Phylogenie und Evolution der Gattung Dyckia (Bromeliaceae) Dissertation angefertigt in der Abteilung Morphologie und Systematik der Pflanzen, Institut für Biologie, FB 10: Mathematik und Naturwissenschaften, Universität Kassel zur Erlangung des akademischen Grades eines Doktors der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.) vorgelegt von Dipl.-Biol. Florian Krapp Kassel, im Oktober 2012 Dekan: Prof. Dr. Friedrich W. Herberg Betreuer: Prof. Dr. Kurt Weising Promotionskommission: Prof. Dr. Kurt Weising (1. Gutachter) Prof. Dr. Georg Zizka (2. Gutachter) Prof. Dr. Ewald Langer (Beisitzer) Prof. Dr. Rüdiger Wagner (Beisitzer) Tag der Disputation: 20. Dezember 2012 Für meine Mutter Inhalt 1 Einleitung...........................................................................................................................1 1.1 Die Familie der Bromeliaceae.....................................................................................................1 1.1.1 Merkmale und Ökologie.......................................................................................................1 1.1.2 Systematik und Biogeographie.............................................................................................3 1.1.3 Die Unterfamilie Pitcairnioideae...........................................................................................4 1.2 Die Gattung Dyckia...................................................................................................................... 6 1.2.1 Morphologie.........................................................................................................................6 1.2.2 Lebensraum....................................................................................................................... 12 1.2.3 Physiologie, Ökologie und Fortpflanzungsbiologie.............................................................18 1.2.4 Taxonomische Geschichte.................................................................................................20 1.3 Ziele dieser Arbeit...................................................................................................................... 23 1.3.1 Bisherige wissenschaftliche Arbeiten zu Dyckia.................................................................23 1.3.2 Bisherige molekulare Arbeiten an Dyckia...........................................................................24 1.3.3 Fragestellung..................................................................................................................... 25 1.3.4 Einführung in die Methodik dieser Arbeit............................................................................26 2 Material und Methoden...................................................................................................28 2.1 Pflanzenmaterial........................................................................................................................ 28 2.2 Molekulare Methoden................................................................................................................33 2.2.1 DNA-Isolation..................................................................................................................... 33 2.2.2 Gelelektrophorese..............................................................................................................35 2.2.3 Polymerase-Kettenreaktion (PCR).....................................................................................37 2.2.3.1 Untersuchte plastidäre Loci.........................................................................................37 2.2.3.2 Untersuchte nukleäre Loci..........................................................................................43 2.2.3.3 Verwendete Reagenzien und Durchführung...............................................................47 2.2.4 DNA-Sequenzierung..........................................................................................................49 2.2.5 Plastidäre Mikrosatelliten (cpSSRs)...................................................................................51 2.2.5.1 Entwicklung von Primerpaaren für cpSSR-Loci..........................................................51 2.2.5.2 Primer-Tests und Charakterisierung...........................................................................52 2.3 Datenanalyse............................................................................................................................ 54 2.3.1 DNA-Sequenzen, Alignments und Außengruppen.............................................................54 2.3.2 Behandlung von Heterozygotie..........................................................................................55 2.3.3 Distanzanalysen, Bootstrap- und Jackknife-Verfahren.......................................................57 2.3.4 Parsimonieanalyse, Abschätzung von Homoplasie............................................................58 2.3.5 Maximum Likelihood-Analyse und Substitutionsmodelle....................................................60 2.3.6 Bayes'sche Analyse...........................................................................................................61 2.3.7 Datierte Phylogenien mit BEAST.......................................................................................63 2.3.8 Netzwerke.......................................................................................................................... 