigartigen Fragmentmasse quantifiziert. Die Annotation erfolgte jeweils durch manuellen Vergleich des Fragmentspektrum eines deutlichen Peaks mit den Spektren der Golm Metabolite Database. Zum Vergleich der relativen Intensität einzelner Metabolit- Peaks zwischen verschiedenen Messungen wurden die Messwerte auf den 13C-Sorbitol- Peak standardisiert. Etwaige Ausreißer wurden mit dem Nalimov-Test für Dreifachbestimmung identifiziert und eliminiert, wenn der Variationskoeffizient über 50% lag. Zum statistischen Probenvergleich wurden mittels der Software Multi-Experiment Viewer Hauptkomponentenanalyse, t-Test, Heatmapping und hierarchische Clusterung an logarithmierten mittelwertnormierten Datensätzen durchgeführt. 2.5.6. Fluoreszenz-Anregungs-Spektroskopie (FAS) Mit der FAS wird versucht, einen ganzheitlich-holistischen Aspekt der Proben zu erfassen. Die Methode hat das Potential, ökologische von konventionellen Proben zu unterscheiden (STRUBE et al 2007). Die Methode beruht darauf, dass Proben nach vorhergehender Anregung durch Licht langfristig fluoreszieren, d.h. Licht niedrigerer Energie emittieren. Diese Emission verläuft probenspezifisch und wird gemessen. Da für Milch bis jetzt noch keine Erfahrungen vorliegen dienen diese Proben gleichzeitig der Prüfung, inwieweit diese Methode für Milch geeignet ist. Die Untersuchungen wurden von KWALIS durchgeführt (KWALIS Qualitätsforschung Fulda GmbH, Fuldaer Str. 21, D-36160 Dipperz) und die Ergebnisse im Untersuchungsbericht P 90311-1 übergeben (siehe Anhang E). 2.5.7. Steigbildmethode nach Wala Untersuchungsmethode: Ein chromatographisches Verfahren, bei dem in einem drei- phasigen Prozeß Substanzlösung und Salzlösungen in Filterpapier aufsteigt. Die entstehenden farbigen und strukturierten Bilder werden nach Bildmerkmalen visuell ausgewertet (umfassende Methoden-Beschreibung siehe: „Standardisierung und Charakterisierung der Steigbildmethode“. Kapitel 3.1). 2.5.8. Milchmengenmessung Die Milchleistung der Kühe wurde erfasst, indem nach dem Melken auf der (geprüften) melkeimer-eigenen Skala die Milchmenge abgelesen wurde. Sehr geringe Mengen (<3l) wurden im Litermaß abgemessen. Material und Methode: Methoden 54 2.5.9. Futtermittel-Analysen Futtermittelanalysen wurden von der VD LUFA sowie vom Fachgebiet Tierernährung hausintern durchgeführt. Die Proben wurden mit der NIRS-Methode im Standardverfahren auf ihren Futterwert hin untersucht. 2.6. Statistische Auswertungen Im Allgemeinen wurden mit Hilfe von JMP 8 die Daten der Milchinhaltsstoffe und Fettsäuren sowie die FAS-Werte und Gärproben-pH-Werte ausgewertet – meistens mit Regressionsanalysen (fit model-Plattform, least square means), z.T. aber auch auf einfache Korrelationen untereinander. Die Auswertung der Proteom- und Metabolom-Ergebnisse ist schon in der jeweiligen Methodenbeschreibung wiedergegeben. Zur Signifikanzbestimmung der Differenzierbarkeit bei den Steigbildergebnissen (Gruppierungen) wurde der Fisher’s Exakte Test eingesetzt (ermittelt mit dem Statistikprogramm „R“). Die Datenauswertung im Einzelnen je Probensatz: Bei Versuch A: Die Milchleistung wurde anhand von Daten von 24 Kühen ermittelt, von denen von allen 4 PrN-Terminen vom Abendgemelk Daten vorlagen. Es wurde mit JMP 8 ein Modell (fit- model-Plattform, least square means) mit drei fixen Effekten erstellt (Futter, Tier, PrN). Der Einfluss der einzelnen Effekt-Anteile wird beurteilt. Die Milchinhaltsstoffe (Fett, Eiweiß, Lactose...) wurden anhand von Daten von 8 Kleingruppen (à drei Kühe) ausgewertet, die von allen 4 PrN-Terminen vorlagen. Es wurde mit JMP ein Modell mit drei fixen Effekten erstellt (Futter, Gruppe, PrN) und die Effektanteile sowie die Güte des gesamten Modells (r² und Signifikanzniveau) beurteilt. Die Fettsäuredaten von je PrN-Termin 2 Vergleichs-Poolproben (bei 4 PrN-Terminen) wurden mit JMP 8 ausgewertet. Es wurde ein Modell mit drei fixen Effekten (Futter, Gruppe, PrN) erstellt und die einzelnen Effektanteile je Fettsäure sowie die Güte des gesamten Modells beurteilt. Die Summe der p-Werte je einzelnem Effekt wird gebildet zur Beurteilung der Bedeutung der einzelnen Effekte für das Fettsäuremuster. Die proteomischen und metabolomischen Daten werden mit Hilfe von t-Tests (zweiseitig, ungepaart) ausgewertet und die Summe der p-Werte je Effekt gebildet. Bei Versuch B: Die Milchleistung sowie die Hauptmilchinhaltsstoffe werden anhand von Daten von 28 Kühen ausgewertet, die von zwei PrN-Terminen (2. und 4. PrN, jeweils Abendgemelk) stammen. Es wird mit JMP 8 ein Modell mit drei fixen Effekten erstellt (Futter, Tier, PrN) und Material und Methode: Methoden 55 die Güte des gesamten Modells sowie der Anteil der einzelnen Effekte an der Gesamtvarianz beurteilt. Für die Auswertung der Gärprobe wurden Daten von allen Poolproben 1. Stufe und 2. Stufe berücksichtigt. Die Auswertung umfasste die Bildung eines Regressions-Modells mit den Faktoren Futter, Gruppe und PrN. Die pH-Werte der 2. und 3. PrN wurden für die Temperaturen 20° und 37° getrennt ausgewertet. Zusätzlich wurden Modelle für die 1. bis 3. PrN für 20°C und 2. bis 4. PrN für 37°C gebildet und mit den ersten Ergebnissen verglichen. Die Fettsäuredaten von je PrN-Termin 2 Vergleichs-Poolproben (von allen 4 PrN- Terminen) werden mit JMP 8 ausgewertet. Es wird ein Modell mit drei fixen Effekten gebildet (Futter, Gruppe, PrN) und die Effekt-Anteile je Fettsäure und die Güte des gesamten Modells beurteilt. Die Summe der p-Werte je Effekt werden gebildet zur Beurteilung der Effekt- Bedeutung für das gesamte Fettsäuremuster. Die proteomischen und metabolomischen Daten werden mit Hilfe von t-Tests (zweiseitig, ungepaart) ausgewertet und die Summe der p-Werte je Effekt gebildet. Die Auswertung der FAS-Daten ist im Anhang E wiedergegeben. Es wurden die zwei Probenqualitäten im Rahmen einer ANOVA miteinander verglichen. Die Steigbilder (je Probe vier Bilder) werden auf Grundlage der Bildmerkmalsausprägungen gruppiert. Die vorgenommene Gruppierung wird mit der realen Probenqualität verglichen. Die sich daraus ergebenden Häufigkeiten werden in Kreuztabellen festgehalten und mit dem Fisher’s exakten Test die Unwahrscheinlichkeit dieser Anordnung geprüft (siehe auch Kapitel 3.1.9). Bei Versuch C: Die Milchleistung und die Hauptmilchinhaltsstoffe wurden anhand von Daten von 22 Kühen beurteilt, die von allen 4 PrN vorlagen. Es wurde mit JMP8 ein Modell mit 3 fixen Effekten gebildet (Futter, Tier, PrN) und die Güte des gesamten Modells sowie die Effekt- Anteile beurteilt. Die pH-Werte der Gärprobe wurde mit JMP8 im Regressionsmodell beurteilt. Es wurden Daten von 22 Kühen verwendet, von allen 4 PrN. Es wurde ein Modell mit drei fixen Effekten erstellt: Futter, Tier, PrN. Das Signifikanzniveau der einzelnen Effekte und des gesamten Modells wird beurteilt. Zusätzlich wurden Daten von Poolproben ausgewertet (Mittelwert-Bildung und Streuung). Die Fettsäuredaten von 2 Vergleichs-Poolproben von der 2. und 4. PrN wurden ausgewertet. Es erfolgte eine Mittelwertbildung je Fütterung und mit Hilfe von t-Tests (zweiseitig, ungepaart) wurden je Fettsäure die Effekte Futter, Gruppe und Zeit beurteilt. Die Auswertung der FAS-Daten wird in Anhang E wiedergegeben. Es wurden die Daten mit einer mehrfaktoriellen Varianzanalyse ausgewertet. Material und Methode: Methoden 56 Die Steigbilder wurden in einer leicht variierten Form des Triangeltestes ausgewertet. Die Bestimmung des Signifikanzniveaus aufgrund der tallierten Ergebnisse wurde anhand der Tabellenwerte der DIN-Norm vorgenommen. Thematik „Hörner“: Die Milchleistung der einzelnen Kühe laut MLP und die Hauptmilchinhaltsstoffe der Poolproben von 11 Höfen und je drei PrN-Terminen werden ausgewertet (von einem Hof nur eine PrN, insgesamt n=68 Datensätze). Es wurde mit JMP 8 ein Regressionsmodell mit vier fixen Effekten erstellt (Horn, Gruppe, Hof, PrN) und der Anteil der einzelnen Effekte je Fettsäure beurteilt sowie die Güte des gesamten Modells (r² und Signifikanzniveau p). Die pH-Werte der Gärprobe wurden einerseits auf Korrelation zwischen den Doppelproben-Werten (n=46) untersucht sowie ein Regressionsmodell erstellt mit den vier fixen Effekten Horn, Betrieb, Gärdauer, Zeitpunkt (Kalenderwoche). Die Fettsäuredaten von 10 Betrieben mit je 3 PrN, von 2 Betrieben mit je 1 PrN wurden ausgewertet. Es wurde mit JMP 8 ein Modell gebildet mit den drei fixen Effekten: Horn, Hof, PrN. Die Steigbilder von drei Höfen (jeweils einer PrN) wurdem mit einer leicht variierten Form des Triangeltestes ausgewertet. Die Bestimmung des Signifikanzniveaus aufgrund der tallierten Ergebnisse wurde anhand der Tabellenwerte der DIN-Norm vorgenommen SB-Methode: Standardisierung – die einzelnen Prozeßschritte 57 3. Ergebnisse und Diskussion: Standardisierung und Charakterisierung der Steigbildmethode für Milchproben 3.1. Standardisierung: Die einzelnen Prozeßschritte der Steigbildmethode 3.1.1. Überblick Die Steigbildmethode (in ihren Grundzügen nach WALA) besteht aus drei Phasen, in denen mit Hilfe chromatographischer Prozesse „Bilder“ erstellt werden. Anhand der Bilder werden mittels software-gestützter Bildauswertung oder visueller Bildbeschreibung anhand von Kriterien (Bonitur) Ergebnisse gebildet, die in eine statistische Auswertung einfliessen können. Parallel dazu können die Bilder auch anhand bestimmter Merkmalsausprägungen qualitativ beschrieben werden. Zur Bildererstellung wird bei 20°C und 60%r.F. gearbeitet. In Filterpapier, das zu Rollen geformt ist, werden in drei Phasen (mit ca. 3 Stunden Trocknungszeit zwischen den Phasen) verschiedene wässrige Lösungen aufsteigen gelassen, so dass ein drei-zoniges „Bild“ entsteht. Bei jedem Bildererstellungs-Prozeß werden zusätzlich zu den Untersuchungsproben Standard-Referenzbilder erstellt (UHT-Milch und a.d.). Die einzelnen Verfahrensschritte: A) Probenvor- /auf-bereitung (Rahm untermischen durch Schütteln, verdünnen) B) Bilder erstellen 1. Phase (0,6 ml Probenlösung) 2. Phase (0,7 ml 0,25%ige Silbernitrat-Lösung) 3. Phase (2,0 ml 0,25%ige Eisensulfat-Lösung) Bildentwicklung (Belichtung) C) Bilder auswerten SB-Methode: Standardisierung – die einzelnen Prozeßschritte 58 Abb. 2: Grafische Darstellung des Labor-Ablaufs (mit Probennahme), ergänzt durch die wichtigsten prozeßspezifischen Faktoren und dem charakteristischen Klimaverlauf während der Bildererstellung. SB-Methode: Standardisierung – die einzelnen Prozeßschritte 59 3.1.2. Die Labor-Ausrüstung (Material) Klimakammer: ein Kellerraum (ehemals Fotolabor / Dunkelkammer), ca.8m², knapp 20m³, auf 20°C +/- 0,5° und 60% r.F. +/-5% klimatisiert (Ziel-Werte, tatsächliche Werte gemessen 10cm über der Tischplatte). Die Temperatur wird manuell geregelt (haushaltsüblicher Heißwasser-Heizkörper), die Luftfeuchte wird über einen Passiv- Verdunster auf dem Heizkörper oder bei Bedarf zusätzlich durch feuchte Tücher erhöht und durch einen Entfeuchter automatisch auf 60% r.F. reduziert. Der Raum ist verdunkelt, eine 18W-Neonröhre in der Mitte des Raumes wird bis zu Beginn der 2. Phase verwendet, danach nur noch eine 25W-Glühbirne auf dem Fensterbrett, die nur so lange an ist, wie sie wirklich benötigt wird, um die Bilder unter möglichst geringem Lichteinfluß zu entwickeln. In dem Raum sind zwei Tische, auf denen in je drei Reihen bis zu 72 (max 75) Schälchen versetzt zueinander aufgestellt werden können (je nach Bedarf). Da die Tische verschiedene Klimabedingungen haben (kleiner Tisch auch im Winter oft 0,5°C wärmer / 1,5% höhere r.F. als großer, obwohl er niedriger ist und näher dem Fenster an der Außenwand steht) wird auf jedem Tisch separat das Klima erfaßt und werden Bilder von zu vergleichenden Proben nur auf klimatisch vergleichbaren Plätzen (je Tisch) erstellt. Die Papiere und Kaelin-Schälchen werden in Schubladen unter den Tischen gelagert, die angerührten Reagenzien und sonstigen Gerätschaften werden in den Schränken unter den Tischen gelagert, die Deckelgläser in Kopfhöhe über den Tischen bzw. auf Tischhöhe neben dem Spülbecken. Abb. 3: Labor-Grundriß und Einrichtung SB-Methode: Standardisierung – die einzelnen Prozeßschritte 60 Luftbefeuchter: Firma Benta, passiver Luftbefeuchter (über Filterpapier-Fläche), an den Heizkörper gehängt. Luftentfeuchter: Duracraft DD-TEC10E (Entfeuchtungs-Leistung: Max. 10 l/24 h. Geeignet für Räume bis 80 m². Max. Leistungsaufnahme: 210 W. Luftdurchsatz: ca. 100 m³/h). Stufenweise einstellbar, in 5%-Schritten. Heizung: Warmwasser-Heizkörper, Zentralheizung. Manuell nachregulierbar. Kühlung: -- (nicht notwendig, da der Kellerraum ohne Heizung auch im Sommer nicht über 18°C warm wird). Temperatur- und Luftfeuchte-Messung: 2x Klimalogger TFA 30.3015. Meßbereich: 0°C bis + 59,9 °C (Auflösung 0,1 Grad) und 1 % bis 99 %r.F. (Auflösung 0,1 %, Genauigkeit + - 3 %) – Meßpunkte: A (auf „großem Tisch“) und B (auf „kleinem Tisch“). Destilliertes Wasser: Ultrafiltriertes Wasser von einer Milli-Q-Anlage (Gradient A10). Standard-Spezifikationen: Leitfähigkeit (25°C): 0,056mikro- Siemens/cm; Widerstand (25C): 18 MegaOhm x cm; Total Silica max. Wert: 3mikro-l;TOC: 100mikro-g/l. Standard-Probe (UHT-Milch): Milsani – Haltbare Vollmilch, 3,5% Fett, H-Vollmilch, ultrahocherhitzt (imTetrapack). Hersteller: MWT Erfurt (DE-TH601 EG). MHD: 17.8.07 AgNO3: Silbernitrat pro analysi, Merck Nr. K29053912 138. FeSO4: Eisen(II)Sulfat heptahydrat, Merck Nr. TA988065 132. Filterpapiere: Schleicher & Schuell 2043 A, 500 Stck, 165x170 mm(L x B), mit Lasche (Ausschnitt 2,5cm). Charge Lot EU0416-2, Ref No 10381186. (Die Papiere sind seit Okt.09 wieder bei der ursprünglichen Herstellerfirma Hahnemühle erhältlich, Tel 0049-5561-791-0 oder direkte Durchwahl Frau Wenger -524). Mit Hilfe von Pappröhren werden die Papiere zu je 15 Stück einige Wochen lang vor Verwendung zu Röhren / Zylindern vorgeformt. Deckelglas: sechseckige 1700ml-Gläser („Einmachglas mit Schraubdeckel“). Kaelin-Schale: Ein von W. Kaelin (1965) für die Steigbildmethode entwickeltes Gefäß von 7cm Durchmesser und einer 0,5cm tiefen Rille. Pipette: Eppendorf Research variable, 1000 mikroliter. Meßkolben: 100ml und 200ml, Schott, Duran. Bechergläser: 50ml, Schott, Duran. Scanner: EPSON Perfection 2580 Photo – Scan-Modus ohne automatische Farbanpassungen. Referenzdia: Scanner calibration target; ANSI IT 8.7 und ISO 12641. Reference Files; Charge: M030117; Lieferant Wolf Faust, Frankfurt, Grösse 2x3cm für Reflexionsscanner. SB-Methode: Standardisierung – die einzelnen Prozeßschritte 61 Vorbereitende Prozeduren Abwasch Mit Lauge und alle 2 Monate mit Säure, per Hand. Reinigungsmittel: ASIRAL D(alkalisch) und S(sauer), Pulver. Reinigungs- und Desinfektionsmittel für Melk- und Milchkühlsysteme. Hersteller: Asiral Industriereiniger GmbH, 67433 Neustadt. D-ChNr. 96595, S-ChNr. 94875. Abwaschprozedere siehe Anhang. Fiterpapiere vorbereiten Verfahren: 15 Filterpapiere werden - mit der Lasche rechts oben - mittig auf ein normales Papier (Din A4, quer) gelegt. Durch hin- und her-biegen des Stapels werden die Filterpapiere etwas gegeneinander verschoben und anschließend zu einem Zylinder gerollt und in einer Pappröhre fixiert. Die Papiere werden direkt vor der Probenvorbereitung entnommen, nummeriert und an der Lasche mit einer Büroklammer in Zylinderform fixiert, so dass sich die Papierränder nicht berühren, aber fast auf stoß passgenau beieinander liegen. Diese Röhren werden bis zur Verwendung „auf dem Kopf“ dicht nebeneinander auf einen Nebentisch gestellt. 0,25%ige Silbernitrat-Lösung: Es wird je nach Bedarf 100ml (oder 500ml) Silbernitrat-Lösung angerührt: 0,25g (bzw. 1,25g) Silbernitrat wird mit einem Spatel auf einer Feinwaage auf drei Nachkommastellen genau abgewogen (direkt in einen 100ml-Glas-Meßzylinder oder 500ml Glasflasche) und auf 100g (500g) mit destilliertem Wasser aufgefüllt. Die Lösung wird per Hand geschüttelt, bis sich das Silbernitrat gelöst hat. Die Lösung wird bis max. 2 Wochen nach Anrühren verwendet. 0,25%ige Eisensulfat-Lösung: Siehe Silbernitrat, mit dem Unterschied, dass je nach Bedarf 200ml oder 500ml angerührt werden. SB-Methode: Standardisierung – die einzelnen Prozeßschritte 62 3.1.3. Der Laborprozess (Methode) a) Vorbereitungen 1) Die Filterpapiere müssen als Zylinder geformt und mit Büroklammer fixiert vorbereitet bereitgestellt sein. (Verfahren siehe oben) 2) Die benötigten sauberen Kaelinschalen werden auf dem Steigbild-Tisch entsprechend dem Lageplan aufgestellt. Proben-Vor/Aufbereitung Es wird eine Vorverdünnung (1 Teil Milch zu 3 Teile a.d.) hergestellt, aus der dann entsprechend der gewünschten Endkonzentration zwischen 0,2 und 0,45ml entnommen werden, um in der Kaelinschale die endgültige Verdünnung herzustellen (auf 0,6ml mit a..d. ergänzt). Vorverdünnung erstellen Zur Vorverdünnung wird für alle Proben, die miteinander verglichen werden sollen, in 50ml - Bechergläser 3ml a.d. pipettiert. Dann werden die Milchproben aus dem Kühlschrank (4°C bis 6°C ) genommen und fünf mal hin- und her geschüttelt, damit sich die abgesetzte Sahne mit der Milch gut vermischt. Bei älteren Proben muß manchmal mehr geschüttelt werden, da sich die Sahne klumpig abgesetzt hat. Es werden bis zu 8 Proben dem Kühlschrank entnommen, kräftig geschüttelt und vor die zugehörigen Bechergläser gestellt. Die Probenbezeichnung wird notiert / übertragen. Danach wird für jede Probe eine neue Pipettenspitze aufgesetzt, die Probenflasche sanft einmal auf den Kopf gehalten („schütteln“), hingestellt, aufgeschraubt, direkt 1ml entnommen (aus 1cm Tiefe), und in das Becherglas gegeben, die Pipettenspitze dazu (abwerfen). Sind mehr als 8 Proben miteinander zu vergleichen, werden die folgenden Proben auf dieselbe Weise in 8er Gruppen aufbereitet, bis von allen zu vergleichenden Proben Vorverdünnungen hergestellt sind. Rahm abpipettieren Soll der Rahm (die Sahne / das Fett) einzeln untersucht werden, so wird die sich über 24h im Kühlschrank abgesetzte Sahne verwendet. Die Milchflasche wird vorsichtig ohne Schütteln dem Kühlschrank entnommen, aufgedeckelt und mit einer frischen trockenen Pipettenspitze wird aus 0,5 bis 1mm Tiefe Sahne (0,5ml) entnommen. Dabei wird die Pipettenspitze knapp unterhalb der Oberfläche bewegt, um von verschiedenen Orten Sahne zu entnehmen. Diese so gewonnene Probe wird jetzt wie die normalen Milchproben zur Vorverdünnung in ein Becherglas mit 1,5ml a.d. gegeben (incl. Pipettenspitze). Entrahmte Milch entnehmen Mt einer neuen Pipettenspitze wird durch die Sahneschicht hindurchgestochen bis in die Mitte der Milchfraktion. Hier wird jetzt die Pipette gedrückt, dass die Luft als Blasen austritt und anschließend wird 0,5ml Flüssigkeit aufgenommen. Anhaftende Sahne wird mit einem Haushaltspapier abgewischt, ohne dass die Pipettenspitze berührt wird. Dies wird wie SB-Methode: Standardisierung – die einzelnen Prozeßschritte 63 die normalen Milchproben zur Vorverdünnung in ein Becherglas mit 1,5ml a.d. gegeben (incl. Pipettenspitze). „Streß“-Prozeduren für Milch Zur Ermittlung der Stabilität bzw. Sensibilität der Probe wird für die bildschaffenden Methoden häufig eine sogenannte Streßprozedur angewendet. Es wird hierbei geprüft, ob eine Probe auf eine spezielle Behandlung besonders sensibel reagiert oder stärker verändert wird als die Vergleichsprobe (beurteilt an den veränderten Bildmerkmalen). Ergebnisse von Proben, die einer Streßbehandlung unterlagen, können auch als Referenz zur vergleichenden Qualitätsbeurteilung dienen. So kann eine Probenalterung (Faktor Dauer) ähnliche Änderungen der Bildmerkmale hervorrufen wie die Einwirkung tiefer Temperaturen auf die Probe. Bezeichnet man die Änderung der Merkmale durch Alterung als Degeneration, so kann anhand dieser Referenz eine Degeneration auch bei Bildern von Proben beschrieben werden, die anderen Einflüssen unterlagen. Streß-Prozeduren wurden v.a. im Rahmen der Charakterisierung der Steigbildmethode angewendet, um allgemein die Sensibilität der Proben und die daraufhin auftrende Bildmerkmalsveränderung zu ermitteln. Die Lagerung und der Transportvorgang, der die ursprünglich beim Melken vorliegenden Probeneigenschaften möglichst wenig beeinflussen sollte, wurden auf dieser Grundlage optimiert. Die Alterung der Proben wurde auch bei der Anwendung der Methode zur verbesserten Differenzierung von Proben angewendet, um Probenunterschiede zu verdeutlichen, die sich bei den frischen Proben noch nicht so deutlich zeigten (z.B. SB-Abb-47-Hof_6-081006 oder PrN F der Bilder zum Thema „Wirtschaftsstile“). a) Alterung A) Probe im Kühlschrank bei 6°C mehrere Tage lang stehen lassen (ca. 4 - 6 Tage nach Probennahme / Melkvorgang) B) Als angerührte Lösung für ½ bis 2 Stunden bei 20°C offen stehen lassen. b) Hitze durch Mikrowelle Von den zu vergleichenden Proben werden 80ml in 100ml-Glas-Flaschen abgefüllt. Diese werden nebeneinander in eine haushaltsübliche Mikrowelle gestellt und mit 750W so lange erhitzt, bis die Milch zu Kochen beginnt. Anschließend wird die Probe wieder im Kühlschrank auf 8°C gekühlt und dann wie üblich verwendet. c) Hitze durch Wasserbad Es werden 15ml Milch in 20ml Glas-Fläschchen gefüllt und diese ins ca. 70°C heiße Wasserbad gestellt, bis die Probe die gewünschte Temperatur hat. Es wird mehrfach mit dem Thermometer umgerührt (zum Überprüfen der Temperatur und Vereinheitlichen der Termperatur innerhalb der Probe). SB-Methode: Standardisierung – die einzelnen Prozeßschritte 64 d) Kühlung Zur Abkühlung der melkwarmen Proben wird die in Glasflaschen abgefüllte Milch auf bzw. zwischen Eisakkus gestellt (zugeschraubt). Es wird wiederholt die Temperatur gemessen, bis die Zieltemperatur erreicht ist. e) Frost Es werden 10ml Milch in 20ml Glas-Fläschchen gefüllt, mit einem Schraubdeckel verschlossen und in einen haushaltsüblichen Gefrierschrank gelegt (-18°C). Nach 24h wird die Probe herausgenommen, bei Raumtemperatur aufgetaut (20°C im Labor), und nach Verflüssigung (bei ca. 5°C) direkt anschließend verwendet (wie Frischmilchproben aus dem Kühlschrank). b) 1. Steigphase Es werden insgesamt 0,6ml wässrige Flüssigkeit in die Kaelinschalen appliziert und die vorbereiteten Filterpapiere eingestellt. Vorverdünnung mischen und pipettieren Bei den hier untersuchten Milchproben wird je Probe die Pipettenspitze aus der Vorverdünnung auf die Pipette gesteckt, die Vorverdünnung 4 bis 5 mal per Hand im Kreis geschwenkt, zum vermischen von Milch und Wasser, die Pipette zwei mal gefüllt und in die Vorverdünnung wieder entleert. Die Vorverdünnung wird wiederum drei bis vier mal geschwenkt, die Pipette aufgezogen, entleert (bis zum zweiten Anschlag), wieder aufgezogen und in die Kaelinschale entleert (mit „vorbenetzter Spitze“), die Spitze auf den Rillengrund kurz getippt, wobei anhaftende Tropfen abgestriffen werden, und die in der kurzen Zeit nachgelaufenen Milchreste „ausgepustet“. Der ganze Vorgang findet in einem gleichbleibenden Rhythmus statt, so dass wirklich die gewünschte Menge aus der vorbenetzten Pipette abgegeben wird. Auf diese Weise wird mit jeder Probe verfahren. Alle miteinander zu vergleichenden Proben werden hintereinander pipettiert, danach wird bei allen a.d. ergänzt (siehe „Endverdünnung herstellen“). Endverdünnung in der Kaelinschale herstellen Sind in alle Kaelinschalen die Vorverdünnungen appliziert, wird in derselben Reihenfolge je nach gewünschter Endkonzentration meist 0,3ml a.d. ergänzt. Danach werden die Schälchen alle nacheinander in derselben Reihenfolge vier bis fünfmal im Kreis geschwenkt zum Vermischen von Vorverdünnung und Wasser. Papiere einstellen Ist die Flüssigkeit gleichmäßig in den waagerecht stehenden Schälchen verteilt, können die Papiere mit leicht kreisender Bewegung in die Rille gestellt werden, so daß das Papier an allen Stellen an der niedrigsten Stelle der Rille aufsitzt und senkrecht steht. SB-Methode: Standardisierung – die einzelnen Prozeßschritte 65 Jetzt wird die Lösung von dem Papier aufgesogen und steigt ca. 3 bis 4cm im Papier auf. Die Papiere bleiben die folgenden drei Stunden zum trocknen so stehen. c) 2. Steigphase Papiere markieren Die Filterpapiere werden eins nach dem anderen aus den Schälchen genommen und mit einem Geodreieck wird mit weichem Bleistift eine Markierung einen cm über der ersten Steiglinie angebracht. Danach wird das Papier „auf dem Kopf“ auf einen Nebentisch gestellt. Für jedes Papier wird diese Markierung angebracht. Silbernitrat applizieren Von der 0,25%igen Silbernitratlösung wird in jedes Schälchen 0,7ml appliziert. Es wird in der gleichen Reihenfolge gearbeitet wie bei der ersten Phase. Papiere einstellen und zudeckeln Die Silbernitratlösung wird durch Schwenken der Schälchen im Kreis verteilt. Sind alle Schälchen, deren Bilder miteinander vergleichen werden sollen, vorbereitet, werden die Papiere eingestellt. Jedes Papier wird wieder in sein altes Schälchen gestellt. Bei Bedarf (fast immer nötig) werden die Ecken der Papiere mit Daumen und Zeigefinger wieder zur Mitte gebogen, und das Papier wird wie bei der ersten Phase mit leichtem Drehen in die Schälchen gestellt. Bei bis zu 8 zu vergleichende Bildern werden diese nacheinander in die Schälchen gestellt und daraufhin die 8 dazugehörenden Deckelgläser über die Papiere gestülpt, damit eine annähernde „Gleichzeitigkeit“ des Prozesses in allen Papieren gegeben ist. Sollen mehr als 8 Bilder miteinander verglichen werden, so werden immer zwei Papiere nacheinander in die Schälchen gestellt und sogleich zugedeckelt, danach die nächsten zwei, usw., um eine „gleichmäßige Drift“ zu erhalten. Die Deckelgläser stehen im Labor an unterschiedlichen Orten – und sind somit unterschiedlich klimatisiert (Temperatur / Luftfeuchte). Um den Effekt fassen zu können werden z.B. die Deckelgläser, die direkt an der Wand stehen, immer bei Reihe 1 (an der Wand) verwendet, und die aus Reihe 2 und 3 werden bei Reihe 2 und 3 verwendet. Deckelgläser abnehmen Die Silbernitratlösung benötigt ca. 25 bis 30 min., bis sie die Markierung (1cm über der ersten Substanz-Steiglinie) erreicht hat. Dann werden die Deckelgläser abgenommen. Bei sehr unterschiedlichen Probenqualitäten oder deutlich unterschiedlichen Verdünnungsstufen kann es vorkommen, dass die eine Probe schon die Markierung erreicht hat, während die andere erst an der 1. Steiglinie angekommen ist. Normalerweise steigt das Silbernitrat aber bei allen Proben etwa gleich schnell. Um die Probenunterschiede möglichst präzise zu fassen (incl. Steiggeschwindigkeiten) wird angestrebt (in Anlehnung an J. Fritz), die Deckelgläser möglichst in derselben Reihenfolge abzunehmen, wie sie draufgetan wurden, um jeder Probe die gleiche Steigzeit zu ermöglichen. Wenn die Papiere nicht gerade stehen kommt es vor, dass das Silber auf der einen Seite des Papiers schneller / höher SB-Methode: Standardisierung – die einzelnen Prozeßschritte 66 steigt als auf der anderen Seite – solche „Fehler“ werden mit der Methode „der Reihe nach aufdeckeln“ leichter bemerkt. Auch bei sehr ungleichmäßig steigenden Proben („Steighemmungen“) wird die „mittlere obere Steiglinie“ als obere Steiglinie definiert. Es wird für jede Probe notiert, wann / in welcher Reihenfolge die Deckelgläser abgenommen werden. Trocknungszeit Sind die Deckelgläser abgenommen, bleiben die Papiere für die nächsten 3 Stunden zum trocknen in den Schälchen stehen. d) 3. Steigphase Die Papiere werden aus den Schälchen genommen und wieder „auf dem Kopf“ auf einen Nebentisch gestellt. Eisensulfat applizieren Es wird in alle Schälchen der Proben, die miteinander verglichen werden sollen (wie bei der 2. Phase), 2ml der 0,25%igen Eisensulfat-lösung pipettiert, die Lösung wird durch Drehen der Schälchen verteilt. Papiere einstellen und zudeckeln Die Papiere werden mittig in die Rille der Schälchen gestellt, bei Bedarf werden die Ecken vorher nach innen gebogen, um einen gleichmäßigen Kontakt mit der Lösung und somit gleichmäßiges Aufsteigen zu sichern. Wie bei der zweiten Phase werden die Deckelgläser über die Papiere gestülpt, damit sich die Luftfeuchte darunter erhöht und das Aufsteigen im Papier verstärkt wird. Deckelgläser abnehmen Nach ca. 45 bis 60 Minuten ist die Lösung so hoch gestiegen, dass der Steigrand auf Höhe des unteren Laschenrandes liegt. Jetzt wird das Deckelglas abgenommen. Trocknungszeit Die Papiere verbleiben bis zum nächsten Tag zum Trocknen in den Schälchen. SB-Methode: Standardisierung – die einzelnen Prozeßschritte 67 3.1.4. Dokumentation der Klimadaten Für jeden Bildererstellungstag werden die Temperatur und relative Luftfeuchte im 5- minuten-Takt aufgezeichnet. Für jede der drei Phasen wird der Mittelwert, Streuung der Werte sowie Minimum und Maximum ermittelt. Jede Phase wird wie folgt zeitlich begrenzt: Beginn ca. 10 min. vor Beginn der Pipettierarbeiten – Ende zu Beginn der nächsten Phase bzw. bis nach der 3 Phase die Trocknung abgeschlossen ist (60%r.F. wieder erreicht ist). 3.1.5. Bildentwicklung / Belichtung Die Bilder werden am folgenden Tag eingesammelt und die Büroklammer entfernt und immer ca. 16 auf einmal in die Gegenrichtung gerollt, so dass die Papiere annähernd flach sind. Dann werden sie nebeneinander auf einen Tisch im Büro ins diffuse Tageslicht gelegt, ohne direkte Sonnenbestrahlung, und nach 6 Stunden wieder eingesammelt, mit Datum, Proben-Nummer und Verdünnungsstufe beschriftet. Da sich die Bilder unter Einfluss von Luft und Licht weiterhin leicht verändern, werden die Bilder eingescannt. 3.1.6. Bilder einscannen / aufbewahren Die Bilder werden alle mit Hilfe einer Schablone zusammen mit einem Referenzdia eingescannt (600dpi Farbe, ohne automatische Farbanpassungen usw., Speicherformat .tif (tagged image format)). Zur Aufbewahrung der Original-Bilder werden die Bilder je Tag bzw. je Fragestellung gemeinsam als Stapel in Hängerigster-Mappen gelegt und in großen Register-Kartons im Büro gelagert. SB-Methode: Standardisierte Bildauswertung 68 3.1.7. Standardisiertes Vorgehen bei der Bildauswertung Die Auswertung der Bilder erfolgt in 8 Schritten, wobei drei grundsätzliche Tätigkeiten (unterscheiden, charakterisieren, zuordnen) damit verbunden sind (siehe Abb. 4:): Unterscheidung und Charakterisierung 1) Je Probenahmetermin werden die von gedoppelten und codierten Probe erstellten Bilder einander zugeordnet (nach Bildmerkmalen „gruppiert“). Dazu werden die Merkmale von Schalen- und Sockelzone (z.T. auch Fahnenzone) berücksichtigt. 2) Einzelne Bildmerkmale, die zur Unterscheidung beitragen, werden notiert (Charakterisierung der Proben im Vergleich zueinander). z.T. wird die Ausprägungsintensität der Bildmerkmale auf einer Skala von 0 bis 10 ermittelt. 3) Z.T. werden die Bilder frei charakterisiert – d.h. die Wirkung / der Eindruck, der beim Betrachten der Bilder im Betrachter entsteht, wird festgehalten. Zuordnen bei wiederholter PrN 4) Es wird je PrN-Termin eine Konzentrationsstufe ausgewählt, in der die Unterschiede besonders deutlich sind. 5) Die ausgewählten Beispielbilder werden je Probenahmetermin untereinander gelegt, so dass jeweils die einander ähnlichen untereinander liegen – so dass auf der einen Seite die eine Bild-Gruppe liegt, auf der anderen Seite die andere. Probenspezifische Bildmerkmale ermitteln 6) Bei Bildern der Fütterungssystemvergleiche: Es wird nach Bildmerkmalen gesucht, die sich innerhalb der zwei Gruppen konsistent finden – und gleichzeitig nach Merkmalen, die nach dem zweiten Probenahmetermin die Gruppe wechseln (als Hinweis für das Cross-Over-Design). Klassifizierung nach Probenqualität 7) Bei Versuch C: Die aus der Literatur ermittelten Bildmerkmale werden angewendet. 8) Bei Bildern zur Hörner-Thematik: Die unterscheidenden Merkmale werden herangezogen, um eine Klassifizierung vorzunehmen. Sollten die üblichen / bekannten Klassifizierungsmerkmale nicht notiert sein, werden die Bilder evtl. daraufhin nochmals gezielt ausgewertet. 9) Bei Bildern des Wirtschaftsstiles: Ranking nach dem Merkmal „Intensität der grünen Bereiche“ und anhand der inneren Referenz6 / bekannten Merkmalen wird eine Klassifizierung in die vier Proben-Klassen vorgenommen. Anschließend wird eine Zuordnung der Proben-Bilder bei wiederholter PrN vorgenommen. 6 Bildmerkmale, die dem Beurteiler aufgrund von Erfahrung aus anderem Zusammenhang bekannt sind und auf die Bilder übertragen werden, ohne dass sie gesondert dokumentiert sind. SB-Methode: Standardisierte Bildauswertung 69 Grundsätzliches Vorgehen bei der Bildauswertung: Tätigkeit Ziel / Ergebnis 1) Gruppieren, Reihen Unterscheiden 2), 3), 6) Merkmale beschreiben, bonitieren Charakterisieren 5), 7) , 8), 9) Zuordnung aufgrund von Bildmerkmalen Klassifizieren Abb. 4: Grundsätzliches Vorgehen bei der Bildauswertung. Die Zahlen 1 bis 9 weisen auf die entsprechenden Auswertungsschritte hin (siehe vorige Seite). Bei der Darstellung der Ergebnisse werden die Schritte „Gruppierung“ und „Merkmale beschreiben“ in einer Tabelle zusammengefaßt, der Schritt „Zuordnung“ (der einerseits die Zuordnung von wiederholt genommenen Proben zueinander als auch die Klassifizierung nach Probenqualitäten umfassen kann) wird gesondert davon aufgeführt. Zusätzliche Bildauswertungen: Dieses oben beschriebene Verfahren wird auf alle Bilder angewendet. Bei einigen Vergleichsproben werden weitere Auswertungsverfahren angewendet, um aufzuzeigen, dass auch auf andere Weise eine Unterscheidung der Bilder möglich ist. 1. Beispielhaft an div. Probenpaaren bzw. -quartetten wird mit dem Verfahren der „einfach beschreibenden Prüfung“ bzw. einer „Profilprüfung“ umfassend der Unterschied der Bildmerkmalsausprägungen zwischen den Bildern dargestellt (s.a. Kapitel 3.6.2). Bei allen Probenpaaren sind zumindest einzelne unterscheidende Bildmerkmale dokumentiert. - Anwendung der „einfach beschreibenden Prüfung“ bei z.B. Tab 71 und Tab 72 oder „Anhang B, Versuch A: Bonitur der Steigbilder“ und „Anhang D, PrN A“ - Anwendung der „Profilprüfung“ mit Bonitur der Merkmalsausprägungs-Intensitäten, z.B. bei Standardbildern in Kapitel 3.3.2.4, Kapitel 3.6.2 oder Anhang A, S.12 2. Beispielhaft an 7 Probenpaaren wird ein dem Triangeltest vergleichbares Verfahren angewendet, um aufzuzeigen, inwiefern sich die Probenbilder mit diesem Verfahren unterscheiden lassen und inwieweit von einer statistisch abgesicherten Unterscheidbarkeit gesprochen werden kann (Bilder von Hof 2, 7 und 11 sowie Versuch C, Ergebnisse siehe Kapitel 3.6.1) SB-Methode: Standardisierte Bildauswertung 70 3. Beispielhaft an 7 anderen Probenpaaren werden nicht nur zwei Bilder je Probe und Verdünnungsstufe, sondern jeweils vier Bilder gruppiert und anschließend auf Grundlage von Kontingenztabellen und dem Fisher’s Exakten Test die Wahrscheinlichkeit (bzw. Unwahrscheinlichkeit) dieser Zusammenstellung der Bilder geprüft (siehe Kapitel 3.6.4). 4. An 8 Probenquartetten (vier Proben im Vergleich zueinander) wird ebenfalls auf Grundlage von Kontingenztabellen und dem Fisher’s Exakten Test die Wahrscheinlichkeit (bzw. Unwahrscheinlichkeit) dieser Zusammenstellung der Bilder geprüft (siehe Kapitel 3.6.4). 3.1.8. Angewandte Auswerteverfahren bei den verschiedenen Themengebieten (Übersicht) Charakterisierung der SB-Methode Fütterung Hörner Wirtschaftsstile Ziel / Frage - unterscheiden - charakterisieren - unterscheiden - charakterisieren - klassifizieren (bei Versuch C) - unterscheiden - charakterisieren - klassifizieren - unterscheiden - charakterisieren - klassifizieren Methode - Gruppierung nach Bildmerkmalen - unterscheidende Bildmerkmale erfassen - Gruppieren nach Bildmerkmalen - unterscheidende Bildmerkmale erfassen - Wdh. PrN zuordnen - Fütterungsvariante bestimmen (bei Versuch C) - Gruppieren nach Bildmerkmalen - unterscheidende Bildmerkmale erfassen - Wdh. PrN zuordnen - Hornstatus bestimmen - Gruppieren nach Bildmerkmalen - unterscheidende Bildmerkmale erfassen - Wdh. PrN zuordnen - Wirtschaftsstil bestimmen Codierung Nein Nur beim Versuch C: „Wiesenheu vs. Silage“ Ja Ja Zusätzliche Bildauswertung Var 1: Rahm- Fettarm Var 4: Alterung Var. 2: Versuch C Var. 3: Versuch B Var. 2: Hof 2, 7 u. 11 Var. 3: Hof 1 und 8 Var. 4: Hof 12 Var 1: PrN A Var. 4: alle 6 PrN Zu vergleichende Proben 2 bis n 2 2, (z.T. 3 oder 4) 4 Tab 18. Auswerteverfahren je Themenbereich SB-Methode: Standardisierte Bildauswertung 71 3.1.9. Ausführliche Darstellung der einzelnen Auswerteverfahren (Methoden zur Bildauswertung) Im Folgenden werden die verschiedenen Verfahren, die zur Bildauswertung eingesetzt werden, ausführlich beschrieben. a) Einfach beschreibende Prüfung Die „einfach beschreibende Prüfung“ aus der Sensorik (Norm DIN 10964: 1996-02) wird in der Fassung, wie sie von ZALECKA (2006) für Steigbilder angepaßt wurde, angewendet. Einige Verfahrens-Hinweise sollen hier kurz wiedergegeben werden: Anwendungsbereich: „... zur verbalen Beschreibung der Kriterien von Steigbildern.... Prinzip: Die Kriterien von Steigbildern... werden mit Ausdrücken beschrieben, die entweder frei gewählt oder aus vorgegebenen Listen entnommen werden können. Intensitätsangaben sind hilfreich. ... Allgemeine Begriffe wie „typisch“ oder „atypisch“ sollten nur zusätzlich zu den beschreibenden Begriffen verwendet werden...“ (ZALECKA 2006) ZALECKA (2006) gibt eine Liste mit Bildmerkmalen für Weizen- und Möhren-Proben an – für Bilder von Milchproben wird diese Liste angepaßt (siehe Tab. unten). Diese Liste dient als Leitfaden bei der Bildbeschreibung. Es können aber auch weitere Kriterien zur Bildbeschreibung ergänzend verwendet werden, oder nur einzelne daraus ausgewählt werden. Grundlegende Hinweise zur praktischen Bildauswertung: siehe Kapitel 1.3.6. Tropfenzone T-1 Deutlichkeit: Die Tropfen können mehr oder weniger deutlich zu sehen sein. T-2 Konturen: Die Tropfen können mehr oder weniger deutlich konturiert, von der Zone abgegrenzt sein. T-3 Länge: Die Tropfen können verschieden lang sein. T-4 Die dritte Steiglinie: Diese Linie kann mehr oder weniger deutlich als oberer Rand des Bildmusters erscheinen. Fahnenzone F-1 Parallelität: Der Verlauf der Fahnen senkrecht nebeneinander kann mehr oder weniger parallel sein. F-2 Länge: Die Fahnen können verschieden lang sein. F-3 Auflösung: Die Fahnen können sich mehr oder weniger auflösen, wodurch leere Stellen in der Fahnenzone entstehen. F-4 Kontrast: Die Fahnen können im verschieden starken Kontrast zu den sie umgebenden Farben stehen. F-5 Beweglichkeit: Die Fahnen können mehr oder weniger beweglich erscheinen, sie können sich dabei überlappen, wodurch ein Eindruck der Bewegung in der Fahnenzone entsteht F-6 Breite: Die Fahnen können mehr oder weniger breit sein F-7 Reduktionsflecken: Die Reduktionsflecken sind dunkle Silberablagerungen, die im oberen Bildteil erscheinen können. Sie können mehr oder weniger dunkel und verschieden breit sein. Schalenzone S-1 Geschlossenheit: Der untere Rand der Schalen kann der Basiszone gegenüber geöffnet, zerfetzt, geschlossen sein. S-2 Kontrast: Die Schalen können im verschieden starken Kontrast zu den sie umgebenden Farben stehen S-3 Regelmäßigkeit: Die Formen, Breite und Länge der Schalen innerhalb eines Bildes können mehr oder weniger regelmäßig sein. S-4 Dichte / Dichtigkeit: Die Schalen können mehr oder weniger dicht nebeneinander SB-Methode: Standardisierte Bildauswertung 72 angeordnet sein. (viele schmale Schalen werden als „dichter beieinander“ empfunden, insofern liegt eine höhere „Dichtigkeit“ vor als bei wenigen Schalen. Aber auch große Schalen können als „dicht beieinander“ erscheinen) S-5 Füllung der Schalen: Die Schalen können mehr oder weniger gefüllt erscheinen und / oder Verzweigungen enthalten. Verzweigungen innerhalb der Schalen sind für zuckrige Proben typisch (z.B. Möhrensaft). Bei Milch sind die Schalen sehr schlicht schichtartig „gefüllt“: der untere Rand bläulich-grau, nach oben/innen hin folgt eine mehr oder weniger breite weiße Schicht, gefolgt von einer braunen oder teils mehr grünen inneren „Füllung“, die sich aber linienartig von Schale zu Schale über die gesamte Bildbreite erstreckt und bei den Schalen „dicker“ wird. 6 Farben: Die Schalen können verschieden gefärbt sein. 7 Formen: Die Schalen können verschieden geformt sein. Sie können z.B. mehr oder weniger rund, breit, spitz, zwiebelförmig u.ä. sein. 8 Übergangsbereich: Die Zone, die sich zwischen der Frontlinie der ersten Steigphase und dem unteren Rand der Schalen befindet. Der Bereich kann als mehr oder weniger gefüllt erscheinen. Er kann weiß oder gefärbt sein. Dieses Merkmal ist für Weizenproben relevant, bei Möhrensaft jedoch nicht zu finden. Weil die Milchproben in ähnlicher Weise wie Weizenproben Schalen bilden, ist der „Übergangsbereich“ wie definiert zu finden. Er kann mit einem grauen Band („grauer Schleier“) unterhalb der Schalen z.T. ausgefüllt werden. Oder es entstehen grüne, wolkenartige, undifferenzierte Bereiche unterhalb / anstatt der Schalen, die diesen Bereich mehr oder weniger ausfüllen. Manchmal erscheint auch der Schalenrand wie „abgesunken“, „gelöst“ von der Schale in diesem Bereich. Bei Milch ist diese Zone schon als Teil der Schalenzone zu betrachten. Bei Zalecka wird er der Basiszone (Merkmal 5) zugeordnet. Basiszone 1 Anzahl der Schichten: Die Basiszone kann in mehrere Schichten eingeteilt sein, die mehr oder weniger voneinander getrennt sind. Bei Milch tritt manchmal zusätzlich ein schmaler rostfarbener / rötlich-brauner Streifen am unteren Sockelrand auf. Kurz darüber ist häufig ein etwas hellerer Streifen (weiß bis rosa – grau) 2 Farben: Die Basiszone kann einfarbig oder mehrfarbig sein. 3 Bart: Der Bart ist ein dunkler Streifen, der von der ersten Steiglinie ausgeht und in die Basiszone „runterhängt“. Der Bart kann verschieden breit und mit unterschiedlich geformtem unteren Rand sein. Bei Milch ist der „Bart“ ohne konturierten unteren Rand, insofern eher als ein weiterer dunkel-brauner Streifen im oberen Sockelbereich zu bezeichnen, der von der 1. Steiglinie nach oben hin begrenzt wird. 4 (Kranz:) Der Kranz ist ein heller Streifen, der die Schalen umgibt und ihnen mehr oder weniger folgt. Er kann mehr oder weniger breit, regelmäßig, mit oder ohne Konturen, verschieden gefärbt sein. Dieses Merkmal ist typisch für zuckrige Proben, bei denen der obere Sockelrand nicht mehr als Linie zu erkennen ist – bei Milch sind gänzlich anders geformte Schalen anzutreffen, die mit diesen hier gemeinten nicht vergleichbar sind. 5 Höhe der Basiszone: Die Basiszone kann mehr oder weniger breit / hoch sein, was von den Eigenschaften der zu untersuchenden Probe abhängig ist. 6 Doppellinie: die Basiszone kann bei Milchproben von einer „Doppellinie“ nach oben hin begrenzt sein, die unterschiedlich farbintensiv bzw. unterschiedlich breit ausfallen kann (u.a. Klima-abhängig). Tab 19. Liste der Kriterien, die bei der visuellen Bildauswertung (z.B. „einfach beschreibende Prüfung“) verwendet werden können. Übernommen von ZALECKA 2006, S. 48, Tab.4, und ergänzt (in rot) im Hinblick auf Milchproben-Bilder SB-Methode: Standardisierte Bildauswertung 73 b) Triangel-Test Der „Triangel-Test“ aus der Sensorik (Norm DIN ISO 4120:2001) wird in der Fassung, wie er von Zalecka (2006) für Steigbilder angepaßt wurde, leicht variiert angewendet. Einige Verfahrens-Hinweise sollen hier kurz wiedergegeben werden: Anwendungsbereich: „... zur Feststellung, ob zwischen den Bildern von zwei zu untersuchenden Proben ein wahrnehmbarer .. Unterschied vorhanden ist.... Kurzbeschreibung: ... Die Anzahl der Prüfpersonen wird ... ausgewählt. Die Prüfpersonen erhalten einen Satz aus drei Bildern und die Information, dass zwei Bilder gleich sind und eins sich unterscheidet. Die Personen teilen mit, welches Bild sich ihrer Meinung nach unterscheidet, auch wenn die Auswahl nur auf einer Vermutung beruht. Die Ergebnisse werden talliert und die Signifikanz wird ... bestimmt....“ (ZALECKA 2006) Zur Erfassung der Beurteilungs-Ergebnisse wird ein Prüfformular verwendet (siehe Abb. 5:). Das Prüf-Panel bestand aus 11 Studenten, die im Rahmen einer zweitägigen Einführung in die Steigbildmethode jeweils 10 Bilder-Trios beurteilten. Die Proben stammten von drei Höfen zur Thematik „Hörner“ sowie von vier PrN des Fütterungssystemvergleichs C „Wiesenheu vs. Silage“. Die Personen saßen bei der Bildbeurteilung jeder an einem Tisch, mit dem Gesicht zur Wand / zum Fenster, so dass jeder ungestört beurteilen konnte. Bei der Vorlage der Bilder-Trios wurde darauf geachtet, dass jede mögliche Kombination der Proben beurteilt wurde (AAB, ABB, BAB, ...). Die zu beurteilenden Bilder wurden für jede Prüfperson neu zusammengestellt. Es wurden aus je Probenpaar vier Bildern (zwei Bilder je Probe und Verdünnungsstufe) jeweils drei zu einem Bildertrio zusammengestellt und den Prüfpersonen gereicht. Bei den Höfen 2, 7 und 11 wurden Bilder von zwei Verdünnungsstufen beurteilt, bei Versuch C von einer Verdünnungsstufe. Die vorgenommenen Antworten wurden auf Richtigkeit geprüft und entsprechend der Häufigkeit korrekter Antworten wurde das Signifikanzniveau (auf Grund des Tabellenwertes der DIN-Norm) bestimmt. Die Ergebnisse werden im Kapitel 3.6.1 dargestellt. Es wurde nur ein Teil der Proben mit diesem Verfahren ausgewertet, um grundsätzlich zu zeigen, inwieweit sich Milchsteigbilder mit diesem Auswertungsverfahren differenzieren lassen. Die zu beurteilenden Probenserien waren danach ausgesucht worden, dass sich die Bilder des einen Hofes aufgrund der Bildmerkmalsausbildung (festgehalten in der Charakterisierung der Bilder, siehe Anhang C) sehr deutlich unterscheiden sollten (von Hof 11, 1. PrN), die eines nächsten sehr wenig (Hof 2, 1. PrN), und die des dritten mittelmäßig (Hof 7, 3. PrN). Diese Auswahl der Serien wurde vorgenommen, um die Bandbreite der Probenunterschiede zu verdeutlichen. Beim Fütterungssystemvergleich C wurden die Bilder von vier PrN-Terminen untersucht (mit z.T. sehr geringen Unterschieden). Alle die mit dem Triangeltest untersuchten Bilder konnten von Autor korrekt gruppiert SB-Methode: Standardisierte Bildauswertung 74 werden. Die anderen Proben wurden nicht mit dem Triangeltest beurteilt, weil anhand der vom Autor vorgenommenen Gruppierung und Charakterisierung der Bilder (unter Berücksichtigung mehrerer Verdünnungsstufen) die Deutlichkeit des Unterschiedes schon erfasst wurde. Dreiecks-Prüfung (Triangel-Test) Datum: 9.6.09 Prüfperson – Name: Anweisung: Schauen Sie sich die drei Bilder an. Zwei Bilder sind gleich. Kennzeichnen Sie das Kästchen des Bildes, das sich von den anderen unterscheidet, mit einem X. Falls kein Unterschied wahrnehmbar ist, müssen Sie vermuten. Bilder: Kennzeichnung Bemerkungen* Bild-Charakter** _______ □ _________ ____________ _______ □ _________ ____________ _______ □ _________ ____________ * Falls Sie Ihre Auswahl begründen möchten oder Anmerkungen zu den Merkmalen der Probe haben, können Sie das unter Bemerkungen darlegen. ** Wenn Sie möchten, dürfen Sie eine freie Charakterisierung zu dem Bild vermerken. Abb. 5: Verwendetes Prüfformular zur Bildauswertung beim Triangeltest. c) Doppel zuordnen („Gruppierungen“, Reihungen) In dieser Arbeit wird zur Unterscheidung von Proben für alle Vergleichsproben eine Methode angewendet, die eine Art der „Gruppierung“ von einander ähnlichen Bildern darstellt. Dabei ist es gleichgültig, ob zwei oder mehrere Proben miteinander verglichen werden sollen, es müssen jedoch mindestens zwei Bilder je Probe vorliegen. Bei diesem Vorgehen wird zuerst eine „Reihung“ der Bilder vorgenommen: Ähnlich wie bei einer „Rangordnungsprüfung“ werden die Bilder, die miteinander verglichen werden sollen, in eine Reihe gelegt, die sich aufgrund eines speziellen Bildmerkmals ergibt (häufig die Intensität der grünen Bereiche in der Schalenzone oder die Schalengröße). Es ergibt sich hierbei meistens keine lineare Merkmalsentwicklung im Verlauf der Reihe, sondern es gibt sprunghafte Veränderungen der Merkmals-Ausbildungen. Somit ist naheliegend, keine „Reihe“, sondern „Gruppen“ von Bildern zusammenzustellen. Werden mehr als ein Merkmal gleichzeitig berücksichtigt, kann das zu mehrdimensionalen Anordnungen der Bilder führen, oder zu „Sonderstellungen“ einzelner Bildergruppen. In diesem Sinne werden die Bilder mit ähnlichen Bildmerkmalen „gruppiert“ bzw. die Doppel zusammengelegt. Im einfachsten Fall werden vier Bilder in zwei Gruppen aufgeteilt. Werden von zwei Proben mindestens je zwei Bilder vorgelegt und in der Art gereiht, dass jeweils die beiden Bilder einer Probe nebeneinander zu liegen kommen, ist einerseits gezeigt, dass sich die Bilder der Proben unterscheiden, und andererseits ist eine Aussage zum Verhältnis der beiden Proben zueinander in Bezug auf dieses Merkmal möglich: bei den Bildern der einen Probe ist es mehr ausgebildet als bei denjenigen der anderen Probe. Das ermöglicht eine einfache Charakterisierung. SB-Methode: Standardisierte Bildauswertung 75 Eine statistische Auswertung ist auf der Grundlage von Kontingenztafeln im Hinblick auf die Unterscheidbarkeit von zwei Proben auch mit dem Fisher’s Exakten Test möglich (siehe auch folgendes Kapitel d) Statistische Absicherung von „Grupppierungen“). Werden von zwei Proben jeweils vier Bilder korrekt gruppiert, dann kann von einer signifikanten Differenzierung der Proben gesprochen werden (p=0,0286), werden jedoch nur zwei Bilder je Probe gruppiert, so ist der Signifikanzwert p=0,3333 (n.s.). Bei den meisten Proben wurden Bilder in mehreren Verdünnungsstufen erstellt, jedoch je Probe und Verdünnungsstufe meistens nur zwei Bilder. Wenn sich die Bilder in allen Verdünnungsstufen unabhängig voneinander auf einheitliche Weise aufgrund der Bildmerkmale gruppieren lassen, und die Merkmale deutliche Ausprägungsunterscheide aufweisen, wird davon ausgegangen, dass die Unterschiede groß sind, die Unterscheidungsmöglichkeit mit großer Sicherheit besteht. Die Decodierung der Proben zeigte dann, ob die vorgenommenen Gruppierungen korrekt waren. In manchen Fällen ist aber der Probenunterschied so gering, dass nur in einer Verdünnungsstufe geringe Unterschiede in der Bildmerkmalsausprägung beobachtet werden können – hier ist dann die Unterscheidungsmöglichkeit unsicher. d) Statistische Absicherung von „Gruppierungen“ Die Prüfung der Unterscheidbarkeit der Proben wird für alle zu vergleichenden Proben durch eine „Gruppierung“ der Bilder erreicht, indem die doppelt oder mehrfach erstellten Bilder entsprechend der Bildmerkmalsausprägung zusammengelegt werden. Es kann hier auch von einer „Zuordnung der doppelt erstellten Bilder zueinander“ gesprochen werden. Nach Decodierung kann dann beurteilt werden, inwieweit tatsächlich die „richtigen“ Gruppierungen vorgenommen wurden. Es wird nun nach dem Muster von Kontingenztabellen beurteilt, ob die vorgenommene Zuordnung den realen Probenqualitäten entspricht. Die sich aus diesen „Häufigkeiten“ ergebenden Kontingenztabellen bzw. Kreuztabellen dienen als Grundlage für die statistische Prüfung der Unterschiedlichkeit der Proben. Mit dem Fisher’s exakten Test (zweiseitig) wird geprüft, wie wahrscheinlich diese Anordnung der Bilder per Zufall ist bzw. wie unwahrscheinlich. Er wird bei geringen Stichprobenumfängen anstelle des Chi-Quadrat-Testes angewendet. Der Fisher’s exakte Test ist anwendbar, sobald drei oder mehr Bilder bei zwei zu vergleichenden Proben voneinander zu unterscheiden sind (d.h. „gruppiert“ wurden) oder wenn mehr als zwei Proben (bei zwei oder mehr Bildern je Probe) voneinander zu unterscheiden sind. Wenn nur zwei Proben mit je zwei Bildern „gruppiert“ wurden (das Minimum, das für alle zu vergleichenden Proben angewendet wurde), ist eine statistische Auswertung nicht möglich. Hier wird u.U. von dem Vorgang „Doppel zuordnen“ gesprochen. Wenn diese Doppel- Zuordnung zusätzlich an Bildern einer anderen Verdünnungsstufe (derselben Proben) vorgenommen werden kann, wird dieses als zusätzliche Bestätigung der vorgenommenen SB-Methode: Standardisierte Bildauswertung 76 „Gruppierung“ betrachtet. In den Ergebnistabellen nach der „einfach beschreibenden Prüfung“ sind deshalb die unterscheidenden Bildmerkmale je Verdünnungsstufe aufgeführt. Gruppe 1 Gruppe 2 Probe A 4 0 Probe B 0 4 Gruppe 1 Gruppe 2 Gruppe 3 Gruppe 4 Probe A 2 0 0 0 Probe B 0 2 0 0 Probe C 0 0 1 1 Probe D 0 0 1 1 Abb. 6: Kontingenztabellen für (oben) zwei Proben mit je vier Bildern (alle korrekt gruppiert, p=0,0286) bzw. vier Proben und je zwei Bildern (unten), hier jedoch wurden die Bilder von Gruppe 3 und 4 nicht korrekt gruppiert (Unterscheidung der Proben C und D nicht möglich, p=0,0016 bei Anwendung des Fisher’s exakten Test, zweiseitig). e) Profilprüfung (einzelne Bildmerkmale skaliert bonitieren) Bei der Profilprüfung (im Prinzip nach den Vorgaben der sensorischen Prüfung, mit der Änderung, dass Bilder statt Lebensmittelproben dargeboten werden) werden Bildmerkmale in ihrer Ausprägungs-Intensität erfaßt (s.a. KRETSCHMER 2003). Für Milch- Steigbilder wird ein Kriterien-Katalog aus der Diplomarbeit von WOHLERS (2003) übernommen und z.T. ergänzt (siehe Anhang Teil A „Kriterien zur Profilprüfung von Milch- Steigbildern“, incl. Definition der Merkmale und ihrer Ausprägungs-Intensität). Die darin aufgeführten Bildmerkmale sind v.a. solche Merkmale, die als „einzelne Merkmale“ erfasst werden können wie z.B. die Schalengröße. Es wird die Ausprägungs-Intensität der Merkmale in 11 Stufen erfaßt (Skala 0 bis 10). Für Wasser- und UHT-Milch-Standard-Bilder wird jeweils ein eigener Kriterien-Katalog definiert (siehe dazu Anhang Teil A: „Merkmalsausprägung bei Standard-Bildern (a.d. und UHT)“). Die auf diese Weise erfaßten Kriterien können auch zu statistischen Auswerte-Verfahren herangezogen werden. Weil dieser Kriterien-Katalog für Milch-Steigbilder sehr umfangreich ist, wird in den meisten Fällen nur eine Auswahl dieser Merkmale bonitiert. Die Auswahl richtet sich danach, ob v.a. die Merkmale erfaßt werden sollen, durch welche sich die zu vergleichenden Bilder unterscheiden, oder ob die Bilder in gewisser Weise „allgemeingültig“ mit anderen verglichen werden sollen. Im zweiteren Fall, um in einem gewissen „Überblick“ über das Bild die grundlegendsten charakteristischen Merkmale zu erfassen, eignen sich besonders folgende Merkmale: - Schalen-Größe / Form - Fahnen-Größe / Form - Farbintensität / Konturiertheit (gesamtes Bild) - Ungewöhnliche auffällige Merkmale - Regelmäßigkeit in den Form-Ausbildungen SB-Methode: Standardisierte Bildauswertung 77 - „Beweglichkeit“ in der Fahnenzone - „Dichte“ in der Schalenzone Dabei ist zu bedenken, dass die beiden letzten Merkmale neben den rein äußerlich messbaren Merkmalen eine Art „Charakter“ der Bildmerkmale wiedergeben können. Angewendet wird dieses Verfahren der Bonitur von Bildmerkmalen z.B. bei der Probenserie zur Alterung (Kapitel 3.4.2 und 3.5.2) oder ausgiebig im Rahmen der Ermittlung von Einflussfaktoren auf die Standardbilder (Kapitel 3.3.2.4). Die bonitierten Bildmerkmale werden anschließend auf ihre Streuung und Unterschiedlichkeit (t-Test) geprüft bzw. die Korrelation zu diversen Faktoren geprüft. Für einen Großteil der Vergleichsproben werden die g.B.-Intensität und Sgröße bonitiert (siehe Ergebnisteil), um die Größe des Unterschiedes zwischen den Bildmerkmalsausprägungen zweier Vergleichsproben zu verdeutlichen. f) Merkmalsermittlung zur Klassifizierung Wenn Bilder von codierten Proben klassifiziert werden sollen, müssen die Merkmale, nach denen die Zuordnung vorgenommen wird, bekannt sein. Meistens sind diese Merkmale aber unbekannt. Deshalb wird folgendermaßen vorgegangen, um Merkmale für eine Klassifizierung (hinsichtlich vorgegebener Probenqualitäten, z.B. Heu- vs. Silagefütterung bei den Wirtschaftsstil-Proben) zu ermitteln: 1) Es werden Bilder betrachtet, welche mit Sicherheit den gesuchten Faktor als Unterschied in der Ausgangsprobe aufweisen. Die Proben sollten unter verschiedenen Umständen entstanden sein, damit mit Sicherheit keine anderen, gleichzeitig auftretenden Faktoren den Merkmalsunterschied ausmachen können. In diesem Fall von Poolproben eines cross-over-Fütterungssystemvergleiches. Die Bilder könnten durch weitere paarweise vergleichbare Proben-Bilder ergänzt werden (verschiedene Höfe bei entsprechender Fütterung...). 2) Die zu betrachtenden Bilder werden so ausgelegt, dass die Bilder der einen Qualität auf der einen Seite, die der anderen auf der anderen Seite liegen. 3) Es werden Bildmerkmale gesucht, die bei den Bildern der einen Probenqualität auftreten, bei der anderen nicht, bzw. deren Ausprägungs-Intensität unterschiedlich ist. Ob diese Merkmale in allen gewünschten Fällen bei entsprechender Probenqualität auftreten, kann überprüft werden, indem andere codierte Probenbilder mit Hilfe der ermittelten Merkmale den Probenqualitäten zugeordnet werden (klassifiziert werden). SB-Methode: Standardisierte Bildauswertung 78 g) Zuordnung (Klassifizierung) bei wiederholter Probennahme / zu vorgegebener Qualität Eine Zuordnung (Klassifizierung) auf Grundlage einer Mustererkennung wird für die Steigbilder hier einerseits hinsichtlich wiederholter Probennahmen vorgenommen, andererseits hinsichtlich spezieller definierter Probenqualitäten (z.B. Heu vs. Silage). Bei der Zuordnung (Klassifizierung) von Bildern wiederholter Probennahmen zueinander wird zuerst ermittelt, in welchen Merkmalen sich die Bilder der zwei (oder mehreren) Proben der einen Probennahme unterscheiden (Ermittlung der Klassifizierungs- Merkmale). Anschließend werden die Bilder der anderen Probennahme nach denselben Merkmalen bonitiert bzw. gereiht. Die Zuordnung erfolgt nach dem Muster der Reihung, evtl. ergänzt durch weitere Merkmale. Bei der Klassifizierung von Bildern hinsichtlich vorgegebener Proben-Qualitäten werden die zu klassifizierenden Bilder in den Merkmalen bonitiert, die als „Klassifizierungs- Kriterien“ ermittelt wurden, und dementsprechend eingruppiert. Es wird möglichst mit mehreren Merkmalen gleichzeitig gearbeitet, damit Zuordnungen nicht aufgrund eines einzelnen Merkmals vorgenommen werden, sondern durch mehrere Merkmale an „Sicherheit“ gewinnen. Die bei den vorgenommenen Klassifizierungen angewendeten Merkmale sind in Kapitel 3.1.10 dargestellt. SB-Methode: Klassifizierungsmerkmale 79 3.1.10. Angewandte Gruppierungs- und Klassifizierungs- Merkmale für die Versuchs-Proben Es gibt für die einzelnen Einflussfaktoren faktorspezifische Bildmerkmale. Diese zu ermitteln und zu prüfen war ein Ziel der Arbeit. Die ermittelten und angewendeten Klassifizierungsmerkmale sind im folgenden aufgeführt. Außerdem werden die Merkmale aufgeführt, die für die Gruppierung der Bilder meistens ausschlaggebend waren. Alle Bildmerkmale, die für eine Klassifizierung eingesetzt werden, wurden auf ihre Beeinflußbarkeit durch variierende Faktoren geprüft, indem sie auch an allen Bildern erfaßt wurden, die im Rahmen der Charakterisierung der Steigbild-Methode entstanden. 3.1.10.1. Auffällige Bildmerkmale, die häufig zu einer Gruppierung beitragen 1. Abgesunkener Schalenrand, in Verbindung mit unregelmäßigen Bildern, verwaschenem, unkonturiertem Schalenrand und braun-rötlicher, rostfarbener Linie am unteren Sockelrand. 2. Braun-rötliche Linie am unteren Sockelrand, meistens im Zusammenhang mit abgesunkenem Schalenrand. Ein mit wenigen Ausnahmen sehr sicher reproduzierbares Bildmerkmal. 3. Grüne, undifferenzierte Bereiche in der Schalenzone. Die Färbung variiert von dunkel-braun-grün bis hell-türkis-grün oder sogar rosa-lila-farbigem Einschlag. Sie treten bei größeren Schalen (höher konzentrierten Bildern) eher auf als bei kleinen Schalen, aber sind nicht unbedingt an die Sgröße gebunden. Grundsätlich erscheinen Merkmale der Schalenzone und Sockelzone für eine Gruppierung gut geeignet zu sein, die FZ-Merkmale unterliegen häufig einer recht großen Streuung und führten meistens zu einer falschen Gruppierung. SB-Methode: Klassifizierungsmerkmale 80 3.1.10.2. Bild-Merkmale zur Klassifizierung für die Bilder des Fütterungssystemvergleiches C: „Wiesenheu vs. Silage“ Zur Ermittlung von Klassifizierungsmerkmalen wurde auf Ergebnisse aus der Literatur zurückgegriffen. Es gibt zwar keine Milch-Referenz-Bilder zu dieser Thematik, aber mit Hilfe der von Balzer-Graf entwickelten „Pflanzenorgan-Bildtypen“, die auch von anderen als allgemeine Referenz-Bildtypen genutzt werden, erscheint eine Einstufung der Bilder möglich. Insofern sollen diese versuchsweise als Referenz zu Hilfe genommen werden. Es wird folgende Annahme gemacht: 1) Silage besitzt aufgrund des früheren Erntetermines (mehr Blatt, weniger Stengel) und des höheren Wassergehaltes im Vergleich zu Heu eher Qualitäten, die zu einem „Blatt-Typ“ oder „wäßrigen, undifferenzierteren“ Typ gezählt werden können. 2) Heu besitzt aufgrund des späteren Erntetermins mehr Rohfaser und Stengeliges, ist trockener, das Eiweiß ausgereifter, die Pflanze vollständig ausgebildet. Somit könnten diese Qualitäten als „blütenhafter“ oder als „ausgeformter“ im Steigbild erscheinen. Die Bildmerkmale bei Steigbildern für Bilder, die dem „Blüten-Typ“ entsprechen, werden von Geier und Fritz (unveröff.) mit folgenden Worten beschrieben: „Hoher Sockel, helles Band unterhalb der Mittelzonentropfen (=Schalen), schmale, kleine Mittelzonentropfen, Fahnen ausgeprägt vertikal, oft farbig.“ (S. 11). Zum Blatt-Typ wird nur „Steighemmung“ vermerkt. Werden diese Merkmale auf Milchbilder übertragen (unter Berücksichtigung dessen, dass natürlich der Grundtyp Milch erhalten bleibt, aber dass er in unterschiedlicher Weise zusätzlich geprägt sein kann), so kommen z.B. Steighemmungen bei hoch konzentrierten Proben vor. Die „Blüten“-Merkmale können direkt auf Milchbild-Merkmale übertragen werden. Zusätzlich sollen die Begriffe „wäßrig“ und „ausgeformt“ berücksichtigt werden: als wäßrige Bildmerkmale werden nach außen zerlaufende, groß-voluminöse, farbintensive, dunkle Merkmale bezeichnet. Dahingegen sind ausgeformte Bildmerkmale solche, die scharf konturiert sind, in ihrer Form deutlich erkennbar, eher klein / schmal und hell sind. Daraus werden folgende Klassifizierungsmerkmale abgeleitet, die für die Bilder aus dem Fütterungssystemvergleich C „Wiesenheu vs. Silage“ verwendet werden: Heu Silage „ausgeformt“: scharf konturiert, Formen deutlich erkennbar, klein, schmal, hell „wäßrig“: nach außen verlaufend, groß-voluminös, farbintensiv, dunkel Blüte-Typ: schmale, kleine S, F vertikal, farbig. (Bildmerkmale wie geringer konzentrierte Proben) Blatt-Typ: „Steighemmung“ (Bildmerkmale von höher konzentrierten Proben) Tab 20. Klassifizierungs-Merkmale für die Bilder aus dem Fütterungssystemvergleich C: „Wiesenheu vs. Silage“ Teil „SB-Methode“: Klassifizierungsmerkmale 81 3.1.10.3. Bildmerkmale zur Klassifizierung der Bilder zur Thematik „Hörner“ Verwendetes Bildmaterial: Es wurden die bis zu dem Zeitpunkt der Merkmalsermittlung erstellten Bilderserien berücksichtigt. Dazu zählen die Bilder von: - Hof 11 - Hof 3 - Hof 4 - „Wirtschaftsstile“: PrN B (Juli 08) Ermittelte Bildmerkmale Horntragend (= bio-dyn.): Enthornt (= konv.): Wenig oder gar keine grünen Bereiche, Schalen eher klein, regelmäßig, S deutlich geformt, konturiert, ordentlich ausgestaltet: Schalenrand präzise geformt, ausdifferenziert. Vermehrt grüne Bereiche, bzw. Schalen, deren Ränder nach unten hin unterbrochen sind (Anfänge von grünen Bereichen, Vorstufen); Schalen eher groß, unregelmäßig geformt, S oft unpräzise, verwaschene, Übergänge zwischen den einzelnen Farbbereichen (unkonturiert). Tab 21. Klassifizierungsmerkmale „Horn“ (SZ-Merkmale) Dieser Merkmale wurde für eine Klassifizierung der Bilder zur Thematik „Horn“ verwendet. Teil „SB-Methode“: Klassifizierungsmerkmale 82 3.1.10.4. Bild-Merkmale zur Klassifizierung der Bilder von verschiedenen Wirtschaftsstilen – Faktor „Heu vs. Silage“ Die Proben aus dem Versuch „Wirtschaftsstile“ lassen sich bei den Winter-Proben in die zwei Gruppen „Heu“ vs. „Silage“ unterteilen: die Heu-Fütterung findet auf den extensiv wirtschaftenden Höfen statt, die Silage-Fütterung auf den intensiv wirtschaftenden. Es werden somit Hilfsmerkmale gewählt, die zur Klassifizierung der Proben versuchsweise angewendet werden sollen. Für die Sommer-Proben können in diesem Sinne keine Klassifizierungskriterien ermittelt werden. Weil die Merkmale für die Klassifizierung für Wiesenheu vs. Silage bei den Bildern aus dem Fütterungssystemvergleich für die 1. PrN nicht zu einer korrekten Zuordnung führten, wurde nochmals nach Bildmerkmalen gesucht, um für die weiteren Bilder (verschiedene Wirtschaftsstile) bessere Klassifizierungsmerkmale zu gewinnen. Es wurden gezielt auch die zuerst nicht klassifizierbaren Bilder mit berücksichtigt, um die dort vorliegenden Faktoren bei einer weiteren Merkmals-Ermittlung zu berücksichtigen. Bildauswertung Es wurde an den decodierten Bildern aus dem Fütterungssystemvergleich „Wiesenheu vs. Silage“ nach Bildmerkmalen gesucht, welche als „typische Merkmale“ für Milch aus Heu- bzw. Silage-Fütterung bezeichnet werden können. Alle vorhandenen Bilder der verschiedenen Poolproben (zur Proben- Zusammenstellung siehe Tab 15) wurden nach Heu- bzw. Silage-Fütterung sortiert zusammengelegt. Es lagen folgende Bilder vor: - von allen 4 PrN ein „normales“ (gepaartes) Misch (je Gruppe n=9 Kühe), - von der 2. und 3. PrN Poolproben mit reduzierter Probanden-Anzahl, um Proben mit relativ hoher Zellzahl auszuschließen („gutes Misch“). - von der 4. PrN Poolproben, bei denen Proben zusätzlicher Tiere ergänzt wurden („Maximal-Misch“). Es liegen also Bilder vor, die in gewissem Rahmen unterschiedliche Tier- Zusammenstellungen aufweisen – an diesen wurde nach Merkmalen gesucht, die trotzdem je Fütterungsvariante einheitliche Bildmerkmale durchgängig aufwiesen. Teil „SB-Methode“: Klassifizierungsmerkmale 83 Ergebnis: Fütterungsspezifische Bildmerkmale Es konnten folgende Merkmale gefunden werden, die fütterungs-spezifisch auftreten: Heu-Fütterung Silage-Fütterung F heller, farbschwächer F dunkler, farbintensiver Gelb hinter-über Fahnen heller Gelb hinter-über Fahnen dunkler F zarter, luftiger, zierlicher gestaltet, konturierter F fülliger, satter („ausgestalteter“, „deftiger“, „kräftiger“,) wäßriger, verwaschener F zart (zittrig) aufstrebend, durchlässig, („angreifbar“), beeinflußbar F „nicht zu beeinflussen“, „sicher“ und gerade aufstrebend F-Ansätze trocken-konturiert F-Ansätzte leicht verwaschen-wäßrig DL heller DL dunkler Tab 22. Bildmerkmale, die fütterungsspezifisch auftreten Die Schalenzone wies eher Merkmale auf, die sich mit dem Wechsel der Tiergruppe änderten. Somit scheint die SZ wenig geeignet, fütterungsspezifisch Merkmale auszubilden. Mit Hilfe dieser Merkmale wurden die Bilder der Proben verschiedener Wirtschaftsstile klassifiziert, um zu prüfen, ob sich diese Merkmale auch in anderen Proben wiederfinden. 3.1.10.5. Bild-Merkmale zur Klassifizierung der Bilder von verschiedenen Wirtschaftsstilen – Faktor „konventionell vs. bio-dynamisch“ Der Faktor „konventionell vs. bio-dynamisch“ konnte anhand des vorliegenden Bildmaterials nicht ermittelt werden. Jedoch gab es das Hilfs-Merkmal „horntragend vs. enthornt“, das diese beiden Varianten ebenfalls unterscheidet: die Kühe der konventionellen Betriebe waren alle enthornt, die der bio-dynamischen waren alle horntragend. So war es im Studiendesign vorgegeben. Für dieses Merkmale wurde an den vorhandenen decodierten Bildern von vier Höfen (Hof 1, Hof 3, Hof 5 und Hof 8), dessen Bilder bei wiederholter PrN nicht konsistent einander zugeordnet werden konnten bzw. die nach SZ-Merkmalen falsch klassifiziert wurden, nach Bildmerkmalen gesucht, die trotzdem konsistent im Zusammenhang mit dem Faktor „Horn“ auftreten. Folgende Merkmale wurden ermittelt (s.a. SB-Abb-34-Hof_3-070830): Horntragend Enthornt F „aufstrebend“, „leicht“ F groß, beweglich F „schwer lastend“, „absinkend“ „Sackartig“ F kleiner, starr Wenige g.B. S gestalteter, ohne grS Viele g.B. S weniger gestaltet, Tendenz zu grS Tab 23. Klassifizierungsmerkmale für den Faktor „horntragend vs. enthornt“, als Ersatz für „bio-dynamisch vs. konventionell“ bei den Proben zum Wirtschaftsstil SB-Methode: Charakterisierung 84 3.2. Charakterisierung: Mögliche Einflußfaktoren auf das Ergebnis der Steigbildmethode 3.2.1. Einflußfaktoren - zeitlich geordnet Beim gedanklichen Durchlaufen der Methode lassen sich Faktoren ermitteln, die rein theoretisch einer Variation unterliegen könnten. Einerseits sind dies Effekte, die mit der Probe in Beziehung stehen (chemisch- oder physikalische Veränderung der Probe durch Alterung, Umwelteinflüsse, oder bei wiederholter PrN), andererseits sind dies laborseitig hervorgerufene Effekte (klimatische Variationen während des Steigvorganges, s.a. ZALECKA 2006, oder Handhabungsvariationen der Methode), oder auch Variationen in der Handhabung der Auswertung der Bilder. Eine thematische Übersicht dieser Effekte ist in Tab 25 zu finden, eine Auflistung entsprechend des zeitlichen Auftretens der Effekte im Prozeß der Methode ist in Tab 24 wiedergegeben, der Abb. 2: können einige dieser Faktoren auch entnommen werden. Es gibt bis jetzt keine solche Übersicht über die Einflussfaktoren für Milchproben. ZALECKE (2006) untersuchte eine Reihe von Effekten auf die Steigbildmerkmalsausprägung bei Weizen- und Möhrenproben, HIRSCHBERGER (2004) ermittelte grundlegend die Effekte von z.B. Einzelsubstanzen im Steigbild (im Zusammenhang mit Gemüseproben) – auf deren Ergebnissen sowie eigenen Erfahrungen und mündlichen Mitteilungen von z.B. J. Fritz und U. Geier aufbauend wurde diese Zusammenstellung gemacht. In den folgenden Kapiteln werden diese Faktoren in ihrer Einflußintensität auf die Bildmerkmalsvariation bzw. die Unterscheidungsfähigkeit der Methode geprüft. Da sich Milchproben anders verhalten können als Möhren- und Weizen-Proben, werden auch Variationen im Klima als zu bestimmende Einflußfaktoren aufgeführt. Weil Milch ein chemisch-physikalisch sehr komplexes Gemisch von Fett, Eiweiß, Kohlehydraten und Mineralien ist, und die Wirkung der Einzelsubstanzen im Steigbild unbekannt ist, wird als Haupt-Untersuchungsgut die nicht-standardisierte, nicht- homogenisierte frisch gemolkene Milch-Fett-Mischung, und zwar als Ur-Produkt, als „Rohmilch“ verwendet. SB-Methode: Charakterisierung 85 Tab 24. Auflistung der möglichen Einflußfaktoren auf die Bildmerkmals-Ausprägung / das Ergebnis bei Milchsteigbildern – nach ihrem zeitlichen Auftreten sortiert Punkt Thema / Einflußfaktor Prüfung in Kapitel 1-a PrN reproduzierbar – Tankmilch 3.4.1 1-b PrN reproduzierbar – Einzeltiere 3.4.1 Probennahme Misch-Faktor ET – ET-Einfluß auf Mischproben-Ergebnis 3.4.1 2-a Lagerungstemperatur – Einfluß 3.4.3 2-c Plastik / Glasgefäß 2-c Flasche halb / ganz voll / 100ml / 1l n.b. 2-d Bromopol n.b. 2-e Lagerungsdauer / Alterung 3.4.2 Lagerung / Transport 2-f Kühlung / Erhitzung der Probe 3.4.3 3-a Milch-Fett-Gemisch / Rahm 3.4.4 3-c Milchtemperatur beim Verdünnen 3.3.4.2 3-d Konzentrationsstufe / Pipettierfehler 3.3.1 / 3.3.4.2 3-e Rühreffekt Vorverdünnung (P-spitze „sprudelnd“ Probe Probenvor- bereitung / Vorverdünnung 3-f Standzeiten Vorverdünnung 3.3.4.1 4-a Pipettierfehler – Abtropfzeiten 3.3.4.2 4-b Standzeiten in K-Schälchen 3.3.4.1 Proben in Schälchen applizieren 4-c Endverdünnung in K-S / Becherglas n.b. 5-a Papier vorklimatisiert n.b. 5-b Papier schräg im Schälchen 3.3.8 Papier 5-c Papier oval 3.3.8 6-a Klima-Raum (Luftfeuchte) 3.3.2 6-b Klima-Raum (Temperatur) 3.3.2 6-c Klima-Raum (Luftdruck) 3.3.2 6-e Klima-Raum (Luft-Qualität) n.b. 6-f Licht n.b. 6-g Klima – Reiheneffekt / Standplatzeffekt / Tischeffekt 3.3.2 Raumklima 6-h Luftzug / Tischausrichtung 3.3.2 1. Steigphase Trocknen 7-a (+ 9a) Trocknungszeit 1. Phase (+2. Ph) 3.3.3 8-a Ag-Alter der Lösung 3.3.7 8-b Ag-Steighöhe 3.3.5 8-c Ag-Steigdauer 3.3.5 Steigen 8-d (+10d) Klima-Deckelglas 3.3.2 9-a (+7a) Trocknungszeit 2. Phase 3.3.3 2. Steigphase Trocknen 9-b Klima-Trocknungszeit (viele / wenig Bilder) 3.3.2 10-a Fe-Alter der Lösung 3.3.6 10-b Steighöhe 10-d (+8d) Klima - Deckelglas 3.3.2 Steigen 10-e Papier nach Fe aus Schälchen nehmen 3. Steigphase Trocknen 11-a Klima Ende dritte Phase 3.3.2 Belichtung 12-a / -b Belichtung n.b. Scannen 13-a / -b/ c Scan-Effekte n.b. 14-a Anzahl berücksichtigter Bildmerkmale Visuell 14-b Auswahl berücksichtigter Bildmerkmale 15-a Visuelle Bonitur 15-b Bonitur statistisch weiterverarbeiten (Mittelwerte) Auswertung PC 15-c Optimas (Bilderkennungssoftware) z.T. in 3.5 (Bildaus- wertungsverfahren) SB-Methode: Charakterisierung 86 3.2.2. Einflußfaktoren – thematisch geordnet Die Einflussfaktoren wurden zur besseren Übersicht thematisch geordnet (siehe unten). Diese thematische Gruppierung der Einflußfaktoren wurde für die Darstellung der Ergebnisse übernommen. Die Labor-Effekte sind in Kapitel 3.3 wiedergegeben, die proben- verursachten Effekte in Kapitel 3.4. Die Effekte der Bildauswertung werden in Kapitel 3.5 dargestellt. Tab 25. Thematische Gruppierung der Faktoren, die einen Einfluß auf die Bildmerkmals-Ausprägung von Milchsteigbildern bzw. das Ergebnis der Untersuchung haben können. A: Laborprozeß-bedingte Faktoren (Kapitel 3.3) 1. Verdünnung / Konzentrationsstufe 2. Klima 2.1. Experimentell gezielt variiert 2.2. Standort-Effekte (Reihe, Tisch) 2.3. Deckelglas-Klima 2.4. Standard-Auswertung 3. Trocknungszeiten 3.1. Gezielt nach P1 bzw. P2 12h trocknen lassen 3.2. Standard-Auswertung 4. Probenvorbereitung / -aufbereitung 4.1. Alterung der Vorverdünnung / Beginn 1. Phase 4.2. Rühreffekte 4.3. Pipettierfehler / Temperatur der Probe bei Pipettieren 5. Sonstiges 5.1. Steighöhe, Steigdauer 2. Phase 5.2. Alterung der Ag- bzw. Fe-Lösung 5.3. Ursache von Bildfehlern 5.4. Lichteinfluß bei Bildererstellung B: Proben-verursachte Effekte (Kapitel 3.4) 1. Probenahme / Transport / Lagerung 5.5. Probenahme reproduzierbar (Einzeltier, verschiedene Poolproben, Tankproben) 5.6. Alterungseffekt der Probe 5.7. Temperierung der Probe (Kühlung, Erhitzung) 2. Milch-Bestandteile (Milch, Fett, fettarme Milch, Molke...) 3. Faktoren: a. Milchleistung b. Laktationsstadium c. Individualität Auswertung der Bilder: Verschiedene Verfahren im Vergleich (Kapitel 3.5) SB-Methode: Charakterisierung der Steigbildmethode – laborseitige Einflüsse 87 3.3. Charakterisierung: laborseitige Einflüsse auf die Bildmerkmals-Ausprägung In diesem Kapitel 3.3 werden die Ergebnisse der Untersuchungen dargestellt, anhand derer verschiedene laborseitige, laborprozeß-bedingte Einflüsse auf die Bildmerkmals- Ausprägung ermittelt wurden. Im folgenden Kapitel 3.4 wird auf die proben-spezifischen Einflüsse näher eingegangen. Von grundlegendem Interesse war, ob die in Betracht gezogenen Faktoren einen Einfluß auf die Bildmerkmals-Ausprägung haben, und wenn ja, wie sie sich äußern, wie intensiv die Bildmerkmals-Ausprägung verändert ist. Dazu wurde eine Reihe von Experimenten durchgeführt. Die untersuchten Faktoren sind in Tab 25 aufgeführt – entsprechend der Gliederung erfolgt die Ergebnis-Darstellung. Diese gliedert sich je Experiment in eine Einleitung zum Thema, die Aufführung der Fragestellung und des Versuchsaufbaus, mit kurzem Hinweis auf das Vorgehen bei der Bildauswertung, damit dem Leser die speziellen Umstände jeweils bewußt sind. Darauf folgen die Ergebnisse und eine Diskussion der Ergebnisse. Zum Teil wurden Versuche wiederholt oder unter leicht veränderten Umständen wiederholt – dies ist dann unter „Versuchsaufbau“ je Thema wiederzufinden. Zum Abschluß werden die verschiedenen Einflußfaktoren in ihrer Bedeutung untereinander nochmals dargestellt und kommentiert. SB-Methode: Charakterisierung – laborseitige Einflüsse - Verdünnungsstufe 88 3.3.1. Faktor 1: Konzentrationsstufe / Verdünnungsstufe Einleitung Ein wichtiger Einflußfaktor auf die Bildmerkmals-Ausprägung ist die Konzentrationsstufe (bzw. Verdünnungsstufe), in der die Probe untersucht wird. Es gibt meistens einen Bereich der „optimalen“ Konzentration, in dem sich die Bilder zweier (oder mehrerer) Proben besonders gut unterscheiden (ANDERSEN et al. 2003), und in dem „eine ausgeglichene, dreigegliederte Bildeinheit mit deutlicher Formzeichnung“ entsteht (ENGQVIST 1977). Der Effekt der Konzentrationsstufe wurde für Milch schon von WOHLERS (2003) untersucht – hier sollen die grundsätzlichen Merkmale nochmals aufgeführt werden und an weiteren Proben der Effekt gezeigt werden. Fragen a) wie verändern sich die Bildmerkmals-Ausprägungen bei veränderter Probenkonzentration? b) Ist das Unterscheidungsvermögen von der Konzentrationsstufe abhängig? c) Welche Konzentrationsstufe kann als „optimal“ ausgewählt werden? Vorgehen Bei verschiedenen Milchproben werden Bilder in unterschiedlichen Konzentrationsstufen angefertigt. Es wird je Konzentrationsstufe eine Gruppierung der Bilder erstellt (zur Unterscheidung), und die unterscheidenden Merkmale notiert. Die Merkmalsentwicklung im Verlauf der Konzentrationsstufen wird ermittelt. Ergebnisse zu a) Veränderung der Bildmerkmale bei verschiedenen Konzentrationsstufen Bei hohen Konzentrationen (unverdünnt, d.h. 1:0, oder 1:1 mit Wasser verdünnt) entstehen gar keine Bilder – am unteren Bildbereich ist eine braune eher flache Bande, aber darüber entstehen keine / kaum weiter Bilmerkmale – das Papier erscheint „verstopft“, der Steigvorgang ist „gehemmt“ (SB-Abb-3-Konzentrationsreihe). Bei geringerer Konzentration (stärkerer Verdünnung) entstehen ab ca < 0,15ml Milch je Bild dreigegliederte Bilder. Bei 0,15 bis 0,1ml Milch je Bild (z.B. SB-Abb-15-Temperierung- Übersicht-071218) sind die Schalenzonen-Merkmale kaum ausgebildet – es treten allenfalls grünlich-braune Bereiche in Abgrenzung zum helleren Hintergrund in der Schalenzone auf, wenige relativ breite Fahnen sind zu erkennen – ist die Konzentration jedoch zu hoch, so SB-Methode: Charakterisierung – laborseitige Einflüsse - Verdünnungsstufe 89 bildet sich die Schalenzone nicht in der vollen Höhe oder nur Abschnittsweise aus, und auch die Fahnenzone weist an solchen Stellen Lücken auf (siehe SB-Abb-13-Abkühlung-070802). Je geringer die Konzentrationsstufe, desto regelmäßiger ist die Höhe der Schalenzone / die obere Linie der Schalenzone, und desto formenreicher wird die Schalenzone und die Fahnenzone, bis ab einem bestimmten Punkt die Schalen sehr klein und die Fahnen sehr schmal, kurz, (verwaschen) sind, und insofern die Formgestalten nicht mehr so ausdrucksstark sind (bei <0,066 ml). Mit zunehmender Verdünnung werden also die Schalen kleiner, bis nur noch eine wellige Linie vorliegt, die grünen Bereiche werden weniger und verschwinden ganz, die Fahnen werden schmaler und paralleler, der Sockel wird heller. Beispielhaft ist dieses an den Abbildungen SB-Abb-15-Temperierung-Übersicht-071218, SB-Abb-17-Fett-Milch- Mserum, SB-Abb-19-entrahmteMilch-Milch und SB-Abb-25-Hof_1-080819 zu sehen. Ergebnisse zu b) und c): Unterscheidungsvermögen und Konzentrationsstufe Die Bilder aus dem Temperierungs-Versuch (SB-Abb-15-Temperierung-Übersicht- 071218) ließen sich in der Konzentrationsstufe 0,1 ml nicht gut voneinander unterscheiden, aber in der Stufe 0,05 deutlich. In anderen Versuchen (z.B. Hof_1. V.a. 12.8 und 19.8.08) lassen sich die Bider bei 0,1ml gut unterscheiden – dafür im Bereich 0,05 nur schwer, die Bildunterschiede sind gering. Beim Vergleich der vier Wirtschaftsstile waren manchesmal die Bilder der einen Konzentrationsstufe für die Unterscheidung von zwei oder drei Proben geeignet, und die letzte Probe ließ sich aufgrund einer anderen Konzentrationsstufe von den anderen trennen. Besonders gut ist das Unterscheiden / Gruppieren von Proben bei Bildmerkmals- Ausprägungen möglich, die vielfältige Schalenzonen-Merkmale aufweisen. Die Fahnenzonen-Merkmale erscheinen (mit größerer Streuung) weniger zur Unterscheidung geeignet. Diese „optimale“ Bildmerkmals-Ausprägung ist aber proben-spezifisch (vergleiche z.B. Hof 11 und Hof 5, oder Hof 6 und Hof 10) – und auch in gewissem Rahmen Tages- spezifisch, da auch z.B. das Labor-Klima einen Einfluß auf die Bildmerkmals-Ausprägung nimmt. Fazit Um in jedem Fall Bilder in einer geeigneten Konzentrationsstufe zu erhalten, sollten Bilder in verschiedenen Konzentrationsstufen angefertigt werden. Meistens haben sich Konzentrationen von 0,075 oder auch 0,087 ml Milch je Bild als sinnvoll erwiesen, oft zeigten sich aber auch die geringeren oder höheren Konzentrationen von 0,1 oder 0,066 bzw. 0,05 ml je Bild als sehr hilfreich. SB-Methode: Charakterisierung – laborseitige Einflüsse - Klimaeffekte 90 3.3.2. Faktor 2: Klima Das Klima (Temperatur und Luftfeuchte) im Labor kann einen deutlichen Einfluß auf die Bildmerkmals-Ausprägung haben (ZALECKA 2006). Um den Klima-Effekt auf den gesamten Prozeß zu ermitteln kann das gesamte Labor auf verschiedene Temperatur- und Luftfeuchte-Niveaus eingestellt werden. Es kann aber auch eine Klima-Variation vorgenommen werden, indem kleinräumlich um das Papier herum ein spezielles Klima hergestellt wird. Aufgrund der (gewünschten) geringen Luftbewegung im Labor und der (unerwünscht) kalten Wände (Kellerraum) ist das Klima im Labor nicht einheitlich, sondern stark von der Position im Raum abhängig. Das gewünschte Klima-Niveau von 20°C und 60% r.F. wird für die Position A = „Mitte des großen Tisches“ eingestellt. Trotz Abschirmung zur Wand hin ist aber die Temperatur auf den Plätzen der R1 etwas kühler als auf den Plätzen von R2 und R3 (im Mittel 0,3 bis 0,5°C Differenz, bzw. 3% bis 5% höhere r.F.). Ähnliches findet sich für den „kleinen Tisch“ bezüglich der Plätze von R4 (näher der Wand) im Vergleich zu R5 und R6. Und die Temperatur auf Position B = „Mitte des kleinen Tisches“ ist im Mittel 0,5°C wärmer als bei Position A (1,5% geringere r.F.). Auch abhängig von der Höhe im Raum lassen sich klimatische Unterschiede feststellen: etwas über Kopfhöhe (Standort der Deckelgläser, über dem großen Tisch) ist es um 0,5°C wärmer (aber kaum trockener) als bei Position A, und im Beinbereich (20cm über dem Fußboden, unter dem Spültisch) ist es 2°C kälter. Im Verlaufe der Bildererstellungs-Prozedur verändert sich das Klima in der Nähe der Steigbilder deutlich: z.B. treten in der 3. Phase oft Werte bis über 70%r.F. auf. Insofern wurde als Meßpunkt für die Klima-Dokumentation die für die Papiere wichtige Position im Raum gewählt: zwischen den Papieren, im Bestand, in der Mitte des Tisches (Position A bzw. B). Aber das Raumklima (v.a. r.F.) verändert sich nur sehr wenig demgegenüber. Das kann in der Abb. 7:, Klimaverlauf am 9.5.08, sichtbar werden. An diesem Tag wurden auf dem großen Tisch Bilder erstellt (Meßpunkt A, dunkelblaue bzw. rote Linie), auf dem kleinen Tisch wurden keine Bilder erstellt (Meßpunkt B, hellblaue bzw. gelbe Linie). Der Verlauf der Luftfeuchte ist charakteristisch – während sich die Luftfeuchte zwischen den Bildern jeweils nach Pipettieren (P1) bzw. nach Aufdeckeln (P2 und P3) deutlich ansteigt (und die Temperatur sinkt, Verdunstungskälte), ist sie im Raum (in diesem Fall Position B) konstant. Sobald auf dem kleinen Tisch auch Bilder erstellt werden, ist auch hier diese charakteristische Kurve zu beobachten (Klimaverläufe vom 12.6., 18.6. und 21.7.08). Vereinzelt wurde auch das Klima in 30cm über den Papieren (vergleichbar der Meßposition bei Zalecka 2006) erfaßt – dort waren diese Schwankungen der r.F. und Temperatur nicht mehr festzustellen. Der Klimaverlauf ist dort vergleichbar dem von Position B am 9.5.08 (0,5°C wärmer als bei Position A, r.F. 1,5% geringer als A, konstant bei 59% +/- 2%). Werden jedoch keine Bilder im Raum erstellt, so sind die Klimaverläufe auf Tischhöhe (Position A) und 30cm über Papierhöhe gleich (max. 0,1°C Unterschied). SB-Methode: Charakterisierung – laborseitige Einflüsse - Klimaeffekte 91 Abb. 7: Klima-Verlauf im Labor am 9.5.08, 12.6.08, 18.6.08 und 21.7.08. Meß-Ort: A = großer Tisch (zwischen den Papieren), B = kleiner Tisch (zwischen den Papieren). P1, P2, P3= Beginn der 1., 2. und 3. Phase. SB-Methode: Charakterisierung – laborseitige Einflüsse - Klimaeffekte 92 3.3.2.1. Klima – punktuell variiert Um den Einfluß des Klimas auf die Bildmerkmals-Ausprägung zu untersuchen, kann entweder das gesamte Labor auf unterschiedlichem Niveau klimatisiert werden – oder einzelne Positionen werden unterschiedlich klimatisiert. Der Vorteil bei kleinräumlicher Klimatisierung ist der, dass alleinig der Faktor „Klima“ und nicht auch noch der Bildererstellungstag oder eine Proben-Veränderung (Alterung) als zusätzliche Faktoren in Betracht kommen. Deshalb werden hier zuerst die Versuche zur punktuellen Klimavariation in ihrem Einfluß auf die Bildmerkmals-Ausprägung dargestellt. a) Klima in der 3. Phase variiert (kaltes vs. warmes Deckelglas) Einleitung: Zur sicheren Bestimmung des Effektes des Klimas auf die Bildmerkmals-Ausprägung wird zuerst ein deutlicher Klima-Unterschied experimentell erzielt, indem besonders warme bzw. besonders kalte Deckelgläser in der 3. Phase (für die endgültige Bildmerkmals- Ausprägung besonders bedeutsame Phase) verwendet werden. Die praxis-relevanten Temperatur-Varianten werden im folgenden Versuch untersucht. Fragen: a. Wie verändert sich das Bildmuster bei deutlich unterschiedlichem Deckelglas- Klima in der 3. Phase? b. Ist der Proben-Effekt oder der Deckelglas-Effekt größer? Versuchsaufbau: Es werden von zwei gedoppelten Proben (Fütterungssystemvergleich Heu vs. Silage, 16.3.09) in zweifacher Wiederholung Bilder in R4 erstellt. In der 3. Phase werden die Bilder der 1. Wiederholung mit „kalten“ Deckelgläsern zugedeckt (Lagerung der Gläser unter der Spüle, 20cm über dem Fußboden), die anderen (2. Wiederholung) mit „warmen“ Deckelgläsern (Lagerung auf Kopfhöhe, über der Spüle). Zur Bildposition auf dem Tisch siehe auchAbb. 8:. Die Bilder werden nach Bildmerkmalen gruppiert und unterscheidende Merkmale notiert. Abb. 8: Lageplan. blau = „unter Tisch“ (kalt), lila = „über Tisch“ (warm) R4 (4-1 bis 4-8) O O O O O O O O R5 (5-1 bis 5-8) O O O O O O O O R6 (6-1 bis 6-8) O O O O O O O O SB-Methode: Charakterisierung – laborseitige Einflüsse - Klimaeffekte 93 Ergebnis: Die acht Bilder lassen sich in vier Zweier-Gruppen gruppieren. Diese Gruppen entsprechen den Deckelglas-Klima-Varianten und den Proben-Varianten (siehe Tabelle). Aufgrund der g.B.-Intensität könnten die Bilder gereiht werden, so dass die Probe „Heu“ mit wenig g.B., die Probe „Silage“ mit viel g.B. charakterisiert wird, die Deckelglas-Variante ist als Ko-Faktor von nebensächlicher Bedeutung. Wird nach dem Merkmal „Fahnenzone verwaschen“ gereiht, so ist der Faktor „Deckelglas-Klima“ von vordergründiger Bedeutung, die Probenunterschiede sind in diesem Merkmal geringer (SB-Abb-4-warmes-kaltes- Deckelglas). 3938+3934 = Probe „Heu“ 3936+3933 = Probe „Silage“ Warmes Deckelglas GB=4 (wenig) F kurz, schmal, heller F konturiert DL heller GB=7,5 (viel) F lang, schmal, aufstrebend, heller F + S konturiert DL heller Kaltes Deckelglas GB=6 (mittel) F mittel, breiter, dunkler F leicht verw. DL dunkler GB=9 (sehr viel) F lang, breit, schwerer, dunkler, F + S leicht verw. DL dunkler Tab 26. Ergebnis der Gruppierung der Bilder Diskussion: Anhand dieses einfachen Designs läßt sich mit Sicherheit feststellen, dass einzig der Faktor der Deckelgläser (dessen Klima) im Vergleich zum Faktor der Probenqualität wirksam ist, da alle anderen Faktoren (und Prozeßschritte) bei den Bildern vergleichbar sind. Es läßt sich feststellen, dass der Temperaturunterschied der Deckelgläser (6°C) während der dritten Phase einen deutlichen Einfluß auf die Bildmerkmals-Ausprägung zeigt – und es ist naheliegend, dass dieser Effekt nicht ganz verschwinden kann, wenn die gesamte Prozedur unter solchen Klimabedingungen durchgeführt wird. Fazit: - Zu Frage 1): Die Deckelglas-Variante hat einen deutlichen Einfluß auf die Bildmerkmals-Ausprägung: die Bilder der „kalten“ Deckelgläser weisen (im Vergleich zu den „warmen“) mehr grüne Bereiche auf (mind. 1,5 Boniturnoten mehr), und deutlich breitere und größere Fahnen, die etwas verwaschener /unkonturierter sind. Die Bilder der „wärmeren“ Variante hingegen haben wengier g.B., kleinere F und sind konturierter. - Zu Frage 2): Der Proben-Effekt ist im Merkmal „g.B.-Intensität“ größer als der Deckelglas-Effekt, weil eine Reihung nach g.B.-Intensität zur Gruppierung nach Proben- und nicht nach Deckelglas-Variante führt. Nach dem Merkmal „Kontur der Fahnen“ jedoch ist die Deckelglas-Variante von vorrangigem Einfluß. - Die Proben lassen sich je Deckelglas-Variante gleich gut unterscheiden (Gruppierung der 8 Bilder nach Bildmerkmalen in vier Gruppen, die den Proben / Deckelglas- Varianten entsprechen). SB-Methode: Charakterisierung – laborseitige Einflüsse - Klimaeffekte 94 b) Deckelglas-Klima in der Praxis, und Klima auf bestimmter Labortisch-Position Problem: Die für die Bildererstellung verwendeten Deckelgläser stehen aus Platzmangel z.T. an unterschiedlichen Orten im Labor. Sie erscheinen geringfügig unterschiedlich temperiert zu sein, je nach Standort. (weiter unten auf dem Tisch und näher an der Wand: kälter, weiter oben: wärmer). Dieser für die Praxis wichtige Einflußfaktor sollte bestimmt werden. Außerdem wird eine weitere Klima-Variation der Bilder aufgrund der Position auf dem Labortisch vermutet. Dieser zweite Faktor soll zusätzlich bei dieser Untersuchung berücksichtigt werden (in Form von Wiederholungen an verschiedenen Labor-Positionen), um zu ermitteln, ob das Deckelglas-Klima oder die Labor-Position (das Klima dort) von größerer Bedeutung ist. Fragen: 1) Wie stark ist der Einfluß des praxisüblichen Deckelglas-Klimas auf die Merkmalsausprägung im Steigbild? 2) Wie stark ist der Einfluß der Position auf dem Tisch (und des Klimas dort) auf die Merkmalsausprägung? 3) Ist der Faktor „Deckelglas-Klima“ oder „Labor-Position-Klima“ größer? Versuchsaufbau: Es werden am 9.2.09 in dreifacher Wiederholung (an drei Positionen im Labor; R1, R3, R5, siehe Lageplan Abb. 9:) 6 Bilder nebeneinander mit der gleichen Probe in der ersten Phase bestückt. In der zweiten und dritten Phase werden je Wiederholung zwei Deckelgläser „von hinten“ = „Hi“, zwei „von vorne“ = „Vo“ und zwei „vom Tisch“ = „Ti“ verwendet, gleichzeitig zugedeckelt und gleichzeitig wieder abgenommen. Die Bilder werden a) nach Bildmerkmalen gruppiert (zum Unterscheiden und Charakterisieren) b) nach Varianten nebeneinander gelegt und varianten-spezifische Bildmerkmale beschrieben (Merkmals-Ermittlung) Abb. 9: Lageplan der Varianten und Wiederholungen, Position im Labor Grau hinterlegt: Position mit Bild belegt. Farbig: Versuchs-Bilder. Gelb= „vorne“, grün = „hinten“, rot = „Tisch“ R4 (4-1 bis 4-8) O O O O O O O O R5 (5-1 bis 5-8) O O O O O O O O R6 (6-1 bis 6-8) O O O O O O O O R1 (1-1 bis 1-16) O O O O O O O O O O O O O O O O R2 (2-1 bis 2-16) O O O O O O O O O O O O O O O O R3 (3-1 bis 3-16) O O O O O O O O O O O O O O O O SB-Methode: Charakterisierung – laborseitige Einflüsse - Klimaeffekte 95 g.B.-Intensität S Z -F a rb in te n si tä t st e ig t Ergebnis der Gruppierung (zu a): Wenig gB (gB=7,5) Mittel viele (gB=8) Viele gB (gB=9) SZ farbintensiv, gB leicht verwaschen 5-6, 5-4 Ti, Hi (gB schmal) 5-5, 5-3 Ti, Hi 5-1, 5-2 Vo, Vo (gB breit) SZ mittel farbintensiv, gB leicht verwaschen 3-14, 3-13 Ti, Ti (gB breit) SZ normal bis mittel farbintensiv 3-15, 1-11, 3-11 Vo, Vo, Hi (gB schmal) 3-10, 1-15, 1-12, 3-12, 1-14, 1-13 Vo, Ti, Vo, Hi, Hi, Hi (gB breit) GB=6, schmal: 1-16 Ti Tab 27. Gruppierung und unterscheidende Merkmale der Bilder Aus obiger Tabelle ist abzulesen: - Die Wiederholungen in R1 und R3 (untere drei Zeilen der Abbildung) unterscheiden sich von der Wiederholung in R5 (obere Zeile). In R5 ist die SZ farbintensiver als in R3 und R1. - In der Wiederholung R5 lassen sich „Vo“ von „Hi+Ti“ trennen. („Vo“ hat mehr g.B. als die anderen Varianten). In den anderen Wiederholungen (R3 und R1) ist dieses nicht als konstante Differenzierung festzustellen. - In der Wiederholung R3 ist „Hi+Vo“ von „Ti“ zu trennen. „Ti“ hat eine farbintensivere SZ. - In der Wiederholung R1 sind die Deckelglas-Varianten nicht voneinander zu unterscheiden. Ergebnis der Merkmals-Ermittlung (zu b): Ermittlung der varianten-spezifischen Bildmerkmale (gleiche Varianten nebeneinander, je Reihe): - „Vo“: Mittelmaß aller Merkmale. Tendenz zu Steighemmung - „Hi“: SZ flacher, gB leicht rötlicher - „Ti“: gB grünlich, breit, dunkel, farbintensiv. Daran wird deutlich, dass sich Bildmerkmale finden lassen, die variantenspezifisch erscheinen (s.a. Abb. SB-Abb-5-Deckelglas.Vo-Hi-Ti). Ansonsten sind sich die Bilder sehr ähnlich. SB-Methode: Charakterisierung – laborseitige Einflüsse - Klimaeffekte 96 Diskussion: Die Gruppierung der Bilder nach Merkmals-Ausprägung zeigt, dass sich in erster Linie die Bilder der Wiederholung in R5 von den anderen unterscheiden. Somit ist Frage 3 zu beantworten mit:  „Die Position im Raum (Wiederholung R5) hat größeren Einfluß auf die Bildmerkmals-Ausprägung als die Deckelglas-Variante“. Frage 2 ist zu beantworten mit:  „Die Position R5 unterscheidet sich von den anderen Positionen R1 und R3. Diese wiederum lassen sich nicht voneinander unterscheiden.“ Die Unterscheidung in die Deckelglas-Varianten kann nur in zwei der insgesamt 9 Fälle vorgenommen werden. Außerdem ist keine einheitliche Merkmalsentwicklung im Rahmen dieser „verblindeten“ Gruppierung zu bemerken. Schon das läßt darauf schließen, dass der Effekt sehr gering sein muß. Interessant ist, dass sich bei „geordnetem, offenem“ Betrachten der Bilder zur Ermittlung varianten-spezifischer Bildmerkmale tatsächlich Merkmale finden lassen, die mit den Deckelglas-Varianten in Beziehung stehen können, diese lassen sich aber nicht konsistent in der „verblindeten“ Gruppierung wiederfinden. Insofern sind die Effekte des Deckelglas-Klimas vernachlässigbar gering gegenüber anderen Faktoren wie der Position im Labor (= Wiederholung). Frage 1 kann beantworten werden mit:  „Die Deckelglas-Varianten haben einen sehr geringen Einfluß auf die Bildmerkmals-Ausprägung, und sind gegenüber der Labor-Position kaum zu bemerken.“ Im Vergleich zu dem Experiment mit den extrem unterschiedlich temperierten Deckelgläsern sind die Effekte auf die Bildmerkmals-Ausprägung bei praxisrelevanten Temperatur-Unterschieden offensichtlich zu vernachlässigen. Ähnliches zeigte der Versuch, der unter Kapitel 3.3.5 „Steighöhe in 2. Phase“ dargestellt wird: die Bilder 5-3 (V-7) und 5-5 (V-8) sind mit „kalten“ Deckelgläsern (von unten) zugedeckelt worden, Bild 5-1 mit „warmem“ (von oben) – die Bilder mit „kalten“ Deckelgläsern sind langsamer gestiegen (2min länger / später aufgedeckelt) als das mit „warmem“, jedoch lassen sich keine unterschiedlichen Merkmalsausprägungen feststellen – die Reiheneffekte und Aufdeckel-Effekte (2mm vs. 2cm über 1. Steiglinie) sind deutlich größer. Der Deckel-Klima-Effekt ist ziemlich gering. Fazit:  Das praxis-relevante Deckelglas-Klima hat einen sehr geringen Einfluß auf die Bildmerkmals-Ausprägung. Der Faktor „Position im Labor“ bzw. „Klima der Position“ scheint von größerer Bedeutung zu sein. SB-Methode: Charakterisierung – laborseitige Einflüsse - Klimaeffekte 97 c) Klima auf bestimmter Labortisch-Position: Problem: Das Klima über der Tischoberfläche ist von der ersten (hinteren) zur dritten (vorderen) Reihe nicht konstant, sondern im hinteren Tischbereich werden etwas geringere Temperaturen gemessen, im vorderen etwas höhere (bis ca. 0,5°C Differenz). Selbst mit einer Abschirmung der kalten Luft, die die Wand herabfällt (Brett hinter dem Tisch mit 10cm Abstand zur Wand) ließt sich der Umstand nicht ändern. Auch ist der Tischrand des großen Tisches zur einen Seite hin offen, und die Trocknungszeit der Papiere könnte verkürzt sein und dadurch die Bildmerkmals-Ausprägung beeinflussen. Außerdem wurden auf einem zweiten, niedrigeren, „kleinen Tisch“ weitere Stellplätze für Bilder eingerichtet (rundherum umrandet), da für einige Fragestellungen mehr Bilder gleichzeitig erstellt werden mussten („Höfe-Wirtschaftsstile“). Auch hier ist die Temperatur und Luftfeuchte im Vergleich zum „großen Tisch“ (jeweils in der Mitte des Tisches gemessen) deutlich (um ca. 0,5°C höher und 1,6% r.F. geringere Werte als auf dem großen Tisch), und auch der Reiheneffekt ist wie beim „großen Tisch“ messbar. Noch gravierender werden die Klima-Unterschiede, wenn noch ein weiterer „extra- Tisch“ (auf Kniehöhe nahe der Heizung) improvisiert genutzt wird. Es ist wichtig, diese Einflußfaktoren (Position im Labor, Klima dort) auf die Bildmerkmals-Ausprägung zu kennen, um die Vergleichbarkeit der Bilder an den verschiedenen Positionen sicherzustellen bzw. die Nicht-Vergleichbarkeit zu berücksichtigen. Fragen: 1) Wie stark wirkt sich der Tisch-Standplatz (positionsbedingter Klima-Unterschied) auf die Merkmalsausprägung der Bilder aus? a. Können Bilder aus Reihe 1 mit Bildern aus Reihe 2 und 3 verglichen werden? b. Können Bilder aus Reihe 4 mit Bildern aus Reihe 5 und 6 verglichen werden? c. Können Bilder des „großen Tisches“ mit Bildern des „kleinen Tisches“ verglichen werden? 2) Sind Probenunterschiede trotz Reiheneffekten weiterhin sichtbar? Versuchsaufbau 1 (R1 vs. R2 vs. R3): Es werden Bilder ausgewertet, die aus einer Probe, jedoch an verschiedenen Positionen auf dem „großen Tisch“ (zu vergleichbarer Zeit) erstellt wurden. Dazu werden alle Plätze des „großen Tisches“ (je Reihe 11 bis 13 Bilder) mit EINER Probe belegt (jeweils 8 Schälchen nacheinander pipettiert, Schälchen gedreht, Papiere eingestellt, dann die nächsten 8. Beginnend bei 1-1, 1-2... bis 3-10, 3-11). Diese Bilder werden nach Bildmerkmalen (in diesem Fall „Intensität der gB“) gruppiert. SB-Methode: Charakterisierung – laborseitige Einflüsse - Klimaeffekte 98 Ergebnis: Gruppe Gruppe 1 (gB=5) Gruppe 2 (gB=6) Gruppe 3 (gB=7) Bild-Nr R1- 1, 2, 10, 11, 13 R2- 1, 2, 10, 11 R3- 1, 2, 4, 11 R1 – 5, 7, 8, 9, 12 R1- 3, 4 R2- 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 R3- 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10 R1-6: Bild fehlerhaft. Nicht auswertbar. Es ist deutlich, - dass die ca. zwei Bilder am Anfang und am Ende der Reihen jeweils weniger gB ausbilden als die Bilder in der Mitte der Reihe, - dass die Bilder der Reihe 1 im Mittel etwas weniger gB ausbilden als die Bilder der Reihen 2 und 3, - dass sich die Reihen 2 und 3 in der Intensität der gB nicht voneinander unterscheiden. Fazit: Zu Frage 1: Bilder aus Reihe 1 können nicht mit Bildern aus Reihe 2 und 3 verglichen werden – außer es wird der Faktor der geringeren gB-Ausbildung bei Reihe 1 berücksichtig. Auch muß die geringere gB-Ausbildung der ersten und letzten Plätze je Reihe beachtet werden. Versuchsaufbau 2 (R4 vs. R5, vs. R2): An den Positionen R4 (5 Bilder), R5 (3 Bilder) und in R2 (1 Bild) werden Bilder aus einer Probe erstellt (von UHT-Milch, in R4 in zwei Varianten, siehe auch „Steighöhe in 2. Phase“, Kapitel 3.3.5). Diese neun Bilder werden nach Bildmerkmalen gruppiert. Ergebnis: In Tab 28 sind die Merkmale, nach denen die Bilder gruppiert werden konnten, aufgeführt, im Zusammenhang mit den experimentellen Einflußfaktoren. Daran ist abzulesen, dass die Bilder aufgrund der Bildmerkmale entsprechend der Position im Labor gruppiert wurden, dass der Faktor „Zeitpunkt des Aufdeckelns in P2“ aber auch offensichtliche Effekte zeigt. Besonders deutlich ist, dass die drei Bilder aus Reihe 4 (mit kleineren S und verwascheneren S) sich von den drei Bildern aus Reihe 5 (mit größeren S und konturierteren F) bei sonst gleichen Bedingungen unterscheiden. Das eine Bild aus R2 läßt sich von diesen ebenfalls unterscheiden (durch längere Fahnen als bei den Bildern aus R4 und R5 bei vergleichbaren Bedingungen). F lang F kurz F konturiert S groß „2mm“, R4 „1cm“, R5 F verwaschen S klein „1cm“, R2 „1cm“, R4 SB-Methode: Charakterisierung – laborseitige Einflüsse - Klimaeffekte 99 Tab 28. Ergebnis der Gruppierung nach Bildmerkmalen. Fazit: Die Bilder aus R4 haben kleiners S und verwaschenere F Die Bilder aus R5 haben größere S und konturiertere F  Die Bilder aus R4 sind von den Bildern aus R5 unterscheidbar. Das Bild aus R2 hat längere Fahnen als die Bilder aus R4 und R5, die S sind vergleichbar R4.  Tischeffekt. Versuchsaufbau 3 (R1 vs. kleiner Tisch): Von zwei gedoppelten Proben (W-Stile, 7.3.08) werden an mehreren Positionen Bilder erstellt (je Probe vier Bilder in R1 und zwei auf dem kleinen Tisch (R4, R6), insgesamt 12 Bilder). Diese werden nach Bildmerkmalen gruppiert / gereiht. Ergebnis: Die Bilder lassen sich in zwei grundsätzliche Gruppen aufteilen, und diese wiederum in zwei bzw. drei Subgruppen unterteilen. Gruppe 1 hat unten eine weiße Sockellinie und mehr g.B., Probe 2 hat eine rötlich-braune Linie unten und keine g.B.. Die Subgruppen sind durch die Breite des Srands und Breite der DL bzw. g.B.Intensität zu unterscheiden. Die Gruppen entsprechen der Proben-Qualität (Probe „X“ vs. Probe „Y“), während die Position im Labor als „Untergruppierung“ auftaucht (siehe Abb. 10:). Bild-Gruppe Gruppe 1: Sockellinie unten weiß Gruppe 2: Sockel unten rötliche Linie Bild-Nr 1-2 1-1, 1-3, 1-4 6-2, 4-2 1-8, 1-6, 1-5, 1-7 6-6, 4-6 gB=0,5 gB=5 gB=6,5 gB=0 gB=0 Bild-Merkmale Srand schmal DL eng Srand breiter DL breiter Srand schmal DL mittel-breit Srand breit DL breit. Probe X1 X1, X2, X2 X2, X1 Y2, Y1, Y1, Y2 Y2, Y1 Abb. 10: Gruppierung von Bildern von zwei Proben, die an verschiedenen Positionen im Labor erstellt wurden. Fazit: Hinsichtlich des Effektes der Position im Labor läßt sich festhalten: - Die Bilder von kleinen Tisch (R4 und R6) unterscheiden sich deutlich vom großen Tisch (kleiner Tisch: breitere DL, breiterer Srand). - Der Probeneffekt ist größer als der Tischeffekt (bei sich deutlich unterscheidenden Proben). - Die Reihen des kleinen Tisches scheinen sich nicht voneinander zu unterscheiden. - Der Unterscheid der Proben ist auf dem kleinen Tisch größer als auf dem großen Tisch. SB-Methode: Charakterisierung – laborseitige Einflüsse - Klimaeffekte 100 Versuchsaufbau 4 (R4, R5): Von zwei Proben (Mischprobe Heu vs. Silage, 2.3.09) werden in Reihe 4 und Reihe 5 je ein Bild erstellt (insgesamt 4 Bilder). Diese Bilder werden nach Bildmerkmalen gereiht / gruppiert. Ergebnis: Die Bilder können aufgrund der Bildmerkmale in zwei Gruppen unterteilt werden, die den Proben-Qualitäten entsprechen. Die Unterschiede der Merkmale sind als gering zu bezeichnen (z.B. gB-Unterschied 0,4). Jedoch reichen die geringen Unterschiede in den Merkmalen der Schalenzone für eine Gruppierung der Proben aus. Deutlich wird der Unterschied im Merkmal der DL. Bild-Nr 5-7, 4-7 4-8, 5-8 Merkmale gB=8 gB etwas dunkler, „kompakter“ S weniger geformt DL eng gB=7,6 gB etwas heller, „luftiger“ S mehr ausgeformt (wegen weniger gB.) DL breit Proben-Q Re-GuM Li-GuM Tab 29. Unterscheidende Bildmerkmale Fazit zum Reiheneffekt: Der Faktor „Position im Labor“ ist im Vergleich zum (geringen) Proben-Unterschied nicht zu bemerken. Versuchsaufbau 5 (an Molke, R1 vs. R2): Von zwei Molke-Proben (Höfe – 20.11.08) wurden in Reihe 1 und Reihe 2 je 1 Bild (insgesamt 4 Bilder) erstellt. Diese Bilder werden nach Bildmerkmalen gereiht / gruppiert. Ergebnis: Die Bilder lassen sich entsprechend der Bildmerkmale in zwei Zweier-Gruppen aufteilen. Die eine Gruppe hat dunklere F und dunkle Punkte in der SZ, die andere hellere F und keine dunklen Punkte in der SZ. Die Gruppierung entspricht der Proben-Qualität. Bild-Nr 1-13, 2-13 1-14, 2-14 Merkmale F dunkler Dunklere Punkte in SZ F heller Keine dunklen Punkte in SZ Probe Probe A Probe B Tab 30. Gruppierung der Bilder nach Bildmerkmalen Fazit: Der Einfluß der Position im Labor auf die Bildmerkmals-Ausprägung ist geringer als der Einfluß der Probe (er beeinträchtigt die Gruppierung der Proben nicht.). SB-Methode: Charakterisierung – laborseitige Einflüsse - Klimaeffekte 101 d) Diskussion zu der Labortisch-positionsbedingten Merkmals-Variation: Es ist auffällig, dass bei gezielten Versuchen, in denen die Variation der Bilder aufgrund von verschiedenen Positionen / Tischstandplätzen ermittelt werden sollen, Unterschiede in der Merkmalsausprägung festgestellt werden. Interessanter Weise sind diese Effekte „einheitlich“, wenn sie auf die Effekte bezogen werden, die bei einer Konzentrationsreihe beobachtet werden können: - In Versuch 1 hat R1 (kälter) weniger g.B. als R2 und R3 – es könnte ein Vergleich zum Konzentrations-Effekt hergestellt werden: die hintere, kältere Reihe (R1) erscheint mit weniger g.B. wie geringer konzentriert. - In Versuch 2 hat R4 (kälter) kleiners S und verwaschenere F als R5 – auch hier könnte die hintere Reihe als „scheinbar geringer konzentriert“ beschrieben werden, also in Übereinstimmung mit dem 1. Versuch: kältere Bilder ähneln scheinbar geringer konzentrierten. - In einem weiteren Versuch (zum Effekt der Standzeiten der Vorverdünnung, Kapitel 3.3.4) hatten wie in Versuch 2 die Bilder der Reihe 4 weniger gB und kleinere S als die Bilder von Reihe 5. - In Versuch 3 hat der kleinere Tisch (wärmer) Bilder mit einem breiteren Srand und breiterer DL als der große Tisch. Jedoch sind diese Merkmale schwierig auf die Konezntrations-Effekte zu beziehen. Die g.B.-Intensität eignet sich besser: die Bilder vom kleine Tisch haben mehr g.B. als vom großen Tisch, insofern ist auch hier die kältere Position (großer Tisch) mit scheinbar geringer konzentrierten Bildern anzutreffen. - Im Versuch zum Deckelglas-Klima und Tischposition ist der Reiheneffekt von R1 zu R3 nicht offensichtlich. Der Effekt von R5 (kleiner Tisch) im Vergleich zum großen Tisch kann als gesichert bezeichnet werden, wobei auf dem großen Tisch (kühler) die etwas „farblich helleren“ Bilder auftreten – was wiederum einen Zusammenhang mit den Effekten bei einer Verdünnung hat (geringer konzentriert – hellerer Sockel) - Im Versuch zum Effekt der Alterung der Fe-Lösung wurden zwei Wiederholungen in verschiedenen Reihen durchgeführt. Es zeigte sich, dass die gB-Intensität bei R2 um eine Boniturnote größer als bei R3 (also in R2 mehr g.B. auftreten als in R3 – siehe dazu auch Kapitel 1.1.1 - Fe-Alterung). Dieser Effekt wäre konträr zum Ergebnis von Versuch 1: hier ist die mittlere (vermutlich kältere) Reihe mit mehr g.B., also scheinbar höher konzentriert als die vermutlich wärmere R3. Aus den vier Versuchen kann abgeleitet werden, dass Bilder, die an Positionen erstellt werden, die etwas kälter sind als andere, die Bildmerkmale verändert sind dahingehend, dass sie wie geringer konzentriert erscheinen, d.h. z.B., dass entweder die g.B.-Intensität geringer ist, die Schalen kleiner, oder die Bilder (Sockel) heller sind. Die Bilder des Versuches zur Fe-Alterung jedoch können diese These nicht unterstützen. SB-Methode: Charakterisierung – laborseitige Einflüsse - Klimaeffekte 102 Bei Versuch 4 und 5, in denen nur geprüft wurde, ob die Proben- oder die Positions- Effekte größer sind, waren in beiden Fällen die Proben-Eigenschaften diejenigen, nach denen die Gruppierung vorgenommen wurde, die Positions-Effekte waren dagegenüber nicht zu bemerken. Aber auch in den anderen Verschen, in denen neben den Positions- oder Klima-Effekten der Vergleich zum Probeneffekt gemacht wurde, war immer der Proben- Effekt größer oder noch erkennbar im Vergleich zum Klima- bzw. Positions-Effekt. Auch der Effekt des Deckelglas-Klimas unter praxisüblichen Bedingungen war so gering, dass er im Vergleich zum Positions-Klima-Effekt zu vernachlässigen ist. Der gezielt extreme Unterschied in P3 führte zu Bildunterschieden, die vergleichbar den Proben- Qualitäten waren, jedoch anders geartet, die Probenunterschiede blieben erhalten, da sie sich z.T. mit anderen Merkmalen als die Klima-Variante (F-Kontur) äußerte, wobei die g.B.- Intensität sowohl durch die Probe als auch durch die Klima-Variante beeinflußt war. Bei der Deckelglas-Klimatisierung im „extremen“ Versuch waren die Bilder der kälteren Variante jedoch mit mehr g.B. als die wärmere – also die scheinbar höher konzentrierten. Dies steht im Kontrast zu den Versuchen aus den Positions-Klima-Versuchen und kann noch nicht erklärt werden. Die anfänglichen Fragen lassen sich wie folgt beantworten: 1) Wie stark wirkt sich der Tisch-Standplatz (positionsbedingter Klima- Unterschied) auf die Merkmalsausprägung der Bilder aus? a. Bilder aus Reihe 1 können nicht direkt mit Bildern aus Reihe 2 und 3 verglichen werden. b. Bilder aus Reihe 4 können nicht direkt mit Bildern aus Reihe 5 und 6 verglichen werden. c. Bilder des „großen Tisches“ können nicht mit Bildern des „kleinen Tisches“ verglichen werden. 2) Probenunterschiede sind trotz Reiheneffekten weiterhin sichtbar. Weitere Faktoren wie z. B. der Zeitpunkt des Pipettierens können (im Zusammenhang mit dem positionsbedingten Klima) auch einen deutlichen Einfluß auf die Bildmerkmals-Ausprägung haben (siehe Kapitel „Standzeiten-Vorverdünnung“, und Kapitel „Standardbilder“ 1.4.2009 an drei Standorten / drei Zeiten). SB-Methode: Charakterisierung – laborseitige Einflüsse - Klimaeffekte 103 3.3.2.2. Labor-Klima - gezielt variiert Einleitung: Aus der Arbeit von Zalecka ist bekannt, dass das Klima einen starken Einfluß auf die Steigbilder hat. Zalecka untersuchte 40%, 60% und 80% r.F. bei 20°C – und kam zu dem Ergebnis, dass die Bilder bei 40% sehr klar konturiert sind, und die Bilder von 80% sehr verwaschen – so dass kaum noch eine Aussage zur Qualität möglich war. Sowohl 40% als auch 60% eigneten sich ähnlich gut für die Differenzierung der Proben. Ein ähnlicher Versuch soll für Milchbilder durchgeführt werden. Fragestellung: 1) Hat das Kammer-Klima bei Milchproben einen ähnlichen Effekt auf die Bildmerkmals- Ausprägung wie bei Weizen / Möhrensaft? 2) In welcher Art und Weise verändern sich die Milchbilder bei verändertem Kammer- Klima? 3) Ist das Unterscheidungsvermögen der Methode vom Klima stark beeinflusst? Versuchsaufbau: An 6 aufeinander folgenden Tagen werden bei je Tag verändertem Klima Bilder erstellt. Es werden die Temperaturen 18°C, 20°C und 22°C untersucht sowie die Luftfeuchtegehalte 40%, 60% und 70% (Versuchsplan in Tab 31). Es werden Bilder von (Roh)Milchproben angefertigt, sowie Standard-Bilder (UHT-Milch und Wasser). Weil nicht ganz sicher ist, ob eine vom selben Hof wiederholt genommene Probe immer gleich ist und weil mit Alterung der Probe eine Bildveränderung einhergeht wird möglichst sowohl mit frischen (0d), als auch mit gealterten Proben (1d, 2d, 3d) gleichzeitig gearbeitet. Außerdem werden von 3 verschiedenen Milch-Qualitäten (2 Höfe mit Rohmilch, 1 Molkerei mit Vollmilch, nicht homogenisiert) Bilder angefertigt, um das Unterscheidungsvermögen zu überprüfen. Die je Tag verwendeten Proben sind der Tab 31 (s.u.) zu entnehmen. Das Problem des Designs ist, dass abgesehen von den Standard-Bildern nicht sichergestellt werden kann, dass die Ausgangs-Probe immer die gleiche ist – weshalb die Proben in ihrer Alterung parallel untersucht werden. Auch wäre eine Wiederholung notwendig, um klima-unabhängige, tagesspezifische Effekte auszuschließen, was nicht durchgeführt wurde. Dafür wird ein Abgleich der Standard-Bilder mit den anderen Standard- Bildern vorgenommen, um Klima-Effekte von weiteren (Tages-) Effekten zu trennen. Die endgültige Diskussion der Ergebnisse findet deshalb zusammen mit jenen Ergebnissen statt. SB-Methode: Charakterisierung – laborseitige Einflüsse - Klimaeffekte 104 Datum Klima (Ziel) Proben 4.4. 18°C, 60%r.F. DFH – 0d LW – 0d SB – 0d 6.4. 18°C, 40% r.F. DFH – 1d LW – 1d SB – 0d SB – 1d 7.4. 20°C, 40% r.F. DFH 3d LW – 0d (MHD 10.4.) SB – 0d SB – 3d (MHD 8.4.) 8.4. 20°C, 60% r.F. DFH – 0d DFH – 4d LW – 1d (MHD 10.4.) SB – 0d (MHD 12.4.) SB – 4d (MHD 8.4.) 9.4. 20°C, 70% r.F. DFH – 0d DFH – 1d LW – 2d (MHD 10.4.) SB – 1d (MHD 12.4.) 10.4. 22°C, 60% r.F. DFH - 0d DFH - 1d DFH - 2d LW - 0d Tab 31. Versuchsplan zur Klima-Variation, mit Angabe der je Tag untersuchten Proben. DFH, LW, SB = verschiedene Probenherkünfte / Höfe. d= day (Tage nach dem Melken). Auswertung: Die Bilder ALLER Versuchstage und ALLER Milch-Varianten wurden gemischt und nach Bildmerkmalen gruppiert / geordnet (ohne Berücksichtigung des Erstellungsdatums oder der Probenqualität, insgesamt 80 Bilder). Die Merkmale, nach denen sich die Proben unterscheiden und gruppieren lassen, wurden festgehalten (siehe unten, Abb. 12:), und anschließend die Klima-Variante / Proben-Qualität je Bild ergänzt (Abb. 13:). An der Gruppierung läßt sich ablesen, inwieweit das Kammer-Klima bzw. die Proben-Qualitäten sich voneinander unterscheiden lassen und wie sie sich charakterisieren lassen. Ergebnisse: Die Bilder der (Roh)Milchproben lassen sich in drei grundsätzliche Gruppen aufteilen: Gruppe 1 mit hellen, zarten, dünnen, scharf konturierten, „kompakten“ Schalenformen, Gruppe 2 mit dunklen, farbintensiven, „kompakten“ Schalenformen, und Gruppe 3 mit „normalen“ Schalenformen, deren Rand relativ breit ist, und deren Schalen und grünen Bereiche mittelgroß sind. Gruppe 1 läßt sich nochmals unterteilen in eine Gruppe, die die genannten Merkmale extrem ausgebildet hat (1a), und eine weitere (1b), die etwas mehr g.B. und größere S hat, insofern Gruppe 3 ähnelt. Und in Gruppe 3 (3b, unten) gibt es wiederum Bilder, die der Untergruppe von 1 (=1b) ähnlich sind (etwas kompakter als die anderen sind). Die Bilder wurden entsprechend dieser Gruppen ausgelegt. Im Abb. 11: wird dieses Grundmuster dargestellt. SB-Methode: Charakterisierung – laborseitige Einflüsse - Klimaeffekte 105 Gruppe 1a: Hell, zart, dünn, scharf konturiert, „kompakt“ Gruppe 2: Dunkel, farbintensiv, „kompakt“ Gruppe 3a: „normal“: Srand relativ breit, S und gB mittelgroß Gruppe 1b: Etwas mehr gB, S größer, „voluminöser“, ähnlich re unten Gruppe 3b: Etwas kleinere S als oben, „kompakter“ Abb. 11: Grundsätzliche Gruppierung der Bilder aus den Klima-Variationen: In jeder dieser grundsätzlichen Gruppen lassen sich die Bilder weiterhin zu Subgruppen anordnen – aufgrund einzelner Bildmerkmale wie z.B. S-Größe, g.B.-Intensität, Srand-Gestaltung, usw. Diese Gruppierung in 32 Subgruppen ist in Abb. 12: wiederzuerkennen – jedes Kästchen stellt eine Bildergruppe dar und benennt ihre charakteristischen Bildmerkmale, im Vergleich zu den anderen Subgruppen. Dabei sind einander ähnliche Gruppen möglichst eng beieinander angeordnet, und unterschiedliche weit auseinander. Außerdem sind die Bilder mit kleineren S (geringerer Substanzwirkung) im oberen Bereich, die mit größeren S und mehr g.B. im unteren Bereich der Abb. 12:. Werden diesen 32 Subgruppen, von denen bis jetzt nur die Bildmerkmale bekannt sind, jetzt die tatsächlichen Proben-Qualitäten (textlich) und die Klima-Daten bzw. Bildererstellungsdatum (farblich markiert) hinzugefügt, zeigt sich folgendes (Abb. 13:): - Die Bilder eines Bildererstellungsdatums (= Klima-Variante) sind oft dicht beieinander. Es lassen sich Ähnlichkeiten im Bildtyp je Klima-Variante unabhängig von der Probe feststellen. - Die Bilder vom 6., 7. und 8.4. sind nahe beieinander angeordnet. Der Einfluß der Klima-Variation ist gering. - In den Subgruppen sind meistens nur Bilder einer Qualität. Ein Hinweis darauf, dass sich die Proben anhand der Bildmerkmale unterscheiden lassen. Ausnahme: Bei den Bildern unten rechts in der Abbildung (6.4., SBg) treten mehrere Alterungsstufen einer Probe in einer Gruppe auf. Und in der Mitte sind Bilder vom 7.4. und 6.4. in einer Gruppe zusammengefaßt. Die Bilder der UHT-Standard-Bilder und Wasser-Bilder werden bei der Auswertung der Standard-Bilder (siehe dort) mit berücksichtigt. Zur Orientierung sind sie in SB-Abb-6-Klima-ad-H-Übersicht wiedergegeben. SB-Methode: Charakterisierung – laborseitige Einflüsse - Klimaeffekte 106 Hell, zart, dünn, scharf konturiert, „kompakt“ Dunkel, farbintensiv, „kompakt“ „normal“: Srand relativ breit, S und gB mittelgroß S=2 GB=0 DL breit S=2,5, verwaschen GB=0 DL breit SW S-füllung farbintensiv , S=2,5-3 Srand körnig GB=0 DL S=3 Srand breit, verw., körnig S=4 Srand schmal GB=1 DL breit S=4 Srand breit GB=1 DL breit S=3,5 Srand schmal, körnig GB=1,5 DL breit S=2,5 GB=1, kruz, kompakt Srand gelöst, verw. SW, rötl.L DL S=3,5, rund, verw. GB=0,5 Srand gelöst F breit S=3,5, rund, verw. GB=0 Srand nicht gelöst F schmal Etwas mehr gB, S größer, „voluminöser“, ähnlich re unten S=2, konturi ert GB=1, kurz, kompa kt Rötl.L GB breiter, farbint ensiv Rötl.L SZ dunkl e F lang, F- beine Rötl.L SZ dunke l Ähnli ch links SW Rötl. L S-füllung farbintensiv F- Hintergrund dunkel S=2,5-3 GB=1 Srand körnig, dunkel S- füllung farbinte nsiv Fhinterg rund heller S=3 GB=1,5 Srand heller F-Beine. S=2,5, dunkel GB=dunkle, kompakt S=3-4, unregelm. Srand gelöst GB=2, kaum DL F-Beine. S=3, hell GB=1, hell, schmal S=2, hell Srand schmal, dünn GB=4 DL Sockel rosa S=2, hell Srand schmal, dünn GB=4 DL Sockel weiß S=3, (viele, schmal, „rund“) GB=3-4 (kurz, rund, kompakt) F-Beine S=4,5, dunkel GB=1, dunkel, breit S=3-4, unregelm., gB=3 (ähnlich oben) deutlich DL S=4, rund, verw. GB=1 (Asätze) DL SW S=4, rund, verw. GB=1 (Asätze) DL SW Ag- Steigfehler Srand verw., gelöst S rund, gB=0,5, eher „rund“ DL SW S=2, verw. GB= kurz, kompakt, dunkel-grün, farbintensiv, Srand gel. Rötl.L SW S=3 S heller S verw. GB=0 Rötl. L SW S=3 S konturierter GB=0,1 Rötl.L SW Abb. 12: Bildmerkmale, nach denen sich die Bilder der 6 Klima-Varianten und div. Proben-Qualitäten gruppieren lassen. Es war unbekannt, wieviele Bilder je Variante vorhanden waren (zwischen 2 und 4). Die grundsätzlichen Bildtypen sind grau hinterlegt. SW = Sockelwolke SB-Methode: Charakterisierung – laborseitige Einflüsse - Klimaeffekte 107 Hell, zart, dünn, scharf konturiert, „kompakt“ Dunkel, farbintensiv, „kompakt“ „normal“: Srand relativ breit, S und gB mittelgroß 9.4. 1-5 = DFH 1d 1-6 = DFH 1d 1-7 = DFH 1d 9.4. 1-9 = SB 1d 1-10 = SB 1d 1-11 = SB 1d 1-12 = SB 1d 8.4. 4-1 = DFH 4d 4-2 = DFH 4d 10.4. 1-5 = DFH 2d 1-7 = DFH 2d 1-8 = DFH 2d 9.4. 1-2 = DFH 0d 1-3 = DFH 0d 1-4 = DFH 0d 1-8 = DFH 1d 9.4. 1-1 = DFH 0d 1-14 = LW 2d, Fe frisch 9.4. 1-13 = LW 2d 1-15 = LW 2d Fe alt 8.4. 5-1 = SB 4d 5-2 = SB 4d 10.4. 1-3 = DFH 0d 1-4 = DFH 0d 1-9 = DFH 1d 1-10 = DFH 1d 10.4. 1-1 = DFH 0d 1-2 = DFH 0d 1-6 = DFH 2d Etwas mehr gB, S größer, „voluminöser“ (ähnlich re unten) F-Beine: 6.4. 1-6 = LW 1d 6.4. 1-8 = LW 1d 6.4. 1-5 = LW 1d 6.4. 1-4 = DFH 1d 6.4. 1-3 = DFH 1d 6.4. 1-7 = LW 1d 1-9 = SB 0d 1-10 = SB 0d 8.4. 2-1 = LW 1d 8.4. 1-2 = DFH 0d 7.4. 1-12 = LW 0d 1-13 = LW 0d 1-14 = LW 0d 10.4. 1-11 = LW 0d 1-12 = LW 0d 1-13 = LW 0d 7.4. 1-1 = DFH 3d 1-2 = DFH 3d 6.4. 1-1 = DFH 1d 4.4. 1-9 = LW 0d 1-10 = LW 0d 4.4. 1-11 = LW 0d 7.4. 1-3 = DFH 3d 1-4 = DFH 3d 6.4. 1-2 = DFH 1d 8.4. 1-1 = DFH 0d 1-3 = DFH 0d 1-4 = DFH 0d 2-2 = LW 1d 4.4. 1-1 = DFH 0d 1-2 = DFH 0d 1-3 = DFH 0d 1-4 = DFH 0d 4.4. 1-5 = SB 0d 1-6 = SB 0d 1-7 = SB 0d 4.4. 1-8 = SB 0d 8.4. 2-3 = SB 0d 2-4 = SB 0d 7.4. 1-5 = SB 3d 1-6 = SB 3d 1-7 = SB 3d 1-11 = SB 0d 6.4. 1-11 = SB 0d 1-13 = SB 1d 1-14 = Sb 1d 7.4. 1-8 = SB 3d 6.4. 1-12 = SB 1d 1-15 = SB 1d 7.4. 1-9 = SB 0d 1-10 = SB 0d Abb. 13: Bildererstellungsdatum und Proben-Qualitäten der gruppierten Bilder, gleiche Anordnung wie in Abb. 12: mit den Bildmerkmalen dieser Gruppen. Farbige Markierung der Gruppierung nach Klima-Variante. Subgruppen mit ähnlichen Bildmerkmalen sind nebeneinander / übereinander dargestellt, in Abgrenzung zu den anderen Subgruppen. Jedes Kästchen enstpricht einer Subgruppe mit ähnlichen Bildmerkmalen, in der Vermutung, dass es wiederholte Bilder einer Probe seien. Aus diesen gruppierenden Bild-Merkmalen, die parallel zu den Klima-Varianten auftreten, kann zusammenfassend festgehalten werden, dass die Bilder vom 4.4. eher zarte, feine, dünne, konturierte S haben, die etwas „voluminöser“ sind als die vom 9.4.. Sie sind schon fast als „normal“ zu bezeichnen, wie die Bilder vom 6.4. und 7.4., die sich kaum voneinander unterscheiden. Deutlich farbintensivere und kompaktere Schalen finden sich am 8.4., und die Bilder vom 9.4. heben sich deutlich von denen ab, mit sehr zarten, feinen, hellen, scharf konturierten Schalen und der Tendenz zu einer breiten DL, dagegen treten am 10.4. wieder fast „normale“ Schalen-Formen auf, jedoch relativ kleine Schalen (siehe dazu auch Tab 32). SB-Methode: Charakterisierung – laborseitige Einflüsse - Klimaeffekte 108 Das je Tag tatsächlich vorliegende Klima in der Kammer ist in Tab 32 aufgeführt – die gewünschten Klima-Varianten konnten großenteils gut simuliert werden, die beiden Tage mit 18°C-Ziel-Temperatur hatten jedoch etwas höhere Luftfeuchte-Gehalte als geplant. Auch die 20°C - 40%r.F.-Variante was feuchter als gewünscht (bei jeweils knapp 50%r.F.). Die genauen Klima-Verläufe (gemessen zwischen den Papieren) können der Abb. 14: entnommen werden. Es könnte ein Zusammenhang zwischen dem herrschenden Klima und der Bildmerkmalsausbildung gesehen werden. Datum Klima (Ziel) Klima (real) Trocknungs- zeiten Klima-Charakteristische Bildmerkmale 4.4. 18°C, 60%r.F. P1: 17,8°±0,2; 66,5%±3,5 P2: 17,8°±0,1; 62,3%±3,2 P3: 17,7°±0,1; 64,7%±2,7 P1: 4h P2: 3h Eher zarte, feine, dünne, konturierte S, etwas „voluminöser“, d.h. größer als 9.4., fast schon „normal“. Tendenz zu breiter DL. F kurz, hoch ansetzend, rel. dunkel. 6.4. 18°C, 40% r.F. P1: 18,0°±0,1; 48,2%±1,1 P2: 17,8°±0,2; 48,6%±1,6 P3: 17,5°±0,3; 49,9%±3,6 P1: 3h P2: 3,4h 7.4. 20°C, 40% r.F. P1: 19,2°±0,5; 48,9%±1,8 P2: 20,1°±0,3; 47,0%±2,1 P3: 19,6°±0,4; 49,7%±7,2 P1: 4h P2: 3h Vor P3 gelüftet 6.4. und 7.4. kaum zu unterscheiden. „normale“ bis relativ zarte, helle S und gB. DL eher schmal / einfach. F eher lang, aufstrebend, hell 8.4. 20°C, 60% r.F. P1: 19,7°±0,6; 63,6%±3,8 P2: 20,1°±0,4; 61,9%±2,0 P3: 20,3°±0,4; 62,7%±4,3 P1: 3,5h P2: 3h Farbintensiv, kompakt, dunkel (SZ und gesamtes Bild). DL eher schmal / einfach. F kurz, breit, hoch ansetzend, dunkel. 9.4. 20°C, 70% r.F. P1: 19,9°±0,1; 70,3%±1,4 P2: 20,0°±0,3; 73,7%±2,8 P3: 19,9°±0,1; 73,4%±3,3 P1: 3h P2: 3h Sehr zarte, feine, dünne, helle, scharf konturierte S.. Tendenz zu breiter DL. F mittellang, seitlich verlaufend, parallel, deutl. F-kranz. 10.4. 22°C, 60% r.F. P1: 21,8°±0,2; 63,7%±2,1 P2: 22,0°±0,1; 64,5%±2,1 P3: 21,7°±0,3; 65,9%±3,6 P1: 4h P2: 3h „normale“, eher kleine S / wenig gB. S- Rand relativ breit. Tendenz zu breiter DL. F lang, breit, beweglich, eher verw. Tab 32. Übersicht über die untersuchten Klimavarianten, verwendeten Probenqualitäten und Klima-charakteristischen Bildmerkmale, die sich aus der obigen Gruppierung ablesen lassen. Siehe dazu auch SB-Abb-7-Klima-Uebersicht. P1 = Phase 1 (Beginn der Arbeiten im Labor, ca. ½ h vor Pipettier-Beginn, bis Beginn der 2. Phase) P2 = Phase 2 (Beginn der Arbeiten im Labor, ca. 10min. vor Pipettier-Beginn, bis Beginn der 3. Phase) P3 = Phase 3 (Beginn der Arbeiten im Labor, ca. 10min. vor Pipettier-Beginn, bis ca. 5h danach) SB-Methode: Charakterisierung – laborseitige Einflüsse - Klimaeffekte 109 Bemerkungen zu der Ergebnissen: Das gewünschte Klima war nicht immer so präzise zu erreichen, wie es wünschenswert wäre. Insbesondere die 40% r.F. am 6.4. und 7.4. waren nicht realisierbar. Die tatsächliche r.F. lag bei ca. 48%. Auch die r.F. am 10.4. war nicht wie gewünscht: hier war sie zu hoch, und ließ sich mit dem vorhandenen Entfeuchter nicht stärker drosseln. Bei der Schwankung der r.F. ist zu bedenken, dass das Klima im Bestand, in der Mitte des Tisches, gemessen wurde (nicht das Raumklima). Wie stark sich ein kurzfristiges Lüften auf die r.F. auswirkt, kann am 7.4., vor der 3. Phase, beobachtet werden. Fazit: Die Bildmerkmals-Ausprägungen im Zusammenhang mit dem Klima weisen darauf hin, - dass bei erhöhter Temperatur kleinere S / weniger g.B. auftreten, - und dass bei erhöhter r.F. eher breite DL auftreten und ebenfalls weniger g.B. Die stark erhöhte r.F. am 9.4. führt zu auffällig dünnen, zarten, feinen, kleinen S. Die Bilder vom 6.4. und 7.4. sind sich sehr ähnlich, woraus gefolgert werden kann, dass es für die Bildmerkmals-Ausprägung relativ gleichgültig ist, ob bei 18° oder 20°C (bei 50% r.F.) gearbeitet wird. Die Proben lassen sich unabhängig vom Klima fast immer voneinander unterscheiden (unterschiedliche Merkmals-Ausbildung). Um die Ergebnisse abzusichern müßte der Versuch wiederholt werden, am besten in zwei verschieden klimatisierten Kammern gleichzeitig, um Tages-Effekte auszuschließen. SB-Methode: Charakterisierung – laborseitige Einflüsse - Klimaeffekte 110 Abb. 14: Klimaverlauf (°C und % r.F.) an den Versuchstagen zur Klima-Variation, Aufzeichnungs-Intervall: 5min. SB-Methode: Charakterisierung – laborseitige Einflüsse - Klimaeffekte 111 3.3.2.3. Standardbild-Variationen 2007 bis 2009 – Gruppierung und Ordnung der Bilder nach div. Merkmalen Problem: Die bei jedem Bildererstellungsdatum mit erstellten Standard-Bilder sehen einander teilweise sehr ähnlich – teilweise unterscheiden sie sich aber deutlich hinsichtlich Schalenzonen- und Fahnenzonen-Merkmalen. Frage: Was ist die Ursache dieser unterschiedlichen Merkmalsausprägung? a) Klima-Variation im Labor (Kammer-Klima)? b) Trocknungszeiten nach erster / zweiter Phase? c) Luftdruck? d) Äußere Klima-Verhältnisse? e) Proben-Effekt? f) Datum? g) Sonstiges? Vorgehen: A: Gruppierung nach Bildmerkmalen 1) Alle vorhandenen H-Milch-Standardbilder (2007 bis 2009) werden nach Bildmerkmalen gruppiert und diese Gruppierung festgehalten 2) Die Bildererstellungstage von 2007 bis Mitte 2008 werden nach Klima- Varianten gruppiert 3) Die dazugehörigen Bilder werden zu den Klimavarianten gelegt und die Gemeinsamkeit der Bildmerkmals-Ausprägungen geprüft. 4) Die Trocknungszeiten werden zusätzlich berücksichtigt 5) Es wird im Überblick über die ausgelegten Bilder geprüft: i. Sind bei ähnlichem Klima ähnliche Bilder, die sich von anderem Klima unterscheiden? ii. Sind bei ähnlichen Trocknungszeiten ähnliche Bilder, die sich von anderen unterscheiden? iii. Unter welchen Bedingungen / Umständen treten ähnliche Bilder auf? / treten anders geartete Bilder auf? B: Bonitur und statistische Auswertung (folgendes Kapitel) Ergebnis Gruppierung Die H-Milch-Standard-Bilder lassen sich grob in vier Gruppen (A, B, C, D) einteilen (s.a. SB-Abb-8-H-Standard-4-Gruppen). - Gruppe A mit relativ „normalen“ Bildern, die konturierte, grün-gefüllte S aufweisen. - Gruppe B und C mit „untypischen“ Bildern, - Gruppe D mit „normalen“ Bildern, jedoch mit braunen, eher kleinen, verwaschenen S. Innerhalb dieser Bildertyp-Gruppen wurden die Bilder hinsichtlich der S-Größe und F- Größe gruppiert, wobei A1 = kleine S, A9 = große S. Die vorgenommene Gruppierung ist der Tabelle im Anhang Teil A („H-Milch-Standard-Bilder, Gruppierung nach Bildmerkmalen“) zu entnehmen. SB-Methode: Charakterisierung – laborseitige Einflüsse - Klimaeffekte 112 Die Subgruppen A6 und A8 sind sich relativ ähnlich, auch C2 weist gewisse Ähnlichkeiten dazu auf. Die Gruppe B77 beinhaltet die Bilder, die aufgrund von „verdorbener“ H-Milch nicht als „Standard-Bild“ angesprochen und genutzt werden kann. Zur Vollständigkeit werden sie aber mit aufgeführt. Diskussion Bei der Suche nach einer Erklärung zu dieser Gruppierung fällt auf: a) die Bilder aus 2009 sind bis auf eines (25.3.09 in Gruppe C6) alle in Gruppe D. b) In den Gruppe A6 und A8 sind sehr viele Bilder c) In A6 sind fast nur Bilder aus 2008, in Gruppe A4 sind fast nur Bilder aus 2007 d) Es gibt sehr ungewöhnliche Bilder („Ausreißer“), insbes. Gruppen B, C, A1, D1 e) An manchen Tagen sind an verschiedenen Standplätzen erstellte Bilder in verschiedenen Gruppen (z.B. 1.4.09), an manchen Tagen nicht (8.4.08, 15.4.08, 26.11.07 usw.). f) Manchmal sind Bilder dicht beieinander liegender Tage in einer Gruppe, manchmal nicht. Die Befunde können mit folgenden Faktoren zusammenhängen: - Zu a) Der Jahreseffekt für 2009 kann auch mit der Probe zusammenhängen, da ab dem 9.2.09 eine neue Charge H-Milch verwendet wurde. Es kann jedoch auch ein Jahreseffekt vorliegen, da kein direkter Vergleich der H-Milch- Chargen durchgeführt wurde. - Zu b) Diese Bildmerkmale scheinen „typisch“ für H-Milch-Bilder, und könnten bei „häufig erzieltem Klima“ auftreten. - Zu c) Der Jahreseffekt 2007 (Gruppe A4) kann mit dem gesamten Kammerklima zusammenhängen, da der Datenlogger, nach dem das Klima eingestellt wurde, auf der rechten Tischseite nahe der Wand stand und der Platz etwas kälter ist als die Mitte des Tisches, auf dem der Datenlogger ab 2008 stand. Somit war das Raumklima 2007 insgesamt wärmer. Es kann jedoch ein Jahreseffekt nicht ausgeschlossen werden. - Zu e) Wenn Bilder eines Datums in verschiedene (Sub-) Gruppen eingeordnet wurden, liegt der Zusammenhang mit dem Raumklima nah, weil die verschiedenen Standplätze unterschiedliche Klimabedingungen aufweisen. Z.B. R1 an der Wand kühler als R2 und R3, d.h. tendenziell größere S, was sich im Bild bestätigt. R10 sehr feucht, was das Bild mit verwaschenen F bestätigt. - Zu d) und f): Die „Ausreißer“ sind nicht jahreszeitlich einzuordnen. Sie treten scheinbar „zufällig“ auf. Ein Zusammenhang zum Kammerklima (und anderem) muß geprüft werden. SB-Methode: Charakterisierung – laborseitige Einflüsse - Klimaeffekte 113 Prüfen des Zusammenhanges von Labor-Klimadaten und Bildmerkmalen des H-Milch-Standards Die Bildererstellungstage werden nach dem „charakteristischen Klimaverlauf“ gruppiert, indem z.B. Tage in eine Gruppe sortiert werden, an denen die erste Phase (P1) relativ warm war, die 2. und 3. Phase relativ kalt, die r.F. aber immer „normal“. Oder an dem alle drei Phasen relativ kühl waren, die r.F. aber hoch. Als „relativ warm“ gilt eine mittlere Temperatur von 20,3°C und höher (bis 22°C), als „relativ kalt“ gilt 19,7°C und kälter (bis 18°C). Eine „relativ hohe“ mittlere r.F. liegt bei 63% und höher (bis 75%), eine „relativ niedrige“ bei 57% und niedriger (bis 45%). Diese Gruppen werden auf folgende Weise angeordnet: von links nach rechts abnehmende Wärme (links warm, rechts kalt), von unten nach oben zunehmende Feuchte (unten trocken, oben feucht). Ergebnis: Abb. 15: Gruppierung der Bildererstellungstage nach Klima-Variante und Ergänzung der Gruppe, in die das H-Milch-Standard-Bild dieses Tages einsortiert wurde. SB-Methode: Charakterisierung – laborseitige Einflüsse - Klimaeffekte 114 Nach diesem Muster werden die Steigbilder (H-Milch und a.d.) ausgelegt und die Bildmerkmale betrachtet. Dabei fällt folgendes auf: 1) Die Bilder je Klima-Gruppe stammen z.T. aus unterschiedlichen Bild-Merkmal- Gruppen bzw. Bilder einheitlicher Merkmalsausbildung entstanden bei unterschiedlichem Klima (z.B. 26.11.07 und 27.11.07; 23.8.07 und 6.9.07; 6.5.08 und 10.4.08, 8.4.08 und 4.4.08).. D.h. das Klima ist nicht der primär die Bilder beeinflussende Faktor. Es können aber gewisse Zusammenhänge zwischen Bildmerkmalen und Klima-Gruppierung gefunden werden. 2) Die unter gezielt extremen Klimabedingungen (22°C bis 18°C, 70% r.F. bis 45% r.F.) erstellten Bilder heben sich von den anderen Bildern nicht durch besonders auffällige Merkmale ab. D.h. wie bei 1): das Klima ist nicht der primäre Einflussfaktor. 3) Die H-Milch-Bilder sind sich zwar ähnlich, aber die a.d-Bilder sind z.T. unterschiedlich (Ergebnis nicht gezeigt). Bzw. andersherum. D.h. die H-Milch-Bilder zeigen anderes als die a.d.-Bilder. 4) Die relativ geringen Klima-Effekte (z.B. Reiheneffekte...) entsprechen den unter „Klima-Variation“ dargestellten Ergebnisse (Die unter wärmeren Bedingungen erstellten Bilder haben kleinere / flachere Schalen und kürzere Fahnen als Vergleichsbilder, bzw. bei erhöhter r.F. (s.a. Zalecka 2006) entsteht ein verschwommeneres Bild (wenig konturiert, z.B in R10), die S werden kleiner (9.4.08=G6, 10.4.08=G5). SB-Methode: Charakterisierung – laborseitige Einflüsse - Klimaeffekte 115 Prüfen des Zusammenhanges vom Luftdruck und Bildmerkmalen des H- Milch-Standards Der Einfluß des Luftdruckes auf die Bildmerkmals-Variation soll geprüft werden. Hierzu wird eine Grafik (Balkendiagramme) erstellt, die den Luftruck für jeden Bildererstellungstag wiedergibt. Die Daten sind so angeordnet, dass die Tage mit ähnlichen Bildmerkmalen (definiert nach Bild-Gruppen) nebeneinander stehen. Abb. 16: Luftdruck an der Wetterstation „Witzenhausen/Wald“ je Tag in hPa. Es ist deutlich, dass sich keine Bildmerkmal-Gruppe durch besondere Luftdruck- Werte von den anderen absetzt – alle haben sowohl niedrige als auch hohe Werte. Daraus kann gefolgert werden, dass der Luftdruck nicht vorrangig für die Bildmerkmals-Ausprägung verantwortlich ist. (der Luftdruck an der Messstation der Uni ist konstant 14 hPa höher als derjenige der hier dargestellten Messstation.) Bei gleichem Vorgehen für die Außentemperatur und Außen-Luftfeuchte ergibt sich ein vergleichbares Ergebnis. Luftdruck[hPa] 980 990 1000 1010 1020 1030 1040 1050 A 1 A 2 A 3 A 4 A 5 A 6 A 7 A 8 A 9 B 1 B 2 B 3 B 6 C 1 C 4 C 5 C 6 Luftdruck[hPa] SB-Methode: Charakterisierung – laborseitige Einflüsse - Klimaeffekte 116 Diskussion zu den Ergebnissen nach Vorgehen A - Gruppierung Die z.T. sehr auffällig unterschiedlich ausgeprägten Bildmerkmale sind nicht in allen Fällen mit den erfaßten Faktoren erklärbar. Eine Reihe von Faktoren läßt sich in den Bildmerkmalsvariationen wiederfinden: Die Klima-Variation im Labor (Kammer-Klima) spiegelt sich in gewissem Rahmen im Bild, wird jedoch von anderem oft überlagert (d.h. es sind die je Klimavariante zusammengestellten Bilder nicht einheitlich in der Merkmalsausprägung). Eine verlängerte Trocknungszeiten nach der erster Phase (P1 – 7 Tage bzw. 5 Stunden) zeigt keine bemerkbaren Veränderungen im Standard-Bild. Eine Trocknungszeit von 12 Stunden nach P2 jedoch führte zu stark veränderten Bildmerkmalsausprägungen (Bild sehr viel heller, ganz anders geartet als normal), was sich aber auch nicht in allen Fällen so ausgeprägt zeigte (siehe Diskussion zu „Trocknungszeiten“). Für die Bildmerkmalsvariation 2009 könnte ein Proben-Effekt verantwortlich sein (2009 wurde mit einer anderen H-Milch-Charge gearbeitet), jedoch sind die Unterschiede zwischen den Bildmerkmalsausprägungen von 2007 und 2008 bei gleicher (alternder) Probe ebenfalls beachtlich. Deshalb wird der Effekt „Probe“ als nebensächlich betrachtet. Viel naheliegender ist der Faktor „Datum“, der mit der Bildmerkmalsvariation in Beziehung zu stehen scheint – oft sind zeitnah erstellte Bilder einander ähnlich, obwohl gewisse Klima-Variationen auftreten (siehe „experimentelle Klima-Variation“ im April 2008 im Vergleich zu Bildern aus 2007 und 2009). Welcher verursachende Faktor nun genau mit dem „Datum“ zusammenhängt und die Bildmerkmalsvariation veranlaßt konnte nicht ermittelt werden. Denkbare Einflüsse, die über mehrere Tage / im Verlauf eines Jahres sich „langsam“ verändern, aber auch „spontanen“ Veräderungen unterliegen (in wenigen Stunden...), wären z.B. die Stimmung des Laboranten (der daraufhin die Klimaführung oder Handhabung der Geräte verändert), die Luft-Elektrizität im Raum, kosmische Einflüsse (z.B. Mondphasen). Ein denkbarer weiterer Effekt wäre die Wasserqualität – die zwar Tageseffekte erklären könnte, wenn das Wasser von verschiedenen Chargen stammen würde. Da aber Wasser unterschiedlicher Herkunft kaum unterschiedliche Bildmerkmalsausprägungen ausbildet (s.a. Zalecka 2006), ist der Effekt unwahrscheinlich. Das Alter der Fe- oder Ag-Lösung könnte noch denkbar sein im Zusammenhang von Tageseffekten – ist aber unwahrscheinlich, da der Jahreseffekt (2007 vs. 2008 vs. 2009) dadurch nicht geklärt werden kann. Es ist somit deutlich, dass sich einige Bildmerkmalsvariationen nicht mit den erfaßten Faktoren erklären lassen. SB-Methode: Charakterisierung – laborseitige Einflüsse - Klimaeffekte 117 Fazit zu Ergebnissen nach Vorgehen A - Gruppierung Zu den Fragen: Was ist die Ursache dieser unterschiedlichen Merkmalsausprägung? a) Klima-Variation im Labor (Kammer-Klima)? In gewissem Rahmen im Bild festzustellen, jedoch von anderem oft überlagert. b) Trocknungszeiten nach erster / zweiter Phase? - Trocknung nach P1 7 Tage: nicht bemerkbar im Standard-Bild - Trocknung nach P2 5h: nicht bemerkbar. -Trocknung nach P2 12h: Bild sehr viel heller, ganz anders geartet als normal. c) Luftdruck? Kein Zusammenhang d) Äußere Klima-Verhältnisse? Keine Zusammenhänge e) Proben-Effekt? Unbedeutend bzw. nebensächlich. f) Datum? Naheliegend g) Sonstiges? - Alter der Fe- oder Ag-Lösung: unwahrscheinlich. - Wasserqualität: unwahrscheinlich. - Luft-Elektrizität: keine Aussage möglich. - Stimmung des Laboranten, kosmische Einflüsse: im Zusammenhang mit dem Datum denkbar. SB-Methode: Charakterisierung – laborseitige Einflüsse - Klimaeffekte 118 3.3.2.4. Standardbild-Variationen 2007 bis 2009 - Bonitur der Bildmerkmale und statistische Auswertung (Korrelationen) Problem Es ist bei der Anzahl Standard-Bilder schwierig, einen Überblick zu bekommen hinsichtlich des Zusammenhanges der Bildmermale und z.B. des Klimaverlaufs an dem Tag. Um dieses zu vereinfachen wurden zwei Verfahren gewählt: 1) die vorliegenden Bilder werden nach Bildmerkmalen gruppiert 2) die Bildmerkmale werden bonitiert Ziel ist es, zu ermitteln, ob es einen Zusammenhang zwischen Bildmerkmal und Klimaverlauf gibt. Dieses soll für die Wasser-Bilder und die UHT-Milch-Standard-Bilder getrennt voneinander durchgeführt werden. Fragen 1) Gibt es einen Zusammenhang zwischen den Bildmerkmalen der Standard-Bilder und dem Klimaverlauf im Labor? 2) Gibt es andere Faktoren, die sich in den Bildmerkmalen wiederspiegeln? Material und Methode Es wurden je Bildererstellungstag (104 Tage) ein- bis zwei UHT-Milch-Standardbilder sowie a.d.-Standardbilder nach definierten Bildmerkmalen bonitiert (Bonitur-Verfahren siehe Anhang, insgesamt 159 Datensätze). Diese Merkmale wurden mit Labor-Klima-Merkmalen sowie Außenklima-Merkmalen und Laborprozeßmerkmale (Trocknungszeiten) in Beziehung gebracht, indem Korrelationen ermittelt wurden (REML-Methode, in JMP8). In dieser Korrelationsmatrix wurden Korrelationen r>0,5 (Bildmerkmale untereinander bzw. Klimadaten untereinander) und Korrelation von r>0,3 (Bildmerkmale mit Klimadaten) als relevant eingestuft und beschrieben. Ergebnisse Korrelationen der Klimadaten untereinander Es wird geprüft, inwieweit die Klimadaten untereinander in Beziehung zueinander stehen. Es zeigt sich, dass es sehr enge Korrelationen zwischen den Temperaturen der drei Phasen gibt. D.h. ist das Labor in P1 „warm“, so ist es auch in P2 und P3 relativ warm (r=0,7). Gleiches gilt für die Luftfeuchte im Labor. Ein Zusammenhang zwischen Luftfeuchte und Temperatur im Labor ist geringfügig (zwischen r = 0,18 und 0,34). Ein Zusammenhang zwischen Labor-Klima und Luftdruck oder Außentemperatur ist nicht offensichtlich. Die Temperatur (Außen) korreliert mit dem Luftdruck (r= 0,6) und der relativen Luftfeuchte (r=- 0,6). SB-Methode: Charakterisierung – laborseitige Einflüsse - Klimaeffekte 119 Korrelationen der Bildmerkmale untereinander - die Höhe der Fahnenansätze korreliert mit der Fahnenlänge (r=0,8) und Fahnenbreite (r=0,5) - Fahnenbreite ist mit der Fahnenlänge korreliert (r=0,5) - Die Fahnenkontur korreliert mit der Fahnenlänge und Schalenkontur (r=0,5). Weitere Korrelationen sind geringfügiger. Korrelationen zwischen Bildmerkmalen und Labor- bzw. Klima-Effekten In Tab 33 ist ein Ausschnitt der ermittelten Korrelationsmatrix wiedergegeben. farblich hinterlegt und fett markiert sind die Werte >0,3, vereinzelt sind auch kleinere Werte markiert, aber dann nicht fett gedruckt. Grau gedruckte Zeilen und Spalten enthalten keine auffälligen korrelierenden Werte. Es lassen sich folgende Effeke feststellen, die einen Zusammenhang mit der Bildmerkmalsausprägung haben: 1) Temperatur in P1 (geringfügig auch in P2 und P3, aber mit abnehmendem Effekt): in Merkmal 14, 17 und 23 (r=0,3 bis 0,4) 2) Temperatur in P3: kaum Korrelationen 3) Temperatur-Schwankungen: in Merkmal 19 für P1 und P3, in Merkmal 7 und 10 für P3 (r=0,3 bis 0,4) 4) Luftfeuchte in P1: kaum Korrelationen 5) Luftfeuchte in P2 und P3-Minimum: in Merkmal 23 und 14, geringfügig in Merkmal 11 (r=0,29 bis 0,4) 6) Trockungszeit nach P1: kaum Korrelatinen 7) Trocknungszeit nach P2: deutlich in Merkmal 17 und 20 (r=0,6), geringfügiger in Merkmal 13 und 21 (r=0,3) 8) Luftdruck: in Merkmal 6 und 7 mit p=0,57 und 0,47 sowie in Merkmal 1, 2, 4, 13 und 23 mit p=0,3 9) Temperatur außen: in Merkmal 6, 8, 9, 10, 12, und 23 mit p=0,3 bis 0,4 SB-Methode: Charakterisierung – laborseitige Einflüsse - Klimaeffekte 120 Außerdem können folgende Bildmerkmale genannt werden, die auf spezielle Faktoren besonders empfindlich reagieren: 1) S-Größe (1) und S-Kontur (2): Luftdruck-Einfluß (r=0,3) 2) grS (3): geringer Temperatur-Effekt in P3 (maximal-Temp.) 3) F-Länge (4): Luftdruck und Luftfeuchte-Schwankung in P3 4) F-Kontur (6): Luftdruck und Außen-Temperatur 5) F-Ansätze Höhe (7): Schwankung der Luftfeuchte und Temperatur in P3, sowie Luftdruck 6) F-Ansätze regelmäßig (8): Außentemperatur 7) Ocker Linie Farbintensität (9): Außentemperatur (r=0,5) 8) DL einfach (10): Außentemperatur und Schwankung der Temperatur in P3 9) Breite der DL (11): minimale Luftfeuchte in P2 und P3 10) Rosa im Sockel (14): Temperatur in P1 und P2, sowie minimale Luftfeuchte in P2 und P3 bzw. Schwankung der Luftfeuchte in P3 11) Sockelwolke (17): Trocknungszeit nach P2 (r=0,6) sowie Temperatur in P1 12) Ag-Linie – Ausprägung (20): Trocknungszeit in P2 (r=0,6) 13) Ocker Linie – Farbintensität (23): Temperatur in P1, minimale Luftfeuchte in P2 und P3, sowie Außen-Temperatur und Luftfeuchte. SB-Methode: Charakterisierung – laborseitige Einflüsse - Klimaeffekte 121 Diskussion zu Ergebnisse nach Verfahren B: statistische Auswertung Es ist auffällig, dass nur in zwei Fällen Korrelationen von r>0,6 auftraten: bei den Bildmerkmalen 17 (Sockelwolke) und 20 (Ag-Linie – Ausprägung) im Zusammenhang mit der Trocknungszeit nach P2. Da auch dieses noch Werte sind, die nicht als signifikant bezeichent werden können, kann allgemein davon ausgegangen werden, dass die Bildmerkmalsausprägung nur geringfügig mit den untersuchten Faktoren zusammenhängt, und dass andere Faktoren einen größeren Einfluß haben. Es könnte gefragt werden, ob die Effekte überhaupt in unterschiedlicher Ausprägung vorlagen – durch die Klima-Variations-Versuche lagen Bilder von Labor-Temperaturen zwischen 18° und 22°C vor, sowie Luftfeuchten von real 45% bis 74% (so hoch wegen der gezielten Klimavariation). Insofern kann von einer gewissen Variation der Werte ausgegangen werden – der Effekt in den Bildern ist aber im Hinblick auf andere (nicht erfaßte) Effekte relativ gering. Trotzdem lassen sich aber gewisse Effekte mit einem Zusammenhang zur Bildmerkmalsausprägung finden: vor allem die Außen-Temperatur und häufig auch der Luftdruck, gefolgt von der Trocknungszeit nach P2. Weil der Luftdruck mit der Außentemperatur korreliert (r=0,68) könnten auch gleichzeitig beeinflußte Bildmerkmale auftreten – dies ist jedoch nur vereinzelt der Fall. Es gibt aber ganz deutlich eine Vielzahl von Bildmerkmalen, die sich mit der Außentempartur (somit Sommer – Winter) verändern. Von diesem Effekt wird auch von anderen Personen, die mit der Methode arbeiten, berichtet (DORN, FRITZ, GEIER, mdl. Mitteilungen). Der Effekt der Trocknungszeiten ist auch bekannt (DORN, FRITZ, mdl. Mitteilungen), jedoch ist interessant, dass es sich v.a. in zwei Merkmalen (17 und 20) wiederspiegelt. Die Temperatur und Luftfeuchte im Labor haben relativ geringe Einflüsse, wenngleich sie noch bemerkbar sind. Dabei wäre zu erwarten, dass v.a. die Temperierung in der 3. Phase von Bedeutung sein müßte – jedoch finden sich die meisten Korrelationen im Bereich der Werte von P1 und P2. D.h. die ersten Phasen sind von größerer Bedeutung als die 3. Phase. Ein Teil der Bildvariationen läßt sich mit den erfaßten Faktoren nicht erklären. SB-Methode: Charakterisierung – laborseitige Einflüsse - Klimaeffekte 122 S - G r ö ß e S - K o n t u r g r S F - L ä n g e F - B r e i t e F - K o n t u r F - A n s ä t z e H ö h e F - A n s ä t z e r e g e l m . H ö h e o c k e r l i n i e f a r b i n t e n s i t ä t D L ( e i n f a c h - d o p p e l t ) B r e i t e d e r D L g r a u e r B a r t ü b e r w e i ß ( w e i ß e r R a n d ) w e i ß e r B a r t r o s a i m S o c k e l u n t e n ( F l ä c h e ) r o s a - F a r b i n t e n s i t ä t ( d u n k e l h e i t ) k ö r n i g e " W o l k e " u n t e r D L S o c k e l w o l k e ( F l ä c h e ) S o c k e l w o l k e - F a r b e ( h e l l - d u n k e l ) O b e r e S o c k e l l i n i e - A u s p r ä g u n g A g - L i n i e - A u s p r ä g u n g g r a u e r F a h n e n b e r e i c h - F l ä c h e F Z - k o n t u r e n o c k e r L i n i e - F a r b e Bildmerkmal-Nr 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 (1) 18 (2) 19 (3) 20 (4) 21 (5) 22 (6) 23 (7) UHT-Milch-Bilder a.d.-Bilder P1- °C- mw 0,00 -0,11 0,15 0,16 -0,05 0,13 -0,19 -0,14 0,15 -0,02 0,04 0,06 0,11 -0,34 0,00 -0,04 0,30 0,13 -0,13 0,21 -0,12 0,09 0,42 P1- °C stdabw 0,02 0,16 0,22 0,01 -0,02 0,06 0,04 -0,12 -0,18 0,08 -0,13 -0,14 -0,12 0,14 -0,04 -0,11 0,11 0,14 -0,30 0,08 -0,15 -0,09 -0,04 P1- °C- min -0,05 -0,15 0,13 0,18 -0,10 0,13 -0,22 -0,08 0,19 -0,05 0,09 0,08 0,10 -0,37 -0,03 -0,01 0,28 0,13 -0,08 0,21 -0,12 0,08 0,45 P1- °C max 0,01 -0,01 0,22 0,22 -0,10 0,18 -0,21 -0,17 0,12 -0,04 0,01 -0,01 0,09 -0,30 0,00 -0,06 0,35 0,19 -0,23 0,24 -0,18 0,08 0,40 P2- °C- mw -0,05 -0,08 0,24 0,08 -0,09 -0,08 -0,09 0,12 -0,05 0,00 -0,10 0,18 0,18 -0,27 0,01 0,03 0,22 0,08 -0,24 0,27 -0,11 0,10 0,17 P2- °C stdabw 0,01 -0,09 0,16 -0,06 -0,07 -0,15 0,06 0,09 -0,24 0,00 -0,02 -0,05 -0,12 -0,20 -0,11 0,11 0,03 -0,09 -0,33 0,05 0,13 -0,24 -0,26 P2- °C- min -0,04 0,00 0,14 0,17 -0,07 0,03 -0,15 0,02 0,07 -0,07 -0,03 0,14 0,24 -0,25 0,10 0,03 0,22 0,13 -0,15 0,24 -0,14 0,14 0,24 P2- °C max -0,08 -0,09 0,28 0,08 -0,12 -0,08 -0,11 0,10 -0,08 -0,03 -0,09 0,15 0,17 -0,33 0,00 0,04 0,24 0,09 -0,33 0,29 -0,10 0,04 0,11 P3- °C- mw -0,15 -0,22 0,28 -0,02 -0,07 -0,13 0,01 0,11 -0,01 -0,01 -0,03 0,20 -0,01 -0,26 -0,12 -0,01 0,10 0,04 -0,15 0,18 -0,15 0,03 0,28 P3- °C stdabw 0,19 0,06 0,08 0,29 -0,26 0,03 -0,40 0,25 -0,34 0,31 -0,27 0,18 0,15 -0,01 0,12 0,21 0,15 0,02 -0,21 0,11 0,06 0,07 -0,06 P3- °C- min -0,29 -0,17 0,22 -0,05 0,02 -0,08 0,10 0,00 0,11 -0,22 0,10 0,13 -0,02 -0,13 -0,07 -0,05 -0,01 0,09 -0,06 0,10 -0,19 0,03 0,25 P3- °C max -0,11 -0,17 0,30 0,09 -0,10 -0,10 -0,12 0,17 -0,11 0,02 -0,07 0,26 0,04 -0,21 -0,05 0,08 0,15 0,10 -0,21 0,22 -0,19 0,08 0,24 P1- %r.F.- mw -0,16 -0,17 0,00 0,16 -0,08 -0,01 -0,16 0,07 0,16 0,04 0,18 0,08 -0,04 -0,16 -0,05 0,03 -0,13 -0,11 0,00 -0,09 0,19 -0,09 0,07 P1- %r.F. stdab 0,12 0,14 0,08 0,15 0,07 0,12 -0,05 -0,01 0,01 -0,09 0,15 0,05 0,07 0,04 0,20 0,27 0,12 0,14 -0,11 -0,05 0,04 0,16 -0,14 P1- %r.F.- min -0,09 -0,15 0,09 0,23 -0,31 -0,04 -0,23 0,14 0,07 0,07 -0,01 0,15 0,07 -0,15 -0,06 0,01 -0,11 -0,16 0,01 -0,05 0,19 -0,07 0,12 P1- %r.F. max -0,03 -0,07 0,09 0,26 -0,13 0,08 -0,20 0,04 0,14 0,02 0,22 0,11 0,02 -0,15 0,09 0,13 0,04 0,00 -0,05 -0,08 0,20 0,04 0,08 P2- %r.F.- mw -0,17 -0,29 -0,03 0,12 -0,05 -0,06 -0,15 0,08 0,07 0,17 0,26 0,16 -0,10 -0,21 -0,12 -0,09 -0,06 -0,14 0,05 -0,08 0,22 -0,04 0,20 P2- %r.F. stdab 0,19 -0,01 0,11 0,28 -0,21 -0,01 -0,29 0,22 -0,01 0,02 -0,01 0,03 0,24 0,22 0,24 0,13 0,00 -0,08 0,12 -0,05 0,35 -0,02 -0,29 P2- %r.F.- min -0,17 -0,19 -0,06 0,12 0,03 0,09 -0,11 -0,12 0,17 0,11 0,29 0,15 -0,16 -0,34 -0,12 -0,09 0,01 -0,02 -0,06 -0,07 -0,03 0,06 0,41 P2- %r.F. max -0,04 -0,22 0,03 0,22 -0,12 0,03 -0,21 0,07 0,13 0,11 0,24 0,16 0,00 -0,16 0,02 0,01 0,02 -0,10 0,01 -0,05 0,27 -0,01 0,14 P3- %r.F.- mw -0,13 -0,12 -0,01 0,23 -0,01 0,04 -0,27 0,01 0,20 0,06 0,24 0,01 0,06 -0,14 0,02 -0,03 -0,07 -0,11 0,11 -0,06 0,14 -0,01 0,13 P3- %r.F. stdab 0,26 0,27 0,07 0,38 -0,21 -0,03 -0,35 0,22 -0,22 -0,02 -0,23 0,03 0,30 0,31 0,33 0,34 0,01 0,03 -0,07 -0,03 0,05 0,08 -0,20 P3- %r.F.- min -0,28 -0,22 -0,07 -0,03 0,12 0,04 -0,02 -0,10 0,34 0,07 0,29 -0,12 -0,13 -0,23 -0,16 -0,29 -0,15 -0,15 0,15 -0,03 0,04 -0,08 0,23 P3- %r.F. max -0,06 -0,04 0,06 0,27 -0,09 -0,04 -0,30 0,15 0,13 0,06 0,16 -0,04 0,12 0,01 0,13 0,03 -0,09 -0,12 0,05 -0,03 0,14 0,01 0,02 P1 - Trocknungszeit 0,02 0,03 -0,19 -0,28 0,14 -0,22 0,24 0,13 -0,10 0,17 0,17 -0,11 -0,16 -0,17 -0,07 -0,07 -0,21 -0,23 0,14 -0,16 0,33 -0,19 -0,26 P2 – Trocknungszeit 0,22 -0,10 0,07 0,07 -0,07 0,04 -0,15 -0,02 0,12 0,16 -0,24 -0,22 0,31 -0,15 0,14 0,08 0,64 -0,01 -0,28 0,61 -0,30 0,22 0,23 Luftdruck 0,39 0,34 0,10 0,39 -0,28 0,57 -0,47 -0,26 0,06 0,01 -0,06 0,26 0,33 -0,06 0,28 . 