64 3 Ergebnisse.......................................................................................................................66 3.1 DNA-Isolation............................................................................................................................ 66 3.2 Sequenzierung plastidärer Loci.................................................................................................66 3.2.1 Charakterisierung verschiedener plastidäre Loci...............................................................66 3.2.2 Phylogenetische Untersuchungen......................................................................................72 3.3 Sequenzierung nukleärer Loci...................................................................................................85 3.3.1 Pilotexperimente................................................................................................................85 3.3.2 Phylogenie auf Basis von phyC..........................................................................................87 3.4 Plastidäre Mikrosatelliten (cpSSRs)..........................................................................................96 3.4.1 Etablierung von cpSSR-Loci..............................................................................................96 3.4.2 Anwendung ausgewählter cpSSRs für Verwandtschaftsanalysen...................................101 4 Diskussion.....................................................................................................................106 4.1 Methodische Aspekte..............................................................................................................106 4.1.1 DNA-Isolation................................................................................................................... 106 4.1.2 Charakterisierung verschiedener plastidärer Loci............................................................107 4.1.3 Phytochrom C (phyC).......................................................................................................109 4.1.4 Verwendete Methoden zur Datenanalyse........................................................................110 4.1.5 Plastidäre Mikrosatelliten (cpSSRs).................................................................................112 4.2 Phylogenetische Untersuchungen...........................................................................................116 4.2.1 Erzielte Auflösung der Phylogenien.................................................................................116 4.2.2 Phylogenie auf Basis plastidärer Sequenzen...................................................................117 4.2.3 Phylogenie auf Basis von phyC........................................................................................119 4.2.4 Schlussfolgerungen zur Phylogenie von Dyckia und Encholirium....................................125 4.2.5 Phylogenie und Merkmalsevolution innerhalb von Dyckia................................................128 4.3 Evolution und Geschichte von Dyckia.....................................................................................133 4.3.1 Historische Biogeographie von Dyckia und Encholirium..................................................133 4.3.2 Klima- und Habitatgeschichte im Verbreitungsgebiet von Dyckia....................................135 4.3.3 Diversifizierung anderer Pflanzengruppen im Verbreitungsgebiet von Dyckia.................139 4.3.4 Die besonders hohe Diversität von Dyckia.......................................................................143 4.3.5 Artkonzepte für Dyckia.....................................................................................................146 4.4 Ausblick................................................................................................................................... 148 5 Zusammenfassung........................................................................................................150 6 Literaturverzeichnis......................................................................................................153 7 Abbildungsverzeichnis.................................................................................................169 8 Tabellenverzeichnis......................................................................................................170 9 Abkürzungsverzeichnis................................................................................................171 10 Anhang.........................................................................................................................173 11 Referenzen...................................................................................................................196 Erklärung...........................................................................................................................199 Danksagung.......................................................................................................................200 Einleitung 1 Einleitung 1.1 Die Familie der Bromeliaceae Die Familie der Bromeliaceae wurde erstmals durch Antoine Laurent de Jussieu publiziert (Jussieu 1789). Der Name leitet sich