0,06 0,48 0,01 -0,25 -0,16 0,00 0,32 °C (außen) -0,05 0,25 -0,05 0,14 0,08 0,41 -0,02 -0,46 0,53 -0,43 0,06 -0,30 0,28 -0,10 0,18 -0,25 0,16 0,19 -0,12 0,03 -0,17 -0,04 0,34 r.F. % (außen) 0,09 0,02 -0,11 0,04 -0,11 -0,10 -0,04 0,22 -0,31 0,27 -0,05 0,23 -0,05 0,19 0,20 0,20 -0,14 -0,07 0,19 -0,05 0,13 0,11 -0,22 Tab 33. Korrelationen zwischen Klima-Bedingungen (im Labor und Außenklima) und Bildmerkmalen der Standardbilder (UHT-Milch und a.d.) SB-Methode: Charakterisierung – laborseitige Einflüsse - Trocknungszeiten 123 3.3.3. Faktor 3: Trocknungszeiten Frage: Was für einen Effekt hat es, wenn die Bilder nach der 1. oder 2. Phase für längere Zeit (mehrere Tage) trocknen? Versuchsaufbau: Von einer Rohmilch-Probe werden in der 1. Phase drei Bilder gleichzeitig angesetzt (21.11.08). Eines der Bilder wird wie üblich (Standard-Prozedere) fertiggestellt. Ein Bild wird nach der 1. Phase 2,5 Tage stehen gelassen, ein anderes nach der 2. Phase. Die jeweils andere Phase ist mit 3h Trocknungszeit „normal“. Die drei Bilder werden anschließend hinsichtlich der Bildmerkmale miteinander verglichen. Weil keine Doppel-Bilder erstellt wurden, kann keine Gruppierung vorgenommen werden. Die Bilder sind in SB-Abb-9- Trocknungszeit-Effekt dargestellt – das Bild mit „P1-lange“ ist ganz rechts abgebildet, leider mit Bildfehler. Ergebnis: Das Bild, das nach der 1. Phase lange trocknete, weist deutlich Steighemmung auf – dadurch kann kaum etwas über „besondere Merkmalsausprägungen“ gesagt werden. Die FZ-Merkmale ähneln jedoch denen vom „normalen“ Bild. Das Bild, das nach der 2. Phase lange trocknete, unterscheidet sich von dem „normalen“ Bild deutlich (s.u.). Die Bilder sind in SB-Abb-9-Trocknungszeit-Effekt wiedergegeben. „normales“ Bild „nach P2 lange getrocknet“ S=3 S-füllung dunkel-grün, farbkräftig, mit wenig dunkel-brauner Füllung GrS, schmaler weißer S-Rand. „Übergangsbereich“ unten hell, oben dunkler-grau (geht in grS über) Sockel gleichmäßig grau-braun, oben etwas braune Linie („Bart“), unten hell-rosa Streifen Fahnen lang, eher schmal, konturiert, F-ansätze oben und unten, vielfarbiger / grünlicher F- Hintergrund (über Schalenzone), deutliche Fahnenbein-Ausbildung S=2 S-füllung braun, farbkräftig Kein grS, eher grauer S-Rand, jedoch sehr häufig unterbrochen. Sehr breiter weißer S- rand. „Übergangsbereich“ weiß. Weißer Bereich zieht sich teilweise bis in den Sockel runter. Sockel dunkler-grau-lila-braun, oben keine braune Linie, dafür weißer Bereich (aus SZ). Unten dunkel-brauner Streifen. Fahnen „breit“, F-Ansätze sehr niedrig, F verwaschen, scheinbar kurz, ineinander übergehend. Nach unten hin klar konturierter F-Rand. F-Hintergrund einfarbig hell-braun. Keine ausgeprägten F-Beine. Tab 34. Merkmals-Veränderungen bei langer Trocknungszeit nach P2 SB-Methode: Charakterisierung – laborseitige Einflüsse - Trocknungszeiten 124 Diskussion: Dieses an nur drei Bildern dargestellte Ergebnis ist für sich alleine nicht fundiert genug, um es zu verallgemeinern. Wenn jedoch weitere Bilder aus ähnlichen Situationen vergleichbare Merkmals-Veränderungen aufweisen, können diese Bilder als „beispielhaft“ für dieses Phänomen bezeichnet werden. Es finden sich folgende weitere Tage, an denen die Bilder nach der 1. oder 2. Phase lange (12h und mehr) trockneten: Datum Trocknungszeit nach P1 Trocknungszeit nach P2 18.12.07 18.9.08 8.10.08 3h 12h 7.3.08 15h 3h 6.8.08 24h 3h 27.8.07 7 Tage 3,5h Die Bilder vom 18.12.07 z.B. (s.a. SB-Abb-15-Temperierung-Übersicht-071218) weisen ähnliche Merkmalsausprägungen auf wie die für die lange Trocknungszeit nach P2 in Tab 34 beschriebenen: Im H-Milch-Standard (vom 18.12.07) ist das Bild insgesamt mit relativ starken Kontrasten: heller Übergansbereich, dafür braun-farbkräftige Schalen, die aber wenig konturiert sind. Die Schalen bilden sich eher linienartig aus und sind dabei verwaschen, ohne grüne Füllung. Die Fahnen setzen weit unten an, haben einen konturierten Rand und sind eher flächig statt einzeln ausgebildet. Die Sockellinie oben ist hellbraun, wie „ausgeblichen“. Im Sockel entstehen körnig-flockige Bereiche. Bei Rohmilch- Bildern sind die Merkmale ähnlich verändert, jedoch fallen die Veränderungen bei geringen Konzentrationen (Schalenbildung) mehr auf, bei höheren Konzentrationen weniger, weil die g.B. davon nicht so stark betroffen sind. Die Bilder vom 27.8.07, bei denen erst am 3.9. P2 und P3 durchgeführt wurden (7 Tage Trocknungszeit nach P1), sind ebenfalls als „extreme“ Vertreter beispielhaft zum Vergleich verwendbar. Bei den H-Milch-Standard-Bildern ist kaum ein Unterschied zu den anderen Standard-Bildern zu bemerken (z.B. ähnlich den Bildern vom 8.8.07, die in beiden Trocknungszeiten 3h trockneten. Bei den Rohmilch-Bildern ist der Faktor „7 Tage trocknen nach P1“ ebenfalls nicht bemerkbar. In einzelnen Fällen treten etwas vermehrt Steighemmungen auf. Insofern könnte eine Parallele zu dem Ergebnis des Experimentes gesehen werden. Diese Steighemmungen können aber auch mit der Probe im Zusammenhang stehen, weil die Vergleichsbilder von verschiedenen Probenahme-Terminen stammen. Diese Befunde weisen darauf hin, dass die im Experiment festgestellten Bildveränderungen zumindest teilweise mit dem Faktor „lange Trocknungszeit“ zusammenhängen können. Bei der Ermittlung von Korrelationen zwischen Bildmerkmalen der Standard-Bilder und Faktoren während der Bildererstellung zeigte sich, dass bei langer Trocknungszeit nach P2 vermehrt ein weißer Bart auftritt. SB-Methode: Charakterisierung – laborseitige Einflüsse - Trocknungszeiten 125 Fazit: Nach der 1. Phase lange trocknen:  in dem einen Fall (21.11.08, experimentell aufgebaut) waren die nach 2,5 Tagen weiterentwickelten Bilder mit starken Steighemmungen nicht mehr auswertbar. In dem anderen Fall (27.8.07, Not-Lösung in der Praxis) waren nur sehr geringe Bildveränderungen zu vermerken (vereinzelt Steighemmungen), obwohl die Papiere 7 Tage trockneten.  Die Bilder der Proben (vom 27.8.07) können nach der ersten Phase wie „konserviert“ werden, und auch noch nach 7 Tagen weiterentwickelt werden, ohne nennenswerte Einbußen. Nach der 2. Phase lange trocknen:  in beiden betrachteten Fällen (21.11.08 und 18.12.07) ist eine längere Trocknungszeit nach der 2. Phase von 12h bzw. 2,5 Tagen im Bild deutlich sichtbar, und verändert die Bildmerkmale im Vergleich zu den „normal“ entwickelten Bildern deutlich. Die Bilder haben einen hellen bzw. keinen oberen Sockelrand, der Übergangsbereich ist sehr hell, „ausgelichtet“, und die Schalen sind eher braun, wenig konturiert / differenziert. Auch die Fahnen sind wenig konturiert, eher verwaschen-flächig, der untere Rand dafür scharf konturiert. SB-Methode: Charakterisierung – laborseitige Einflüsse - Probenvorbereitung 126 3.3.4. Faktor 4: Probenvorbereitung, Probenaufbereitung 3.3.4.1. Alterung der Vorverdünnung, Beginn der ersten Phase Problem: Die Vorverdünnung steht je nach Anzahl der Proben und der Pipettier-reihenfolge länger oder kürzer an der Luft / im Raum. Die Probenmenge ist bei großer Oberfläche relativ gering, so dass ein denkbar großer Austausch zwischen Luft und Lösung möglich ist. Normalerweise ist zwar die Milch „schwerer“ als das Wasser und befindet sich am Boden des Gefäßes, darüber das Wasser. Wenn jedoch die Lösung gerührt / geschwenkt wird, ist rasch ein gleichmäßiges Gemisch hergestellt – und von Milch an sich ist bekannt, dass Reaktion mit der Luft stattfinden (RADA-MENDOZA et al. 2002). Als Lösung wäre denkbar, die Vorverdünnung möglichst sofort in die Schälchen zu applizieren und die Papiere einzustellen. Dann kommt aber die Frage auf, ob sich die Bildmerkmale bei gleicher Ausgangsprobe auch vergleichbar ausbilden, unabhängig von dem Zeitpunkt des Beginns der ersten Phase (d.h. des Papier einstellens). Denn damit zusammenhängend würde sich die Trocknungszeit nach P1 entsprechend unterschiedlich gestalten, wenn die in der ersten Phase zeitversetzt aufgestellten Bilder dann gleichzeitig weiterentwickelt werden. Fragen: 1) Wie stark wirkt sich die Standzeit der angerührten Vorverdünnung auf die Merkmalsausprägung in den Bildern aus? 2) Wie gravierend ist im Vergleich dazu, wenn die Bilder zeitversetzt angesetzt werden / Papiere eingestellt werden? Versuchsaufbau 1: Von zwei einander relativ ähnlichen Proben (A=14.4.08 LW, B=15.4.08 LW, d.h. wiederholte Probennahme von einem Hof an zwei aufeinanderfolgenden Tagen) werden am 15.4.08 im Abstand von 30 min drei mal Vorverdünnungen angerührt, zum Rühren geschwenkt, und bis zu 1h stehen gelassen. So werden verschieden „alte“ Vorverdünnungen zeitgleich in die Kaelinschälchen appliziert und die Papiere eingestellt. Zusätzlich werden 1h später nochmals Proben angerührt und zeitversetzt zu der ersten Gruppe ohne längere Standzeiten appliziert und Papiere eingestellt. Der Rest der Prozedur wird bei allen Bildern gleich gehalten. SB-Methode: Charakterisierung – laborseitige Einflüsse - Probenvorbereitung 127 Folgende Varianten von Anrührzeitpunkt und Standzeiten werden untersucht: Gruppe 1 („gleichzeitig appliziert“, d.h. innerhalb von 10 min wird Variante 1 bis 5 und 8 und 9 pipettiert und Papiere eingestellt): Variante Nr. Anrührzeitpunkt Vorverdünnung Standzeit Vorverdünnung Pipettierzeitpunkt (Beginn P1) Proben- Qualtität Anzahl Bilder 1 a 1 b 12:30 5 min 12:35 A A 3 2 2 12:30 5 min 12:36 B 5 3 12:28 15 min 12:43 B 2 4 12:06 30 min 12:44 B 2 5 11:36 60 min 12:44 B 2 8 12:40 5 min 12:45 B 1 9 12:40 5 min 12:45 B 1 Gruppe 2 (später als Gruppe 1 appliziert): Variante Nr. Anrührzeitpunkt Vorverdünnung Standzeit Vorverdünnung Pipettierzeitpunkt (Beginn P1) Proben- Qualtität Anzahl Bilder 6 13:25 5 min 13:30 B 1+1 7 13:25 5 min 13:30 A 2 Es wurden insgesamt 22 Bilder erstellt (mit meistens 2 Bildern je Variante). Variante 6 wurde in zwei Verdünnungsstufen angefertigt. Diese Bilder werden nach den Bildmerkmalen gereiht bzw. gruppiert, in denen sich die Bilder besonders offensichtlich unterscheiden (v.a. Schalengröße, gB-Intensität). Ergebnisse: Die 22 Bilder lassen sich nach folgender Reihenfolge / Gruppierung sortieren: Gruppe A mit „gB=0“: Variante: 1b 7 1b 1b 1a 9 2 3 1a 2 4 2 2 Gruppe 0 1 2 3 4 Standzeit: 5 min 5 5 5 5 5 5 15 5 5 30 5 5 Probe: A A A A A B B B A B B B B Platz-Nr 5-5 6-3 5-4 4-3 4-2 6-8 5-3 5-6 4-1 5-2 4-7 4-5 4-4 Bild- Merkmale Srand gelöst, Ag zu hoch. S=4, kein grS S=3, grS S=3,5 S=4 S=3 gB=1 S=3 gB=1 S=3 gB=0,3 S=2 gB=0,5 S regelmäßig, „rund“ S unregelmäßig, „spitz“ Gruppe B mit „gB>0“ Variante 5 2 6 5 4 8 3 7 6 (0,1) Gruppe 5 6 7 Standzeit: 60 5 5 60 30 5 15 5 5 Probe: B B B B B B B A B Platz-Nr 4-8 5-1 6-1 5-8 5-7 6-7 4-6 6-6 6-2 Bild- Merkmal S=2 gB=0,7 S=3 gB=1 S=3,5 gB=1,5 S=3,5 gB=2 S=6 GB=2,5 S=5 gB=2,5 S=5 gB=4 S=5 gB=4 S=4,5 gB=6 S und g.B. „feiner, zarter“ S und g.B. größer, „gröber“ Tab 35. Ergebnis der Gruppierung / Reihung SB-Methode: Charakterisierung – laborseitige Einflüsse - Probenvorbereitung 128 In der Tab 35 der Gruppe A mit „gB=0“ sind links zwei Bilder, die nicht ganz in die Reihe passen (Gruppe 0). Dann kommen zwei einander recht ähnliche Gruppen (Variante 1b, 1a, 9, 2, 3 = Gruppe 1+2) mit Bildern ohne g.B. und eher kleinen S („schwache“ Bilder), gefolgt von einer weiteren, recht ähnlichen Gruppe (1a / 2, 4, 2, 2 = Gruppe 3+4). Anschließend ist (in Tabelle „gB>0“) die nächste Gruppe (mit fast nahtlosem Übergang) (5, 2, 6, 5 = Gruppe 5) zu platzieren, gefolgt von der Gruppe mit den meisten gB und größten S: 4, 8, 3, 7 = Gruppe 6. Variante 6 (0,1) hebt sich etwas von den anderen ab – und hat mit Abstand am meisten g.B. In einer etwas anderen Anordnung (gereiht nach Variante, Tab 36) und Reduktion der Angaben auf Gruppe und Variante, Standzeit und Probe wird der Zusammenhang zwischen Bild-Merkmal-Ausprägung und Standzeit bzw. Probenqualität noch deutlicher, und auch die Variation, die innerhalb einer Variante auftritt, wird offensichtlich: Variante: Standzeit: Probe: Gruppe Mittelwert der Bilder- Gruppen je Variante 1 5 A 0 1,4 1 5 A 1 1 5 A 1 1 5 A 2 1 5 A 3 2 5 B 2 3,8 2 5 B 4 2 5 B 4 2 5 B 4 2 5 B 5 3 15 B 2 4 3 15 B 6 4 30 B 4 5 4 30 B 6 5 60 B 5 5 5 60 B 5 6 5 B 5 3,8 7 5 A 0 7 5 A 6 8 5 B 6 9 5 B 2 6 (0,1) 5 B 7 Tab 36. Streuung der Bildmerkmale innerhalb der Varianten Korr. "Standzeit in Minuten. vs. S" Korr "Standzeit in Minuten. vs. gB" Korr. Standzeit in Minuten. vs. Bild-Gruppe -0,11435708 0,07726181 0,282784 Tab 37. Korrelation in Excel, Minuten Standzeit vs. S, g.B. Hier sind die Daten nach „Variante“ sortiert – und rechts daneben ist notiert, welcher Bonitur-Gruppe die Bilder zugeordnet wurden. Die Rangordnungs-Nummer der Bonitur- Gruppen je Variante wurden gemittelt („Mittelwert der Bildergruppen je Variante“). Diese SB-Methode: Charakterisierung – laborseitige Einflüsse - Probenvorbereitung 129 Werte entsprechen der g.B.-Intensität, welche bei der Gruppierung ausschlaggebend war. Daran, an den Einzelwerten sowie an der Tabelle mit den Bild-Merkmalen kann folgendes abgelesen werden: - Die Bilder der Probe A haben weniger g.B. als die Bilder der Probe B. - Die Proben mit langer Standzeit haben Bilder mit mehr g.B. als die mit kurzer Standzeit - Die später angesetzten Bilder mit kurzer Standzeit (Variante 6, 7, 8) haben ähnlich viele g.B. wie die früher angesetzten mit langer Standzeit. (Ausnahme: Variante 9). D.h. der Zeitpunkt des Applizierens / Papier Einstellens ist von Bedeutung. - Bilder gleicher Varianten sind oft in der gleichen / benachbarten Bonitur-Gruppe. - Ein „Standplatz“ oder „Reiheneffekt“ (Position im Labor, siehe auch Kapitel 3.3.2.1) ist zu beobachten (in 6 von 7 Fällen der Reihe 4 und 5): Bilder der Reihe 4 haben weniger gB und kleinere S als von Reihe 5 und Bilder von Platz 1 haben mehr g.B. als von den anderen Plätzen – dafür wurden die Bilder aus R4 und R5 nochmals zusätzlich beurteilt. Fazit: Der Zeitpunkt des Pipettierens ist von mindestens genau so großer Bedeutung für die Merkmalsausprägung wie die Standzeit der Vorverdünnung – beides führt zu einer Zunahme der gB.-Intensität. Auffällig und nicht direkt erklärbar ist die große Streuung bei den Bildern der Varianten 6 bis 9. Versuchsaufbau 2: Von zwei Proben (318 und 328 vom Fütterungssystemvergleich „Weizen vs. Futterrüben“) werden am 13.3.08 Bilder erstellt – zum einen von 2h gealterter Vorverdünnung, zum anderen von frisch angerührter Vorverdünnung: Die Vorverdünnungen wurden gleichzeitig in die Schälchen appliziert und Papiere eingestellt. In Reihe 4 standen die „frischen“ Bilder, in Reihe 5 die 2h gealterten. Dieser zweite Effekt muß bei der Auswertung berücksichtigt werden. Zur Auswertung werden die Bilder gruppiert und unterscheidende Merkmale erfaßt. Ergebnis: Die Bilder können in vier Gruppen zu je drei Bildern angeordnet werden, mit abnehmender g.B.-Intensität (siehe Tab 38). Diese Gruppierung entspricht den Probenqualitäten und Standzeit-Varianten. Probe Platz-Nr GB-Intenität Zusätzl. Merkmal 318 „2h“ 5-3, 5-1, 5-2 9 318 „0h“ 4-2, 4-1, 4-3 6 Viel grün, hell 328 „2h“ 5-7, 5-6, 5-5 5 328 „0h“ 4-8, 4-6, 4-7 2 Brauner, kompakter, dunkler (rötliche Linie) SB-Methode: Charakterisierung – laborseitige Einflüsse - Probenvorbereitung 130 Tab 38. Gruppierung der Bilder und Vermerk zu den unterscheidenden Merkmalen. Diskussion: Der Effekt der Alterung der Vorverdünnung ist gleichzeitig mit einem möglichen Reiheneffekt aufgetreten: die Bilder der gealterten Probe haben mehr g.B. als die frischen, gleichzeitig aber sind die gealterten aus Reihe 5, in der meistens auch mehr g.B. in den Bildern ausgebildet werden. Weil der hier aufgetretene Effekt (3 Bonitur-Klassen Unterschied) sehr stark ist, kann angenommen werden, dass sowohl der Reiheneffekt (Position im Labor) dazu beitrug, der in den Versuchen in Kapitel 3.3.2.1 dargestellt ist, als auch der Faktor der Alterung, der im vorangehend dargestellten Versuch zu dieser Thematik dargestellt wurde. Da beide Faktoren einen gleichgerichteten Effekt auf die Bildmerkmals- Ausprägung aufweisen, ist diese starke Ausprägung der g.B.-Intensität hier nachvollziehbar. Fazit: Die Bilder der gealterten Proben (aus Reihe 5) weisen deutlich mehr g.B. auf als die frisch angesetzten (Differenz je Probe: 3 Klassen), die Proben untereinander unterscheiden sich immer, gleichgültig ob frisch oder gealtert. Die Alterung der Vorverdünnung verschlechtert oder verbessert das Unterscheidungsvermögen der Methode nicht. Versuchsaufbau 3, Extremfall: Von zwei Proben (Hof 3 H / Eh) werden am 30.8.07 je zwei Vorverdünnungen erstellt und im Kühlschrank gelagert (8ml im offenen 50ml Becherglas). Am 3.9.07 (3 Tage später) werden von den Original-Proben (100ml in 100ml Glasflasche, unverdünnt, zugedeckelt, ebenfalls im Kühlschrank gelagert) frisch Vorverdünnugen angerührt und gleichzeitig mit den gealterten Vorverdünnungen Bilder erstellt. Es werden also folgende Varianten verglichen: a) 3 Tage als „Vorverdünnung“ im Kühlschrank gealtert, offen b) 3 Tage als Original-Probe gealtert, unverdünnt, zugedeckelt Die daraus erstellten acht Bilder (jede Variante je Probe in gedoppelter Vorverdünnung) werden gruppiert und die unterscheidenden Merkmale erfaßt. Ergebnisse: Die Bilder lassen sich in vier Gruppen aufteilen, die sich nach den in Tab 39 aufgeführten Merkmalen unterscheiden (s.a. SB-Abb-10-Alterung-Vorverdünnung). Variante Bildtyp: Probe 1 Probe 2 „frisch“ „normal“ S kompakter S heller, zarter „gealtert“ Sockel flach, Ag zu hoch gestiegen, F- Hintergrund braun, keine Fahnen S kompakter, dunkler, konturierter S „weicher“, verwaschener, heller Tab 39. Unterscheidende Merkmale bei zwei Proben in gealterter und frischer Vorverdünnung SB-Methode: Charakterisierung – laborseitige Einflüsse - Probenvorbereitung 131 Verbleibt die angerührte Vorverdünnung drei Tage (offen, ohne Deckel) im Kühlschrank, so entstehen Bilder, die kaum noch als „Milchtypisch“ anzusprechen sind: der Sockel wird flacher, der Bildhintergrund sehr dunkel, es entstehen kaum Fahnen, und auch der Schalenbereich ist sehr verwaschen. Weil das Silbernitrat viel höher gestiegen ist als gewünscht (wg. flachem Sockel), ist der Vergleich nochmals erschwert. Bilder aus der (nun ebenfalls drei Tage gealterten, aber frisch angerührten) Original-Probe (verdeckelt, unverdünnt, im Kühlschrank gelagert) zeigen weiterhin milchtypische Bilder (die den frisch untersuchten Proben noch stark ähnlich sehen, abgesehen vom „normalen“ Alterungseffekt). Der Unterschied der Proben bleibt jedoch weiterhin erhalten. Die eine Probe weist kompaktere, dunklere, konturiertere S auf, die andere hellere, zartere, weichere, verwaschenere S. Fazit zum Faktor „Alterung der Vorverdünnung“: In den drei Versuchen zur Alterung der Vorverdünnung konnte gezeigt werden, dass die Alterung einen Einfluß auf die Bildmerkmals-Ausprägung hat. Die Bilder der gealterten Vorverdünnung können im Vergleich zu der Bildmerkmalsentwicklung bei der Konzentrationsreihe als „scheinbar konzentrierter“ bezeichnet werden, aufgrund der intensiveren g.B.-Ausbildung oder gar (Versuch 3) Steighemmungen und flachem Sockel (Merkmale von überkonzentrierter Probe). Auffälliger Weise bleibt der Proben-Unterschied trotz Alterung erhalten. Um diesen Faktor der Alterung der Vorverdünnung als Einflußfaktor beim Vergleich von mehreren Proben auszuschließen, können alle zu vergleichende Proben hintereinander angerührt werden, und anschließend in die Schälchen appliziert werden, so dass alle Proben vergleichsweise gleich lange angerührt altern. SB-Methode: Charakterisierung – laborseitige Einflüsse - Probenvorbereitung 132 3.3.4.2. Pipettierfehler Einfluß von Pipettierfehlern auf die Ausprägung der Bildmerkmale Problemstellung: Milch ist eine sehr viskose Flüssigkeit, die stark an der benetzten Oberfläche anhaftet. Somit bleibt ein Rest in der Pipettenspitze zurück (anders als bei Wasser, das vollständig abtropft). Dieser verbleibende Rest scheint probenspezifisch (Oberflächenspannung? Fettgehalt? molekulare Bindungen?) zu sein – auf jeden Fall ist nicht immer die selbe Restmenge in der Pipettenspitze. Weil die Milch einerseits in die Vorverdünnung pipettiert wird (Pipette statt Dispensette /Verdrängersystem aufgrund der einfacheren Handhabung), und im zweiten Schritt verdünnt in die Kaelinschälchen, könnten sich unbeabsichtigte Fehler vervielfachen. Selbst mit der Absicht, alle Handgriffe immer gleich durchzuführen, kann der Fall eintreten, dass bei der einen Probe etwas mehr Zeit zum Nachlaufen besteht, und somit ein klein wenig mehr Milchlösung in die Kaelinschale gelangt als bei der anderen Probe. Um diese Fehlerquelle objektiv fassen zu können werden gezielt leicht variierte Pipettier-Verfahren angewendet und miteinander verglichen. Weil die Viskosität (und Volumen) auch temperatur-abhängig ist, soll dieser Aspekt mit berücksichtigt werden. Frage: 1) Wie stark wirken sich Pipettierfehler (Abtropfzeiten) auf die Bildausprägung aus? 2) Ist ein Einfluß der Temperatur der Probe beim Pipettieren in die Vorverdünnung im Bild sichtbar? Versuchsaufbau: Zwei verschiedene Proben werden jeweils einmal auf 20°C erwärmt (35min bei Raumtemperatur stehen lassen) und einmal bei 6°C (direkt aus dem Kühlschrank) in die Vorverdünnung (1+3) pipettiert. Dabei wird entweder (A) die zügig entleerte Pipettenspitze (mit kleinem Milchrest) weggetan, oder (B) sie wird in die Vorverdünnung gestellt, kann noch etwas abtropfen und wird vor erneuter Verwendung (zum Applizieren DIESER Vorverdünnung in die Kaelinschale) mehrmals aufgezogen und entleert. Beim Pipettieren der Vorverdünnung in die Kaelinschälchen (0,3ml) wird wiederum jeweils auf zweierlei Weise verfahren: einerseits (f) wird eine frische, trockene Pipettenspitze verwendet, andererseits (g) kommt eine vorbenetzte, „gebrauchte“ Spitze zum Einsatz. Die Abtropfzeit nach Applizieren in die Kaelinschälchen wird möglichst gleich gehalten (Pipette leeren und Rest entleeren (bis zum 2. Druckpunkt) innerhalb von 1,3 sec, also „zügiges Arbeiten“). SB-Methode: Charakterisierung – laborseitige Einflüsse - Probenvorbereitung 133 Folgende Proben-Varianten werden untersucht: Probe 1 (Nr. 227): 19,6°C. / 8,0°C Probe 2 (Nr. 233): 19,2°C. / 8,2°C (Bei Bild 13 + 14 ist MEHR Rest in der Pipettenspitze als bei 11 + 12) Abb. 17: Grafische Darstellung des Versuchsaufbaus These: die Bilder der Varianten „B-g“ müssten etwas mehr Milch enthalten und entsprechend des Verdünnungsreiheneffektes mehr g.B. / größere S aufweisen, die Bilder der Variante „A- f“ müssten besonders wenig Milch enthalten und somit Bildern von stärker verdünnten Proben ähnlich sehen. Die anderen müssten dazwischen liegen. SB-Methode: Charakterisierung – laborseitige Einflüsse - Probenvorbereitung 134 Ergebnisse und Diskussion: Beim Reihen / Gruppieren der Bilder hinsichtlich mehrerer Bildmerkmale (auffällige, unterscheidende Merkmale aus Fahnen- und Schalenzone) entstand folgende „Ordnung“: S größer, unregelm. 12 18 + 24 22 + 20 + 19 S kleiner, regelm. 11 21 + 17 16 + 13 + 15 + 14 Abb. 18: Gruppierung der Bilder nach Bildmerkmalen, Bild-Nr. in rot Wird der Faktor „Pipettierfehler“ in dieser oben dargestellten Ordnung gesucht, so ist er nicht besonders auffällig, andere Faktoren bleiben bildbeeinflussend bestehen: - 3 Paare der je Variante doppelt erstellten Bilder (von insgesamt 8 Paaren) sind NICHT gemeinsam einer Gruppe zugeordnet. D.h. nur in 5 von 8 Fällen sind die doppelt erstellten Bilder einer Variante wirklich als „gleich“ beurteilt worden. Es muß weitere Faktoren geben, die zu einer Bildvariation führen, obwohl die Doppel fast zeitgleich erstellt wurden. - Verschiedene Pipettierverfahren (z.B. „f“ und „g“ derselben Ausgangsvariante) sind z.T. in EINER Gruppe zusammengefasst (Bild 16, 13, 15, 14 sowie 5, 6, 7 sowie 1, 1 + 2 F kurz, breit S unregelm., groß grS 4 F lang, schmal S unregelm., groß Kein grS 3 F kurz, breit S regelm grS 8 + 9 + 10 F lang, schmal S größer Kein grS 5 + 6 + 7 F kurz, breit S klein (regelm.) grS gB=0 23 „extra“ F sehr kurz, verwaschen F-Ansatz sehr hoch S groß gB=1 gB=4 gB>0 SB-Methode: Charakterisierung – laborseitige Einflüsse - Probenvorbereitung 135 2). D.h. es ist im Bild nicht zu unterscheiden, ob mit frischer (f) oder mit vorbenetzter (g) Pipettenspitze gearbeitet wurde (außer bei Bild 3 und 4). - Die Varianten „A“ und „B“ sowie „6°C“ und „20°C“ treten unregelmäßig, verteilt, ohne ersichtlichen Ordnungszusammenhang auf. D.h. der Einfluß auf die Bilder ist verhältnismäßig gering gegenüber anderen Faktoren. - Die beiden Ausgangs-Proben wurden mit 10 von 12 Bildern bzw. 12 von 14 Bildern voneinander unterschieden (Probe 1 mit gB=0, Probe 2 mit gB>0, außer Bild-Nr. 11 und 12 von Probe 1). D.h. das Unterscheidungsvermögen für diese beiden Proben bleibt erhalten, kann von verschiedenen Pipettierverfahren und Probentemperaturen nicht überlagert werden. (Es handelt sich um Probe Nr. 227=Weizen-Fütterung und 233=Futterrüben-Fütterung, Mischproben aus dem Fütterungssystemvergleich B „Weizen vs. Futterrüben“, 27.2.08, 2. PrN)). Werden die Bilder in ihrer logischen Ordnung (offen) zusammengelegt und nach unterscheidenden Merkmalen gesucht, so ergibt sich folgendes: 1 gB=0 2 gB=1 3 gB=0 FZ verw 4 gB=0 5 + 6 gB=0 7 + 8 gB=0 9 + 10 gB=0 11 + 12 gB=1 21 gB=2 22 gB=3 23 gB=1 FZ verw 24 gB=1 13 + 14 gB=3,5 S=3,5 15 + 16 gB=3,5 S=3,5 17 + 18 gB=1 S=4 19 + 20 gB=4 S=4 Abb. 19: Gruppierung der Bilder nach Versuchsvarianten und Ermittlung von Bildmerkmalen – Bild-Nr. in rot, Besonderheiten farbig hinterlegt - Es ist auffällig, dass sich die Bilder 11 und 12 sowie 19 und 20 von den Bildern der anderen Varianten gleicher Ausgangs-Temperatur (6°C) dadurch unterscheiden, dass sie mehr gB aufweisen – was mit der Pipettiervariante übereinstimmt, da hier („B-g“) vermutlich die meiste Milch in den Bildern sein müsste, und die Bilder wie „konzentriertere“ Bilder aussehen müssten – und tatsächlich aussehen. Bei den Bildern der 20°C-Variante findet sich dieser Effekt jedoch nicht. - Die Bilder, die vermutlich am wenigsten Milch haben müssten („A-f“) sind nicht offensichtlich von den „mittleren“ Varianten zu unterscheiden. - Bei den Bildern der 20°C-Variante sind die Varianten „A-g“ jeweils (je Probe) die scheinbar am konzentriertesten – was der Realität eher wiederspricht, da hier die 1. Spitze („A“) mit einem Milchrest weggeschmissen wurde, jedoch die 2. Spitze „g“ SB-Methode: Charakterisierung – laborseitige Einflüsse - Probenvorbereitung 136 vorbenetzt genutzt wurde. Hier scheint der 2. Schritt (in die Kaelinschalen) von größerem Einfluß zu sein. Es läßt sich aber nicht nachvollziehen, warum das so ist. - Bei den Bildern der 20°C-Variante sind die Varianten „B-f“ je Probe im Vergleich zu allen anderen Bildern auffällig hinsichtlich des Merkmals „verwaschene Fahnenzone (FZ verw)“. Auch dieses läßt sich nicht erklären. Im Vergleich zu der codiert erstellten „Ordnung aus den Bildmerkmalen heraus“ wird deutlich, dass sich auch dort die Bilder 11 + 12 sowie 19 + 20 von den anderen Bildern derselben Probe deutlich abheben – als die jeweils „scheinbar konzentriertesten“. Fazit: Der Pipettier-Effekt (unterschiedliche Abtropf-Varianten von der Pipettenspitze) ist relativ gering, eine „doppelte Überkonzentration“ (Variante „B-g“) hebt sich von den anderen Varianten bei 6°C-Proben ab. Die Probenqualität an sich ist jedoch innerhalb jeder Pipettiervariante sehr deutlich, und auch die Probentemperatur („Aufwärmeffekt“) ist nicht wahrzunehmen / zu vernachlässigen. D.h. das Verfahren ist relativ robust gegenüber leichten „Pipettier-Fehlern“ und an der Luft mehr oder weniger erwärmten Proben. SB-Methode: Charakterisierung – laborseitige Einflüsse - Probenvorbereitung 137 Versuch 2: Die Wiederholung des Experimentes am 4.3.09 mit einer Probe und vier Pipettier- Varianten (je Variante 2 Bilder) ergab ein ähnliches Bild. Pipettier-Varianten (0,3ml in die Kaelinschale): a) frische, leere Spitze, OHNE den Rest (bis zum 2. Druckpunkt) auszublasen b) vorbenetzte Spitze, MIT GESAMTEN Rest (4 sec. Nachlaufen lassen – ausblasen) c) „normal“, d.h. vorbenetzte Spitze, leeren bis zum 2. Druckpunkt innerhalb von 1,3 sec d) =b) Die Bilder wurden in der Reihenfolge a), b), c), d) erstellt. Ergebnisse: Ergebnis der Reihung der Bilder: Variante a, b, a b, c D d, c Platz-Nr 5-2, 5-3, 5-1 5-4, 5-5 5-8 5-7, 5-6 Bild-Merkmal gB=7 gB=5 gB=1 gB=4, braun statt grün Tab 40. Gruppierung / Reihung der Bilder, und Bildmerkmale Diskussion: Aus der Gruppierung / Reihung wird ersichtlich, dass sich der Pipettier-Effekt weniger zeigt, und die Pipettier-Reihenfolge von größerer Bedeutung zu sein scheint (Variante a und b auf der einen Seite mit etwas mehr g.B., Variante c und d auf der anderen Seite mit weniger / brauneren g.B.). Und selbst die eigentlich „gleichen“ Pipettiervarianten b und d unterscheiden sich sichtlich. Die Ursache könnte in der vorverdünnten Probe liegen (von Variante a zu Variante d „gealtert“, gerührt, Luftkontakt...), oder an dem etwas anderen Zeitpunkt, zu dem die Papiere in die (jeweils direkt davor befüllten) Schälchen gestellt wurden (alle Bilder wurden innerhalb weniger als 2 min angesetzt). Der Zeitpunkt des Pipettierens ist in dem Versuch 1 untersucht und festgestellt worden – dass jedoch zwei Minuten einen solchen Effekt haben sollen, ist nicht sehr wahrscheinlich. Der Faktor „Rühren“ (wiederholtes Pipettieren aus der Vorverdünnung b) für Variante d)) erscheint theoretisch von größerer Bedeutung. SB-Methode: Charakterisierung – laborseitige Einflüsse – Steighöhe in 2. Phase 138 3.3.5. Faktor 5: Steighöhe in 2. Phase Problem: Zalecka (2006) hat beim Erstellen der Bilder in der zweiten Phase (Silbernitrat) die Deckelgläser abgenommen, als die Lösung geradeeben (1mm) überall die 1. Steiglinie überstiegen hat. Üblicherweise (Balzer-Graf, Dorn, Geier, Fritz) wird jedoch das Becherglas abgenommen, wenn die Silbernitratlösung 1cm über die 1. Steiglinie gestiegen ist. Frage: 1) Wie stark wirkt sich der Zeitpunkt des Abnehmens des Deckelglases auf die Merkmalsausprägung des Bildes aus? 2) Ist das kleinräumige Klima (kaltes Deckelglas) oder der Faktor Steighöhe von größerer Bedeutung für die Merkmalsausbildung? Versuchsaufbau: Probe: H-Milch (Standard) Varianten: bei 2mm / 1cm (Silbernitrat über 1. Steiglinie) Deckelglas abnehmen (9.2.08) In Reihe 4 und 5 (und 2) werden Bilder erstellt. In Reihe 4 wird abwechselnd bei 1cm und 2mm das Deckelglas abgenommen (insgesamt 9 Bilder bei 4 Varianten). Die Bilder werden nach ihren Bildmerkmalen gruppiert und diese notiert. Ergebnis: F lang F kurz F konturiert S groß v*-4 v-2 *v=R4 F lang, konturiert S „groß“ (=1,7) 5-1 5-3 5-5 F mittellang F konturiert S „groß“ (=1,5) (Srand gelöst) F verwaschen S klein 2-11 F lang – mittellang, verwaschen S „klein“ (=1) v-1 v-3 v-5 F kurz, verwaschen S „klein“ (=1,2) Die Unterschiede zwischen den Varianten sind gering, jedoch wahrnehmbar – und die Bilder ließen sich codiert / ohne Berücksichtigung der Variante in diese „Ordnung“ bringen (siehe auch SB-Abb-11-Ag-Steighöhe). Dies entspricht genau den experimentellen Varianten: F lang F kurz F konturiert S groß „2mm“, R4 „1cm“, R5 F verwaschen S klein „1cm“, R2 „1cm“, R4 SB-Methode: Charakterisierung – laborseitige Einflüsse – Steighöhe in 2. Phase 139 Fazit: Zur Frage „Standplatz-Effekt“ - Die Bilder aus Reihe 4 sind von Bildern aus Reihe 5 unterscheidbar (R4 kleinere S, R5 größere S. Siehe auch Kapitel – Vorverdünnung altert) - Die Bilder aus R5 sind von der Merkmalsausprägung zwischen den Extremen (2mm, R4 vs. 1cm, R4) anzusiedeln. - Das eine auf dem „großen Tisch“ erstellte Bild (2-11) weist wie die 2mm-Bilder lange Fahnen auf, die jedoch verwaschen sind wie die 1cm-Bilder aus R4. D.h. der Standplatz / das damit verbundene Klima hat einen ähnlich starken Effekt auf die Merkmalsausprägung wie die Steighöhe der zweiten Phase. Zu Frage 1) Zeitpunkt des Aufdeckelns (Steighöhe) - Die „2mm“-Bilder unterscheiden sich von den „1cm“-Bildern bei vergleichbaren Umständen (innerhalb der R4) hinsichtlich der Fahnenlänge und Fahnenkontur deutlich (blau hinterlegt). - Der Zeitpunkt des Aufdeckelns hat einen stärkeren Einfluß auf das Bild als der Reiheneffenkt (R4 vs. R5): die Bilder der Reihe 4 sind mit denen von Reihe 5 hinsichtlich der Fahnenlänge (beide kurze / mittellange Fahnen) vergleichbar und heben sich dadurch davon den früher (2mm) aufgedeckelten Bildern mit langen Fahnen deutlich ab. Zu Frage 2): „warme – kalte Deckelgläser“ Bilder 5-3 (V-7) und 5-5 (V-8) sind mit „kalten“ Deckelgläsern (von unten) zugedeckelt worden, Bild 5-1 mit „warmem“ (von oben) – die Bilder mit „kalten“ Deckelgläsern sind langsamer gestiegen (2min länger / später aufgedeckelt) als das mit „warmem“, jedoch lassen sich keine unterschiedlichen Merkmalsausprägungen feststellen – die Reiheneffekte und Aufdeckel-Effekte sind deutlich größer. Vergleiche hierzu auch Kapitel 3.3.2.1 – Klima örtlich variiert (Deckelgläser) SB-Methode: Charakterisierung – laborseitige Einflüsse – Alterung der Fe-Lösung 140 3.3.6. Faktor 6: Alterung der Eisensulfat-Lösung Problem: Die Eisensulfat-Lösung (Fe-Lösung) verfärbt sich im Laufe der Zeit: es entstehen hell- braune Ausflockungen, die als Bodensatz auftreten, der sich aber aufschütteln läßt, so dass die Flüssigkeit gleichmäßig hell-braun-gelb gefärbt erscheint. Schon nach eine Woche ist die geschüttelte Flüssigkeit somit leicht hell-braun, nach zwei Wochen noch intensiver. Parallel ändert sich der pH-Wert der Lösung. Frage: 1) Wie stark wirkt sich eine gealterte Eisensulfat-Lösung auf die Merkmalsausprägung der Bilder aus? 2) Ist die Unterscheidbarkeit der Bilder bei gealterter Eisensulfat-Lösung beeinträchtigt? Versuchsaufbau Variante 1): (25.3.09) Es wird in der dritten Phase zu je zwei Bildern von zwei Proben (A und B; Mischproben aus dem Fütterungssystemvergleich Wiesenheu vs. Silage, 3 Tage gealtert, als Doppelproben gelagert und angerührt) jeweils a) 5 Stunden alte b) 5 Tage alte c) 1,5 Monate alte Eisensulfat-Lösung verwendet. Die Bilder werden nach den Bildmerkmalen gruppiert. Alter der Lösung pH-Wert Aussehen Frisch (5 Stunden alt) 4,20 Klar 5 Tage alt 3,72 Zart hell-gelb / braun, leicht trüb 1,5 Monate alt (vom 30.1.) 3,26 Deutlich hell-braun-gelb, deutlich trüb a.d. (Ausgangsmaterial zu „frisch“) Ca. 6,30 Klar. Der pH-Wert war stark schwankend, zwischen 7,3 und 5,2, und pendelte sich bei 6,3 als „Mittelmaß“ ein. Tab 41. PH-Wert der Eisensulfat-Lösungen Ergebnis: 3-7, 3-5 gB=6 3-8, 3-6 gB=5 gB heller 3-9, 3-11 gB=6 3-10, 3-12 gB=4 Graue Sockel- Bande 2-1, 2-3 gB=7 3-15, 3-13 gB=6 2-2, 2-4 gB=5 3-14, 3-16 gB=4 Weiße breite Sockelbande gB dunkler, farbintensiver Tab 42. Gruppierung der Bilder nach Bildmerkmalen Die Bilder lassen sich anhand ihrer gB-Intensität reihen bzw. gruppieren (Spalten), jedoch gibt es weitere (Sockel-)Merkmale, die zu Unter-Gruppierungen führen (die drei SB-Methode: Charakterisierung – laborseitige Einflüsse – Alterung der Fe-Lösung 141 Zeilen). (S.a. SB-Abb-12a-Fe-Alterung.) Im Abgleich mit den Eisensulfat-Varianten zeigt sich an dieser Gruppierung folgendes: in der oberen Zeile sind die mit frischem Fe angefertigten Bilder, in der zweiten Reihe die mit 5 Tage altem Fe, und in der dritten Reihe die mit 1,5 Monate altem Fe. Eisen- und Proben-Varianten: a), A a), B gB heller b), A b), B Graue schmale Sockel- Bande c), A c), A c), B c), B Weiße breite Sockelbande gB dunkler, farbintensiver Tab 43. Zusammenstellung der Gruppierung mit der Versuchsvariante Es läßt sich folgendes daraus ablesen: 1) Die Alterung der Eisensulfat-Lösung ist in den Steigbildern zu erkennen – schon bei 5 Tage gealterter Lösung zeigen sich leichte Veränderungen im Bild gegenüber frisch angerührtem Fe, v.a. in Sockel-Merkmalen. Eine gravierende Bildveränderung tritt bei 1,5 Monate altem Fe auf (breite weiße Bande im Sockel unten). Die SZ-Merkmale sind nur geringfügig betroffen, die F sind bei der „alten“ Variante schmaler und heller als bei den anderen Varianten. 2) Die Probenunterschiede sind unabhängig vom Alter der Eisensulfat-Lösung konstant festzustellen, bei der ganz frischen Fe-Lösung sind die Probenunterschiede geringer als bei gealtertem Fe. Bilder, die in einer anderen Reihe (R2 statt R3) angefertigt wurden, weisen vergleichbare Unterschiede auf, jedoch ist die gB-Intensität bei R2 um eine Boniturnote größer als bei R3 (siehe auch Kapitel „Reiheneffekt“). SB-Methode: Charakterisierung – laborseitige Einflüsse – Alterung der Fe-Lösung 142 Versuchsaufbau Variante 2): (23.3.09) Es wird in der dritten Phase zu je zwei Bildern von zwei Proben (A und B; Mischproben aus dem Fütterungssystemvergleich Wiesenheu vs. Silage, als Doppelproben angerührt, also aus 4 Probenflaschen) jeweils a) 3 Tage alte, b) 3 Wochen alte und c) 1,5 Monate alte Eisensulfat-Lösung verwendet. Die Bilder werden nach den Bildmerkmalen gruppiert. Alter der Lösung pH-Wert Aussehen Frisch (2 Tage alt) 3,7 Klar 1 Woche alt 3,4 Zart hell-gelb / braun, leicht trüb 1,5 Monate alt 3,2 Deutlich hell-braun-gelb, deutlich trüb a.d. (Ausgangsmaterial zu „frische“) 5,5 Klar Tab 44. PH-Wert der Eisensulfat-Lösungen: Ergebnis: 5-1, 5-2 gB=1 5-4, 5-3 gB=5,5 gB breit, dunkler Keine weiße Sockellinie, Srand breit 6-1, 6-2 gB=2,3 6-4, 6-3 gB=6 gB schmal, heller schmalere helle Sockellinie, oberer Rand konturiert 6-5, 6-6 gB=4 farb- intensiv 6-8, 6-7 gB=6, farb- intensiv gB farbintensiv breitere helle Sockellinie, oberer Rand verlaufend / ausflockend Breite weiße Sockellinie, Srand schmal Tab 45. Gruppierung der Bilder nach Bildmerkmalen Es ergeben sich im groben vier Gruppen, die von links nach rechst in steigender gB- Intensität gereiht werden können, und von oben nach unten mit keinem / schmalem bzw. breitem weißen Streifen im Sockel. In der unteren Doppelgruppe treten zwei Subgruppen auf: einerseits mit schmaleren, hellen gB, andererseits mit farbintensiveren / dunkleren gB. Die Fahnenzonen der Bilder sind sich relativ ähnlich. Im Abgleich mit den Eisensulfat-Varianten zeigt sich: a), A a), B b), A b), B c), A c), B SB-Methode: Charakterisierung – laborseitige Einflüsse – Alterung der Fe-Lösung 143 Aus dem kann folgendes abgelesen werden: 1) Die Proben lassen sich unterscheiden, unabhängig vom Alter des Eisensulfats 2) Die Bilder, von denen ich den größten Unterschied erwartet habe, zeigen in am deutlichsten. (5-1, -2, -3, -4, frisches Fe) 3) Die Unterschiede zwischen den Proben nehmen bei dem stark gealterten Eisensulfat ab 4) Die Bilder von den beiden gealterten Fe-Varianten b) und c) haben eine breite, weiße Bande / Linie im unteren Sockelbereich, die bei den Bildern mit frischem Fe nicht auftreten. ABER: die Bilder von frischen Fe sind aus Reihe 5, die anderen aus R6, es könnte ein Reiheneffekt sein.) 5) Es könnte ein Reiheneffekt zwischen R5 und R6 vorliegen: die Bilder in R6 (mit altem Fe) haben eine deutliche weiße Sockellinie und einen breiteren S-rand als die von R5 (mit frischem Fe). Um diese zwei Effekte zu trennen muß der Versuch wiederholt werden. (siehe oben, Versuch 1), oder aufgrund bekannter Reiheneffekt-Merkmale kann sicher davon ausgegangen werden, dass sich Reiheneffekte auf anderer Weise äußern. SB-Methode: Charakterisierung – laborseitige Einflüsse – Alterung der Fe-Lösung 144 Versuchsaufbau Variante 3): (1.10.08) Es wird in der dritten Phase zu je zwei Bildern einer Probe jeweils frische, 1 Woche alte und 2 Wochen alte Eisensulfat-Lösung verwendet. Die Bilder werden nach den Bildmerkmalen gruppiert. pH-Wert der Eisensulfat-Lösungen: Alter der Lösung pH-Wert Aussehen Frisch (2 Tage) 3,80 Klar 1 Woche alt 3,67 Zart hell-gelb / braun, leicht trüb 2 Wochen alt 3,45 Deutlich hell-braun-gelb, deutlich trüb a.d. (Ausgangsmaterial zu „frische“) 5,00 Klar Tab 46. pH-Wert der Eisensulfat-Lösungen: Ergebnisse: Bild-Nr 3-1, 3-2 1-2, 2-2 1-1, 2-1 Bildmerkmale S=3 gB schmal, hell S=4,5 gB breit, “dunkel” (farbintensiv) S=6 gB besonders breit, Steighemmung. Alter der Fe-Lösung 2 T, 2 T 1 Wo, 2 Wo 2 Wo, 1 Wo Tab 47. Gruppierung der Bilder nach Bildmerkmalen (T = Tage, Wo=Woche, Fe=Eisen) Die Bilder lassen sich aufgrund der Breite der g.B. bzw. aufgrund von „Steighemmungen“ deutlich in drei Gruppen aufteilen (siehe Tabelle). Im Zusammenhang mit dem Alter der Eisensulfat-Lösung wird deutlich, dass die Bilder der „frischen“ Lösung die schmaleren gB aufweisen, die Bilder der „alten“ Eisensulfat- Lösung die breiten gB. Die Bilder der „alten“ Lösung konnten untereinander nicht unterschieden werden. Werden weitere mögliche Faktoren zur Erklärung der Gruppierung gesucht, so wird der Standplatzeffekt sichtbar: Reihe 3 (mit „frischer“ Lösung) hat die Bilder mit schmaleren gB, Platz 1 in R1 und R2 hat Steighemmungen, und Platz 2 der Reihen R1 und R2 hat keine Steighemmung, ist aber vom Charakter den Platz 1-Bildern ähnlich. Daraus muß geschlossen werden, dass auch der Standplatz der ausschlaggebende Faktor für die Bildmerkmals-Ausprägung sein könnte. Für eine sichere Aussage muß das Experiment unter Ausschluß von Standplatzeffekten / mit mehr Bildern wiederholt werden. SB-Methode: Charakterisierung – laborseitige Einflüsse – Alterung der Fe-Lösung 145 Versuchsaufbau Variante 4: (9.4.08) Bei drei Bildern einer Probe wurde eines mit frisch angerührtem Fe, die anderen beiden mit altem Fe in der 3. Phase entwickelt. Die Bilder standen zwischen anderen Bildern, direkt nebeneinander, das mittlere mit frischem Fe, so dass Standplatz- Effekte ausgeschlossen sind. Die Bilder unterscheiden sich in folgenden Merkmalen: Altes Fe (1-13, 1-15) Frisches Fe (1-14) FZ Über den Fahnen keine gelben senkrechten Schleier F kürzer, verwaschener F-Ansätze höher Grauer Kranz unter den Fahnen Über den Fahnen gelbe senkrechte Schleier F länger, konturierter F-Ansätze niedriger Kein grauer Kranz unter den Fahnen SZ Braune Schalenfüllung dunkler, „härter“ Helle Linie im Schalenrand breiter Srand schmal, körnig, konturiert Braune Schalenfüllung heller, „weicher“ Helle Linie im Schalenrand schmaler Srand breit Basis Kein „Bart“ Deutlicher weißer Streifen unten Leicht „Bart“-Bildung (dunkler Streifen) Kein weißer Streifen unten Charakter: „schwer, träge“, „belastet“, „dunkler“ „neutral, tat-bereit“, „Form- freudig, Form-fähig“, „lichter“ Tab 48. Unterscheidende Bildmerkmale je Variante Der weiße Streifen im Sockel war beim alten Fe auch schon bei den anderen drei Varianten aufgefallen. Zumindest das Sockel-Merkmal kann für die Fe-Alterung bestätigt werden, die anderen Merkmale können, müssen aber nicht mit der Fe-Alterung im Zusammenhang stehen. Fazit aus den vier Varianten: - Die Bilder ändern sich bei alternder Eisensulfat-Lösung dahingehend, dass bei stark gealtertem Eisensulfat (1,5 Monate) ein breites weißes Band im unteren Sockelbereich entsteht, bei leicht gealtertem Eisensulfat (5 bis 14 Tage) ist es ein schmaleres, graues Band. Außerdem werden die gB ein wenig dunkler / farbintensiver bei gealterter Eisensulfat-Lösung. (mit zunehmendem Alter sinkt der pH-Wert der Fe-Lösung). - Die Unterscheidbarkeit der Proben ist durch die Alterung der Fe-Lösung in dem einen Fall positiv, in dem anderen negativ beeinflusst – insofern muß von einem „zufälligen“ Effekt gesprochen werden. Das Alter der Fe-Lösung hat keinen nennenswerten Effekt auf die Unterscheidbarkeit der Proben. - Es treten deutliche Reihen- / Standplatz-Effekte auf, die sich jedoch in anderen Merkmalen äußern als die gealterte Fe-Lösung (siehe Kapitel 3.3.2.1 Reiheneffekte) Bemerkung: Das Merkmal des „hellen Streifens“ am unteren Sockelrand tritt z.T. auch probenspezifisch auf: z.B. bei den Proben von Hof 9 (25.6.08, 3. PrN). SB-Methode: Charakterisierung – laborseitige Einflüsse – Alterung der Ag-Lösung 146 3.3.7. Faktor 7: Alterung der Silbernitrat-Lösung Problem: Die Silbernitrat-Lösung könnte genauso wie die Eisensulfat-Lösung einem Alterungsprozeß unterliegen, obwohl dieser sich nicht in einer farblichen Veränderung zeigt. Sollte in den Bildern tatsächlich kein Alterungseffekt ersichtlich sein, kann die Ag-Lösung problemlos längere Zeit gelagert werden und muß nicht immer frisch angerührt werden. Fragen: 1) Werden Bildmerkmale durch gealterte Ag-Lösung sichtbar verändert im Vergleich zu frischer Ag-Lösung? 2) Ist die Unterscheidbarkeit der Bilder verändert durch gealterte Ag-Lösung? Versuchsaufbau (Variante 1): Es wird (23.3.09) in der zweiten Phase zu je zwei Bildern von zwei Proben (Probe A und Probe B; Mischproben aus dem Fütterungssystemvergleich Wiesenheu vs. Silage, als Doppelproben angerührt) jeweils a) 3 Wochen alte b) 2,5 Monate alte Silbernitrat-Lösung verwendet. Die Bilder werden nach den Bildmerkmalen gruppiert. Ag-Lösung PH- Wert Ausgangs- Wasser PH- Wert a) Silbernitratlösung „frisch“ (3Wochen alt) 5,9 a.d. (Laborleitung) 5,9 b) Silbernitratlösung „alt“ (2,5 Monate alt) 5,70 a.d. (MilliQ) 5,57 Tab 49. pH-Wert der Ag-Lösung Problem: die Lösungen wurden mit verschiedenem a.d. (als Ausgangsmaterial) angerührt, was ein weitere (unbeabsichtigter) Faktor ist. SB-Methode: Charakterisierung – laborseitige Einflüsse – Alterung der Ag-Lösung 147 Ergebnisse: 5-5, 5-6 gB=2 S=2,5 5-8, 5-7 gB=3,5 S=3,5 SZ dunkler, S größer, verwaschener, mehr g.B. FZ mehr grauer F-Bereich. F breiter, weniger kontur. 5-1, 5-2 gB=1,5 S=2 5-4, 5-3 gB=5,5 S=3,5 SZ heller, S kleiner, konturierter, weniger g.B. FZ mehr gelbe Streifen zwischen grauen F- F schmaler, konturierter. Die Bilder lassen sich anhand der gB-Intensität reihen, und zusätzlich aufgrund der „dunkleren“ SZ (=Schalenzone) in zwei Gruppen aufteilen (s.a. SB-Abb-12b-Ag-Alterung). Dies entspricht den Variaten: die obere Reihe ist von älterem Ag, die untere vom frischeren. b)A b)B SZ dunkler FZ mehr grauer F-Bereich a)A a)B SZ heller FZ mehr gelbe Streifen zwischen grauen F Tab 50. Zusammenstellung der Gruppierung mit der Versuchsvariante In der Fahnenzone finden sich weiter Merkmale, mit denen sich die Varianten deutlich unterscheiden lassen: a)A: Fahnen oben mit gelben Bereichen (etwas) b)A: Fahnen zusammenlaufend, eine „Masse“ bildend, etwas ungeordnet. b)B: Fahnen zusammenlaufend, aber eher gerade, geordnet. a)B: F sehr schmal, lang, oben viel gelber Bereich. Daraus folgt: 1) das Alter des Ag hat einen Einfluß auf die Bilder dahingend, dass bei älterer Lösung die SZ dunkler / farbintensiver wird, und die Fahnen zusammenlaufen / weniger geordnet verlaufen. 2) der Unterschied zwischen der beiden Proben wird bei älterer Ag-Lösung geringer. 3) Die Unterschiede können auch mit dem Ausgangs-a.d. zusammenhängen. (ältere Ag-Lösung mit MilliQ-Wasser, frische Ag-Lösung mit Laborleitungs-a.d.). SB-Methode: Charakterisierung – laborseitige Einflüsse – Alterung der Ag-Lösung 148 Versuchsaufbau Variante 2: Es wird (25.3.09) in der zweiten Phase zu je zwei Bildern von zwei Proben (A und B; Mischproben aus dem Fütterungssystemvergleich Wiesenheu vs. Silage, 4. PrN, 3 Tage gealtert, als Doppelproben gelagert und angerührt) jeweils unterschiedlich gealterte Silbernitrat-Lösung verwendet. Die Bilder werden nach den Bildmerkmalen gruppiert. pH-Wert a) 2 Stunden alt „frisch“ 4,80 b) 3 Wochen alt gealtert (mit Leitungs-a.d..), 5,90 c) 2,5 Monate alt stark gealtert 5,70 a.d. (Ausgangsmaterial für a) Ca. 6,3 (Messwert stark schwankend zwischen 7,3 und 5,2) Tab 51. PH-Wert der Ag-Lösung Ergebnisse: 2-11 2-5, 2-7, 2-9 2-6, 2-8, 2-10, 2-12, 2- 13, 2-15 2-14, 2-16 gB=7 GB=6 GB=5 GB=4 b)A a)A, a)A, b)A a)B, a)B, b)B, b)B, c)A, c)A c)B, c)B Tab 52. Zusammenstellung der Ergebnisse mit der Versuchsvariante Die Bilder unterscheiden sich hinsichtlich der gB-Intensität und lassen sich mit diesem Merkmal in obige Gruppen einsortieren. Ansonsten sind keine unterscheidenden Merkmale offensichtlich. Aus dem Abgleich mit den tatsächlichen Varianten wird deutlich: 1) Das Altern des Silbernitrates hat einen geringen Einfluß auf die Intensität der gB: bei der stark gealterten Ag-Lösung traten weniger gB auf als bei der frischen. 2) die Proben lassen sich unterscheiden, aber nur jede in ihrer „Ag-Variante“. 3) Die „3 Wochen“-Variante (ausnahmsweise mit a.d. aus der Labor-Leitung) zeigt in einem Fall etwas größere Probenunterschiede als die anderen Varianten. FAZIT aus den zwei Varianten: 1) das Alter des Ag zeigt einen geringen Einfluß auf die gB-Intensität, andere Merkmale sind kaum betroffen – zumindest nicht direkt an die Versuchsvariante gebunden (z.B. FZ mit mehr Fahnen, SZ dunkler). Die Bilder sind sich enorm ähnlich. 2) Die Proben lassen sich unabhängig vom Alter des Ag jeweils in ihrer „Ag-Variante“ voneinander unterscheiden. SB-Methode: Charakterisierung – laborseitige Einflüsse – Bildfehler 149 3.3.8. Ursachen von Bildfehlern „Papier steht schräg im Schälchen“ Versuch zu „Steighöhe in 2. Phase“: V-7 = 5-3: stand in der 2. Phase schräg in Schälchen: der linke Rand des fertigen Bildes lag direkt am inneren Zylinder des Schälchens an, der rechte Rand stieß an den äußeren Rand des Kaelinschälchens. „Papier oval“ Bilder vom H-Milch-Standard am 8.4.08 (SB-Abb-6) haben in der Mitte ein „Bild-Loch“ – das Papier war oval und konnte nicht gleichmäßig die Silbernitratlösung aufnehmen. „Silbernitratlösung nicht gleichmäßig im Schälchen verteilt“ Ergibt ähnliche Bilder wie bei oben genanntem Umstand. SB-Methode: Charakterisierung – laborseitige Einflüsse – Standardprobe 150 3.3.9. Verwendung einer Standard-Probe Um Schwankungen der Methode (laborprozeß-bedingt) festzustellen, wird bei allen Versuchen mindestens ein Standard-Bild angefertigt (UHT-Milch, 0,078ml / Bild), ergänzt durch mindestens ein Wasser-Bild (a.d. ohne Probenzusatz, als „Nullprobe“). Mit Hilfe dieser Standard-Bilder ist es möglich, zu beurteilen, ob Bilder verschiedener Versuchstage miteinander verglichen werden können (bei vergleichbaren Standard-Bildern), oder ob bei dem Vergleich von Bildern verschiedener Versuchstage eine „Anpassung“ der Bildmerkmals- Ausprägungen des einen Tages entsprechend der Veränderung der Standard-Bildmerkmals- Ausprägungen vorgenommen werden muß. Solange nicht alle das Ergebnis beeinflussenden Faktoren bekannt und kontrolliert werden können, ist ein solcher Standard notwendig. Es wurde neben der Wasser-Nullprobe ein UHT-Milch-Standard gewählt, weil diese Substanz den Milchprobenbildern charakterlich ähnliche Bildmerkmals-Ausprägungen ausbildet. Werden z.B. die Schalenformen im Standard größer oder kleiner, ist entprechende Veränderung auch bei den anderen (meist Rohmilch) -Bildern festzustellen. Bei Zalecka wurde eine 25%ige Zuckerlösung (Succhrose) als Standard verwendet – bei Weizen- und Möhren-Proben. V.a. Möhren-Bilder haben diesen Zucker-Bildern charakterlich ähnliche Bildmerkmals-Ausprägungen und Labor-Effekte können so relativ einfach entdeckt und übertragen werden. In anderen Laboratorien (GEIER, FRITZ) wird Honig als Standard verwendet. Im Zusammenhang der Ergebnisse zur Charakterisierung der Steigbildmethode wird auf die konkrete Streuung der Standard-Bilder (in Kapitel 3.3.2) eingegangen, und mögliche Einflußfaktoren gesucht. Als kurzes Fazit aus diesen Untersuchungen soll hier aufgeführt werden, dass es verschiedene Einflüsse auf die Bildveränderungen des Standards gibt: Es trat eine Bild-Veränderung im Laufe der Zeit auf, die vermutlich im Zusammenhang mit der Alterung der (kühl gelagerten) UHT-Milch zu sehen ist. Die Probe war jedoch schon deutlich über das Haltbarkeitsdatum hinaus (ca. ¾ Jahr abgelaufen). Nach 1 Jahr über Haltbarkeitsdatum (1,5 Jahre nach Kaufdatum) waren charakterlich stark veränderte Bilder aufgetreten – die Milch war verdorben (und nicht mehr als Standard nutzbar). Die Bildmerkmals-Ausprägungen sind unabhängig von der Alterung der Probe an einzelnen Tagen deutlich verändert gegenüber den anderen Tagen – ein Zusammenhang zu laborklimatischen Bedingungen, dokumentierten Laborprozeßvariationen oder dem Wettergeschehen scheinen hier nur von geringer Bedeutung zu sein (siehe Kapitel „Standard-variationen“ unter Kapitel 3.3.2). Der/die verursachenden vorrangigen Faktor(en) sind nicht bekannt. SB-Methode: Charakterisierung – probenseitige Einflüsse – Probennahme 151 3.4. Charakterisierung: Proben-spezifische, Proben-verursachte Einflüsse auf die Bildmerkmals-Ausprägung Neben den Effekten, die laborseitig verursacht werden und sich in der Bildmerkmalsausprägung der Steigbilder zeigen, gibt es auch von Seiten der Probe eine Reihe von Einflüssen, die sich auf die Bildmerkmale auswirken könnten. Bei der gezielten Vergleichsuntersuchung von zwei Proben macht man sich dies zunutze, dass die Bilder sich probenspezifisch aufbilden. Es kann aber eine Reihe von Kofaktoren geben, die sich neben den gewünschten / zu untersuchenden Effekten im Steigbild zeigen. Hierzu zählt die Probennahme, die Alterung der Probe, die Temperaturführung der Probe, aber auch z.B. der Fettgehalt der Probe, oder andere kuhseitige Effekte (Laktationsstadium, Milchleistung), die sich auf die Milcheigenschaften aufwirken und somit eine Bildmerkmalsveränderung hervorrufen können. Um zu prüfen, wie stark diese Effekte sind und in welcher Weise sich die Bildmerkmale verändern im Zusammenhang der variierten Proben-Eigenschaften werden diese hier aufgeführten Untersuchungen durchgeführt. Bei spätern Probennahmen kann dann darauf u.U. gezielt Rücksicht genommen werden, oder bei der Bildbeurteilung können diese Effekte mit einbezogen werden. 3.4.1. Faktor 1: Probennahme 3.4.1.1. Variation der Milchprobe bei wiederholter PrN Problem: Wenn an einem Stichtag eine Tankprobe oder von einer Melkzeit eine Einzelkuhprobe genommen wird, kann diese dann als „repräsentativ“ für die gewünschte Frage gelten? In welchem Zeitraum, unter welchen Bedingungen, treten Veränderungen auf? Es ist also die Frage nach der Variation der Milchprobe. Frage: 1) Wie stark verändern sich die Bildmerkmale, wenn an veschiedenen Tagen vom gleichen Objekt (einzelne Kuh oder Tank- / Pool-Probe) eine Probe gezogen wird? Versuchsaufbau 1: Es werden Bilder von 3x wiederholt genommenen Einzeltierproben und deren Poolproben miteinander verglichen. a) Von 10 Kühen werden drei mal (Tag 1, Tag 8 und Tag 15) Proben genommen und Bilder davon erstellt. b) Die Proben von 2x vier Kühen werden gepoolt und von diesen zwei Poolproben werden Bilder erstellt. SB-Methode: Charakterisierung – probenseitige Einflüsse – Probennahme 152 Zur Auswertung werden a) je Kuh und Probennahme die zwei Bilder nebeneinander gelegt und die Bildvariation abgeschätzt. Es werden die Bilder der 1. Prn neben die der 3. PrN gelegt und die Bildveränderung je Kuh betrachtet. Die Bidler der Poolproben b) werden je PrN codiert gruppiert, und die Bilder der wiederholten PrN denen der vorhergehenden zugeordnet. Dadurch soll festgestellt werden, ob sich die Bildmerkmale im Verlaufe der Zeit verändern oder so konstant sind, dass die Bildmerkmale „vergleichbar“ bleiben, auch bei wiederholter PrN. Ergebnis: Zu b) sind die Ergebnisse unter Hof 1 zu finden. Es zeigte sich, dass 1) die Bilder der zwei gedoppelten Proben je PrN gruppiert werden können (d.h. Unterscheidung möglich) 2) die Bilder der 2. PrN denen der 1. PrN zugeordnet werden können (Klassifizierung möglich) 3) die Bilder der 3. PrN vertauscht denen der 2. PrN zugeordnet wurden (Klassifizierung nicht möglich) Zu a) (die einzelnen Bilder werden nicht gesondert beschrieben): 1) Die doppelt erstellten Bilder je Kuh und Tag sind sich sehr ähnlich. Der Faktor „Bildwiederholung“ führt zu keiner deutlichen Bildmerkmals-Veränderung. 2) Die Bilder der einzelnen Tiere unterscheiden sich deutlich mehr, als die wiederholt erstellten Bilder aus einer Probe (Probeneffekt größer als Bildwiederholungs-Effekt). Die Bilder der einzelnen Tiere unterscheiden sich untereinander sehr deutlich in der Merkmals-Ausprägung, und es gibt sogar den Fall (Kuh 37), dass sehr Milch- untypische Bildmerkmale bei wiederholter PrN über mehrere Tage gut reproduzierbar sind. (siehe dazu auch Einzelkuh-Ergebnisse von Hof 6). 3) Bei 8 der 10 Kühe sehen die Bilder der ersten Probenahme denen der zweiten Probenahme sehr ähnlich, bzw. sind so gut wie nicht davon zu unterscheiden (SB- Abb-27-Hof_1-10 Einzeltiere). Bei zwei Kühen sind sichtbare Veränderungen aufgetreten: die eine (Kuh 31) hatte am ersten PrN-Tag deutlich gB ausgebildet (gB=3), am anderen jedoch nur Schalen aber keine g.B.. Die andere (Kuh 34) hatte erst kleinere Schalen und einen grauen Schleier unter dem Schalenrand ausgebildet, am anderen Probenahme-Tag jedoch deutlich größere Schalen ohne GrS. Diskussion: Die Veränderung der Bildmerkmale bei der Poolprobe der 3. PrN (am Tag 15) sind mit der Veränderung der Einzeltier-Proben erklärbar: Bei der Poolprobe von Hof 1 sind bei der 1. und 2. PrN die Bilder der Probe „Enthornt“ mit relativ vielen g.B. im Vergleich zu den SB-Methode: Charakterisierung – probenseitige Einflüsse – Probennahme 153 Bildern der Probe „Horntragend“, aber am 3. PrN-Termin ist das andersherum. Bei den Bildern von zwei Einzeltieren kann eine ähnliche Merkmalsveränderung beobachtet werden, die entsprechend in den Bildern der Poolprobe beobachtet werden (siehe auch Ergebnisse Hof 1). Fazit:  Die Probenahme (gemessen an den Bildmerkmalen der wiederholt genommenen Proben) ist bei den Einzelkühen in 8 von 10 Fällen sehr gut reproduzierbar.  Die Veränderung von Poolproben-Bildmerkmalen läßt sich auf die Veränderung der Bildmerkmale bei Einzeltierproben zurückführen. Ähnlicher Ergebnisse finden sich bei weiteren Einzeltier-Untersuchungen anderer Höfe wieder. Versuchsaufbau 2: Material: 3x Milch von Hof L (14., 15., 17.4.) und 4x Milch von Hof D (14., 15., 16., 10.4.), jeweils zwei, drei oder vier Bilder (0,075ml / Bild) von frischer Probe (0Tage gealtert): zwei Höfe, verschiedene PrN-Termine. Vorgehen: Die codierten Bilder werden nach einem Merkmal, das die Bilder deutlich unterscheidet, gereiht oder gruppiert. Frage: Lassen sich die Bilder von Milchproben von zwei Höfen bei wiederholter Probennahme und mehreren Bildentstehungstagen unterscheiden? (oder: ist der Faktor “Hof” größer als der der Probennahme und des Labortages?) Ergebnis: Eine Gruppierung der Bilder nach dem Merkmal „grüne, undifferenzierte Bereiche in der Schalenzone, in %-Fläche der Schalenzone“ führt zu folgendem Ergebnis: Gruppe a) b) c) Merkmalsausprägung viele grüne Bereiche (50-30% grün): wenige grüne Bereiche (5-15% grün): keine grünen Bereiche (0%), große Schalen Hof L 14.4.: 2 Bilder 16.4.: 3 Bilder 17.4.: 3 Bilder 17.4.: 1 Bild Hof D 14.4.: 3 Bilder 15.4.: 2 Bilder 16.4.: 4 Bilder 10.4.: 4 Bilder Tab 53. Gruppierung der Bilder von zwei Höfen, bei Bildern wiederholter PrN von verschiedenen Tagen. Bis auf ein Bild von dem Hof L konnten die Höfe voneinander unterschieden werden, wobei sogar die Bilder des einen Tages (10.4.) mit ungewöhnlichen Bildmerkmalen sich von allen anderen unterscheiden (was auch in den Standardbildern deutlich sichtbar ist), die SB-Methode: Charakterisierung – probenseitige Einflüsse – Probennahme 154 Bilder der anderen drei Tage sind bei beiden Betrieben nicht voneinander zu unterscheiden bzw. sich so ähnlich, dass die Hofunterschiede viel deutlicher sind im Merkmal „grüne Bereiche“. Werden die Schalen mit mehreren Merkmalen mit der “einfach beschreibenden Prüfung” charakterisiert, so lassen sich die Bilder der einzelnen Tage (wiederholte PrN bzw. anderer Bildererstellungstag) besser voneinander unterscheiden (Tab 54) Fazit: Die 22 Bilder der 7 Proben lassen sich bis auf eines in drei Gruppen aufteilen, die den Proben-Qualitäten (Höfen) bzw. dem Bildererstellungstag entsprechen. Werden Gruppe b und c als „ähnlich“ zusammengefaßt, so kann gefolgert werden, dass 95% der Bilder korrekt gruppiert werden können entsprechend der Probenqualität, obwohl die Probennahme wiederholt stattfand und die Bilder von verschiedenen Erstellungstagen stammen. SB-Methode: Charakterisierung – probenseitige Einflüsse – Probennahme 155 Versuchsaufbau 3: Material: Milch von Hof D vom 7.4., 10.4., 14.4., 15.4., 16.4., somit Bilder vom 8.4., 11.4., 15.4., 16.4., 17.4 (ein Hof, verschiedene PrN-Termine). Methode: codierte Bilder reihen / gruppieren nach frei zu wählenden, unterscheidenden Merkmalen. Ergebnis: Gruppe Kontur Farben g.B. Schalen Fahnen Anzahl Bilder x Datum Probennahe A1 verwaschene Kontur helle Farben, weiß im Schalenrand keine grünen Bereiche S unregelmä- ßig groß, eher flach, aber groß 4x 10.4. A2 wie A1 weniger Weiß als A1, dadurch „dunklere“ S 2x 15.4. B1 klar konturiert einzelne, eher helle g.B. Schalen unregelmäßig tief Fahnen parallel, lang 2x 14.4., 1x 16.4. B2 wie B1 einzelne, eher dunkle g.B. wie B1 Fahnen kürzer, mehr oben, beweglicher 3x 16.4., 1x 14.4. C stark konturierte Formen farbintensiv (dunkel-ocker Schalenfüllung) Sockel: weiße Bande unten 4x 8.4. Tab 54. Gruppierung der Bilder von Hof D nach Bildmerkmalen Die Bilder vom 15.4. und 17.4. (PrN 14.4. und 16.4.) sind sich relativ ähnlich und können nur in 3 von 4 bzw. 2 von 3 Fällen voneinander getrennt werden. Diskussion: Die Bider vom 15 und 17.4. (PrN 14.4. und 16.4.) sind schwer voneinander zu unterscheiden, der 16.4. (PrN 15.4.) hat etwas ungewöhnliche Bildmerkmale, der 11.4. (PrN 10.4.) hat auffällig ungewöhnliche Bildmerkmale. Die Standard-Bilder dieser Tage zeigen genau denselben Sachverhalt auf, und die Klimadaten bestätigen diesen noch. D.h. die Bildunterschiede haben (zumindest zum Teil) ihre Ursache im Labor-Klima, ob gleichzeitig ein Probeneffekt vorliegt läßt sich nur mit Hilfe der Matrix ermitteln, die auch die Alterungs- Untersuchung der Proben beinhaltet (siehe “Faktor Alterung“, Punkt 3). SB-Methode: Charakterisierung – probenseitige Einflüsse – Probennahme 156 Diskussion zu „PrN reproduzierbar“: In den meisten Fällen (geschätzt 75%) scheint eine Probennahme reproduzierbar – bzw. bleiben die Probenunterschiede größer als die Veränderungen aufgrund wiederholter PrN. Wenn dies der Fall ist (der Probeneffekt bzw. der Produktionseinfluß auf die Milch ist größer als der Laboreffekt (incl. Auswerte-Verfahren)), dann ist eine gewisse Bildmermalsvariation aufgrund der Methode akzeptabel. Weil bekannt ist, dass Bildmerkmalsvariationen von Tag zu Tag auftreten können, ist es notwendig, den Labor- Effekt auf die Bildmerkmale zu beachten und nur Bilder von einem Labortag miteinander zu vergleichen, oder nur dann Bilder verschiedener Tage zu vergleichen, wenn die Standardbilder „ähnlich“ sind (d.h. wenn Doppel nicht einander zuzuordnen oder im Triangeltest nicht von den anderen zu differenzieren sind). Es gibt Fälle (ca. 25% der Fälle), in denen bei wiederholter PrN sehr unterschiedliche Bildmerkmale ausgebildet wurden. Diese „Ausnahmen“ sind z.B. bei den Einzeltier- Ergebnisse von Versuchsaufbau 1 zu beobachten, bei dem deutlich ist, dass es zwei von 10 Kühen gab (20%), bei denen die Bildmerkmals-Ausprägung nicht bei allen genommenen Proben vergleichbar ist. Ein ähnliches Ergebnis kann auch an den Ergebnissen der Proben abgelesen werden, an denen die Methode angewendet werden sollte: Wenn eine Zuordnung der wiederholt genommenen Proben zu denjenigen der vorhergehenden PrN aufgrund der Bildmerkmale möglich ist, kann von einer „reproduzierten PrN“ gesprochen werden. Bei den „Hörner-Proben“ sind z.B. bei 4 PrN (22%) die Bilder falsch den vorhergehenden zugeordnet worden, bei den restlichen 14 Fällen (78%) waren die Zuordnungen zur vorhergehenden PrN korrekt. Bei den drei Fütterungs-Versuchen sind die Zuordnungen bis auf eine PrN (Wiesenheu vs. Silage, 1. PrN) korrekt, also in 8 von 9 Fällen (89%) kann die PrN als „reproduziert“ bezeichnet werden. Bei den Bildern zu den Wirtschaftsstilen ist es schwer, diesbezüglich eine klare Aussage zu machen, da einerseits vier Proben zu beurteilen waren, und einige Proben nicht voneinander unterschieden werden konnten. Jedoch ist deutlich, dass sich die Bildmerkmale dort im Laufe der Zeit (von 1. zur 3. PrN z.B.) dahingehend verändert hatten, dass eine Reihung genau im umgekehrter Reihenfolge vorgenommen wurde, insofern auch eine Zuordnung nicht mehr korrekt war. Einzelne Zuordnungen waren jedoch weiterhin korrekt. Auch ist hier zu berücksichtigen, dass der Abstand der PrN 2 Monate betrug, bei den anderen Proben jeweils nur 1 bis maximal 2 Wochen. In diesem kürzeren Zeitrahmen scheinen die PrN relativ gut reproduzierbar. Fazit zu „PrN Reproduzierbar“ Diese Ergebnisse weisen auf eine reproduzierbare Probennahme, die aber in einzelnen Fällen (u.a. aufgrund von veränderten Einzeltier-Effekten innerhalb von 7 Tagen) nicht gegeben ist. In 22 von 27 Fällen (81%) ließen sich Mischprobenpaare bei wiederholter PrN einander zuordnen. SB-Methode: Charakterisierung – probenseitige Einflüsse – Probennahme 157 3.4.1.2. Robustheit gegenüber PrN-Verfahren Es sollte in einer Projektarbeit geprüft werden, inwieweit die Art der Probenahme einen Einfluß auf die Ergebnisse hat. Es wurden drei PrN-Verfahren verglichen: Handmelken, Maschinenmelken mit Milchabscheider, Maschinenmelken in Kanne. Es zeigte sich, dass gleichgültig bei welcher PrN-Variante die Bildmerkmals-Ausprägungen doch einander recht ähnlich waren, die Unterschiede von verschiedenen Poolproben waren deutlich größer, auch der Tag der Bildererstellung führte zu deutlichen Bildveränderungen (TIGGES UND LEUPOLT 2009). Insofern kann geschlossen werden: Gegenüber verschiedenen Probenahme- Verfahren weist die Steigbildmethode bei Milch eine große Robustheit auf – die verschiedenen Probenahmeverfahren sind als gleichwertig zu beurteilen, die Proben- Eigenschaften können sich jedesmal deutlich im Bild ausdrücken, der Bildererstellungstag ist ebenfalls deutlich an der Bildmerkmals-Ausprägung wahrzunehmen. 3.4.1.3. Einzeltierprobe vs. Sammelprobe Werden Steigbilder von Einzeltierproben erstellt, so treten deutliche tierindividuelle Bildmerkmals-Ausprägungen auf (siehe z.B. Hof 1 und Hof 7). Ähnliches wird von Geier (2004) berichtet. Werden die Proben verschiedener Individuen gemischt (gepoolt), so ergibt sich eine Bildmerkmals-Ausprägung, die ein gewisses „Mittelmaß“ dieser Einzeltierproben- Bildmerkmals-Ausprägungen aufweist. Dieses kann z.B. am Bildmaterial von Hof 7 nachvollzogen werden: Die Bilder der Einzeltiere sind z.T. als „sehr ungewöhnlich“ zu bezeichnen, mit flachem Sockel und unregelmäßiger Schalen- und Fahnenzone, z.T. aber auch als „mit normaler Bildmerkmals-Ausprägung“. Die Bilder der Poolproben der 1. PrN wurden bei der „Horntragend“-Probe aus nur 6 Tieren zusammengestellt – davon eine (Doris) mit besonders auffälligem Bild. Dieses „untypische“ Bildmerkmal ist auch in der Sammelprobe zu finden. Bei den folgendne PrN wurden 8 bzw. 9 Einzeltier-Proben gepoolt – der Effekt des einen Einzeltieres tritt in den Mischproben-Bildern nicht mehr in Vorschein. Der Effekt ist in den Hintergrund getreten, die anderen „normalen“ Proben waren in der Überzahl bzw. in größerer Quantität vorhanden: da die Poolproben proportional zur Milchleistung zusammengestellt wurden und Doris eine geringe Milchleistung hat, geht der Effekt bei der Ergänzung der Poolprobe um Proben von zwei leistungsstarken Kühen verloren. Vergleichbares zeigte sich bei der z.T. unterschiedlichen Zusammenstellung von Einzeltierproben bei Hof 5 oder beim Fütterungssystemvergleich C „Wiesenheu vs. Silage“. Es wurden Poolproben von „allen“ Kühen sowie von einer reduzierten Anzahl von Kühen zusammengestellt (z.B. Ausschluß von Kühen mit hoher Zellzahl). Die Poolproben-Bilder weisen dementsprechend leicht veränderte Bildmerkmals-Ausprägungen auf – bei den Proben des Hofes 5 sind die Bildunterschiede z.T so groß, dass eine Zuordnung der unterschiedlich zusammengestellten Proben „normal“ vs. „GuM“ aufgrund der Bildmerkmale SB-Methode: Charakterisierung – probenseitige Einflüsse – Probennahme 158 nicht möglich war bzw. die Klassifizierung (nach SZ bzw. FZ-Merkmalen) unterschiedlich ausfiel. (siehe Tabelle „Übersicht über Klassifizierungsergebnisse“ unter Hof 5, Kapitel 2.5.3 im Anhang A, Bilder dazu im Anhang „SB-Abb-Hof_5-...„). Unter Hof 7 ist dargelegt, dass eine Klassifizierung hinsichtlich des Merkmals „Horn“ bei Einzeltieren in 13 von 17 Fällen möglich war, die vier falsch klassifizierten Fälle wiesen bei mindestens einer PrN „untypische“ Bildmerkmale auf (unregelmäßige SZ, abgelöster Srand...). Insofern scheinen Bilder mit untypischen Bildmerkmalen nicht so gut beurteilbar zu sein. Ein anderes Beispiel ist unter Hof 1 dargelegt. Hier kann abgelesen werden, dass sich die Bilder der Sammelprobe (Poolprobe) verändern, wenn die Bilder der Einzeltierproben verändert sind (im Vergleich zur vorhergehenden PrN). Fazit: Aus diesen Beobachtungen muß abgeleitet werden, dass die Einzeltierprobe einen deutlichen Effekt auf die Bildmerkmals-Ausprägung haben kann – und dass dieses auch noch in den Bildern der Poolprobe / Sammelprobe zu bemerken ist. Bilder mit „untypischen“ Merkmalen wie unregelmäßiger SZ und abgelöstem Srand sind schwieriger zu beurteilen als „normale“ Bilder, hier treten eher Fehlklassifizierungen auf. Der Effekt scheint additiv zu sein, jedoch kann eine Probe mit untypischen Bildmerkmalen sich stärker im Poolproben-Bild bemerkbar machen als „normale“. Es kann somit von einer „Mittelwertbildung“ gesprochen werden, solange keine extremen, untypischen Bildmerkmale auftreten. SB-Methode: Charakterisierung – probenseitige Einflüsse – Probenalterung 159 3.4.2. Faktor 2: Probenalterung Problem: Die zu untersuchenden und miteinander zu vergleichenden Milchproben stammen manchmal nicht alle von einem Probenahme-Tag. Somit ist von Interesse, wie stark sich die Alterung der Probe auf die Bildmerkmals-Ausprägung auswirkt. Oft ist es auch schwer, Bilder verschiedener Bildererstellungstage miteinander zu vergleichen, weil z.T. unerklärliche tagesspezifische Variationen in den Bildmerkmals-Ausprägungen auftreten können (an den Standardbildern deutlich zu bemerken). Somit wäre es auch von Interesse, zu klären, ob die Probe besser „flüssig im Kühlschrank“ oder „getrocknet im Steigbildpapier“ konserviert wird, um sie mit anderen zu vergleichen – oder ob die PrN gleichzeitig stattfinden muß, um einen Vergleich zu ermöglichen. Hierzu siehe auch die Ergebnisse unter „Faktor Trocknungszeiten“, Kapitel 3.3.3) Frage: 1) Wie äußert sich im Steigbild der Faktor „Alterung der Probe“? Versuch: An mehreren aufeinanderfolgenden Tagen werden Tankmilchproben eines Hofes genommen und jeweils frisch und in mehreren Stufen gealtert untersucht (siehe Tab 55). Vorgehen bei der Bildauswertung: 1) Aus den 2 bis 4 Bildern je Probe wird ein “repräsentatives Bild” ausgewählt, das in etwa den Mittelwert der anderen Bilder wiedergibt. 2) Anhand von 5 repräsentativen Bildern der Probe vom 10.4.08, die an 5 aufeinanderfolgende Tagen erstellt wurden, werden Merkmale ermittelt, die sich relativ konsistent in dieser Reihe verändern. 3) Diese Merkmale werden daraufhin an den anderen repräsentativen Bildern der Alterungs-Matrix überprüft. (siehe Tab 55) 4) Alle Bilder (2, 3 oder 4 je Probe) eines Untersuchungstages bzw. einer Probe bzw. aller “Frisch untersuchten” Proben werden codiert nach dem Merkmal „g.B.-Intensität“ gereiht (incl. Gruppierung nach freien Merkmalen), um zu ermitteln, ob sich die Bilder unterscheiden. 5) Die Bilder (je Probe 4 Bilder) vom 11.4., 14.4. und 18.4. werden in zweifacher Wiederholung einer Profilprüfung unterzogen, um die Ergebnisse der “repräsentativen Bilder” abzusichern. SB-Methode: Charakterisierung – probenseitige Einflüsse – Probenalterung 160 Ergebnis: Ausschnitte der repräsentativen Bilder sind im Anhang A „Alterung von Milchproben“ zu sehen (Probennahme x Alterungsmatrix). Das Merkmal „Schalengröße der großen Schalen“ (Breite x Tiefe der größten der vorhandenen Schalen, kleine Schalen werden neben großen nicht beachtet) nimmt mit der Alterung kontinuierlich ab (was sich sowohl an einer Probe und täglich neu erstellten Bildern ermitteln läßt, als auch an mehreren, verschieden alten Proben, von denen an einem Tag Bilder erstellt werden). Gleichzeitig (daran in gewissem Rahmen gebunden) wird der grün gefärbte, undifferenzierte Bereich der Schalenzone geringer. Die Kontur der Schalen ändert sich kaum, die Farbintensität nimmt etwas zu. Zur weiteren Bonitur wird die Schalengröße mit den Boniturnoten „1 = kleine Schalen” bis „9 = große Schalen” erfaßt Die grünen Bereiche in % der Schalenzonenfläche, die Kontur mit “1 = verwaschene Farbübergänge” bis “9 = deutlich konturierte, getrennte Farbbereiche, klare Abgrenzung der Schalen nach unten hin” und die Farbintensität mit “1 = blasse, helle Farben” bis “9 = dunkle, intensive Farbtöne in deutlichem Kontrast zu der helleren Umgebung” Eine Bonitur der “Schalengröße” an den repräsentativen Bildern in der Matrix zeigt dass sowohl eine alternde Probe als auch wiederholt genommene Proben, an einem Tag untersucht, den “Alterungseffekt” von kontinuierlich abnehmender Schalengröße aufweisen (s.a. Tab 55). Das Merkmal “grüne Bereiche” weist aber Unregelmäßigkeiten auf: am 15.4. und 17.4. treten bei ALLEN Bildern im Vergleich zu den anderen Tagen mehr grüne Bereiche auf, außerdem hat die Milch vom 9.4. eher grüne Bereiche als die anderen Tagen, die Milch vom 8.4. hat verhältnismäßig flache Schalen, die vom 15.4. verhältnismäßig große Schalen. Die gleichzeitig entstandenen Standard und Nullproben-bilder (H-Milch und Wasser) vom 15. Und 17.4. sind nicht voneinander zu unterscheiden, die vom 14. und 18. sind ihnen sehr ähnlich, etwas anders ist der Standard am 16.4., deutlich anders am 11.4. – die gleiche Bildveränderung findet sich auch in den Proben-Bildern. (z.B. konturiertere, kleinere Schalen am 16.4., weichere Farbübergänge und größere Schalen am 11.4.) Verschiedene Verfahren zur Auswertung der Bilder sind im Kapitel 3.5 „Bild- Auswertung“ wiedergegeben. Die Profilprüfung zeigt, dass das an den repräsentativen Bildern gefundene Merkmal “Schalengröße” mit Alterung der Probe abnimmt – die Trennschärfe ist jedoch relativ gering (große Streuung u.a. bei der Bonitur), noch größer wird die Unsicherheit beim Merkmal “grüne Bereiche”, was mit der hier relativ großen Schwankungsbreite (evtl. labortechnische Faktoren wie Luftfeuchte) dieses Merkmals zusammenhängt. SB-Methode: Charakterisierung – probenseitige Einflüsse – Probenalterung 161 Datum der Bildererstellung 11.4. 12.4. 13.4. 14.4. 15. Apr 16.4. 17.4. 18.4. 07.04.08 4 3t 2 6t 08.04.08 4 2t 3 5t 3 6t 09.04.08 7 1t 5 4t 4 5t 2 6t 10.04.08 8 0t 7 3t 6 4t 4 5t 3 6t 11.04.08 12.04.08 13.04.08 14.04.08 6 0t 5 1t 5 2t 4 3t 15.04.08 6 0t 6 1t 5 2t D a tu m d e r P ro b e n n a h m e 16.04.08 6 0t 6 1t Tab 55. “Bonitur Schalengröße an repräsentativen Bildern” sowie Alter der Probe in Tagen Die Frage, ob sich Proben besser im Kühlschrank oder im Papier eingetrocknet konservieren lassen, ist im Abgleich mit den Ergebnisse zur „Trocknungszeit“ (Kapitel 3.3.3) wie folgt zu beantworten: Bei langer Trocknungszeit nach P1 kann es zu starken Steighemmungen kommen, so dass es nicht sicher ist, ob die Bilder gelingen. Bei Lagerung der Probe im Kühlschrank ist mit einer Bildveränderung zu rechnen, die einem Verdünnungseffekt nahe kommt. Keine der beiden Methoden erscheint perfekt, um Proben für die Steigbildmethode zu konservieren. Fazit Zu 1) Die Alterung der Probe ist im Steigbild deutlich wahrnehmbar und äußert sich u.a. in kleiner werdenden Schalen. Zu 2) Die Lagerung der Probe getrocknet im Steigbildpapier ist u.U. sehr gut geeignet – jedoch kann es zu Ausfällen kommen, wenn Steighemmungen auftreten (wie in einem der beiden untersuchten Fälle). Sichere Ergebnisse sind eher mit im Kühlschrank gealterten Proben zu erzielen, die dann jedoch einem deutlichen Alterungseffekt unterliegen. SB-Methode: Charakterisierung – probenseitige Einflüsse – Temperatur-Effekte 162 3.4.3. Faktor 3: Temperierung (Hitze / Kälte) 3.4.3.1. Einfluß der Kühlung der Milch auf die Bildmerkmale Problemstellung: Die kuhwarm gemolkene Milch wird im Rahmen dieser Arbeit normalerweise mit Eisakkus gekühlt transportiert, im Kühlschrank über Nacht gelagert und am folgenden Tag untersucht. Die Kühlungsintensität kann variieren – und es gibt vereinzelt den Fall, dass Proben vom Morgengemelk direkt am selben Tag untersucht werden sollen. Deshalb ist von Bedeutung, den Einfluß der Temperatur der Milchprobe auf die Bildmerkmals-Ausprägung zu kennen. Außerdem ist von Intresse, ob es eine besonders geeignete Kühl-Variante gibt. Fragen: 1) Ist ein besonders rasches Abkühlen notwendig, um die Probenqualität zu konservieren? 2) Macht es einen Unterschied, ob die Kühlung per Eisakkus (-18°C) oder per Kaltwasser (ca. 6°C) stattfindet (ohne dass die Proben dabei gefrieren) ? 3) Welchen Einfluß hat die Kühlung an sich auf die Bildmerkmalsausprägung? („kuhwarm = 25°-20°C“ im Vergleich zu „leicht gekühlt = 12°C“ bzw. „stark gekühlt = 7°C“) Weil es eine gewisse Zeit dauert, bis die Proben entsprechend gekühlt sind bzw. über Nacht gelagert werden ist der Einfluß der Alterung der Probe ebenfalls zu berücksichtigen: 4) Welchen Einfluß hat die Dauer der Lagerung (Zeit zwischen Melken und Untersuchung) auf die Bildmerkmalsausprägung? Versuch 1: 1) 2) 3) 4) 5) Eis-Kühlung (auf 7°C) Wasserbad (> 12°C) Wasser+Eis (7°C) In Glas / Plastik Kuhwarm (ca. 20°C) Gefrostet (- 18°C) 1h n.d. Melken A = 17°C B = 18°C C = 25°C 4h D = 7°C E = 13°C / Wasser = 12°C F = 20°C 8h G = 14°C H I = 18°C 12h J 24h (1 Tag) K = 7°C L = 14°C M / N O =18°C P Tab 56. Proben-Varianten und Temperatur der Proben beim Erstellen der Vorverdünnung: SB-Methode: Charakterisierung – probenseitige Einflüsse – Temperatur-Effekte 163 Probenhandhabung: Aus dem Milchabscheider im Melkstand werden über den Schieber per Eimer 2 Liter Milch während des Melkens entnommen und in 2 braune 1l-Milchflaschen gefüllt. Flasche 1 wird in einer leeren Kühlbox transportiert („warm“, Variante 4), Flasche 2 wird in einer Kühlbox mit 6 Eisakkus („kalt“) transportiert. Im Labor (30 min. später) wird von der „kalten“ Probe 1) 100ml in eine kleine Glasflasche (Duran) abgefüllt und zwischen 3 Eis-Akkus gekühlt, 2) 600ml in einer 1l-Flasche im Wasserbad (ca. 10l Wasser) gekühlt 3) a) 100ml in einer 100ml-Glas-Flasche im Wasserbad mit 2 Eisakkus gekühlt b) 150ml in einer 200ml Plastik-Flasche (PE) im Wasserbad mit 2 Eisakkus gekühlt 4) ...... 5) 10ml in einem 20ml-Glas-Fläschchen bei –18°C eingefroren. Die Probe wird 1h vor Verwendung herausgenommen und bei Raumtemperatur aufgetaut. Bildererstellung: Von den Proben „1h nach dem Melken“, „4h“ und „8h“ werden entsprechend die Vorverdünnungen erstellt und die 1. Phase angesetzt. Gemeinsam wird die 2. und 3. Phase durchgeführt (2.8.07)– d.h. die Trocknungszeit für die „1h-Proben“ beträgt bis zu 10h. Bei den Doppel der doppelt erstellten „1h“-Bildern wird die 2. und 3. Phase erst 24h später durchgeführt. Die „12h“-Bilder trocknen 12h, die „24h“-Bilder jedoch wie üblich 3h, gemeinsam werden die „12h“, „24h“ und die Doppel der „1h“-Bilder (24h getrocknet) fertiggestellt (3.8.07). Ergebnisse: Charakterisierung der Bilder: Konz.- stufe A B C 0,05 Srand nicht gelöst (=0,5) Srand kaum gelöst (=1) Srand deutlich gelöst (=4) „1h“ 0,1 Rötliche Linie Sockel flach Rötliche Linie Sockel flach Rötliche Linie Sockel flach K L O 0,05 Srand nicht gelöst (=0) Srand nicht gelöst (=0) Srand gelöst (=2) 0,075 Srand deutlich, breit g.B.=0 Srand deutlich, breit g.B.=0 Srand nicht deutlich g.B.=3 „24h“ 0,1 Srand nicht gelöst (=0) Keine / kaum rötliche Linie Sockel normal hoch Srand nicht gelöst (=0) Keine / kaum rötliche Linie Sockel normal hoch Srand gelöst (=4) Rötliche Linie Sockel flach Tab 57. Ausgewählte, unterscheidende Merkmale., vergleiche dazu SB-Abb-13- Abkühlung-070802 SB-Methode: Charakterisierung – probenseitige Einflüsse – Temperatur-Effekte 164 Daraus wird ersichtlich, dass die Bilder bei zunehmender Kühlung - weniger rötliche Linie aufweisen - der Sockel höher / größer wird - der Srand weniger gelöst ist - die Srand-Bildung verstärkt auftritt (breiter, konturierter) Die Bilder der Variante „A“ und „B“ sind sich sehr ähnlich, die Bilder der Variante „O“ ähneln denen von Variante „B“ und „A“, und der Sprung von „O“ zu den Bildern der Variante „C“ ist deutlich geringer als zu „K“ und „L“. Werden die Temperaturen der Proben bei Erstellen der Vorverdünnung daneben gelegt, so sind die Varianten „A“, „B“ und „O“ von ca. 18°C-Proben, die Variante „C“ ist etwas wärmer (25°C), die Proben „K“ und „L“ sind von 7°C- Proben. Die Bilder der „4h“ und „8h“-Variante unterscheiden sich je Kühlungsvariante fast gar nicht. Sie sind auch von Proben gleicher Temperatur erstellt. Im Vergleich zu den Bilder der „1h“-Variante und „24h“-Variante liegen sie in der Bildausprägung dazwischen (s.u., Reihung aller Proben). Reihung der Bilder (alle Varianten) nach Bildmerkmalen: °C / h 2 5 / 1 2 0 / 4 1 8 / 8 1 7 / 1 1 8 / 1 1 8 / 1 1 7 / 1 1 8 / 2 4 1 3 / 4 7 / 4 1 4 / 8 6 / 8 7 / 2 4 7 / 2 4 P 7 / 2 4 G 7 / 1 2 1 4 / 2 4 -1 8 / 2 4 Prbe C C F I A B B A O E D G H K N M J L P Sg=10 Sg=10 Sg=10 Sg=3 gB=0 gB schmal gB=3,5 gB breit gB=3,5 GB=7 b+g gB=5 b+g gB=4 grün gB=3 braun gB=3 grün, verw 0,1 Sockel flach, rötliche Linie Sockel normal, kaum rötliche Linie 0,07 5 S=6 Sg=5 S=4,5 Sg=4 S=4 Sg=3 S=3,5 Sg=2 gB=1 S=4 Sr verw S=5 Sr verw S=4 gB=0,3 S=4 gB=1 Sr deutl S=3,5 Sr deutl S=3, Sr deutl 0,05 S=2,5 S=0,5 S=2 S=1 Sg=1 GrS, Sr verw S=1 S=1 S=1 S=0,5 S=0 “milch-untypische Bilder” „normale“ Bilder Tab 58. Auffällige unterscheidende Merkmale bei der Reihung. (Sg = Srand gelöst, GrS = Grauer Schleier, Sr = Schalenrand, b+g = braun und grün) Die Bilder der Varianten A bis P lassen sich in der Weise reihen, dass auf der einen (linken) Seite die Bilder mit sehr milch-untypischen Bildern zu liegen kommen, und auf der rechten Seite die „normalen“ Milchbilder. Die links liegenden Bilder (C,F,I,A,B,O) haben einen sehr deutlich gelösten Schalenrand, die Schalen sind eher groß, und die Schalenbildung ist sehr unkonturiert, eher „verwaschen“. Der Sockel ist bei 0,1ml Milch je SB-Methode: Charakterisierung – probenseitige Einflüsse – Temperatur-Effekte 165 Bild sehr flach, und es bildet sich eine deutliche rötliche Linie am untern Rand des Bildes. Die Bilder auf der rechten Seite (E,D,G,G,K,N,M,J,L,P) sind mit kleineren, dafür deutlicher gestalteten Schalen, und es bilden sich grüne / braune Bereiche. Der Schalenrand ist NICHT gelöst. Der Sockel ist normal-hoch, und es bildet sich eher keine rötliche Linie aus. Vergleicht man die Reihung mit der Kühl-Einwirkung, so ist zu bemerken, dass die „milch-untypischen“ Bilder von Milchproben entstanden, die über 17°C warm waren, die anderen waren unter 14°C kühl. Und entsprechend der abnehmenden Temperatur bzw. der längeren Zeit, die bis zur Untersuchung verstrich, wurden die Bilder gereiht. Die Proben von 4h bzw. 8h und 7°C bzw. 14°C lassen sich nicht voneinander trennen, rechts daneben sind dieselben Proben nach 12h und 24h angeordnet, gefolgt von den Bildern der gefrosteten Probe. Diese Bilder haben die kleinsten Schalen, die geringste g.B.-Intensität. Eine Bonitur einiger Merkmale an den in SB-Abb-13-Abkühlung.070802 abgebildeten Bildern ist in Tab 59 wiedergegeben. 0,05 C (25°C, 1h alt) O (18°C, 1 Tag alt) G ähnlich K (14°C, 8h alt, ähnl. 7°C, 1 Tag alt) P (-18°C, 1 Tg alt) Fahnen (0,05) F schmal, mittellang, konturiert, parallel F breiter, kurz, bewegt, verwaschen F breiter, kurz, parallel, verwaschen F breiter, sehr kurz, unregelmäßig, verw., dunkel Schalen (0,05 und 0,075) S groß, konturiert, Srand gelöst,, kein grS, keine g.B. S mittelgroß, wenig konturiert, Srand wenig gelöst, wenig grS, g´kein g.B. S kleiner, mittel- konturiert, Srand nicht gelöst, z.T. grS, wenig g.B. S sehr klein, eher verw., Srand nicht gelöst, deutlich grS, keine g.B. Rötliche Ablager- ung (Sockelrand) deutlich wenig nicht nicht Tab 59. Bonitur der in SB-Abb-14-Abkühlung-090401 dargestellten Bilder. Fazit: Die Bilder verändern sich deutlich im Zusammenhang mit der Temperatur, auf die die Probe heruntergekühlt wurde. Der Effekt der Alterung der Probe (24h) ist demgegenüber zu vernachlässigen, auch der Effekt der verschiedenen Bildererstellungstermine ist gering. Zu den Fragen: 1) Ist ein besonders rasches Abkühlen notwendig, um die Probenqualität zu konservieren? Die Geschwindigkeit des Abkühlens ist nicht direkt experimentell erfaßt worden. Jedoch ist die tatsächlich erreichte minimale Temperatur ein gravierender Einfluß auf die Bildausgestaltung, die Alterung der Probe (24h) ist demgegenüber zu vernachlässigen. SB-Methode: Charakterisierung – probenseitige Einflüsse – Temperatur-Effekte 166 2) Macht es einen Unterschied, ob die Kühlung per Eisakkus (-18°C) oder per Kaltwasser (ca. 6°C) stattfindet (ohne dass die Proben dabei gefrieren) ? Die Kühlung per Eisakkus (auf 7°) und die per Wasser (auf 14°) unterscheiden sich dahingehend, dass die wasser-gekühlten Proben nach 24h den gefrorenen Proben ähnlicher ist (kleinere S, wenig g.B.), und die Eis- gekühlten Proben nach 24h den wasser-gekühlten nach 8h ähnlicher sind (größere S). Die Proben waren jedoch unterschiedlich temperiert – somit ist wahrscheinlich, dass die 14°-Probe mehr „gealtert“ ist, die kühler gelagerte weniger. Die Kühlart an sich ist vermutlich zu vernachlässigen, die tatsächlich erreichten End-Temperaturen scheinen von größerer Bedeutung, solange sie innerhalb von 8h erreicht werden. (die Proben nach 8h sind sich sehr ähnlich, gleichgültig ob auf 7° oder 14° gekühlt.) 3) Welchen Einfluß hat die Kühlung an sich auf die Bildmerkmalsausprägung? („kuhwarm = 25°-20°C“ im Vergleich zu „leicht gekühlt = 12°C“ bzw. „stark gekühlt = 7°C“) Die Kühlung an sich hat einen ausgeprägten Einfluß auf die Milchqualität (wenn man davon ausgeht, dass die Bilder die Qualität wiederspiegeln). Es scheint einen Qualitätssprung bei einer Kühlung unter 17° bzw. 14°C zu geben. Danach ergibt sich eine fast kontinuierliche Veränderung der S-größe bis hin zu der eingefrorenen Probe. Mit dieser Kühlungsreihe ist gleichzeitig eine wichtige Referenzreihe für die Qualitätsbeurteilung entstanden –die Referenz der Verdünnungs- und Alterungs-Reihe wird durch diese ergänzt. Zusätzlich: Die in der 2. Phase extrem langsam gestiegenen Bilder der „warmen“ Milch erinnern in ihrem „Verhalten“ und der Merkmalsausprägung an Muttermilch-Steigbilder. SB-Methode: Charakterisierung – probenseitige Einflüsse – Temperatur-Effekte 167 Versuch 2. WIEDERHOLUNG der Abkühlungs-Varianten: Probenhandhabung: 1.4.09: Um 7:40 werden über den Schieber im Melkstand 2,5 Liter melkwarme Milch in einen sauberen Eimer abgefüllt und daraus zwei 1l-Milchflaschen gefüllt. Diese werden in Kissen warm gehalten. Aus jeder Flasche wird direkt nach Abfüllen 100ml in eine kleine, vorgekühlte 100ml-Glasflasche gefüllt und diese zwischen Eisakkus gestellt zum raschen abkühlen. So werden die Proben innerhalb von 30 min. zum Labor transportiert. Dort angekommen sind die gekühlten Proben 12°C kalt, die warmen 26°C. Aus den gekühlten wird jeweils 15 ml in ein 20ml- Glas-Fläschchen gefüllt und nochmals „auf Eis“ gestellt, bis es auf 7°C abgekühlt ist, daraus wird wiederum 5ml entnommen, um es bis auf 0°C abzukühlen. Diese kleinen Mengen sind innerhalb weniger Minuten auf gewünschter Temperatur. Nach Erreichen der Temperatur werden die Proben zur Entnahme auf den Labortisch gestellt. Die eine 7°-Probe wird im Nachhinein nochmals im 60°-Wasserbad auf 37°C erhitzt (unter rühren). Die (doppelten) Proben werden nun gemeinsam verdünnt und in die Kaelin- Schälchen appliziert (die Erhitzungs-Variante ganz zum Schluß, aber alle innerhalb von 10 min). Es werden in zwei Verdünnungsstufen Bilder erstellt. Die Auswertung der Bilder erfolgt nach dem Schema 1) Gruppieren nach Bildmerkmalen 2) Unterschiede beschreiben Ergebnis: (s.a. SB-Abb-14-Abkühlung-090401) 12°C 26°C 7° / 37°C 0°C und 7°C 0,3ml S=4, groß, konturiert F lang, „geerdet“, konturiert, viel Gelb in oberer FZ Srand mittel breit S=3, breit, konturiert F tiefer, schmaler, konturiert, „gehalten“, „geerdet“. Weniger Gelb in FZ. Srand breit S=3, schmal, leicht verwaschen F breit, verlaufend. F-Ansätze hoch. „hochgezogene Schultern“. Kaum Gelb in FZ Srand schmal S=2,5, „weich“, verwaschen bis konturiert F sehr schmal, teils. „hochgezogen“, hoch ansetzend, teilw. ineinander verlaufend. Srand mittelbreit. 0,25ml S=2, mittelbreit GrS dunkel, „hart“ S=1, breit, flach, regelmäßig GrS hell, „weich“ S=1, breit, unregelmäßig S=0,7 – 0,5 GrS eher hell, „weich“. empathisch „schwankend“ zwischen „Umraum bildend“ und „gehalten, auf Innen bezogen“ Harmonisch umhüllt, Umraum bildend. Erstarrt, wieder zur Weite „gezwungen“ (aus Erstarrung heraus wieder geweitet) Starr-unruhig, schreckhaft-hektisch Tab 60. Unterscheidende Bildmerkmale (s.a. SB-Abb-14-Abkühlung-090401) SB-Methode: Charakterisierung – probenseitige Einflüsse – Temperatur-Effekte 168 Daraus kann man ableiten: - die Abkühlungs-Varianten unterscheiden sich voneinander, die Abkühlung hat einen Effekt auf die Bildmerkmals-Ausprägung. - Die Schalen werden mit zunehmender Abkühlung kleiner. Diskussion: Im Vergleich zum Versuch 1 ist festzustellen: Die extremen Bilder von der warmen Variante aus Versuch 1 sind in Versuch 2 nicht wieder anzutreffen. Die warme Milch in V2 läßt „normale“ Bilder entstehen. Daraus muß geschlossen werden, dass die Abkühlung der Milch je nach Probenqualität gravierendere oder geringere Einflüsse auf die Bildmerkmals-Ausprägung hat. Auch gibt es Proben (z.B. Einzeltiere, Hof 3, Hof 4 u.a.), die trotz Kühlung noch Bildmerkmale entstehen lassen, die denen der warmen Probe aus Versuch 1 ähnlich sehen. Die Ursache, warum diese „ungewöhnlichen“ Bilder entstehen, ist noch nicht bekannt. Die Abkühlung hat offensichtlich einen Effekt auf die Bildmerkmals-Ausprägung, jedoch nicht immer in dem extremen Ausmaß wie in V1. SB-Methode: Charakterisierung – probenseitige Einflüsse – Temperatur-Effekte 169 3.4.3.2. Erhitzung / Abkühlung Versuch 3: Fragen: 1) läßt sich die Unterscheidungsfähigkeit der Methode verbessern, indem die Milchproben vorher einer Erhitzung / Abkühlung unterzogen werden? (d.h. ist duch die Temperierung der Probenunterschied vergößerbar? 2) Auf welche Weise wirkt sich eine Temperierung der Milch in den Steigbild-Merkmalen aus? Vermutlich relevante Temperaturen: Die Temperiereung über Körpertemperatur müßte die Eiweiße deutlich schädigen, und ein Abkühlen unter 0°C (gefroren) müßte ebenfalls zu einer Veränderung der stofflichen Komponenten führen (u.a. sensorisch feststellbar). Versuchsaufbau: Am 17.12.07: von zwei einander relativ ähnlichen Milchproben (verschiedene Fütterung) werden jeweils 10ml in einem Glasfläschchen im 80°C-Wasserbad unter rühren erhitzt: innerhalb von 2 min. auf 47°C, und innerhalb von 4,5min. auf 60°C. Die Proben werden im Kühlschrank wieder heruntergekühlt und anschließend werden, gleichzeitig mit den nicht erhitzten Ausgangsproben, Bilder erstellt (in einer Verdünnungsstufe, je zwei Bilder, wobei die Wiederholungsbilder jeweils in R1 und R2 standen). Insgesamt 12 Bilder. Zu vergleichende Variaten von je zwei Milchproben (J-31, J-40): a. unbehandelt b. auf 47°C erhitzt c. auf 60°C erhitzt Am 18.12.07: von denselben Ausgangsproben wie am 17.12.07 werden nochmals je 10ml im Wasserbad auf 60°C erhitzt und diesmal heiß in die Schälchen appliziert, im Vergleich zu den unbehandelten und abgekühlten Proben des Vortages. Außerdem wird von den Ausgangsproben eine Probe im Gefrierschrank (-18°C) eingefroren und an der Luft wieder aufgetaut. An zwei anderen Ausgangsproben derselben Qualität, jedoch zwei Tage älter, wird die Erhitzung auf 60°C wiederholt. Es werden je Variante je ein Bild in drei Verdünnugsstufen erstellt. Zu vergleichende Variaten von je zwei Milchproben (J-31, J-40) (24 Bilder) d. unbehandelt e. auf 60°C erhitzt, heiß pipettiert f. auf 60°C erhitzt, kalt pipettiert (Probe vom 17.12.07) g. auf –18°C abgekühlt, wieder aufgetaut SB-Methode: Charakterisierung – probenseitige Einflüsse – Temperatur-Effekte 170 von zwei anderen Proben (J-13, J-14) (12 Bilder): h. unbehandelt i. auf 60°C erhitzt, heiß pipettiert Auswertungsverfahren: Die Bilder werden je Bildererstellungstag und Proben (J-13 und J-14 zusamen, sowie J-31 und J-40 zusammen) gruppiert und Bildmerkmale beschrieben. Danach werden die Bilder offen (uncodiert) hingelegt und unter Berücksichtigung der Behandlungsvariaten nach Bildmerkmalen gesucht, die im Zusammenhang der Behandlung oder der Probenqualität gesehen werden können. Ergebnisse: Die Gruppierung wurde nach folgenden Gesichtspunkten umgesetzt: J-40, 60°C J-40, 47°C J-31, J-40. J-31, J-40 (unbehandelt) J-31, 47°C J-31, 60°C 1. Merkmal Rötliche Linie Keine rötliche Linie 2. Merkmal F lang F rund, verwaschen „Rest“, relativ ähnlich F lang runter, gebündelt F rund, verwaschen 3. + 4. Merkmal S groß GB=4 S mittel, GB=8 „Rest“, relativ ähnlich S mittelklein GB=6 S =0 GB=8,5 BSp- Bild 2-14 1-2 2-8, 2-7 2-15 2-13 Tab 61. Gruppierung von Bildern von zwei Proben, unterschiedliche Temperierungs- Varianten (Bilder vom 17.12.07). Die mittlere Gruppe weist relativ ähnliche Bilder auf. Die anderen Gruppen lassen sich voneinander unterscheiden (je Gruppe zwei Bilder, nur in der mittleren Gruppe 4 Bilder). Daran wird deutlich, dass die Temperierungs-Varienten zu einer bemerkbaren Bildveränderung führen. Ob die Proben-Unterschiede dadurch vergrößert werden ist noch nicht sicher – denn z.B. die F-Form (oder die gB-Intensität) ist bei der Probe J-31 und 47°C „lang“, bei 60°C „rund und verwaschen“, bei der Probe J-40 dahingegen treten diese Merkmale im Zusammenhang mit der Temperierung genau gegenläufig auf. Die Reihung / Gruppierung der vier Bilder der mittleren Gruppe kann nach zwei Gesichtspunten durchgeführt werden: a) wird nach z.B. der Fahnenzone (Länge bzw. Rundung der Fahnen) gruppiert, so werden die Bilder entsprechend der Reihe, in der sie erstellt wurden, gruppiert (d.h. der Reiheneffekt / Klimaeffekt der Kammer ist deutlich wahrzunehmen, siehe Kapitel „Reiheneffekt"). Wird jeodch auf die Fahnenform und der „Bewegung“, die ihr innewohnt, geschaut, so ergibt sich eine probenspezifische Gruppierung mit folgenden Merkmalen (siehe Tabelle) SB-Methode: Charakterisierung – probenseitige Einflüsse – Temperatur-Effekte 171 J-40 J-31 Fahnen Fahnen schlängelnd-aufsteigend, oben „versprühend“, an den Seiten NICHT gehalten Fahnen unten gebündelt, konzentriert, gerade aufstrebend, seitlich rund umfaßt-gehalten insgesamt „wäßriger“, ungeformter „geformter“ Schalen Schalen größer (tendenziell) Srand breiter Schalen kleiner, kompakter (tendenziell) Srand schmaler Bsp-Bild 2-8 2-7 Tab 62. Probenspezifische Gruppierung nach Merkmalen der Fahnenzone („Bewegung der Fahnenform“) Bemerkung: die Unterschiede in den Bildern, die mit der Probenqualität in Beziehung zu stehen scheinen, werden bei „offener, geordneter“ Betrachtung der Bilder (bei Berüchsichtigung des Reiheneffektes) noch deutlicher. Es muß jedoch angemerkt werden, dass die Probenunterschiede offensichtlich relativ gering sind und die laborspezifischen Effekte bei oberflächlicher Betrachtung nach den „auffälligsten unterscheidenden Merkmalen“ im Vordergrund stehen. A (unbehandelt) B (-18°C) C (+60°C) Probe j-31+ j-40 „unbehandelt“ J-31 + J-40 „-18°C“ J-31 + J-40 “60°C” (heiß und kalt pipettiert) DL DL breit, heller DL sehr breit, heller DL enger, schmaler, dunkler F konturierter F verwaschener F konturierter Fahnen F-Ansätze höher, F-Anzahl mehr F-Ansätze niederiger F-Anzahl weniger Schalen S-rand breiter S-rand schmaler Tab 63. Gruppierung der Bilder von zwei Proben und verschiedenen Temperierungs- Varianten. Bilder vom 18.12.07, s.a. SB-Abb-15-Temperierung-Übersicht-071218 und Tab 66 (Bildmerkmale „Unbehandelt“ und „–18°C“ im Vergleich). Die acht Proben-Varianten lassen sich in drei Gruppen einteilen – wobei die Gruppe „C“ 4 Varianten enthält, die anderen jeweils nur 2. Es zeigt sich, dass die Gruppe A die zwei (gering unterschiedlichen) Probenqualitäten „unbehandelt“ enthält, in Gruppe B sind die zwei Probenqualitäten „-18°C“ zusammengefaßt, und in Gruppe C sind die beiden Probenqualitäten mit beiden 60°C-Varianten zusammengefaßt. Die Gruppierung nach diesen Merkmalen zeigt somit v.a. die Temperierungsvariaten der Milchproben, die offensichtlich deutlicher im Bild zu erkennen sind als die Probenqualitäten. In SB-Abb-15-BBh- Temperierung sind beispielhaft für eine der beiden Proben die vier Behandlungsvarianten wiedergegeben. SB-Methode: Charakterisierung – probenseitige Einflüsse – Temperatur-Effekte 172 Eine weitere Gruppierung der Bilder von Gruppe C kann auf zwei Weisen erfolgen, wobei nach zwei verschiedenen Proben-Merkmalen gruppiert wird: 1) Gruppierung nach offensichtlichen Merkmalen der Fahnen- und Schalenzone 2) Gruppierung nach „anderen Merkmalen“ (u.a. Sockelzone und Form-Charakteristik stark berücksichtigt) Die 1. Herangehensweise führt zu einer Gruppierung nach Behandlungseffekt. Die zweite Herangehensweise führt zu einer Gruppierung nach Probenqualität. (Siehe Tab. unten) Probenmerkmal „heiß“ pipettiert (frisch erhitzt) „kalt“ pipettiert (am Vortag erhitzt) R2 F-Ansatz niedrig F-Anzahl mehr GB brauner F-Ansatz höher F-Anzahl weniger GB grüner Tab 64. Gruppierung nach der Methode 1) (offensichtliche Merkmale) Probenmerkmal J-40 J-31 FZ / SZ F weniger, kürzer S größer F mehr, länger S kleiner Sockel Rötliche Linie DL dunkel, „deftig“, „grob“ Sockel grau-löchrig, bläulich ausgeflockte Bereiche Keine rötliche Linie DL heller, rötlicher, „smart“, „geschmeidig“ Sockel braun-rötlich, füllig Keine bläulichen ausgeflockten Bereiche Charakter, insgesamt Weniger geformt, „verwaschener“ „kahl, schmal, in Auflösung“ Geformter, konturierter „vielfältig, differenziert, gegriffen, gestaltet“ Tab 65. Gruppierung nach Methode 2) (Sockelzone und „Charakter“ der Formen) Im Vergleich der beiden Herangehensweisen zeigt sich, dass sich im Bild verschiedene Dinge auszudrücken vermögen, und es hängt davon ab, auf welche Bildmerkmale geschaut wird, welche Einflußfaktoren bei der Auswertung Berücksichtigung finden. Bei den Gruppen A und B liegt ähnliches vor: es gibt temprierungs-spezifische Bildmerkmale, und gleichzeitig ist die Probenqualität je Temperierungsvariante festzustellen. Ungünstigerweise sind aber nicht spezielle Merkmale für die Probenqualität, andere für die Behandlungsvarinten spezifisch. Z.B. die DL ist bei der 60°C-Behandlung eher probenspezifisch ausgebildet zu finden, bei der „frisch“ und „-18°C“-Varianten jedoch nicht, dafür ist der Behandlungseffekt daran deutlich zu erkennen. D.h.das Merkmal „DL“ reagiert sowohl probenspezifisch, als auch temperierungsspezifisch. SB-Methode: Charakterisierung – probenseitige Einflüsse – Temperatur-Effekte 173 unbehandelt -18°C DL enger DL breiter F weniger, schmaler, heller, differenziert F mehr, breiter, dunkler, undifferenzierter F-Beine konturierter, präzise gestaltet F-Beine verwaschener, „undifferenziert, ungestaltet“ GB weniger, heller GB mehr, dunkler, leicht Steighemmung Srand geschlossen, konturiert Srand unterbrochen, verwaschen (grS) S größer S kleiner Sfüllung heller-grün Sfüllung dunkler-grün F-charakter F sanft, zart, licht-gestaltet, anpassungsfähig, „in die Leichte“ tragend, gestaltend tätig F grob, plump, Formverlust  „Masse“, dunkel, schwer, träge. „in die Schwere“ lastend, Gestalt auflösend. Tab 66. Unterschiede zwischen „unbehandelt“ und „-18°C“ (18.12.07) (siehe auch SB- Abb-15-Temperierung-Übersicht-071218) -j40 j-31 J-40, -18° J-31, -18° S größer Kleiner S werden kleiner. S nicht so viel kleiner S schmaler, kleiner F breiter, größer F verwaschener F konturierter F-Ansätze höher, unregelmäßiger F-Ansätze niederiger, regelmäßiger Rötliche linie Keine rötliche L Sockel gekörnt Sockel rötlich, füllig. Ohne kontur - wäßrig Sanft gefaßt“ Srand gelöst (auch bei 60°C, neu) Srand nicht gelöst (auch bei 60°C, neu) Tab 67. Proben-spezifische Merkmale bei unterschiedlicher Temperierung SB-Methode: Charakterisierung – probenseitige Einflüsse – Temperatur-Effekte 174 Fazit: Bessere Unterscheidbarkeit der Proben durch Temperierung? Eine Temperierung auf 60°C hat einen geringen Effekt auf die Verbesserung der Unterscheidungsfähigkeit der Methode. Die Proben unterscheiden sich nicht viel deutlicher als vorher. Die Temperierung auf –18°C verändert die Proben stärker probenspezifisch und könnte als ein Verfahren genutzt werden, um geringe Probenunterschiede deutlicher zu machen bzw. um zu beobachte, wie sich die Proben bei gleichem „Streß“ unterschiedlich verhalten. Einzelne Bildmerkmale und ihre Veränderung im Zusammehang mit Temperierungs- Verfahren a. DL: durch Erhitzung auf 60°C wird sie enger als bei der Ausgangsprobe (7°C), durch Frost (-18°C) wird sie deutlich breiter, weiter auseinander (v.a. bei gering konzentierten Bildern). Aber auch probenspezifisch kann die DL-Breite variieren. b. S-rand-Breite: Der S-Rand wird durch Erhitung (60°C) schmaler aus bei der Ausgangprobe, bei der er (J-13. j-14) relativ breit war. Bei J-31, J-40 nicht so offensichtlich, aber doch warhnehmbar. Durch Abkühlung: kaum ein Effekt. c. S-Größe: durch Abkühung auf im Extremfall –18°C werden die S kleiner, und mit dunklerer grüner Füllung. Ebenfalls durch Erhitzung auf 60°C d. GB-intensität: nimmt duch Erhitzung und Frost leicht zu (Tendenz zu Steighemmung vermehrt) e. Fahnen: heiß pipettiert sind die F-Ansätze der Proben J-31 und J-40 am 18.12.07 sehr niederig. (bei J-13 und J-14 nicht.). Frost oder Erhitzung führen zu größeren, breiteren Fahnen, die weniger konturiert sind als die der Ausgangsprobe (v.a. bei stark konzentrierten Bildern) f. Rötliche Linie: bei Erhitzung auf 60° (nicht auf 47°) deutlich mehr als bei unbehalndelt. Bei Frost nicht verstärkt, eher verringert. SB-Methode: Charakterisierung – probenseitige Einflüsse – Temperatur-Effekte 175 3.4.3.3. Erhitzung auf 100°C (kochen) Problem / Situation: Von Möhren und Biokristallisations-Untersuchungen ist bekannt, dass die Proben (bio / konventionell) unterschiedlich auf eine Erhitzung (mit Mikrowelle) reagieren: die einen Proben verändern deutlich ihre Bildmerkmals-Ausprägung, die anderen nicht so stark. Somit kann ein zusätzliches Probenmerkmal erfaßt werden (Reaktion der Probe auf Erhitzung). Ob dies bei Milch ebenso gilt soll geprüft werden. Außerdem wird die Probe durch die Erhitzung einem „Streß“ ausgesetzt – und es können auf diese Weise Referenz-qualitäten definierter Herstellungsweise erzeugt werden, mit denen Bilder andere Proben verglichen werden können („Referenz-Material“ zur Qualitäts-Charakterisierung). Frage: 1) Wie verändern sich die Steigbild-Bildmerkmale, wenn die Milch (mit der Mikrowelle) bis zum Kochen erhitzt wird? 2) Werden die Probenunterschiede dadurch evtl. größer? / reagieren die Proben unterschiedlich auf diese Behandlung? Versuchsaufbau: Zwei frische Rohmilchproben (von zwei Höfen, LW und DFH) werden in 100ml- Glasflaschen zusammen in eine Mikrowelle gestellt und für 1min und 3 min. bei 750W erhitzt, bis sie kochen. Danach werden die Proben im Kühlschrank für 2h abgekühlt und anschließend Bilder erstellt, parallel mit den frischen Ausgangsproben. Am 16.4.08 werden jeweils in drei Verdünnungsstufen Bilder erstellt. am 17.4. wird der Versuch mit frischen Proben wiederholt, jedoch nur in einer Verdünnungsstufe und je zwei Bildern. Auswertung: Die Bilder werden je Bildererstellungstag allesamt gemischt und gruppiert / gereiht, um die Unterscheidbarkeit und Ähnlichkeit von Bildern zu ermitteln. Anschließend werden die Bilder geordnet (offen) hingelegt und nach Bildmerkmalen charakterisiert, um die Merkmalsveränderung durch die Erhitzung zu erfassen (allgemein, probenunabhängig). SB-Methode: Charakterisierung – probenseitige Einflüsse – Temperatur-Effekte 176 Ergebnis: Die Bilder gleicher Probe bzw gleicher Verdünnungsstufe lassen sich an beiden Tagen jeweils gruppieren, und deutlich von den anderen unterscheiden. Die Reihung am 16.4. war folgende: a) Bilder mit breiter Doppellinie: DFH, Mikrowelle, 0,1ml LW, Mikrowelle, 0,1ml DFH, Mikrowelle, 0,08 und 0,075ml LW, Mikrowelle, 0,08 und 0,075ml b) Bilder mit schmaler Doppellinie: LW, frisch, 0,08ml DFH, frisch, 0,08ml LW, frisch, 0,075ml DFH, frisch, 0,075ml Die Proben „LW“ und „DFH“ (frisch) lassen sich mit folgenden Merkmalen unterscheiden: LW DFH S kleiner, flacher, konturierter S größer, tiefer, verwaschener Srand konturiert, kein grS GrS, Srand leicht verwaschen F heller, kleiner, schmaler F dunkler, farbintensicher, größer, breiter Tab 68. Unterscheidende Bildmerkmale Die Unterschiede je Probe zur erhitzten Variante können wie folgt beschrieben werden: (Bilder dazu siehe SB-Abb-16-Mikrowelle-Uebersicht). LW, erhitzt LW, frisch DFH, erhitzt DFH, frisch 0,1ml Sockel flach, „überstiegen“, Srand gelöst, S formlos, chaotisch / (Theoretisch: gB=9, keine S, Steighemmung. Stark üßberstiegen, chaotisch (zu spät nach 2. Phase aufgedeckelt) / 0,08 S=7, rund, hell, zart, Srand verw. GB=0 F lang, schmal, parallel-starr DL breit Rötliche Linie S=3, flach, Srand konturiert GB=7 F mittellang, eher breit DL schmaler Keine rötl. Linie SZ verw., chaotisch, Srand gelöst GB=0 F schmal DL breit Rötliche Linie SZ gut konturiert, Srand leicht verw. GB=6 F breit DL schmal Keine rötl. Linie 0,075 S=3,5, rund, regelmäßig, Srand breit, berwaschen, grS GB=0 F schmal, lang, parallel, konturiert, starr DL breit S=4, eher flach, spitzig, unregelm. Srand schmaler, konturiert GB=1 F breit, beweglich, lang, eher weich- unkonturiert DL eng, schmal S=4,5, rund, verwaschen, Srand gelöst, grS GB=0 F schmal, parallel, konturiert, hart-starr DL breit S=6, konturierter, Srand leicht verw., Srand nicht gelöst GB=1 F breit, beweglich, weich-unkonturiert DL eng, schmal Tab 69. Einfluß der Erhitzung der Proben (per Mikrowelle) auf die Bildmerkmals- Ausprägung von zwei Milchproben. Die Wiederholung des Experimentes am folgenden Tag mit frischen Proben ergab sehr ähnliche Bilder, was als Bestätigung der Ergebnisse gesehen werden kann. SB-Methode: Charakterisierung – probenseitige Einflüsse – Temperatur-Effekte 177 Fazit Zu Frage 1: Die Erhitzung der Milch (per Mikrowelle) führte zu einer Veränderung der Bilder im Vergleich zu frischer Milch, die wie folgt beschrieben werden kann (im Überblick aller Bilder, die zu dieser Fragestellung erstellt wurden): In der Fahnenzone: Die Fahnen werden viel schmaler, paralleler, die F-Beine sind weniger intensiv ausgebildet / viel heller. Die Fahnen erscheinen vom Charakter her „starr gehalten, versteift, erstarrt“. In der Schalenzone: Die Schalen werden rund, mit „weichen“ Formen, und nehmen eine „mittlere Größe“ an – je nach Verdünnungsstufe und Größe in den Bilder der „frischen“ Milch werden sie größer bzw. kleiner. Außerdem nimmt die Kontur / die klare Differenzierung der einzelnen Schalen-Bereiche und des Schalenrandes ab, der Bereich scheint „in Auflösung“ zu sein, „löchrig“ zu werden. Der Srand wird breiter und verwaschener, bis zur Bildung von grauen Schleiern unter dem S-rand. Die S-füllung wird breiter, verwaschener, der weiße Streifen in der S wird schmaler / verschwindet. Der Srand löst sich z.T. von den Schalen. Bei zu hoher Konzentrationsstufe wird die SZ sehr hoch (2cm und mehr), chaotisch, „überstiegen“ (wie bei nach der 2. Phase zu spät aufgedeckelten Bildern). In der Sockelzone: Die obere Doppellinie des Sockels wird viel breiter und heller, der gesamte Sockelbereich ist heller (auch der dunklere Streifen am oberen Sockelbereich). Unten bildet sich meist eine rötlich-braune Linie. Bei hoher Konzentrationsstufe ist der Sockel insgesamt relativ flach (gefolgt von einer viel zu breiten, „überstiegenen“ SZ). Zu Frage 2: Die Probenunterschiede wurden durch die Erhitzung nicht deutlicher. SB-Methode: Charakterisierung – probenseitige Effekte – Fettgehalt der Probe 178 3.4.4. Faktor 4: Fettgehalt der Probe, Rahm vs. entrahmte Milch Problem: Parallel zu den Steigbild-Untersuchungen werden auch Fettsäure-Muster-Analysen durchgeführt, mit dem Ziel, über die Fettsäuren einen Hinweis zur Qualitätsbeurteilung der Milchproben zu erhalten. Es ist jedoch fragwürdig, ob mit den Steigbildern genau dieser Aspekt der „Fettqualität“ auch erfaßt wird, ob sich also Eigenschaften des Fettes (des Rahmes) in den Steigbildern wiederspiegeln könnne, oder nicht. Außerdem ist es von Interesse, ob sich Proben z.B. besser voneinander unterscheiden lassen, wenn nur die fettarme Milch oder alleinig der Rahm untersucht wird. Frage: 1) Lassen sich Bilder von Milchproben besser unterscheiden, wenn nur ein Teil der gesamten Milch (der Rahm = Sahne, aufgerahmte Fettkügelchen oder die „fettfreie“, entrahmte Milch = Milchplasma) zur Bildererstellung verwendet wird? 2) Inwiefern unterscheiden sich die Bilder von einzelnen Milchkomponenten im Vergleich zur gesamten Milch (Rohmilch)? Versuchsdesign: Es wird von verschiedenen Proben sowohl die gesamte Milch (Rohmilch) als auch der sich auf der Milch oben absetztende Rahm (Fett, Sahne) oder die sich darunter befindende Milch (entrahmte Milch, Milchplasma) verwendet und Steigbilder erstellt. Es wurde jeweils eine doppelte Probenentnahme bzw. Proben-Aufbereitung durchgeführt. Zu Frage 1): Ist die Unterscheidbarkeit verbessert bei der Verwendung einzelner Milch- Fragmente? Der Vergleich von Rahm (Sahne), entrahmter Milch und Frischmilch (Rohmilch) bei gleicher Konzentrationsstufe und von zwei verschiedenen Betrieben führt zu folgendem Ergebnis (SB-Abb-17-Fett-Milch-Mserum): Die Bilder der entrahmten Milch weisen eine große Streuung auf. Die Bonitur (Tab 70) bezieht sich auf den „Mittelwert“ der beiden Bilder, wobei das in der Abbildung (SB-Abb- 17-Fett-Milch-Mserum) jeweils linke, größere Bild als „beispielhaft“ ausgewählt wurde. Das andere Bild ist als „Ausreißer“ oder „Fehler-Bild“ zu bezeichnen. Hof LW Hof D Rahm GB=0 S=0,5 (sehr klein) GB=0 S=0,6 (sehr klein) Entrahmte Milch GB=1 – 2 S=3,5 Srand schmal, konturiert GB=1 S=4 Srand relativ breit, mittel-konturiert Rohmilch GB=1 – 2 S=4,5 Srand schmal, konturiert F schmal, hell GB=1 S=4,5 Srand breit, weich-verwaschen F breit, dunkel Tab 70. Unterschiede in den Bildmerkmalen von Rahm / entrahmte Milch / Rohmilch SB-Methode: Charakterisierung – probenseitige Effekte – Fettgehalt der Probe 179 (je Bild 0,075ml Substanz. Bilder vom 18.4.08, Proben 2 Tage gealtert) Diskussion zu obigen Bildern Mögliche Ursache der „Ausreißer-Bilder“: Die zwei „Ausreißer-Bilder“ können mit der Proben-Entnahme zusammenhängen: Bei der Entnahme der entrahmten Milch wird mit der Pipettenspitze durch die Sahneschicht hindurchgestochen und die danach am Rand haftende Sahne mit einem Papiertuch entfernt. Bei der Entnahme für Bild 3-12 (Hof LW) ist zusätzlich zu der entrahmten Milch beim Herausnehmen der Pipette etwas Sahne in die Pipettenspitze gelagt. Evtl. war die Spitze durch einen größeren Partikel erst zugesetzt und bei Erreichen der Sahneschicht war der Druckunterschied zur Umgebung so stark, dass er mitsamt der (vermutlich unteren) Sahneschicht eingesaugt wurde. In der Spitze der Pipette war auf jeden Fall deutlich etwas (gelbliche) Sahne neben der weißen Milchfraktion zu erkennen. Das Bild wies weniger g.B. auf, größere S mit verwaschenerem S-Rand. Am unteren Sockelrand ist eine braun-rötliche zackige Linie, der obere Sockelrand ist heller und etwas geschwungen (nicht ganz gerade), die Fahnen sind heller und setzen höher an. Bei Hof D war beim Entnehmen der Probe keine Sahne-Kontamination der Probe in der Pipettenspitze visuell zu erkennen, kann aber trotzdem unbemerkt vorgelegen haben. Das Bild war in den Merkmalen „g.B.-Intensität“ (g.B.=2, deutlich mehr als im Vergleichsbild), „Fahnenfarbe“ (Fahnen heller), „obere Sockellinie“ (verläuft etwas schräg), und“rötliche Linie“ (im untern Sockelbereich ist eine zarte, eher graue dünne zackige Linie zu erahnen) verändert. Auffällig ist, dass das sonst gut reproduzierbare Merkmal „rötliche Linie“ (und damit zusammenhängende große, unkonturierte S mit wenig g.B. und ungleichmäßiger Sockelhöhe) in dem einen Bild auftritt, im anderen nicht. Es kann evtl. mit der Sahnekontamination der Probe zusammenhängen. Bildmerkmalsentwicklung Die Milchfraktionen „Rahm“ und „entrahmte Milch“ unterscheiden sich bei gleicher Verdünnungsstufe deutlich: der Rahm führt zu Bildern mit sehr kleinen Schalen (Merkmal von gering-konzentrierten Bildern), die entrahmte Milch zu „optimalen7“, milchtypischen Bildern, die den Rohmilch-Bildern sehr ähnlich sehen. Die Proben der beiden Höfe lassen sich unabhängig von der Milchfraktion voneinander unterscheiden. Die Bilder vom Hof LW haben z.B. einen schmaleren Srand als 7 Als „optimale“ Bilder werden solche bezeichnet, bei denen sowohl die Schalenzone als auch die Fahnenzone möglichst vielfältige, eher große Bildmerkmale (Schalen, g.B. und Fahnen) aufweist, denn dann sind die probenspezifischen Merkmale meistens am besten im Vergleich zu anderen Proben zu erkennen. SB-Methode: Charakterisierung – probenseitige Effekte – Fettgehalt der Probe 180 die von Hof D, und schmalere, hellere Fahnen. Die Unterscheidbarkeit bei den Rahm-Bildern ist jedoch relativ schwierig, da aufgrund der Konzentrationsstufe nicht „optimale“ Bilder vorliegen. Daraus ergibt sich die Frage: wie entwickeln sich die Bildmerkmale von Rahm (Sahne) im Vergleich zu Milch / entrahmter Milch bei verschiedener Konzentrationsstufe? Dazu sollen die Bilder unter „Zu Frage 2“ (s.u.) verwendet werden. An weiteren Proben läßt sich zeigen, dass z.T. bei den Rohmilch-Bildern, z.T. aber auch bei den Rahm-Bildern die Unterscheidbarkeit besser möglich ist: 1) Bilder vom 25.9.08, Hof 10 und Hof 6: Rahm bei 2617 / 12 / 19 / 15: keine Unterschiede in Rahm-Bildern, aber in Milch-Bildern deutlich. Rahm bei 2620 / 14 / 21 / 18: deutliche Unterschiede im Rahm, in den Milch-Bildern kaum Unterschiede. D.h. der Rahm ist im Milchbild irrelevant. (s.a. Rahmbild vs. Milchbild) 2) Hof 1, Bilder vom 20.8. 08 - Extra-Bilder: Merkmale der Rahm-Bilder (g.B.- Intensität) sind invers zu den Milch-Bildern. 3) Bei Hof 7, Bilder vom 5.7.08, tritt derselbe Fall auf wie bei Hof 1, hier mit dem Merkmal „S-Größe“: die eine Probe hat im Rahm größere S, in der Rohmilch kleinere als die andere Probe. Zu Frage 2): Es wird der Vergleich von Rahm mit Rohmilch sowie weiter unten von entrahmter Milch mit Rohmilch bei verschiedenen Verdünnungsstufen vorgenommen. 3.4.4.1. Rahm vs. Rohmilch Der Vergleich von Rahm mit Rohmilch (Rahm mit Milch) am Beispiel von Probe 2977 (Wirtschaftsstile – Nov08) führt zu folgendem Ergebnis: Die größten Unterschiede sind in der Intensität der g.B. bzw. der Größe der Schalen zu sehen (die auch Merkmale von Konzentrationseffekten sind) (siehe Tabelle und SB-Abb- 18-Fett-Milch-FfM). SB-Methode: Charakterisierung – probenseitige Effekte – Fettgehalt der Probe 181 Tropfenzone Rahm-Bilder Milch-Bilder T-1 Deutlichkeit: 1. mittel 2. deutlich 1. deutlich 2. deutlich T-2 Konturen: 1. konturiert 2. konturiert 1. konturiert 2. konturiert T-3 Länge: 1. breiter, mittellang 2. breiter, mittellang 1. schmaler, mittellang 2. schmaler, mittellang T-4 Die dritte Steiglinie: -- (keine Unterschiede) -- Fahnenzone F-1 Parallelität: 1. wenig parallel 2. mittel parallel 1. deutlich parallel 2. sehr deutlich parall. F-2 Länge: 1. eher kurz, breit 2. mittellang, mittelbreit 1. mittellang, mittelbreit 2. eher kurz, schmal F-3 Auflösung / Kontur: 1. mittel 2. mittel 1. mittel 2. konturiert F-4 Kontrast: 1. mehr, alles dunkler 2. mehr, alles dunkler 1. weniger, alles heller 2. weniger, alles heller F-5 Beweglichkeit: 1. stark beweglich 2. etwas beweglich 1. eher starr, etwas beweglich 2. etwas ungeordnet F-6 Breite: 1. breit 2. mittelbreit 1. mittelschmal 2. schmal F-7 Reduktionsflecken: -- -- F-8 Kranz unter Fahnen: 1. Kranz 2. Kein Kranz 1. wenig Kranz 2. viel Kranz Sonstiges 1 + 2 F dunkler, farbintensiver, breiter 1 + 2 F heller, schmaler, zarter Schalenzone S-1 Geschlossenheit: 1. Srand weniger geschlossen, mittelbreit 2. Srand verwaschen, breit 1. Srand geschlossen, mittelbreit 2. Srand konturiert, sehr breit S-2 Kontrast: 1. stark 2. schwach 1. stark 2. mittel S-3 Regelmäßigkeit: 1. regelmäßig 2. regelmäßig 1. regelmäßig 2. regelmäßig S-4 Dichte / Dichtigkeit: 1. eher locker 2. locker 1. dicht 2. mitteldicht S-5 Füllung der Schalen: 1 + 2 Heller, mit weißer Linie 1 + 2 Dunkler, kaum weiße Linie S-6 Farben: 1 + 2 Hellgrüne S-Füllung 1 + 2 Wenig hellgrüne S-Füllung S-7 Formen: 1. konturiert gefüllt, vielfältig 2. konturiert gefüllt 1. etwas verwaschen gefüllt, vielfältig 2. eher unkonturiert gefüllt S-8 Übergangsbereich: 1. mittelwenig farbintensive g.B. 2. keine g.B., Srand als grauer Schleier 1. sehr viele mitteldunkle g.B. 2. kaum mitteldunkle g.B., sehr breiter Srand eher konturiert, noch kein grS Basiszone B-1 Anzahl der Schichten: 4 4 B-2 Farben: -- -- B-3 Bart: 1. dunkler, schmaler 2. dunkler, schmaler 1. heller, breiter 2. heller, breiter B-4 Kranz: B-5 Höhe der Basiszone: 1. flacher 2. flacher 1. höher 2. höher B-6 Doppellinie: 1. dunkel, mittelbreit 2. hell, mittelbreit 1. dunkel, mittelbreit 2. hell, breit Tab 71. Bonitur von Rahm- und Milch-Bildern verschiedener Konzentrationsstufen (1 = 0,075 ml Probe je Bild, 2 = 0,05 ml Probe je Bild) SB-Methode: Charakterisierung – probenseitige Effekte – Fettgehalt der Probe 182 3.4.4.2. Entrahmte Milch vs. Rohmilch Der Vergleich von entrahmter Bild mit Rohmilch (am Beispiel der gedoppelten Probe 2008 +2005, jeweils drei Verdünnungsstufen) führte zu folgendem Ergebnis (SB-Abb-19- EntrahmteMilch-Milch, s.a.Tab 72): Die Varianten unterscheiden sich dahingehend, dass die entrahmte Milch Bilder aufweist, die wie etwas höher konzentriert wirken als die der „gesamt-Milch“. Der Sockel ist etwas dunkler-braun (mit rötlich-brauner Linie), die g.B.-Intensität ist erhöht, und die S sind größer (v.a. bei 0,05ml Milch-Bildern). Es tritt eher ein grS auf als bei der gesamt-Milch. Es ist bei der Farbintensität der g.B. (und fehlender grS) bei der Gesamt-Milch zu bedenken, dass der Rahm wahrscheinlich schon sauer war (Bilder milch-untypisch) und sich das auch in der Gesamt-Milch bemerkbar macht. Bei anderen Vergleichen von fettfreier Milch mit Gesamt-Milch ist die Ähnlichkeit der Bilder (bei Berücksichtigung der „Konzentrationseffektes“) beachtlich. Diese Bilder wurden beipeilhaft gewählt, weil hier mehrere Konzentrationsstufen zur Verfügung standen. Tropfenzone Bilder entrahmter Milch Milch-Bilder T-1 Deutlichkeit: 1. mittel 2. mittel 3. undeutlich 1. deutlich 2. deutlich 3. deutlich T-2 Konturen: 1. konturiert 2. konturiert 3. mittel konturiert 1. konturiert 2. konturiert 3. konturiert T-3 Länge: 1. sehr breit, rund 2. mittelbreit, eher kurz 3. schmal, mittellang 1. mittelschmal, eher lang 2. mittelbreit, eher kurz 3. schmal, mittellang T-4 Die dritte Steiglinie: -- (keine Unterschiede) -- Fahnenzone F-1 Parallelität: 1. mittel parallel 2. ziemlich parallel 3. parallel 1. parallel 2. parallel 3. in Auflösung F-2 Länge: 1. mittellang 2. lang 3. mittellang 1. lang 2. eher kurz 3. kurz F-3 Auflösung / Kontur: 1. unkonturiert, in Auflösung 2. konturiert 3. mittel konturiert, zerlaufend 1. konturiert 2. mittel konturiert, anfänglich zerlaufend 3. zerlaufend, unkont. F-4 Kontrast: 1. eher gering 2. gut 3. mittel 1. gut 2. mittel 3. gering F-5 Beweglichkeit: 1. beweglich 2. sanft beweglich 3. etwas starr 1. eher starr, etwas beweglich 2. eher starr 3. etwas ungeordnet F-6 Breite: 1. breit 2. mittelbreit 3. mittelbreit 1. mittelbreit 2. mittelschmal 3. mittelschmal, verschmelzend F-7 Reduktionsflecken: -- -- F-8 Kranz unter Fahnen: 1. Kranz 2. Kein Kranz 3. Kein Kranz 1. wenig Kranz 2. wenig Kranz 3. kein Kranz Sonstiges SB-Methode: Charakterisierung – probenseitige Effekte – Fettgehalt der Probe 183 Schalenzone S-1 Geschlossenheit: 1. eher geschlossen, von vielen g.B. durchbrochen 2. geschlossen 3. nach unten geöffnet (Rand unkonturiert) 1. konturiert, geschlossen 2. anfänglich unkonturiert 3. ohne Abschluß / Kontur S-2 Kontrast: 1. stark 2. mittel 3. schwach 1. stark 2. mittel 3. stark S-3 Regelmäßigkeit: 1. unregelmäßig 2. regelmäßig 3. regelmäßig 1. unregelmäßig 2. regelmäßig 3. regelmäßig-monoton S-4 Dichte / Dichtigkeit: 1. dicht 2. eher locker 3. locker 1. mitteldicht 2. locker 3. fast aufgelöst S-5 Füllung der Schalen: 1. farbintensiv, konturiert, mit weißer Linie 2. konturiert, farbintensiv, mit weißer Linie 3. fast keine Füllung, eher braunes Band, etwas weiße Linie 1. konturiert, helle Farben, mit weißer Linie 2. leicht verwaschen, mit etwas weißer L. 3. braunes Band statt S-Füllung, ohne weiße Linie S-6 Farben: Hellbraun-ocker und weiß-dominiert Hellbraun-ocker und weiß-dominiert S-7 Formen: 1. scharf konturiert, sehr flach und breit. 2. Recht flach, gut konturiert, mittelklein 3. Verwaschen, klein, flach 1. mittelgroß, eher tief, gut konturiert, rund 2. mittelklein, verwaschen, rund 3. sehr flach, sehr klein – ohne Füllung, nur braunes Band S-8 Übergangsbereich: 1. viele mittel-farbintensive g.B. 2. einige eher farbintensive g.B., Kontrast zu hellbraunem Umfeld 3. keine g.B., Srand als grauer Schleier (nach unten verwaschen) 1. mittelviele sehr farbintensive g.B. (leicht lila) vor hellem Umfeld 2. keine g.B., hellbraunes Umfeld leer. 3. Keine g.B., fast kein grS, aber auch kein konturierter Srand Basiszone B-1 Anzahl der Schichten: 6 5 (dunkelbraun 4 B-2 Farben: 1. Rötlich-braune Linie am unteren Rand, darüber weißliche Bande 2. hell-weißliche Bande unten 3. breiter heller Bereich unten 1. rosa-gelber Streifen unten (schmal) 2. rosa-gelber Streifen (schmal) 3. rosa-gelber Streifen (schmal) B-3 Bart: 1. dunkel, braun 2. mitteldunkel, grau-braun 3. hellgrau 1. dunkel, braun, schmaler als links 2. mitteldunkel, eher braun als grau, schmaler 3. hellgrau B-4 Kranz: B-5 Höhe der Basiszone: 1. flacher 2. normal 3. normal 1. normal 2. flacher 3. normal B-6 Doppellinie: 1. sehr dunkel, eng (1 Linie) 2. grau-dunkel, eng (1 Linie) 3. helles dunkelbraun, mittelbreit 1. dunkel, gelber, leicht breiter 2. mitteldunkel, anfänglich doppelt 3. wie links, etwas enger Tab 72. Bonitur von Rohmilchbildern und Bilder von entrahmter Milch. (Entrahmte Milch: 1)=0,1ml 2)= 0,75ml 3)=0,05ml, Rohmilch (gesamte Milch): 1)=0,075ml 2)=0,06ml 3)=0,05ml. Zum Vergleich eignen sich v.a. die in beiden Varianten angefertigten Verdünnungen 0,05ml und 0,075ml. Die anderen beiden Bilder sind zur Verdeutlichung der Bildentwicklung innerhalb der Variante bei unterschiedlichen Konzentrationen gedacht (Konzentrationseffekt).) Bei weiteren Proben (z.B. Hof 9, Hof 3) konnte der „typische Verdünnungseffekt“ bei Rahm im Vergleich zu Milch auch beobachtet werden, es liegen keine gegenteiligen Beobachtungen vor. SB-Methode: Charakterisierung – probenseitige Effekte – Fettgehalt der Probe 184 Diskussion Es ist sehr interessant, dass sowohl in der Rahm-Fraktion als auch in der Milchplasma-Fraktion (entrahmte Milch) vergleichbare Bildmerkmalsausbildungen zu beobachten sind - in der Rahmfraktion jedoch erscheinen die Bildmerkmale wie bei geringer konzentrierten Proben kleiner als in der Milchplasma-Fraktion, welche Bilder entstehen lässt, die wie stärker konzentriert erscheinen. Es kann die naheliegende Vermutung entstehen, dass die Bildmerkmalsausbildung im Zusammenhang mit gewissen Substanzen stehen könnte. Es gibt jedoch hierzu fast keine Untersuchungen – und selbst bei diesen bleibt es ungewiss, ob die Substanzen oder andere Eigenschaften der Probenzusätze die Bildmerkmalsveränderung hervorrufen (GEIER 2008, Untersuchungen zur Vitaminierung). Sollte es sich tatsächlich um analytisch erfassbare Substanzen handeln, so müßte es sich theoretisch um wasserlösliche Substanzen handeln oder zumindest um solche, die sich durch die Poren des Filterpapiers bewegen können, somit kleiner sind als diese. Das reine Fett ist bei den Rahmbildern deutlich am unteren Sockelrand konzentriert (bei Auflegen der Bilder auf eine Glasscheibe verbleibt anschließend ein Fett-Streifen auf der Scheibe an der Stelle des untersten Randes des Steigbildes, der ca. 1,5mm breit ist). Dies kann dazu führen, dass die Poren verstopfen und ein Nachsteigen der restlichen Probenflüssigkeit verringert wird, so dass deshalb die Bildmerkmale wie „gering konzentriert“ erscheinen. Es kann nicht von einer direkten Bildmerkmals-Ausprägung aufgrund des Fettes gesprochen werden. Steigbilder von reinem Öl (z.B. Massageöl, Speiseöl) weisen keine Formgestalten im Bild auf – das Bild ist den Wasser-Bildern sehr ähnlich. Bei Milch sind bis auf Konzentrationsunterschiede keine nennenwerten Bildmerkmalsvariationen zwischen fettarmem Milchplasma (ca. 0,06% Fett) und sehr fettreichem Rahm (über 30% Fett) zu beobachten. D.h., je mehr Fett in der verwendeten Substanzmenge, desto weniger „bildgestaltende“ Eigenschaften sind wahrzunehmen, die Bilder erscheinen unterkonzentriert. Fazit: Die Bilder der entrahmten Milch und die des Rahms sind den normalen Milchbildern sehr ähnlich – mit dem einzigen Unterschied des Konzentrationseffektes. Es treten „milchtypische“ Bilder mit Fahnen und Schalen mit grünen Bereichen auf. Grundsätzlich kann gesagt werden, dass der Rahm in einer höheren Konzentration verwendet werden muß als die Milch, und die entrahmte Milch in einer etwas geringeren Konzentration als die Milch (Rohmilch), um aussagefähige / einander ähnliche Bilder zu erhalten. Bei genauem Betrachten der Bilder unterschiedlicher Probenherkunft (Ergebnisse nicht alle gezeigt) wird deutlich, dass bei den einen Proben dieser „Unterschied“ zwischen den Bildern von Fett und Milch geringer ist als bei den anderen. Bei einigen Proben ist die Unterscheidbarkeit erhöht, wenn das Fett im Vergleich zu der Gesamtmilch untersucht wird, bei anderen nicht oder gar verringert. Ähnlich ist es bei der entrahmten Milch. Insofern kann gesagt werden, dass sich im Fett bzw. in der entrahmten Milch z.T. ein einzelner Aspekt der Milchprobe deutlicher zeigt als in der Milch-gesamt-Probe, z.T. aber auch nicht. Womit das im Zusammenhang stehen könnte ist nicht geklärt. SB-Methode: Charakterisierung – probenseitige Effekte – kuhseitige Effekte 185 3.4.5. Faktor 5: Laktationsstadium, Milchleistung, Individualität... Es kann vermutet werden, dass sich eine Reihe von Faktoren auch deutlich im Steigbild auswirken müßten, wie sie sich auch in der Veränderung der stofflichen Zusammensetzung zeigen. Dazu gehört z.B. das Laktationsstadium, das Alter der Tiere, die Milchleistung, oder ganz allgemein die Tier-Individualität (s.a. GEIER 2004). Im Rahmen der Diplomarbeit von WOHLERS wurde der Vergleich von „Anfang Laktation“ zu „Ende Laktation“ an Poolproben dargestellt, und es konnten Unterschiede gefunden werden. Eine im Rahmen dieser Untersuchungen erstellte Poolproben-Untersuchung zum Faktor „Alter“ konnte auch Unterschiede aufzeigen. Wenn man jedoch in die Ebene der tierindividuellen Untersuchung geht, wird deutlich, dass jedes Tier sehr „eigene“, individuelle Bildmerkmals-Ausprägungen aufweist, wenn von dessen Milch Bilder erstellt werden (siehe z.B. Hof 1 oder Hof 6, Einzeltier-Untersuchungen, im Anhang C). Die Merkmale, die als erstes offensichtlich die Gruppenunterschiede ausmachen (z.B. Schalengröße, g.B.-Intensität), sind auf der Einzeltierebene nicht immer offensichtlich. Andere Faktoren überlagen die „Gruppen- Merkmale“ deutlich. So kann zwar der Gruppen-„Mittelwert“ als Pool-Probe kleine Schalen haben, aber einzelne Tiere in der Gruppe können z.B. sehr große Schalen aufweisen, so dass nicht jedes einzelne Tier mit den ermittelten Merkmalen klassifiziert werden kann. Am Beipiel von Hof 1 (Kapitel 3.4.1.1) oder auch an verschieden zusammengestellten Poolproben (Hof 5 - Ergebnisse im Anhang C) oder vom Fütterungssystemvergleich C (gepaartes Misch vs. Maximal-Misch, Ergebnisse s.u.) läßt sich der Einzeltiereffekt in den Bildern darstellen. Bei den Bildern vom Fütterungssystemvergleich C sind die Silage-Bilder (4. PrN, 23.3.08) der gepaarten Mischprobe mit auffällig langen F – beim Maximal-Misch ist dieses jedoch nicht mehr so – die Bilder dieser Proben sind sich sehr ähnlich, mit Tendenz zur Wiesenheu-Probe mit langen F. Die Ursache liegt darin, dass im Maximal-Misch der Silage- Probe Lilo, Omega (und Ulrike) als zusätzliche Tiere beigemischt wurden – erstere beide haben sehr kleine S und keine gB, aber eine hohe Milchleistung – somit wird dieser Effekt in der Mischprobe (Pool proportional zur Milchleistung) deutlich, indem auch dort die S kleiner werden, die F kürzer. Die Wiesenheu-Probe hingegen wird im Maximal-Misch durch zwei Kühe (Bonni und Valencia) ergänzt, die relativ viele gB und große S haben – somit zeigt sich das auch im Misch. Daraus kann der starke Einzeltiereffekt auf das Bild der Poolprobe abgelesen werden – und die Relativität z.B. des Merkmals Fahnenlänge oder Schalengröße bezüglich der Fütterungsvariante wird deutlich, aber auch der grundsätzliche Einzeltiereffekt in den Poolproben-Bildern ist offensichtlich. SB-Methode: Charakterisierung – Fazit 186 3.5. Fazit aus den Untersuchungen zur Charakterisierung: Einflußintensität der verschiedenen Effekte auf die Bildmerkmals-Ausprägung (Zusammenfassung) In den Untersuchungen zur Charakterisierung der Steigbildmethode für Milchproben wurde geprüft, inwieweit einzelne Faktoren einen Effekt auf die Bildmerkmals-Ausprägung haben. Hier soll eine Zusammenfassung der Ergebnisse wiedergegeben werden (siehe Tabelle unten), ergänzt durch eine Beurteilung der Bedeutung des Faktors. Wirkt sich der Faktor besonders stark auf die Bildmerkmals-Ausprägung aus, sind also bei leichten Faktor- Variationen deutliche Bildmerkmals-Veränderungen festzustellen, so besteht ein starker Einfluß dieses Faktors auf die Bildmerkmals-Ausprägung (markiert mit +++) Kapitel Faktor: Einfluß- Intensität * Laborprozess-verursachte Effekte 3.3.1 Faktor 1: Konzentrationsstufe / Verdünnungsstufe +++ Faktor 2: Klima Experimentell gezielt variiert –Temperatur Luftfeuchte ++ ++ Standort-Effekte (Reihe, Tisch) ++ Deckelglas-Klima ++ Standard-Auswertung (Temp. und Luftfeuchte – Labor) ++ Temp. und Luftfeuchte: Differenz von Labor zu Außenklima - Außenklima – Temperatur (Jahreszeit) ++ Außenklima – Luftfeuchte + Außenklima – Luftdruck +++ 3.3.2 Tages-Effekt (unbekannte Ursache von Tages-Schwankungen) + Faktor 3: Trocknungszeiten Gezielt nach P1 12h trocknen lassen + 3.3.3 Gezielt nach P2 12h trocknen lassen ++ Faktor 4: Probenvorbereitung, Probenaufbereitung Alterung der Vorverdünnung / Beginn 1. Phase +++ Rühreffekte ++ 3.3.4 Pipettierfehler / Temperatur der Probe bei Pipettieren - 3.3.5 Faktor 5: Steighöhe in 2. Phase ++ 3.3.6 Faktor 6: Alterung der Eisensulfat-Lösung + Faktor 7: Alterung der Silbernitrat-Lösung + 3.3.7 Lichteinfluß bei Bildererstellung + Ursachen von Bildfehlern 3.3.8 Papier schräg im Schälchen Papier oval Fingerabdruck Steighöhe in P2 ungleichmäßig / zu gering / zu hoch ++ ++ - +++ Tab 73. Beurteilung der Einflußintensität der untersuchten Faktoren auf die Bildmerkmals-Ausprägung (Teil 1) SB-Methode: Charakterisierung – Fazit 187 Kapitel Faktor: Einfluß- Intensität * Proben-spezifische, proben-verursachte Effekte Faktor 1: Probennahme (Variation der Milchprobe bei wiederholter PrN) + (bei ca. 80% reproduzierbar) 3.4.1 Einzeltier verschiedene Poolproben Tankproben ++++ ++ + 3.4.2 Faktor 2: Proben-Alterung 1 Tag: +/- 2 - 3 Tage: + 4 - 5 Tage: ++ Faktor 3: Temperierung (Hitze / Kälte) – Effekt auf Bildmuster Abkühlung von Kuhwarm auf 4°C +++ +++ / - (proben- spezifisch) 3.4.3 Temperierung – Effekt auf Unterscheidungsfähigkeit der Proben +/- 3.4.4 Faktor 4: Fettgehalt der Probe, Rahm vs. entrahmte Milch ++ Faktor 5: Laktationsstadium, + Milchleistung + 3.4.5 Kuh-Individualität ++++ Faktor 6: Bilder von Milchproben verschiedener Spezies ++++ Tab 74. Beurteilung der Einflußintensität der untersuchten Faktoren auf die Bildmerkmals-Ausprägung (Teil 2) * Einfluß-Intensität des Faktors auf die Bildmerkmale (Merkmals-Veränderung) Es läßt sich festhalten, dass es einige Faktoren gibt, die sehr genau beachtet werden sollten. Dazu gehören a) Die Konzentrationsstufe der Probe b) Die Alterung der Vorverdünnung bzw. Beginn der 1. Phase c) Die Steighöhe der Ag-Lösung in der 2. Phase d) Das Klima, bei dem die Bilder erstellt werden e) Und die Proben-Zusammenstellung aus Einzeltierproben, da Milchproben von Einzelkühen sehr unterschiedliche Bildmerkmals-Ausprägungen aufweisen können. Für die weiteren Untersuchungen8 wurden folgende Faktoren besonders berücksichtigt: 8 Alle Probenserien von Fütterungsystemvergleich B und C und die Proben zum Thema „Hörner“, mit Ausnahme von Fütterungsystemvergleich A und den Proben von Hof 3 und Hof 4 2007 zum Thema „Hörner“. SB-Methode: Charakterisierung – Fazit 188 a. Raumklima / Labor-Position / Deckelglas-Klima: vergleichbar bei zu vergleichenden Bildern. Der Faktor „Klima“ ist für die Bildmerkmals- Ausprägung von Bedeutung – solange er aber für alle zu vergleichenden Bilder „gleich“ ist, sind Abweichungen vom „Normalen“ vernachlässigbar. In der Praxis heißt das: zu vergleichende Proben sind auf benachbarten Plätzen innerhalb einer Reihe (gleicher Abstand zur Wand) gleichzeitig anzufertigen. b. Gleiche Standzeiten der Vorverdünnung / Beginn der 1. Phase gleichzeitig / Rühreffekte (Lufteintrag in die Vorverdünnung) vermeiden. c. Gleiche Steigdauer / Steighöhe in der 2. Phase (Deckelglas möglichst zeitgleich aufdeckeln). Papier gerade in Schälchen stellen, auf gleichmässige Benetzung mit Flüssigkeit achten. d. Alter der Probe (Lagerungsdauer). e. Mehrere Konzentrationsstufen je Probe, sowie Rahm vs. fettarme Milch. f. Trocknungszeit 3h (+/- 0,5h). g. Ag- und Fe-Lösung max. 7 Tage alt. Folgende Faktoren wurden als „weniger bedeutsam“ eingestuft: h. Abkühlung der Probe / Temperatur der Probe beim Pipettieren i. Erhitzung / Frost als Alterungs- bzw. Streß-Varianten SB-Methode: Bildauswertungsverfahren im Vergleich 189 3.6. Einfluss des Bildauswertungsverfahrens auf die Unterscheidbarkeit von Probenbildern Eine Bildauswertung kann auf verschiedene Weise vorgenommen werden. Dabei weist jede Methode ihre speziellen Eigenschaften auf. Je nach Ziel der Untersuchung ist insofern die eine oder andere Methode besser geeignet. Für die praktische Auswertung ist es weiterhin von Bedeutung, zu wissen, wie viele Merkmale tatsächlich berücksichtigt werden müssen, um eine korrekte Gruppierung bzw. Unterscheidung der Proben vorzunehmen. Das Ziel dieses Kapitels ist, zu zeigen, welches Auswertungsverfahren welche Aussagen ermöglicht. 3.6.1. Triangeltest Mit dem Ziel, Proben voneinander zu unterscheiden, wurde an den Bildern von drei verschiedenen Betrieben zur Thematik „Hörner“ ein Triangeltest durchgeführt, sowie an Bildern vom Fütterungssystemvergleich C „Wiesenheu vs. Silage“ (von vier PrN). Die Probenserien zur Thematik „Hörner“ sollten verdeutlichen, dass die Bild-Unterschiede, die in der Charakterisierung beschrieben wurden (siehe Anhang C), sehr unterschiedlich ausfallen können. Ergebnisse Folgende Unterschiede konnten mit dem Triangeltest erfasst werden: - Die Bilder von Hof 11 waren signifikant (p=0,001) differenzierbar (in 96% der Fälle, 23/24 Antworten richtig). - Die Bilder von Hof 7 waren signifikant (p<0,01) differenzierbar (in 76% der Fälle). - Die Bilder von Hof 2 waren signifikant (p<0,01) differenzierbar (in 62% der Fälle). - Die Bilder vom Fütterungssystemvergleich C „Wiesenheu vs. Silage“ ließen sich o Bei der 1. PrN in 2 von 11 Fällen (18%) unterscheiden, aber in 9 Fällen (82%) nicht, d.h. eine Differenzierung ist nicht möglich. o Bei der 2. PrN in 9 von 11 Fällen (82%) unterscheiden – die Bilder sind mit p<0,01 signifikant differenzierbar. o Bei der 3. PrN in 4 von 11 Fällen (36%) unterscheiden, in 7 Fällen (69%) nicht (Bilder nicht differenzierbar). o Bei der 4. PrN in 3 Fällen (27%) unterscheiden, in 8 Fällen (73%) nicht (Bilder nicht differenzierbar). SB-Methode: Bildauswertungsverfahren im Vergleich 190 Diskussion Es ist deutlich, dass sich die Bilder von den Hof-Proben zur Thematik „Hörner“ sicher unterscheiden lassen (in allen drei Fälle signifikant differenzierbar) – die Bilder aus dem Fütterungssystemvergleich hingegen scheinen mit diesem Auswertungsverfahren nicht differenzierbar zu sein, mit Ausnahme der Bilder der 2. PrN. Bei diesen Proben der 2. PrN sind aber auch mit anderen Methoden (z.B. Gärprobe) die deutlichsten Unterschiede festzustellen. Bei Anwendung einer Reihung und darauf aufbauenden Gruppierung unter Berücksichtigung der Bilder mehrerer Konzentrationsstufen je Probe, wie dies für die Bilder durch den Autor vorgenommen wurde, („Gruppierung“ in 2+2 Bilder) konnten sowohl die Bilder zur Thematik „Hörner“ als auch die vom Fütterungssystemvergleich C korrekt gruppiert werden (Ergebnisse siehe Kapitel „Fütterungssystemvergleich C – Steigbild- Untersuchungen“ und Anhang C für die Steigbilder zum Thema „Hörner“). Es läßt sich jedoch mit der Gruppierung von 2+2 Bildern keine Signifikanz bestimmt, d.h. die Größe des Unterschiedes wird nicht deutlich. Dies könnte höchstens an der Ausprägungsintensität der Bildmerkmale bestimmt werden. Aufgrund der im Triangeltest vorgenommenen Beurteilung der Bilder bei der 1. PrN könnte eine Gruppierung „4004+4005 vs. 4006+4008“ angenommen werden (Bilder 6-4+6-2 vs. 6-1+6-3 vom 23.2.09, siehe SB-Abb-22-Fütterungssystemvergleich C: Wiesenheu-Silage, erste Zeile). Dies ist jedoch nicht richtig. Aufgrund der Gestaltung der Fahnenzone könnte diese Gruppierung jedoch für möglich gehalten werden. Fazit Der Triangeltest ist geeignet, bei ausreichend unterschiedlichen Bildern eine signifikante Differenzierung zu erzielen. – wie dies in der Methodenbeschreibung bei ZALECKA (2006) als Grundvoraussetzung angegeben wird. Sind die Bildmerkmale jedoch sehr gering unterschiedlich (siehe Bildmerkmals-Beschreibungen im entsprechenden Kapitel), so ist die Methode der Gruppierung / Reihung (unter Berücksichtigung mehrerer Bildmerkmale / mehrerer Bilder in verschiedenen Konzentrationsstufen je Probe) häufiger geeignet, die Proben zu unterscheiden. Es läst sich jedoch mit der Gruppierung von 2+2 Bildern keine Signifikanz bestimmt, d.h. die Größe des Unterschiedes wird nicht deutlich, erst ab 3+3 Bildern ist eine statistische Absicherung der Ergebnisse möglich (s.a. Kapitel 3.6.4). SB-Methode: Bildauswertungsverfahren im Vergleich 191 3.6.2. Profilprüfung und einfach beschreibende Prüfung Vorgehen: Die Bilder (2 Bilder je Probe) werden für die Profilprüfung nach drei definierten Bildmerkmalen (Schalengröße, grüne Bereiche und Kontur) bonitiert. Anschließend wird je Proben-Alter der Mittelwert und Streuung der Werte ermittelt und mit den anderen Daten verglichen (siehe Tab 75). Sind Proben nicht signifikant unterschiedlich, so ist eine Differenzierung auf diesem Wege nicht möglich. Für die einfach beschreibende Prüfung werden dieselben Bilder wie für die Profilprüfung nach einer Vielzahl von frei wählbaren Merkmalen beschrieben, wobei möglichst Merkmale des gesamten Bildes zu Hilfe genommen werden. Ziel dabei ist eine Unterscheidung der Proben, gleichzeitig eine Charakterisierung und Klassifizierung nach dem Alter der Proben. Dabei wurden die Merkmale Schalengröße sowie Farbintensität zur Klassifizierung herangezogen: ältere Probe = flachere Schalen und farbintensiver. Ergebnis der Profilprüfung: Alter der Probe Bildmerkmal Konz. Stufe 0T 1T 5T 6T 4 a 1,5 c 3,25 b 1,5 c0,075 s 0 0,57 0,5 0,57 3 a 3 a 2,5 a 4 b Schalengröße 0,08 s 0,81 0 0,57 0 1,5 a,b 1 a 5 b 1,5 a0,075 s 0,57 0 2,16 0,57 15 a 5,5 b 17,5 a 1,5 b grüne Bereiche 0,08 s 0 2,88 2,88 0,57 3,75 a 4,25 a,b 5,25 b 3,5 a0,075 s 0,5 1,5 0,95 0,57 6,5 a 7,25 a 6,5 a 3,75 b Kontur 0,08 s 0,57 0,5 0,57 0,5 Tab 75. Mittelwert und Streuung von drei Bildmerkmalen, bonitiert an 2x2Bildern, in zwei Verdünnungsstufen, jede separat. Unterschiedliche Buchstaben je Zeile weisen auf signifikant unterschiedliche Ausprägungsintensität. In der Konzentrationsstufe 0,075 sind die Proben 1T und 6T nicht zu trennen, jedoch in 0,08, dafür sind in 0,08 die Bilder der Proben 0T und 5T nicht zu trennen. SB-Methode: Bildauswertungsverfahren im Vergleich 192 Ergebnis der einfach beschreibenden Prüfung: 0,08ml/Bild Rang- Gruppe grüne Bereiche Schalenform Farbintensität Alter der Probe in Tagen These: Alter der Probe A keine grünen Bereiche runde, kleine, gedrungene Schalen Farbintensive, (dunkel-grüne) Schalenfüllung 6, 6 Alt C viele grüne Bereiche gedrungenere, flachere Schalen als B, d.h. B jünger als C farbintensive, dunkle grüne Bereiche 5, 5 Ähnelt „alt“, aber jünger B wenige grüne Bereiche Lockere, mitteltiefe Schalen mit viel Weiß farbschwach 1, 1 ähnelt „frisch“, aber älter D viele grüne Bereiche „lockere“, tiefe Schalen mit viel Weiß helle grüne Bereiche 0, 0 Frisch Tab 76. Charakterisierung und Klassifizierung nach frei gewählten Merkmalen In der Konzentrationsstufe 0,075 fällt die Klassifizierung auf dieselbe Weise aus, jedoch mit teilweise anderen Merkmalen. Es zeigte sich, dass sich alle Proben korrekt voneinander differenzieren liessen (Fishers Test für vier Proben und je zwei Bilder, p=0,0095, zweiseitiger Test). Auf Grund der Charakterisierung war auch eine korrekte Klassifizierung möglich. Diskussion: Mit der Profilprüfung war eine sichere Differenzierung der Proben nicht möglich – erst bei Kombination der Ergebnisse von beiden Konzentrationsstufen war es möglich, dass sich alle vier Gruppen voneinander unterscheiden. Die Ergebnisse können mit Hilfe der Statistik geprügt werden – die Größe des Unterschiedes (Signifikanz) kann ermittelt werden. Eine Klassifizierung nach dem Alter der Proben war damit aber noch nicht möglich. Bei der einfach beschreibenden Prüfung liessen sich alle Proben voneinander differenzieren – die Bildauswertung ist zeitaufwändiger als die der Profilprüfung. Auch hier lässt sich mit dem Fishers Test auf Grundlage von Kontingenztafeln eine statistische Auswertung vornehmen – mit der Aussage, dass die vorgenommene Gruppierung mehr als zufällig ist. Die Klassifizierung und Sicherheit in der Gruppierung war jedoch nur unter Berücksichtigung beider Konzentrationsstufen gleichzeitig möglich. In diesem Sinne scheint es angemessen, den größeren Aufwand von zwei Konzentrationsstufen hinzunehmen für eine größere Sicherheit in der Aussage. Der Unterschied der beiden Verfahren, die an demselben Bildmaterial durchgeführt wurden, ist interessant: im ersten Fall werden die Bildmerkmalsausprägungen einzeln erfasst. Im zweiten Fall werden diese zwar ebenfalls (relativ zueinander) erfasst, aber es SB-Methode: Bildauswertungsverfahren im Vergleich 193 gehen noch mehr Merkmale in die Beurteilung ein, und ausgewertet wird die Anzahl korrekt zugeordneter Bilder. Die realen Bildmerkmalsunterscheide sind daraus gar nicht mehr ersichtlich, dafür bedarf es einer zusätzlichen Bonitur der Merkmale. Es kann sein, dass die Bildmerkmale sehr gering sind, aber die Proben trotzdem alle richtig gruppiert wurden. Insofern sagt der Fisher’s Test in Realität über die Bildmerkmalsunterschiede nichts aus – nur, ob die Unterschiede ausreichen, eine mehr als zufällige Gruppierung zu erzielen, oder ob die methodischen Ursachen von Merkmalsvariationen größer und deshalb keine probenspezifischen Merkmale mehr erkennbar sind. SB-Methode: Bildauswertungsverfahren im Vergleich 194 3.6.3. Unterscheidung mehrerer Proben auf Grundlage einer einfachen Reihung vs. „Gruppierung aufgrund von vielfältiger Merkmals-Berücksichtigung“ Frage: Können 8 Proben voneinander differenziert werden? Ist dieses aufgrund von einer Reihung der Bilder nach dem Merkmal „g.B.“ möglich? Reicht es, nur wenige Bildmerkmale / einzelne Konzentrationsstufen zu berücksichtigen, oder müssen möglichst viele Bildmerkmale / Bilder mehrerer Konzentrationsstufen gleichzeitig berücksichtigt werden? Probenmaterial: Die Proben stammen aus dem Fütterungssystemvergleich B „Weizen vs. Futterrüben“ und sind die Poolproben 2. Stufe (je 3 bis 4 Tiere gepoolt, je PrN vier Proben Weizen-Fütterung, und vier Proben Futterrüben-Fütterung). Vorgehen: A: Je Konzentrationsstufe werden 16 Bilder (aus 8 gedoppelten Proben) nach der g.B.-Intensität gereiht, und anschließend immer zwei mit ähnlichen Bildmerkmalen als „vermutliche Doppel“ zusammengelegt und die grundlegenden Bildmerkmale notiert Wenn die Decodierung eine korrekte Doppel-Zuordnung bestätigt, wird diese grün markiert. B: Jeweils zwei Konzentrationsstufen gemeinsam wurden je Probe unabhängig von der Reihungs-Auswertung nochmals beurteilt und gruppiert. Das Bild der zeiten Konzentrationsstufe diente dabei wie eine Erweiterung des ersten Bildes, in dem zum ersten Bild ergänzende Merkmale wiedergegeben werden. Ergebnisse: Reihung / Gruppierung: Folgende Gruppierung wird mit den Bildern der Konzentration 0,075ml Milch vorgenommen (Tab 77) (die Bilder sind dabei geordnet, von oben nach unten mit zunehmender Anzahl grüner Bereiche). Der Fisher’s Test gibt für diese Gruppierung (drei Paare korrekt, zwei untereinander und drei andere untereinander vertauscht) einen p-Wert von 0,01735 an. Probe Bildmerkmale Decodierung J-238 + J-236 Schalenrand abgesunken, keine grünen Bereiche LR2 + LR2 J-221 + J-232 Sehr flache Schalen, Schalenrand breit LR3 + LR1 J-230 + J-223 Ähnlich. Sehr flache Schalen, Schalenrand schmaler LR1 + LR3 J-227 + J-239 Wenig grüne Bereiche, regelmäßige Schalen LR + D3 J-249 + J-250 Wenig grüne Bereiche, schalen groß, unregelmäßig D4 + D4 J-225 + J-226 Relativ viele grüne Bereiche, viele kleine, schmale Schalen, Schalenrand präzise D1 + D1 J-244 + J-241 Ähnlichkeiten. Viele kleine Schalen, mittelviele grüne Bereiche 241: Steigfehler. D2 + D3 J-243 + J-247 Viele grüne Bereiche, Schalenrand verwaschen D2 + LR4 Tab 77. Reihung und Gruppierung der 16 Bilder vom 26.2.08 aus R1 mit 0,075ml Milch / Bild SB-Methode: Bildauswertungsverfahren im Vergleich 195 In dieser Tabelle ist die Gruppierung zu sehen, die aufgrund der Bilder von zwei Konzentrationsstufen erzielt wurde. Das Ergebnis ist höchst signifikant (p<0,0001). Probe Nr Bildmerkmale Decodierung 238+236 GB=0, „überstiegen“, grS LR2 + LR2 232+230 GB=0, Sockel unten helles Band LR1 + LR1 221+223 GB=0,5, „Zähne“ LR3 + LR3 250+249 GB=3, etwas rötliche Linie, S unregelmäßig D4 + D4 226+225 GB=3 D1 + D1 246+247 GB=4,5, wenig gelbliche Linie LR4+LR4 244+243 GB=4, S=Berge, dunkler D2 + D2 239+241 GB=4, S=Berge, grüner D3 + D3 Tab 78. Gruppierung der Bilder vom 26.2.08 (Auswertung am 30.10.08, zwei Konzentrationsstufen gemeinsam) Diskussion Eine Reihung (nach dem Merkmal g.B.-Intensität), ergänzt durch ein oder zwei weitere frei gewählte Bildmerkmale führt nur in einigen Fällen zu einer korrekten Unterscheidung der Proben (3 von 8 Paaren richtig). Diese Methode wurde an den Bildern der anderen drei PrN wiederholt angewendet – mit ähnlichem Ergebnis: 1. und 3. PrN waren 3 von 8 richtig, bei der 4.PrN konnten 5 von 8 Paaren richtig gruppiert werden (auf Grundlage der Reihung der g.B., ergänzt durch ein oder zwei weitere Bildmerkmale). Bei einer Gruppierung beider Konzentrationsstufen gemeinsam unter Berücksichtigung mehrerer Bildmerkmale konnten alle acht Paare (der Bilder der 2.PrN) korrekt zusammengefunden werden. Daraus kann abgeleitet werden, dass bei gleichzeitiger Berücksichtigung von mehreren Bildern / mehreren Bildmerkmalen die Variation der einzelnen Bilder ausgeglichen wird, und mit dieser größeren Anzahl von Daten bessere Gruppierungs-Ergebnisse erzielt werden. Es wäre ebenfalls denkbar, mehrere Bilder einer Konzentrationsstufe zu verwenden – jedoch zeigen verschiedene Konzentrationsstufen je Probe oft unterschiedliche „Aspekte“ (die eine Verdünnungsstufe zeigt fast keine Unterschiede, eine andere jedoch deutlich – das kann je nach Probe unterschiedlich sein). Deshalb erscheint es sinnvoll, je Probe verschiedene Konzentrationsstufen zu verwenden, und nicht nur mehrere Bilder je Konzentrationsstufe, um auch einander ähnliche Probenbilder voneinander unterscheiden zu können. Fazit Werden mehrere Bilder (z.B. aus mehreren Konzentrationsstufen) berücksichtigt und – auf der „Reihung nach g.B.-Intensität“ aufbauend - weitere Bildmerkmale zur Gruppierung herangezogen, so ist die Gruppierung (am Beispiel von 8 gedoppelten Proben) häufiger korrekt. SB-Methode: Bildauswertungsverfahren im Vergleich 196 3.6.4. Statistische Absicherung von „Gruppierungen“ Beipielhaft an ein paar Probenserien wurde geprüft, ob sich auch bei Erstellung von vier Bildern je Probe eine entsprechende Gruppierung aufgrund der Bildmerkmale erreichen lässt bzw. ob bei vier voneinander zu unterscheidenden Proben mit je zwei Bildern eine signifikante Differenzierung möglich ist (mit Prüfung der Wahrscheinlichkeit der Gruppierung mit dem Fisher’s exakten Test). Material: Die Bilder von folgenden Proben wurden verwendet: Zwei Vergleichsproben, je vier Bilder, z.B. bei: - Hof 1, 3. PrN (in zwei Konzentrationsstufen, getrennt voneinander beurteilt) - Hof 8, 1. und 3. PrN - Fütterungssystemvergleich B, alle vier PrN Vier Vergleichsproben, je zwei Bilder je Verdünnungsstufe, z.B. bei: - Hof 12 (alle drei PrN) - Hof 4 - 2008 - Proben zum Thema „Wirtschaftsstile“ (siehe Anhang, sechs PrN) Vorgehen: Die Prüfung der Unterscheidbarkeit der Proben wird für alle zu vergleichenden Proben durch eine „Gruppierung“ der Bilder erreicht, indem die doppelt oder mehrfach erstellten Bilder entsprechend der Bildmerkmalsausprägung zusammengelegt werden. Es kann hier auch von einer „Zuordnung der doppelt bzw. mehrfach erstellten Bilder zueinander“ gesprochen werden. Nach Decodierung wird dann beurteilt, inwieweit tatsächlich die „richtigen“ Gruppierungen vorgenommen wurden. Es wird nun nach dem Muster von Kontingenztabellen beurteilt, ob die vorgenommene Zuordnung den realen Probenqualitäten entspricht. Mit dem Fisher’s exakten Test (zweiseitig) wird geprüft, wie wahrscheinlich diese Anordnung der Bilder per Zufall ist bzw. wie unwahrscheinlich. Ergebnisse: Für die Vergleichsproben, bei denen vier Bilder je Probe bei zwei zu vergleichenden Probenqualitäten erstellt und ausgewertet wurden, konnten in 6 von den betrachteten 7 Fällen vollkommen korrekte Gruppierungen vorgenommen werden. Insofern sind in 85,7% der betrachteten Fälle eine mit p=0,0286 unwahrscheinliche Gruppierung vorgenommen worden. Eine Unterscheidung der Proben ist somit signifikant möglich. SB-Methode: Bildauswertungsverfahren im Vergleich 197 Bei den vier zu vergleichenden Proben mit je zwei Bildern konnten für Hof 12 an allen drei PrN-Terminen die Bilder korrekt gruppiert werden, ebenfalls für Hof 4 – 2008. Daraus ergibt sich, dass die Unterscheidung der Proben mit p=0,0004 höchstsignifikant ist. Bei den Proben zum Thema „Wirtschaftsstile“ konnten die vier Proben nicht an allen PrN-Terminen korrekt gruppiert werden (siehe Tabelle unten). Gruppe 1 Gruppe 2 Gruppe 3 Gruppe 4 Signifikanz-Niveau PrN A: Mai 08 BS BH KS KH p=0,0004 PrN B: Juli 08 KH KS BH BS p=0,0004 PrN C: Sept 08 KH + BH BH + KH KS BS p=0,0016 (*) PrN D: Nov. 08 BH + KH BH + KH KS BS p=0,0016 PrN E: Jan 09 BH + KH KH + BH KS BS p=0,0016 PrN F: März 09 KH + KS KH + BH BH + KS BS p= Abb. 20: Vorgenommene Gruppierungen der Bilder zum Thema „Wirtschaftsstile“ und Unwahrscheinlichkeit der beobachteten Häufigkeitsverteilung (Fischer’s exakter Test, zweiseitig). (*): zugrundegelegte Häufigkeitstabelle siehe Abb. 6: unten. Diskussion: Es ist deutlich, dass sich einige Vergleichsproben signifikant differenzieren lassen – dass es aber auch Ausnahmen davon gibt, und die Unterscheidbarkeit von zwei Proben nicht gegeben ist. In den Beschreibungen der Bildmerkmale ist zu erkennen, dass die Ähnlichkeit der Merkmalsausprägung hoch ist bei diesen Bildern. Oftmals wird (wie z.B. bei Fütterungssystemvergleich B, 4. PrN) die Ähnlichkeit der Proben auch durch andere Methoden bestätigt. Auch bei den Proben zum Thema „Wirtschaftsstile“ ist durch andere Methoden z.B. die Ähnlichkeit der Proben KH und BH wiederholt festgestellt worden (KUSCHE, unveröff.), so dass eine nicht korrekte Gruppierung nicht unbedingt als methodische Unfähigkeit gedeutet werden sollte, sondern in diesem Fall eher als eine Eigenschaft, tatsächlich auch mit anderen Methoden feststelltbare Ähnlichkeiten wiederzugeben. Außerdem ist auffällig, dass die Proben zum Thema „Wirtschaftsstile“ große Poolproben sind, in denen keinerlei Einzeltiereffekte mehr zu beobachten sein werden – hingegen sind Proben, bei denen nur relativ wenige Proben einzelner Kühe gepoolt wurden wie z.B. bei Hof 12, „leichter“ zu unterscheiden: die Bildmerkmale sind deutlich unterschiedlicher ausgeprägt, der „Einzeltiereffekt“ wird deutlicher sichtbar. SB-Methode: Charakterisierung – Prüfen der Anwendbarkeit 198 3.7. Zur Prüfung der Anwendbarkeit der Methode unter Standardbedingungen Problemstellung: Es hat sich im Rahmen der Charakterisierung der Steigbildmethode gezeigt, dass die Bildmerkmals-Ausprägung bei Milch-Steigbildern von vielen Faktoren leicht beeinflußbar ist (siehe vorhergehende Kapitel), dass also die Methode keine ausgeprägte Robustheit gegenüber gewissen Störfaktoren aufweist – gegenüber einigen Störfaktoren jedoch ausgesprochen „robust“ reagiert. Vor der weiteren umfassenden Anwendung der Methode ist zu prüfen, ob unter Berücksichtung der Labor-Faktoren, die die Bildmerkmale leicht beeinflussen, die Methode wiederholbare, reproduzierbare Ergebnisse für Milchproben liefern kann. Als Versuchsdesign wird hierfür folgender Plan zugrundegelegt: Aus zwei unterschiedlichen Proben werden bei wiederholter (zweifacher) Probenaufbereitung Bilder erstellt. Insgesamt liegen je Probe somit vier Bilder vor, deren Ähnlichkeit sich im Rahmen einer Gruppierung zeigen sollte. Dieses Versuchsdesign wird an mehreren Probenpaaren angewendet. Zeigt sich an allen untersuchten Probenpaaren eine Differenzierbarkeit, erscheint die Methode auch für die Untersuchung der weiteren Proben geeignet zu sein. Material: Es werden die Proben von Hof 1, 3. PrN sowie die Mischproben der vier PrN aus dem Fütterungssystemvergleich B verwendet. Ergebnisse: Die 4x4 Bilder je Verdünnungsstufe lassen sich für Hof 1, 3. PrN, für den ersten und zweiten Bildererstellungstag (einen Tag gealtert) unabhängig voneinander und für die ersten drei PrN vom Fütterungssystemvergleich B (frische untersucht) signifikant voneinander differenzieren (p=0,0286, Fisher’s Test, zweiseitig, d.h. alle Gruppierungen waren korrekt). Die Bilder der 4. PrN waren nur in drei von vier Fällen richtig gruppiert worden, d.h. diese Differenzierung ist nicht signifikant (p=0,4857). Eine ausführliche Ergebnisdarstellung befindet sich im jeweiligen Kapitel. Diskussion: An diesem Beispiel wird deutlich, dass bei wiederholter Probenaufbereitung und wiederholter Bildererstellung sich zwei Milchproben voneinander differenzieren lassen - auch bei sehr ähnlichen Bildmerkmalsausprägungen, wie dies für z.B. die Bilder von Hof 1 zum Thema „Hörner“ der Fall war. Auch wird deutlich, dass die Unterscheidbarkeit der Proben am zweiten Bildererstellungstag (mit optimierten Konzentrationsstufen) deutlicher ist als an den Bildern des ersten Tages. Da auch eine Zuordnung der Bilder von beiden Bildererstellungstagen zueinander möglich ist, kann von einer Reproduzierbarkeit der Ergebnisse ausgegangen werden, d.h. die Bildmerkmale bilden sich an beiden Tagen je SB-Methode: Charakterisierung – Prüfen der Anwendbarkeit 199 Probe ähnlich aus, die auftretenden Bildmerkmalsvariationen aufgrund von Laboreffekten / Tageseffekten sind gegenüber den Probeneffekten zu vernachlässigen. Die Bilder vom Fütterungssystemvergleich B waren an drei der vier PrN-Termine signifikant differenzierbar – bei der 4. PrN waren die Bildmerkmale der beiden Proben sehr ähnlich, und eine Differenzierung nicht mehr möglich. Insofern muss von einer eingeschränkten Differenzierbarkeit bei wiederholter PrN (unter veränderten Bedingungen) ausgegangen werden. Dass die PrN nicht zu 100% reproduzierbar ist kann an der Gesamtheit der erstellten Bilder beobachtet werden: Die Zuordnung von Bildern zu denjenigen einer vorhergehenden PrN war bei den Proben zur Thematik „Hörner“ in 71% der Fälle möglich (s.a. Kapitel 3.4.1 „Faktor 1: Probennahme“). Insofern liegt laborseitig ein eher geringer Fehler in der Proben- Beurteilung aufgrund der Bildmerkmale vor. Der „Fehler“ aufgrund der PrN ist deutlich größer als der laborseitige Meß-Fehler – was der Erfahrung auch anderer Labore mit analytischen Methoden entspricht. Fazit: Es kann aufgrund dieser Ergebnisse davon ausgegangen werden, dass die Methode ausreichend reproduzierbare und wiederholbare Ergebnisse für die Milchproben liefert. Die Methode scheint für die Anwendung an weiteren Proben ausreichend entwickelt worden zu sein. Fütterungsvergleich A: Wiesenheu vs. Ackerfutterheu (Kleegras) – Ergebnisse 200 4. Ergebnisse und Diskussion - Methodenvergleich Neben dem Ziel, die verschiedenen Probenqualitäten zu differenzieren und zu charakterisieren, besteht die Absicht, die Ergebnisse der verschiedenen Methoden miteinander zu vergleichen. Um diesen drei Zielen gerecht zu werden ist die Darstellung der Ergebnisse wie folgt gegliedert: Die Ergebnisse zu den Fütterungssystemvergleichen und zur Thematik „Hörner“ werden je Versuch dargestellt und diskutiert. Der Fokus liegt hierbei auf methodischen Aspekten und einer Charakterisierung der Probeneigenschaften, unabhängig von den Fütterungsfaktoren. Da es sich um Sytemvarianten im Vergleich handelt, ist eine konkrete Rückführung oder Erklärung der Ergebnisse aufgrund einzelner Fütterungsfaktoren nicht angemessen, selbst wenn im Vergleich mit anderen Ergebnissen eine Übereinstimmung vorzuliegen scheint. Die Beurteilung von Effekt-Intensitäten im Vergleich untereinander (Futter-, Gruppen- und Zeit-Effekte) steht im Vordergrund. Anschließend wird je Versuch eine Übersicht über die Ergebnisse der verschiedenen Methoden gegeben und ein Vergleich der Ergebnisse vorgenommen. Erst in der abschließenden Diskussion (Kapitel 5) werden Beziehungen zwischen den einzelnen Versuchen hergestellt. Fütterungsvergleich A: Wiesenheu vs. Ackerfutterheu (Kleegras) – Ergebnisse 201 4.1. Ergebnisse Fütterungssystemvergleich A: Einfluß von Wiesenheu und Kleegras-Ackerfutter-Heu auf verschiedene Parameter der Milch 4.1.1. Milchleistung Die Abendgemelk-Milchleistung wurde an vier PrN-Terminen von je 24 Kühen erfaßt. Zwei Proben wurden wegen möglicher subklinischer Mastitis (ZZ >300.000) verworfen. Im Regressionsmodell mit den drei fixen Effekten Futter, Kuh und PrN stellt sich die Milchleistung bei Wiesenheu-Fütterung mit im Mittel 5,21l hochsignifikant geringer (p=0,0004) dar als die bei Kleegrasheu-Fütterung mit im Mittel 5,94l. Dieses Modell erklärt 89,88% der Varianz (bei p<0,0001 für das gesamte Modell). Wiesenheu Kleegrasheu Futter-Effekt Tier-Effekt PrN-Effekt Mittlere Werte Signifikanz-Niveau (p=) Milchleistung (Abendgemelk) 5,21 5,94 0,0004 <0,0001 0,0067 Tab 79. Mittlere Milchleistung je Kuh und Abendgemelk (n=94) mit Signifikanzniveau für die drei im Modell berücksichtigten Effekte Fütterung, Kuh (Tier-Effekt) und Probenahme-Termin (PrN-Effekt) bei Fütterungssystemvergleich A. 4.1.2. Gehalte von Fett, Eiweiß, Lactose, Harnstoff und Zellzahl Das gewählte Modell (Tab 80) für die Werte der 8 Kleingruppen (à 3 Kühe) an vier PrN-Terminen kann für den Fett-, Eiweiß- und Harnstoff-Gehalt der Proben eine signifikante Voraussage machen – beim Effekttest zeigt sich, dass der Effekt häufig mit dem Faktor „Gruppe“ und insofern Einzeltier-spezifisch hervorgerufen wird. Ein Zusammenhang mit dem Futter kann einzig für die Lactose festgestellt werden (auch noch bei alleiniger Berücksichtigung des Futter-Effektes bleibt der Effekt im t-Test (einfaktorielle ANOVA) mit p=0,01 signifikant) und für den Harnstoff. Demzufolge ist der Lactosegehalt bei Kleegrasheu- Fütterung um 0,08% erhöht, der Harnstoffgehalt ist um 26 ppm auf 198 erhöht. Die anderen Parameter (Fett, Eiweiß und Zellzahl) sind Gruppen-spezifisch beinflußt, ein Futter-Effekt läßt sich nicht feststellen. Wiesenheu Kleegrasheu Ges. Modell Futter- Effekt Gruppen- Effekt PrN- Effekt Mittlere Werte r² Signifikanz-Niveau (p=) Fett % 5,77 5,56 0,71 0,003 0,161 0,002 0,131 Eiweiß % 4,04 3,96 0,66 0,007 0,455 0,002 0,676 Lactose % 4,61 4,69 0,51 0,102 0,009 0,276 0,390 Harnstoff ppm 172 198 0,57 0,044 0,025 0,136 0,090 Zellzahl in 1000 147 127 0,53 0,078 0,363 0,026 0,839 Tab 80. Mittlere Werte und Signifikanzniveau für Fett, Eiweiß, Lactose, Harnstoff und Zellzahl bei Wiesen- bzw. Kleegrasheu-Fütterung (n=32, Werte der 8 Kleingruppen von vier PrN). Fütterungsvergleich A: Wiesenheu vs. Ackerfutterheu (Kleegras) – Ergebnisse 202 4.1.3. Fettsäuremuster Im Regressionsmodell mit den drei fixen Effekten Futter, Gruppe und PrN konnten für die an vier PrN-Terminen genommenen je zwei Vergleichs-Poolproben (n=8) keine signifikanten (p<0,05) Unterschiede zwischen den Probennahme-Zeiten bei den einzelnen Fettsäuren gefunden werden (siehe Tab 81). Es traten vereinzelt Gruppeneffekte auf (C- 14:0, C-16iso, C-17:0, C-18:0, C-20:0 und C-20:3-cis8,cis11,cis14 (=n6)). Der Großteil der Probenunterschiede beruht auf Fütterungseffekten. Das läßt sich auch an der Summe der p- Werte je Effekt erkennen: der Futtereffekt ist mit am deutlichsten (geringste Summe der p- Werte mit 16,65), gefolgt von dem Gruppeneffekt (Summe der p-Wete: 23,65), der Zeiteffekt (mit 32,95) ist nochmals deutlich geringer. Das Signifikanzniveau vom Modell und der einzelnen Effekte ist in Tab 81 angegeben, zusätzlich die durch das Modell erfasste Varianz (r²). Es gibt eine Reihe von Fettsäuren, die fütterungs-spezifisch auftreten. Auffällig ist, dass der SFA- und MUFA-Gehalt vom Futter unbeeinflusst ist, dass bei Kleegras-Heu- Fütterung vermehrt PUFA’s auftreten, der CLA-Gehalt, der n-3 und n-6 Gehalt und deren Verhältnis und die SCT ebenfalls für die KG-Fütterung erhöht sind, im Gegensatz zur Wiesenheu-Fütterung. Die –iso-Fettsäuren sind für Wiesenheu erhöht. Vor allem im kurz- bis mittellangkettigen Fettsäurebereich treten oftmals gleichzeitig mit Futter- auch Gruppeneffekt auf, manchmal auch eine Tendenz zu Zeiteffekten (C-4:0, C-6:0, C-8:0). Wiesen- heu Kleegras- heu Gesamtes Modell Futter- effekt Gruppen- effekt PrN- Effekt Fettsäuren in g/100g Fett Mittlere Werte r²= Signifikanz-Niveau (p=) SFA 77,84 77,79 0,68 0,618 0,954 0,274 0,644 MUFA 19,58 19,15 0,71 0,568 0,597 0,272 0,600 PUFA 2,58 3,06 0,92 0,188 0,045 0,314 0,903 Sum C-18:1Trans-FS 1,37 1,74 0,83 0,371 0,093 0,788 0,928 Sum CLA 0,63 0,78 0,83 0,364 0,098 0,743 0,765 C-16:0/C-18:1cis9 3,21 3,31 0,83 0,373 0,698 0,133 0,495 C-16:0/C-18:1 ges. 2,94 2,94 0,80 0,431 0,986 0,151 0,562 Sum n-3 1,11 1,36 0,94 0,141 0,032 0,498 0,699 Sum n-6 1,05 1,17 0,88 0,265 0,074 0,225 0,956 Sum MCT(C-10>C-14) 21,22 21,43 0,88 0,273 0,401 0,414 0,199 Sum SCT(C-4>C-8) 6,84 7,29 0,97 0,064 0,044 0,058 0,074 CLA-cis9c,tr11 0,50 0,62 0,76 0,497 0,165 0,594 0,747 CLA-tr11,cis13 0,02 0,04 0,99 0,032 0,007 0,364 0,247 Tab 81. Einige Summenparamter der Fettsäuren der Milchproben aus dem Fütterungssystemvergleich „Kleegras- vs. Wiesen-Heu“ (Versuch A, n=8). Mittlere Fettsäure-Gehalte je Fütterungsvariante und Signifikanzniveau für Futter-, Gruppen- und Zeiteffekt sowie gesamtes Modell. Orange markiert: p<0,05, gelb markiert: p <0,1 Fütterungsvergleich A: Wiesenheu vs. Ackerfutterheu (Kleegras) – Ergebnisse 203 Wiesen- heu Kleegras- heu Gesamtes Modell Futter-Effekt Gruppen- Effekt PrN-Effekt Fettsäuren in g/100g Fett Mittlere Werte r² Signifikanz-Niveau (p=) C-4:0 3,35 3,53 0,98 0,058 0,057 0,049 0,060 C-6:0 2,24 2,40 0,97 0,065 0,039 0,070 0,077 C-7:0 0,03 0,04 0,93 0,167 0,039 0,703 0,602 C-8:0 1,22 1,32 0,97 0,074 0,039 0,060 0,110 C-9:0 0,03 0,03 0,89 0,254 0,069 0,477 0,609 C-10:0 2,95 3,18 0,93 0,177 0,074 0,309 0,224 C-10:1 0,39 0,41 0,88 0,273 0,314 0,362 0,213 C-11:0 0,05 0,07 0,89 0,258 0,069 0,620 0,597 C-12:0 3,47 3,67 0,86 0,314 0,150 0,675 0,319 C-12:1 0,12 0,12 0,86 0,319 0,665 0,916 0,209 C-13iso 0,10 0,10 0,78 0,460 0,837 0,993 0,311 C-13:0 0,10 0,11 0,76 0,502 0,174 0,673 0,692 C-14iso 0,17 0,13 0,98 0,038 0,009 0,072 0,592 C-14:0 12,23 12,09 0,92 0,180 0,186 0,049 0,754 C-14:1tr9 0,01 0,01 0,40 0,899 0,951 0,480 0,893 C-14:1 1,60 1,53 0,72 0,558 0,384 0,468 0,520 C-15iso 0,41 0,32 0,98 0,054 0,013 0,092 0,829 C-15a iso 0,66 0,59 0,99 0,027 0,007 0,052 0,133 C-15:0 1,50 1,58 0,95 0,120 0,037 0,167 0,276 C-16iso 0,30 0,23 0,99 0,031 0,008 0,036 0,425 C-16:0 41,40 40,69 0,89 0,259 0,392 0,070 0,674 C-16:1,tr9 0,06 0,07 0,93 0,175 0,067 0,338 0,240 C-16:1,cis9 2,39 2,25 0,83 0,366 0,213 0,355 0,380 C-17iso 0,34 0,30 0,91 0,215 0,063 0,322 0,491 C-17a iso 0,49 0,43 0,98 0,058 0,015 0,193 0,188 C-17:0 0,66 0,67 0,98 0,054 0,163 0,029 0,055 C-18iso 0,07 0,05 0,96 0,089 0,023 0,237 0,285 C-18:0 5,64 5,83 0,93 0,176 0,394 0,053 0,340 C-18:1tr6/7/8 0,06 0,08 0,56 0,762 0,289 0,674 0,955 C-18:1tr9 0,13 0,14 0,41 0,891 0,547 0,556 0,933 C-18:1tr10 0,08 0,09 0,68 0,613 0,219 0,654 0,821 C-18:1tr11 0,69 0,93 0,92 0,189 0,050 0,315 0,569 C-18:1tr12 0,07 0,09 0,97 0,079 0,019 0,244 0,387 C-18:1tr13 0,12 0,14 0,81 0,407 0,253 0,282 0,460 C-18:1tr15 0,07 0,08 0,63 0,687 0,259 0,915 0,821 C-18:1tr16 0,16 0,19 0,79 0,445 0,141 0,813 0,672 C-18:1cis9 12,94 12,41 0,85 0,338 0,395 0,157 0,391 C-18:1cis11 0,36 0,31 0,88 0,268 0,148 0,412 0,268 C-18:1cis12 0,05 0,05 0,85 0,333 0,684 0,302 0,256 C-18:1cis13 0,06 0,05 0,70 0,590 0,281 0,669 0,611 C-18:1cis15 0,04 0,05 0,68 0,618 0,401 0,594 0,561 C-18:2-tr9,tr12 0,05 0,08 1,0 0,008 0,002 0,178 0,510 C-18:2-cis9,cis12 0,66 0,72 0,88 0,281 0,103 0,147 0,885 C-18:3-cis6,cis9,cis12(γ) 0,04 0,04 0,51 0,813 0,337 0,945 0,907 C-19:0aiso 0,12 0,12 0,78 0,459 0,363 0,536 0,383 C-18:3-cis9,cis12,cis15(α) 0,71 0,94 0,99 0,032 0,007 0,461 0,329 C-19:0 0,06 0,06 0,93 0,170 0,824 0,061 0,222 CLA-cis9,tr11 / tr8,cis10 0,50 0,62 0,76 0,497 0,165 0,594 0,747 CLA-tr11,cis13 0,02 0,04 0,99 0,032 0,007 0,364 0,247 CLA-cis9,cis11 0,03 0,03 0,88 0,267 0,313 0,205 0,242 CLA-Y 0,04 0,04 0,97 0,073 0,413 0,032 0,082 CLA-tr11,tr13 0,01 0,01 0,95 0,125 0,032 0,324 0,414 CLA-tr9,tr11 0,03 0,04 0,88 0,273 0,179 0,203 0,311 C-20:0 0,13 0,13 0,95 0,111 0,092 0,040 0,277 C-20:1-tr11 0,12 0,10 0,85 0,330 0,123 0,193 0,722 C-20:1-cis11 0,03 0,02 0,68 0,619 0,229 0,404 0,971 C-20:2-cis11,cis14 0,01 0,02 0,90 0,221 0,076 0,186 0,494 C-20:3-cis8,cis11,cis14 0,09 0,08 0,96 0,109 0,077 0,041 0,279 C-20:4-cis5,cis8,cis11,cis14 0,07 0,06 0,77 0,472 0,175 0,297 0,874 C-21:0 0,02 0,02 0,61 0,708 0,856 0,612 0,560 C-20:5- cis5,cis8,cis11,cis14,cis17 0,11 0,11 0,61 0,708 0,997 0,330 0,717 C-22:0 0,07 0,07 0,93 0,171 0,493 0,069 0,209 C-23:0 0,04 0,05 0,91 0,201 0,065 0,156 0,582 C-22:5n3 0,12 0,12 0,61 0,709 0,900 0,236 0,952 C-24:0 0,04 0,05 0,90 0,234 0,080 0,155 0,666 Tab 82. Fettsäuremuster der 8 Milchproben aus dem Fütterungssystemvergleich A. Mittlere Fettsäuren -Gehalte je Fütterungsvariante und Signifikanzniveau für Futter-, Gruppen- und Zeiteffekt sowie ges. Modell. Orange markiert: p<0,05, gelb: p <0,1 Fütterungsvergleich A: Wiesenheu vs. Ackerfutterheu (Kleegras) – Ergebnisse 204 4.1.4. Proteomik (MOSLER UND WOHLERS) Es wurden vier Poolproben gemessen (Pool von 1.+2. PrN sowie 3.+4. PrN je Fütterung und Gruppe). Im nanoLC-ESI-Tandemmassenspektrometer konnten 20 minore Molkeproteine annotiert und aufgrund der relativen Abundanzwerte verglichen werden (Gesamtabundanz = 100%). Zudem wurde das vorherrschende Molkenprotein, Laktoglobulin (=LACB) in die Betrachtung aufgenommen, dessen Prozentwert sich auf die minoren plus LACB bezieht. In der Abb. im Anhang F „grundsätzliches Proteinmuster“ ist die relative Häufigkeit der Proteine je Probe dargestellt. Daran wird offensichtlich, dass 11 Proteine nur in geringer Häufigkeit anzutreffen sind (Abundanz <4%). Bei vier der Proteine gab es niedrige Fehlwerte (=NA), die mit jeweils 50% des niedrigsten Messwertes im Set ersetzt wurden. Mit der Hauptkomponentenanalyse (PCA, Abb. 21:) ist der Futtereffekt sehr gut erkennbar, wobei der Eigenwert der PC1 an der Gesamtvarianz 57.8% beträgt. Der zweitgrößte Effekt ist mit 30.7% in der PC2 im Zusammenhang mit der PrN (Zeiteffekt) zu sehen, und der Gruppeneffekt macht mit 11.5% in der PC3 nur noch einen geringen Anteil an der Gesamtvarianz der Daten aus. Der Vergleich der Summe aller p-Werte aus dem ungepaarten t-Test zeigt die gleichen Verhältnisse auf: die Futtereffekte sind mit 7,6 am deutlichsten, gefolgt von den Zeiteffekten (8,7), der Gruppeneffekt ist mit 10,2 am geringsten. Die geclusterte Heatmap im Anhang F veranschaulicht die Abundanzunterschiede. Vier der 21 Proteine sind bei Kleegrasheu-Fütterung erhöht, während für Wiesenheu- Fütterung 6 Proteine erhöht sind. Aber auch Gruppen- und Zeit-Effekte sind erkennbar. Ausgeprägte Fütterungseffekte zeigten sich für 10 Proteine. Für Kleegrasheu finden sich erhöhte Spiegel für Beta-2-microglobulin (B2MG), Beta-1,4-galactosyltransferase 1 (B4GT1), Kappa-casein (CASK), und besonders Alpha-lactalbumin (LALBA). Wie in der Heatmap im Anhang F deutlich zu sehen ist, unterliegt das hochabundante LALBA neben dem hauptsächlichen Futtereffekt auch einem deutlichen Zeiteffekt. Für Wiesenheu sind Serum-albumin (ALBU), Butyrophilin (BT1A1), Alpha-2-HS- glycoprotein-Kette A, Synonym: Fetuin (FETUA), Glycosylation-dependent cell adhesion molecule 1, Synonym: Lactophorin (GLCM1), Beta-lactoglobulin (LACB) und besonders das hochabundante Lactotransferrin (TRFL) erhöht (siehe Tab 83, farbig hervorgehoben). Für LACB besteht auch ein Gruppeneffekt mit niedrigeren Werten in Gruppe 2 (G1-Wiese: 75%, G1-Kleegas: 68%, G2-Wiese: 70%, G2-Kleegras: 61%). Ein reiner Zeiteffekt findet sich für Osteopontin (OSTP), Polymeric immunoglobulin receptor (PIGR) und Zinc-alpha-2-globulin (ZA2G), die im November (1. und 2. PrN) erhöht sind. Ein ebenfalls futterunabhängiger, aber kombinierter Gruppen- und Zeiteffekt zeigt sich für das hochabundante Fatty-acid binding protein (FABP), das in Gruppe 1 niedriger ist als in Gruppe 2 und jeweils im Dezember (3. und 4. PrN) deutlich abfällt (G1-Nov: 6,7%, G2-Nov: 11,9%, G1-Dez: 5.1%, G2-Dez: 8,8%). Fütterungsvergleich A: Wiesenheu vs. Ackerfutterheu (Kleegras) – Ergebnisse 205 Mittlere Werte Zunahme-Faktor Signifikanzniveau (p=) Minore Molkenproteine – relative Abundanzen, in % der gesamten Messwerte Wiesen- heu Kleegras- heu Wheu KGheu Futter- Effekt Gruppen- Effekt Zeit- Effekt ABS PC1 (57.8%) loadings [%] ALBU Serum Albumin 18,44 15,68 1,1 0,006 0,936 0,911 2,2% B2MG** Beta-2-Microglobulin NA 1,53 2,1 Effekt 10,8% B4GT1* Galactosyl Transferase Lactose Synthase Subunit 0,94 2,00 3,1 Effekt 16,4% BT1A1 Butyrophilin 1,63 0,68 2,4 0,019 0,957 0,809 12,4% CASK Kappa-Casein 2,35 3,41 1,4 0,090 0,913 0,594 4,9% CO3 Complement 3 0,34 0,36 1,1 0,837 0,544 0,125 1,5% FABP Fatty Acid-Binding Protein 7,78 8,51 1,1 0,977 0,107 0,550 0,7% FETUA** Fetuin 0,59 NA 2,3 Effekt 11,7% FOLR1** Folate Receptor 1 0,86 0,79 1,3 Effekt 1,8% GLCM1 Lactophorin 26,02 19,54 1,4 0,202 0,476 0,701 4,3% LACB Beta-Lactoglobulin 72,26 64,49 1,1 0,196 0,420 0,868 1,7% LALBA Alpha-Lactalbumin Lactose Synthase Subunit 9,71 20,81 2,2 0,059 0,930 0,670 10,8% MFGM Lactadherin 4,52 4,29 1,1 0,863 0,111 0,562 0,1% OSTP Osteopontin 2,07 2,21 1,2 0,765 0,487 0,174 0,6% PERL Lactoperoxidase 1,09 1,47 1,9 0,513 0,370 0,395 4,6% PIGR Polymeric Immunoglobulin Receptor 1,17 1,16 1,2 0,937 0,703 0,047 0,6% TETN Tetranectin 1,01 0,90 1,2 0,531 0,940 0,119 2,0% TRFE Serotransferrin 0,70 0,79 1,1 0,523 0,148 0,783 2,3% TRFL Lactotransferrin 17,57 11,95 1,5 0,010 0,867 0,949 5,3% XDH Xanthine Dehydrogenase 2,23 1,93 1,2 0,537 0,402 0,345 2,4% ZA2G Zinc-Alpha-2-Glycoprotein 1,86 2,40 1,5 0,570 0,865 0,107 2,9% Tab 83. Mittlere Werte der Protein-Abundanzen (in % der gesamten Messungen) je Fütterungsvariante, Zunahmefaktor, sowie Signifikanzniveau des t-Tests (zweiseitig, ungepaart) für die Faktoren Futter, Gruppe und PrN (Zeit) an mittelwertnormalisierten, log2-transformierten Daten, und Loading der PC1 aus der PCA für Futtereffekte in %. Vom Futter offensichtlich beeinflußte Proteine (p<0,2) sowie deutliche Gruppen- und Zeiteffekte (visuelle Beurteilung der Lage der Werte) farbig hervorgehoben, jeweils höhere Werte fett gedruckt. */**=ein bzw. zwei Fehlwerte (NA). Abb. 21: PCA über die relativen Abundanzänderungen der 21 Proteine für die vier Proben des Fütterungssystemvergleiches A. Farbig (rot/grün) markiert sind die Futter- Varianten, der graue / schwarze Punkt darinnen markiert den PrN-Zeitpunkt. G1 = Gruppe 1(„R“), G2 = Gruppe 2 („L“). Fütterungsvergleich A: Wiesenheu vs. Ackerfutterheu (Kleegras) – Ergebnisse 206 4.1.5. Metabolomik (MOSLER UND WOHLERS) Es wurden vier Poolproben gemessen (Pool von 1.+2. PrN sowie 3.+4. PrN je Fütterung und Gruppe). Bei der Analyse der Spektraldaten aus der GC-TOF- Massenspektrometrie wurden insgesamt 135 vergleichbare Metabolite gefunden. Darunter konnten 82 Substanzen eindeutig annotiert werden. Eine Hauptkomponentenanalyse (PCA) über die 135 Metabolite zeigt, dass Futter-, Zeit- und Gruppeneffekt deutlich voneinander unterscheidbar sind. Die Eigenwerte der Hauptkomponenten vermitteln den herausragenden Futtereffekt (mit 91,1%) (auf der X- Achse dargestellt, Abb. 22:), und die demgegenüber geringen Zeit- und Gruppeneffekte (5,8% und 3,1%). Auch beim Vergleich der Summe alle p-Werte aus dem ungepaarten t-Test über die 122 Metabolite ohne Fehlwerte (s.a. Tabelle im Anhang F „Metabolite von Fütterungssystemvergleich A“) ist der überaus dominante Futtereffekt, (Summe aller p) = 28,9, gegenüber Zeit, 85,4, und Gruppe, 73,9, deutlich, der sich am Großteil der Metabolite zeigt. Unter den annotierten Metaboliten mit Fehlwerten zeigen 8 für Kleegrasheu einen ausgeprägten Anstieg, während sie bei Wiesenheu nicht messbar niedrig waren. Weitere 31 annotierte Metabolite zeigen signifikanten Futtereinfluss im ungepaarten t-Test (p<0.1). Hinzukommen 6 zusätzliche Metabolite, die nur im gepaarten t-Test signifikant beeinflusst sind, d. h. neben Futter- auch Gruppeneffekt, aber keinen Zeiteffekt aufweisen. Diese zusammen 45 Metabolite trennen sich in der geclusterten Heatmap im Anhang F (Metabolite im Fütterungssystemvergleich A) anschaulich in die 33, die für Kleegrasheu mitunter sehr stark ansteigen, und die 12 bei Wiesenheu erhöhten. Bei Wiesenheufütterung fällt auf, dass vor allem Zuckervarianten wie Fruktose und Galaktose sowie Glukon- und Galaktonsäure erhöht sind und ebenso Vitamin C (Dehydroaskorbat), die zwar nur geringe Anstiege (Faktor <1,6) aufweisen, andererseits aber von vornherein auf hohem Spiegel standen (siehe Tab 84). Bei Kleegrasfütterung hingegen übersteigen die Zunahmen mitunter Faktor 10. Abb. 22: PCA über 135 Metabolite für die vier Proben aus dem Fütterungssystemvergleich A. Farbig (rot/grün) markiert sind die Futter- Varianten, der graue / schwarze Punkt darinnen markiert den PrN-Zeitpunkt. G1 = Gruppe 1(„R“), G2 = Gruppe 2 („L“). Fütterungsvergleich A: Wiesenheu vs. Ackerfutterheu (Kleegras) – Ergebnisse 207 Mittlere Werte Zunahme-Faktor für Futter- effekt Gruppen -effekt Zeit- effekt Metabolite, die signifikante (p<0,1) Futtereffekte aufweisen, in C13-Sorbitol- normalisiertem Einheitsmaß Wiesen- heu Kleegras- heu Wiesen- heu KG- Heu Signifikanz-Niveau (p=) Futtereffekt loadings [%] für PC1 (91.1%) Butyric acid 2-amino- 0,469 1,253 2,8 0,062 0,676 0,880 1,4% Creatinine 0,066 0,589 9,6 0,016 0,866 0,883 2,9% Dehydroascorbic acid dimer 0,838 0,652 1,3 0,024 0,796 0,927 0,3% Erythritol 0,789 0,711 1,1 0,039 0,773 0,844 0,1% Erythronic acid 0,788 1,206 1,5 0,081 0,659 0,802 0,6% Fructose 1,277 1,084 1,2 0,011 0,898 0,889 0,2% Fumaric acid** NA 0,066 Zunahme Effekt Kein E. Kein E. 1,2% Galactonic acid 1,156 0,808 1,5 0,081 0,938 0,611 0,5% Galactose 1,824 1,621 1,1 0,043 0,879 0,737 0,2% Glucaric acid-1-4-lactone 0,810 1,018 1,3 0,277 0,315 0,913 0,4% Gluconic acid 1,152 0,783 1,5 0,095 0,944 0,579 0,5% Glucose 2-deoxy- 0,828 1,068 1,3 0,144 0,488 0,923 0,4% Glucose-6-phosphate** NA 0,286 Zunahme Effekt Kein E. Kein E. 1,1% Glucuronic acid-3-6-lactone 1,111 0,954 1,2 0,092 0,979 0,581 0,2% Glutamic acid 0,005 0,071 13,1 0,015 0,833 0,947 3,4% Glyceraldehyde-3-phosphate* 0,163 0,704 5,3 Effekt Kein E. Kein E. 2,4% Glyceric acid 0,515 1,331 2,7 0,167 0,461 0,875 1,5% Glycerol 2,065 1,316 1,6 0,051 0,775 0,780 0,5% Glycerol-3-phosphate 0,026 0,300 11,6 0,022 0,794 0,983 3,3% Hexadecanoic acid 0,393 0,878 2,2 0,003 0,922 0,995 1,0% Inositol myo- -1-phosphate 0,306 0,448 1,5 0,091 0,893 0,597 0,5% Isoleucine* 0,179 0,472 3,2 Effekt kein E. kein E. 1,8% Lysine 0,308 0,722 2,4 0,034 0,752 0,928 1,1% Lyxose 1,080 0,973 1,1 0,082 0,751 0,690 0,1% Mannose 1,247 1,123 1,1 0,002 0,947 0,980 0,1% Nicotinamide 0,739 0,983 1,3 0,289 0,298 0,954 0,5% Octadecanoic acid 0,355 0,601 1,7 0,107 0,558 0,916 0,8% Octadecenoic acid 6-(Z)- 0,740 0,997 1,3 0,018 0,820 0,936 0,4% Ornithine 0,624 0,924 1,5 0,030 0,874 0,794 0,5% Pantothenic acid 0,316 0,778 2,5 0,019 0,804 0,989 1,2% Phenylalanine** NA 0,564 Zunahme Effekt kein E. kein E. 1,3% Phosphoenolpyruvic acid 0,042 0,316 7,7 0,021 0,802 0,956 2,7% Phosphoric acid 0,272 1,190 4,3 0,042 0,716 0,964 2,0% Proline 0,038 0,189 5,4 0,028 0,815 0,857 2,2% Proline 4-hydroxy-** NA 0,286 Zunahme Effekt kein E. kein E. 1,3% Propane-1-2-diol 3-amino- 0,446 0,704 1,6 0,051 0,831 0,735 0,6% Pyroglutamic acid 0,021 0,230 10,8 0,024 0,793 0,932 3,1% Serine 0,077 0,466 6,2 0,031 0,757 0,947 2,4% Tetradecanoic acid 0,637 1,007 1,6 0,012 0,969 0,850 0,6% Threitol 1,352 1,151 1,2 0,241 0,349 0,971 0,2% Threonine 0,114 0,701 5,9 0,046 0,724 0,881 2,4% Tyrosine 0,205 0,181 1,1 0,096 0,831 0,608 0,1% Uracil** NA 0,385 Zunahme Effekt kein E. kein E. 1,7% Uridine** NA 0,272 Zunahme Effekt kein E. kein E. 1,2% Vanillic acid 0,265 0,768 2,9 0,001 0,957 1,000 1,4% Tab 84. Metabolite der vier Proben aus dem Fütterungssystemvergleich A, die im ungepaarten T-Test mit p<0,1 signifikante Futtereffekte aufweisen. Mittlere Werte je Fütterungsvariante, mit Zunahmefaktor, Signifikanzniveau für die Effekte Futter, Gruppe und Zeit, und Loading der PC1 aus der PCA für Futtereffekte in %. * / ** = ein bzw. zwei Fehlwerte, die für die PCA ersetzt wurden. NA = Fehlwert (nicht meßbar). Farbig markiert: Substanzen mit hohen Zunahmefaktoren (>2,0). Fütterungsvergleich A: Wiesenheu vs. Ackerfutterheu (Kleegras) – Ergebnisse 208 4.1.6. Steigbilder Material und Methoden Bildmaterial: Für jede der vier PrN lag aus jeder der zwei Gruppen 1 Poolprobe vor, die vor den Untersuchungen gedoppelt und codiert wurde; insgesamt 4 Proben je PrN. Diese wurden in mehreren Verdünnungsstufen untersucht. Zusätzlich wurden diese Proben (in anderer Bezeichnung) für methodische Fragen verwendet (siehe Teil „Charakterisierung der Steigbildmethode“, Proben-Nr. 1 bis 40). Bildauswertung: Die Bildauswertung erfolgte gemäß dem in dieser Arbeit üblicherweise vorgenommenen Schema (Kapitel 3.1.8). Es wurden Bilder von frischer Milch in verschiedenen Konzentrationsstufen ausgewertet (keine Alterung). Die Auswertung (an mit Nummern / Buchstaben beschrifteten Bildern) erfolgte im Juli 2009. Die Decodierung fand nach vollständiger Bildauswertung statt (nach Schritt C). Fütterungsvergleich A: Wiesenheu vs. Ackerfutterheu (Kleegras) – Ergebnisse 209 A) Ergebnis der Gruppierung und Charakterisierung je PrN 1. PrN: (Bilder vom 26.11.07, insges. 8 Bilder) Gruppierung korrekt Probe-Nr 718 + 111 648 + 903 ja 0,075 F heller, kürzer, verwaschenere Kontur. F-Ansätze höher F dunkler, länger, konturierter. F-Ansätze niedriger 0,062 F schmaler, konturierter, heller, gestalteter S=1,7 F breiter, verwaschener, dunkler, „mastiger“ S=3 Wirkung auf den Betrachter F „zarter“, „feiner“, „zus.-gezogener“ „licht, zart“ F „derber“, „gröber“, „kräftiger“, „rund“. „rund, wäßrig, Wärme“ Decodierung Wiesenheu – G1 Kleegrasheu- G2 2. PrN: (Bilder vom 1.12.07, insges. 12 Bilder) Probe-Nr 18 + 8 5 + 7 ja 0,075 (R3-ende) GB=3 Sockel heller S konturiert GB=4 Sockel dunkler S verwaschen, 0,075 F heller, differenzierter, durchgestaltet DL weiter, heller S gestaltet, durchgeformt. GB=2 F dunkler, verwaschen DL enger, dunkler S wenig gestaltet, eher verwaschen GB=4 0,062 „licht“ „wärme-wäßrig, kräftig“ Wirkung auf den Betrachter S „schlicht“ F klarer gestaltet, „hell, licht, differenziert gestaltet“ S „füllig“, „rund“, „weich“ F „fülliger“, „satt“, „weich“ „dunkel, kräftig, wäßrig, mächtig“ Decodierung Wiesenheu – G1 Kleegrasheu- G2 3. PrN: (Bilder vom 13.12.07, insges. 8 Bilder) Probe-Nr f, j b, i ja 0,075 F-Ansatz verwaschen S=4, Srand schmal GB=3 F heller DL enger, gleichmäßiger F-Ansatz konturiert S=6, Srand breiter GB=4 F dunkler DL breiter, unregelmäßiger 0,062 GB=3 F-Ansätze niedriger F schmaler, aber z.T. auslaufend. F gerader, paralleler, gehaltener GB=3,5 F-Ansätze hoch F breit F bewegter Wirkung auf den Betrachter F „gebündelter“, „starrer“, „licht“ F „ausladend“, aber innerer Haltepunkt. „wäßrig“ Decodierung Wiesenheu – G2 Kleegrasheu- G1 4. PrN: (Bilder vom 15.12.07, insges. 8 Bilder) Probe-Nr. s + r h + m ja 0,075 Ocker Linie oben weniger F verwaschen, breit, bewegt, dunkler Srand breit, fast gelöst, verwaschen S=5-6 DL unruhiger, „kruzelig“ Bart heller, breiter Ocker Linie merh F konturiert, aufrecht, schmal, lang, heller Srand schmaler, konturierter S=3-4 DL gleichmäßiger Bart dunkler, schmaler 0,062 F-Ansätze höher F weniger konturiert F schmaler, paralleler F-Ansätze niedriger F mehr konturiert, differenzierter ausgestaltet. F breiter, bewegter Wirkung auf den Betrachter „zierlich-zart“ „gestört“, empfindlich. Feines Ordnungsprinzip ging verloren. „schwach“, „licht“ (und etwas wäßrig) „ruhig“, „dick“, „füllig, schwer“, „deftig“. „hier stehe ich“, „propper“. „kräftig“, „wäßrig- wärmend“ (aber auch licht) Decodierung Wiesenheu – G2 Kleegrasheu- G1 Tab 85. Steigbildergebnisse (Gruppierung und Charakterisierung) zum Fütterungssystemvergleich A Fütterungsvergleich A: Wiesenheu vs. Ackerfutterheu (Kleegras) – Ergebnisse 210 B) Ergebnis der Zuordnung bei wiederholter PrN Es wurden jeweils die Bilder mit 0,075 ml (26.11.: 0,06ml) Milch zum Vergleich untereinander ausgewählt. Entsprechend der Sockel-Merkmale (grau vs. rötlich) wurden erst die in Tab 86 grau hinterlegten Bilder (Variante B) untereinander gelegt. Nach der danach sehr auffälligen Merkmalsausprägung der FZ („länger, konturierter, heller“ vs. „kürzer, verwaschener, dunkler“) können die Bilder jedoch auch in folgender Gruppierung liegen (die im weiteren ausschlaggebend sein soll): Datum Bildererstellung (Gruppe 1) (Gruppe 2) Gruppierung korrekt Zuordnung zu vorhergehender PrN korrekt 16.11.07 718 Wheu-G1 111 Wheu-G1 648 KGheu-G2 903 KGheu-G2 Ja 1.12.07 18 Wheu-G1 8 Wheu-G1 5 KGheu-G2 7 KGheu-G2 Ja ja 13.12.07 b KGheu-G1 i KGheu-G1 f Wheu-G2 j Wheu-G2 Ja 15.12.07 h KGheu-G1 m KGheu-G1 s Wheu-G2 r Wheu-G2 ja ja Tab 86. Übersicht der vorgenommenen Gruppierung und der Zuordnung der Proben zueinander (Fütterungssystemvergleich A), incl. Decodierung in Rot, und Beurteilung des Gruppierungserfolges / Zuordnungserfolges. Es ist in Tab 86 jeweils die Probennummer angegeben, ergänzt durch die Decodierung (in Rot). Daraus kann abgelesen werden, dass die Gruppierung an allen vier PrN-Terminen möglich war, und dass die Bilder der 2. PrN denen der 1. PrN sicher zugeordnet werden konnten, sowie die Bilder der 4. PrN denen der 3. PrN. Die Zuordnung von der 3. zur 2. PrN (bei Futterwechsel) ist auf zweierlei Weise möglich: entweder nach „Futter“, oder nach „Gruppe“ – je nachdem, welche Bildmerkmale berücksichtigt werden. Insofern kann hier nicht eine „korrekte“ Zuordnung ermittelt werden. Die grau hinterlegten Proben werden im weiteren Auswertungsverlauf (an den noch codierten Proben) als „Variante B“ bezeichnet, die anderen als „Variante A“. Die untereinander liegenden werden im Weiteren als „Gruppe 1“ und „Gruppe 2“ bezeichnet – ohne zu wissen, ob es sich tatsächlich um die „Tiergruppe“ oder „Fütterungsvariante“ handelt, einzig zum Unterscheiden der beiden Einflüsse. Fütterungsvergleich A: Wiesenheu vs. Ackerfutterheu (Kleegras) – Ergebnisse 211 C) Ergebnis zum Ermitteln probenspezifischer Bildmerkmale Folgende Bildmerkmale wurden an den codierten Bildern ermittelt, die „gruppenspezifisch“ auftreten (d.h. nach denen die eine Zuordnung von der 2. zur 3. PrN – nach FZ-Merkmalen – vorgenommen werden kann): Gruppe 1 Gruppe 2 F länger, unten konturierter, am Ansatz steiler-spitz, F heller, paralleler Strukturiertere S und F F breiter, kürzer, verwaschener, am Ansatz oben bald breiter werdend, F dunkler, beweglicher Verwaschenere, unstrukturiertere S und F Decodierung Gruppe 1 „Wheu-KGheu“ Gruppe 2 „KGheu-Wheu“ Tab 87. Bildmerkmale, die im Zusammenhang mit der Gruppe auftreten Folgende Bildmerkmale wechseln die Gruppen nach der zweiten Probenahme (d.h. sind sehr auffällig und wurden auch zur ersten Zuordnung der Bilder von der 2. zur 3. PrN verwendet / sind in allen Bildern der entsprechenden Variante anzutreffen): Variante A (Wiesenheu) Variante B (Kleegrasheu) Sockel grau-braun, heller DL heller Weniger g.B., farbschwächer S mehr „gefaßt“ gestaltet, „kleiner“ F „lichter = heller“, zarter, fein-gestaltet, „spitziger“, „lichter“, „innerlich scharf gehalten“ (Innere Konzentration) Mehr weißliche Bereiche zwischen F und SZ. „lichter“, „zierlich-zart-durchgestaltet“, aufstrebend Jeweils 2. PrN: S-rand breiter, etwas gelöst, S ungewöhnlich vergrößert, SZ ein wenig unregelmäßig Tendenz zu „untypisch“, („Störung“), deswegen Bild äußerlich rel. verwaschen, ungestaltet. Sockel rötlich-braun, dunkler DL dunkler Mehr g.B., farbintensiver S „lockerer“ geformt, „größer“. F etwas „dunkler“, „weicher“, „runder“, „wäßriger“, „sich nach außen wolkig ausbreitend“ (Umraum) Weniger weißliche Bereiche zwischen F und SZ „wäßrig“, „Wärme“, „rund“, schwer-lastend, „dick-behäbig“ „füllig-schwer“ Decodierung Wiesenheu Kleegrasheu Tab 88. Bildmerkmale, die im Zusammenhang mit der Fütterung auftreten Es ist im Zusammenhang mit der Decodierung in Tab 86 deutlich, dass sich Bildmerkmale finden, die entsprechend des Cross-Over-Designs konstant bleiben: die einen (in diesem Fall recht auffälligen), die mit der Fütterung zusammenhängen, und die anderen, die sich v.a. in der FZ wiederspiegeln und weniger auffällig sind, die mit der Gruppe im Zusammenhang stehen. Eine umfassende Bonitur der einzelnen Bildbereiche je Probenahme-Termin ist im Anhang B aufgeführt. Fütterungsvergleich A: Wiesenheu vs. Ackerfutterheu (Kleegras) – Ergebnisse 212 Zusammenfassung der Steigbild-Ergebnisse 1) Je vier Bilder einer Probennahme liessen sich an allen Probenahmeterminen in zwei Gruppen gruppieren. 2) Eine Zuordnung der Gruppen zu den Gruppen einer vorhergehenden Probennahme war bei zwei von drei Terminen möglich. Eine Zuordnung von der 3. zur 2. PrN war auf zweierlei Weise möglich: beide Effekte des Cross- Over-Designs zeigen sich in den zwei möglichen Zuordnungen der Bilder. 3) Es ließen sich deutlich Bildmerkmale ermitteln, die im Zusammenhang mit der Fütterung / dem Futterwechsel innerhalb der Gruppe stehen (siehe Tab 88). 4) Die Bildmerkmale, die im Zusammenhang mit der Fütterung auftreten, sind auffälliger als diejenigen, die im Zusammenhang mit der Tiergruppe auftreten. Fütterungsvergleich A: Wiesenheu vs. Ackerfutterheu (Kleegras) - Diskussion 213 4.2. Diskussion Fütterungssystemvergleich A 4.2.1. Zur Probenherkunft Die beiden gefütterten Rationen weisen eine Reihe von Unterschieden auf: nicht nur das Ausgangsmaterial ist unterschiedlich (Kleegras vs. Wiesengras). Das Kleegras stammt aus dem Ackerfutterbau, das Wiesengras vom Dauergrünland. Auch die Trocknungsart war unterschiedlich: das Kleegrasheu aus der Heutrocknung, das Wiesengrasheu von Bodentrocknung und z.T. etwas ausgeblichen. Dass das Kleegrasheu von den Kühen bevorzugt wurde (gefolgt von höherer Milchleistung) kann u.a. damit zusammenhängen. Ein Vergleich dieser beiden Systemvarianten ermöglicht aufgrund der multifaktoriellen Effekte somit keinen Rückschluss auf „Kleegras“ oder „Wiesengras“-Effekte. Für inhaltiche Rückschlüsse müssten immer die weiteren Systemeffekte mit bedacht werden. Aber eine direkte Rückführung der Ergebnisse auf einzelne Effekte ist aufgrund des multifaktoriellen Systemvergleichs nicht angemessen. Eine von der Fütterungsvariante unabhängige Charakterisierung der Probenqualitäten und der Vergleich dieser durch verschiedene Methoden ermittelten Probeneigenschaften ist jedoch möglich und wird zum Vergleich der Methoden verwendet. 4.2.2. Milchleistung und Gehalte von Fett, Eiweiß, Lactose, Harnstoff und Zellzahl Bei Kleegrasheu-Fütterung ist die Milchleistung je Gruppe höher als bei Wiesenheu- Fütterung. Am 12.12. (3. PrN) sind die Gruppen einander recht ähnlich – da sie noch in der Phase des Futterwechsels sind. Bei der 4. PrN ist die eine Gruppe extrem niedrigleistend – die andere hat ihre Leistung im Vergleich zur vorherigen PrN kaum steigern können, weil vermutlich beide aufgrund von äußeren Faktoren beeinträchtigt werden. Der Futter-Effekt wird im Vergleich der zwei Gruppen jedoch sehr deutlich. Die Ursache der extrem geringen Milchleistung liegt einerseits darin, dass zwei Kühe am Ende der Laktation stehen, und eigentlich vor 1 bis 2 Wochen hätten trockengestellt werden sollen. Aber auch andere haben ihre Milchmenge stark reduziert – stärker als über das fortgeschrittene Laktationsstadium hinaus zu vermuten gewesen wäre. Auch wurden keine frischlaktierenden Kühe in den Versuch integriert. Der Landwirt sieht die geringe Milchleistung im Zusammenhang mit der nicht ausreichenden Fütterung der Wiesenheu- Gruppe (die auch weniger frißt als die Kleegrasheu-Gruppe). Vermutlich in Folge der Blauzunge-Impfung fiel die Milchleistung der Herde deutlich ab, und einige Kühe hatten Euterentzündungen und Stoffwechsel-Probleme. Theoretisch könnte das aber auch mit einer unausgeglichenen Fütterung (zu hohes Protein/Energie- Verhältnis) zu Ende der Weidephase zusammenhängen, die sich in hohen Harnstoffwerten Anfang Oktober zeigt (Weidegang, Kleegras, s.a. TREVASKIS und FULKERSON 1999, FULKERSON et al. 1997). Fütterungsvergleich A: Wiesenheu vs. Ackerfutterheu (Kleegras) - Diskussion 214 Der sich mit der Fütterung ändernde Lactosegehalt wurde auch mit der proteomischen Untersuchung ermittelt. Jedoch sind die Unterschiede mit 0,08% sehr geringfügig. Der um 0,2% (nicht signifikant) erhöhte Fettgehalt bei Wiesenheu-fütterung kann im Zusammenhang mit der gleichzeitig zu beobachtenden reduzierten Milchleistung gesehen werden. 4.2.3. Fettsäuremuster Vergleichbar z.B. mit den proteomischen Ergebnissen ist der Futtereffekt im Fettsäuremuster (ermittelt an der geringen Summe der p-Werte) relativ groß im Vergleich zum Gruppeneffekt oder gar dem Zeiteffekt. Weil die Kühe bei der Wiesenheu-Variante mit geringer Milchleistung und etwas erhöhten Fettgehalten Anzeichen für rohfaser- und strukturreiche Rationen zeigen wäre es naheliegend, dass die Fettsäuren vermehrt kurzkettig auftreten (wie für rohfaserreiche Rationen bekannt ist – CHILLIARD et al. 2000). Dies lässt sich jedoch im Vergleich zur Kleegras-Variante nicht beobachten. Die Fett-de-novo-Synthese scheint bei der Kleegras- Variante ausgeprägter zu sein als bei der Wiesenheu-Variante, was sich auch in den metabolomischen Ergebnissen widerspiegelt. Die Kleegrasheu-Variante führte generell zu erhöhten Werten für fast alle kurz- und langkettigen Fettsäuren, somit sind auch die PUFA’s und die Summe der CLA erhöht, ebenfalls die ALA (C-18:3-cis9,cis12,cis15 (=n3)) und LA (C-18:2-cis9,cis12). Dies spricht sowohl für eine ausgeprägte Fett-de-novo-Synthese (aufgrund der kurzkettigen Fettsäuren), aber auch für eine umfassende Übernahme der vermutlich im Futter großzügig vorhandenen langkettigen C-18-Fettsäuren. Da PUFA’s und CLA’s als in vielerlei (gesundheitlicher) Hinsicht „vorteilhaft“ beschrieben werden (BELURY 2002, MCGUIRE UND MCGUIRE 2000), kann die Milch der Kleegrasheu-Variante diesbezüglich mit positiven Eigenschaften aufwarten. Außerdem weist diese Fütterungsvariante somit Merkmale auf, die für grünfutterbasierte, kraftfutterarme Fütterungsvarianten bekannt sind (BUTLER et al. 2007, NOZIERE et al. 2006, COLLOMB et al. 2002a und b). Das gesamte Fettsäuremuster der Kleegrasheu-Variante erscheint insofern „üppiger“, da es sowohl im kurz-als auch langkettigen Bereich erhöhte Werte aufweist, die mit Fett- Neubildung oder gesundheitlich vorteilhaften Eigenschaften verbunden sind. Die Wiesenheu- Variante könnte demgegenüber als etwas „magerer“ bezeichnet werden. 4.2.4. Proteomik Es kann aufgrund der PCA und dem geringen summarischen p-Wert der T-Test- Ergebnisse davon ausgegangen werden, dass vorrangig ein deutlicher Futtereffekt vorliegt. Fütterungsvergleich A: Wiesenheu vs. Ackerfutterheu (Kleegras) - Diskussion 215 Demgegenüber fällt der Gruppen-Effekt kaum ins Gewicht – ähnlich wie bei den anderen, parallel angewendeten Methoden. Zwar zeigen sich an den beiden hochabundanten Proteinen FABP und LACB durchaus Gruppenunterschiede, aber so gering, dass die Teilung der Versuchsherde als gleichmäßig beurteilt werden kann. Eine Interpretation der Abundanz-Veränderungen der einzelnen Proteine im Hinblick auf physiologische Vorgänge unter Futtereinfluss ist nicht einfach, weil die Proteine einerseits oft multifunktionell sind, und andererseits beim Verdau teilweise bioaktive Peptide freisetzen, die ihrerseits zusätzliche Funktionen haben. Bei den Proteinanstiegen unter Wiesenheu-Fütterung fallen einige funktionelle Bereiche auf. Butyrophilin (BT1A1), ein Membranprotein, spielt bei der Fetttröpfchenbildung eine zentrale Rolle, so dass vermutet werden kann, dass die Fetttröpfchen kleiner sind und daher mehr Membranmaterial gebraucht wird. Lactophorin (GLCM1) wird dem Milchmucinkomplex zugerechnet, wo es einerseits durch daran gekoppelte Oligosaccharide spezielle Bakterienstämme fördert und andere hemmt, und andererseits an der Verdichtung des die Verdauungstraktmukosa schützenden Schleims beteiligt ist (s.a. FORDER 2007). Besonders markant ist die Erhöhung von Lactotransferrin (TRFL), das zweiwertige Metallionen, vor allem Eisen, transportiert, also somit der Blutbildung dient und dem wahrscheinlich ein reiches Mineralienangebot zugrundeliegt. Fetuin ist zwar geringabundant, transportiert aber speziell Spurenelemente, die in vielen Enzymen essentiell sind, und fördert die Knochenmineralisierung. Der 10%ige Anstieg des abundantesten Molkenprotein, Beta- lactoglobulin (LACB), hat großes Gewicht. LACB wird unter anderem zugeschrieben, der Gewebedifferenzierung und Immunsystementwicklung, als geschützte Aminosäurequelle und als Transporter für große hydrophobe Moleküle, insbesondere dem für die Knochenmineralisierung notwendige Vitamin D2, zu dienen. – Folglich spiegeln die Anstiege unter Wiesenheufütterung die Anpassung an eine „magere“ Futterlage inklusive dem entsprechenden Schutz und eine Ausrichtung auf zeitbeanspruchende Gewebereifung. Demgegenüber steht Kleegrasheumilch im Zeichen von hohem Energiegehalt und Nährstofffülle. Die Erhöhung von Kappa-casein (CASK), dem Regulator der Kaseinmicellgröße, lässt Veränderungen im Kaseinspektrum vermuten (jedoch waren die Kaseine hier nicht Gegenstand der Untersuchung). Das niedrigabundante Beta-1,4- galactosyl transferase 1(B4GT1) und das hochabundante Alpha-lactalbumin (LALBA) bilden zusammen die Lactosesynthase. Ihre Erhöhung steht augenfällig mit dem hohen Lactose- Gehalt in Zusammenhang. Beides wird sich auf Prozesse wie die Verkäsung auswirken. LALBA hat aber vorallem vielfältige Transporterfunktionen. Sein überaus starker Anstieg ist vermutlich auch für die Herunterregulierung von Serum albumin (ALBU) verantwortlich. Der Anstieg des niedrigabundante Beta-2-microglobulin (B2MG), dem Immunoglobulin-G- Transporter, hat wahrscheinlich damit zu tun, dass das höhere Nährstoffangebot mit einer erhöhten intestinalen Resorbtionsrate einhergeht, und kann als Präventivmaßnahme zum Fütterungsvergleich A: Wiesenheu vs. Ackerfutterheu (Kleegras) - Diskussion 216 Schutz der Darmwand gesehen werden. Kleegrasheumilch ist somit ausgerüstet, „schnellen“ Wuchs zu nähren und die Energiespeicher zu füllen. Neben diesen Futtereffekten sind zwei Zeiteffektbeobachtungen von Bedeutung. Zum einen zeigt LALBA nach initialen drei Wochen Wiesenheu beim Wechsel auf Kleegrasheu eine große Hochregulierung (Faktor 2,7). Umgekehrt wird beim Start mit Kleegrasheu nur ein halb so hoher LALBA-Wert erreicht und beim Wechsel zu mager wird auch nicht so ein niedriger Wert erreicht. Daraus folgt, dass die Gruppe 1 nach initialen drei Wochen Wiesenheu etwas ausgehungert war, während Gruppe 2 nach Kleegrasheu mit größeren Reserven in die Wiesenheufütterung ging. Hier liegt ein deutlicher Carry-Over-Effekt vor – der mit einer neutralen Zwischenfütterung evtl. hätte abgefangen werden können. Dass er so stark auftritt kann im Zuammenhang der deutlich unterschiedlichen Rationen (Grundfutter) gesehen werden, bei Versuch B (Ergänzungsfutter) sind die Carry-Over-Effekte geringer. Eine weitere Besonderheit sind die im November erhöhten Werte von Polymeric immunoglobulin receptor, dem IgA-Transporter (PIGR), Zinc-alpha-2-globulin (ZA2G), Osteopontin (OSTP), Fatty-acid-binding protein (FABP) und Fetuin (FETUA) gegenüber der PrN im Dezember. Alle diese Proteine sind in Abwehrreaktionen involviert und sind ein Indiz für zeitgleiche und gleichgroße Immunaktivität in der Herde, die im Zusammenhang mit der Blauzunge-Impfung kurz vor Beginn des Fütterungssystemvergleiches gesehen werden kann bzw. der allgemeinen Gesundheitslage der Herde (Milchleistungseinbruch nach Impfung, s.a. Diskussion zur Milchleistung und F,E,L-Werten) Fütterungsvergleich A: Wiesenheu vs. Ackerfutterheu (Kleegras) - Diskussion 217 4.2.5. Metabolomik Die Ergebnisse der PCA und die für den Futtereffekt geringen p-Werte des T-Testes (im Vergleich zu den p-Werten der anderen Effekte) beweisen den in diesem Probensatz sehr deutlichen Futtereffekt. Somit kann von einer deutlichen Differenzierung der Proben hinsichtlich des Futters mit dieser Methode gesprochen werden. Eine qualitative Beurteilung bzw. Charakterisierung der Proben ist dahingehend möglich, dass die Kleegrasheufütterung zu beachtlichen Konzentrationsanstiegen zahlreicher Metabolite führt. Diese Milch zeigt insgesamt ein höheres chemisches Energieniveau und ein größeres Potential für energieaufwendige Biosynthesen: Phosphorylierte Bausteine des C3- und C6-Metabolismus liegen stark erhöht vor, Glycerol-3- Phosphat, Phosphoenolpyruvat und Glyceraldehyd-3-Phosphat sowie Pyroglutamat. Hinzu kommt das dabei benötigte Vitamin Nicotinamid. Auch zentrale Bausteine der Fettbildung wie C14-, C16- und C18-Fettsäuren sowie das Vitamin Pantothensäure sind erhöht. Und für den Proteinaufbau nötige Aminosäuren wie Phenylalanin, Serin, Threonin sowie Prolin, und insbesondere die für den Bindegewebsaufbau wichtigen Aminosäuren Hydroxyprolin und Lysin weisen hohe Anstiege auf. Kleegrasheu bietet in hohem Maße biochemische Bausteine und Energieträger an, so dass die Milch aus dessen Verfütterung als äußerst nahrhaft im Sinne von Fett- und Gewebeaufbau beurteilt werden kann („Substanzbildung“). Wiesenheu wirkt hingegen im Vergleich dazu „mager“. Die dafür gefundenen Metabolitanstiege scheinen eher Energieträger und Vitamine für bestimmte Zwecke abseits von schnellem Wuchs zu sichern und damit dem Schutz vor Mangelerscheinungen zu dienen (z.B. Fructose als Energieträger für die Leberfunktionen), bis wieder reicheres Futter zugänglich ist. Außerdem sind Metabolite vermehrt anzutreffen, die mit der Ausdifferenzierung von Gewebe in Verbundung gebracht werden können – in dem Sinne, dass Wachstum immer in Schüben stattfindet, und einmal mehr Substanzbildung/Wuchs, dann wieder mehr Gewebe-differenzierung auftritt, unterstützen beide Qualitäten die für ein gesundes Wachstum wichtigen Funktionen. Jede für sich unterliegt einer gewissen Einseitigkeit, die zu Ernährungszwecken (bei Mensch oder Kalb) aber u.U. gewünscht sein kann. Fütterungsvergleich A: Wiesenheu vs. Ackerfutterheu (Kleegras) - Diskussion 218 4.2.6. Steigbilder Zu den Bildern (Bild-Merkmals-Variation) An allen Bildererstellungs-Tagen traten sowohl im FZ- als auch im SZ-Bereich relativ große Bildvariationen innerhalb der Doppel auf. Oft konnte nach der SZ die eine Gruppierung, nach der FZ eine andere Gruppierung vorgenommen werden. Zur Festlegung der Gruppierung war deshalb ausschlaggebend, welche der Gruppierungen mit mehr sicheren Merkmalen (v.a. der Sockel- und Schalenzone) belegt werden konnte (SB-Abb-20- Fütterungssystemvergleich A, im Anhang G). Die Streuung der Bild-Merkmale kann mehrere Ursachen haben: einerseits kann es in den Proben begründet sein, die auf dem Hof abgefüllt und evtl. ungleichmäßig rasch gekühlt wurden (per Eisakkus). Andererseits kann es am Labor-Prozeß liegen: zu dem Zeitpunkt der Bildererstellung war noch nicht bewußt, dass die Zeit, die eine Probe angerührt im Labor steht, der Rühr- und Pipettier-Vorgang, der Standplatz des Bildes auf dem Tisch und die Zeit, zu der die Probe pipettiert wird, einen deutlichen Einfluß auf die Bildmerkmals-Ausprägung haben können. Auch die Zeitdauer, in der die Bilder in der Ag-Phase zugedeckelt sind, hat einen deutlichen Einfluß auf die Bild-Merkmals-Ausbildung. Dieses wurde erst in späteren Untersuchungen sehr gewissenhaft berücksichtigt – bei der Erstellung dieser Bilder war die Charakterisierung der Methode noch nicht ganz abgeschlossen. Aufgrund der vielen möglichen Faktoren kann nicht genau gesagt werden, welcher davon die tatsächliche Ursache der Bildvariation ist – vermutlich sind es alle zusammen. Bei später erstellten Bildern (unter vollständiger Standardisierung der Labormethode) sind die Variationen der Bildmerkmale deutlich geringer. Zur Zuordnung bei wiederholte PrN Es wurden die Bilder einander zugeordnet, deren Sockel-Merkmale sich ähneln („grauer“ vs. „rötlicher“), und die bei der ersten Beurteilung (je PrN für sich) mit „lichter“ bzw. „wäßriger“ bezeichnet wurden – in der Vermutung, dass die Bildmerkmale je Gruppe sich weniger ändern (also ausgeprägter sind), und die Fütterung einen geringeren Effekt als die Tierzusammenstellung hat. Als die Bilder jedoch auf diese Weise zusammengelegt waren, entstand der Eindruck, dass sich die FZ-Charakteristik nach der 2. PrN deutlich verändert und die Gruppen wechselt – somit waren sowohl Merkmale zu bemerken, die sich in der Gruppe fortsetzen, als auch welche, die die Gruppe wechseln. Beide Merkmalsveränderungen (also beide Effekte, Gruppe sowie Futter) waren ähnlich deutlich – in verschiedenen Merkmalen – wahrzunehmen, mit leichter Tendenz zu mehr Futter- Effekten. Weil es hier nicht beabsichtigt war, eine Zuordnung zur Fütterungsvariante vorzunehmen, wurden beide Möglichkeiten als gleichwertig in Betracht gezogen. Bei der Decodierung wurde klar, welches die Gruppe bzw. Fütterungsvariante war. Fütterungsvergleich A: Wiesenheu vs. Ackerfutterheu (Kleegras) - Methodenvergleich 219 4.3. Methodenvergleich Fütterungssystemvergleich A Differenzierung: Methode Differenzierungsfähigkeit Effekt-Intensität Milchleistung W ≠ KG Einzelkuh > Futter > PrN Fettgehalt Eiweißgehalt Lactosegehalt Harnstoff W = KG W = KG W ≠ KG W ≠ KG Gruppe > Futter > PrN Gruppe > Futter > PrN Futter > Gruppe + PrN Futter > PrN > Gruppe Gärprobe n.b. n.b. Fettsäuremuster W ≠ KG Futter > Gruppe > PrN Proteomik W ≠ KG Futter > PrN > Gruppe Metabolomik W ≠ KG Futter > PrN > Gruppe FAS n.b. n.b. Steigbilder W ≠ KG Futter > Gruppe Tab 89. Vergleich der Differenzierungsfähigkeit der verschiedenen Methoden für Fütterungssystemvergleich A Bei den meisten der erfaßten Qualitätsaspekte (siehe Tab 89) zeigte sich ein deutlicher fütterungsspezifischer Effekt, die Gruppen-Unterschiede erscheinen demgegenüber gering. An allen PrN-Terminen sind diese Effekte gleichermaßen zu vermerken. Insofern kann davon ausgegangen werden: Die Methoden geben einheitlich die Probenunterschiede hinsichtlich des Futters wieder, und dieser Effekte ist sogar fast durchgängig der „intensivste“ (bis auf die Milchleistung, die an Einzeltierproben ermittelt wurde und nicht an Poolproben). Einzig Fett- und Eiweiß-Gehalt (und Zellzahl) sind vorrangig gruppen- (und somit tierspezifisch) beeinflusst. Fütterungsvergleich A: Wiesenheu vs. Ackerfutterheu (Kleegras) - Methodenvergleich 220 Charakterisierung: Charakterisierung Methode Wiesenheu Kleegrasheu Merkmal Milchleistung Gering hoch l Milch Lactosegehalt Harnstoff wenig normal mehr erhöht Fettsäuremuster Mittellangkettige FS („magerer“) Kurz- und langkettige FS („üppig“, für Fettneubildung und gesundheitliche Wirkung) W: MCT KG: SCT + LCT, CLA’s… Proteomik Gewebereifung, Ausdifferenzierung Nährstoff-fülle, schneller Wuchs W: BT1A1, GLCM1, TRFL, FETUA, LACB KG: CASK, B4GT1, LALBA, ALBU, B2MG Metabolomik Strukturierung und Reifung von Gewebe Nahrung und Wachstum div. Steigbilder differenziert, klein verwaschen, groß S-Form Tab 90. Charakterisierung der Proben aus Fütterungssystemvergleich A mit verschiedenen Methoden – Übersicht Die Proteomik und Metabolomik liefern ähnliche Charakterisierungen der Proben: die Proteine und Metabolite der Wiesenheu-Milch stehen mehr im Zusammenhang mit Gewebereifung und Ausdifferenzierung, während diejenigen der Kleegrasheu-Milch im Zusammenhang mit Nahrung (Nährstoff-Fülle) und daraus sich ergebendem Wachstum stehen. Die Steigbildmethode beschreibt die Bilder der Wiesenheu-Milch mit „kleinen, ausdifferenzierten Schalen“, und die der Kleegrasheu-Milch mit „großen, verwaschenen Schalen“. Die Milchleistung ist bei Wiesenheufütterung geringer, bei Kleegrasheu erhöht – dazu ernährungsphysiologisch passend ist der Harnstoffgehalt bei Kleegrasheu erhöht. Fazit: 1) Die Milchproben lassen sich hinsichtlich der Fütterung mit 7 von 9 angewendeten Methoden unterscheiden. 2) Der Fütterungseffekt ist deutlich größer als der Gruppen-bzw. Zeiteffekt. 3) Die Charakterisierung der Qualität weist bei mehreren Methoden darauf hin, dass bei Kleegrasheufütterung eine „üppigere“ Qualität erzielt wird (mehr „Nährstoff-Fülle“), wohingegen bei der Wiesenheuvariante eher „magere“, ausdifferenzierende Wirkungen aufzutreten scheinen. Fütterungsvergleich B: Weizen vs. Futterrüben - Ergebnisse 221 4.4. Ergebnisse Fütterungssystemvergleich B: Einfluß von Weizen und Futterrüben auf verschiedene Parameter der Milch 4.4.1. Milchleistung und Gehalte von Fett, Eiweiß, Lactose, Harnstoff und Zellzahl Die Milchleistung und die Milchinhaltsstoffe wurden bei 28 Kühen an je zwei PrN- Terminen erfaßt (2. und 4. PrN, n=56). Im Regressionsmodell mit den drei fixen Effekten Futter, Kuh und PrN zeigt sich der Eiweiß- und Fettgehalt bei Futterrüben-Fütterung etwas erhöht (Eiweiß um 0,1% erhöht), jedoch steht der Einzeltier-Effekt mit einem deutlich höheren Signifikanz-Niveau im Vordergrund. Der Harnstoffgehalt ist fütterungs-bedingt bei der Weizen-Fütterung erhöht, hier sind keine tierindividuellen Einflüsse festzustellen. Die anderen Werte sind nur von Einzeltier abhängig verändert. Die Milchleistung verändert sich im Zusammenhang mit der Fütterungsvariante nicht signifikant – eine Tendenz (Futterrüben: mehr Milch) ist wahrzunehmen. Es ließ sich kein Einfluß aufgrund des PrN-Termines (Zeiteffekt) feststellen. Futter- rüben Weizen Gesamtes Modell Futter- Effekt Kuh- Effekt PrN- Effekt Mittlere Werte r² Signifikanzniveau (p=) Fett % 4,68 4,30 0,73 0,024 0,038 0,028 0,811 Protein % 3,55 3,45 0,96 <0,0001 0,012 <,0001 0,868 Lactose % 4,62 4,62 0,95 <0,0001 0,769 <,0001 0,769 Harnstoff (ppm) 202 240 0,71 0,042 0,004 0,077 0,865 Zellzahl in 1000 226 228 0,96 <0,001 0,793 <,0001 0,775 Milchleistung (l / Abendgemelk) 7,34 7,14 0,92 <0,001 0,274 <,0001 0,668 Tab 91. Mittlere Werte der Haupt-Milchinhaltsstoffe und Milchleistung je Fütterung und Signifikanzniveau für Futter-, PrN- und Einzeltier-Effekte (n=56). Orange markiert: p<0,05. Fütterungsvergleich B: Weizen vs. Futterrüben - Ergebnisse 222 4.4.2. Gärprobe pH-Werte wurden nach Gärung von allen Poolproben der 1. Stufe und 2. Stufe ermittelt (zur Poolstufe s.a. Tab 12). Die Temperierung war unterschiedlich: bei der 1. PrN wurde nur auf 20° temperiert, bei der 2. und 3. PrN wurde doppelt angesetzt: einmal bei 20° und einmal bei 37° temperiert, bei der 4. PrN wurde nur bei 37° temperiert. Zur Auswertung wurde ein Regressionsmodells mit den fixen Effekten Futter, Gruppe und PrN erstellt. Die pH-Werte der 2. und 3. PrN wurden gemeinsam, aber je Temperaturen (einmal für 20° und einmal für 37°C) ausgewertet. Zusätzlich wurden Modelle für die 1. bis 3. PrN für 20°C und 2. bis 4. PrN für 37°C gebildet und mit den ersten Ergebnissen verglichen. Es zeigte sich im zuerst ermittelten Regressionsmodell (2. und 3. PrN, siehe Tabelle), dass bei beiden Temperierungvarianten die Futterrüben-Proben im Mittel einen etwas höheren pH-Wert hatten als die Proben aus Weizen-Fütterung, insofern weniger intensiv säuern. Der Zeiteffekt (PrN) ist jedoch in beiden Fällen ein sehr wichtiger Einflußfaktor auf das Ergebnis. Effekt 20°C 37°C Futterrüben Weizen Futterrüben Weizen Mittelwert Signifikanz Mittelwert Signifikanz Futter 5,6 5,1 0,0056** 5,7 5,4 0,0257* Gruppe 0,0036** 0,06 2.PrN 3. PrN 2.PrN 3. PrN PrN 5,1 5,5 0,0018** 5,1 5,9 0,0001*** Tab 92. pH-Wert der Gärproben der 2. und 3. PrN bei 20° und 37° - Mittelwerte und Signifikanzniveau. Bei Berücksichtigung der Ergebnisse der 1. PrN (zusätzlich zur 2. und 3. PrN) zur 20°C-Variante ist der Effekt weiterhin deutlich, bei der Variante mit 37°C und unter Berücksichtigung der 4. PrN (zusätzlich zur 2. und 3.) ist nur noch ein PrN-Effekt, aber keine signifikanten Futter- oder Gruppen-Effekte festzustellen. Fazit: Insofern kann konstatiert werden: bei einer Gärtemperatur von 20°C kann bei der 1., 2. und 3. PrN ein Futtereffekt festgestellt werden, für die 4. PrN (bei 37°C) jedoch nicht. Fütterungsvergleich B: Weizen vs. Futterrüben - Ergebnisse 223 4.4.3. Fettsäuremuster Die 8 Poolproben der 1. Stufe (je Fütterungsgruppe eine Probe, an 4 PrN-Terminen) wurden in einer Regressionsanalyse mit den Faktoren „Futter“, „Gruppe“ und „Probennahnme“ modelliert (least square means). In der Tab 94 sind die analysierten Fettsäuren aufgeführt, sowie einige summarische Werte daraus, mit Signifikanzniveau für die einzelnen Effekte. Im Bereich C-11:0 bis C-15aiso gibt es einige Fettsäuren, die einen signifikanten Zusammenhang mit der Probennahme oder auch mit der Tiergruppe aufweisen, zusätzlich zu Futtereffekten. In diese Gruppe gehört ebenfalls die C-18:2-9c,12c. Bei Fütterung von Weizen treten höhere Gehalte von CLA, MUFA und PUFA auf als bei Futterrüben-Fütterung, sowie geringe Gehalte an SFA und MCT. CLA-cis9,tr11 und CLA- tr11,cis13 sind bei Weizenfütterung ebenfalls häufiger anzutreffen. C-14:0 und C-16:0 sind bei Futterrüben-Fütterung jedoch deutlich erhöht gegenüber Weizen-Fütterung (siehe Tab 94). An der Summe der p-Werte läßt sich erkennen, dass der Futtereffekt mit 19,3 fast genauso groß ist wie der Gruppeneffekt (19,7), dicht gefolgt von dem Zeiteffekt (20,7). Fütterungsvergleich B: Weizen vs. Futterrüben - Ergebnisse 224 Futter- rüben Weizen Gesamtes Modell Futter- Effekt Gruppen- Effekt PrN-Effekt Fettsäuren in g/100g Fett Mittlere Werte r²= Signifikanz-Niveau (p=) C-4:0 3,53 3,66 0,73 0,550 0,476 0,883 0,422 C-6:0 0,84 0,80 0,90 0,232 0,171 0,115 0,337 C-7:0 0,05 0,04 0,93 0,171 0,187 0,260 0,137 C-8:0 1,46 1,44 0,82 0,390 0,729 0,322 0,305 C-9:0 0,034 0,030 0,98 0,047 0,051 0,126 0,037 C-10:0 3,56 3,71 0,91 0,205 0,265 0,214 0,169 C-10:1 0,3 0,3 0,92 0,187 0,196 0,245 0,154 C-11:0 0,07 0,06 0,99 0,034 0,025 0,058 0,032 C-12:0 4,19 3,90 0,98 0,056 0,038 0,513 0,048 C-12:1 0,09 0,08 1,0 0,009 0,006 0,011 0,010 C-13iso 0,08 0,07 1,0 0,009 0,007 0,011 0,011 C-13:0 0,12 0,11 0,94 0,147 0,238 0,063 0,189 C-14iso 0,15 0,16 0,98 0,040 0,045 0,025 0,047 C-14:0 13,43 12,84 0,96 0,089 0,029 0,441 0,142 C-14:1tr9 0,01 0,01 0,80 0,420 0,581 0,170 0,505 C-14:1cis9 1,1 1,0 1,0 0,001 0,001 0,001 0,02 C-15iso 0,33 0,37 0,98 0,043 0,026 0,154 0,041 C-15a iso 0,57 0,69 0,99 0,020 0,007 0,130 0,031 C-15:0 1,52 1,56 0,96 0,100 0,236 0,024 0,475 C-16iso 0,27 0,31 0,95 0,117 0,045 0,205 0,172 C-16:0 38,75 36,09 0,98 0,043 0,013 0,031 0,256 C-16:1 1,76 1,65 0,96 0,099 0,046 0,080 0,165 C-17iso 0,37 0,42 0,97 0,071 0,022 0,475 0,121 C-17a iso 0,46 0,54 0,97 0,077 0,022 0,492 0,142 C-17:0 0,69 0,74 0,92 0,190 0,091 0,480 0,199 C-18iso 0,06 0,07 0,81 0,404 0,268 0,402 0,383 C-18:0 6,16 6,95 0,96 0,104 0,084 0,062 0,138 C-18:1tr6/7/8 0,07 0,06 0,50 0,821 0,577 0,475 0,842 C-18:1tr9 0,12 0,14 0,91 0,206 0,108 0,083 0,598 C-18:1tr10 0,10 0,10 0,42 0,883 0,749 0,630 0,804 C-18:1tr11 0,56 0,72 0,96 0,087 0,021 0,960 0,309 C-18:1tr12 0,10 0,10 0,67 0,636 0,944 0,264 0,697 C-18:1tr13 0,15 0,15 0,78 0,468 0,917 0,375 0,365 C-18:1tr15 0,08 0,09 0,71 0,571 0,545 0,260 0,643 C-18:1tr16 0,17 0,18 0,69 0,611 0,663 0,420 0,530 C-18:1cis9 12,69 14,77 0,91 0,210 0,077 0,190 0,399 C-18:1cis11 0,42 0,44 0,94 0,149 0,316 0,898 0,098 C-18:1cis12 0,11 0,09 0,53 0,796 0,639 0,627 0,700 C-18:1cis13 0,07 0,06 0,69 0,606 0,577 0,992 0,456 C-18:1cis15 0,03 0,03 0,42 0,887 0,947 0,635 0,783 C-18:2-tr9,tr12 0,05 0,06 0,79 0,454 0,13 0,593 0,856 C-18:2-cis9,cis12 0,91 1,05 0,99 0,014 0,003 0,143 0,044 C-18:3- cis6,cis9,cis12(γ) 0,04 0,05 0,61 0,707 0,364 0,489 0,791 C-19:0aiso 0,02 0,02 0,76 0,492 0,262 0,514 0,499 C-18:3- cis9,cis12,cis15(α) (ALA) 0,78 0,83 0,95 0,112 0,066 0,049 0,268 C-19:0 0,07 0,07 0,90 0,234 0,272 0,539 0,171 CLA-cis9,tr11 0,36 0,45 1,0 0,0057 0,001 0,039 0,066 CLA-tr11,cis13 0,02 0,02 0,95 0,115 0,027 0,209 0,696 CLA-cis9,cis11 0,03 0,02 0,85 0,329 0,632 0,197 0,295 CLA-Y 0,03 0,04 0,98 0,058 0,014 0,514 0,191 Fütterungsvergleich B: Weizen vs. Futterrüben - Ergebnisse 225 CLA-tr11,tr13 0,01 0,01 0,84 0,344 0,130 0,710 0,427 CLA-tr9,tr11 0,03 0,04 0,93 0,161 0,371 0,124 0,136 C-20:0 0,14 0,14 0,95 0,130 0,457 0,243 0,088 C-20:1-tr11 0,11 0,11 0,82 0,400 0,679 0,197 0,399 C-20:1-cis11 0,03 0,03 0,76 0,501 0,874 0,232 0,506 C-20:3c- cis8,cis11,cis14 0,09 0,10 0,79 0,439 0,128 0,612 0,809 C-20:4- cis5,cis8,cis11,cis14 0,08 0,08 0,76 0,499 0,428 0,165 0,864 C-20:5 cis5,cis8,cis11,cis14,ci s17 0,10 0,10 0,82 0,383 0,938 0,119 0,589 C-21:0 0,01 0,01 0,99 0,030 0,156 0,067 0,020 C-22:3n3 0,04 0,04 0,94 0,152 0,322 0,240 0,109 C-22:0 0,07 0,08 0,93 0,169 0,600 0,361 0,112 C-23:0 0,04 0,04 0,80 0,426 0,699 0,253 0,381 C-24:0 0,05 0,05 0,77 0,486 0,759 0,269 0,447 Summe der p-Werte 19,297 19,680 20,676 Tab 93. Fettsäuremuster der Poolproben aus dem Fütterungssystemvergleich B „Futterrüben vs. Weizen“. Futter- rüben Weizen Gesamtes Modell Futter- Effekt Gruppen- Effekt PrN-Effekt Fettsäuren in g/100g Fett Mittlere Werte r²= Signifikanz-Niveau (p=) SFA 79,02 76,64 0,94 0,143 0,044 0,275 0,297 MUFA 18,12 20,25 0,93 0,157 0,053 0,217 0,289 PUFA 2,79 3,11 0,99 0,025 0,006 0,040 0,249 Sum C-18:1Trans-FS 1,35 1,54 0,85 0,341 0,135 0,292 0,529 Sum CLA 0,48 0,59 0,98 0,040 0,010 0,066 0,278 C-16:0/C-18:1cis9 3,08 2,46 0,96 0,106 0,036 0,093 0,288 C-16:0/C-18:1 ges. 2,8 2,2 0,97 0,079 0,026 0,081 0,218 Sum n-3 1,20 1,25 0,92 0,186 0,164 0,061 0,479 Sum n-6 1,43 1,57 0,96 0,106 0,046 0,383 0,135 Sum MCT(C-10>C-14) 23,32 22,16 0,96 0,107 0,051 0,948 0,109 Sum SCT(C-4>C-8) 7,58 7,69 0,72 0,559 0,759 0,681 0,405 CLA-cis9,tr11 0,36 0,45 1,0 0,006 0,001 0,039 0,066 CLA-tr11,cis13 0,02 0,02 0,95 0,115 0,027 0,209 0,696 n-3 / n-6 0,84 0,80 0,90 0,232 0,171 0,115 0,337 Tab 94. Fettsäuremuster der Poolproben aus dem Fütterungssystemvergleich B „Futterrüben vs. Weizen“ - einige summarische Werte, incl. Signifikanzniveau für die drei Faktoren Futter, Gruppe und PrN, sowie zum gesamten Modell. Fett gedruckt sind die jeweils höheren Werte, orange hinterlegt diejenigen, die vorrangig Futtereffekte aufweisen (p<0,05), gelb hinterlegt sind weitere mit p<0,1 signifikante Effekte. Fütterungsvergleich B: Weizen vs. Futterrüben - Ergebnisse 226 4.4.4. Proteomik (MOSLER UND WOHLERS) Es konnten an vier Poolproben (1. + 2. sowie 3. + 4. PrN gepoolt, je Fütterungsvariante eine Probe zu zwei Zeitpunkten) 20 minore Molkeproteine sowie das vorherrschende Protein, Laktoglobulin (LACB), im nanoLC-ESI-Tandemmassenspektrometer annotiert werden und aufgrund der relativen Abundanzwerte verglichen werden. Bei 6 der Proteine gab es niedrige Fehlwerte, die mit jeweils 50% des niedrigsten Messwertes im Set ersetzt wurden (Meßwerte je Probe im Anhang F). Mit der Hauptkomponentenanalyse (PCA) kann keiner der drei Effekte Futter, Gruppe oder Zeit als besonders herausragend ermittelt werden. Eine Differenzierung der Futter- Varianten ist nicht möglich. Auch beim Vergleich der Summe aller p-Werte aus dem ungepaarten t-Test zeigt sich der Futtereinfluss mit 7.0 nur wenig stärker als Gruppen- und Zeiteffekte. In der geclusterten Heatmap (im Anhang F) ist erkennbar, dass bei Futterrübenzusatz für 3 der 21 Proteine augenfällige Abundanzanstiege vorliegen, während bei Weizenfütterung 2 Protein-Abundanzen erhöht sind. Signifikante Zunahmen (p<0.1) finden sich bei Futterrübenzusatz am ausgeprägtesten für das Eisentransportprotein Laktotransferrin (TRFL), das zu den abundanteren unter den minoren Molkeproteinen gehört, (mit einer relativen Abundanzzunahme von 14,7% auf 19.6%). Daneben findet sich auch für das Abwehrprotein Complement 3 (CO3) eine signifikante Zunahme (p<0.1). Auch das an der Bildung und dem Transport der Fetttröpfchen beteiligte Butyrophilin (BT1A1) steigt an. Bei Weizenzufütterung steigt das Abwehrprotein Zink-Alpha-2-Glykoprotein (ZA2G) markant an, sowie das Regulations- und Transportprotein Ubiquitin (UBIQ) (siehe Tab 95). Ein Sonderfall ist das multifunktionelle alpha-Laktalbumin, das unter anderem als katalytische Untereinheit der Lactosesynthase agiert. LALBA gehört auch zu den abundanteren minoren Molkeproteinen. Der LALBA-Spiegel liegt mit mittleren 20.1% bei Weizenzufütterung viel höher als bei Futterrüben (13.4%). Hinzu tritt aber auch ein ebenso starker Gruppeneffekt, so dass der t-Testwert kompromitiert wird. Ähnliches findet sich für PIGR: die weizenbedingte Spiegelerhöhung des IgA-Transporters (PIGR) ist von einem Gruppenunterschied überlagert. Weitere signifikante Gruppeneffekte finden sich sowohl für den Fettsäuretransporter FABP (der bei der Abwehr mitwirkt), als auch für das Abwehrenzym Laktoperoxidase (PERL). Eine Auffälligkeit zeigt sich für die März-Probe (3. und 4. PrN) von Gruppe 1: hier liegt im Vergleich zu allen anderen Proben ein ungewöhnlicher Anstieg von Serumalbumin (ALBU) und beta-Laktoglobulin (LACB) vor, und ein gleichzeitiger Abfall des IgA- Transporters PIGR (siehe Tabelle im Anhang F). Fütterungsvergleich B: Weizen vs. Futterrüben - Ergebnisse 227 Mittlere Werte Zunahme-Faktor Signifikanzniveau (p=) Minore Molkenproteine – relative Abundanzen, in % der gesamten Meßwerte Futter- rüben Weizen Futter- rüben Weizen Futter- Effekt Gruppen- effekt Zeit- Effekt ALBU (Serum Albumin) 15,48 13,15 1,189 0,274 0,908 0,319 B2MG** (Beta-2-Microglobulin) 3,55 2,97 1,283 no effect no effect effect B4GT1* (Galactosyl Transferase (Lactose Synthase Subunit)) 1,98 1,71 1,155 no effect no effect effect BT1A1 (Butyrophilin) 1,48 0,89 1,870 0,224 0,591 0,519 CASK (Kappa-Casein) 3,46 3,44 1,019 0,930 0,353 0,241 CO3 (Complement 3) 0,73 0,41 1,799 0,054 0,892 0,693 FABP (Fatty Acid-Binding Protein) 6,76 5,61 1,228 0,609 0,088 0,871 FETUA** (Fetuin) 0,51 0,42 no effect effect no effect GLCM1 (Lactophorin) 21,07 21,03 1,022 0,939 0,154 0,470 LACB (Beta-Lactoglobulin) 67,15 55,37 1,216 0,073 0,917 0,635 LALBA (Alpha-Lactalbumin (Lactose Synthase Subunit)) 13,36 20,13 1,540 0,314 0,285 0,867 MFGM (Lactadherin) 1,63 1,33 1,395 0,602 0,181 0,587 OSTP (Osteopontin) 2,69 3,04 1,191 0,704 0,866 0,054 PERL (Lactoperoxidase) 1,24 1,40 1,066 0,948 0,022 0,797 PIGR (Polymeric Immunoglobulin Receptor) 0,91 1,75 2,310 0,281 0,395 0,657 TETN (Tetranectin) 0,93 0,83 no effect no effect no effect TRFE (Serotransferrin) 0,82 0,88 no effect no effect no effect TRFL (Lactotransferrin) 19,57 14,73 1,328 0,003 0,942 0,951 UBIQ ** (Ubiquitin) NA 2,13 ++ effect no effect no effect XDH (Xanthine Dehydrogenase) 1,35 1,54 1,219 0,942 0,514 0,128 ZA2G (Zinc-Alpha-2-Glycoprotein) 2,01 2,68 1,337 0,056 0,811 0,729 Summe 6,954 7,919 8,519 Tab 95. Mittlere Protein-Abundanzen (relative Häufigkeiten) in der Milch für die Fütterungsvarianten Weizen vs. Futterrüben (Versuch B), sowie t-Test (ungepaart) für die Effekte Futter, Gruppe und Zeit (PrN). Zunahmefaktoren (Futterrüben-Werte / W- Werte bzw. andersherum). Farbig hervorgehoben die „deutlichen“ Effekte: bei Zunahmefaktor > 1,3 und Futter-p<0,3, bzw. selektierte Gruppen- / Zeiteffekte. Abb. 23: PCA für die 21 Proteine von Fütterungssystemvergleich B. Fütterungsvergleich B: Weizen vs. Futterrüben - Ergebnisse 228 4.4.5. Metabolomik (MOSLER UND WOHLERS) Bei der Analyse der GC-TOF-MS-Spektraldaten wurden insgesamt 124 Metabolite gefunden, die in allen Proben durch relative Quantifizierung verglichen werden konnten. Nur ein niedriger Fehlwert musste durch die Hälfte des niedrigsten Wertes im Set geschätzt werden (markiert mit *). 88 Substanzen konnten eindeutig annotiert werden. In der PCA (siehe Abb. 24:) über die 124 Metabolite wird die Zufütterung von Weizen und Futterrüben in der ersten Hauptkomponente deutlich getrennt, während die zweite Komponente die beiden Gruppen unterscheidet. Der Futtereffekt (51.4% der Gesamtvarianz) ist nur wenig größer als der Gruppeneffekt (38.6%). Die dritte Haupkomponente erfasst den Zeiteffekt (10.0%). Der Futtereffekt ist für die Proben von Februar viel deutlicher (größerer Abstand zueinander in Bezug zur X-Achse), für die Proben im März sind die Futtereffekte eher gering. Auch beim Vergleich der Summe alle p-Werte aus dem ungepaarten t-Test sieht man den Futtereffekt dicht vom Gruppeneffekt gefolgt (53.8 und 58.8), gegenüber dem Zeiteffekt (77.6). Der Gruppeneffekt spiegelt sich in 22 von 124 Metaboliten signifikant (t-Test: p<0.1) wieder, gegenüber 33 für den Futtereffekt, von denen 23 annotiert werden konnten (s. Tab 96). Generell bringt die Weizenzufütterung mehr und stärkere Spiegeländerungen einzelner Metabolite mit sich, sichtbar in der Heatmap als Cluster von 15 Substanzen (Abbildung im Anhang F). Dabei reichen die Anstiegsfaktoren bis 2,9 (s. Tab 96). Bei der Weizenzufütterung sind Glucose (hier in der Sechserringstruktur, Pyranose), Glucose-6-Phosphat und Fruktose-6-Phosphat sowie Ethanolaminphosphat, Glycerol-3- Phosphat, 2hydroxy-glutalsäure und das Vitamin Pantothensäure erhöht. Für Futterrüben- Fütterung treten keine deutlichen Anstiege auf. Fütterungsvergleich B: Weizen vs. Futterrüben - Ergebnisse 229 Mittlere Werte Zunahme- Faktor für Futter- effekt Futter- effekt Gruppen- effekt Zeit- effekt Metabolite, die signifikante (p<0,1) Futtereffekte aufweisen, in C13-Sorbitol-normalisiertem Einheitsmaß Futter- rüben Weizen Futterr üben W gepaarter t-Test Ungepaarter T-Test Signifikanz-Niveau (p=) Futtereffekt loadings [%] für PC1 (51.4%) Butyric acid 2-amino 1,219 1,343 1,10 0,090 0,294 0,299 0,900 0,458% Ethanolaminephosphate 0,486 1,045 2,20 0,118 0,046 0,761 0,821 2,893% Fructose-6-phosphate 0,468 1,050 2,26 0,028 0,133 0,503 0,962 3,355% Galactonic acid 0,463 0,607 1,31 0,093 0,049 0,725 0,860 0,804% Galactose 1,535 1,386 1,11 0,107 0,023 0,867 0,834 0,362% Glucaric acid-1-4-lactone 1,569 1,398 1,12 0,089 0,036 0,773 0,865 0,355% Gluconic acid 0,354 0,464 1,31 0,061 0,021 0,821 0,906 0,976% Gluconic acid 2-amino-2-deoxy 0,134 0,257 1,91 0,002 0,216 0,379 0,997 1,486% Glucopyranose 0,200 0,575 2,89 0,013 0,136 0,497 0,983 2,724% Glucosamine N-acetyl 1,220 0,954 1,28 0,053 0,208 0,393 0,934 1,066% Glucose-6-phosphate 0,358 0,908 2,57 0,032 0,114 0,538 0,955 3,808% Glutaric acid, 2-hydroxy 0,569 1,368 2,40 0,025 0,001 0,987 0,961 2,951% Glyceraldehyde-3-phosphate 0,584 0,737 1,27 0,102 0,088 0,618 0,852 0,923% Glycerol-3-phosphate 0,417 0,787 1,89 0,081 0,012 0,905 0,874 2,182% Glycerophosphoglycerol 0,776 1,068 1,38 0,024 0,017 0,819 0,963 0,990% Hexadecanoic acid 0,502 0,582 1,16 0,223 0,078 0,810 0,662 0,464% Isocaproic acid 2-oxo 0,277 0,295 1,07 0,027 0,663 0,058 0,986 0,460% Malic acid 2-methyl 0,250 0,192 1,30 0,052 0,019 0,824 0,919 0,943% Octadecenoic acid 6-(Z) 0,570 0,498 1,15 0,201 0,058 0,864 0,692 0,475% Ornithine 0,917 1,191 1,30 0,031 0,210 0,388 0,961 1,132% Pantothenic acid 0,925 1,207 1,31 0,071 0,025 0,808 0,891 0,970% Uracil 0,856 0,789 1,08 0,011 0,720 0,040 0,995 0,639% Xylose 0,960 0,875 1,10 0,069 0,052 0,698 0,897 0,346% Tab 96. Metabolite der Proben aus dem Fütterungssystemvergleich B, die im gepaarten bzw. Ungepaarten T-test signifikante (p<0,1) Futtereffekte aufweisen. Mittlere Werte, Zunahmefaktoren, Signifikanzniveau für die drei Effekte Futter, Gruppe und Zeit, sowie Loadings für PC1 (Futtereffekt). Metabolite mit Zunahmefaktor >1,5 hervorgehoben. Abb. 24: PCA für die 124 Metabolite der vier Proben aus dem Fütterungssystemvergleich B (Weizen vs. Futterrüben). Fütterungsvergleich B: Weizen vs. Futterrüben - Ergebnisse 230 4.4.6. FAS-Untersuchungen Ausführliche Ergebnis-Darstellung siehe Anhang E (Bericht KWALIS). Eine Vielzahl der Messwerte zeigen die Unterschiede der beiden Fütterungsvarianten. An den Messwerten R40w und R40hr werden die Unterschiede besonders deutlich. Die Messwerte R40w und R40hr verhalten sich gegenläufig bei wechselnder Fütterung: der Wert für R40w ist bei Weizen-Fütterung geringer, der Wert R40hr ist erhöht gegenüber Futterrüben-Fütterung (siehe Abb. 25:). Das Ergebnis ist mit p=0,02575 signifikant (siehe Abb. 26:). Abb. 25: Die Messgrößen R40hr (links) und R40w (rechts) für die Varianten Futterrüben und Weizen (n=4). Abb. 26: Die Messgrößen R40w und R40hr für die Varianten Futterrüben und Weizen (n=4). Fütterungsvergleich B: Weizen vs. Futterrüben - Ergebnisse 231 4.4.7. Steigbilder Material und Methoden Es wurden Bilder von 8 Poolproben (von 4 PrN je zwei gedoppelte Proben) ausgewertet. Alle Poolproben werden gedoppelt untersucht, so dass aus jeder gedoppelten Probe in zweifacher Probenaufbereitung Bilder erstellt werden. Bilder werden in mehreren Konzentrationsstufen angefertigt, z.T. werden mehrere Bilder einer Probe je Konzentrationsstufe erstellt. Die Bildauswertung der Poolproben erfolgt nach dem Grundmuster: Gruppieren (je PrN), Charakterisieren, Zuordnen wiederholte PrN. Ergebnis der Gruppierung und Charakterisierung Die Bilder wurden je PrN gruppiert (s.u.). Die Gruppierung bei der 1., 2. und 3. PrN ist in allen Fällen korrekt – alle Bilder einer (gedoppelten) Probe wurden einander zugeordnet und von den Bildern der anderen Probe unterschieden. Die Gruppierung bei der 4. PrN war bei den Bildern mit 0,075ml Milch in 6 von 8 Fällen (75%) korrekt, zwei Bilder wurden vertauscht zugeordnet. Bei den vier höher konzentrierten Bildern (0,087ml Milch) ist die vorgenommene Gruppierung falsch – eine Gruppierung ist nicht möglich. 1. PrN: Die Bilder in der Konzentrationsstufe 0,075 mit Bild-Nr. 3-4, 3-5, 3-6, 3-8 gehören einer Fütterungsgruppe an (sind die Bilder der gedoppelten Probe), und die Bilder 3-1, 3-2, 3-3, 3-7 gehören ebenfalls zusammen. Die Bilder der Konzentrationsstufe 0,1 mit Bild-Nr. 3- 10 und 3-12 gehören der ersten Gruppe an, diejenigen mit Nr. 3-9 und 3-11 der zweiten Gruppe. Die Proben unterscheiden sich hinsichtlich der Anzahl der grünen Bereiche und der Ausprägung des Schalenrandes deutlich (vergl. Tab. unten). Bild-Nr. 0,075ml Milch / Bild Bild-Nr. 0,1ml Milch / Bild unterscheidende Merkmale Proben- Code Decod. Proben- Qualität Diff korrekt 3-4 3-5 3-6 3-10 J-180 3-8 3-12 Mehr grüne Bereiche, Schalenrand präziser, konturierter J-179 Gruppe „FuR-W“, 3-1 3-2 3-3 3-9 J-178 3-7 3-11 Weniger grüne Bereiche, Schalenrand verwaschener J-177 Gruppe „W- FuR“ ja Tab 97. Steigbilder vom 23.2.08. Gruppierung, Bild-Charakteristik und Decodierung (Proben-Code, Proben-Qualität) Fütterungsvergleich B: Weizen vs. Futterrüben - Ergebnisse 232 2. PrN: Die Bilder unterscheiden sich in der Anzahl der grünen Bereiche und der Breite des Schalenrandes deutlich und werden demnach in zwei Gruppen unterteilt (siehe Tab. ). Bild-Nr. 0,075ml Milch / Bild Bild-Nr. 0,1ml Milch / Bild unterscheidende Merkmale Proben- Code Decod. Proben- Qualität Diff korrekt 1; 2; 3 A J-233 4 B Viele grüne Bereiche, schmaler Schalenrand J-234 Gruppe „FuR-W“, 5; 6; 7 C J-228 8 D Wenig grüne Bereiche, breiter Schalenrand J-246 Gruppe „W- FuR“ ja Tab 98. Steigbilder vom 26.2.08. Gruppierung, Bild-Charakteristik und Decodierung (Proben-Code, Proben-Qualität) 3. PrN: Durch das Merkmal „rötliche Milchablagerungen“ lassen sich die Proben eindeutig unterscheiden, die Ausbildung der Schalenzone ist geringfügig unterschiedlich: J-328 und J- 329 haben etwas braunere und weniger grüne Bereiche, J-317 und J-318 hingegen etwas mehr und eher grüne grüne Bereiche. Bei 0,08ml Milch / Bild sind die Sockelbanden unterschiedlich gefärbt, bei 0,075ml sind sie bei allen Bildern gleich dunkel. Bild-Nr. 0,075ml Milch / Bild Bild-Nr. 0,087ml Milch / Bild unterscheidende Merkmale Proben- Code Decod. Proben- Qualität Diff korrekt 3-1 3-2 3-3 3-11 J-318 3-7; 3-8 3-13 Kaum /keine rötliche Milchablagerung, mehr, grünere grüne Bereiche, hellbraune Sockelbande J-317 Gruppe „FuR-W“, 3-4 3-5 3-6 3-12 J-328 3-9; 3-10 3-14 Rötliche Milchablagerung, weniger, braunere grüne Bereiche, dunkelbraune Sockelbande J-329 Gruppe „W- FuR“ ja Tab 99. Steigbilder vom 13.3.08. Gruppierung, Bild-Charakteristik und Decodierung (Proben-Code, Proben-Qualität) 4. PrN: Die Unterschiede der Bilder sind geringfügig, und die Gruppierung ist unsicher. Die Gruppierung nach Schalengröße, Anzahl der Schalen und Färbung der Schalen führt zu einer möglichen Unterscheidung (siehe Tab. unten), die aber unsicher erscheint. Bild-Nr. (R5) 0,087ml Milch / Bild unterscheidende Merkmale Proben- Code Decod. Proben-Q. Diff. korrekt A B Eher braune, weniger grüne Bereiche, insgesamt weniger. Fahnen breiter J-475 J-470 „FuR-W“ „W-FuR“” C D Schalenrand etwas abgelöst, eher grüne, etwas größere grüne Bereiche. Fahnen schmaler J-467 J-471 „W-FuR“ „FuR-W“ nein Bild-Nr. (R4) 0,075ml Milch / Bild unterscheidende Merkmale Proben- Code Decod. Proben-Q. Diff korrekt 4-4 4-6 4-7 4-8 Braunere, etwas kleinere „grüne“ Bereiche, Schalenrand teilw. etwas abgelöst J-475 J-471 J-471 J-470 „FuR-W“ „FuR-W“ „FuR-W“ „W-FuR“” 4-1 4-2 4-3 4-5 Eher grüne, etwas größere grüne Bereiche. J-467 J-470 J-475 J-467 „W-FuR“ „W-FuR“ „FuR-W“ „W-FuR“ Nein (in 6 von 8 Fällen korrekt gruppiert) Tab 100. Steigbilder vom 19.3.08. Gruppierung, Bild-Charakteristik und Decodierung (Proben-Code, Proben-Qualität) Fütterungsvergleich B: Weizen vs. Futterrüben - Ergebnisse 233 Eine Charakterisierung der Bilder im Sinne der „einfach beschreibenden Prüfung“ (nach frei zu wählenden Merkmalen) findet sich im Anhang. Ein Vergleich der für die jeweilige Fütterung charakteristischen Bildmerkmale wurde auch an Einzeltierproben ermittelt und ist ebenfalls im Anhang wiedergegeben. Bei Auszählung der Ergebnisse im Sinne von Kontingenztabellen lassen sich die Bilder der ersten drei PrN jeweils signifikant voneinander differenzieren (p=0,0286, Fisher’s Test, zweiseitig, bei 4 Bildern je Variante), bei der vierten PrN ist die Signifikanz nicht gegeben (p=0,4857). Ergebnis der Zuordnung bei wiederholter PrN Die oben dargestellte Gruppierung der Proben wird als „vermutlich korrekt“ angesehen und mit diesen Ergebnissen wird hier versucht, die Bilder der wiederholten PrN einander zuzuordnen: Bilder mit ähnlichen Bildmerkmalen im Vergleich zur anderen Gruppe werden einander zugeordnet. Es ergibt sich folgende Zuordnung (Tab 101), wobei jeweils ein Bild der erstgenannten Probe (fett gedruckt) als „probentypischer Stellvertreter“ berücksichtigt wurde. Datum Gruppe 1 (W-FuR) Gruppe 2 (FuR-W) Differenzierung (Gruppierung) korrekt Zuordnung zur vorhergehenden PrN korrekt 23.2. 178 + 177 „G1 + G1“ 180 + 179 „G2 + G2“ Ja 26.2. 228 + 246 „G1 + G1“ 233 + 234 „G2 + G2“ Ja Ja 13.3. 328 + 329 „G1 + G1“ 318 + 317 „G2 + G2“ Ja 19.3. 470 + 475 „G1 + G2“ 471 + 467 „G2 + G1“ Nein n.b. Tab 101. Zuordnung der wiederholten PrN zueinander (aufgrund der fett gedruckten Proben-Bilder) und Decodierung der Gruppenzugehörigkeiten. Grün markiert = korrekt zugeordnet. Es ergibt sich eine Gruppe mit „helleren“ Bildern (Gruppe 1), und eine Gruppe mit „dunkleren“ Bildern (Gruppe 2), gleichzeitig sind sich aber die Bilder der 1. und 2. PrN je Gruppe recht ähnlich untereinander, sowie diejenigen der 3. und 4. PrN (grau hinterlegt) – insofern kann wermutet werden, dass dies entweder ein Effekt des Futterwechsels oder des Gruppenwechsels sein müßte. Die Zuordnung der wiederholten PrN zueinander ist im ersten Fall korrekt, beim zweiten Fall kann eine Zuordnung nicht beurteilt werden, da die Gruppierung der Proben mit diesen Bildern nicht möglich war. Fütterungsvergleich B: Weizen vs. Futterrüben - Ergebnisse 234 Probenspezifische Bildmerkmale ermitteln Folgende Bildmerkmale treten gruppenspezifisch auf / können als unterscheidende Merkmale zwischen den Gruppen 1 und 2 genannt werden: Gruppe A (FuR-W) Gruppe B (W-FuR) g.B. wenig DL hell F schmaler, kleiner, heller Ges. Bild heller, „zarter“ g.B viel DL dunkel F breiter, größer, dunkler Ges. Bild dunkler, farbintensiver, „kraftvoller“ Tab 102. Bildmerkmale, die gruppenspezifisch auftreten Folgende Merkmale wechseln die Gruppen nach der zweiten Probennahme (und treten insofern fütterungsspezifisch auf): Bildmerkmal: Variante 1 (Weizen) Variante 2 (Futterrüben) grüne undifferenzierte Bereiche Schalengröße Schalenbreite Schalenformen Fahnenformen Fahnenbreite Schalenrand Fahnen weniger („schwächer“) kleiner schmaler differenziert und präzise geformt präzise, konturiert schmaler durchgängig kürzer mehr („kräftiger“) größer breiter undifferenziert verwaschen breiter unterbrochen länger Tab 103. Bildmerkmale, die mit der Fütterung die Gruppen wechseln Zusammenfassung der Steigbild-Ergebnisse 1) Je acht Bilder einer Probennahme liessen sich an drei von vier Probenahmeterminen korrekt in zwei Gruppen gruppieren. Der Fisher’s Test gibt hierfür mit p<0,05 eine signifikante Unterscheidung an. Die Bilder der 4. PrN waren z.T. falsch gruppiert worden. 2) Eine Zuordnung der Bilder bei wiederholter PrN war im ersten Fall möglich, im zweiten Fall nicht, weil die Bilder nicht gruppierbar waren. 3) Es gibt Bildmerkmale, die gruppenspezifisch auftreten, und solche, die mit Futterwechsel die Gruppe wechseln. Weitere Ergebnisse zu den Steigbildern sind im Anhang C aufgeführt. Fütterungsvergleich B: Weizen vs. Futterrüben - Diskussion 235 4.5. Diskussion Fütterungssystemvergleich B 4.5.1. Milchleistung und Gehalte von Fett, Eiweiß, Lactose, Harnstoff und Zellzahl Es lassen sich die Futtereffekt im erhöhten Fett-, Eiweiß- und reduziertem Harnstoff- Gehalt für Futterrüben-Fütterung (vs. Weizen) wiederfinden, wobei bis auf bei dem Harnstoff auch deutliche Einzeltier-Effekte auftreten. Lactose, Zellzahl und Milchleistung führen nicht zu signifikanten Futtereffekten. Ein höherer Eiweißgehalt bei Futterrübenfütterung wurde auch in anderen Fütterungsversuchen festgestellt (ERIKSSON et al. 2004, FERRIS et al. 2003, HODEN 1988, JAMBOR 1988, GRUBER 1986, GFRORER 1982, BURCKHARDT 1979, KNIGA et al 1968). Vereinzelt wurden auch positive Effekt auf den Fettgehalt (BIRKENMAIER et al 1996, GFRORER 1982, BURKHARD 1979) oder die Milchleistung (FERRIS et al. 2003, GFRORER 1982, BURKHARD 1979, OBRACEVIC 1969) gefunden – oft sind die Effekte aber als „nicht signifikant“ angegeben. Insgesamt können die hier festgestellten Umstände als in der Literautur bestätigt bezeichnet werden – sie werden zumindest nicht mit gegenteiligen Ergebnissen wiederlegt. Der erhöhte Eiweiß-Gehalt der Milch ist mit dem hohen Gehalt an frei verfügbaren Kohlenhydraten der Futterrübe zu sehen (KIRCHGEßNER et al. 1977), die zu vermehrter mikrobieller Buttersäure-Produktion im Pansen führt und auf diese Weise den Casein-Gehalt der Milch steigert. 4.5.2. Gärprobe Bei den Proben der ersten PrN zeigen sich deutliche Futtereffekte, bei denjenigen der 4. PrN nicht mehr. Wenn bei der 4. PrN (37°C) die Futtereffekte nicht mehr sichtbar sind, kann das mit der PrN, oder mit der Methode zusammenhängen. Leider gibt es keine parallelen 20°- Ergebnisse. Jedoch zeigen Parallel-Ergebnisse aus der 2. und 3. PrN, dass die Futter- Effekte bei der 20°C-Variante deutlich besser zu erkennen sind, und bei der 37°C-Variante fast verschwinden zugunsten der PrN-Effekte. Daheraus kann vermutet werden, dass eine spontane Säuerung bei 20° in diesem Fall besser zur Untersscheidung der Milchproben geeignet gewesen wäre als bei 37°C (welche jedoch die „Standard-Variante“ der Methode ist). Mit den anderen Methoden (Proteomik, Metabolomik, Steigbilder) wird die Ähnlichkeit der Proben der letzten PrN bestätigt – so dass der mangelnde Probenunterschied hier nicht nur auf methodische Unfähigkeiten zurückgeführt werden darf, die aber gewiss auch eine Rolle spielen. Es kann vermutet werden, dass die nicht-signifikanten Ergebnisse der 4. PrN z.T. aufgrund der Temperierungsvariante so ausfallen, z.T. aber auch im Zusammenhang mit dem geringen Proben-Unterschied stehen. Hinsichtlich der Probenqualität säuert die Weizen-Probe besser als die Futterrüben- Proben. Es könnte gesagt werden, die Weizen-Probe ist für die Käserei besser geeignet, Fütterungsvergleich B: Weizen vs. Futterrüben - Diskussion 236 bzw. weist mehr Milchsäurebildner auf / ein Milieu, das für die MSB positiv ist. Bei anderen Versuchen sind meistens die „extensiven“ Varianten ebenfalls mit einem besseren Säuerungsvermögen anzutreffen (mehr thermophile Lactobazillen - HÜFNER 2009, persönl. Mitt, zit. in SCHÖNE (2008, Diplomarbeit). Darum könnte die Weizen-Probe als aus „extensiverer“ Fütterung bezeichnet werden, die Futterrüben-Proben aus „intensiverer“. Vergleicht man dieses z.B. mit dem Fettsäure-Muster, so wurde dort vergleichbares festgestellt. 4.5.3. Fettsäuremuster Die hohen Gehalte an kurzkettigen Fettsäuren bei der Futterrüben-Variante deuten auf eine Fett-de-novo-synthese hin, vermutlich aufgrund des hohen Zuckergehaltes der Rüben, der die nötige Energie für diesen Prozeß zur Verfügung stellt. Die Fett-Neubildung steht auch im Einklag mit dem erhöhten Fettgehalt der Proben aus der Futterrüben-Variante und erfährt durch die proteomisch ermittelten erhöhten Gehalte der Bausteine für die Fetttröpfchenbildung eine Bestätigung. Somit ist in mehreren Methoden auf die erhöhte Fettsynthese in der Futterrüben-Variante hingewiesen. Die erhöhten Werte der mittellangkettigen Fettsäuren C-12 bis C-16 bei der Futterrüben-Variante werden auch von KIRCHGEßNER (2008) erwähnt. Hinsichtlich der Verarbeitung der Milch ist bekannt, dass dies zu härterem Fett führt und u.U. zu einer verringerten Verkäsbarkeit. Hinsichtlich einer gesundheitlichen Wirkung der Fettsäuren muß konstatiert werden, dass die Milch aus Weizen-Fütterung mit mehr CLA, MUFA und PUFA, n-3 und n-6 als „vorteilhaft“ eingestuft werden muß (SHINGFIELD et al. 2008, WAHLE et al. 2004) gegenüber der Milch aus Futterrüben-Fütterung. Dieses Muster ist vergleichbar einer „extensiven“ Fütterung (BUTLER et al. 2007, NOZIERE et al. 2006, COLLOMB et al. 2002). Jedoch ist das Verhältnis von n-3 zu n-6 bei der Milch der Futterrüben-Variante als vorteilhafter einzustufen als das der Weizen-Variante. Fütterungsvergleich B: Weizen vs. Futterrüben - Diskussion 237 4.5.4. Proteomik (MOSLER UND WOHLERS) In diesem Probensatz sind die Futtereffekte ähnlich stark ausgeprägt wie Gruppen- und Zeit- Effekte, so dass der Futtereffekt gegenüber den anderen Effekten als eher geringfügig oder mit denen gleichbedeutend eingestuft werden muß. Auch der absolute Futtereffekt ist relativ gering, v.a. auch im Vergleich zu den deutlichen Futtereffekten aus dem Fütterungssystemvergleich A. Aus der PCA läßt sich erkennen, dass die eine Probe (Futterrübe-G2-Feb) sich nicht in das Muster des Cross-Over-Designs einfügen mag (d.h. optimaler Weise kommt jede Probe in einem der Quadranten zu liegen). Das liegt daran, dass die eine Probe (Futterrübe- G1-März) sich auf der ersten Komponente stark von den anderen unterscheidet (in der PCA weit links). Diese Probe weist auffällige Werte für ALBU, LACB und PIGR auf. Da die PCA bei vier Proben jedoch nur DREI Effekte angeben kann, und in diesem Fall ein vierter (sehr bedeutender) Effekt (der Einzelprobe) hinzukommt, trennen sich die Effekte nicht mehr nach Achsen auf. Die Methode der „PCA“ ist in diesem Fall somit ungeeignet, eine Aussage zum Futter-, Gruppen- oder Zeiteffekt zu machen. Es wären mehr Proben nötig, um diesen Effekt wiedergeben zu können. Bei Versuch A, bei dem keine „auffällige“ Probe zwischen den anderen war, waren die vier Proben ausreichend, um die gesuchten Effekte des Versuches wiederzugeben. Mit dem T-Test jedoch oder den Zunahmefaktoren (in Abhängigkeit vom Abundanzniveau) kann jedoch weiterhin der Futtereffekt einzelner Proteine deutlich werden. Bei Futterrüben-Fütterung scheint der Eisentransport (über das TRFL), die Fettröpfchenbildung (mit dem BT1A1) und die Immunabwehr (CO3) erhöht zu sein. Bei Weizenzufütterung ist die Abwehrreaktion (ZA2G) sowie Regulations- und Transport-Reaktionen (UBIQ) erhöht. Bei zwei Proteinen (LALBA und PIGR) zeigen sich sowohl Futter- als auch Gruppen- Effekte, bei zwei weiteren (FABP und PERL) vorrangig Gruppen-Effekte: Das multifunktionelle (und recht abundante) alpha-Laktalbumin (LALBA), das unter anderem als Untereinheit der Lactosesynthase agiert, zeigt mit Faktor 1.5 einen verhältnismässig starken Anstieg bei Weizenzufütterung, weist aber auch einen deutlichen Gruppeneffekt auf (wodurch in beiden t-Tests relativ hohe Werte gefunden werden). Der Gruppeneffekt (Gruppe 1 hat höhere Werte als Gruppe 2) spiegelt sich im Lactosegehalt der Proben deutlich wieder, der Futtereffekt jedoch nicht. Ähnliches findet sich für den PIGR-Wert: der Gruppen-Effekt ist vergleichbar dem Futter-Effekt, beide sind wahrnehmbar. Hier fällt Gruppe „LR“ (Gruppe 1) mit einem höheren Wert auf (sowie die Futterrüben-Fütterung) – da das PIGR für den IgA-Transport und deren Sekretion verantwortlich ist, könnte ein Zusammenhang mit der Eutergesundheit und den Zellzahlen gesucht werden. Da die Proben mit den höchsten PIGR-Werten eher geringe ZZ haben und andersherum, kann dieser direkte Zusammenhang als bestätigt betrachtet werden. Auch der PERL- und FABP-Gehalt spricht für deutlich gruppenspezifische Immunabwehr- Reaktionen bzw. Abwehrlagen. Fütterungsvergleich B: Weizen vs. Futterrüben - Diskussion 238 Eine Besonderheit im Hinblick auf die Immunreaktionen weist die Probe Futterrüben- G1-März auf, die bei der PCA auffällig ist und dort weit links liegt. Der Serumalbuminanstieg ist in Gruppe 1 nach dem Wechsel von Weizen auf Futterrüben auffällig. Gleichzeitig ist das beta-Laktoglobulin (LACB) erhöht, und der IgA-Transporter PIGR reduziert (siehe Tabelle im Anhang F). Diese Proteine stehen im Zusammenhang mit Immunabwehr-Reaktionen - es könnte eine Entzündung dafür verantwortlich sein, die sich auch in einer (im Vergleich zu vorher) deutlich erhöhten Zellzahl bei dieser Probe wiederspiegelt, bzw. niedrigen Harnstoff- Werten, die auf eine unausgeglichene Fütterungssituation (Eiweiß-Mangel) hinweisen. Letztlich wird dieser Umstand auch zur schlechten Differenzierbarkeit in der PCA beigetragen haben. 4.5.5. Metabolomik (MOSLER UND WOHLERS) Aufgrund der PCA und der t-Test-Werte wird deutlich, dass die Fütterungseffekte mittels Metabolomik deutlich werden, jedoch sind Unterschiede zwischen den Gruppen fast genauso deutlich bemerkbar. Bei der Weizenzufütterung fällt auf, dass zentrale Bausteine und Energielieferanten der Fettbildung mit p<0.05 und hohem Beitrag zur Varianz (PC1 loadings) erhöht sind. - Einerseits für die glykolytische Energiegewinnung: Glucose (hier in der Sechserringstruktur, Pyranose), Glucose-6-Phosphat und Fruktose-6-Phosphat. - Andererseits für die Lipidsynthese: Ethanolaminphosphat, Glycerol-3-Phosphat, 2-Hydroxy-Glutalsäure und das Vitamin Pantothensäure. Für die Futterrübenzufütterung sind keine größeren Anstiege im Niveau festzustellen. Abschließend ist zu bemerken, dass die Zufütterung keinen signifikanten Einfluss auf Aminosäurespiegel und Bildung verschiedener Zuckerderivate nimmt, diese aber deutlich gruppenspezifische Effekte zeigen. Demgegenüber betrifft der Zeiteffekt hier einige Pentosen (Nukleotid- und Coenzymsynthesen). Im Vergleich mit Ergebnissen anderer Methoden wird deutlich, dass mit der Steigbildmethode die Futterunterschiede für die März-Proben ebenfalls als sehr gering gegenüber den Februar-Proben beurteilt wurden, die Proteomik zeigt für die März-Proben auch eher uneindeutige Futtereffekt, für die Februar-Proben deutlich. Es könnte aufgrund des Versuchsdesigns ein gewisser Carry-over-Effekt vorliegen: von einer neutralen Fütterung ausgehend, die beide Futtermittel enthielt, wurde in die Extreme aufgeteilt. Nach einer Zeit dieser „Extrem-Fütterung“ wurden die Extreme gewechselt, so dass vielleicht der Organismus der Kühe längere Zeit benötigt hätte, sich ganz umzustellen bzw. die Einseitigkeit der vorhergehenden Fütterung auszugleichen. Deshalb sind die Unterschiede der Proben nach vorhergehender Neutral-Fütterung größer. Fütterungsvergleich B: Weizen vs. Futterrüben - Diskussion 239 4.5.6. FAS-Untersuchungen Die sich gegenläufig verhaltenden Meßwerte R40w und R40hr können in einen Zusammenhang mit den Probenqualitäten gebracht werden: bei Messungen an Samen (Getreidekörner, Grassamen...) treten erfahrungsgemäß höhere Werte für R40hr auf (und niedrigere für R40w), werden Messungen an frischen, saftigen Proben vorgenommen (z.B. Äpfel), so treten geringere Werte für R40hr auf (und höhere für R40w) (Strube 2009). Insofern kann eine parallele Messgrößenveränderung festgestellt werden: Die Meßwerte verhalten sich vergleichbar für Samen und für Milch aus Weizen-Fütterung – sowie für saftige Proben und Milch aus Futterrüben-Fütterung. Es kann deshalb die Milch aus Weizen- Fütterung als „samen-typisch“ bezeichnet werden, und die aus Futterrüben-Fütterung als „typisch für saftige Proben“ 4.5.7. Steigbilder Die korrekte Gruppierung bei den ersten drei PrN weist darauf hin, dass sich die Bildmerkmale der Proben unterschiedlich ausbilden („Gruppe d“ hat „mehr grüne Bereiche“ und „konturiertere, schmalere Schalenränder“ als „Gruppe LR“ mit weniger grünen Bereichen und breiteren, verwascheneren Schalenrändern) – was als Hinweis der Unterschiede der Proben gedeutet werden kann. Bei der vierten PrN jedoch waren die Bilder einander sehr ähnlich – was auf eine Angleichung der beiden Proben in deren Eigenschaften hinweisen kann. Bei der Gruppierung der Bilder in der Konzentration 0,087ml Milch wurde als erstes unterscheidendes Merkmal das Merkmal „Schalenrand etwas abgelöst“ verwendet – offensichtlich ist es hier nicht sehr gut reproduzierbar bzw. nicht direkt Proben-spezifisch, sondern scheint in diesem Fall eher methoden-spezifisch aufzutreten (ungleichmäßige Höhe der SZ, Gesamthöhe der SZ bzw. Steigdauer / Zeitpunkt des Aufdeckelns nach der 2. Phase), was dem Autor auch bei anderen Proben aufgefallen ist. Die anderen Merkmale jedoch sind vergleichbar denen aus der geringeren Konzentrationsstufe, und führen trotzdem nicht zur besseren Unterscheidbarkeit. Bei anderen Proben ist dem Autor aber auch aufgefallen, dass die Konzentrationsstufe 0,075 besonders sensibel ist, und bei höher konzentrierten Bildern die Ausprägung der Merkmale manchmal weniger unterschiedlich sind. Hinsichtlich der Bildmerkmale soll darauf hingewiesen werden, dass die Merkmale, die bei den drei ersten PrN konsistent zur Gruppierung der Proben beitrugen, auch untereinander die gleichen waren, und insofern die Proben schon mit diesen Merkmalen in der wiederholten PrN einander zugeordent werden können. Die Merkmale, die bei den Bildern der 4. PrN angewendet wurde, sind jedoch andere – und die Gruppierung ist nicht mehr sicher. Dieselben Bilder wurden später nochmals umfassend beurteilt (im Rahmen zu Untersuchungen von „Pflanzenorgandbildtypische Merkmale in Milch-Steigbildern“, Ergebnsise nicht gezeigt)– und dort werden die Proben J-471 und J-475 (beide Gruppe 2 „FuR-W“) sowie die Proben J-467 und J-470 (beide Gruppe 1 „W-FuR“) einander zugeordnet Fütterungsvergleich B: Weizen vs. Futterrüben - Diskussion 240 (richtige Gruppierung) – mit ähnlicher Merkmalsbeschreibung wie für die ersten drei PrN. Der Unterschied in der Beurteilung: hier wurden 8 Bilder unabhängig voneinander beurteilt – dort wurden immer zwei Bilder eines Proben-Codes gemeinsam beurteilt, so dass der „Mittelwert“ zum Tragen kam, und die Einzel-Bild-Variation, die hier noch zum Tragen kommt, dort nicht mehr auffällt. Auch wurden dort nur die 0,075ml Bilder beurteilt, die 0,087ml-Bilder nicht. Das bestätigt die methodischen Untersuchungen in Kapitel 3.6.3) Bei der Zuordnung der Bilder bei wiederholter PrN wurde in diesem Fall immer nur ein Bild je Variante verwendet worden (in den Ergebnissen fett gedruckt), das zweite wurde der Vereinfachung und Übersicht halber nicht dazu verwendet, in der Annahme, dass das eine verwendete Bild ausreichend Informationen enthält für eine Zuordnung. Zufälligerweise war für die 4. PrN das berücksichtigte Bild korrekt zugeordnet worden – weil jedoch die Gruppierung der Bilder der 4.PrN nicht richtig war, ist eine weitergeheden Auswertung (Zuordnung) nicht zulässig, diese Zuordnung kann nicht beurteilt werden. Die Gruppen-Charakteristischen Bildmerkmale sind offensichtlich denjenigen der Fütterung überlegen – denn bei der Zuordnung wurde immer die gleiche Tier-Gruppe einander zugeordnet – mit dem Hinweis, dass sich aber eine Veränderung der Bildmerkmale nach der 2. PrN andeutet. Somit ist der Futter-Effekt als geringer einzustufen als der Gruppen-Effekt, aber er ist vorhanden. Fütterungsvergleich B: Weizen vs. Futterrüben - Methodenvergleich 241 4.6. Methodenvergleich Fütterungssystemvergleich B Es wird getrennt die Differenzierungsfähigkeit der verschiedenen Methoden und die Charakterisierung der Proben vergleichend dargestellt. Eine Diskussion dazu wird im Zusammenhang der Schlussdiskussion geführt. Differenzierung Methode Ergebnis Effekt-Intensität Futtereffekt vorrangig Milchleistung (FuR = W) Kuh >> Futter >> PrN - Fettgehalt Eiweißgehalt Lactosegehalt Harnstoff FuR ≠ W FuR ≠ W FuR = W FuR ≠ W Kuh > Futter >>> PrN Kuh > Futter >>> PrN Kuh >>>>> Futter + PrN Futter (>) Kuh > PrN - - - + Gärprobe FuR ≠ W (pH-Wert) PrN >>> Futter + Gruppe - Fettsäuremuster FuR ≠ W Futter (>) Gruppe (>) PrN + Proteomik FuR ≠ W Futter (>) Gruppe > PrN + Metabolomik FuR ≠ W Futter (>) Gruppe > PrN + FAS FuR ≠ W Futter n.b. Steigbilder FuR ≠ W Gruppe + Futter +/- Tab 104. Vergleich der Ergebnisse verschiedener Methoden untereinander (Fütterungssystemvergleich B) Es ist auffällig, dass mit allen Methoden (außer mit dem Lactosegehalt, mit der Milchleistung nur tendenziell) Futtereffekte darstellbar sind. Bei fünf der angewendeten Methoden (Metabolomik, Proteomik, Fettsäuremuster, Steigbilder, Harnstoff) wird deutlich, dass der Futtereffekt nur geringfügig größer bzw. ähnlich groß ist wie der Gruppen-Effekt. Der Zeiteffekt ist ebenfalls deutlich bemerkbar. Bei den Methoden, bei denen Einzeltiermessungen vorgenommen wurden (Milchinhaltsstoffe), sind bis auf bei dem Harnstoff die Tiereffekte größer als die Futtereffekte, die PrN-Effekte sind sehr gering. Die FAS-Auswertung hat den Gruppen- und PrN-Effekt nicht berücksichtigt, so dass diese nicht mit beurteilt werden können. Auffällig an diesen Proben ist, dass sich der Futtereffekt im Februar deutlicher zeigt als im März, und das mit fast allen Methoden: Metabolomik deutlich (PCA), Proteomik anfänglich (PCA), Gärprobe ebenfalls (pH-Wert-Effekte bei 4.PrN nicht mehr vorhanden), und Steigbilder auch (Bildmerkmale bei 4.PrN sehr ähnlich, bei 1. PrN deutlich unterschiedlich). Fütterungsvergleich B: Weizen vs. Futterrüben - Methodenvergleich 242 Charakterisierung Methode Weizen-Zufütterung Futterrüben- Zufütterung Messgröße Fettgehalt Eiweißgehalt Niedrig Niedrig Hoch Hoch Harnstoffgehalt Hoch Gering Gärprobe Säuert schneller Bleibt länger frisch (säuert nicht) pH-Wert, Gallert-Bildung Fettsäuremuster Gesundheitlich vorteilhaft „intensive Fütterung“ W: CLA, MUFA, PUFA FuR: SFA, (MCT) Proteomik Mehr Stärke / Brennwert Eisentransport, Fettröpfchenbildung, Immunabwehr W: ZA2G, UBIQ (LALBA, PIGR) FuR: TRFL, CO3, BT1A1 Metabolomik Energie-Gewinnung, Lipidsynthese Keine Auffälligkeiten FAS „Samen-typisch“ „Saftfutter-typisch“ R40w und R40hr Steigbilder Kleine, „zusammengezogene“ Formen, differenziert Große, „ausladende“ Formen, verwaschen- auslaufend S-Größe, S-Form Tab 105. Charakterisierung der Proben aus Fütterungssystemvergleich B mit verschiedenen Methoden – Übersicht Jede Methode liefert eine Charakterisierung bzw. Beschreibung der Probeneigenschaften – es bedarf jedoch einer Interpretation der Ergebnisse, um Übereinstimmungen in der Charakterisierung zu verdeutlichen. Hierzu erscheint der Bezugsrahmen zu Wachstums- bzw. Bildungsprozessen hilfreich zu sein. Der hohe Fett- und Eiweißgehalt kann im Zusammenhang mit einer „produktiven Fütterung“ gesehen werden, die aufgrund ausgeglichener Fütterungsbedingungen hohe Leistungen ermöglicht. Das Fettsäuremuster spricht ebenfalls für eine solche Situation, und in den proteomischen Ergebnissen ist mit den erhöhten Gehalten für z.B. Substanzen für die Fettröpfchenbildung der Bezug zum Fettgehalt aufgezeigt. Nicht ganz stimmig erscheint dazu die metabolomische Charakterisierung, die auf eine vermehrte Lipidsynthese für die Weizenfütterung hinweist, die sich in dem realen Fettgehalt nicht wiederfindet. Besonders interessant erscheint die Charakterisierung der FAS-Methode und der Steigbildmethode: „Samen-typische“ Merkmale wären Eigenschaften wie „trocken, zusammengezogen, klein“ (z.B. Weizenkörner, Apfelsamen), im Vergleich zu Merkmalen, die „Saftfutter-typisch“ sind (z.B. Äpfel): „groß, wässrig, sich ausdehnend im fortschreitenden Wachstumsverlauf“ (vergl. hierzu auch STRUBE & STOLZ (2004). Diese Merkmale lassen sich auch in den Steigbildmerkmalen wiederfinden und könnten sogar auf die aus den analytischen Merkmalen ermittelten Eigenschaften übertragen werden, wenn der Bezug zu den Wachstums- und Bildungsprozessen gesucht wird. In diesem Sinne wäre die bei der Weizen- Variante aufgrund der metabolomischen Beschreibung scheinbar verstärkte Lipidsynthese einzuordnen, denn Fettbildung findet eher im Reifeprozess von Samen statt, nicht im Wachstumsprozess von wässrig-saftigen Früchten. Fütterungsvergleich B: Weizen vs. Futterrüben - Methodenvergleich 243 Fazit: 1) Die Milchproben lassen sich hinsichtlich der Fütterung mit 9 von 11 Methoden unterscheiden. 2) Der Fütterungseffekt ist geringfügig größer als der Gruppen-Effekt, der Zeiteffekt ist ähnlich dem Gruppen-Effekt. 3) Es ist bei Bezugnahme zu Wachstums- bzw. Bildungsprozessen eine in den meisten Methoden vergleichbare Charakterisierung je Probenqualität möglich. Die Futterrüben-Variante kann mit Eigenschaften aufwarten, die für eine produktive Situation spricht („saftfutter-typisch“) im Vergleich zu mehr „samen-typisch“ erscheinenden Eigenschaften bei der Weizen-Variante. Fütterungsvergleich C: Heu vs. Silage - Ergebnisse 244 4.7. Ergebnisse Fütterungssystemvergleich C: Einfluss von Wiesenheu und Silage auf verschiedene Parameter der Milch 4.7.1. Milchleistung und Gehalte von Fett, Eiweiß, Lactose, Harnstoff und Zellzahl Die Milchleistung (Abendgemelk) und Milchinhaltsstoffe von 23 Kühen wurden an allen vier PrN erfaßt (ein Fehlwert) und in einem Regressionsmodell mit den drei fixen Effekten Futter, Kuh und PrN modelliert. Die Milchleistung unterscheidet sich zwischen den Gruppen nur sehr geringfügig. Im Modell mit den drei fixen Effekten Fütterung, PrN und Einzeltier ist ein enger Zusammenhang der Milchleistung mit dem Einzeltier festzustellen (p<0,0001), ebenfalls mit dem PrN-Termin. Aber die Fütterung ist mit p=0,40 als Effekt nicht signifikant. Es lassen sich bis auf den Harnstoff keine signifikanten Fütterungseffekte auf die Milch-Inhaltsstoffe feststellen. In allen Fällen ist ein deutlicher Einzeltiereffekt festzustellen, häufig auch ein Zusammenhang mit der PrN. Der Fettgehalt ist bei Silagefütterung um 0,3% (p<0,1) erhöht. Wiesenheu Silage Ges. Modell Futter Einzeltier PrN Mittlere Werte r² Signifikanz-Niveau (p=) Fett % 5,53 5,68 0,89 <0,0001 0,08 <0,0001 0,030 Eiweiß % 3,71 3,64 0,91 <0,0001 0,07 <0,0001 0,030 Lactose % 4,78 4,81 0,74 <0,0001 0,40 <0,0001 0,003 Harnstoff ppm 202 179 0,74 <0,0001 0,0001 <0,0001 <0,0001 Zellzahl in 1000 247 247 0,50 0,002 0,76 0,002 0,14 Milchleistung Abendgemelk l 5,76 5,83 0,94 <0,0001 0,40 <0,0001 <0,0001 Tab 106. Mittlere Werte von Milchleistung (Abendgemelk), Fett, Eiweiß, Lactose usw. und Siginfikanzniveau für die Effekte Futter, PrN und Einzeltier der Regressionsanalyse, sowie für das gesamte Modell für Fütterungssystemvergleich C. 4.7.2. Gärprobe Bei fast allen Proben hat sich keine Molke oder nur wenig Molke abgesetzt. Bei den Heuproben der 2. PrN und den Silage-Proben der 3. PrN tritt etwas vermehrt abgesetzte Molke auf –also jeweils bei der „Gruppe Links“, offenbar unabhängig von der Fütterung. Die Konsistenz der Proben ist abhängig vom pH-Wert: dick (niedriger pH-Wert) bzw. eher flüssig (hoher pH-Wert, wenig gesäuert) – nur bei der 2. PrN sind die Proben der Heumilch generall „dick“, die der Silage-Milch „flüssig“. Bei den Proben der anderen PrN sind diese Unterschiede nicht so deutlich. Der Geruch wurde nur bei den Proben der 1. PrN erfaßt – dort zeigte sich ein deutlicher Unterschied: die Heu-Proben waren geruchlich angenehm sauer, die Silage- Proben „stanken“. Fütterungsvergleich C: Heu vs. Silage - Ergebnisse 245 Der pH-Wert ist im Mittel der je zwei bis drei Proben je PrN-Termin und Fütterungsvariante in Abb. 27: wiedergegeben. Es zeigt sich der Unterschied der pH-Werte je PrN-Termin – die Proben der 4. PrN mit auffällig hohen pH-Werten (die im Zusammenhang mit der kürzeren Gärzeit zu sehen sind), die vom 3. PrN-Termin auffällig gering, obwohl die gleiche Gärzeit und Temperatur wie bei den ersten beiden PrN vorlagen. Es ist an allen Terminen ein pH-Wert-Unterschied zwischen den Fütterungsvarianten festzustellen – wenngleich meistens nur als geringe Tendenz, nur bei der 2. PrN im t-Test siginfikant. Ein Regressionmodell mit den drei fixen Faktoren Futter, Gruppe und PrN (Tab 107) kann 78% der auftretenden Streuung erfassen – der Beitrag der einzelnen Effekte liegt bei p<0,0001 für die PrN, p=0,0179 für die Fütterung, und p=0,3540 für die Gruppe. Die Heu- Proben haben einen mittleren pH-Wert von 4,74, die Silage-Proben von 4,94. Wiesenheu Silage Mittelwert Signifikanz r² Effekt-Test Futter 4,74 4,94 0,0179 Gruppe 0,3540 PrN <0,0001 Gesamtes Modell <0,0001 0,78 Tab 107. pH-Werte der Gärprobe von den Poolproben aus dem Fütterungssystemvergleich C „Wiesenheu vs. Silage“.- Mittelwerte und Signifikanzniveau (sowie r²) für das gesamte Modell und die einzelnen Effekte Futter, Gruppe und PrN. Die Einzeltier-Proben weisen in der Gärprobe hinsichtlich des pH-Wertes (und des Aussehens sowie der Konsistenz, Ergebnisse nicht gezeigt) sehr große tierindividuelle Unterschiede auf. Bis auf bei den Proben der 2. PrN sind die Ergebnisse im t-Test nicht signifikant voneinander zu unterscheiden. An jenem PrN-Termin jedoch sind die Ergebnisse vergleichbar den Poolproben-Ergebnissen. Abb. 27: links: Poolproben – Mittlerer pH-Wert der Gärproben je PrN-Termin und Fütterungsvariante (n=2 bis 3 je Probe). Rechts: Einzeltierproben-Ergebnisse der Gärprobe (n=11 je Säule), parallel zu den Mischproben untersucht. Federbalken geben Standardabweichung der Werte an. Fütterungsvergleich C: Heu vs. Silage - Ergebnisse 246 4.7.3. Fettsäuremuster Das Fettsäuremuster wurde für 6 Poolproben bestimmt (von drei PrN je Fütterungsvariante eine Probe). Da von der 1. PrN keine Daten vorliegen wurden für die statistischen Auswertungen (zweiseitiger gepaarter t-Test je Effekt) nur die Daten der 2. und 4. PrN berücksichtigt. Eine visuelle Beurteilung der Daten aller drei PrN wurde gesonder vorgenommen und Effekte in der letzten Spalte von Tab 108 notiert. An der Summe der p-Werte zeigt sich, dass die größten Effekte aufgrund der Gruppenunterschiede zustande kommen (29,05), dicht gefolgt von den Futter-Effekten (32,2), die Zeiteffekte sind etwas geringer, aber deutlich vorhanden (42,9). Fütterungseffekte zeigen sich bei den Fettsäuren C-4:0, C-6:0, C-7:0, C-10:0, C- 13aiso, C-14:1tr9, C-18:1cis12 und cis13 (p<0,1). Hier kann eine Veränderung der Gehalte im Zusammenhang mit der veränderten Fütterung festgestellt werden. Bei den Summenparametern „Summe MCT“ und „Summe SCT“ sind ebenfalls fütterungsbedingte Effekte festzustellen. Tendenziell sind die MUFA’s, die PUFA’s und die CLA (sowie n-3 und n-6-Fettsäuren) bei der Silage-Fütterung etwas stärker vertreten als bei der Wiesenheu- Fütterung; die Wiesenheu-Variante führte zu vermehrt kurz- und mittellangkettigen Fettsäuren (siehe Tabelle unten). Gruppen-Effekte zeigen sich für eine Vielzahl von Fettsäuren, die häufig auch fütterungsspezifisch beeinflußt sind. Besonders auffällig ist der Gruppeneffekt bei C-12:0, C- 14:0, C-16:1tr9, und C-17:0, aber auch bei C-16:0 und C-18:0 läßt sich in der visuellen Beurteilung deutlich ein Gruppeneffekt finden (wenngleich er nicht statistisch abzusichern ist). Folgende Fettsäuren unterliegen einem Zeiteffekt: C-18:1tr10, C-18:1tr13, C-19aiso, C-20:1tr11, C-20:4n3, C-22:1cis11 (p<0,19, zweiseitiger gepaarter T-Test). Alle anderen Fettsäuren sind nicht bzw. kaum vom Zeitfaktor beeinflußt. Es finden sich in den Proben aus Wiesenheu-Fütterung mehr ungeradzahlige Fettsäuren (2,53 vs. 2,31 für Wiesenheu bzw. Silage), und mehr verzweigtarmige (iso und aiso) Fettsäuren (2,14 vs. 1,98) (p<0,2). Fütterungsvergleich C: Heu vs. Silage - Ergebnisse 247 Wiesenheu Silage Futter Gruppe Zeit Fettsäuren in g/100g Fett Mittlere Werte Signifikanz-Niveau (p=) C-4:0 3,41 2,97 0,046 0,029 0,971 C-6:0 2,95 2,54 0,031 0,044 0,956 C-7:0 0,06 0,03 0,087 0,473 0,527 C-8:0 1,33 1,19 0,114 0,138 0,862 C-9:0 0,02 0,02 0,771 0,205 0,795 C-10:0 2,93 2,68 0,097 0,029 0,971 C-10:1 0,34 0,3 0,207 0,139 0,861 C-11:0 0,06 0,05 0,625 0,404 0,596 C-12:0 3,55 3,13 0,231 0,087 0,912 C-12:1 0,1 0,08 0,12 0,108 0,892 C-13iso 0,09 0,07 0,224 0,213 0,787 C-13aiso 0,02 0,01 0,007 0,018 0,982 C-13:0 0,12 0,1 0,522 0,422 0,578 C-14iso 0,15 0,14 0,256 0,485 0,515 C-14:0 12,05 11,14 0,214 0,087 0,913 C-14:1rt9 0,0027 0,0011 0,036 0,057 0,943 C-14:1cis9 1,35 1,19 0,219 0,219 0,781 C-15iso 0,34 0,3 0,483 0,543 0,457 C-15aiso 0,55 0,48 0,104 0,159 0,841 C-15:0 1,48 1,29 0,133 0,260 0,740 C-16iso 0,33 0,27 0,02 0,043 0,957 C-16:0 37,1 36,81 0,95 0,413 0,587 C-16:1tr9 0,2 0,21 0,257 0,083 0,917 C-17iso 0,32 0,32 0,981 0,529 0,471 C-17aiso 0,45 0,44 0,346 0,077 0,923 C-17:0 0,68 0,69 0,951 0,01 0,900 C-18iso 0,3 0,31 0,433 0,064 0,936 C-18:0 8,09 8,84 0,647 0,493 0,507 C-18:1tr6/7/8 0,04 0,07 0,128 0,203 0,797 C-18:1tr9 0,12 0,13 0,834 0,380 0,620 C-18:1tr10 0,08 0,11 0,62 0,973 0,027 C-18:1tr11 0,65 0,99 0,547 0,609 0,392 C-18:1tr12 0,09 0,16 0,598 0,836 0,164 C-18:1tr13 0,03 0,07 0,414 0,924 0,076 C-18:1tr15 0,09 0,16 0,412 0,824 0,176 C-18:1tr16 0,18 0,24 0,357 0,721 0,279 C-18:1cis9 16,33 17,52 0,455 0,11 0,890 C-18:1cis11 0,3 0,48 0,305 0,337 0,663 C-18:1cis12 0,08 0,12 0,014 0,024 0,976 C-18:1cis13 0,02 0,06 0,030 0,034 0,966 C-18:2-tr9t,cis12 0,24 0,3 0,533 0,539 0,461 C-18:2-cis9,cis12 0,87 0,93 0,106 0,043 0,957 C-18:3-cis6,cis9,cis12(γ) 0,24 0,32 0,697 0,648 0,352 C-19aiso 0,03 0,05 0,424 0,948 0,053 C-18:3-tr3,cis9,cis12 0,007 0,014 0,227 0,525 0,475 C-18:3-cis9,cis12,cis15(α,ALA) 0,68 0,76 0,143 0,076 0,924 C-19:0 0,08 0,1 0,530 0,456 0,544 C-18:4-cis6,cis9,cis12,cis15 0,01 0,01 0,889 0,561 0,439 CLA-cis9,tr11 0,48 0,63 0,550 0,386 0,614 CLA-cis11,tr13 0,01 0,01 0,859 0,744 0,256 CLA-tr10,cis12/cis11,tr13 0,01 0,01 0,681 0,681 0,319 CLA-tr11,cis13 0,04 0,06 0,681 0,881 0,119 CLA-cis9,cis11 0,02 0,04 0,592 0,697 0,303 C-20iso 0,01 0,01 0,776 0,534 0,466 CLA-tr11,tr13 0,003 0,01 0,116 0,154 0,846 CLA-tr9,tr11 0,04 0,04 0,799 0,253 0,747 Fütterungsvergleich C: Heu vs. Silage - Ergebnisse 248 Wiesenheu Silage Futter Gruppe Zeit C-20:0 0,17 0,16 0,416 0,619 0,381 C-20:1-tr11 0,12 0,1 0,251 0,980 0,020 C-20:1-cis11 0,04 0,04 0,772 0,194 0,806 C-20:2-cis11,cis14 0,02 0,02 0,759 0,775 0,225 C-20:3-cis8,cis11,cis14 0,04 0,04 0,986 0,854 0,146 C-20:4-cis5,cis8,cis11,cis14 0,04 0,05 0,326 0,13 0,870 C-20:3-cis11,cis14,cis17 0,01 0,01 0,781 0,298 0,702 C-21:0 0,03 0,04 0,379 0,207 0,793 C-20:4n3 0,03 0,04 0,773 0,953 0,047 C-22:0 0,06 0,07 0,443 0,300 0,700 C-22:1-cis11 0,01 0,01 0,755 0,979 0,021 C-23:0 0,09 0,08 0,457 0,469 0,531 C-22:5n3 0,1 0,1 0,831 0,697 0,303 C-24:0 0,04 0,04 0,744 0,085 0,915 C-26:0 0,03 0,08 0,467 0,736 0,264 Summe der p-Werte 32,201 29,051 42,86 Wiesenheu Silage Futter Gruppe Zeit Fettsäuren in g/100g Fett Mittlere Werte Signifikanz-Niveau (p=) SFA 76,92 74,46 0,474 0,197 0,803 MUFA 20,17 22,11 0,467 0,171 0,829 PUFA 2,92 3,43 0,500 0,384 0,616 Summe C-18:1Trans-FS 1,28 1,93 0,524 0,697 0,303 Summe CLA 0,61 0,82 0,590 0,485 0,515 C-16:0/C-18:1cis9 2,33 2,24 0,814 0,175 0,825 C-16:0/C-18:1 ges. 2,17 2,05 0,778 0,209 0,791 Summe n-3 0,93 1,15 0,272 0,297 0,703 Summe n-6 1,64 1,97 0,470 0,524 0,476 Summe MCT(C-10>C-14) 20,77 18,89 0,056 0,023 0,977 Summe SCT(C-4>C-8) 7,74 6,74 0,048 0,058 0,942 CLA-cis9,tr11 0,48 0,63 0,558 0,386 0,614 Tab 108. Fettsäuremuster der Proben aus dem Fütterungssystemvergleich C „Wiesenheu vs. Silage“. Mittelwerte der Poolproben von 2. und 4. PrN sowie Signifikanz-Niveau der drei Effekte „Futter“, „Gruppe“ und „Zeit“ (zweiseitiger gepaarter t-Test je Effekt). Futter-spezifisch auftretende Fettsäuren und p-Werte <0,05 sind orange hinterlegt, p-Werte <0,1 sind gelb hinterlegt. Fütterungsvergleich C: Heu vs. Silage - Ergebnisse 249 4.7.4. FAS-Untersuchungen Ausführliche Ergebnisse siehe Anhang E, Bericht KWALIS. Als relativ stark auf den Faktor Fütterung reagierende primäre Messgröße ergab sich u.a. R80gr (Abb. 28:). Die Punkte repräsentieren Messwiederholungen. Im Vergleich der Messwerte mit denen aus einem anderen Datensatz zu den Varianten Wiesenheu und Silage (die beiden linken Datenreihen H und S) liegt es nahe, die unbekannten Probenpaaren P4001 und P 4011 als Silage-Variante, P4002 und P 4010 als Wiesenheu-Variante einzustufen. Nach dem Crossover der Fütterung (P 39xx) wurde der Unterschied geringer – eine Klassifizierung erscheint sehr unsicher. Nach Decodierung wurde nochmals nach Messgrößen gesucht, die den Faktor „Fütterung“ wiedergeben könnten – der einzige, der (bis auf bei der 1. PrN) konsistent Effekte zeigt und wenig auf PrN-Effekte anspricht, ist R80hr, ähnlich R80r (Abb. unten). Ansonsten sind bei fast allen Messgrößen sehr deutliche PrN-Effekte festzustellen, Gruppen-Effekte treten fast nie auf. Abb. 28: Die Messgröße R80gr für die Variable Fütterung (H=Heu, S=Silage). Die unbekannten Proben wurden mit ihren Code-Bezeichnungen angegeben (gelb hinterlegt: Eingangsdatum des jeweiligen Probenpaares). Fütterungsvergleich C: Heu vs. Silage - Ergebnisse 250 Abb. 29: Die Messgröße R80w für die Variable Fütterung (H=Heu, S=Silage). Die Proben nach dem Fütterungs-Crossover (P 39xx) weichen von sämtlichen anderen Daten deutlich ab. Abb. 30: Die Messgröße R80hr für alle Messwiederholungen für die 8 Proben. Fütterungsvergleich C: Heu vs. Silage - Ergebnisse 251 4.7.5. Steigbilder Material und Methoden: Es lagen Bilder von 8 gedoppelte, codierte Poolproben (von vier Probenahmen) zur Beurteilung vor: je PrN-Termin 2 gedoppelte Proben aus unterschiedlicher Fütterung. Es wurden Bilder von frischer und z.T. von gealterter Milch erstellt, in verschiedenen Konzentrationsstufen, und zusätzlich die Varianten „nur Rahm“ bzw. „nur Milch ohne Fett“ verwendet. Es wurden zur Auswertung alle aus einer Probe erstellten Bilder berücksichtigt. (Auswertung im Mai 2009). Die Bildauswertung erfolgte nach dem Grundmuster: Gruppieren (je PrN), Charakterisieren, Zuordnen wiederholter PrN. Zusätzlich erfolgte eine Klassifizierung (Zuordnung zur Fütterungsvariante) nach im Vorhinein entwickelten Bildmerkmalen (Kapitel 3.1.10.2). Ergebnis der Gruppierung und Charakterisierung je PrN Den Tabellen (s.u.) kann die vorgenommene Gruppierung der Bilder je PrN-Termin entnommen werden, sowie die Bildmerkmale, die als unterscheidend deutlich hervortreten. Es handelt sich z.T. um einfach bonitierbare Merkmale, z.T. aber auch um Merkmale, die sich als „einfach beschreibend, charakterisierend“ aus dem Bild spontan ergeben oder sich als „Wirkung auf den Betrachter“ ausbilden. Eine Zusammenfassung der Ergebnisse zur Gruppierung ist in Tab 113 zu finden. Eine umfassende Bonitur der einzelnen Bildbereiche je Probenahme-Termin findet sich in Anhang B. Fazit: Die Proben lassen sich konsistent an allen PrN, und bei der 4. PrN sogar in allen Konzentrationsstufen / Varianten korrekt gruppieren. 1. PrN: 4006 + 4004 4008 + 4005 23.2.09 0,06 ml Milch GB=3,5 , hell, schmal, kürzer S=3 (kleiner) F kürzer, zusammenlaufend F-Kranz DL heller „feiner“ GB=5, dunkel, breit, länger S=4 (größer) F länger, einzeln, geformter Ohne F-Kranz DL dunkler „gröber“ 25.2.09 0,075ml Milch o. Rahm F schmal, zierlich, zart GB=4, schmal, hell F breit, mächtig, beweglich, „kräftig“ GB=5, breiter, dunkler 25.2.09, R6, 0,06ml Milch S=2, flacher, unregelmäßiger, „kompakter“ GB=0 S=3, runder, tiefer, regelmäßiger, „aufgelockerter“ GB=0 25.2.09, R4 0,XX ml Milch ohne Rahm F schmal, gestaltet, licht, höher ansetzend S=2,5 (kleiner) GB=4 DL dunkler F breiter, verwaschener, dunkler / farbkräftiger, tiefer ansetzend S=3 (größer) GB=4 DL heller 25.2.09, R4 Rahm(ohne Milch) (Fast schlecht.) F-Ansätze höher, F heller, Kontrast gering Srand verwaschen (Fast schlecht.) F-Ansätze niedriger, F dunkler, Kontrast höher Srand kompakter These --- --- Decodierung Wiesenheu Silage Tab 109. Unterscheidende Bildmerkmale und Bild-Eigenschaften der Bilder vom 23.2. und 25.2.09 (1. PrN, Fütterungssystemvergleich C) Fütterungsvergleich C: Heu vs. Silage - Ergebnisse 252 2. PrN: 4024 + 4016 4014 + 4021 2.3.09 0,06 ml (R5-1...-4) S=3 (kleiner) GB=1 (wenig) Srand breit, S rund F zerlaufend, gerader S=3,5 (größer) GB=7 (viel) Srand schmal S spitzig F konturierter, beweglicher 2.3.09 0,075ml GB=7 F schmaler, zarter, „feiner“ Aufrecht-geordnet. GB=8 F breiter, „mächtiger“ Beweglich-ungeordnet 4.3.09 0,06ml – Milch leicht sauer. F schmal, lang F-Ansätze niedriger Lange F-Beine F-Rand verwaschen S kleiner, dunkler DL einfach Sockel höher F breiter F-Ansätze höher Weniger / konturiertere F-Beine F-Rand konturiert. F-Kranz. S größer, heller DL doppelt Sockel flacher These Silage Wiesenheu Decodierung Silage Wiesenheu Tab 110. Unterscheidende Bildmerkmale und Bild-Eigenschaften der Bilder vom 2.3.09 und 4.3.09 (2. PrN, Fütterungssystemvergleich C) 3. PrN: 3938 + 3934 3936 + 3933 0,075 ml, „warmes“ Deckelglas GB=4 (weniger) S=4,5 (mehr), spitzig F kürzer, „gestockt“, zusammenlaufend, „ungeordnet“ F-Ansätze höher GB=7,5 (mehr) S=3 (weniger), spitzig F länger, gerade, aufstrebend, „geordent“. F-Ansätze niedriger Kaltes Deckelglas Ohne F-Kranz F-Kranz 0,06ml GB=3,5 (weniger) S=4 Viel Gelb über F F geformter, konturierter, heller, obere ockerfarbene Linie mehr GB=5,5 (mehr) S=3,5 Wengier Gelb über F F dunkler, „massiger“, weniger geformt. (bzw. extrem schmal) Fett 0,1 S rund, „weich-kompakt“ S=2-4 (sehr unterschiedlich), wenig weiße Linie in S GB=3 F länger, bewegter, breiter F-Ansätze unterschiedlich hoch S spitzig, „aufgelockert“ S=4,5, mehr weiße Linie in S GB=5,5 F niedriger, schmaler, gerader F-Ansätze gleichmäßig hoch These Wiesenheu Silage Decodierung Wiesenheu Silage Tab 111. Unterscheidende Bildmerkmale und Bild-Eigenschaften der Bilder vom 16.3.09 (3. PrN Fütterungssystemvergleich C) Fütterungsvergleich C: Heu vs. Silage - Ergebnisse 253 4. PrN: 3966 + 3968 3969 + 3965 0,075 ml Fett S ohne weißliche Linie S=1 Srand gelöst F verwaschener, zerlaufender, „Formverlust“, „zarter, schwächer“ Weniger Gelb über F F-Ansatz höher S mit weißlicher Linie S=1,8 Srand gelöst F geformter, aufrechter, „kräftiger“ Mehr Gelb über F F-Ansatz niedriger 0,05 ml Milch (mit Fett) F-Ansatz höher F schmaler, kürzer S=1-0,8 S ohne weißliche Linie F-Ansatz niedriger F „kräftiger“, breiter, länger S=1,8 S ohne weißlicher Linie Milch (und Fett) R2 F heller, zarter, schmaler GB=3 F farbintensiver, dunkler, „kräftiger“ GB=6 0,06 ml Milch (mit Fett) R5 F breiter, verlaufend, „zarter“, weniger kräftig geformt Wenig Gelb über F S=3 (kleiner) GB=1 (weniger) DL heller F kräftig gehalten, gut geformt, aufrecht, lang, schmal Viel Gelb über F S=4,5 (größer) GB=5,5 (mehr) DL dunkler 0,06 ml Milch, FeSO4 2,5Monate alt F regelmäßig, geordnet, gestalteter, gerader F-Ansatz niederiger S=3,5, flacher, kleiner, runder GB=3,5 F unregelmäßiger, chaotischer, Form/Ordnungs-verlust, beweglicher F-Ansatz höher S=5-4,5, tiefer, größer, spitzer GB=4,5 0,06 ml Milch FeSO4 3 Wochen alt GB=2 S=2,5, rund F hell, zart, gerade, geordnet GB=6 S=4, spitzig F dunkel, bewegt-chaotisch?, farbintensiv, kräftig. „deftig, grobschlachten“ 0,06 ml Milch AgNO3 1,5 Monate alt F verwaschener S=3,5 GB=2 F weniger verwaschen als li. S=3 GB=3 0,06 ml Milch Ag und Fe frisch S=2-3 GB=2 F eher verwaschen, breiter, verlaufend, „nebelig“ DL heller S=4 GB=6 F schmal, viel Gelb oben, aufrechter, gehalten (leicht starr) DL dunkler, „kruseliger“ These Wiesenheu Silage Decodierung Wiesenheu Silage Tab 112. Unterscheidende Bildmerkmale und Bild-Eigenschaften der Bilder vom 23.3.09 (4. PrN Fütterungssystemvergleich C) Fütterungsvergleich C: Heu vs. Silage - Ergebnisse 254 Ergebnis der Zuordnung bei wiederholter PrN Es wurden jeweils die Bilder mit 0,06 ml Milch zum Vergleich untereinander ausgewählt (Bildmerkmalsunterschiede waren dort am deutlichsten). Diese Bilder werden entsprechend der Merkmalsausprägung in folgende Gruppen gelegt (siehe Tab 113). Die Abbildung SB-Abb-22-Fütterungssystemvergleich C: Heu vs. Silage gibt genau diese Bilder wieder. Bei der Zuordnung wurde berücksichtigt, dass aufgrund des Cross-Over-Designs a) die Gruppe einen Effekt auf die Bilder hat, und dass dieser fütterungsspezifisch verändert sein wird b) die Fütterung einen Effekt auf die Bildmerkmals-Ausprägung hat, und die Gruppen-Effekte überlagern / verändern kann. Insofern ist zu vermuten, dass die Bildmerkmale von der 1. und 2. sowie 3. und 4. PrN ähnlich sind, dass sie sich aber von der 2. zur 3. PrN ändern. Es ist das Ziel, die Bilder der wiederholten PrN je Gruppe einander zuzuordnen – und darin den Futterwechsel festzustellen. Datum Bildererstellung Gruppe 1 Gruppe 2 Gruppie- rung korrekt Zuordnung zu vorhergehender PrN korrekt 23.2.09 = 1. PrN 4006 + 4004 G2-H + G2-H 4008 + 4005 G1-S + G1-S Ja 2.3.09 = 2. PrN 4024 + 4016 G1-S + G1-S 4014 + 4021 G2-H + G2-H Ja nein 16.3.09 = 3. PrN 3934 + 3938 G1-H + G1-H 3936 + 3933 G2-S + G2-S Ja 23.3.09 = 4. PrN 3966 + 3968 G1-H + G1-H 3965 + 3969 G2-S + G2-S Ja ja Tab 113. Übersicht der vorgenommenen Gruppierung, der Zuordnung der Proben zueinander sowie der vermutlichen Fütterungsgruppen, incl. Decodierung (in rot). Es ist jeweils die Probennummer angegeben. Die grau hinterlegten Bilder werden im weiteren als „Variante B“ bezeichnet, die anderen als „Variante A“ – um auf diese Weise Effekte der Tiergruppe von Effekten der Fütterungsvarianten trennen zu können. Ergebnis-Übersicht: - Die an allen PrN gruppierbaren Bilder lassen sich in der ersten Fütterungsphase nicht einander zuordnen, jedoch in der zweiten. - Die Zuordnung der Bilder nach Gruppe bei gleichzeitigem Futterwechsel von der 2. zur 3. PrN (Cross-Over-Phase) war möglich. - Der Futterwechsel von der 2. zur 3. PrN ist in geringfügig veränderten Bildmerkmalen wahrnehmbar. Der Gruppeneffekt ist deutlich größer als der Futtereffekt. Fütterungsvergleich C: Heu vs. Silage - Ergebnisse 255 Probenspezifische Bildmerkmale ermitteln Folgende Bildmerkmale treten gruppenspezifisch auf / können als unterscheidende Merkmale zwischen den Gruppen 1 und 2 genannt werden: Gruppe 1 Gruppe 2 Weniger g.B., heller DL heller, breiter F-Kranz (z.T.) F zusammenlaufend, verschmelzend, F weniger geordnet-gefaßt Mehr g.B., dunkler DL dunkler, enger Kein F-Kranz F einzeln, „gefaßt“, F mehr geformt-geordnet. Tab 114. Bildmerkmale, die gruppenspezifisch auftreten Folgende Merkmale wechseln die Gruppen nach der zweiten Probennahme (und treten insofern fütterungsspezifisch auf): Variante A (Silage) Variante B (Wiesenheu) Im Vergleich je PrN-Termin Tropfen weniger rund und undeutlich Schalenrand etwas geschlossener nach unten hin (F kürzer) Tropfen rund und deutlich erkennbar Schalenrand eher geöffnet nach unten hin, „durchlässiger“. (F länger) Im Vergleich der Bilder der 2. mit der 3. PrN F weniger geformt, „zerlaufend“, F dunkler F geformter, durchgestaltet, F heller, „lichter“, mehr gelbe Bereiche über F Tab 115. Bildmerkmale, die mit der Fütterung die Gruppen wechseln Eine umfassende Bonitur der einzelnen Bildbereiche je Probenahme-Termin führt zu folgendem Ergebnis: Die Varianten A und B (Wiesenheu und Silage) unterscheiden sich nur in der Bildung der Tropfen und dem Schalenrand. Die Gruppen 1 und 2 unterscheiden sich in einer Vielzahl von Merkmalen. (siehe Tabelle im Anhang Teil A ). Ergebnis Klassifizierung nach Fütterungsvariante Die Bildmerkmale von Variante A und B wurden mit den ermittelten Klassifizierungskriterien (Kapitel 3.1.10.2) abgeglichen. Es wurde Variante A mit zerlaufenden, „dunkleren“ Fahnen und wenig ausgeformten Tropfen eher dem wäßrigen Blatt-Typ zugeordnet, und somit der Silage-Fütterung. Und Variante B mit den geformteren, durchgestalteteren, und oben gelberen Fahnen dem Blüten-Typ und somit dem Wiesenheu zugeordnet. Die Klassifizierung der Bilder von der 2. bis zur 4. PrN ist richtig, die der 1. PrN ist falsch / nicht möglich (Bilder der 1. PrN wurden bei der Zuordnung bei wiederholter PrN vertauscht zugeordnet). Fütterungsvergleich C: Heu vs. Silage - Ergebnisse 256 Zusammenfassung der Steigbild-Ergebnisse 1) Je vier Bilder einer Probennahme ließen sich an allen PrN-Terminen in zwei Gruppen gruppieren. 2) Eine Zuordnung der Gruppen zu den Gruppen einer vorhergehenden PrN war bei der 2., 3. und 4. PrN entsprechend der Fütterungsgruppen möglich, eine Zuordnung zur 1. PrN war nicht möglich. 3) Eine Klassifizierung zur Fütterungsvariante war bis auf bei der 1. PrN in allen Fällen möglich. 4) Der Gruppeneffekt (in diesem Fall in den Schalenzonen-Merkmalen) war gegenüber dem Futtereffekt in den Bildern deutlicher ausgebildet. Fütterungsvergleich C: Heu vs. Silage - Diskussion 257 4.8. Diskussion Fütterungssystemvergleich C 4.8.1. Zur Probenherkunft Die eingesetzten Futtermittel unterscheiden sich nicht nur in der Konservierungsart (Wiesenheu vs. Silage), sondern auch in der Herkunft (Wasserschutzgebiet der Magdeburger Börde, Dauergrünland vs. Acker bei Alfeld/Leine) und somit auch in der Gräserzusammensetzung (vielfältige Wiesengräser, wenig Kräuter vs. vorrangig Weidelgras). Es liegt somit kein reiner Vergleich der Konservierungsart vor, sondern lediglich Proben „unterschiedlicher Herkunft“, die im Systemvergleich einander gegenübergestellt werden. Es ist von Interesse, ob die durch die unterschiedlichen Methoden vorgenommene Charakterisierung der Probenqualität eine gewisse Übereinstimmung aufzeigen, der Bezug zur tatsächlichen Fütterung bzw. der Konservierungsart des Futters ist nebensächlich und aufgrund des multifaktoriellen Systemvergleichs nicht mit Sicherheit möglich. 4.8.2. Milchleistung und Gehalte von Fett, Eiweiß, Lactose, Harnstoff und Zellzahl Die Milchleistung ist nach den Einzeltier-Messungen nicht signifikant von der Fütterung beeinflusst. Im Vergleich der Konservierungsart (Heu vs. Silage) gibt es sowohl Untersuchungen, die eine geringere Milchleistung bei Heufütterung feststellten (z.B. KERR UND BROWN 1962a und b und 1963a und b), und andere (GRAVES et al. 1938) eine höhere Milchleistung, und GUTHER (1967) (wie in dieser Studie), der keinen Effekt auf die Milchleistung abhängig von der Konservierungsart des Futters feststellen konnte. Gleiches gilt für alle oben genannten Studien und den Fettgehalt. Der Proteingehalt ist ebenfalls nicht beeinflusst (GUTHER 1967). Die Futteraufnahme ist für Heu in einigen Studien als „erhöht“ dargestellt (STRICKLAND 1967, STRICKLAND et al 1966, FARRIES 1965, KERR UND BROWN 1963a und b), was aber nicht zu erhöhten Leistungen führte. Unter dem Aspekt der Konservierungsart (Heu vs. Silage) werden die geringen Unterschiede in diesem Experiment von den oft uneinheitlichen Angaben der Literatur bestätigt. Der an den Proben beobachtete unterschiedliche Harnstoff-Gehalt könnte auf ausgeglichenere Energie- und Eiweißgehalte in der Ration der Silage-Variaten hinweisen. Die theoretische Wiesenheu-Ration kann mit geringem Eiweißgehalt und sehr niedriger RNB diese Vermutung bekräftigen. Fütterungsvergleich C: Heu vs. Silage - Diskussion 258 4.8.3. Gärprobe Es sind vor allem Futter-, aber keine Gruppeneffekte in den pH-Wert-Veränderungen der Poolproben sichtbar. Evtl. gruppenspezifisch treten Molkeabscheidungen von der Gallerte auf. Die z.T. auftretenden Abweichungen der Doppelproben können methodenbedingt sein – diesbezüglich wäre eine größere Anzahl von Wiederholungsbestimmungen angeraten. Trotzdem bleiben Futtereffekte erkennbar. Die pH-Werte weisen im Zusammenhang der Fütterung darauf hin, dass die Wiesenheu-Proben entweder eine mikrobielle Besiedelung aufweisen, die zu einer rascheren / intensiveren Säuerung der Probe führt, oder die Milchprobe weist Eigenschaften auf, dass sich die Keime darinnen entsprechend besser vermehren können, die Milch besser gesäuert werden kann. Der Vergleich von Poolproben-Ergebnissen mit den Einzeltier-Ergebnissen zeigt, dass die Ergebnisse der 2. PrN miteinander verglichen werden können, an den anderen PrN- Terminen sind jedoch die Einzeltiere untereinander so unterschiedlich in den Ergebnissen, dass die Streuung so groß wird, dass von einem „sicheren Unterschied“ der Proben nicht mehr gesprochen werden kann und die im Mittelwert ermittelten Unterschiede als zufällig zu bezeichnen sind. Die in den Poolproben auftretende Streuung spiegelt die Einzeltier- Streuung wieder – wenngleich hier der Vorteil auftritt, dass der Mittelwert der Poolproben einheitlich für die Wiesenheu-Variante niedriger ist. Die z.T. große Streuung der Poolproben- Werte ist im Zusammenhang der wenigen Meßwerte zu sehen, die in diesen Wert eingehen. 4.8.4. Fettsäuremuster Zur Datengrundlage und Datenstruktur (deskriptiv) Bei der Auswertung der Daten bestand das Problem, dass die Proben der 1. PrN nicht analysiert wurden – somit würde eine dreifaktorielle Varianzanalyse (wie bei den anderen Fütterungssystemvergleichen) für die drei PrN zu einer Überschätzung der doppelt beprobten Variante führen. Deshalb wurden für die statistischen Auswertungen die Daten der 3. PrN ausgeschlossen, und nur mit denen der 2. und 4. PrN gearbeitet. Zuerst sollten Zeiteffekte ermittelt bzw. ausgeschlossen werden – mit Hilfe eines Student’s t-test (zweiseitig, gepaart) wurden Zeiteffekte ermittelt, daran anschließend wurde für die anderen Effekte jeweils mit dem t-Test das Signifikanz-Niveau ermittelt. Es zeigte sich, dass die Fettsäuren, die zeitspezifisch auftraten, nicht gleichzeitig gruppen- oder fütterungsspezifisch auftraten, und somit die Fettsäuren, die auf die veränderte Fütterung ansprachen, ohne Zeiteffekt auftraten. Bei einer visuellen Beurteilung des Verlaufes der Werte von der 2. zur 4. PrN, unter Berücksichtigung der 3. PrN als „Übergangssituation“, zeigt sich einerseits deutlich die 3. PrN noch in vielen Fettsäuren als „in Umstellung“ (beispielhaft bei C-15:0), andererseits Fütterungsvergleich C: Heu vs. Silage - Diskussion 259 konnten Futtereffekte deutlich erkannt werden, aber auch Gruppen- oder Zeit-Effekte waren in dem Datenmuster offensichtlich (Ergebnisse nicht gezeigt). Es ist somit deutlich, dass es Fütterungs-Effekte gibt, dass aber auch sehr deutliche Gruppen-Effekte vorliegen – und häufig sind beide Faktoren gleichzeitig bei derselben Fettsäure festzustellen, beide Effekte sind von ähnlicher Bedeutung, mit Tendenz zu mehr Gruppen- als Futter-Effekten. Zur inhaltlichen Bedeutung der Ergebnisse Die Proben aus der Wiesenheu-Variante wiesen relativ hohe Werte für kurzkettige (SCT) und mittellangkettige (MCT) Fettsäuren (sowie für gesättigte Fettsäuren (SFA)) auf. Die langkettigen Fettsäuren waren bei den Wiesenheu-Proben geringer vertreten. Die erhöhten Gehalte von Linolsäure und Linolensäure in den Proben aus der Silage-Variante könnte auf den z.B. von FERLAY et al. (2006) berichteten Effekt hinweisen, dass in Silage mehr Linolsäure und Linolensäure vorhanden ist, die sich dann auch vermehrt in der Milch wiederfinden, und der prozentuale Anteil der kürzerkettigen Fettsäuren (MCT und SCT) somit relativ reduziert wird. Das Auftreten kurzkettiger Fettsäuren (wie dies im Zusammenhang mit der Heu- Variante beobachtet wurde) ist vermutlich in engem Zusammenhang mit dem Stoffwechsel der Kühe zu sehen und deutet auf eine rohfaserreiche Ration hin mit Fett-Neubildung (BUTLER et al. 2009, CHILLIARD et al. 2000). Die langkettigen Fettsäuren (C18:0 und länger), die bei der Silage-Variante vermehrt beobachtet wurden, werden eher aus dem Futter direkt übernommen (BUTLER et al. 2009, SHINGFIELD et al. 2008, CHILLIARD et al. 2000). Da die gesättigten Fettsäuren (vorrangig die mittellangkettigen) hinsichtlich der Gesundheitswirkung großenteils als nachteilig angesehen werden (SHINGFIELD et al. 2008), ist aus diesen Ergebnissen die Wiesenheuvariante im Vergleich zur Silage-Variante als nachteilig für das Fettsäuremuster anzusehen. Es ist hierbei jedoch zu bedenken, dass das Wiesenheu aus einer grundsätzlich anderen Gräser-Zusammensetzung stammte als die Silage, und von viel üppigerem Standort (Hildesheimer Börde), wohingegen die Silage von lehmig-tonigem Boden im Alfelder Bergland stammt, so dass ein Unterschied des Fettsäuremusters des Futters unabhängig vom Konservierungsverfahren vorgelegen haben kann. Ob der Konservierungseffekt, der z.B. von BOUFAIIED et al. (2003) dargestellt wird, ursächlich für den Unterschied der Varianten ist, und sich auch in der Milch ausdrückt mit vermehrt längerkettigen Fettsäuren in der Silage-Milch, bzw. den Säuerungseigenschaften, die auch erwartungsgemäß dem Konservierungsverfahren entsprechen, kann aufgrund der großen Anzahl von Effekten nicht sicher bestimmt werden. Fütterungsvergleich C: Heu vs. Silage - Diskussion 260 4.8.5. FAS-Untersuchungen Der Versuch der Klassifizierung mit Hilfe von Messgrößen, die aus einem anderen Datensatz10 gewonnen wurden, mißlang – die vermutete Zuordnung der ersten beiden PrN ist für die 1. PrN korrekt – für die zweite falsch. Die folgenden PrN waren auch nicht korrekt einzuordnen (bei denkbar geringen Unterschieden, v.a. bei der 4. PrN). Daheraus muß konstatiert werden, dass die gewählten Messgrößen nicht geeignet sind, reproduzierbar eine Vorhersage zur Fütterung (Wiesenheu bzw. Silage) vorzunehmen. Jedoch ist interessant, dass ähnliche Effekte bei den Ergebnissen der Steigbildmethode festgestellt wurden: auch dort war eine korrekte Zuordnung von der 1. zur 2. PrN nicht möglich – die Bildmerkmale (bzw. hier die Meßwerte) haben sich von der einen zur anderen PrN wie „vertauscht“. Im Falle der „Vertauschung“ könnte der Gedanke aufkommen, dass die Proben vertauscht wurden. Der Fett- und Eiweißgehalt dieser Proben könnte dafür sprechen – der Lactosegehalt jedoch, der eher tierspezifisch und recht konstant auftreten sollte, spricht gegen eine Proben-Verwechslung, ebenfalls der Harnstoffgehalt und die Ergebnise der Gärprobe – somit ist zu vermuten, dass aufgrund der konträren Gehalte von Fett und Eiweiß bei den Proben der 1. und 2. PrN die Ergebnisse der FAS-Untersuchung und der SB- Ergebnisse ebenfalls konträr ausfallen. Zu den Fettsäure-Ergebnissen kann leider keine Aussage gemacht werden, da die Proben der 1. PrN nicht analysiert wurden. Es ist offensichtlich, dass der Faktor „Futter“ in diesem Fall sehr geringfügig mit den Meßwerten der FAS wiedergegeben werden kann – am ehesten mit der Messgröße R80hr, alle anderen Messgrößen geben eher PrN-Effekte wieder, und nur in geringerem Grade Futter-Effekte, wenngleich diese bei Modellbildung in einer mehrfaktoriellen Varianzanalyse in mehreren Meßwerten sichtbar werden. 4.8.6. Steigbilder Je Probenahmetermin liessen sich die Bilder z.T. sehr deutlich, z.T. etwas undeutlicher unterscheiden. Bei der Gruppierung werden jeweils alle Bilder (verschiedene Konzentrationsstufen usw.) einer Probe berücksichtig. Die Bilder der ersten Probenahme waren relativ schwierig zu unterscheiden, jedoch aufgrund der Vielzahl von Varianten erschien es doch möglich – und war korrekt. Die letzte Probenahme hat sehr deutlich unterschiedliche Bildmerkmale je Gruppe, die Gruppierung war sehr sicher möglich. Die Bilder der Proben von der 1. PrN konnten zwar untereinander korrekt gruppiert werden, aber nicht korrekt der Fütterungsgruppe (wiederholte PrN) zugeordnet werden. Somit war auch die Klassifizierung falsch. Hierbei muß berücksichtigt werden, dass die Bilder dieser Proben sich nur schwer gruppieren ließen (d.h. einander ähnlich sind, siehe dazu auch die Ergebnisse vom Triangeltest in Kapitel 3.6.1) (s.a. Ergebnisse im Anhang). Auch 10 Milchproben aus einer Studie zum Einfluss des Wirtschaftsstiles (konventionell vs. biologisch-dynamisch) und der Fütterungsintensität (Heu und geringe Kraftfuttergaben vs. Silage und hohe Kraftfuttergaben). Fütterungsvergleich C: Heu vs. Silage - Diskussion 261 findet sich ein ähnliches Zuordnungsproblem bei der FAS-Untersuchung (siehe Diskussion FAS-Untersuchung). Da auch die Fett- und Eiweißgehalte der Proben von der 1. zur 2. PrN wie „vertauscht“ erscheinen (Ergebnisse im Anhang), kann die Bildmerkmalsveränderung damit in Zusammenhang gebracht werden. Denn bei erhöhtem Fettgehalt tritt eine Verringerung der g.B auf (siehe z.B. „Rahm vs. Vollmilch“). Aufgrund der Annahme, dass die einzelnen Tiere einen deutlichen Effekt auf die Bildmerkmals-Ausprägung haben (was sich bei Poolproben mit leicht variierter Probenzusammenstellung zeigt bzw. an den z.T. sehr unterschiedlichen Bildern der Proben von Einzeltieren – siehe dazu auch Hof 6, Einzeltierbilder im Anhang, SB-Abb-48, SB-Abb- 49 und Sb-Abb-50), wurden die Bilder mit mehr grünen Bereichen und größeren Fahnen der einen Gruppe zugeordnet (Gruppe 2), die mit weniger grünen Bereichen der anderen. Bei der Zuordnung der verschiedenen Probenahmetermine untereinander war es naheliegend, die Bilder mit mehr grünen Bereichen und größeren Fahnen als eine Gruppe zu bezeichnen, die andere als die andere Gruppe. Der Fütterungseffekt sollte sich dann (aufgrund des Cross-Over-Designs) in der Veränderung der Bildmerkmale von der 2. zur 3. PrN zeigen bzw. die Gruppen wechseln. Ob diese Merkmale tatsächlich Kuhgruppen- oder Fütterungsvarianten-bedingt waren war zuerst irrelevant – im ersten Schritt sollte geprüft werden, ob es solche Merkmale gab oder nicht, um einen Effekt im Sinne des Cross-Over- Designs zu belegen. Tatsächlich fanden sich solche Merkmale (relativ wenige, eher unauffällige, Tab 115– wechselnde Merkmale). Jedoch zeigte die Decodierung, dass die Bilder der 1. PrN falsch eingruppiert wurden, dass somit die Bilder nicht streng nach den Fütterungsvarianten gruppiert wurden bzw. die Bildmerkmale nicht alleinig die Gruppen- und Fütterungs-Varianten wiedergaben. Es ist jedoch zu berücksichtigen, dass die Bilder der 1. PrN einander sehr ähnlich waren, die „falsche“ Zuordnung also aufgrund von sehr geringfügig unterschiedlichen Merkmalen stattfand. Außerdem hatte die FAS-Methode eine vergleichbare „verdrehte Zuordnung“ aufgrund von scheinbaren Ähnlichkeiten angedeutet. Ein weiterer Hinweis auf fütterungsspezifische Veränderung der Bildmerkmale kann in der Veränderung der Bildmerkmale von der 2. zur 3. PrN je Gruppe gesehen werden - also im Vergleich zwischen verschiedenen Probenahmeterminen, und nicht im Vergleich der Bilder eines Probenahmetermines. Dann fällt auf, dass die Fahnen von Variante B etwas geformter, durchgestalteter, und im oberen Bereich mehr gelbe Bereiche aufweisen, die Fahnen von Variante A etwas weniger geformte, eher zerlaufende, fast „dunklere“ Fahnen aufweisen. Diese Unterschiede sind jedoch verhältnismäßig geringfügig im Vergleich zu den Unterschieden zwischen den beiden Gruppen. Diese Merkmale entsprechen jedoch denen, die für eine Klassifizierung der Fütterungsvarianten ermittelt wurden (somit „typisch“ sind), und entsprechen den tatsächlichen Fütterungsvarianten und der Veränderung mit dem Futterwechsel. Somit kann ein gewisser Effekt der Fütterung auf die Bildmerkmals- Ausprägung angenommen werden, wenngleich Gruppen-Effekte im Vordergrund stehen. Fütterungsvergleich C: Heu vs. Silage – Methodenvergleich 262 4.9. Methodenvergleich Fütterungssystemvergleich C Differenzierung Methode Ergebnis Effekt-Intensität Milchleistung (Heu ≠ Sil) Fettgehalt Eiweißgehalt Lactosegehalt Harnstoff (Heu ≠ Sil) (Heu ≠ Sil) Heu = Sil Heu ≠ Sil (Futter + Gruppe + PrN) Gärprobe Heu ≠ Sil (pH-Wert) PrN > Futter > Gruppe Fettsäuremuster Heu ≠ Sil Gruppe > Futter >> Zeit Proteomik n.b. Metabolomik n.b. FAS Heu = Sil (Diff. je PrN möglich, klass. Zuordnung nicht) Steigbilder Heu ≠ Sil Gruppe > Futter Tab 116. Vergleich der Ergebnisse verschiedener Methoden untereinander (Fütterungssystemvergleich C) Bei einigen Methoden finden sich fütterungsbedingte Effekte – auch wenn sie z.T. gering sind und häufig von Gruppeneffekten überlagert werden. Die FAS (und der Lactosegehalt) können keine Fütterungsunterschiede wiederspiegeln. Die Methoden, die einen Futterunterschied erfassen können, geben gleichzeitig den Gruppeneffekt als „größer“ an als den Futtereffekt. Auffällig ist, dass die Proben der 1. PrN sich nicht immer entprechend der Fütterung beurteilen lassen: z.B. die Steigbildmethode ordnete die Bilder dieser Proben nicht korrekt der Fütterungsvariante zu. Diese (falsch) vorgenommene Zuordnung der Steigbilder zueinander findet sich als „Muster“ in gleicher Weise auch im Harnstoff- und Fett-Gehalt der Proben sowie dem FAS-Ergebnis wieder: bei der 1. PrN hat die Gruppe „G“ den höheren Fett- und niedrigeren Harnstoffgehalt als Gruppe „W“, bei den anderen PrN ist diese aber genau andersherum; bei der FAS sind die Werte für R80 für die Proben der 1. PrN konträr zu denen der 2. PrN. Insofern kann die vorgenommene Gruppierung als ein Abbild der Probenqualität bezeichnet werden, welche auch im Harnstoff-Gehalt oder Fett-Gehalt der Probe bzw. im FAS-Ergebnis bestätigt wird. Im Zusammenhang mit dieser Unregelmäßigkeit der Probenqualitäten ist weder die SB-Methode, noch die FAS-Methode geeignet, in allen Fällen die Proben korrekt der Fütterungsvariante zuzuordnen. Ob mit dem Fettsäure-Muster eine Klassifizierung in allen Fällen möglich wäre kann leider nicht beurteilt werden, da die Proben der 1. PrN nicht analysiert wurden, die hier besonders von Interesse gewesen wären. Weil diese in mehreren Methoden erfaßte Besonderheit der Proben der 1. PrN vorliegt, kann davon ausgegangen werden, dass alle diese Methoden den „besonderen Effekt“ zu fassen vermögen. Die Gärprobe kann mit konsistenten Ergebnissen aufwarten, die die Probenqualitäten zu allen PrN wiederspiegeln. Die Sonderstellung der 1. PrN wird nicht so deutlich: diese Methode kann den „besonderen Effekt“ nicht erfassen. Fütterungsvergleich C: Heu vs. Silage – Methodenvergleich 263 Charakterisierung Charakterisierung Methode Heu-Fütterung Silage -Fütterung Messgröße Harnstoff-Gehalt Etwas erhöht (202) – aber ausgeglichen. ausgeglichener ppm Gärprobe Säuert schneller / besser Säuert langsamer / weniger pH-Wert, Gallert- Bildung Fettsäuren Mehr kurzkettige (mehr de-novo- Synthese) Weniger kurzkettige FS Steigbilder F durchgestaltet, heller F zerlaufend, dunkler Fahnen Tab 117. Charakterisierung der Proben aus Fütterungssystemvergleich C mit verschiedenen die Proben unterscheidenden Methoden – Übersicht Die vier die Probenqualität differenzierenden Methoden liefern jeweils eine Charakterisierung, die aber nur wenige auffällige Ähnlichkeiten aufweisen. Im Hinblick auf Wachstums- und Bildungsprozesse kann vergleichbar wie für den Fütterungssystemvergleich B hier festgestellt werden, dass die Silage-Variante mit langsamer Säuerung und „zerlaufenden“ Steigbildmerkmalen Ähnlichkeiten zur „produktiven, saftfutter-typischen“ Futterrüben-Variante aufweist, auch der Harnstoffgehalt kann einen leichten Hinweis auf eine ausgeglichenere Ration geben. Das Fettsäuremuster weist aufgrund der kurzkettigen Fettsäuren bei der Heu-Variante scheinbar darauf hin, dass diese Variante die „produktivere“ sei – wenn jedoch die Fett-Neubildung im Zusammenhang mit strukturreichem Futter gesehen wird, ist die Beobachtung in Übereinstimmung zu sehen mit dem „trockenen“ Charakter der Heu-Variante, der sich auch in den Steigbild-Merkmalen („gestaltet, strukturiert“) widerzuspiegeln scheint. Fazit: 1) Die Milchproben lassen sich hinsichtlich der Fütterung mit 4 von 9 Methoden unterscheiden, mit drei weiteren Methoden sind Tendenzen erkennbar. 2) Der Fütterungseffekt ist etwas geringer als der Gruppen-Effekt, der Zeiteffekt ist deutlich, aber geringer als die anderen Effekte. 3) Die Charakterisierungen der Probenqualitäten je Methode können im Vergleich mit Versuch B die Heu-Variante als „trockener, strukturierter“, die Silage-Variante als „saftfutter-typischer“ bzw. „produktiver“ darstellen. Thematik „Hörner“ – Ergebnisse 264 4.10. Ergebnisse zur Thematik „Hörner“ 4.10.1. Datenstruktur – Zur Vergleichbarkeit der Gruppen Es gibt 6 Höfe, auf denen Vergleichsproben ohne Altersunterschied genommen werden konnten (siehe Tab 118). Auf den anderen liegt gleichzeitig zum Horn-Effekt ein Altersunterschied vor: die enthornten Kühe sind im Mittel aller 12 Probenahme-Bedingungen (11 Höfe, davon einer im Folgejahr wiederholt beprobt, bei neuer Tierzusammenstellung) mit 4,4 Laktationen um 1 Laktation älter als die horntragenden (p=0,0033). Weil bezüglich des Alterseffektes ein Milchleistungeffekt naheliegend ist (und in den Daten vorhanden, s.u.), wird dieser Effekt noch daneben gestellt (s.a. Abb. 31:) – hinsichtlich des alleinigen Faktors „Horn“ (ANOVA) ist der Milchleistungseffekt jedoch nicht signifikant unterschiedlich (p=0,16). Ob sich Futtereffekte zwischen den Gruppen ergeben wurde nicht erfaßt – da alle Kühe je Hof in einer Herde laufen, wurde von weitgehend einheitlicher Futtervorlage (Weidegang) ausgegangen. Das Kraftfutterniveau ist (aufgrund der Orientierung an der Milchleistung) ähnlich. Ob die enthornten Kühe rangniedriger sind und deswegen am Futtertisch erst zweitrangig fressen wurde nicht ermittelt – die Landwirte berichteten, dass der Hornstatus nicht unbedingt die Rangfolge festlege. Gesundheitliche Aspekte (Eutergesundheit) wurden im Rahmen der Zellzahlen beim Zusammenstellen der Proben berücksichtigt, soweit dies möglich war, weitere Gesundheitsparamter konnten nicht erfaßt werden. Hof Alters-Effekt zw. H / Eh Differenz (Laktationen) Milchleistungs-Effekt: Differenz Eh – H (l / Kuh und Tag) Hof 10 Eh > H 3,6 6,6 Hof 11 Eh H 1,2 1,7 Hof 4 Eh > H 0,5 3,9 Hof 4, 2008 Eh > H 0,9 1,4 Hof 8 Eh > H 3,0 - 2,5 Hof 2 EhH 0,25 0 Hof 7 Eh=H 0 - 1,14 Hof 3 Eh>H 0,3 6,0 Hof 5 Eh > H 1,4 1,8 Hof 9 Eh > H 1,6 5,6 Tab 118. Alters- und Milchleistungseffekt je Hof im Vergleich der Proben H / Eh. Offensichtliche Effekte farbig hervorgehoben. Thematik „Hörner“ – Ergebnisse 265 Abb. 31: Links: Alterunterschied zwischen den zwei Proben-Gruppen je Hof Rechts: Milchleistungs-Unterschied je Hof Proben „Nachträglich enthornt“ von Hof 2 Die Proben von Hof 2 („nachträglich enthornt“ vs. „als Kalb enthornt“ vs. „horntragend“) weisen einen geringen Altersunterschied auf (Gruppe 3 (als Kuh enthornt) ist etwas jünger als die anderen, siehe Anhang C: Übersicht über die Proben zum Thema Hörner), das Laktationsstadium von Gruppe 3 ist etwas weiter fortgeschritten als das der anderen. Die Eutergesundheit (Zellzahl) ist bei der 2. PrN (GuM) am ausgeglichensten – mit den höchsten ZZ (166) für die Gruppe 3-GuM. 4.10.2. Milchleistung, Fett, Eiweiß, Lactose, Harnstoff, Zellzahl Unter Berücksichtigung der fixen Faktoren Hornstatus, Alter, Laktationsstadium, Betrieb und PrN konnten bis auf bei der Zellzahl für alle hier aufgeführten MLP-Werte betriesspezifische Effekte festgestellt werden – für den Faktor „Horn“ ergibt sich lediglich ein geringer Zusammenhang mit dem Gefrierpunkt, der jedoch für das Alter der Kühe stärker ausgeprägt ist (p=0,04 vs.0,02). Die Milchleistung und die Zellzahlen sind altersspezifisch beeinflusst (Milchleistung korreliert mit Alter geringfügig (R²=0,12), Zellzahl (log- transformiert) korreliert deutlich mit Alter bei R²=0,47) – der Laktosegehalt verändert sich parallel zum Laktationsstadium (Korrelation mit R²=-0,62). Im Zusammenhang mit dem Tatbestand, dass die enthornten Kühe meistens älter sind und ein altersspezifischer Milchleistungseffekt vorliegt, ist der Rückschluß naheliegend, dass ebenfalls ein Effekt zwischen Milchleistung und Horn vorliegen muß. Jedoch lässt er sich nicht signifikant feststellen, in den absoluten Werten jedoch erkennen. Insofern sind die Werte der Horn- Proben tendenziell von jüngeren Kühen mit geringerer Milchleistung. Thematik „Hörner“ – Ergebnisse 266 Enthornt Horn Horn- Effekt Alters- Effekt LaSt- Effekt Betriebs- Effekt PrN- Effekt r² des Modells Milchleistung 21,90 20,89 ns (0,52) 0,0084 ns (0,82) <0,0001 ns (0,99) 0,87 Fettgehalt 3,92 3,90 ns (0,76) ns (0,48) ns (0,81 <0,0001 ns (0,77) 0,67 Eiweißgehalt 3,23 3,22 ns (0,30) ns (0,15) ns (0,80) <0,0001 ns (0,87) 0,51 Lactosegehalt 4,66 4,69 ns (0,73) ns (0,11) 0,0070 <0,0001 ns (0,41) 0,76 Harnstoff ppm 208 219 ns ns ns <0,0001 ns 0,67 Zellzahl 320 230 ns (0,33) 0,041 ns (0,11) ns (0,15) ns (0,31) 0,45 pH-Wert 6,69 6,69 ns ns ns 0,0005 ns 0,62 Gefrierpunkt -0,5234 -0,5224 0,0429 0,0217 ns (0,63) <0,0001 ns (0,12) 0,78 Tab 119. Mittelwerte für Milchleistung, Fett, Eiweiß, Lactose, Harnstoff, Zellzahl, pH- Wert und Gefrierpunkt der Proben zur Fragestellung „Horn“, sowie Signifikanzniveau für die evtl. die Werte beeinflussenden Faktoren (n=68 Datensätze). 4.10.3. Gärprobe Die Meßwerte der beiden Proben-Wiederholungen weisen einen Korrelationskoeffizienten von R=0,96 auf (sehr stark positiv korreliert). Die Regeressionsanalyse konnte für den Faktor „Horn“ keinerlei Zusammenhang mit dem pH-Wert nach Gärung feststellen. Der Einfluß des Betriebes (n=9) ist als höchst signifikant festzustellen, die Gärdauer sowie die KW der PrN haben ebenfalls einen höchstsignifikanten Effekt auf den pH-Wert (p<0,0001). Das gesamte Modell mit den vier Faktoren erklärt 93% der Streuung (r² = 0,93). Der Faktor Horn kann aber auch ohne Folgen von dem Modell entfernt werden – r² bleibt bei 0,93. Fazit: Der Faktor „Horn“ hat keinen Einfluß auf den pH-Wert der Gärprobe – jedoch der Betrieb, der Zeitpunkt der Probennahme (KW) und die Gärdauer. 4.10.4. Fettsäuremuster Faktor „Horn“ im gepaarten Design Für die Auswertung des Fettsäure-Musters wurden folgende Datensätze verwendet: Hof Anzahl PrN Hof 1 3 Hof 2 3 Hof 3 3 Hof 4 3 Hof 4-2008 1 Hof 5 3 Hof 6 3 Hof 7 3 Hof 8 3 Hof 9 1 Hof 10 3 Hof 11 1 Tab 120. Für Fettsäure-Muster-Analyse verwendete Proben Thematik „Hörner“ – Ergebnisse 267 Je Hof und PrN lagen die Werte der zwei Vergleichsgruppen vor, insgesamt also 62 Datensätze von 11 Höfen plus Proben von Hof 4-2008. Es wird ein Modell mit den fixen Effekten Horn, Betrieb und PrN gebildet, wobei bewusst keine Gewichtungen vorgenommen wurden, so dass also die nur einmalig beprobten Höfe unterbewertet werden, die mehrfach beprobten Höfe tragen mehr zur Absicherung der Ergebnisse bei. Ergebnisse Alle Fettsäuren sind deutlich betriebsspezifisch beeinflusst (höchstsignifikant)– wenige weisen einen probennahme-spezifischen Effekt auf. Einige treten horn-spezifisch auf. Die Fettsäuren C-6:0, C-7:0, C-9:0, 10:0, 11:0, 12:0 sind bei den horntragenden Kühe in geringeren Mengen je 100g Fett anzutreffen, die Fettsäuren CLA-tr11,cis13, C-15aiso, C- 17aiso, C-18:1tr10, C-20:1tr11, C-21:0, C-20:3n3 (=C20:3cis11,cis14,cis17) sind in höheren Mengen bei den horntragenden Kühen vorzufinden. (siehe Tabelle, signifikant (p<0,05) oder deutliche Tendenz (p<0,1)). Bei den Summenparametern findet man keine Unterschiede, lediglich eine schwache Tendenz bei der „Summe SCT“ bzw. „Summe C-4 bis C-10“, mit höheren Werten für die enthornten Kühe (p<0,2). Ein genauer Blick auf die Unterschiede je Hof zeigt, dass die Effekte bei einigen Höfen deutlich sind – jedoch andere Höfe keine Effekte zeigen, selten tritt ein gegensätzlicher Effekt auf. Z.B. sind für C-15aiso bei den Betrieben Hof 10, Hof 1 und Hof 5 deutliche Effekte festzustellen, bei Hof 7 tendenziell gegensätzliche. Mit geringeren Effekten ist dieses Muster auch bei Hof 4 und Hof 8, oft auch für Hof 9 und Hof 6 zu finden (s. Abb. 32:, beispeilhaft für C-17aiso und CLA-tr11,cis13). Dieses Muster findet sich ebenfalls so für weitere Fettsäuren (C-6:0, C-12:0, C-17aiso, CLA-tr11,cis13, C-20:1-tr11, Summe C- 18:1Trans Fettsäuren, Summe SCT). Bei den anderen Höfen sind die Effekte meistens geringer. Bei Hof 2 z.B. (bei dem noch eine dritte Gruppe „nachträglich enthornt“ beprobt wurde, Ergebnisse dazu siehe nächstes Kapitel) sich fast nie Unterschiede zu finden. Thematik „Hörner“ – Ergebnisse 268 Abb. 32: C-17aiso und CLA-tr11,cis13 je Hof, in Abhängigkeit vom Hornstatus Abb. 33: Summe SCT und CLA-cis9,tr11 je Hof, in Abhängigkeit vom Hornstatus Fettsäuren in % Enthornt Horn r² Modell Horn- Effekt Betrieb- Effekt PrN- Effekt Mittelwert Signifikanz-Niveau (p=) C-4:0 3,82 3,76 0,76 0,38 0,0001 0,73 C-6:0 2,45 2,38 0,73 0,0854 0,0001 0,85 C-7:0 0,039 0,035 0,78 0,0801 0,0001 0,19 C-8:0 1,32 1,28 0,76 0,16 0,0001 0,71 C-9:0 0,028 0,024 0,79 0,0812 0,0001 0,20 C-10:0 3,06 2,92 0,79 0,0699 0,0001 0,57 C-10:1 0,31 0,31 0,73 0,59 0,0001 0,69 C-11:0 0,05 0,04 0,76 0,0875 0,0001 0,47 C-12:0 3,31 3,17 0,79 0,0965 0,0001 0,43 C-12:1 0,08 0,08 0,76 0,99 0,0001 0,51 C-13iso 0,07 0,07 0,76 0,91 0,0001 0,56 C-13a iso 0,03 0,03 0,97 0,50 0,0001 0,07 C-13:0 0,09 0,09 0,79 0,52 0,0001 0,56 C-14iso 0,13 0,13 0,76 0,83 0,0001 0,90 C-14:0 11,36 11,27 0,61 0,63 0,0001 0,17 C-14:1 tr9 0,01 0,01 0,54 0,75 0,0004 0,09 C-14:1 cis9 0,97 1,01 0,69 0,21 0,0001 0,80 C-15iso 0,31 0,31 0,67 0,44 0,0001 0,19 C-15a iso 0,54 0,58 0,71 0,0044 0,0001 0,94 Thematik „Hörner“ – Ergebnisse 269 C-15:0 1,34 1,37 0,72 0,20 0,0001 0,24 C-16iso 0,25 0,26 0,71 0,15 0,0001 0,82 C-16:0 31,68 31,54 0,64 0,74 0,0001 0,19 C-16:1-9t 0,17 0,17 0,73 0,93 0,0001 0,69 C-16:1-c9 1,49 1,48 0,71 0,93 0,0001 0,18 C-17iso 0,33 0,33 0,95 0,55 0,0001 0,19 C-17a iso 0,43 0,46 0,73 0,0068 0,0001 0,88 C-17:0 0,66 0,67 0,69 0,38 0,0001 0,25 c-17:1 0,07 0,07 0,46 0,14 0,2700 0,43 C-18iso 0,09 0,09 0,98 0,24 0,0001 0,88 C-18:0 9,44 9,40 0,60 0,85 0,0001 0,45 C-18:1tr6/7/8 0,12 0,12 0,71 0,40 0,0001 0,40 C-18:1tr9 0,19 0,19 0,81 0,29 0,0001 0,16 C-18:1tr10 0,15 0,16 0,81 0,0458 0,0001 0,80 C-18:1tr11 1,50 1,59 0,81 0,31 0,0001 0,07 C-18:1tr12 0,18 0,20 0,53 0,27 0,0001 0,92 C-18:1tr13 0,20 0,21 0,62 0,49 0,0001 0,98 C-18:1tr15 0,19 0,21 0,36 0,16 0,0396 0,29 C-18:1tr16 0,36 0,36 0,60 0,96 0,0001 0,99 C-18:1tr13+tr15+c9 18,74 19,08 0,78 0,37 0,0001 0,01 C-18:1cis9 18,36 18,67 0,78 0,41 0,0001 0,01 C-18:1cis11 0,50 0,51 0,66 0,78 0,0001 0,30 C-18:1cis12 0,13 0,12 0,59 0,40 0,0001 0,69 C-18:1cis13 0,10 0,09 0,43 0,046 0,0083 0,78 C-18:1cis15 0,09 0,09 0,49 0,98 0,0010 0,06 C-18:2tr9,tr12 0,16 0,15 0,98 0,25 0,0001 0,37 C-18:2-cis9,cis12 1,07 1,07 0,78 0,93 0,0001 0,61 C-18:3-cis6,cis9,cis12(γ) 0,08 0,09 0,94 0,14 0,0001 0,84 C-19:0aiso 0,03 0,03 0,98 0,61 0,0001 0,03 C-18:3-cis9,cis12,cis15(α) (ALA) 0,86 0,87 0,83 0,78 0,0001 0,82 C-19:0 0,07 0,07 0,87 0,71 0,0001 0,004 CLA-cis9,tr11 / tr8,cis10 0,89 0,96 0,78 0,30 0,0001 0,21 CLA-tr11,cis13 0,06 0,07 0,93 0,0479 0,0001 0,87 CLA-cis9,cis11 0,03 0,03 0,58 0,73 0,0001 0,24 CLA-Y 0,06 0,06 0,92 0,61 0,0001 0,14 CLA-11t,13t 0,04 0,04 0,79 0,52 0,0001 0,0986 CLA-9t,11t 0,05 0,05 0,45 0,94 0,0035 0,19 C-20:0 0,14 0,15 0,68 0,24 0,0001 0,005 C-20:1-11t 0,10 0,11 0,59 0,0172 0,0001 0,46 C-20:1-cis11 0,04 0,04 0,58 0,42 0,0001 0,34 20:2-cis11,cis14c 0,016 0,018 0,83 0,0816 0,0001 0,04 C-20:3-cis8,cis11,cis14 0,07 0,07 0,77 0,17 0,0001 0,79 C-20:4-cis5,cis8,cis11,cis14 0,06 0,06 0,59 0,93 0,0001 0,94 C20:3-cis11,cis14,cis17 0,03 0,03 0,77 0,0198 0,0001 0,29 C-21:0 0,02 0,023 0,90 0,0659 0,0001 0,24 C-18:3-cis8,tr10,tr12CS 0,04 0,05 0,68 0,11 0,0001 0,46 C-20:5-cis5,cis8,cis11,cis14,cis17 0,09 0,09 0,77 0,45 0,0001 0,23 C-22:0 0,07 0,07 0,63 0,16 0,0001 0,01 C23:0 0,04 0,04 0,91 0,42 0,0001 0,04 C-22:5n3 0,10 0,11 0,70 0,18 0,0001 0,15 C-24:0 0,04 0,04 0,59 0,37 0,0001 0,02 C-26:0 0,05 0,06 0,34 0,18 0,1300 0,44 Thematik „Hörner“ – Ergebnisse 270 Fettsäuren in % Enthornt Horn r² Modell Horn- Effekt Betrieb- Effekt PrN- Effekt Mittelwert Signifikanz-Niveau (p=) SFA 71,22 70,64 0,67 0,24 0,0001 0,011 MUFA 25,03 25,51 0,69 0,27 0,0001 0,0085 PUFA 3,75 3,86 0,72 0,26 0,0001 0,31 Summe C-18:1Trans-FS 2,89 3,05 0,76 0,24 0,0001 0,37 Summe CLA 1,15 1,22 0,81 0,28 0,0001 0,11 C-16:0/C-18:1cis9 1,77 1,73 0,75 0,37 0,0001 0,0145 C-16:0/C-18:1 ges. 1,55 1,51 0,71 0,33 0,0001 0,0191 Summe n-3 1,33 1,35 0,84 0,47 0,0001 0,66 Summe n-6 1,80 1,82 0,88 0,61 0,0001 0,76 Summe MCT(C-10>C-14) 19,45 19,12 0,72 0,34 0,0001 0,38 Summe SCT(C-4>C-8) 7,62 7,45 0,76 0,14 0,0001 0,89 n-3 / n-6 0,76 0,76 0,92 0,98 0,0001 0,61 Summe C-4 > C-10:0 10,66 10,38 0,85 0,18 0,0001 0,12 Tab 121. Fettsäuremuster der Proben zur Thematik „Horn“ – im gepaarten Design. p- Werte des ges. Modells alle höchstsignifikant (p<0,001) Faktor „nachträglich als Kuh enthornt“ (Hof 2) Folgende Fettsäuren treten hornspezifisch auf, wobei sich die Horn-Probe von den anderen beiden Enthornt-Proben unterscheidet bzw. ein Gefälle von Enthornt zu Horn vorliegt: C-14iso, C-14:1, C-15iso, C-16:1-9c, C-18iso, C-20:3n6, C-20:4n6, C-22:5n3. Es gibt einige Fettsäuren, bei denen ein signifikanter Unterschied zwischen den drei Gruppen festgestellt wird – jedoch ist meistens Gruppe 3 (nachträglich enthornt) anders als die anderen beiden, die untereinander ähnlich sind (Ergebnisse siehe Anhang C, „Fettsäuremuster von Hof 2“) Thematik „Hörner“ – Ergebnisse 271 4.10.5. Proteomik (MOSLER UND WOHLERS, 2010) Für sieben Milchproben von drei Herden (Hof 7 (Ob) zwei Proben und Hof 2 (Fu) drei Proben im gepaarten Design, Hof 12 (Da) zu „genetisch hornlos“) konnten im nanoLC-ESI- Tandemmassenspektrometer 17 minore Molkeproteine (für die ein Vergleich der relativen Abundanzwerte möglich war) sowie das vorherrschende Protein, Laktoglobulin, annotiert werden. Bei fünf der 17 Proteine gab es niedrige Fehlwerte, die soweit möglich mit jeweils 50% des niedrigsten Messwertes innerhalb der gleichen Herde (bzw. sonst im Set) ersetzt wurden. Die Proben von Hof 12 (Da) dienen lediglich zur Verdeutlichung von Gruppen- bzw. Herdeneffekten (eine Gruppe enthornt, eine Gruppe genetisch hornlos), und haben keinen direkten Bezug zur Frage der Enthornung. Die PCA kann den Horneffekt nicht in einer einzelnen Hauptkomponente differenzierend darstellen, aber die PC1 (35,2% der Gesamtvarianz) und die PC2 (27,7%) stellen gemeinsam den kombinierten Herden- und Horneffekt dar (siehe Abb. 34:, Herden farbig voneinander abgehoben). Zunächst fällt eine deutliche Dominanz des Herdeneffektes auf. Die Proben der Herde-Ob liegen in der Projektion der ersten beiden Hauptkomponenten rechts oben, Herde-Fu mittig unten und Herde-Da links oben. Die Proben der horntragenden Kühe (Ho+) sind von beiden Herden eher oben-rechts angeordnet, die je Herde dazugehörenden Enthornt-Proben (Ho-) sind jeweils weiter links-unten angeordnet (durch Pfeile markiert). Die beiden Proben vom Hof 12 (Da) (enthornt und genetisch hornlos) setzen sich (links oben) von den anderen deutlich ab – wobei die „genetisch-hornlos“-Probe den horntragenden am nächsten ist. Abb. 34: PCA über ausgewählte 18 Proteine der sieben Proben zur Thematik „Horn“. Dieses Bild spiegelt sich auch in der geclusterten Heatmap der Proteine wieder (Abb. Abb. 35:). Die Milchproben der horntragenden Kühe in Herde-Ob und -Fu bilden mit denen der genetisch hornlosen aus Herde-Da ein eng korreliertes Cluster. Ebenso clustern die Proben von den enthornten Kühen in Herde-Ob und -Fu. Die Milch der enthornten in Herde Da unterscheidet sich von allen anderen am stärksten. Thematik „Hörner“ – Ergebnisse 272 Beim Blick auf die beiden Proben horntragender Kühe fällt in der Heatmap auf, dass sich an vier Proteinen ein genereller Horneffekt zeigt. Serotransferrin (TRFE) und Beta- Lactoglobulin (LACB) sind erhöht, während der Polymeric immunoglobulin receptor (PIGR) und Lactadherin (MFGM) für die Hornproben abgesenkt sind. Nimmt man demgegenüber die beiden Proben der Herde-Ob zum Ausgangspunkt, so wird deutlich, dass die Hälfte der Proteine herdenspezifisch auftreten. In den t-Test-Vergleich werden hier nur die Proben aus Herde-Ob und –Fu einbezogen, die Proben aus Herde-Da (genetisch hornlos) werden lediglich als Quotienten mit berücksichtigt. Es werden einerseits Herdeneffekte zwischen Herde-Ob und –Fu betrachtet, als auch Horneffekte („horntragend“ vs. „als Kalb enthornt“ an Herde-Ob und –Fu gemeinsam, sowie an Herde-Fu einerseits „horntragend“ vs. „als Kalb enthornt“, andererseits „horntragend“ vs „als Kuh enthornt“). Aufgrund der Unterschiedlichkeit der Ho- -Proben von Hof-Fu (als Kalb und als Kuh enthornt), wurde der Horneffekt für beide Bedingungen seperat betrachtet (siehe Tab Tab 122). Im Vergleich der Herden-Ob und –Fu zeigt sich an 10 der 18 Proteine ein Herdereffekt, der im Vergleich zu dem Enthornungs-Effekt sehr dominant ist. Entsprechend ist der mittlere t-Test-wert mit 0.281 viel niedriger als der für den Enthornungseffekt, 0.553 bzw 0.499 (für „als Kalb enthornt“ in beiden Herden bzw in Herde-Ob „als Kalb“ und in Herde-Fu „als Kuh enthornt“). Der Herdeneffekt zeigt er sich am stärksten beim abundanten Fatty acid-binding protein (FABP) und am geringabundanten Butyrophilin (BT1A1). Das höchstabundante Beta-lactoglobulin (LACB) und das geringabundante Beta-2- microglobulin (B2MG) weisen sowohl einen Herdeneffekt, als auch einen Horneffekt auf. LACB nimmt durch Enthornung in Herde-Fu viel deutlicher ab, während B2MG in Herde-Ob stärker abfällt. Ebenso zeigen die geringabundanten Polymeric immunoglobulin receptor (PIGR) und Lactadherin (MFGM) zweierlei Einflüsse. Beide Proteine nehmen durch Enthornung zu. Für MFGM ist der Anstieg bei den als Kuh enthornten Rindern deutlicher, 4- fach gegenüber 2-fach. Bei PIGR sind die Spiegel in den beiden Milchproben der Herde-Ob nur halb so hoch wie in Herde-Fu, während die Enthornung mit einer Verdopplung einhergeht, wobei die Milch der als Kalb enthornten Kühe in Herde-Fu abweicht, indem sie keinen Anstieg zeigt. Galactosyl transferase (B4GT1) und Osteopontin (OSTP) scheinen durch Enthornung vermehrt aufzutreten. Dieser Trend steht jedoch unter Vorbehalt, weil mehrere geschätzte Fehlwerte und Unterschiede in Herde-Fu eingehen und Herde-Da sich gegenläufig verhält. Für das geringabundante Serotransferrin (TRFE) fanden sich nur bei den horntragenden Kühen zuverlässige Messwerte, so dass eine generelle Absenkung bei Hornlosigkeit einzutreten scheint, ohne jedoch Effekte durch Herde und Enthornungszeitpunkt einschätzen zu können. Thematik „Hörner“ – Ergebnisse 273 Fazit: Horneffekte liegen in Herde Ob für sechs der 18 betrachteten Molkenproteine vor. Vier dieser sechs Proteine zeigen sich auch in Herde-Fu sowohl bei den als Kalb, als auch bei den als Kuh enthornten Kühen beeinflußt, während bei den zwei anderen Proteinen nur in jeweils einer der enthornten Subgruppen ein Horneffekt wie in Herde-Ob zu sehen ist. Abb. 35: Hierarchisch geclusterte Heatmap (Person Correlation) der logarithmierten relativen Abweichungen der Abundanzmittelwerte der einzelnen Proteine über 18 Proteine der sieben Proben zum Thema „Hörner“ Thematik „Hörner“ – Ergebnisse 274 Enthornungs-Quotienten Gepaarter T-Test “Horn” Ungepaarter T-Test „Herde“ Relative Abundanzen von 18 Proteinen, Enthornungsquotienten und t-Test für “Horn” und “Hof” Da Ho- genet Da Ho- Kalb Fu Ho+ Fu Ho- Kalb Fu Ho- Kuh Ob Ho+ Ob Ho- Kalb Da Fu - Kalb Fu - Kuh Ob als Kalb enthornt als Kuh enthornt*(Fu / Ob) ALBU (Serum Albumin) 14,10 14,93 14,68 12,98 10,43 12,61 16,09 1,06 0,88 0,71 1,28 0,797 0,894 0,487 ALBU B2MG* (Beta-2-Microglobulin) 4,34 4,29 3,83 1,32 2,65 7,31 1,80 0,99 0,35 0,69 0,25 effect 0,336 effect B2MG* B4GT1* (Beta-1-4-Galactosyl Transferase 1 (Lactose Synthase Subunit)) 1,86 0,54 1,54 1,47 2,00 0,75 1,69 0,29 0,96 1,29 2,00 effect no effect B4GT1* BT1A1 (Butyrophilin) 1,32 2,37 1,14 0,71 1,10 0,38 0,38 1,80 0,62 0,96 1,01 0,510 0,621 0,018 BT1A1 CASK (Kappa-Casein) 6,12 6,05 3,73 6,98 3,79 8,33 4,09 0,99 1,87 1,02 0,49 0,960 0,514 0,579 CASK CO3 (Complement 3) 0,39 0,84 0,45 0,55 0,49 0,38 1,04 2,17 1,22 1,09 2,74 0,377 0,444 0,573 CO3 FABP (Fatty Acid-Binding Protein) 6,58 3,91 3,48 5,51 6,27 1,62 1,64 0,59 1,58 1,80 1,01 0,489 0,492 0,017 FABP GLCM1 (Lactophorin) 19,44 19,22 19,90 28,48 21,26 28,68 28,90 0,99 1,43 1,07 1,01 0,486 0,427 0,208 GLCM1 LACB (Beta-Lactoglobulin) 68,29 59,71 78,47 59,07 55,18 82,73 76,70 0,87 0,75 0,70 0,93 0,365 0,335 0,259 LACB LALBA (Alpha-Lactalbumin (Lactose Synthase Subunit)) 20,53 20,29 21,24 18,17 17,68 17,05 17,18 0,99 0,86 0,83 1,01 0,526 0,531 0,208 LALBA MFGM* (Lactadherin) 1,08 2,99 0,45 0,87 2,28 0,78 1,58 2,75 1,95 5,09 2,02 effect effect no effect MFGM* OSTP* (Osteopontin) 2,79 1,76 2,13 4,26 2,13 1,62 3,71 0,63 2,00 1,00 2,28 effect 0,849 OSTP* PERL (Lactoperoxidase) 2,48 3,68 1,44 0,76 0,77 1,57 1,58 1,48 0,53 0,54 1,01 0,508 0,508 0,157 PERL PIGR (Polymeric Immunoglobulin Receptor) 1,32 2,37 1,69 1,64 2,77 0,87 1,53 1,80 0,97 1,64 1,76 0,537 0,044 0,175 PIGR TRFE* (Serotransferrin) 0,42 0,42 0,85 0,42 0,42 0,92 0,46 1,00 0,50 0,50 0,50 effect effect TRFE* TRFL (Lactotransferrin) 14,25 11,64 21,84 14,84 24,44 14,99 15,10 0,82 0,68 1,12 1,01 0,513 0,457 0,245 TRFL XDH (Xanthine Dehydrogenase) 1,86 1,68 1,59 1,53 1,96 1,35 1,36 0,91 0,96 1,23 1,01 0,615 0,476 0,119 XDH ZA2G (Zinc-Alpha-2-Glycoprotein) 1,55 3,45 2,14 1,25 2,12 2,33 2,34 2,22 0,59 0,99 1,01 0,509 0,903 0,322 ZA2G Tab 122. Mittlere Protein-Abundanzen, Enthornungs-quotienten und t-Test für die Faktoren „Hornstatus“ und „Hof“. Blau-kursiv: imputierte Werte; fett gedruckt: Werte >1,0 (Zunahme für Ho+); dunkelpink hinterlegt: deutliche Effekte; * Werte aus Herde Ob (als Kalb enthornt) und Fu (als Kuh enthornt) Deutliche Effekte sind solche, die einen geringen p-Wert aufweisen, bei gleichzeitig relativ hohem (>2) bzw. niedrigem (<0,75) Enthornungs- Quotienten, wenn bei allen Probenpaaren ähnliche Effekte festzustellen sind. Thematik „Hörner“ – Ergebnisse 275 4.10.6. Metabolomik (MOSLER UND WOHLERS, 2010) Bei der Analyse der GC-TOF-MS-Spektraldaten wurden insgesamt 120 Metabolite gefunden, die in allen sieben Proben der drei Höfe durch relative Quantifizierung verglichen werden konnten (siehe Tabelle im Anhang F). Bei vier Metaboliten wurden niedrige Fehlwerte durch die Hälfte des niedrigsten Wertes im Set geschätzt (markiert mit *). 86 Substanzen konnten beim Abgleich mit der Golm Metabolite Database annotiert werden. Die Proben von Hof 12 (Da) dienen lediglich dem Vergleich mit einer weiteren Herde / Gruppe und haben keinen direkten Bezug zur inhaltlichen Frage der Enthornung. In der PCA über die 120 Metabolite und sieben Proben (Abb. 36:) zeigt sich in der Projektion auf die erste und zweite Hauptkomponente (PC1: 38.4%, PC2: 28:0%) eine sehr ausgeprägte Schräglinksverschiebung der Varianz durch die Enthornung (Fu Ho- Kuh, Ob Ho- Kalb). Demgegenüber projizieren die Milchmetabolite der horntragenden Kühe (Ho+), die der genetisch hornlosen und der als Kalb enthornten von Fu und Da nahe beeinander auf die x-Achse (PC1). Der Unterschied im Metabolitvarianzprofil der als Kalb enthornten Kühe in Herde-Da gegenüber den genetisch hornlosen ist dem durch Enthornung in den Herden –Ob und -Fu unähnlich. In der zweiten Hauptkomponente (y-Achse) zeichnet sich auch ein Herdeneffekt ab, denn die Proben der Herde -Fu liegen im oberen Drittel, die der anderen beiden darunter. Um den Enthornungseffekt und den Einfluss des Enthornungsalters eingehender zu untersuchen, wurden für die Herden –Ob und -Fu zwei t-Tests für die Paarungen "horntragend" und "enthornt" durchgeführt: der eine mit in Herde Fu als Kalb enthornt, der andere als Kuh enthornt. Der Großteil der Metabolite zeigt sich durch den Hornstatus beeinflusst. 61 der Metabolite weisen in einem der beiden t-Tests ein p < 0.2 auf. Die PCA über diese Metabolitgruppe (Abb. 37:) differenziert nun in der zweiten Hauptkomponente (PC2: 28.0% der Gesamtvarianz) deutlich die Herden. Demgegenüber beschreibt die erste Hauptkomponente (PC1: 62.1%) ganz klar den Horneffekt. Die Proben der beiden horntragenden Kühe projizieren ganz nah auf der linken Seite der x-Achse. Rechts davon liegen die noch recht ähnliche Probe der als Kalb enthornten Kühe in Herde-Fu, und weiter rechts die der als Kalb enthornten in Herde-Ob, und schließlich die der als Kuh enthornten aus Herde-Fu. Die gleiche Anordung zeigt sich auch in der geclusterten Heatmap (Abb. 38:) über die relativen Spiegeländerungen in jeder Herde für die 47 annotierten Metabolite mit p < 0.2 im t- Test. Links stehen die beiden Milchproben "horntragend", rechtsaußen die beiden Proben mit starkem Enthornungseffekt, in denen die Hälfte der Metabolite augenfällige Abnahmen (im oberen Teil der Heatmap bzw. Tabelle) und gut ein Viertel ebensolche Zunahmen (unten in der Heatmap bzw. Tabelle) aufweisen. Ebenso wird die Zwischenstellung der Probe der in Herde-Fu als Kalb enthornten Kühe deutlich, die bei vielen Metaboliten denen der horntragenden ähnelt. Besonders auffällig ist der Block mit 11 Metaboliten im oberen Teil, in dem von Pantothenat bis Threonat alle "Horntragenden" gegenüber den "Enthornten" erhöht sind. Bei den links angefügten Proben der Herde-Da gibt es für die 47 ausgewählten Thematik „Hörner“ – Ergebnisse 276 Metabolite zwischen "genetisch hornlos" und "enthornt" auch viele Unterschiede, mitunter jedoch einige von den Herden –Ob und –Fu abweichende Antworten. Der Variationskoeffizient (CV) der Änderungsfaktoren Fu (gelb in Tab 123) ist für Herde-Da mit 44.5% ähnlich groß wie in Herde-Ob (48.7%), während die Änderungen bei den als Kalb enthornten Kühen der Herde-Fu mit 33.1% deutlich geringer sind. Demgegenüber sind sie bei den als Kuh enthornten mit 82.0% viel größer, was sich auch im viel niedrigeren t-Testmittelwert wiederspiegelt, der 0.195 gegenüber 0.284 für als Kalb enthornte Kühe beträgt. Entsprechend finden sich bei den als Kalb enthornten Kühen 23 Metabolite mit einem t-Testwert p < 0.2 gegenüber 35 bei den als Kuh enthornten, davon 11 gemeinsam. Jedoch fällt der t-Testwert im Falle von hinzutretenden Herdeneffekten (neun Metabolite mit p < 0.2) und großen Unterschieden zwischen den eingehenden Datenpaaren schwach aus, obgleich es sich um ausgeprägte Effekte handeln kann. Bei den oberen 23 der 47 Metabolite treten bei Enthornung Abnahmen ein (abweichend: 7 Metabolite bei den als Kalb enthornten Kühen der Herde-Fu), die 70% der Varianz ausmachen. Auffallend ist dieser Abfall in einigen Stoffgruppen. Zum Einen betrifft dies fast alle erfassten Aminosäuren, Serin, 4-Hydroxyprolin, Threonin, Prolin, Lysin und Isoleucin sowie Ornithin. Noch massiver ist der Effekt bei den phosphorylierten Zuckern wie Glukose-6-Phosphat, Galaktose-6-Phosphat und Fruktose-6-Phosphat sowie Phosphoglycerol und dem Derivat Phosphoenolpyruvat. Auch Bausteine der Fettsäuresynthese sind abgesenkt, Pantothenat und Ethanolaminphosphat sowie eines der Hauptprodukt, das Oktadekanoat. Erwähnenswert ist auch die Verminderung von gewissen Disacchariden, hier Maltose und das nicht eindeutig annotierbare Hexosylhexitol 2744.45. Demgegenüber treten Zunahmen hauptsächlich bei Monozuckern und Zuckeralkoholen auf, vorallem Pentosen und Hexosen und Glukosederivaten wie Glukonat, Glukuronat, Aminoglukose und N-Acetylglukosamin. Fazit: Enthornte Kühe zeigen im Vergleich mit horntragenden Kühen in der selben Herde deutliche Änderungen im Spiegel zahlreicher Metabolite, insbesondere bei den Aminosäuren und phosphorylierten Metaboliten. Thematik „Hörner“ – Ergebnisse 277 Enthornungsquotient Gepaarter T-Test “Horn” Ungepaarter T-Test „Herde“ 13C-Sorbitol-standardisierte Intensitäten für 47 annotierte, horn- korrelierte Metabolite (p<0.2) Da Ho- genet Da Ho- Kalb Fu Ho+ Fu Ho- Kalb Fu Ho- Kuh Ob Ho+ Ob Ho- Kalb Da Fu - Kalb Fu – Kuh Ob als Kalb enthornt als Kuh enthornt* ABS PC1 (62.1%) loadings [%] (Fu / Ob) Hexosylhexitol 2744.45 0,447 0,744 0,456 0,559 0,059 0,439 0,067 1,67 1,23 0,13 0,15 0,569 0,026 7,804% 0,293 Maltose 0,906 1,184 0,880 0,952 0,173 0,805 0,219 1,31 1,08 0,20 0,27 0,538 0,070 5,906% 0,753 Creatinine 0,627 0,468 0,642 0,772 0,187 0,454 0,194 0,75 1,20 0,29 0,43 0,635 0,116 4,306% 0,911 Serine 0,330 0,155 0,673 0,371 0,181 0,250 0,178 0,47 0,55 0,27 0,71 0,171 0,339 3,189% 0,773 Octadecanoic acid 0,248 0,755 0,533 0,405 0,199 0,687 0,527 3,04 0,76 0,37 0,77 0,010 0,332 2,774% 0,514 Propane-1-2-diol 3-amino- 1,067 0,951 0,744 0,613 0,260 0,632 0,516 0,89 0,82 0,35 0,82 0,013 0,379 2,802% 0,053 Glycerophosphoglycerol 0,263 0,279 0,841 0,719 0,273 0,325 0,262 1,06 0,86 0,32 0,80 0,103 0,378 2,818% 0,148 Phosphoenolpyruvic acid 0,161 0,202 0,335 0,287 0,090 0,141 0,127 1,25 0,86 0,27 0,90 0,131 0,451 3,163% 0,039 Galactonic acid 0,393 0,488 0,380 0,440 0,239 0,449 0,302 1,24 1,16 0,63 0,67 0,728 0,049 1,840% 0,597 Proline 4-hydroxy- 0,424 0,203 0,378 0,413 0,210 0,261 0,154 0,48 1,09 0,56 0,59 0,605 0,031 2,158% 0,314 Ornithine* 1,388 0,990 0,810 0,843 0,405 1,263 0,835 0,71 1,04 0,50 0,66 0,562 effect 2,463% 0,342 Glycerol-3-phosphate 0,239 0,150 0,362 0,450 0,160 0,244 0,122 0,63 1,24 0,44 0,50 0,696 0,052 3,023% 0,127 Pantothenic acid 0,623 0,656 0,895 0,763 0,338 1,103 0,546 1,05 0,85 0,38 0,50 0,357 0,102 3,378% 0,265 Fructose-6-phosphate* 0,410 0,324 0,472 0,344 0,172 0,543 0,257 0,79 0,73 0,36 0,47 0,244 effect 3,418% 0,280 Threonine 0,424 0,323 0,577 0,398 0,289 0,349 0,163 0,76 0,69 0,50 0,47 0,212 0,032 2,424% 0,133 Galactose-6-phosphate* 0,513 0,257 0,414 0,207 0,207 0,556 0,228 0,50 0,50 0,50 0,41 effect effect 2,625% Proline 0,200 0,172 0,438 0,191 0,149 0,331 0,186 0,86 0,44 0,34 0,56 0,113 0,187 2,954% 0,680 Ethanolaminephosphate 0,176 0,133 0,478 0,230 0,145 0,345 0,139 0,75 0,48 0,30 0,40 0,069 0,084 3,734% 0,567 Glucose-6-phosphate 0,304 0,214 0,360 0,204 0,112 0,454 0,130 0,71 0,57 0,31 0,29 0,230 0,023 4,368% 0,516 Lysine 1,088 0,948 0,919 0,630 0,525 1,193 0,756 0,87 0,69 0,57 0,63 0,060 0,065 1,885% 0,246 Isoleucine 0,634 0,315 0,965 0,647 0,613 0,540 0,411 0,50 0,67 0,63 0,76 0,117 0,155 1,132% 0,629 Citric acid 2-methyl- 1,631 1,013 1,747 1,284 1,251 1,482 1,121 0,62 0,74 0,72 0,76 0,031 0,057 0,999% 0,197 Threonic acid 0,105 1,638 0,092 0,062 0,074 0,117 0,077 (15.54) 0,68 0,81 0,66 0,026 0,207 0,923% 0,301 Maltotriose 1,075 1,383 1,229 1,033 1,295 1,160 0,949 1,29 0,84 1,05 0,82 0,045 0,662 0,015% 0,320 Hexositol 1850.19 1,084 0,987 1,273 1,102 1,083 1,121 0,942 0,91 0,87 0,85 0,84 0,061 0,024 0,526% 0,388 Vanillic acid 1,246 0,894 1,057 0,951 0,934 0,791 0,645 0,72 0,90 0,88 0,82 0,195 0,152 0,447% 0,873 Gluconic acid 0,302 0,296 0,333 0,324 0,265 0,352 0,283 0,98 0,97 0,79 0,80 0,413 0,018 0,874% 0,818 Glycine 2,070 0,829 0,617 0,613 0,512 0,828 0,749 0,40 0,99 0,83 0,90 0,456 0,186 0,686% 0,813 Hexadecanoic acid 0,376 0,348 0,411 0,390 0,314 0,315 0,485 0,92 0,95 0,76 1,54 0,123 0,858 0,018% 0,246 Thematik „Hörner“ – Ergebnisse 278 Hexosylhexitol 2947.05 0,519 0,587 0,802 0,923 0,709 1,080 1,367 1,13 1,15 0,88 1,27 0,158 0,808 0,165% 0,792 Glucuronic acid 0,608 0,680 0,589 0,755 0,614 0,431 0,563 1,12 1,28 1,04 1,31 0,024 0,402 0,398% 0,270 Glucoheptose 0,596 0,572 0,626 0,813 0,680 0,812 0,951 0,96 1,30 1,09 1,17 0,153 0,193 0,197% 0,970 Gluconic acid-1-4-lactone 0,549 1,006 0,330 0,528 0,455 0,491 0,751 1,83 1,60 1,38 1,53 0,033 0,087 1,004% 0,518 Fructose 0,835 0,920 0,980 0,891 1,129 1,016 1,122 1,10 0,91 1,15 1,11 0,986 0,107 0,540% 0,814 Galactose 1,488 1,516 1,551 1,615 2,088 1,323 1,574 1,02 1,04 1,35 1,19 0,355 0,163 1,009% 0,574 Sorbitol 0,925 0,941 0,859 0,858 1,131 0,845 1,106 1,02 1,00 1,32 1,31 0,500 0,008 1,065% 0,054 Glucose 1,828 1,770 1,823 1,777 2,331 1,382 1,865 0,97 0,98 1,28 1,35 0,553 0,063 1,116% 0,748 Lyxose 0,827 0,887 0,894 1,033 1,439 0,651 0,885 1,07 1,16 1,61 1,36 0,221 0,135 1,623% 0,144 Glucose 2-amino-2-deoxy- 0,788 0,892 0,801 0,930 1,238 0,730 1,036 1,13 1,16 1,55 1,42 0,244 0,068 1,514% 0,454 Xylose 0,773 0,772 0,925 1,078 1,380 0,600 0,841 1,00 1,16 1,49 1,40 0,230 0,053 1,497% 0,295 Glucosamine N-acetyl- 0,765 1,001 1,100 1,278 1,398 0,849 1,287 1,31 1,16 1,27 1,52 0,280 0,167 1,148% 0,689 Glucuronic acid-3-6-lactone 1,552 1,301 0,980 1,110 1,611 0,632 1,288 0,84 1,13 1,64 2,04 0,390 0,112 2,260% 0,537 Mannose 1,530 1,512 0,955 1,034 1,434 1,040 1,833 0,99 1,08 1,50 1,76 0,412 0,104 1,721% 0,151 Glucose 2-deoxy- 0,579 0,444 0,291 0,254 0,409 0,349 0,639 0,77 0,87 1,40 1,83 0,641 0,174 1,702% 0,805 Erythritol 1,230 0,832 0,818 0,949 2,432 1,001 1,207 0,68 1,16 2,97 1,21 0,073 0,392 2,888% 0,639 Malic acid 2-methyl- 0,266 0,165 0,381 0,556 1,179 0,247 0,445 0,62 1,46 3,10 1,80 0,135 0,195 3,561% 0,441 Triethanolamine 0,128 0,074 0,181 0,431 0,759 0,098 0,157 0,58 2,38 4,20 1,60 0,184 0,299 3,938% 0,591 Tab 123. Metabolitwerte (13C-normalisiert) der sieben Proben zum Thema „Horn“, Zunahmefaktoren, t-Test und PC1-loadings über die Metabolite, die für Herde-Ob oder –Fu im T-Test signifikant (p<0,2) unterschiedliche Konzentrationen von Metaboliten im Zusammenhang mit dem Faktor „Horn“ aufweisen. Rosa markiert: auffällige Effekte, gelb markiert: gegenläufige Intensitäten. Reihenfolge entsprechend der Heatmap. Thematik „Hörner“ – Ergebnisse 279 Abb. 36: PCA über 120 annotierte Metabolite der 7 Proben zur Thematik „Hörner“. Rot umrandet: die Ho+-Proben (horntragend), je Hof eine Farbe. Abb. 37: PCA über 61 annotierte und horn-korrelierte (p<0,2) Metabolite von 5 Proben zur Thematik „Hörner“. Rot umrandet: die Ho+-Proben (horntragend). Links: PC1 vs. PC2, rechts: PC1 vs. PC3 Thematik „Hörner“ – Ergebnisse 280 Abb. 38: Heatmap über 47 Metabolite, die einen Zusammenhang zum Faktor „Horn“ aufweisen. Log2-transformierte, mittelwertnormalisierte Werte (je Herde an gemeinsamen Mittelwert angeglichen, so dass Hörnereffekte deutlich werden), geclustert (euklidische Distanz). Thematik „Hörner“ – Ergebnisse 281 4.10.7. FAS-Untersuchungen Die Messgröße MW10/R40gr zeigt für die mehrfach untersuchten Proben von den 10 Betrieben einen geringen Effekt dahingehend, dass die Eh-Proben einen etwas höheren Wert aufweisen als die H-Proben. Signifikant wird das Ergebnis, wenn die Messwiederholungen und nicht nur die Mittelwerte je Probe beim Vergleich berücksichtigt werden (siehe Abb. unten). Ähnliches ergibt sich für den Wert Chi EH12r (Abb. unten). Wird jedoch der entsprechende Meßwert je Hof betrachtet, so fällt auf, dass MW10/R40gr bei 5 Höfen in die eine Richtung verändert ist – und bei 4 Höfen genau entgegengesetzt. Jedoch zeigen sich deutliche Hof-Effekt. Anders der Meßwert Chi Eh12r, der kaum Hof-Unterschiede aufzeigt, eine große Streuung hat, aber doch in 9 von 10 Fällen einen gleichgerichteten Effekt für den Faktor „Horn“ aufweist. Bei Berücksichtigung der Faktoren Hof, Horn und Messtag ergibt sich folgendes Modell: Horn Hof Messtag MW10/R40gr 0,33 <0,0001 0,002 Chi Eh12r 0,0097 0,0246 0,5340 Tab 124. Signifikanzniveau der Meßwerte MW10/R40gr und Chi EH12r bei Berücksichtigung der drei Faktoren Horn, Hof und Meßtag im Modell Eine ausführlichere Beschreibung zu einem Teil der Ergebnisse findet sich im Anhang E, „Ergebnisbericht zur FAS-Untersuchung, KWALIS“. Diese wurden durch eigene Auswertungen ergänzt. Fazit: Der Meßwert MW10/R40gr kann den Faktor „Horn“ je Hof nicht differenzierend wiedergeben – der Meßwert Chi EH12r scheint dazu eher geeignet zu sein. Abb. 39: Die Messgröße Mw10/R40gr für die Varianten enthornt und horntragend, Vergleichsproben von 10 Höfen, z.T. doppelt beprobt. Thematik „Hörner“ – Ergebnisse 282 Abb. 40: Messwiederholungen der Messgröße Mw10/R40gr (links) und Chi Eh12r (rechts) für die Varianten enthornt und horntragend. Abb. 41: Meßwert „MW10/R40gr“ und „Chi Eh12r“ für die zwei Varianten Horn vs. Enthornt je Hof. Boxplot und Mittelwertvergleich je Hof. Thematik „Hörner“ – Ergebnisse 283 Nachträglich enthornt: An den Daten von Hof 2 wurde nach Horn-Effekten gesucht, die die drei Gruppen 1=Eh, 2=H, 3=nachträglich enthornt differenzieren bzw. die Ähnlichkeit von 1 und 3 wiedergeben. Für eine geringe Anzahl von Meßwerten zeigen sich Effekte, die den Erwartungen gemäß für die beiden enthornt-Varianten ähnliche Meßwerte zeigen, für die horntragende Variante jedoch davon unterschiedliche. Diese sind MW1hr, MW1dr, MW10ge, MW10 gr, MW10hrDbl und MW10/R40r (siehe auch Abb. unten). Auch Chi Eh12r gibt den Horn-Effekt wieder. Es zeigt sich in vielen Meßwerten eine „Reihung“ der Proben wie für den Meßwert MW10/R40gr: die Probe der Gruppe 1 (als Kalb enthornt) oder Gruppe 3 (als Kuh enthornt) bilden Extreme, die Werte der Horn-Gruppe liegen meistens im mittleren Skalenbereich. Fazit: Horneffekte sind gering, in den meisten Meßwerten werden sie widerlegt. 90 100 110 120 130 140 150 M w 1 h r e h h n a ch tr ä g lc h e n th o rn t 20 22 24 26 28 30 32 34 M w 1 0 h r e h h n a ch tr ä g lc h e n th o rn t Abb. 42: Einfaktorielle Analyse für MW1hr und MW1dr nach Hornstatus sowie Klassenbildung (Student’s t-Test) (Datengrundlage: 2 PrN, je mehrere Meßwiederholungen). 4 5 6 M w 1 0 /R 4 0 gr e h h n a ch tr ä g lc h e n th o rn t Besonderheit Jedes Paar Student-t 0,05 Abb. 43: Einfaktorielle Analyse von Mw10/R40gr nach Hornstatus, sowie Klassenbildung (Student’s t-Test). (Datengrundlage: 2 PrN, je mehrere Meßwiederholungen) Thematik „Hörner“ – Ergebnisse 284 4.10.8. Steigbilder Von allen Höfen wurden je PrN-Termin die Bilder gruppiert und beschrieben, und eine Zuordnung bei wiederholter PrN vorgenommen. Die einzelnen Ergebniss sind im Anhang (Teil C, Thematik „Hörner“: Steigbild-Ergebnisse der einzelnen Höfe) aufgeführt. In der Tabelle auf der nächsten Seite wurden die Ergebnisse nochmals zusammengefasst. Die Beurteilung erfolgte vorrangig aufgrund von Bildmerkmalen der Schalenzone. Die Tabelle gibt wieder, ob die Gruppierung, die Zuordnung bei wiederholter PrN und die Klassifizierung korrekt sind (grün markiert) oder falsch (rot markiert). Rote Zahlen weisen auf eine falsche Gruppierung hin – eine Zuordnung oder Klassifizierung ist daraufhin ungültig und wird mit „nicht bestimmbar“ (n.b.) angegeben. Sind Proben bei wiederholter PrN richtig einander zugeordnet, sind die Proben-Zahlen farblich einheitlich je Hof markiert bzw. nicht markiert. In dieser Übersicht wird deutlich, dass bei alleiniger Berücksichtigung der SZ- Merkmale eine Gruppierung der Proben von Hof 1 bis 11 bei 31 von 34 vorgenommenen Gruppierungen korrekt war, und bei 3 Gruppierungen fehlerhaft (d.h. 91% korrekt gruppiert). Dabei ist zu berücksichtigen, dass meistens zwei Proben je PrN gruppiert wurden. Bei Hof 12 waren die vier Gruppen je PrN korrekt gruppierbar. Aufgrund der mehr als zweifachen Anfertigung von Bildern je Probe bei Hof 1 (3. PrN) und Hof 8 (alle PrN) sowie der vier voneinander zu unterscheidenden Gruppen bei Hof 12 ist es möglich, mit Hilfe von Kontingenztabellen und des Fisher’s exakten Test die Signifikanz der Unterschiedlichkeit zu bestimmen. Es war in diesen Fällen eine signifikante Unterscheidung der Proben möglich (p<0,05). Eine Zuordnung der Bilder zueinander bei wiederholter PrN ist in einigen Fällen möglich. Insgesamt (ohne die Proben von Hof 12) konnten 14 Bildpaare korrekt einer vorhergehenden PrN zugeordnet werden, bei 4 Bildpaaren war das nicht möglich, 4 waren nicht beurteilbar (nicht gruppierbar). Insgesamt waren somit 78% der vorgenommenen Zuordnungen korrekt. Bei Hof 12 mit vier Gruppen waren die Zuordnungen nur vereinzelt korrekt. Die Klassifizierung der Bilder zum Hornstatus „Horntragend vs. Enthornt“ war unter alleiniger Berücksichtigung der SZ-Merkmale eher zufällig verteilt – bei 39% der Auswertungen konnte eine korrekte Klassifizierung vorgenommen werden. Die Bilder von Hof 12 zur Thematik „genetisch hornlos“ wurden aufgrund mangelnden Referenzmaterials nicht klassifiziert. Fazit Die Steigbilder zur Thematik „Hörner“ (34 Probenpaare „Horn vs. Enthornt“ von 11 Höfen, im gepaarten Design) waren a. in 91% der Fälle korrekt gruppierbar b. in 78% der Fälle den Bildern einer vorhergehenden PrN zuzuordnen (14 von 18 Fälle) c. in 39% der Fälle korrekt klassifiziert (12 von 31 Fälle). Thematik „Hörner“ – Ergebnisse 285 Gruppierung und Zuordnung / Klassifizierung nach SZ korrekte Datum Bilder- erstellung Gruppe 1 Gruppe 2 Grup- pierun Zuord nung * Klassi fiz. Hof 1 These nach SZ vermutlich Enthornt vermutlich Horntragend 5.8.08 3581 + 3582 3580 + 3583 1 1 12.8.08 3613+3614 3611+3612 1 1 1 19.8.08 3592+3594+3597+3599 3591+3593+3596+3598 1 0 0 Hof 2 These nach SZ Enthornt Horntragend 12.6.08 3673 + 3675 3671 + 3674 1 0 18.6.08 3679 + 3682 3683 + 3681 1 0 1 25.6.08 3687 + 3691 3689 + 3686 1 0 0 Hof 3 These nach SZ Enthornt Horntragend 8.8.07 3196 + 3198 3195 + 3197 1 0 16.8.07 3209 + 3204 3202 + 3206 1 1 0 23.8.07 3851 + 3854 3853 + 3850 1 1 0 30.8.07 3220 + 3218 3214 + 3217 1 1 0 Hof 4 2007 These nach SZ Enthornt Horntragend 23.8.07 3036 + 3038 3037 + 3039 1 0 30.8.07 3023 + 3019 3020 + 3022 1 1 0 6.9.07 3171+3169 3176+3170 1 1 0 Hof 4 2008 12.8.08 3223+3224 3226+3221 1 - 0 These Enthornt Horntragend Hof 5 These nach SZ Enthornt Horntragend 21.5. „normal“ 3744 +3745 3743 + 3742 0 n.b. n.b. 25.5. „normal“ 3739 +3736 3737 +3738 1 0 3.6. – „normal“ 3775 + 3776 3777 + 3774 1 1 0 Hof 6 These nach SZ Enthornt Horntragend 25.9.08 2612 + 2617 2615 + 2619 1 1 1.10.08 2728 + 2729 2727 + 2726 1 1 1 6.10.08 563 + 801 711 + 505 1 1 1 Hof 7 These nach SZ Enthornt Horntragend 5.7.08 3521 + 3523 3522 + 3520 1 0 14.7.08 3527 + 3528 3529 + 3526 1 0 1 21.7.08 3535 + 3533 3534 + 3532 1 1 1 Hof 8 Enthornt Horntragend 5.7.08 3552+3553 3550+3551 3554+3557 3555+3556 1 0 12.7.08 3565+3563 3564+ 560 3561+3562 1 1 0 21.7.08 3572+3575 3571+3568 3569+3574 3570+3573 1 1 0 Thematik „Hörner“ – Ergebnisse 286 Hof 9 These nach SZ Enthornt Horntragend (milch- untypische Bilder) 11.6.08 3887 + 3888 3886 + 3889 1 0 18.6.08 3895 + 3892 3894 + 3893 0 n.b. n.b. 25.6.08 3880 + 3882 3881 + 3883 1 n.b. 0 Hof 10 These nach SZ Enthornt Horntragend 25.9.08 --- --- 1.10.08 E,F C,D 1 1 8.10.08 2847 + 2851 2850 + 2852 1 1 1 Hof 11 These SZ + FZ Enthornt Horntragend 3.6.08 3769 + 3771 3768 + 3770 1 1 11.6.08 3700 + 3701 3702 + 3703 1 1 1 18.6.08 3706 + 3708 3707 + 3709 0 n.b. n.b. Hof 12 („Genetisch hornlos“) 5.7.08: 3108 + 3113 3111+3107 3109+3110 3112+3106 1 14.7. 21.7. B B D D C (14.7.) A(21.7.) A (14.7.) C (21.7.) 1 1 Decodierung 1. / 2. / 3. PrN M Eh M HL HL HL T T Eh Eh M T (Eh = Enthornt, HL = Hornlos, M=enthornte Mütter, T=hornlose Töchter) Tab 125. Gruppierung und Klassifizierung der Steigbilder zur Thematik „Horn“ * = Zuordnung zu Bildern der vorhergehenden PrN grün makierte Probennummer = korrekt klassifiziert, rot = falsch klassifiziert bau = korrekt zugeordnet (bei Hof 12) nicht markierte Probennummer: Gruppierung falsch. Korrekte Zuordnung ist daran zu erkennen, dass gleiche Farben (rot bzw. grün) untereinander liegen. Thematik „Hörner“ – Diskussion 287 4.11. Diskussion zur Thematik „Hörner“ 4.11.1. Datenstruktur Es war bei der Auswahl der Proben nicht einfach, vergleichbare Gruppen je Hof zusammenzustellen. Um überhaupt eine gewissen Anzahl von Höfen zu erreichen, und nicht nur mit Fallbeispielen zu arbeiten, wurden einige Kompromisse eingegangen – so z.B. die Höfe 10 und 8, bei denen die Gruppe der enthornten Kühe deutlich älter ist als die der horntragenden (und gleichzeitig ein Milchleistungseffekt besteht). Interessant ist, dass die Gruppen dieser Höfe keineswegs mit besonders unterschiedlichen Ergebnissen auffallen, bzw. dass es bei Höfen mit gleichalten Gruppen ähnliche Effekte gibt. Deswegen wurden diese Höfe nicht von den weiteren Auswertungen ausgeschlossen. Weiterhin muß berücksichtigt werden, dass die Euter- / Tiergesundheit nicht jedesmal von allen Tieren erfaßt wurde. Aufgrund der schwankenden Zellzahlen in den Poolproben ist anzunehmen, dass vereinzelt euterkranke Tiere (hohe Zellzahl) beim Melken nicht identifiziert wurden und somit in der Poolprobe enthalten sind. Auch die Futteraufnahme wurde nicht kontrolliert – am Freßgitter ist davon auszugehen, dass ranghöhere Kühe besseren Zugang zum Futter haben. Da die Proben aber aus vorrangiger Weidegangzeit stammen kann angenommen werden, dass ein ähnlicher Zugang zum Futter vorlag, unabhängig von der Rangfolge. Außerdem ist der Hornfaktor vom Rang nicht vollständig abhängig – die alten enthornten Kühe haben oft höhere Ränge als die jungen (horntragenden). Ein ganz bedeutender Faktor in dem Probensatz ist die Jahreszeit, in der die Proben genommen wurden. Es wurde der Weidegang als „optimal“ gewählt, weil weniger Streß in der Herde vermutet wurde. Andere Untersuchungen11 jedoch zeigten, dass gerade unter Streßbedingungen Effekte deutlicher werden – insofern wäre zu prüfen, ob die geringen Effekte der Hörner bei Weidegang vielleicht im Winterhalbjahr unter Stallbedingungen deutlicher werden. 4.11.2. Milchleistung, Fett-, Eiweiß- und Lactose-Gehalt Die Ergebnisse zeigen, dass die Hörner keinen signifikanten Einfluß auf die Milchinhaltsstoffe bzw. die Milchleistung haben. Jedoch zeigt sich eine Tendenz (p=0,51) bei der Milchleistung: die enthornten Kühe geben geringfügig mehr Milch als die horntragenden Kühe. Weil aber der Alterseffekt auf die Milchleistung viel deutlicher ist (p=0,008) und bei 50% der Probenpaare die enthornten Kühe älter waren als die horntragenden, muß hier von einem systematischen Fehler ausgegangen werden, der sich in den Daten zeigt. Im 11 Bei den Bildschaffenden Methoden werden gezielt Stressprozeduren angewendet, um die Stress-Stabilität bzw. -Sensibilität zu ermitteln – Probenunterscheide werden dabei meistens deutlicher. Thematik „Hörner“ – Diskussion 288 Einzelbetriebsvergleich (Abb. 31:, Tab 118) sind diese Leistungsunterschiede bei vergleichbarem Alter der Tiere nicht mehr auffällig oder häufig sogar gegenteilig. Einzig bei Hof 8 ist der Alterseffekt gegenteilig: die Eh-Kühe sind schon so alt (8. Laktation), dass die Laktationsleistung wieder abnimmt (BERNARD et al. 1992) – der Leistungshöhepunkt (ca. 4. Laktation) ist deutlich überschritten. 4.11.3. Gärprobe Weil die Werte der Probenwiederholungen stark korrelieren kann davon ausgegangen werden, dass sie den gleichen Aussagewert besitzen. Deshalb wird bei der Regressionsanalyse nur jeweils eine Probenwiederholung verwendet. Das Ergebnis der Regressionsanalyse ist leicht nachzuvollziehen - wie aus der Methode heraus zu erwarten ist, hat eine unterschiedliche Dauer der Säuerungszeit (Gärdauer) einen Effekt auf den pH-Wert. Außderdem ist es naheliegend, dass je nach mikrobieller Besiedelung der Proben (hofspezifisch) die Säuerungseigenschaften der Proben ausfallen. Dass diese von der einen zur nächten PrN unterschiedlich ausfallen können ist klar. Es muß jedoch bei dieser Auswertung bedacht werden, dass die PrN (d.h. die Zeitpunkte der PrN) in gewissem Rahmen mit den Betrieben einen Zusammenhang aufweisen. Die Vermutung, dass die Betriebe mit den Zeit-Effekten korrelieren, läßt sich dadurch wiederlegen, dass sich die pH-Werte je Betrieb über die drei PrN deutlich unterscheiden, aber auch dass sich der pH-Wert von zwei Höfen an einem Zeitpunkt deutlich unterscheiden – und zwar deutlich mehr unterscheiden als die zwei genommen Proben je Hof (mit dem Faktor „Horn“ als Unterscheidungsmerkmal). Das soll als Beleg gedeutet werden, dass sowohl der Hof, als auch die einzelne Probennahme (KW) ihren Einfluß auf das Ergebnis haben. Der Faktor „Horn“ erscheint absolut irrelevant, da er ohne Effekt aus dem Modell entfernt werden kann. 4.11.4. Fettsäuremuster Der in allen Fettsäuren offensichtliche Betriebseffekt ist damit zu erklären, dass die Betriebe in sehr unterschiedlichen Regionen Deutschlands angesiedelt sind und somit die Futtergrundlage unterschiedlich ist. Außerdem ist der Wirtschaftsstil unterschiedlich intensiv. Der Effekt „extensiv, Bergregion“ v.s „intensiv, Ackerbauregion“ wird deutlich (s.a. z.B. COLLOMB et al. 2002a + b). Horn-spezifische Effekte sind vereinzelt zu finden. Die bei den Höfen Hof 10 und Hof 5 auftretenden Effekte könnten auch mit dem Alterseffekt in Zusammenhang gebracht werden – jedoch weist der Hof 1 ähnlich deutliche Unterschiede in den Proben auf, die Kühe sind jedoch im Alter gleich. Die Milchleistung ist nur bei Hof 10 unterschiedlich, bei Hof 1 und Hof 5 vergleichbar. Somit ist der Effekt „Alter“ oder „Milchleistung“ nicht konsistent zu finden. Im Vergleich mit den Ergebnissen zu KELSEY et al. (2003), der tierindividuelle Effekte untersuchte, lässt sich festhalten, dass die C-18:1 tr10 in seinen Untersuchungen zu 18,3% Thematik „Hörner“ – Diskussion 289 tierindividuell beeinflusst ist, die C-6 zu 17%, und die C-10 sogar zu 24%, die C-12 zu 28,8%. Zu den anderen hier hornspezifisch auftretenden Fettsäuren werden keine Angaben gemacht. Insofern ist ein großer Teil der Fettsäuremuster-Einflüsse auf tier-individueller Seite – jedoch nicht alters- oder laktationsstadiums- oder milchleistungs-abhängig (KELSEY et al. 2003). Dieser tierindividuelle Effekt lässt sich vom Faktor „Horn“ niemals trennen – jedoch wäre zu erwarten, dass er sich zufällig verteilt, und nicht unbedingt gleichzeitig mit dem Faktor „Horn“ auftritt. Neben den oben genannten Fettsäuren ist auffällig, dass die C-15aiso und C-17aiso für die Proben horntragender Kühe bei den genannten drei Höfen erhöht sind – was auf eine unterschiedliche Verzweigungscharakteristik der Proben abhängig vom Hornstatus deuten kann. Es kann somit festgehalten werden, dass auf drei von 11 Höfen (Hof 10, Hof 1 und Hof 5) ein gleichgerichteter, wahrnehmbarer Effekt vorhanden ist, dass er auf einem der 11 Betriebe gegenläufig ist, und dass bei den anderen 8 Betrieben die Effekte geringer bis nicht wahrnehmbar sind. Bei alleinigem Bezug auf den Betrieb Hof 2, bei dem die Gruppenzusammenstellung (Vergleich Horn – als Kalb enthornt) hinsichtlich der Herkunft der Tiere, Alter, Laktationsstadium usw. vorbildhaft vergleichbar ist, müsste konstatiert werden, dass keine Effekte vorliegen. Die Vermutung von LEIBER (2008, sowie 2009 mdl.), dass bei Milch von horntragenden Kühen weniger dehydrierte Fettsäuren vorliegen könnten (erhöhte ALA- (=C- 18:3-9c,12c,15c-alpha) oder Omega-3-Werte), kann mit den vorliegenden Daten nicht bestätigt werden. 4.11.5. Proteomik (MOSLER UND WOHLERS, 2010) Beim Vergleich der Molkenproteinprofile der sieben Proben von insgesamt drei Höfen zeigte sich ein deutlicher Herdeneffekt, aber ebenfalls ein bemerkbarer Horn-Effekt. Am augenfälligsten (hinsichtlich den t-Test-Werten und dem PCA-Plot) ist der Herdeneffekt, der sich vermutlich v.a. mit den zwei Faktoren „Rasse / geographische Lage“ und „Wirtschaftsstil / Intensität“ erklären läßt: Herde-Ob (Demeter, Bayern/Cheimgau, s.a. „UnserLand“ 2009) und Herde-Da (Biokreis, Bayern/Chiemgau) sind Fleckvieh (Doppelnutzung, wobei die genetische Hornlosigkeit per Besamung von Fleisch-Fleckvieh eingekreuzt wurde); Herde–Fu (Bioland, Südniedersachsen) sind Schwarzbunte (HF, Milchtyp). Die Herde-Ob ist die am extensivsten gefütterte. Im PCA-Plot kann die PC2 (y-Achse) die Rassen / geographischen Lagen unterscheiden, und die PC1 (x-Achse) die Fütterungs-Intensität wiedergeben (Herde-Ob am extensvisten), oder aber den Stoffwechselzustand: die Herde-Da hatte sehr dünnen Mist, während die anderen beiden festeren Mist hatten. Der Effekt der Enthornung, der ähnlich stark ist wie der Hof-Effekt, wirkt sich in den Herden-Ob und -Fu deutlich aus und ist in der PCA als eine gleichzeitige „Niveau- Thematik „Hörner“ – Diskussion 290 Steigerung“ für die PC1 und PC2 zu erkennen. Insbesondere das Serumtransferrin (TRFE) könnte als „Horn-Marker“ bezeichnet werden, da es bei den Proben der hornlosen / enthornten Proben nicht meßbar ist. Der Enthornungszeitpunkt ist ebenfalls von Bedeutung, wenn auch nur geringfügig. Unter dem Vorbehalt, dass es sich zwar um Poolproben, aber doch nur um einzelne Proben für eine jeweilige Bedingungskombination handelte, deutet sich für die betrachteten Molkenproteine an, dass Milchkühe sich umso besser an die Enthornung anpassen, je früher die Enthornung stattfindet. Dabei scheint jedoch die Herden-Bedingung eine große Rolle zu spielen. In der „Bioland“-Herde-Fu ist das Molkenproteinprofil der als Kalb enthornten Kühe dem der horntragenden viel ähnlicher, als in der „Demeter“-Herde-Ob, in der sich die Kälberenthornung fast genauso stark auswirkt wie die Kuhenthornung in Herde-Fu. Die genetische Hornlosigkeit in Herde-Da zeigt einen gewissen Bezug zu den Horn- Proben – das Proteinmuster der enthornten Kühe von Herde-Da unterscheidet sich davon gleichgerichtet wie auf den anderen beiden Höfen von den Horn-Proben, wenn auch bei weniger Proteinen - Die „natürlichsten“ Bedingungen je Hof (Ho+ bzw. genetisch hornlos als „natürlicher“ als enthornt) sind hinsichtlich der PC1 weiter rechts positioniert. Inhaltliche Interpretation In allen Milchproben enthornter Kühe fällt der Abfall des höchstabundanten Beta- lactoglobulin (LACB) auf. Jedoch liegt angesichts der funktionellen Vielfalt von LACB keine systemphysiologische Deutung nahe. (LACB als ein Lieferant von Aminosäuren, als Quelle bioaktiver Peptide im Bereich Differenzierung und Immunsystem sowie als Vehikel für eher fettlösliche Biomoleküle). Demgegenüber darf durch den Anstieg von Polymeric immunoglobulin receptor (PIGR) und Lactadherin (MFGM) durch Enthornung vermutet werden, dass ein Teil der Schutzfaktoren für die heranwachsenden Kälber höher dosiert wird. MFGM, dem unter anderem antivirale Eigenschaften zugeschrieben wird, erfüllt im Muzinkomplex Schutzfunktionen, während PIGR die im Lumen des Verdauungstraktes agierenden Antikörper der Klasse IgA transportiert. Im Zusammenhang mit der PIGR- Erhöhung könnte in den Herden-Ob und -Fu auch die Abnahme von Beta-2-microglobulin (B2MG) durch Enthornung stehen, das unter anderem als Transporter für die eher in der Darmwand agierenden Antikörper der Klasse IgG fungiert. Die Lactosebildung könnte durch die Enthornung beeinflußt werden (erhöhte Werte für Galactosyl transferase (B4GT1)), oder auch die Knochenbildung (Osteopontin (OSTP) erhöht bei enthornt). Dieser Trend steht jedoch unter Vorbehalt, weil mehrere geschätzte Fehlwerte und Unterschiede in Herde-Fu eingehen. Dass Herde-Da sich gegenläufig verhält kann eher als Bestätigung des Horn-Faktors gesehen werden. Im Lactosegehalt der Milchproben findet sich für die B4GT1-Werte aber keine Bestätigung. Für das geringabundante Serotransferrin (TRFE), das mit dem Metallionentransport in Verbindung gebracht werden kann, fanden sich nur bei den horntragenden Kühen zuverlässige Messwerte, so dass eine generelle Absenkung bei Hornlosigkeit einzutreten scheint. Thematik „Hörner“ – Diskussion 291 Aus diesen Beobachtungen muß gefolgert werden, dass es im Proteinmuster Effekte zu geben scheint, die sich mit dem Faktor „Horn“ in Verbindung bringen lassen – zumindest bei diesen Proben, was Anlaß für weitere Untersuchungen in diese Richtung sein sollte. 4.11.6. Metabolomik (MOSLER UND WOHLERS, 2010) Bei der Betrachtung der Metabolomikergebnissen müssen zwei Aspekte vergegenwärtigt werden. Zum Einen ermöglicht es die Analyse einphasiger Extrakte mittels GC-TOF-MS zwar, physikochemisch verschiedene Stoffgruppen in einem Messgang zu erfassen, aber auch nur jeweils einige auftrennbare Substanzen und auch nur die im Datenbankabgleich annotierbaren, also eben nur einen Teil der wahrscheinlich über 1000 Milchmetabolite. Alle drei Milchproben aus Herde -Fu unterscheiden sich von Herde -Ob und -Da. Als Ursachen dafür kommen neben der Genetik (HF, Schwarzbunt, während die anderen beiden Fleckvieh sind) v.a. der andere Standort (Südniedersachsen) in Betracht, die Ähnlichkeit mit Herde-Ob könnte mit der Fütterung einhergehen (strukturreiches, ausgereiftes Grundfutter). Hinzu kommt, dass die Milchproben von Herde -Fu im Juni genommen wurden, während die in Herde-Ob und -Da im Hochsommer erhoben wurden. Es zeigt sich in den Herde -Ob und -Fu in den metabolomischen Daten ein großer und ähnlicher Enthornungseffektes für die als Kalb in Herde -Ob enthornten Kühen und die als Kuh enthornten in Herde -Fu. Der enorm große Effekt der Probe Fu-Ho--Kuh könnte im Abgleich mit den anderen Ergebnissen im Zusammenhang mit einer (schwachen) Euterentzündung stehen: leicht erhöhte Zellzahlen (166) und vermehrt Lactose (0,1%). Insofern ist der Vergleich der Proben von Hof-Fu von „Horn“ mit „als Kalb enthornt“ angemessen, die Probe „als Kuh enthornt“ scheint noch weiteren Effekten zu unterliegen – evtl. geht aufgrund des neuen Zustandes „hornlos“ eine übermäßige Streßsituation aus (die Enthornung fand vor knapp 1 Jahr statt). Für die Proben von Herde-Ob ist kein zusätzlicher Effekt zum Faktor Horn festzustellen. Inhaltliche Interpretation: Besonders auffällig ist der markante Abfall der freien Aminosäuren bei den Proben der enthornten Kühe. Für den grundsätzlichen Gewebeaufbau des biologisch vorgesehenen Milchempfängers (Kalb) dienen zwar im Wesentlichen die Milchproteine (allem voran die Kaseine und Beta-Laktoglobulin) als Quelle, aber die freien Aminosäuren spielen wahrscheinlich bei Schnellwuchsphasen und bezüglich der Nährung der Darmflora eine besondere Rolle. Ähnlich kann die Absenkung phosphorylierter C3- und C6-Metabolite (biochemisch aktivierte Substanzen für unterschiedliche Wege der Energiegewinnung und –speicherung) sowie die Abnahme der Fettsäuresynthesebausteine durch Enthornung gesehen werden. Thematik „Hörner“ – Diskussion 292 Zudem steigen die entsprechenden Zucker und Zuckeralkohole sowie aminierte und oxidierte Derivate an, wodurch sich in gewissem Umfang Verstoffwechselungsarbeit von der milchbildenden Kuh zu den Empfängern, Kalb und Darmflora, hinverschiebt. Es gibt keine wissenschaftlichen Abhandlungen zur Physiologie der Hörner oder Studien zum Horneinfluss auf Stoffwechsel und Milchbildung sowie zu relevanten Kofaktoren wie Klima und Futter. Ein möglicher Erklärungsansatz ergibt sich aus den folgenden grundsätzlichen Betrachtungen zum Horn (MOSLER 2010, LEIBER 2008, RATH 1998). Zum Einen sind Rinder als Wiederkäuer essentiell auf die physiologische Symbiose mit Mikroben im Pansen angewiesen. Die ausgewogene Mischung und Zusammenarbeit der dort siedelnden Bakterien, Protozoen und Pilze hängt vom Futter sowie von der Temperatur und dem pH im Pansen ab. Mit dem Auslaufen des Milchverzehrs und dem Übergang in ausschließliche Ernährung durch Festfutter muss sich im Kalb der Pansen samt seiner Mikroflora und -fauna sowie deren Schutz und Regulierung auf die gegebenen Lebensbedingungen eingestellt haben, während die Energieversorgung des älter werdenden Kalbes zunehmend auf flüchtige (volatile) Fettsäuren umgestellt wird. Wahrscheinlich leistet die Milch und ihre Bestandteile mit wachsender Größe und Füllung des Pansen neben der primären Ernährung des Kalbes auch wesentliche Beiträge zur selektiven Nährung, Reifung und Anpassung der Mikroflora und -fauna im Pansen. Zum Anderen haben Rinderhörner einen von einer stark durchbluteten Dermis überzogenen, porösknöchernen Kern mit großen, offene Hohlräumen, die mit der Stirnhöhle und darüber mit dem Rachenraum verbunden sind. Damit geht erstens ein nicht zu unterschätzender Beitrag zur Thermoregulation durch Abstrahlung von Blutwärme durchs Horn einher. Dadurch kann das letzte Mittel der Wärmeabfuhr, die Kühlatmung durch den Mund, möglichst lange ungenutzt bleiben, um Wasser- und CO2-Verlust (und somit Speicheleindickung) zu vermeiden. Denn das Speichelvolumen und seine Pufferkapazität durch Bikarbonat sind für die pH-Regulierung im Pansen von zentraler Bedeutung. Zweitens ermöglicht das ausgiebige Wiederkäuen, dass die volatilen Fettsäuren nicht nur durch die Schleimhäute des Verdauungstraktes und der Schädelhöhlen, sondern insbesondere auch in den gut durchbluteten Hörnern in die Blutbahn eindiffundieren können. In der unterschiedlichen Milchzusammensetzung von enthornten und genetisch hornlosen gegenüber horntragenden Kühen könnte man somit sowohl eine besondere systemphysiologische Anpassung an das Fehlen der Hörner (insbesondere bei strukturreichem Futter), als auch eine Hinführung der Kälber und ihres Pansens zur ebensolchen Anpassung sehen. Die vorgelegten Befunde geben Hinweise, dass die Milchzusammensetzung im Zusammenhang mit dem Hornstatus steht. Die vorgelegten metabolomischen Ergebnisse geben Anlass zu eingehenderen Studien zum physiologischen Zusammenhang zwischen Horn und Verdauung bzw Milchbildung und dessen Auswirkungen auf die Milchqualität für den Milchverarbeiter und den milchkonsumierenden Menschen. Thematik „Hörner“ – Diskussion 293 4.11.7. FAS-Untersuchungen Im Rahmen einer einfaktoriellen Analyse (Faktor „Horn“) und unter Berücksichtigung der Meßwiederholungen läßt sich z.B im Meßwert MW10/R40gr oder Chi Eh12r ein signifikanter Unterschied zwischen den Proben der 10 Höfe finden. Der Wert MW10/R40gr scheint aufgrund der Erfahrungen ein Meßwert zu sein, der für Milch eine gewisse Aussagefähigkeit besitzt (STRUBE 2009, mdl. Mitteilung) Jedoch können die Proben von Hof 2, die als dritte Variante die „nachträglich enthornte“ Gruppe beinhalten, diesen Effekt in der betrachteten Messgröße nicht bestätigen. Hier sind eher gegenteilige Meßwert-Ausbildungen festzustellen. Insofern sind die Unterschiede für diesen Hof, aber auch für 3 weitere, in besagter Messgröße unrelevant. Chi Eh12r weist zwar für fast alle Höfe einheitliche Effekte auf – die Werte streuen aber stark. Ein Vergleich der Fettsäure-Ergebnisse je Hof mit denen der FAS zeigen keineswegs einheitliche Effekte: es gibt immer mindestens einen Hof, der nicht ins Muster paßt. Die Meßwerte, die bei den drei Proben von Hof 2 einheitlich nach Horn / Enthornt trennen konnten, sind auf die Gesamtheit der gemessenen Proben (10 Höfe) nicht anwendbar (keine Effekte). Insofern muß konstatiert werden, dass es zwar bei Berücksichtigung aller Proben Effekte zu geben scheint, dass sie aber nicht in allen Fällen einheitlich auftreten oder eine so große Streuung aufweisen, dass sie für eine Klassifizierung ungeeignet sind. 4.11.8. Steigbilder Eine fehlterhafte Gruppierung kann zwei Gründe haben: entweder sind sich die Bilder so ähnlich, dass eine Unterscheidung nicht möglich ist, oder die Bildmerkmale haben sich unterschiedlich je Probe ausgebildet. Insofern ist dieses Merkmal ein Hinweis auf die Methoden-Präzision. Bei der einen fehlerhaften Gruppierung waren die Bilder einander sehr ähnlich – bei der anderen jedoch lagen sehr unterschiedliche Bildmerkmale vor (rötliche Linie im Sockel), so dass hier von einer deutlichen „nicht-Reproduzierbarkeit“ der Bildmerkmale gesprochen werden muß (obwohl dieses Merkmal bei andern Proben meistens sehr gut reproduzierbar war). Jedoch war in 91% der Fälle eine korrekte Gruppierung möglich. Da immer nur zwei Bilder je Probe gruppiert wurden ist eine statistische Auswertung je PrN mit dem Fisher’s Test zwar möglich, führt aber aufgrund der geringen Anzahl von Bildern (2+2) nur zu einer Tendenz mit p=0,3333 (zweiseitiger Test). Wenn jedoch nicht zwei, sonder vier Bilder je Probe erstellt und korrekt gruppiert werden konnten, kann von einer signifikanten Differenzierung mit p=0,0286 gesprochen werden. Dieser Fall liegt aber nur bei wenigen Proben vor, weil eine Gruppierung schon mit 2+2 Bilder gut möglich ist und die zusätzlichen Bilder keinen zusätzlichen Erkenntnisgewinn gebracht hätten – mit der einzigen Ausnahme, das eine statistische Auswertung mit signifikanten Ergebnissen möglich gewesen wäre. Es war dem Autor wichtiger, Bilder in mehreren Konzentrationsstufen zu erstellen, um auf diese Weise zusätzliche Informationen über die Probeneigenschaften zu bekommen. Normalerweise sind die Bilder anderer Konzentrationsstufen einander sehr ähnlich, die probenspezifischen Eigenschaften bleiben (relativ zur anderen Probe) weiterhin deutlich, und Thematik „Hörner“ – Diskussion 294 eine Zuordnung zur anderen Konzentrationsstufe ist häufig möglich. Da es aber nicht ganz korrekt ist, Bilder einer anderen Konzentrationsstufe als Wiederholung anzusehen, wird davon abgesehen. Aufgrund des vorliegenden Bildmaterials ist deshalb eine statistische Bestimmung der Größe und Sicherheit des Unterschiedes nicht möglich. Eine Zuordnung bei wiederholter PrN kann als ein Maßstab für die Reproduzierbarkeit der Probennahme gewertet werden. Es gab in diesem Datensatz 4 Proben-Paare, die nicht korrekt den Bildern vorhergehender PrN zugeordnet werden konnten. Dies kann evt. aufgrund unterschiedlich zusammengestellter Poolproben eingetreten sein, also aufgrund von Einzeltiereffekten bei der Probenzusammenstellung, oder aufgrund veränderter Einzeltier-Eigenschaften im Laufe der Zeit. Die Bilder des Hofes 5, (3. PrN (3.6.), siehe Anhang C) zeigen das Problem sehr deutlich: verschieden zusammengestellte Poolproben („normal“ und „GuM“) von einem PrN-Termin werden falsch einander zugeordnet (und auch die Klassifizierung ist dementsprechend fehlerhaft). Hier kommen die Einzeltiereffekt besonders stark zum tragen. Da jedoch 71% der Zuordnungen korrekt waren, kann von einer mehr als zufälligen Wiederholbarkeit der Probennahme ausgegangen werden. Es reicht jedoch zur Beurteilung einer Probenqualität nicht aus, eine einzelne Probe zu nehmen – es sollten für eine sichere Angabe zu den Probeneigenschaften (in Form von Bildmerkmalen) mindestens zwei Proben in einem gewissen Abstand voneinander genommen und untersucht werden. Die Klassifizierung aufgrund der im Vorfeld ermittelten Bildmerkmale erwies sich als zufällig – d.h. die gewählten Bildmerkmale geben den gesuchten Faktor „Horn“ nicht wieder. Anschließend (Ergebnisse nicht gezeigt) wurde nochmals nach Bildmerkmalen gesucht (incl. dem FZ-Bereich), die mit dem Faktor „Horn“ zusammenhängen könnten (um zu prüfen, ob dieses Merkmale bei allen Proben vorhanden ist, bevor es auf die Bilder der Wirtschaftsstil- Proben angewendet wurde) – mit diesen Merkmalen konnten alle beurteilten Bilder korrekt klassifiziert werden – mit Ausnahme der Bilder vom Hof 5. Hier war schon während der Auswertung eine gewisse Unsicherheit hinsichtlich der Klassifizierung vorhanden – die sich bestätigte. Um für die Zukunft auch mit solchen „schwierigen“ Bildern zurechtzukommen wären diese besonders gut geeignet, weitere Merkmale zu finden, die für eine Klassifizierung in Betracht kommen können. Daran zeigt sich aber auch, dass es immer wieder Proben gibt, die sich in gewisser Weise der Beweisführung „widersetzen“, die aufzeigen, dass noch nicht alle Elemente berücksichtigt sind, die mit dieser Thematik zusammenhängen. An diesem Punkt könnte nach weiterem Verständnis um die Aussagen der Bildmerkmale und die Einflüsse darauf geforscht werden. Thematik „Hörner“ – Diskussion 295 4.11.9. Proben zur Frage „nachträglich enthornt“ Das vorliegende Design mit den zwei enthornten Varianten im Vergleich zu den horntragenden sollte als Fallbeispiel aufzeigen, ob konsistente Horn-Effekte auf einem Hof, unter unterschiedlichen Enthornungs-Bedingungen, auftreten, und ob diese einer graduellen Veränderung (Übergang von „Horn“ zu „seit kurzem enthornt“ zu „seit langem enthornt“) unterliegen. Hinsichtlich der These, dass der Faktor „Horn“ zu einer Veränderung der Milchzusammensetzung beitragen könnte, wäre bei einer nachträglichen Enthornung als Kuh zu erwarten, dass diese Gruppe (hier Gruppe 3) eine mittlere Stellung zwischen Horn und Enthornt einnehmen müsste, oder dass sich zumindest die Horn- Probe von den anderen beiden unterscheiden müßte. Die Daten zeigen auf, dass sich in vielerlei Hinsicht die Gruppe 3 „nachträglich enthornt“ von den anderen beiden (Eh und H) unterscheidet: geringfügig im Alter (3,4 vs. 3,7 und 4. Laktationen), deutlicher im Laktationsstadium (mit 215 Tagen 45 bzw. 32 Tage später), ebenfalls im Lactosegehalt (0,1% höher), der Zellzahl (mit 194 um 54 bzw. 73 höher), im Fettsäuremuster und den meisten FAS-Meßwerten. Auch die Proteomik und Metabolomik zeigen im PCA-plot die Sonderstellung dieser Probe im Vergleich zu den anderen beiden Proben auf. Bei diesen Ergebnissen ist jedoch zu berücksichtigen, dass sie nicht wie die anderen Methoden auf drei PrN beruhen, sondern an den GuM-Proben vom 17.6.08 (GuM, 2. PrN) ermittelt wurden. „GuM“, weil bei dieser „guten Mischprobe“ potentiell euterkranke Tiere ausgeschlossen wurden, die in der anderen Probe enthalten waren. Dieses Beispiel-Proben-Set ähnelt in seinen Eigenschaften aber stark den anderen Proben und gibt die dort festgestellte Sonderstellung der Probe 3 (nachträglich enthornt) deutlich wieder: Der Eiweißgehalt ist besonders hoch (3,34 vs. 3,24 und 3,11 von Probe 3 vs. 1 (Eh) und 2 (H)), der Lactosegehalt ebenfalls, (4,74 vs. 4,57 und 4,53) und die Zellzahl ist ebenfalls erhöht (166 vs. 101 und 111). Im hohen pH-Wert der Gärprobe (5,5 vs. 5,0 und 4,8) zeigt sich eine geringe Säuerungs-Fähigkeit. Das Ziel von möglichst wenig Unterschieden bis auf den Faktor „Horn“ ist insofern bei diesen Proben nicht erreicht. Und selbst bei dem Versuch, euterkranke Tiere auszuschließen, scheint die Gruppe 3 (nachträglich enthornt) noch immer mit hohen Zellzahlen mindestens eine Kuh zu enthalten, die hohe Zellzahlen hat (wobei keine äußerlichen Sekretionsveränderungen beim Melken bemerkbar waren). Diese „Erkrankungstendenz“ kann in der beobachteten und für Mastitis bekannten (KRÖMKER 2007, WOLTER et al. 2002) schlechten Säuerungs-Eigenschaft der Probe bestätigt gesehen werden. Die Proteine (LACB, PIGR und MFGM) weisen ebenfalls auf eine erhöhte Immunabwehrreaktion. Thematik „Hörner“ – Diskussion 296 Damit kann die Sonderstellung der Probe 3 (nachträglich enthornt) in allen quantitativen Methoden bestätigt und mit einer Erkrankung in Beziehung gebracht werden, obwohl das Zellzahl-Niveau keineswegs besorgniserregend hoch ist. . Die qualitative Methode der Steigbilder zeigt ein etwas anders geartetes Bild: Bei diesen GuM-Proben vom 17.6.08 ist das Muster von „horntragend“ vs. „enthornt“ relativ gut wiedergeben – in den SZ-Merkmalen (g.B.-Intensität) ist das vermutete Gefälle von „Horn“ über „als Kuh enthornt“ zu „als Kalb enthornt“ deutlich. Im Vergeich mit den Bildern der anderen PrN fällt jedoch auf, dass dort dieses Gefälle nicht auftritt, und die Sonderstellung der Probe 3 (nachträglich enthornt) im Vordergrund steht – mit jeweils relativ großen S / vielen g.B. und dunkler DL / dunklem „Bart“ im Sockel. Dies wird damit zusammenhängen, dass beim GuM zwei bis drei Kühe weniger im Pool zusammengefaßt sind, und deren tierindividuellen Effekte sich nicht mehr auf die Bildgestaltung auswirken, so dass diese veränderte Ähnlichkeit der Bilder im GuM auftritt. Somit kann gefolgert werden, dass die Sonderstellung der Gruppe 3 vielfach ermittelt wurde, dass die Steigbilder der GuM-Proben diese nicht wiedergeben, dass sie aber in den quantitativen Methoden erfaßt wird, und auch in den anderen Proben mit der Steigbild- Methode. Dies kann als Hinweis gesehen werden, dass die Steigbildmethode sehr sensibel Einzeltiereffekte wiedergibt, die in der Analytik offenbar weniger deutlich werden. Dass das Ergebnis nicht nur „zufällig“ ist kann damit belegt werden, dass mit Doppelproben gearbeitet wurde und alle Proben (für alle Untersuchungen) zeitgleich abgefüllt wurden. Im Hinblick auf die Frage, ob sich im Fettsäuremuster irgendwelche Effekte bestätigen, die sich als Tendenzen in dem größeren Probensatz der 11 Höfe ergaben, kann einzig die Fettsäure C-18:1tr10 ermittelt werden, die auch auf diesem Hof zu Unterschieden zwischen horntragenden und enthornten Kühen beiträgt. Bei allen anderen evtl. hornspezifisch beeinflußten Fettsäuren sind auf diesem Hof die Proben von den als Kalb enthornten Kühen denjenigen der horntragenden sehr ähnlich im Fettsäure-Muster. Und da Kelsey et al. (2003) die C18:1tr10 als zu 18,3% tierindividuell beeinflusst darstellt, kann dieses der erklärende Faktor für den Unterschied der Proben sein. Die in diesem Probensatz auffällig geringen Werte für die iso-Fettsäuren (C-14iso, C- 15iso, C-18iso, kaum bei C-17iso) bei den Horn-Proben (im Vergleich zu den beiden enthornt-Proben) können im Vergleich mit den Daten der anderen Höfe nicht bestätigt werden – eher das Gegenteil. Selbst die C-18iso, die in beiden Fällen eine gleichgerichtete Tendenz zeigt, ist im Set der 11 Höfe mit einem Horneffekt von p=0,24 eher als „ohne Effekt“ einzustufen. Es kann somit im Vergleich dieses Probensatzes mit dem größeren Probensatz der 11 Höfe nicht von einem Horn-Effekt auf das Fettsäuremuster gesprochen werden. Thematik „Hörner“ – Diskussion 297 Fazit: Es zeigen sich keine hornspezifischen Effekte – die Sonderstellung der Probe 3 (nachträglich enthornt) wird mit mehreren Methoden erfaßt und deutet von den Werten her auf eine Krankheitssituation hin, das Vergleichspaar „Horn vs. als Kalb enthornt“ weist fast keine Unterschiede auf. Thematik „Hörner“ – Methodenvergleich 298 4.12. Methodenvergleich zum Thema „Hörner“ Differenzierung: Methode Ergebnis Effekt-Intensität Milchleistung Eh = H Fettgehalt Eiweißgehalt Lactosegehalt Harnstoff Eh = H Eh = H Eh = H Eh = H Gärprobe Eh = H Fettsäuremuster Eh ähnlich H Hof >>>>>> PrN >> Horn Proteomik Eh ≠ H Horn + Hof ähnlich Metabolomik Eh ≠ H Horn + Hof ähnlich FAS Eh ähnlich H Steigbilder – SZ Eh = H Diff. je Hof bzw. je PrN, klass. Zuordnung nicht möglich Tab 126. Vergleich der Ergebnisse verschiedener Methoden untereinander (Thematik „Hörner“) Im Vergleich der verschiedenen Methoden zeigt sich, dass Unterschiede zwischen den Proben „Horntragend“ vs. „Enthornt“ mit zwei Methoden zu ermitteln waren, mit zwei weiteren nur sehr eingeschränkt – dabei ist jedoch zu berücksichtigen, dass die Proteomik und Metabolomik als Pilotstudie nur an Proben von zwei Höfen zu Horn / Enthornt (und einem Hof zu Enthornt / Genetisch hornlos) vorgenommen wurden, und Fettsäure-Muster und FAS nur sehr geringe Unterschiede feststellen. 1) Die FAS konnte geringfügige Effekte im Meßwert Chi Eh12r feststellen. 2) Das Fettsäure-Muster unterscheidet sich konsistent bei 3 der 11 Höfe, bei den anderen Höfen gibt es kaum / keine Effekte. 3) und 4) Die Proteomik und Metabolomik konnten Unterschiede zwischen den Proben feststellen, mit jeweils einheitlichen Horneffekten. 5) Die Steigbild-Merkmale konnten unter Berücksichtigung der SZ-Merkmale keine Unterschiede darstellen. Weitere Untersuchungen mit proteomischem / metabolomischem Ansatz erscheinen angemessen, um die Befunde abzusichern. Die Steigbild-Methode scheint in der angewendeten Form (SZ-Merkmale) keine aussagefähigen Ergebnisse zur Thematik „Horn“ liefern zu können, auch die FAS-Methode liefert zu dieser Thematik wenig deutliche Ergebnisse – die anderen Meßwerte (F,E,L, Milchleistung, Gärprobe) zeigen für diese Fragestellung keine Effekte und sind insofern ungeeignet, diese Probenunterschiede aufzuzeigen. Thematik „Hörner“ – Methodenvergleich 299 Charakterisierung Methode Charakterisierung Meßwert Horntragend Enthornt Fettsäuremuster H mehr C-17aiso z.B. C-17aiso – bei 3 von 11 Höfen Proteomik +LACB Darmwand - IgG höher dosierte Schutzfunktion (antiviral) / Lumen-IgA Eh: +PIGR, +MFGM : H: +B2MG, +LACB Metabolomik Freie AS – zur Nährung der Darmflora Weniger FS-Synthese- Bausteine, weniger biochemisch aktivierte Substanzen H mehr AS, F-6-P, G-6- P, Vit. B5 FAS Nicht beurteilbar. Nicht beurteilbar Chi Eh12r Tab 127. Charakterisierung mit den die Proben differenzierenden Methoden Es liegen nur zwei die Proben sicher differenzierende Methoden vor (Proteomik und Metabolomik). Weil diese beiden Methoden nur beispielhaft an den Proben von zwei Höfen zum Thema „Horn – Enthornt“ angewendet wurden, muß die Sicherheit der Aussage eingeschränkt werden. Auch sind die Charakterisierungen der Methoden etwas unterschiedlich, so dass kein einheitliches Bild von der Probencharakteristik entsteht. Eine einheitliche Charakterisierung ist nicht möglich, und eine Beurteilung von „typischen“ Eigenschaften ist mangels Referenzmaterial nicht möglich. Fazit: 1) Die Milchproben des gepaarten Designs lassen sich hinsichtlich des Hornstatus mit 4 von 11 Methoden unterscheiden, wobei zwei Methoden (Proteomik und Metabolomik) nur an Proben von drei Höfen exemplarisch angewendet wurden, die anderen beiden Methoden (Fettsäure-analytik und FAS) können nur bei einzelnen Höfen bzw. mit einem einzigen Meßwert Unterschiede ermitteln. 2) Der Horn-Effekt ist gering gegenüber dem Hofeffekt. 3) Eine einheitliche Charakterisierung der Proben ist nicht möglich. Abschließende Diskussion 300 5. Zusammenfassende, abschließende Diskussion der Ergebnisse aller Versuche 5.1. Zur Methodeneignung Im Rahmen diese Arbeit sollten mehrere Methoden miteinander verglichen werden hinsichtlich ihrer Eignung, Proben zu differenzieren und zu charakterisieren. Dabei wurden sowohl gut entwickelte Standardmethoden verwendet (Milchinhaltsstoffe, Fettsäuremuster, Gärprobe), deren Prozessierung und Aussagewert weitgehend festgelegt und bekannt ist, als auch noch nicht voll ausgereifte Methoden, die noch in der Entwicklung sind und bei denen geprüft werden muß, ob sie reproduzierbare / plausible Ergebnisse liefern (Steigbildmethode, FAS, aber auch Proteomik, Metabolomik). Bei diesen Methoden fehlte es einerseits an Erfahrung, ob der methodische Prozeß geeignet ist, die gesuchten Effekte wiederzugeben, und es fehlt z.T. (Steigbilder und FAS) an Referenzmaterial, um die Ergebnisse zu deuten. Um die Methodeneignung zu prüfen (für Proteomik, Metabolomik, Steigbilder und FAS), wird einerseits der Vergleich mit anderen Methoden angewendet, andererseits sind Merkmale wie „Ergebnisse reproduzierbar“ (z.B. bei Mehrfachbestimmungen derselben Proben oder bei vergleichbaren, anderen Proben) ein sicherer Hinweis auf die Aussagefähigkeit und –sicherheit der Methoden (KROMIDAS 2000). Auch die Übereinstimmung mit Ergebnissen anderer Methoden ist einer gegenseitigen Bestätigung dienlich. Wenn die Ergebnisse dahinzu auch noch plausibel sind, und mit den verursachenden Effekten in Verbindung gebracht werden können, ist das eine weitere Bestätigung der Anwendbarkeit der Methode bei der vorliegenden Fragestellung (PETTERSSON 1967). In diesem Sinne sind die proteomischen und metabolomischen Untersuchungen zu betrachten: Der neu entwickelte Prozeß der Probenaufbereitung und Messung sowie Auswertung konnte an mehreren Proben angewendet werden. Es ließen sich für die minoren Molkenproteine für jeden Probensatz Substanzen ermitteln, die in (fast) allen Proben je Set meßbar waren – und im Vergleich mit den Proben eines anderen Sets wurde deutlich, dass dort dieselben Substanzen auftraten. In den Fällen, in denen eine Substanz in der einen Probenqualität wiederholt meßbar war, in der anderen nicht (z.B. Thema „Hörner“, Serotransferrin (TRFE), oder Versuch B, Ubiquintin (UBIQ)), wurde angenommen, dass eine nicht detektierbare Menge vorliegt, aber kein methodischer Meßfehler. Die unterschiedliche Konzentration der Substanzen („Mustererkennung“) kann in Beziehung gebracht werden mit den Futter-, Gruppen- und Zeiteffekten, die den Proben immanent waren, und physiologische Prozesse wiederspiegeln (z.B. Anstieg von B4GT1 und LALBA bei Versuch A, die mit der Lactosesynthase zusammenhängen, und dem unabhängig davon ermittelten hohen Lactosegehalt der Proben). Ähnliches gilt für die Metabolomik, wenngleich hier eine viel größere Anzahl von Substanzen vorliegt. Abschließende Diskussion 301 An „Ausreißern“, die sich nicht ganz in ein Schema einfügen (wie z.B. dem Cross- Over-Design, das sich im PCA-Plot deutlich zeigen sollte), kann eine zusätzliche Absicherung der Ergebnisse stattfinden: bei Versuch B ist die März-Probe von G1 (Futterrüben) in der Proteomik auffällig von den anderen unterschiedlich. Diese Probe weist Proteine auf, die im Zusammenhang mit einer erhöhten Immunabwehr auftreten – und da diese Probe auch hohe Zellzahlen aufweist, und abgesenkte Harnstoffwerte, wird die Vermutung der Erkrankung bestätigt. Ähnliches könnte für die Probe „als Kuh enthornt“ von Hof 2 (Fu) gelten, wenngleich hier die Zellzahlen mit 166 recht niedrig sind – die Werte der Vergleichsproben liegen jedoch bei 100, so dass auch hier ein Entzündungsprozeß als Ursache für die Sonderstellung der Probe denkbar ist. Diese Beobachtungen können als Bestätigung gesehen werden, dass der Proben- aufbereitungs- und Meßvorgang geeignet ist, diese Substanzen zu erfassen und dass eine Deutung der Ergebnisse hinsichtlich physiologischer Vorgänge möglich ist. Die FAS-Untersuchungen liefern quantifizierbare Messungen, die qualitativ- charakterisierenden Charakter haben. Anders als z.B. für Getreideproben besteht für Milchproben noch kein Interpretationskontext – insofern können zwar Unterschiede gemessen werden, aber eine Interpretation der Ergebnisse ist nur bei Übertragung von Erfahrungen von anderem Probenmaterial möglich, wobei diese Übertragbarkeit nicht gesichert ist. Zusätzlich erschwerend für Milchproben zeigen die Messwerte häufig große Streuungen (meßtechnischer Art, Aufrahmung während der Messung u.a.). Im Vergleich der Anwendung an den drei Probensätzen (zwei mal „Fütterung“, einmal „Hörner“) muß konstatiert werden, dass diese Methode nur in einem Versuch (B) die Fütterungsvarianten differenzieren kann. Weil die Proben aus Versuch A nicht untersucht wurden, kann hier leider keine Aussage gemacht werden. Es liegt die Vermutung nahe, dass die Methode bei ausreichend großen Probenunterschieden Effekte messen kann: die beiden Versuche A und B weisen deutliche Futtereffekte auf, die auch mit den anderen Methoden bestätigt werden. Bei Versuch C und dem Thema „Hörner“ sind die Probenunterschiede sehr gering (z.B. im Fettsäuremuster und in der Steigbildmerkmals-Variation), somit ist nachvollziehbar, dass die Unterschiede mit der FAS auch nicht erfaßbar sind. Eine zusätzliche Sicherheit in der Anwendbarkeit der Methode für Milchproben ergibt sich aus dem Umstand, dass die Ergebnisse bei Versuch B in Zusammenhang mit den Probenqualitäten gebracht werden können: die Meßwert-Unterschiede der Milch entsprechen denjenigen, die auch bei Messung von gleichartigen Futter- Ausgangssubstanzen (Samenkörner vs. saftige Proben) auftreten. In diesem Fall war eine Übertragung von Erfahrungswerten anderer Proben stimmig. Diese Ergebnisse sprechen dafür, dass bei relativ deutlichen (Futter-) Effekten reproduzierbare Ergebnisse möglich sind und mit den Ursachen in Zusammenhang gebracht werden können. Abschließende Diskussion 302 Die Steigbild-Methode wurde im Rahmen dieser Arbeit umfassend auf ihre Anwendbarkeit auf Milchproben geprüft – Wiederholungs-bestimmungen (und Doppelproben) wurden genutzt, um die Ergebnisse abzusichern. Alle in dieser Arbeit untersuchten Proben wurden mit doppelter Probenaufbereitung untersucht – einige sogar mit doppelter Bilderanzahl je Probenaufbereitung und Konzentrationsstufe (z.B Hof 1, 3. PrN, Fütterungssystemvergleich B oder Proben-Alterungsversuch). In diesen Fällen mit vier Bildern je Probenqualität ließ sich in 6 von 7 betrachteten Fällen eine mit p=0,0286 (Fischer’s exakter Test, zweiseitig) signifikante Differenzierungsfähigkeit feststellen. Bei der Anwendung der Methode z.B. zur Fragestellung der Hörner ist in der Übersicht der Ergebnisse (Kapitel 4.10.8) zu sehen, dass sich die zu unterscheidenden (jeweils gedoppelten) Proben bis auf 3 Fälle immer korrekt gruppieren ließen (in 91% der Fälle). In SB-Abb-40-Hof_5-080521 im Anhang sind beispeilhaft die doppelt erstellten Bilder mit abgebildet – ebenfalls bei den Ergebnissen zu den Fütterungssystemvergleichen (z.B SB- Abb-22-Fütterungssystemvergleich C: Heu vs. Silage). Bei der Anwendung der Methode zur Fragestellung des Fütterungseinflusses konnten die jeweils zwei zu unterscheidenden Proben bis auf eine Probennahme immer korrekt gruppiert werden (11 von 12 Fälle korrekt). Die Methode zeigt für alle drei Fütterungssystemvergleiche eine Unterscheidungsmöglichkeit der Futtereffekte – bei Versuch B konnte aufgrund der Anzahl der Bilder für die ersten drei PrN mit dem Fischer’s Test eine signifikante Differenzierung der Proben bestimmt werden. Es kann somit festgehalten werden, dass bei zwei Vergleichsproben eine Gruppierung der je Probe mindestens zwei Bilder in den meisten Fällen möglich war: - bei den Fütterungssystemvergleichen in 92% der Fälle (bei 12 Probenpaaren) - bei den Proben zur Thematik „Hörner“ in 91% der Fälle (bei 34 Probenpaaren). Es wurde an drei Probenpaaren zum Thema „Hörner“ sowie an den vier Vergleichsproben von Versuch C ein leicht variierter Triangeltest angewendet zur statistischen Absicherung der Ergebnisse. Aufgrund des Umfanges der Arbeit wurde auf weitere Triangeltest-Auswertungen verzichtet, u.a. da die Gruppierungen der Bilder aufgrund der Bildmerkmalsausprägungen sehr deutlich möglich waren und somit die Unterschiedlichkeit offensichtlich erscheint. Horn-Effekte konnten nicht erfaßt werden, wenngleich fast alle untersuchten Probenpaare dieses Probensatzes (n=34) voneinander unterscheidbar waren (91% der Fälle korrekt gruppiert – wenn 4 Bilder je Probe erstellt wurden ließ sich auch die Signifikanz bestimmen). Es konnte der Einfluß vieler Effekte auf die Bildmerkmals-Ausprägung ermittelt werden, und durch die Beachtung dieser Effekte konnte ein Großteil der Bildvariation ausgeglichen werden. Die Bilder von Versuch A, bei deren Erstellung noch nicht alle Effekte berücksichtigt wurden, zeigen deutlich mehr Bildvariationen als diejenigen aus Versuch C, die unter Berücksichtigung aller Effekte entstanden. Aber obwohl die methodischen Effekte in der Bildvariation sichtbar werden, bleiben die Probenunterschiede auch bei Versuch A deutlich und vordergründig. Im Zusammenhang des Cross-Over-Designs der drei Fütterungssystemvergleiche und wiederholten PrN je Periode ließ sich feststellen, dass in 4 von 6 Fällen die Abschließende Diskussion 303 Wiederholungsproben den ersteren zugeordnet werden konnten (aufgrund einheitlicher Bildmerkmalsausprägung). Bei den Hörner-Proben konnten 14 von 18 beurteilbare Wiederholungsproben korrekt den vorhergehenden zugeordnet werden. Insgesamt spricht dies für eine zu 78% wiederholbare Probennahme und Reproduzierbarkeit der Ergebnisse. Weil im Zusammenhang des Cross-Over je nach berücksichtigten Bildmerkmalen zwei Zuordnungsvarianten möglich waren (besonders deutlich bei Versuch A), kann davon ausgegangen werden, dass sich sowohl die Gruppen-Effekte als auch die Futtereffekte in den Bildern zeigen – oft in unterschiedlichen Bildmerkmalen; bei Versuch C jedoch in der Überlagerung beider Effekte im Merkmal „g.B.-Intensität“: die Gruppen unterscheiden sich in diesem Merkmal, und durch den Futterwechsel verändert es sich zusätzlich, entsprechend der Futtervariante. Im Vergleich der Steigbildergebnisse von Fütterungssystemvergleich B mit den Ergebnissen der anderen Methoden wird deutlich, dass sich z.B. bei der Fettsäure-Analytik, der Proteomik und Metabolomik neben Futtereffekten ebenfalls ein sehr deutlicher Gruppeneffekt zeigt – und zwar mehr als bei den Proben aus dem Fütterungssystemvergleich A. Insofern kann das Ergebnis, dass die Gruppierung hier vor allem nach Gruppen-Merkmalen stattfindet und nicht nach Futter-Merkmalen wie bei Versuch A, mit anderen Methoden als bestätigt betrachtet werden. Es soll noch erwähnt werden, dass sich die Bildmerkmale der Vergleichsproben bei der 4.PrN von Fütterungssystemvergleich B sehr ähnlich ausbilden – bei den ersten drei PrN waren jeweils die Bildunterschiede deutlicher. Die Proteine und Metabolite zeigen einen ähnlichen Effekt: für die erste PrN sind die Futter-Unterschiede deutlicher als für die letzte PrN, was sich in der PCA in der PC1 (X-Achse in Abb. 23:und Abb. 24:) deutlich zeigt. Aufgrund dieser Befunde kann von der grundsätzlichen Eignung der Methoden (Proteomik, Metabolomik, FAS und Steigbild) ausgegangen werden, reproduzierbar Proben zu differenzieren (bzw. zu gruppieren) und plausible Merkmalsveränderungen aufzuzeigen, die im Zusammenhang mit den Probeneigenschaften stehen. Eine zusätzliche Bestätigung der Methoden untereinander findet sich im Zusammenhang mit der fehlerhaften Zuordnung der Steigbilder der 2. zur 1. PrN bei Versuch C. Auf den ersten Blick könnte dies als ein methodischer Fehler erscheinen. Im Vergleich mit Ergebnissen anderer Methoden (zB. FAS, oder die Harnstoffwerte) findet sich dieses „vertauschte“ Verhältnis ebenfalls wieder. In der Gärprobe jedoch zeigt sich der Effekt nicht. Die Fettsäuren wurden für diese 1. PrN nicht analysiert, so dass dazu kein Bezug genommen werden kann. Dieses Ergebnis zeigt, dass die Steigbildmethode und FAS ähnliche „falsche“ Ergebnisse liefern, die aber (wegen der Harnstoffwerte) plausibel sind. Insofern ist der scheinbar methodische Fehler im Methodenvergleich tatsächlich als realer Probeneffekt zu deuten, der zusätzlich zeigt, dass die Steigbildmethode und die FAS ähnlich sensibel darauf reagieren, während die Gärprobe darauf nicht anzusprechen scheint. Abschließende Diskussion 304 Der Vergleich verschiedener Methoden miteinander (Anwendung verschiedener Methoden bei denselben Proben) konnte bei Proben von drei Fütterungssystemvergleichen zeigen, dass die meisten Methoden geeignet sind, die Proben zu differenzieren bzw. zu gruppieren und fütterungsspezifische Effekte im Vergleich zu anderen Effekten (Gruppe, Zeit) zu erfassen. Besonders deutlich wird die gegenseitige Bestätigung der Methoden, wenn die Ergebnisse des Fütterungssystemvergleiches A mit B verglichen werden: während bei Versuch A in allen Methoden, incl. der Steigbildmethode, die Futtereffekte den größten Einfluß hatten, und die Gruppeneffekte dagegen in den Hintergrund traten, war dieses bei dem Fütterungssystemvergleich B anders: hier waren die Gruppen-Effekte bei den Steigbild- Merkmalen mindestens genauso deutlich wie die Futtereffekte, eher deutlicher als die Futtereffekte, und auch die PCA für die Proteine (und Metabolite) zeigt, dass der Futtereffekt im Vergleich zum Gruppeneffekt eher gering ist. Selbst in den Fettsäure-Ergebnissen zeigen sich neben Futter-Effekten viele Gruppen-Effekte – noch extremer ist dieses für den Fütterungssystemvergleich C, bei dem die Futtereffekte neben Gruppen- oder Zeit-Effekten relativ geringfügig erscheinen, und das sowohl bei den Fettsäuren, als auch bei den Steigbild-Merkmalen. Bei den Fütterungssystemvergleichen zeigte sich somit, dass die berücksichtigten Effekte Futter, Gruppe und Zeit je Versuch mit fast allen Methoden (Gärprobe, Fettsäuren, Proteine, Metabolite, FAS, Steigbilder) ähnlich beurteilt wurden: Versuch A hat besonders deutliche Futtereffekte, Versuch B hat geringere Futtereffekte, die Gruppeneffekte werden deutlicher, Versuch C hat nur geringe Futtereffekte, die Zeit- und Gruppeneffekte stehen im Vordergrund – und das bei fast allen Methoden in ähnlicher Weise. In Anbetracht dessen, dass in jedem der Versuche die verschiedenen Methoden diese Effekte sehr ähnlich beurteilen, kann davon ausgegangen werden, dass alle diese Methoden diese drei Effekte ähnlich gut wiedergeben können – wenngleich sich die Methoden auf sehr unterschiedliche Probenaspekte / Substanzen beziehen. Die Milchleistung und die F,E,L-Gehalte sind bei geringen Futtereffekten (z.B. Versuch C) und der geringen Anzahl von Messungen nicht mehr geeignet, Unterschiede aufzuzeigen. Zum Thema „Horn“ ließen sich am Beispiel von 11 Höfen mit den Fettsäuren und der FAS geringfügige Unterschiede feststellen, die anderen Methoden konnten keine konsistenten Unterschiede erfassen. Die proteomisch und metabolomisch ermittelten Unterschiede beruhen auf Daten von zwei Höfen – insofern haben sie explorativen Charakter und bedürfen der Bestätigung durch weitere Untersuchungen. Abschließende Diskussion 305 Fütterungssystemvergleiche Methode Versuch A Versuch B Versuch C Thema Horn Milchleistung W ≠ KG (FuR ≠ W) (Heu ≠ Sil) Eh = H Fettgehalt Eiweißgehalt Lactosegehalt Harnstoff (W ≠ KG) (W ≠ KG) W ≠ KG W ≠ KG FuR ≠ W FuR ≠ W FuR = W FuR ≠ W (Heu ≠ Sil) (Heu ≠ Sil) Heu = Sil Heu ≠ Sil Eh = H Eh = H Eh = H Eh = H Gärprobe n.b. FuR ≠ W Heu ≠ Sil Eh = H Fettsäuremuster W ≠ KG FuR ≠ W Heu ≠ Sil Eh ähnlich H Proteomik W ≠ KG FuR ≠ W n.b. Eh ≠ H * Metabolomik W ≠ KG FuR ≠ W n.b. Eh ≠ H * FAS n.b. FuR ≠ W Heu = Sil Eh ähnlich H Steigbilder W ≠ KG FuR ≠ W Heu ≠ Sil Eh = H Tab 128. Vergleich der Ergebnisse zur Differenzierungs- bzw. Gruppierungs-fähigkeit der Methoden. Grün = Effekte meßbar, lila = Effekte sehr gering meßbar, Tendenzen, rot = Effekte nicht meßbar, * = beispielhaft an zwei von 11 Höfen Fütterungssystemvergleiche Methode Versuch A Versuch B Versuch C Thema Horn Milchleistung Einzelkuh > Futter > PrN Kuh >> Futter >> PrN Fettgehalt Eiweißgehalt Lactosegehalt Harnstoff Futter > Gruppe + PrN Futter > PrN > Gruppe Kuh > Futter >>> PrN Kuh > Futter >>> PrN Kuh >>>>> Futter + PrN Futter > Kuh > PrN (Futter+ Gruppe + PrN) Gärprobe n.b. PrN >>> Futter + Gruppe PrN > Futter > Gruppe Fettsäuremuster Futter > Gruppe > PrN Futter(>) Gruppe (>) PrN Gruppe > Futter >> Zeit Hof >>>>>> PrN >> Horn Proteomik Futter > PrN > Gruppe Futter > Gruppe > PrN n.b. Horn + Hof ähnlich * Metabolomik Futter > PrN > Gruppe Futter > Gruppe > PrN n.b. Horn + Hof ähnlich * FAS n.b. Futter Diff. je PrN möglich, klass. Zuordnung nicht. Steigbilder Futter > Gruppe Gruppe + Futter Gruppe > Futter Diff. je Hof bzw. je PrN, klass. Zuordnung nicht möglich. Tab 129. Vergleich der Methoden: Effekt-Intensitäten. * = beispielhaft an 2 von 11 Höfen Abschließende Diskussion 306 5.2. Zur Charakterisierung der Probeneigenschaften Bei den Methoden, die bei wiederholter PrN eine konsistente Charakterisierung liefern, wird das Ergebnis mit dem der anderen Methoden verglichen. Hierbei zeigt sich auch, welche Methode über welche Probenaspekte Auskunft liefern kann. Im Überblick über die Ergebnisse der vier Probensätze (siehe Tab 130) ist deutlich, dass ein direkter Vergleich der Charakterisierungen je Probensatz nicht ohne weiteres möglich ist. Werden jedoch von den Methoden unabhängig voneinander Charakterisierungen vorgenommen, die sich untereinander in Beziehung bringen lassen, dann kann von einer einheitlichen Charakterisierung gesprochen werden, unabhängig von der angewendeten Methode. Häufig ist der Bezugsrahmen eine Art physiologischer Zustand bzw. Wachstums- oder Bildungsprozesse. Bei der Beurteilung von FAS-Ergebnissen wird dieser Bezug zu physiologischen Vorgängen regelmäßig angewendet: hier wird erfaßt, ob z.B. ein Apfel Merkmale aufweist, die im Bezug zu „Reife“ stehen (STRUBE & STOLZ 2004). Im Zusammenhang mit den Fütterungssystemvergleichen zeigten die Methoden großenteils übereinstimmende Ergebnisse. Es gab keine Methoden, die ein „unerwartetes“ Ergebnis erbracht hätten. Z.B. kann die Charakterisierung der FAS bei Versuch B („Samentypisch“ vs. „Saftfuttertypisch“) im logischen Zusammenhang mit den Futtersubstanzen gesehen werden: Weizen ist ein Korn, ein Same, und Futterrüben sind ein „saftiges Futter“ (hohe Wassergehalte, geringe TM-Gehalte). Aber auch der logische Bezug zu den Charakterisierungen der anderen Methoden im Hinblick auf Wachstums- bzw. Bildungsprozesse ist deutlich. Die Charakterisierungen der Steigbilder sind im Bezug zu den Probeneigenschaften zu sehen. Eine Bestätigung dieses Zusammenhanges wird darin gesehen, dass bei Versuch A und B die Bildmerkmale ermittelt wurden, und im nachhinein der Zusammenhang mit den Probeneigenschaften deutlich wurde. Bei Versuch C wurden die vermutlich futterspezifisch auftretenden Bildmerkmale theoretisch ermittelt und zur Klassifizierung angewendet – mit einem Erfolg von 75% (Bilder der 1. PrN wurden falsch eingestuft aufgrund der vertauschten Zuordnung zur folgenden PrN – allein für sich waren sie nicht beurteilbar aufgrund mehrdeutiger Merkmale). Die Erfahrungen von z.B. BALZER-GRAF, DORN, GEIER und FRITZ weisen darauf hin, dass solche Parallelen zwischen Probencharakter und Bildcharakter wiederholt auftreten. Wird bei der Bildauswertung vermehrt darauf eingegangen, dann werden nicht mehr nur Bildmerkmale der Ebene 1 und 2 betrachtet (s.a. KAHL (2007), WALDBURGER (2005) und Ausführungen in Kapitel 1.3.6), sondern Merkmale der Ebene 3 und 4 werden von Bedeutung – zur Darstellung des „Lebendigen“, des „Wachstumsprozesses“ des Untersuchungsgutes. Es müssen also Kriterien erfaßt werden, die im Bereich der Prozesse, der Entwicklung liegen. Werden diese Elemente mit erfaßt, dann scheint mir eine der Steigbildmethode und ihrem ursprünglichen Anwendungsziel angemessene Auswertung gegeben. Abschließende Diskussion 307 Bei den proteomischen und metabolomischen Charakterisierungen von Versuch A kann der Bezug zu den „Bildungsprozessen“ bzw. Wachstumsprozessen ebenfalls gesehen werden – sie sind aber genauso im Zusammenhang mit den anderen Ergebnissen (F,E,L) zu betrachten: Gewebereifung (bei Wiesengrasheu, Versuch A) hat mit Ausdifferenzierung, Strukturbildung zu tun, während Nährstofffülle mit hohem Energiegehalt (Kleegrasheu) zu Wachstumsbetonung führt. Die Milchleistung spiegelt sich darin wieder (Wiesenheu: gering), die Wirkung der Futtermittel spiegelt sich darin ebenfalls wieder: Kleegrasheu liefert mehr Protein und Energie, d.h. höherer Milcherzeugungswert in der Ration als Wiesengrasheu. Wiesengrasheu liefert aufgrund der Kräuter eher mehr Mineralien, ist aber „karg“ – der Zusammenhang zur Gewebeausdifferenzierung bei niedriger Milchleistung mit erhöhtem Fettgehalt erscheint plausibel. Es könnte auch der „Bildungsprozeß“ des Futters in der proteomischen und metabolomischen Charakterisierung gesehen werden. Bei Versuch B ist ein solcher Zusammenhang nicht ganz so offensichtlich – hier sind aber auch die Futtereffekte geringer als bei Versuch A (im Vergleich zu Gruppen- und Zeiteffekten). Ein Bezug zu „produktiven“ bzw. „saftfutter-typischen Bedingungen“ wie bei der Futterrüben-Variante ist jedoch methodenübergreifend möglich im Vergleich zur eher „kargen“, strukturierten, samen-typischen Weizen-Variante. Ein ähnlicher Vergleich ist bei Versuch C möglich, mit der „produktiveren, saftfuttertypischeren“ Silage-Variante, wenngleich hier die Futter-Effekte nur noch sehr geringfügig sind. Noch geringer sind die Effekte zum Thema „Hörner“ – v.a. über die proteomisch und metabolomisch vorgenommene Charakterisierung der Probeneigenschaften könnte aber ein Zusammenhang mit den Proben gesucht werden. Hierbei ist zu bedenken, dass die proteomischen und metabolomischen Ergebnisse auf zwei Beispiel-Höfen beruhen, die Ergebnisse der anderen Methoden auf Daten von 11 Höfen, so dass weitere Untersuchungen notwendig sind, diese Ergebnisse zu bestätigen. Insofern ist Vorsicht bei der Interpretation der proteomisch und metabolomisch ermittelten Ergebnisse zum Thema „Hörner“ geboten. Zusätzlich ist zu beachten, dass diese Proben im Zusammenhang mit dem Faktor „Horn“ ähnliche Steigbildmerkmalsausprägungen aufweisen: die zwei Horn-Proben mit wenig g.B.-Intensität und kleinen S, die drei Enthornt- Proben mit vielen g.B. und großen S, die Proben von Hof 12 (Da) passen sich entsprechend ihrer „Ähnlichkeit“ mit den anderen Proben laut PCA in dieses Muster ein. Weil auch in den Fütterungssystemvergleichen eine parallele Veränderung der Steigbildmerkmale sowie proteomische/metabolomische Eigenschaften (z.B. in der PCA wiedergegeben) auftritt, erscheint ein Zusammenhang naheliegend. In der Übersicht über alle Ergebnisse (Tab 130) wird deutlich, dass die verschiedenen Methoden Ergebnisse liefern, die bei Bezugnahme zu einer gemeinsamen Eigenschaft wie z.B. einer „üppigen“ Situation vs. einer „mageren“ eine ähnliche Qualitätsbeschreibung vornehmen – wenngleich diese Charakterisierungen auf sehr unterschiedlichen Pobenaspekten beruhen. Abschließende Diskussion 308 Milchleistg Fettgehalt Eiweißgehalt Lactosegehalt Harnstoff Gärprobe Fettsäuremuster Proteomik Metabolomik FAS Steigbilder Wiesenheu gering (n.s. erhöht, 0,2%) k.U. wenig Normal n.b. Mittellangkettige Fettsäuren Gewebereifung, Ausdifferenzierung, Knochenmineralisieru ng Strukturierung und Reifung von Gewebe n.b. S differenziert, klein Kleegrasheu hoch (n.s. verringert, 0,2%) k.U. mehr Erhöht n.b. Kurzkettige FS: Fettneubildung langkettige FS: gesundheitlich vorteilhaft Nährstoff-fülle, schneller Wuchs, Energiegehalt hoch, Lactose-Synthase Nahrung und Wachstum n.b. S verwaschen, groß W= „mager“, KG = „üppig“ ja ja ja ja ja ja ja Weizen- Zufütterung k.U. Niedrig Niedrig k.U. Hoch Säuert schneller „extensiv“, Gesundheitlich vorteilhaft Abwehrreaktion, Regulations- und Transportfunktion (+ Stärke / Brennwert) Energie- Gewinnung, Lipidsynthese „Samen- typisch“ Kleine, „zusammengezogene“ Formen, differenziert Futterrüben- Zufütterung k.U. Hoch Hoch k.U. Gering Bleibt länger frisch (säuert nicht) „intensive Fütterung“ Eisentransport, Fettröpfchenbildung, Immunabwehr Keine Auffälligkeiten „Saftfutter- typisch“ Große, „ausladende“ Formen, verwaschen- auslaufend W= „mager“ FuR = „üppig“ ja Ja Ja (W=extensiv- typisch) ja z.T. z.T- ja ja Heu-Fütterung k.U. k.U. k.U. k.U. Etwas höher (202) – aber ausgeglichen. Säuert schneller / besser kurzkettige FS: de-novo-Synthese – wg. Struktur- Futter) n.b. n.b. k.U. F durchgestaltet, heller Silage - Fütterung k.U. k.U. k.U. k.U. Ausgeglichen er Säuert langsamer / weniger Mehr ALA, mehr C-18: aus Futter n.b. n.b. k.U. F zerlaufend, dunkler H = extensiv, „samentyp“ S = intensiv, „Saftfuttertyp” ja ja ja ja Horntragend k.U. k.U. k.U. k.U. k.U. k.U. mehr C-17aiso +LACB, Darmwand - IgG Freie AS – zur Nährung der Darmflora Nicht beurteilbar. k.U. Enthornt k.U. k.U. k.U. k.U. k.U. k.U. höher dosierte Schutzfunktion (antiviral) / Lumen-IgA Weniger FS- Synthese- Bausteine, weniger biochemisch aktivierte Substanzen Nicht beurteilbar k.U. Tab 130. Vergleich der Charakterisierungen der vier Probensätze mit den unterschiedlichen Methoden. AS = Aminosäuren, F = Fahnen, FS = Fettsäuren, k.U. = keine Unterschiede, n.b. = nicht bestimmt. Abschließende Diskussion 309 5.3. Zur Charakterisierung der Methodeneigenschaften Die verschiedenen Methoden konnten je Probensatz ähnliche Muster in der Veränderung von Merkmalen feststellen (s.a. MÜLLER 2008 zum Methodenvergleich und Charakterisierung der Methoden), und die inhaltliche Beschreibung (Charakterisierung) der Probeneigenschaften ist ebenfalls einheitlich und (soweit dies bei dem mehrfaktoriellen Bedingungen beurteilbar ist) ist ein logischer Zusammenhang mit der Fütterung festzustellen. Dass in diesen Methoden parallel die Probenunterschiede festzustellen waren heißt aber noch nicht, dass die eine Methode sich durch die andere ersetzten ließe („gleiche Aussage mit verschiedenen Methoden“), jedoch kann darin eine gewisse Bestätigung der Ergebnisse untereinander gesehen werden. Aus diesen Umständen heraus kann davon ausgegangen werden, dass die verschiedenen Methoden eine ähnliche Aussage zu treffen vermögen – jedoch sind die inhaltlichen Ergebnisse sehr unterschiedlich: Die F,E,L-Werte sind Gehaltsmengen, die einerseits eine Indikation zur Fütterungssituation und Tiergesundheit bieten, aber andererseits für die Meierei Hinweise auf die Produktausbeute und somit wirtschaftliche Aspekte geben. Ähnlich ist die Gärprobe in ihren Ergebnissen dazu geeignet, die Verkäsbarkeit / Gerinnungseigenschaften der Milch wiederzugeben, ohne aber genauer darauf einzugehen, ob das mit der mikrobiellen Besiedelung oder den Inhaltsstoffen zusammenhängt, aufgrund derer eine bessere Nahrungs- und Vermehrungsgrundlage für die Bakterien vorliegt. Auch scheint diese Methode im Versuch C zu deutlichen Ergebnissen hinsichtlich Fütterungseffekten zu führen, während die anderen Methoden nur geringe Futtereffekte feststellten, und in Versuch B nur geringe Futtereffekte aufzueigte. Es werden hier offensichtlich noch andere Aspekte der Probeneigenschaften dargestellt als mit den anderen Methoden. Das Fettsäuremuster war in der Darstellung von Effektintensitäten häufig ähnlich den proteomisch und metabolomisch erfaßten Effektintensitäten, und Futtereffekte waren deutlich wiederzufinden – Horneffekte jedoch kaum. Weil es ein gut untersuchter Parameter ist sind diese Ergebnisse im Zusammenhang der Tierphysiologie gut deutbar und Ergebnisse mit anderen vergleichbar. Und somit werden dann auch die proteomischen und metabolomischen Ergebnisse bestätigt, zusätzlich dazu, dass diese aufgrund ihrer Möglichkeit der Charakterisierung von Stoffwechselprozessen in direkten Bezug zu den Probenqualitäten gebracht werden können. Die wissenschaftliche Deutung der Ergebnisse erscheint mit Hilfe der Metabolomik, Proteomik und Lipodomik (Fettsäuremuster) am umfassendsten möglich. Mit der Metabolomik kann die unmittelbare Stoffwechsel-Situation wiedergegeben werden. Die Ergebnisse der Proteomik sind schwerer zu deuten, weil die Proteine vielfältigen Umbildungen im Prozeß des Abbaus unterliegen, die mehrere Funktionen aufweisen können. Die Fettsäuren sind als Hinweis der Fett-Synthese nützlich – sie spiegeln vor allem Abschließende Diskussion 310 die Fütterungssituation, geben aber nur einen Teil der gesamten Milch-Eigenschaften (Milch- Qualität) wieder. Die FAS versucht, die Proben nach dem Muster der „arttypischen Ausprägung von Eigenschaften“ zu beurteilen (STRUBE UND STOLZ 2004). Es war bei ausreichend deutlichen Probenunterschieden eine sichere Differenzierung incl. Beurteilung der Proben möglich (Versuch B), bei geringen Probenunterschieden wie bei Versuch C oder dem Thema „Hörner“ waren keine Effekte mehr meßbar. Der Ansatz bei der Steigbildmethode ist ähnlich der FAS, die „typische Ausprägung“ der Bildmerkmale (die aufgrund von Referenzen üblicherweise ermittelt wird) zur Grundlage der Qualitätsbeurteilung zu nutzen (GEIER UND FRITZ, o.J.). Im Zusammenhang mit Milch liegen jedoch noch kaum Referenzmaterialien vor, auf die man sich beziehen könnte. Diese hier untersuchten Proben können somit als Grundlage zur Referenzentwicklung genutzt werden. Es hängt nun von dem Ziel der Untersuchung und der gewünschten Aussage ab, welche der Methoden „am besten geeignet“ ist. Sollen einfach nur Probenunterschiede festgestellt werden, ist eine proteomische oder metabolomische Untersuchung nicht notwendig, solange die Unterschiede relativ deutlich sind und von unter Praxis-Bedingungen produktionsrelevanter Größe. Dann wären Fett- und Eiweißgehalt bzw. Milchmenge meistens ausreichend, wenngleich hier zu berücksichtigen ist, dass es deutliche tierinidviduelle Effekte gibt, denen z.B. durch Beprobung einer großen Anzahl von Tieren Rechnung getragen werden müsste. Die Steigbildmethode könnte auch feine Probenunterschiede aufzeigen, die sich im Fett- und Eiweißgehalt nicht direkt erfassen lassen und in etwa dem Präzisionsniveau der Protoemik oder Metabolomik zu entsprechen scheinen (bei relativ geringem Investitionsbedarf, wobei aber mindestens vier Bilder je Probe zum sicheren Differenzierungsnachweis erstellt werden sollten). Jedoch ist eine Interpretation der Ergebnisse nicht so tiefgehend mit Blick auf physiologische Vorgänge möglich wie mit den proteomischen und metabolomischen Untersuchungen. 5.4. Zur proteomischen und metabolomischen Markersuche Die proteomischen und metabolomischen Untersuchungen waren im Sinne einer „Markersuche“ angelegt: mit möglichst wenig (gepoolten) Proben sollten Substanzen ermittelt werden, die für die Qualitäten als „markant“ oder „typisch“ bezeichnet werden können und die Proben „markieren“ als zu der Qualität gehörend. Für die Fütterungssystemvergleiche ließ sich dies aufgrund des Cross-Over-Designs, das die tierindividuellen Effekte somit ausgleicht, gut durchführen: Die Proben von beiden Versuche (A und B) wiesen deutliche Futter-Effekte auf, begleitet von mehr oder weniger deutlichen Gruppen und Zeit-Effekten, und diese Futter-Effekte ließen sich interpretieren. Abschließende Diskussion 311 Bei den Proben zur Hörner-Thematik wurden Pool-Proben von zwei Betrieben zur Frage „enthornt“ untersucht, ergänzt duch zwei Proben eines weiteren Hofes. Es zeigen sich hier zwar Substanzen, die entsprechend des Hornstatus unterschiedlich konzentriert auftreten – im Abgleich mit den Steigbildergebnissen dieser 7 Poolproben muß jedoch einschränkend vermerkt werden, dass die Bilder der Horn-Proben (Hof-Fu = Hof 2, GuM 2. PrN und Hof-Ob = Hof 7, 2. und 3. PrN gepoolt) ein einheitliches Steigbild-Muster aufweisen (kleinere S, wenig g.B.) im Vergleich zu den Enthornt-Proben (größere S, viele g.B.). Und auch die Proben von Hof-Da = Hof 12, 1. und 2. PrN gepoolt) passen sich da ein: die metabolomisch den Ho+-Proben ähnliche „genet. Hornlos-Probe“ weist auch kleinere S / weniger g.B. auf (wie die Ho+-Bilder). Somit bestätigt sich in den Steigbild-Merkmalen dieser Proben die metabolomisch / proteomisch festgestellt Ähnlichkeit der Ho+ Proben mit den genetisch hornlosen, im Unterschied zu den Enthornt -Proben. Aber weil die Steigbilder über insgesamt 11 Höfe hinsichtlich dieses Merkmals keinen Zusammenhang mit dem Faktor „Horn“ zeigen, ist ungewiß, ob sich bei konträren Steigbild-Merkmalen (große S bei Ho+) die metabolomischen / proteomischen Effekte aufrechterhalten lassen. 5.5. Zum Carry-Over-Effekt in den Fütterungssystemvergleichen Bei Versuch A tritt aus proteomischer und metabolomischer Sicht ein deutlicher Cross-Over-Effekt auf. Bei Versuch B ist er geringer. Er ist in dem Sinne erklärbar, dass nach vorhergehender „neutraler“ Fütterung, in der beide Futtermittel verabreicht wurden, keine Einseitgkeiten vorhanden waren, und jedes Futter „futterspezifisch“ im Kuhorganismus zur Milchbildung eingesetzt werden konnte. In der zweiten Phase jedoch lag schon eine Einseitigkeit aufgrund der vorangegangenen Fütterung vor, und es hätte eines längeren Zeitraumes bedurft, bis die Einflüsse der vorhergenden Fütterung ausgeglichen wären bzw. hätte eine Übergangsfütterung (wiederum mit beiden Futtermitteln gleichzeitig) zu einer „Neutralisierung“ im Vorfeld der 2. Versuchsphase führen können, so dass wiederum beide Gruppen mit den gleichen Zugangsvoraussetzugen in die andere Fütterungssituations gegangen wären. Aufgrund der relativ geringen Zeiteffekte kann das vom jetzigen Wissensstand her als sinnvoll erscheinen – selbst wenn dadurch die Zeitspanne zwischen den Vergleichsmessungen größer wird. Literatur 312 6. 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Abbildungsverzeichnis Abb. 1: a) Steigbild aus verdünntem Möhrensaft, einige Bildmerkmale hervorgehoben (aus: ZALECKA 2006). b) Steigbild aus verdünnter Kuhmilch, einige Bildmerkmale hervorgehoben (aus: WOHLERS 2003). c) Steigbild aus Weizen-Extrakt (eigen). d) Steigbild aus Molke (eigen). ..........................................................................................29 Abb. 2: Grafische Darstellung des Labor-Ablaufs (mit Probennahme), ergänzt durch die wichtigsten prozeßspezifischen Faktoren und dem charakteristischen Klimaverlauf während der Bildererstellung. ........................................................................................58 Abb. 3: Labor-Grundriß und Einrichtung ............................................................................59 Abb. 4: Grundsätzliches Vorgehen bei der Bildauswertung. Die Zahlen 1 bis 9 weisen auf die entsprechenden Auswertungsschritte hin (siehe vorige Seite). ................................69 Abb. 5: Verwendetes Prüfformular zur Bildauswertung beim Triangeltest..........................74 Abb. 6: Kontingenztabellen für (oben) zwei Proben mit je vier Bildern (alle korrekt gruppiert, p=0,0286) bzw. vier Proben und je zwei Bildern (unten), hier jedoch wurden die Bilder von Gruppe 3 und 4 nicht korrekt gruppiert. ...................................................76 Abb. 7: Klima-Verlauf im Labor am 9.5.08, 12.6.08, 18.6.08 und 21.7.08. Meß-Ort: A = großer Tisch (zwischen den Papieren), B = kleiner Tisch (zwischen den Papieren). P1, P2, P3= Beginn der 1., 2. und 3. Phase.........................................................................91 Abb. 8: Lageplan ...............................................................................................................92 Abb. 9: Lageplan der Varianten und Wiederholungen, Position im Labor ..........................94 Abb. 10: Gruppierung von Bildern von zwei Proben, die an verschiedenen Positionen im Labor erstellt wurden.....................................................................................................99 Abb. 11: Grundsätzliche Gruppierung der Bilder aus den Klima-Variationen: ..............105 Abb. 12: Bildmerkmale, nach denen sich die Bilder der 6 Klima-Varianten und div. Proben-Qualitäten gruppieren lassen. Es war unbekannt, wieviele Bilder je Variante vorhanden waren (zwischen 2 und 4). Die grundsätzlichen Bildtypen sind grau hinterlegt. 106 Abb. 13: Bildererstellungsdatum und Proben-Qualitäten der gruppierten Bilder, gleiche Anordnung wie in Abb. 12: mit den Bildmerkmalen dieser Gruppen. Farbige Markierung der Gruppierung nach Klima-Variante. Subgruppen mit ähnlichen Bildmerkmalen sind nebeneinander / übereinander dargestellt, in Abgrenzung zu den anderen Subgruppen. Anhang 323 Jedes Kästchen enstpricht einer Subgruppe mit ähnlichen Bildmerkmalen, in der Vermutung, dass es wiederholte Bilder einer Probe seien...........................................107 Abb. 14: Klimaverlauf (°C und % r.F.) an den Versuchstagen zur Klima-Variation, Aufzeichnungs-Intervall: 5min......................................................................................110 Abb. 15: Gruppierung der Bildererstellungstage nach Klima-Variante und Ergänzung der Gruppe, in die das H-Milch-Standard-Bild dieses Tages einsortiert wurde...................113 Abb. 16: Luftdruck an der Wetterstation „Witzenhausen/Wald“ je Tag in hPa..............115 Abb. 17: Grafische Darstellung des Versuchsaufbaus.................................................133 Abb. 18: Gruppierung der Bilder nach Bildmerkmalen, Bild-Nr. in rot ..........................134 Abb. 19: Gruppierung der Bilder nach Versuchsvarianten und Ermittlung von Bildmerkmalen – Bild-Nr. in rot, Besonderheiten farbig hinterlegt ................................135 Abb. 20: Vorgenommene Gruppierungen der Bilder zum Thema „Wirtschaftsstile“ und Unwahrscheinlichkeit der beobachteten Häufigkeitsverteilung (Fischer’s exakter Test, zweiseitig). (*): zugrundegelegte Häufigkeitstabelle siehe Abb. 6: unten. ....................197 Abb. 21: PCA über die relativen Abundanzänderungen der 21 Proteine für die vier Proben des Fütterungssystemvergleiches A. Farbig (rot/grün) markiert sind die Futter- Varianten, der graue / schwarze Punkt darinnen markiert den PrN-Zeitpunkt. G1 = Gruppe 1(„R“), G2 = Gruppe 2 („L“). ............................................................................205 Abb. 22: PCA über 135 Metabolite für die vier Proben aus dem Fütterungssystemvergleich A. Farbig (rot/grün) markiert sind die Futter-Varianten, der graue / schwarze Punkt darinnen markiert den PrN-Zeitpunkt. G1 = Gruppe 1(„R“), G2 = Gruppe 2 („L“). ............................................................................................................206 Abb. 23: PCA für die 21 Proteine von Fütterungssystemvergleich B. ..........................227 Abb. 24: PCA für die 124 Metabolite der vier Proben aus dem Fütterungssystemvergleich B (Weizen vs. Futterrüben)...............................................229 Abb. 25: Die Messgrößen R40hr (links) und R40w (rechts) für die Varianten Futterrüben und Weizen (n=4)........................................................................................................230 Abb. 26: Die Messgrößen R40w und R40hr für die Varianten Futterrüben und Weizen (n=4). 230 Abb. 27: links: Poolproben – Mittlerer pH-Wert der Gärproben je PrN-Termin und Fütterungsvariante (n=2 bis 3 je Probe). Rechts: Einzeltierproben-Ergebnisse der Gärprobe (n=11 je Säule), parallel zu den Mischproben untersucht. Federbalken geben Standardabweichung der Werte an. ............................................................................245 Abb. 28: Die Messgröße R80gr für die Variable Fütterung (H=Heu, S=Silage). Die unbekannten Proben wurden mit ihren Code-Bezeichnungen angegeben (gelb hinterlegt: Eingangsdatum des jeweiligen Probenpaares). ..........................................249 Anhang 324 Abb. 29: Die Messgröße R80w für die Variable Fütterung (H=Heu, S=Silage). Die Proben nach dem Fütterungs-Crossover (P 39xx) weichen von sämtlichen anderen Daten deutlich ab. .......................................................................................................250 Abb. 30: Die Messgröße R80hr für alle Messwiederholungen für die 8 Proben. ..........250 Abb. 31: Links: Alterunterschied zwischen den zwei Proben-Gruppen je Hof ..............265 Rechts: Milchleistungs-Unterschied je Hof..........................................................................265 Abb. 32: C-17aiso und CLA-11t,13c je Hof, in Abhängigkeit vom Hornstatus ..............268 Abb. 33: Summe SCT und CLA-9c,11t je Hof, in Abhängigkeit vom Hornstatus..........268 Abb. 34: PCA über ausgewählte 18 Proteine der sieben Proben zur Thematik „Horn“. 271 Abb. 35: Hierarchisch geclusterte Heatmap (Person Correlation) der logarithmierten relativen Abweichungen der Abundanzmittelwerte der einzelnen Proteine über 18 Proteine der sieben Proben zum Thema „Hörner“ .......................................................273 Abb. 36: PCA über 120 annotierte Metabolite der 7 Proben zur Thematik „Hörner“. Rot umrandet: die Ho+-Proben (horntragend), je Hof eine Farbe.......................................279 Abb. 37: PCA über 61 annotierte und horn-korrelierte (p<0,2) Metabolite von 5 Proben zur Thematik „Hörner“. Rot umrandet: die Ho+-Proben (horntragend). Links: PC1 vs. PC2, rechts: PC1 vs. PC3 ...........................................................................................279 Abb. 38: Heatmap über 47 Metabolite, die einen Zusammenhang zum Faktor „Horn“ aufweisen. Log2-transformierte, mittelwertnormalisierte Werte (je Herde an gemeinsamen Mittelwert angeglichen, so dass Hörnereffekte deutlich werden), geclustert (euklidische Distanz). ..................................................................................280 Abb. 39: Die Messgröße Mw10/R40gr für die Varianten enthornt und horntragend, Vergleichsproben von 10 Höfen, z.T. doppelt beprobt. ................................................281 Abb. 40: Messwiederholungen der Messgröße Mw10/R40gr (links) und Chi Eh12r (rechts) für die Varianten enthornt und horntragend. ...................................................282 Abb. 41: Meßwert „MW10/R40gr“ und „Chi Eh12r“ für die zwei Varianten Horn vs. Enthornt je Hof. Boxplot und Mittelwertvergleich je Hof. ..............................................282 Abb. 42: Einfaktorielle Analyse für MW1hr und MW1dr nach Hornstatus sowie Klassenbildung (Student’s t-Test) (Datengrundlage: 2 PrN, je mehrere Meßwiederholungen)...................................................................................................283 Abb. 43: Einfaktorielle Analyse von Mw10/R40gr nach Hornstatus, sowie Klassenbildung (Student’s t-Test). (Datengrundlage: 2 PrN, je mehrere Meßwiederholungen).............283 Anhang 325 7.2. Tabellen-Verzeichnis Tab 1. Prüfverfahren, die (nach Anpassung) zur Auswertung von Steigbildern geeignet erscheinen. Auszug aus amtlicher Sammlung § 64 LFBG (2005)..................................27 Tab 2. Übersicht über die durchgeführten Fütterungssystemvergleiche und angewendeten Vergleichsrationen.........................................................................................................33 Tab 3. Gruppenzusammensetzung (Alter in Laktationen, Laktationsphase, Milchleistung in kg/Tag, Fett %, Eiweiß %, Harnstoff in ppm, Zellzahl in Tsd.). Mittlere Werte je Fütterungs-Gruppe und Streuung der Werte (± Standardabweichung), am 30.10.07 (MLP) ............................................................................................................................34 Tab 4. Übersicht über die Fütterungsvarianten je Versuchsphase und Gruppe. ...............34 Tab 5. Analyseergebnisse der verwendeten Futtermittel im Versuch A: „Wiesenheu vs. Kleegrasheu“, je kg TM .................................................................................................35 Tab 6. Theoretische Zusammenstellung der Rationen und daraus ermittelte Werte der Rationen für den Fütterungssystemvergleich A „Wiesenheu vs. Kleegrasheu“. Den Beobachtungen zufolge fraßen die Kühe die Kleegrasration lieber – und nahmen somit vermutlich mehr Futter auf als die Vergleichsgruppe mit Wiesenheu.............................36 Tab 7. Probenzusammenstellung und angewandte Methoden bei Fütterungssystemvergleich A (Wiesenheu vs. Kleegrasheu) .........................................37 Tab 8. Gruppenzusammensetzung (Alter, Laktationsstadium, Milchleistung, Fett- und Eiweißgehalt, Zellzahl, Harnstoff), Mittelwerte der Gruppen und Streuung der Werte (±Standardabweichung). ...............................................................................................38 Tab 9. Fütterungsvarianten der Gruppen je Füttterungsperiode. ......................................38 Tab 10. Theoretische Zusammenstellung der Rationen und daraus ermittelte Werte der Rationen für den Fütterungssystemvergleich B „Weizen vs. Futterrüben“. Auffällige Werte fett.......................................................................................................................39 Tab 11. Futteranalysenwerte der einzelnen Futtermittel vom Fütterungssystemvergleich „Weizen vs. Futterrüben“ (bezogen auf TM) ..................................................................39 Tab 12. Probenzusammenstellung und angewandte Methoden bei Versuch B (Futterrüben vs. Weizen) ...............................................................................................40 Tab 13. Gruppenzusammensetzung (Alter, Laktationsphase, Milchleistung, Fett, Eiweiß, Harnstoff, ZZ). Mittlere Werte je Gruppe ± Standardabweichung am 8.2.09 (MLP). H=Heu, S=Silage...............................................................................................41 Tab 14. Fütterungsvariante je Gruppe und Fütterungsperiode für Versuch C...............41 Tab 15. Proben-Zusammenstellung und angewandte Methoden bei Versuch C (Wiesenheu vs. Silage)..................................................................................................42 Anhang 326 Tab 16. Analysewerte der verwendeten Futtermittel im Fütterungssystemvergleich C: „Wiesenheu vs. Silage“, je kg TM. GS=Grassilage ........................................................43 Tab 17. Angewandte Methoden bei den Proben zur Thematik “Horn”. + ET = zusätzlich Einzeltierproben untersucht. Für die proteomischen / metabolomischen Untersuchungen wurden nicht alle drei Wiederholungsproben untersucht. Bei Hof 2 wurde die Probe vom 17.6. (GuM) analysiert, für Hof 7 die Poolproben vom 12. und 19.7. gepoolt, und von Hof 12 die Poolproben vom 3. und 12.7. ..............................................................................46 * Auf Hof 12 wurden die Gruppen „Enthornt“ mit „genetisch Hornlos“ verglichen. Im Methodenvergleich werden diese Proben nicht weiter verwendet, jedoch dienen sie bei den proteomischen und metabolomischen Untersuchungen als weitere Vergleichsproben. Nähere Angaben zu Probenmaterial und Ergebnissen im Anhang...46 - Anwendung der „einfach beschreibenden Prüfung“ bei z.B. Tab 71 und Tab 72 oder „Anhang B, Versuch A: Bonitur der Steigbilder“ und „Anhang D, PrN A“........................69 - Anwendung der „Profilprüfung“ mit Bonitur der Merkmalsausprägungs-Intensitäten, z.B. bei Standardbildern in Kapitel 3.3.2.4, Kapitel 3.6.2 oder Anhang A, S.12.....................69 Tab 18. Auswerteverfahren je Themenbereich.............................................................70 Tab 19. Liste der Kriterien, die bei der visuellen Bildauswertung (z.B. „einfach beschreibende Prüfung“) verwendet werden können. Übernommen von ZALECKA 2006, S. 48, Tab.4, und ergänzt (in rot) im Hinblick auf Milchproben-Bilder.............................72 Tab 20. Klassifizierungs-Merkmale für die Bilder aus dem Fütterungssystemvergleich C: „Wiesenheu vs. Silage“ .............................................................................................80 Tab 21. Klassifizierungsmerkmale „Horn“ (SZ-Merkmale) ............................................81 Tab 22. Bildmerkmale, die fütterungsspezifisch auftreten ............................................83 Tab 23. Klassifizierungsmerkmale für den Faktor „horntragend vs. enthornt“, als Ersatz für „bio-dynamisch vs. konventionell“ bei den Proben zum Wirtschaftsstil .....................83 Tab 24. Auflistung der möglichen Einflußfaktoren auf die Bildmerkmals-Ausprägung / das Ergebnis bei Milchsteigbildern – nach ihrem zeitlichen Auftreten sortiert ................85 Tab 25. Thematische Gruppierung der Faktoren, die einen Einfluß auf die Bildmerkmals-Ausprägung von Milchsteigbildern bzw. das Ergebnis der Untersuchung haben können. ..............................................................................................................86 Tab 26. Ergebnis der Gruppierung der Bilder...............................................................93 Tab 27. Gruppierung und unterscheidende Merkmale der Bilder .................................95 Tab 28. Ergebnis der Gruppierung nach Bildmerkmalen. .............................................99 Tab 29. Unterscheidende Bildmerkmale ....................................................................100 Tab 30. Gruppierung der Bilder nach Bildmerkmalen.................................................100 Anhang 327 Tab 31. Versuchsplan zur Klima-Variation, mit Angabe der je Tag untersuchten Proben. DFH, LW, SB = verschiedene Probenherkünfte / Höfe. d= day (Tage nach dem Melken). 104 Tab 32. Übersicht über die untersuchten Klimavarianten, verwendeten Probenqualitäten und Klima-charakteristischen Bildmerkmale, die sich aus der obigen Gruppierung ablesen lassen. Siehe dazu auch SB-Abb-7-Klima-Uebersicht. ..............108 Tab 33. Korrelationen zwischen Klima-Bedingungen (im Labor und Außenklima) und Bildmerkmalen der Standardbilder (UHT-Milch und a.d.).............................................122 Tab 34. Merkmals-Veränderungen bei langer Trocknungszeit nach P2 .....................123 Tab 35. Ergebnis der Gruppierung / Reihung.............................................................127 Tab 36. Streuung der Bildmerkmale innerhalb der Varianten .....................................128 Tab 37. Korrelation in Excel, Minuten Standzeit vs. S, g.B. ........................................128 Tab 38. Gruppierung der Bilder und Vermerk zu den unterscheidenden Merkmalen..130 Tab 39. Unterscheidende Merkmale bei zwei Proben in gealterter und frischer Vorverdünnung............................................................................................................130 Tab 40. Gruppierung / Reihung der Bilder, und Bildmerkmale....................................137 Tab 41. PH-Wert der Eisensulfat-Lösungen...............................................................140 Tab 42. Gruppierung der Bilder nach Bildmerkmalen.................................................140 Tab 43. Zusammenstellung der Gruppierung mit der Versuchsvariante .....................141 Tab 44. PH-Wert der Eisensulfat-Lösungen: ..............................................................142 Tab 45. Gruppierung der Bilder nach Bildmerkmalen.................................................142 Tab 46. PH-Wert der Eisensulfat-Lösungen: ..............................................................144 Tab 47. Gruppierung der Bilder nach Bildmerkmalen (T = Tage, Wo=Woche, Fe=Eisen) 144 Tab 48. Unterscheidende Bildmerkmale je Variante...................................................145 Tab 49. pH-Wert der Ag-Lösung ................................................................................146 Tab 50. Zusammenstellung der Gruppierung mit der Versuchsvariante .....................147 Tab 51. PH-Wert der Ag-Lösung...............................................................................148 Tab 52. Zusammenstellung der Ergebnisse mit der Versuchsvariante .......................148 Tab 53. Gruppierung der Bilder von zwei Höfen, bei Bildern wiederholter PrN von verschiedenen Tagen..................................................................................................153 Tab 54. Gruppierung der Bilder von Hof D nach Bildmerkmalen ................................155 Tab 55. “Bonitur Schalengröße an repräsentativen Bildern” sowie Alter der Probe in Tagen 161 Anhang 328 Tab 56. Proben-Varianten und Temperatur der Proben beim Erstellen der Vorverdünnung:...........................................................................................................162 Tab 57. Ausgewählte, unterscheidende Merkmale., vergleiche dazu SB-Abb-13- Abkühlung-070802 ......................................................................................................163 Tab 58. Auffällige unterscheidende Merkmale bei der Reihung. (Sg = Srand gelöst, GrS = Grauer Schleier, Sr = Schalenrand, b+g = braun und grün)......................................164 Tab 59. Bonitur der in SB-Abb-14-Abkühlung-090401 dargestellten Bilder. ..............165 Tab 60. Unterscheidende Bildmerkmale (s.a. SB-Abb-14-Abkühlung-090401) ..........167 Tab 61. Gruppierung von Bildern von zwei Proben, unterschiedliche Temperierungs- Varianten (Bilder vom 17.12.07). .................................................................................170 Tab 62. Probenspezifische Gruppierung nach Merkmalen der Fahnenzone („Bewegung der Fahnenform“) ........................................................................................................171 Tab 63. Gruppierung der Bilder von zwei Proben und verschiedenen Temperierungs- Varianten. Bilder vom 18.12.07, s.a. SB-Abb-15-Temperierung-Übersicht-071218 und Tab 66 (Bildmerkmale „Unbehandelt“ und „–18°C“ im Vergleich). ...............................171 Tab 64. Gruppierung nach der Methode 1) (offensichtliche Merkmale) ......................172 Tab 65. Gruppierung nach Methode 2) (Sockelzone und „Charakter“ der Formen) ....172 Tab 66. Unterschiede zwischen „unbehandelt“ und „-18°C“ (18.12.07) (siehe auch SB- Abb-15-Temperierung-Übersicht-071218) ...................................................................173 Tab 67. Proben-spezifische Merkmale bei unterschiedlicher Temperierung...............173 Tab 68. Unterscheidende Bildmerkmale ....................................................................176 Tab 69. Einfluß der Erhitzung der Proben (per Mikrowelle) auf die Bildmerkmals- Ausprägung von zwei Milchproben..............................................................................176 Tab 70. Unterschiede in den Bildmerkmalen von Rahm / entrahmte Milch / Rohmilch (je Bild 0,075ml Substanz. Bilder vom 18.4.08, Proben 2 Tage gealtert) ..........................178 Tab 71. Bonitur von Rahm- und Milch-Bildern verschiedener Konzentrationsstufen (1 = 0,075 ml Probe je Bild, 2 = 0,05 ml Probe je Bild)........................................................181 Tab 72. Bonitur von Rohmilchbildern und Bilder von entrahmter Milch. (Entrahmte Milch: 1)=0,1ml 2)= 0,75ml 3)=0,05ml, Rohmilch (gesamte Milch): 1)=0,075ml 2)=0,06ml 3)=0,05ml. Zum Vergleich eignen sich v.a. die in beiden Varianten angefertigten Verdünnungen 0,05ml und 0,075ml. Die anderen beiden Bilder sind zur Verdeutlichung der Bildentwicklung innerhalb der Variante bei unterschiedlichen Konzentrationen gedacht (Konzentrationseffekt).) .......................................................183 Tab 73. Beurteilung der Einflußintensität der untersuchten Faktoren auf die Bildmerkmals-Ausprägung (Teil 1) ..............................................................................186 Tab 74. Beurteilung der Einflußintensität der untersuchten Faktoren auf die Bildmerkmals-Ausprägung (Teil 2) ..............................................................................187 Anhang 329 Tab 75. Mittelwert und Streuung von drei Bildmerkmalen, bonitiert an 2x2Bildern, in zwei Verdünnungsstufen, jede separat. Unterschiedliche Buchstaben je Zeile weisen auf signifikant unterschiedliche Ausprägungsintensität......................................................191 Tab 76. Charakterisierung und Klassifizierung nach frei gewählten Merkmalen .........192 Tab 77. Reihung und Gruppierung der 16 Bilder vom 26.2.08 aus R1 mit 0,075ml Milch / Bild 194 Tab 78. Gruppierung der Bilder vom 26.2.08 (Auswertung am 30.10.08, zwei Konzentrationsstufen gemeinsam) ..............................................................................195 Tab 79. Mittlere Milchleistung je Kuh und Abendgemelk (n=94) mit Signifikanzniveau für die drei im Modell berücksichtigten Effekte Fütterung, Kuh (Tier-Effekt) und Probenahme-Termin (PrN-Effekt) bei Fütterungssystemvergleich A............................201 Tab 80. Mittlere Werte und Signifikanzniveau für Fett, Eiweiß, Lactose, Harnstoff und Zellzahl bei Wiesen- bzw. Kleegrasheu-Fütterung (n=32, Werte der 8 Kleingruppen von vier PrN). .....................................................................................................................201 Tab 81. Einige Summenparamter der Fettsäuren der Milchproben aus dem Fütterungssystemvergleich „Kleegras- vs. Wiesen-Heu“ (Versuch A, n=8). Mittlere Fettsäure-Gehalte je Fütterungsvariante und Signifikanzniveau für Futter-, Gruppen- und Zeiteffekt sowie gesamtes Modell. Orange markiert: p<0,05, gelb markiert: p <0,1 .....202 Tab 82. Fettsäuremuster der 8 Milchproben aus dem Fütterungssystemvergleich A. Mittlere Fettsäuren -Gehalte je Fütterungsvariante und Signifikanzniveau für Futter-, Gruppen- und Zeiteffekt sowie gesamtes Modell. Orange markiert: p<0,05, gelb markiert: p <0,1 ...........................................................................................................203 Tab 83. Mittlere Werte der Protein-Abundanzen (in % der gesamten Messungen) je Fütterungsvariante, Zunahmefaktor, sowie Signifikanzniveau des t-Tests (zweiseitig, ungepaart) für die Faktoren Futter, Gruppe und PrN (Zeit) an mittelwertnormalisierten, log2-transformierten Daten, und Loading der PC1 aus der PCA für Futtereffekte in %. Vom Futter offensichtlich beeinflußte Proteine (p<0,2) sowie deutliche Gruppen- und Zeiteffekte (visuelle Beurteilung der Lage der Werte) farbig hervorgehoben, jeweils höhere Werte fett gedruckt. */**=ein bzw. zwei Fehlwerte (NA). ..................................205 Tab 84. Metabolite der vier Proben aus dem Fütterungssystemvergleich A, die im ungepaarten T-Test mit p<0,1 signifikante Futtereffekte aufweisen. Mittlere Werte je Fütterungsvariante, mit Zunahmefaktor, Signifikanzniveau für die Effekte Futter, Gruppe und Zeit, und Loading der PC1 aus der PCA für Futtereffekte in %. * / ** = ein bzw. zwei Fehlwerte, die für die PCA ersetzt wurden. NA = Fehlwert (nicht meßbar). Farbig markiert: Substanzen mit hohen Zunahmefaktoren (>2,0). ..........................................207 Tab 85. Steigbildergebnisse (Gruppierung und Charakterisierung) zum Fütterungssystemvergleich A ......................................................................................209 Anhang 330 Tab 86. Übersicht der vorgenommenen Gruppierung und der Zuordnung der Proben zueinander (Fütterungssystemvergleich A), incl. Decodierung in Rot, und Beurteilung des Gruppierungserfolges / Zuordnungserfolges. ........................................................210 Tab 87. Bildmerkmale, die im Zusammenhang mit der Gruppe auftreten...................211 Tab 88. Bildmerkmale, die im Zusammenhang mit der Fütterung auftreten................211 Tab 89. Vergleich der Differenzierungsfähigkeit der verschiedenen Methoden für Fütterungssystemvergleich A ......................................................................................219 Tab 90. Charakterisierung der Proben aus Fütterungssystemvergleich A mit verschiedenen Methoden – Übersicht .........................................................................220 Tab 91. Mittlere Werte der Haupt-Milchinhaltsstoffe und Milchleistung je Fütterung und Signifikanzniveau für Futter-, PrN- und Einzeltier-Effekte (n=56). Orange markiert: p<0,05. 221 Tab 92. pH-Wert der Gärproben der 2. und 3. PrN bei 20° und 37° - Mittelwerte und Signifikanzniveau. .......................................................................................................222 Tab 93. Fettsäuremuster der Poolproben aus dem Fütterungssystemvergleich B „Futterrüben vs. Weizen“ von C-11:0 bis C-19:0 (Teil A, Fortsetzung nächste Seite) ..225 Tab 94. Fettsäuremuster der Poolproben aus dem Fütterungssystemvergleich B „Futterrüben vs. Weizen“ - einige summarische Werte, incl. Signifikanzniveau für die drei Faktoren Futter, Gruppe und PrN, sowie zum gesamten Modell. Fett gedruckt sind die jeweils höheren Werte, orange hinterlegt diejenigen, die vorrangig Futtereffekte aufweisen (p<0,05), gelb hinterlegt sind weitere mit p<0,1 signifikante Effekte............225 Tab 95. Mittlere Protein-Abundanzen (relative Häufigkeiten) in der Milch für die Fütterungsvarianten Weizen vs. Futterrüben (Versuch B), sowie t-Test (ungepaart) für die Effekte Futter, Gruppe und Zeit (PrN). Zunahmefaktoren (Futterrüben-Werte / W- Werte bzw. andersherum). Farbig hervorgehoben die „deutlichen“ Effekte: bei Zunahmefaktor > 1,3 und Futter-p<0,3, bzw. selektierte Gruppen- / Zeiteffekte. .........227 Tab 96. Metabolite der Proben aus dem Fütterungssystemvergleich B, die im gepaarten bzw. Ungepaarten T-test signifikante (p<0,1) Futtereffekte aufweisen. Mittlere Werte, Zunahmefaktoren, Signifikanzniveau für die drei Effekte Futter, Gruppe und Zeit, sowie Loadings für PC1 (Futtereffekt). Metabolite mit Zunahmefaktor >1,5 hervorgehoben. .229 Tab 97. Steigbilder vom 23.2.08. Gruppierung, Bild-Charakteristik und Decodierung (Proben-Code, Proben-Qualität)..................................................................................231 Tab 98. Steigbilder vom 26.2.08. Gruppierung, Bild-Charakteristik und Decodierung (Proben-Code, Proben-Qualität)..................................................................................232 Tab 99. Steigbilder vom 13.3.08. Gruppierung, Bild-Charakteristik und Decodierung (Proben-Code, Proben-Qualität)..................................................................................232 Tab 100. Steigbilder vom 19.3.08. Gruppierung, Bild-Charakteristik und Decodierung (Proben-Code, Proben-Qualität)..................................................................................232 Anhang 331 Tab 101. Zuordnung der wiederholten PrN zueinander (aufgrund der fett gedruckten Proben-Bilder) und Decodierung der Gruppenzugehörigkeiten....................................233 Tab 102. Bildmerkmale, die gruppenspezifisch auftreten .............................................234 Tab 103. Bildmerkmale, die mit der Fütterung die Gruppen wechseln..........................234 Tab 104. Vergleich der Ergebnisse verschiedener Methoden untereinander (Fütterungssystemvergleich B) ....................................................................................241 Tab 105. Charakterisierung der Proben aus Fütterungssystemvergleich B mit verschiedenen Methoden – Übersicht .........................................................................242 Tab 106. Mittlere Werte von Milchleistung (Abendgemelk), Fett, Eiweiß, Lactose usw. und Siginfikanzniveau für die Effekte Futter, PrN und Einzeltier der Regressionsanalyse, sowie für das gesamte Modell für Fütterungssystemvergleich C. ................................244 Tab 107. pH-Werte der Gärprobe von den Poolproben aus dem Fütterungssystemvergleich C „Wiesenheu vs. Silage“.- Mittelwerte und Signifikanzniveau (sowie r²) für das gesamte Modell und die einzelnen Effekte Futter, Gruppe und PrN. .........................................................................................................245 Tab 108. Fettsäuremuster der Proben aus dem Fütterungssystemvergleich C „Wiesenheu vs. Silage“. Mittelwerte der Poolproben von 2. und 4. PrN sowie Signifikanz- Niveau der drei Effekte „Futter“, „Gruppe“ und „Zeit“ (zweiseitiger gepaarter t-Test je Effekt). Futter-spezifisch auftretende Fettsäuren und p-Werte <0,05 sind orange hinterlegt, p-Werte <0,1 sind gelb hinterlegt. ...............................................................248 Tab 109. Unterscheidende Bildmerkmale und Bild-Eigenschaften der Bilder vom 23.2. und 25.2.09 (1. PrN, Fütterungssystemvergleich C) ....................................................251 Tab 110. Unterscheidende Bildmerkmale und Bild-Eigenschaften der Bilder vom 2.3.09 und 4.3.09 (2. PrN, Fütterungssystemvergleich C) ......................................................252 Tab 111. Unterscheidende Bildmerkmale und Bild-Eigenschaften der Bilder vom 16.3.09 (3. PrN Fütterungssystemvergleich C).........................................................................252 Tab 112. Unterscheidende Bildmerkmale und Bild-Eigenschaften der Bilder vom 23.3.09 (4. PrN Fütterungssystemvergleich C).........................................................................253 Tab 113. Übersicht der vorgenommenen Gruppierung, der Zuordnung der Proben zueinander sowie der vermutlichen Fütterungsgruppen, incl. Decodierung (in rot). Es ist jeweils die Probennummer angegeben. Die grau hinterlegten Bilder werden im weiteren als „Variante B“ bezeichnet, die anderen als „Variante A“ – um auf diese Weise Effekte der Tiergruppe von Effekten der Fütterungsvarianten trennen zu können. ................254 Tab 114. Bildmerkmale, die gruppenspezifisch auftreten .............................................255 Tab 115. Bildmerkmale, die mit der Fütterung die Gruppen wechseln..........................255 Tab 116. Vergleich der Ergebnisse verschiedener Methoden untereinander (Fütterungssystemvergleich C)....................................................................................262 Anhang 332 Tab 117. Charakterisierung der Proben aus Fütterungssystemvergleich C mit verschiedenen die Proben unterscheidenden Methoden – Übersicht ..........................263 Tab 118. Alters- und Milchleistungseffekt je Hof im Vergleich der Proben H / Eh. Offensichtliche Effekte farbig hervorgehoben. .............................................................264 Tab 119. Mittelwerte für Milchleistung, Fett, Eiweiß, Lactose, Harnstoff, Zellzahl, pH-Wert und Gefrierpunkt der Proben zur Fragestellung „Horn“, sowie Signifikanzniveau für die evtl. die Werte beeinflussenden Faktoren (n=68 Datensätze)......................................266 Tab 120. Für Fettsäure-Muster-Analyse verwendete Proben .......................................266 Tab 121. Fettsäuremuster der Proben zur Thematik „Horn“ – im gepaarten Design. p- Werte des ges. Modells alle höchstsignifikant (p<0,001) .............................................270 Tab 122. Mittlere Protein-Abundanzen, Enthornungs-quotienten und t-Test für die Faktoren „Hornstatus“ und „Hof“. Blau-kursiv: imputierte Werte; fett gedruckt: Werte >1,0 (Zunahme für Ho+); dunkelpink hinterlegt: deutliche Effekte; * Werte aus Herde Ob (als Kalb enthornt) und Fu (als Kuh enthornt).....................................................................274 Tab 123. Metabolitwerte (13C-normalisiert) der sieben Proben zum Thema „Horn“, Zunahmefaktoren, t-Test und PC1-loadings über die Metabolite, die für Herde-Ob oder – Fu im T-Test signifikant (p<0,2) unterschiedliche Konzentrationen von Metaboliten im Zusammenhang mit dem Faktor „Horn“ aufweisen. Rosa markiert: auffällige Effekte, gelb markiert: gegenläufige Intensitäten. Reihenfolge entsprechend der Heatmap......278 Tab 124. Signifikanzniveau der Meßwerte MW10/R40gr und Chi EH12r bei Berücksichtigung der drei Faktoren Horn, Hof und Meßtag im Modell .........................281 Tab 125. Gruppierung und Klassifizierung der Steigbilder zur Thematik „Horn“ ...........286 Tab 126. Vergleich der Ergebnisse verschiedener Methoden untereinander (Thematik „Hörner“)298 Tab 127. Charakterisierung mit den die Proben differenzierenden Methoden ..............299 Tab 128. Vergleich der Ergebnisse zur Differenzierungs- bzw. Gruppierungs-fähigkeit der Methoden. Grün = Effekte meßbar, lila = Effekte sehr gering meßbar, Tendenzen, rot = Effekte nicht meßbar, * = beispielhaft an zwei von 11 Höfen ...............................305 Tab 129. Vergleich der Methoden: Effekt-Intensitäten. * = beispielhaft an 2 von 11 Höfen 305 Tab 130. Vergleich der Charakterisierungen der vier Probensätze mit den unterschiedlichen Methoden. AS = Aminosäuren, F = Fahnen, FS = Fettsäuren, k.U. = keine Unterschiede, n.b. = nicht bestimmt. ..................................................................308 Anhang 333 7.3. Abkürzungsverzeichnis a.d. = aqua destillata (destilliertes Wasser) Abb. = Abbildung Ag = Silber (-nitrat) bio.-dyn. = biologisch-dynamisch bzw. = beziehungsweise CLA = conjugated linoleic acid d = day (Tag) d.h. = das heißt Decod = Decodierung Diff = Differenzierung DL = Doppellinie (SB-Merkmal) F = Fahnen (SB-Merkmal) F, E, L = Fett, Eiweiß, Lactose (Milchinhaltsstoffe) F,E,L = Fett, Eiweiß, Lactose (Gehalte in der Milch, in %) FAS = Fluoreszenz-Anregungs-Spektroskopie (umgangssprachlich "Biophotonen") Fe = Eisen (-sulfat) FS = Fettsäure FuR = Futterrüben FZ = Fahnenzone (SB-Merkmal) g.B. = grüne, undifferenzierte Bereiche in der SZ (SB-Merkmal) gB = grüne undifferenzierte Bereiche in der SZ (SB-Merkmal) grS = grauer Schleier unter S-Rand (SB-Merkmal) GS = Grassilage GuM = Gutes Misch h = Stunde i.e.S. = im engeren Sinne incl. = inclusive kg = Kilogramm KG = Kleegras konv. = konventionell Anhang 334 l = liter Lakt.-Tage = Laktationstage (day in milk) LaSt = Laktationsstadium MCT = medium chain fatty acids (mittellangkettige Fettsäuren), C-10 bis C-14 MJ = Megajoule MLP = Milchleistungsprüfung MNEL = Netto Energie Laktation MUFA = mono unsaturated fatty acid (einfach ungesättigte Fettsäuren) n-3 = Omega-3-Fettsäuren NIRS = Nah-Infra-Rot-Spektroskopie NXP = nutzbares Rohprotein P1, P2, P3 = Phase 1, Phase 2, Phase 3 (SB-Methode) PCA = Principal Component Analysis (Hauptkomponentan-Analyse) PCA = Principal conponent analysis pH = pH-Wert PrN = Probennahme PUFA = poly unsaturated fatty acids (mehrfach ungesättigte Fettsäuren) r.F. = relative Luftfeuchte R1, R2, R3 usw. = Reihe 1, 2, 3 (SB-Methode, Platz auf dem Tisch bei der Bildererstellung) RNB = Ruminale Stickstoff Bilanz S = Schale (SB-Merkmal) s.a. = siehe auch s.o. = siehe oben SB = Steigbild (-Methode) SCT = Short chain fatty acids (kurzkettige Fettsäuren), C-4 bis C-8 SFA = saturated fatty acids (gesättigte Fettsäuren) Sil. = Silage SW = Strukturwert SZ = Schalenzone (SB-Merkmal) T = Trockenmasse Tab. = Tabelle Anhang 335 Tsd. = Tausend u.a. = unter anderem u.U. = unter Umständen UHT = Ultra hoch erhitzt (H-Milch) usw. = und so weiter v.a. = vor allem V1, V2, V3 = Versuch 1, 2, 3 verw. = verwaschen (SB-Merkmal), d.h ohne Kontur. Farbverläufe, Übergänge vs. = versus W = Wiese (bei Versuch A) bzw. Weizen (bei Versuch B) Wdh. = Wiederholt(e), Wiederholung XA = Rohasche XF = Rohfaser XL = Rohlipid XP = Rohprotein XZ = Rohzucker z.B. = zum Beispiels.o. z.T. = zum Teil ZZ = Zellzahl (somatische Zellzahl, in 1000) Anhang 336 7.4. Definitionen Probensatz: In einem Probensatz werden die Proben zusammengefasst, die aufgrund ihres thematischen Hintergrundes zusammengehören. Im Rahmen dieser Arbeit werden 4 Probensätze untersucht: - Alle Proben von Fütterungssystemvergleich A gehören zu einem Probensatz - Ein weiterer Probensatz besteht aus allen Proben von Fütterungssystemvergleich B - Die Proben von Fütterungssystemvergleich C bilden einen weiteren Probensatz - Die Proben zum Thema „Horn“ stellen den vierten Probensatz dar. Dieser jedoch wird wiederum unterteilt: Ein „großer Probensatz“ beinhaltet die Proben von allen Proben, die zur Frage der Enthornung genommen wurden und im gepaarten Design ausgewertet wurden. Ein „kleiner Probensatz“ wurde für die proteomischen und metabolomischen Untersuchungen zusammengestellt, bestehend aus ausgewählten Proben von Hof 2 und Hof 7 und Hof 12. „arttypische Ausprägung“ von Milch-Steigbildern: siehe auch Geier und Fritz (unveröff). Saftfutter-typisch bzw. Samen-typisch: Aufgrund von empirisch ermittelten Daten der FAS-Methode zeigen samen-artige Proben ein spezielles Muster der Messwerte, das sich konträr verhält zu demjenigen von saftigen Proben (z.B. ermittelt an Äpfeln, s.a. Strube und Stolz 2004). Samenartige Proben werden hierbei definiert nach ihrer botanischen Definition „Same“, und weisen Eigenschaften auf, die mit „trocken, fest, klein“ oder auch „zusammengezogen auf einen Kern, stark strukturiert, ausdifferenziert“ beschrieben werden können (z.B. Apfelsamen). Saftige Proben hingegen sind im botanischen Sinne eher „Früchte“, können aber auch andere Pflanzenorgane sein. Sie weisen Eigenschaften auf, die mit „wässrig, weich, groß bzw. sich ausdehnend im Wachstum, schwammig bis strukturlos“ beschrieben werden können (z.B. Apfelfruchtfleisch). Im Verlauf des Reifeprozesses bilden sich diese Eigenschaften immer extremer aus. Anhang 337 7.5. Anhang Teil A bis Teil G - Inhaltsverzeichnis 1. Anhang Teil A „Standardisierung und Charakterisierung der Steigbildmethode“ 3 1.1. Die Steigbildmethode – kurzer Überblick 3 1.2. Abwasch 5 1.3. Steigbild-Erhebungsbogen „einfach beschreibende Prüfung“ 6 1.4. Kriterien zur Profilprüfung von Milch-Steigbildern 7 1.5. Intensität der Merkmals-Ausbildung bei Milchsteigbildern – Beispiel-Bilder, Beipiel- Bonitur 11 1.6. Merkmalsausprägung bei Standard-Bildern (a.d. und UHT) 16 1.7. H-Milch-Standard-Bilder, Gruppierung nach Bildmerkmalen 20 1.8. Alterung von Milchproben 23 2. Anhang Teil B: Fütterungssystemvergleiche 25 2.1. Fütterungssystemvergleich A: Haupt-Milchinhaltsstoffe der Poolproben 25 2.2. Fütterungssystemvergleich B: Haupt-Milchinhaltsstoffe der Poolproben 26 2.3. Fütterungssystemvergleich C: Haupt-Milchinhaltsstoffe der Poolproben 27 2.4. Fütterungssystemvergleich A: Bonitur der Steigbilder 28 2.5. Fütterungssystemvergleich B: Bonitur der Steigbilder – freie Charakterisierung der Poolproben 30 2.6. Fütterungssystemvergleich B: fütterungsspezifische Bildmerkmale bei Einzeltierproben 31 2.7. Fütterungssystemvergleich C: Bonitur der Steigbilder 35 3. Anhang Teil C: Thematik „Hörner“ 36 3.1. Fotos von horntragenden / enthornten Kühen im Vergleich 36 3.2. Überischt über die Proben zur Thematik „Horn“ 37 3.3. Milchinhaltsstoffe (Fett, Eiweiß, Zellzahl) der Proben zur Thematik „Hörner“ 38 3.4. Milchinhaltsstoffe (Lactose, Harnstoff) der Proben zur Thematik „Hörner“ 39 3.5. Zusammenhang von Milchinhaltsstoffen und Steigbild-Merkmalen 40 4. Steigbild-Ergebnisse der einzelnen Höfe zum Thema „Hörner“ 42 4.1. Hof 1 42 4.2. Hof 2 50 4.3. Hof 3 55 4.4. Hof 4 (2007 + 2008) 64 4.5. Hof 5 71 4.6. Hof 6 80 4.7. Hof 7 87 4.8. Hof 8 92 Anhang 338 4.9. Hof 9 98 4.10. Hof 10 103 4.11. Hof 11 108 4.12. Hof 12 (genetisch hornlos vs. enthornt) 112 5. Fettsäuremuster der Proben von Hof 2 (Fu) zu „nachträglich enthornt“ 118 6. Ergebnisse und Diskussion zur Thematik „genetisch hornlos“ vs. „enthornt“ – quantitative Methoden 121 7. Anhang D: Ergebnisse zur Anwendung der Steigbildmethode bei Milchproben verschiedener Wirtschaftsstile 125 7.1. Versuchsdesign „Wirtschaftsstil“ 125 7.2. Ergebnisse „Wirtschaftsstil“ 125 7.3. Übersicht Gruppierung 143 7.4. Übersicht Zuordnungen wiederholter PrN und Klassifizierung 143 7.5. Diskussion Gruppierung und Zuordnung / Klassifizierung 145 8. Anhang E: Ergebnisbericht zur FAS-Untersuchung (KWALIS) 147 9. Anhang F: Ergebnisse Proteomik und Metabolomik 148 9.1. Proteomik: Kürzel, ausführliche Bezeichnung und Funktion einiger gemessener Proteine 148 9.2. Grundsätzliches Protein-Muster (am Bsp. von Versuch A) 150 9.3. Fütterungssystemvergleich A 151 9.4. Fütterungssystemvergleich B 157 9.5. Thematik „Hörner“ 165 10. Anhang G: Verzeichnis SB-Abbildungen 175 SB-Abb-1a und 1b: Beispielbilder zur Skalierung der Boniturmerkmale SB-Abb-2- fehlt SB-Abb-3-Konzentrationsreihe (Roh-Milch und UHT-Milch) SB-Abb-4-warmes-kaltes Deckelglas SB-Ab-5-Deckelglas-Vo-Hi-Ti (verschiedene Deckelglas-Temperaturen) SB-Abb-6-Klima-ad-UHT-Übersicht (a.d.- und UHT-Milch-Bilder, bei unterschiedlichen Klimabedingungen erstellt) SB-Abb-7-Klima-Übersicht (Roh-Milch-Bilder, bei unterschiedlichen Klimabedingungen erstellt) SB-Abb-8-H-Standard-4-Gruppen (vier verschiedene Bildmerkmalsausbildungen von H-Milch, an verschiedenen Tagen entstanden.) SB-Abb-9-Trocknungszeit-Effekt SB-Abb-10-Alterung-Vorverdünnung SB-Abb-11-Ag-Steighöhe (1cm vs. 2mm-Steighöhe der Ag-Lösung über den Sockel beim Entfernen des Deckelglases) SB-Abb-12a-Fe-Alterung (Effekt der Alterung der Fe-Lösung auf das Bildmuster) Anhang 339 SB-Abb-12b-Ag-Alterung (Effekt der Alterung der Ag-Lösung auf das Bildmuster) SB-Abb-13-Abkühlung-070802 SB-Abb-14-Abkühlung-090401 SB-Abb-15-Temperierung-Übersicht-071218 SB-Abb-16-Mikrowelle SB-Abb-17-Fett-Milch-Mserum (Bilder von Rahm=Sahne, Rohmilch=Frischmilch und entrahmter Milch) SB-Abb-18-Fett-Milch-FfM (Bilder von Rahm=Sahne, Rohmilch=Frischmilch und entrahmter Milch) Sb-Abb-19-entrahmteMilch-Milch SB-Abb-20-Fütterungssystemvergleich A: Wiesenheu vs. Kleegrasheu SB-Abb-21-Fütterungssystemvergleich B: Futterrüben vs. Weizen SB-Abb-22-Fütterungssystemvergleich C: Heu vs. Silage SB-Abb-23-Hof_1-080805 (1. PrN) SB-Abb-24-Hof_1-080812 (2. PrN) SB-Abb-25-Hof_1-080819 (3. PrN) SB-Abb-26-Hof-1-Übersicht-3xPrN SB-Abb-27-Hof_1-10 Einzeltiere-2xPrN (Steigbilder von 10 Einzeltieren, von 1. und 3. PrN) SB-Abb-28-Hof_2-080611 (1. PrN, 3 Proben) Sb-Abb-29-Hof_2-080618 (2. PrN, 3 Proben) SB-Abb-30-Hof_2-080625 (3. PrN, 3 Proben) SB-Abb-31-Hof_3-080807 (1. PrN, 2007) SB-Abb-32-Hof_3-070816 (2. PrN) SB-Abb-33-Hof_3-070823 (3. PrN) SB-Abb-34-Hof_3-070830 (4. PrN, 4 Proben: Eh, H, Grundfutter, Kraftfutter. Incl. grafische Darstellung der Fahnen-Charakteristik bei H vs. Eh) SB-Abb-35-hof_4-070823 (1. PrN, 3 Proben) SB-Abb-36-Hof_4-070830 (2. PrN, 3 Proben) SB-Abb-37-Hof_4-070906 UND 070913 (3. und 4. PrN, je 3 Proben) SB-Abb-38-Hof_4-080812 (Probennahme 2008, 4 Proben: H, Eh, H-jung/1.Laktation, H-jung/2.Laktation) SB-Abb-39-Hof_5-080521-GuM SB-Abb-40-Hof_5-080521 (2 Proben, doppelt erstellte Bilder mit abgebildet, in 3 Verdünnungsstufen, eine zweifach pipettiert) SB-Abb-41-Hof_5-080529-GuM SB-Abb-42-Hof_5-080529 SB-Abb-43-Hof_5-080603 (GuM und „normal“) Anhang 340 SB-Abb-44-Hof_6-080929-Rahm-Milch (2 Proben, doppelt erstellte Bilder mit abgebildet, Rahm und Rohmilch im Vergleich – mit „untypischen“ Bildmerkmalen) SB-Abb-45-Hof_6-080925 SB-Abb-46-Hof_6-081001 SB-Abb-47-Hof_6-081006 SB-Abb-48-Hof_6-Einzelkuh-Nadja-Nanni (je Kuh drei PrN) SB-Abb-49-Hof_6-Einzelkuh-Elisa-Flori (je Kuh drei PrN) Sb-Abb-50-Hof_6-Einzelkuh-Claire-Korona-Zenzi-Doris (je Kuh drei PrN) SB-Abb-51-Hof_7-080705 (Frischmilch und Rahm im Vergleich) SB-Abb-52-Hof_7-Übersicht-3xPrN SB-Abb-53-Hof_8-080705 (2 Proben) SB-Abb-54-Hof_8-080714 (3 Proben) SB-Abb-55-Hof_8-080721 (4 Proben) SB-Abb-56-Hof_9-Übersicht-3xPrN SB-Abb-57-Hof_10-080925 SB-Abb-58-Hof_10-081001 (3 Proben) SB-Abb-59-Hof_10-081008 (3 Proben) SB-Abb-60-Hof_11-Übersicht-3xPrN SB-Abb-61-Hof_12-genetisch-hornlos-3xPrN (4 Proben) Anhang 341 Eidesstattliche Erklärung Hiermit versichere ich, dass ich die vorliegende Dissertation selbständig und ohne unerlaubte Hilfe angefertigt und andere als die in der Dissertation angegebenen Hilfsmittel nicht benutzt habe. Alle Stellen, die wörtlich oder sinngemäß aus veröffentlichten oder unveröffentlichten Schriften entnommen sind, habe ich als solche kenntlich gemacht. Kein Teil dieser Arbeit ist in einem anderen Promotions- oder Habilitationsverfahren verwendet worden. Jenifer Wohlers Witzenhausen, 6.11.2010