von der durch Charles Plumier beschriebenen Gattung Bromelia ab, welche nach dem schwedischen Botaniker Olaf Bromel benannt ist (Linnaeus 1753). Innerhalb der Liliidae (Monokotyle) werden die Bromelien aktuell zur Ordnung der Poales (Süßgrasartigen) gerechnet (APG 2009). Bis auf Pitcairnia feliciana, welche in Guinea in Westafrika wächst, ist die Familie endemisch für die Neotropis (Abbildung 1). Nach einer im Juni 2008 vorgenommenen Zusammenstellung umfasste die Familie der Bromeliaceae nahezu 3200 anerkannte Arten in 58 Gattungen (Luther 2008). Alleine in den drei Folgejahren wurden jedoch etwa 200 neue Arten beschrieben (IPNI 2012). Die einzige in großem Umfang wirtschaftlich genutzte Art ist Ananas comosus (Abbildung 1), welche heute weltweit in den Tropen und Subtropen angebaut wird. Weiterhin werden einige Bromelien als Zier- und Zimmerpflanzen genutzt, wie etwa die als Lanzenrosette bekannte Aechmea fasciata und verschiedene Arten von Tillandsia (Abbildung 2). 1.1.1 Merkmale und Ökologie Alle Bromelien weisen für Monokotyle typische Merkmale wie etwa dreizählige Blüten, parallelnervige Blätter und Adventivwurzeln auf (Sitte et al. 2002). Innerhalb der Familie gibt es eine Fülle an Lebensformen und damit verbunden eine große morphologische Bandbreite. So lassen sich Vertreter von den ariden Savannen bis hinein in die tropischen Regenwälder und von den Küsten und dem Flachland bis hoch hinauf in die Anden finden. Als Ursache für 1 Abbildung 1: Ananas comosus und die Verbreitung der Bromeliaceae A: Ananas comosus, der einzige in großem Umfang wirtschaftlich genutzte Vertreter der Bromeliaceae. Kolorierte Tuschezeichnung (Blanco 1880). B: Disjunktes Verbreitungsgebiet der Bromeliaceae in der Neotropis und Westafrika. Karte verändert auf Basis der in der Datenbank der GBIF (2007) enthaltenen Datensätze. A B Einleitung diese Vielfalt wird eine adaptive Radiation der Familie innerhalb der Neotropis angenommen, im Zuge derer die Bromelien Anpassungen an die unterschiedlichsten Lebensräume entwickelten (Benzing 2000). Viele Bromelien leben epiphytisch, darunter die weitaus meisten Arten der der Tillandsioideae (Abbildung 2), aber auch Vertreter anderer Unterfamilien (Givnish et al. 2007). Die Wurzeln sind bei epiphytischen Arten häufig reduziert oder zu Haftorganen umgebildet. Mit der epiphytischen Lebensweise verbunden ist oft auch die Bildung von 2 Abbildung 2: Vertreter der Bromeliaceae Habitus von verschiedenen Vertretern der Bromeliaceae in Botanischen Gärten. Prächtige Infloreszenzen von Aechmea weilbachii (A) und Aechmea fasciata (B) aus Brasilien, die in ganz Mittel- und Südamerika verbreitete epiphytische Tillandsia usneoides im trockenen (C) und feuchten (D) Zustand, Tillandsia cyanea aus Ecuador in Blüte mit anderen Tillandsien (E), Bromeliensammlung (F) und Tillandsien-Schauhaus (G) im Botanischen Garten Heidelberg. A B C D E F G Einleitung Blatttrichtern, die von den Basen der eng zusammenstehenden Rosettenblätter gebildet werden. Diese fungieren als Zisternen, das darin gesammelte Wasser und gelöste Nährstoffe können über Saugschuppen aufgenommen werden. Die als Saugschuppen ausgebildeten Trichome sind ein vielen, aber nicht allen Bromelien eigenes Merkmal. Sie finden sich entweder nur in den Blatttrichtern oder auf der gesamten Blattoberfläche. Zisternenbildung und Saugschuppen sind sicherlich entscheidende Faktoren für den Erfolg der epiphytischen Arten (Benzing 2000). Die Infloreszenzen der Bromeliaceae sind meistens auffällig bunt gefärbt, was die Beliebtheit als Zimmerpflanzen erklärt (Abbildung 2). Bei vielen Gattungen sind die Blüten selbst jedoch klein und relativ unscheinbar. Die Schauwirkung geht dann von pigmentierten Hochblättern und Infloreszenzachsen aus. 1.1.2 Systematik und Biogeographie Die Bromeliaceae wurden bis in die jüngste Zeit anhand von Fruchtmerkmalen in drei Unterfamilien eingeteilt. So standen die beerenfrüchtigen Bromelioideae den übrigen, durchweg kapselfrüchtigen Arten gegenüber. Letztere unterscheiden sich ihrerseits durch die Art der Anhängsel an ihren Samen, die bei den Tillandsioideae haarig und bei den Pitcairnioideae häutig sind (Smith & Downs 1974; 1977; 1979). Diese traditionelle Unterteilung der Bromeliaceae in drei Unterfamilien gilt heute als überholt. Während zwar Bromelioideae und Tillandsioideae offenbar monophyletisch sind, handelt es sich bei den klassischen Pitcairnioideae um eine paraphyletische Gruppe. Die häutigen Samenanhängsel müssen demnach als symplesiomorpher Zustand angenommen werden. Anhand molekularer Untersuchungen der plastidären DNA wurden die ursprünglichen Pitcairnioideae in die sechs Unterfamilien Brocchinioideae, Hechtioideae, Lindmanioideae, Navioideae, Pitcairnioideae und Puyoideae aufgeteilt (Givnish et al. 2007; 2011), womit die Bromeliaceae derzeit aus acht anerkannten Unterfamilien bestehen (Abbildung 3). Als phylogenetisch zuerst abzweigende Gruppe gelten die Brocchinioideae, welche in den tiefer gelegenen Gegenden des geologisch sehr alten Guayana-Schildes im Nordosten Südamerikas vorkommen (Givnish et al. 2004). In dieser Gegend wird auch der Ursprung der Bromeliaceae als solche angenommen. Von dort aus eroberte die Familie zunächst die höher gelegenen Bereiche des Guayana-Schildes und diversifizierte sich in verschiedene Linien. Einige dieser Linien verbreiteten sich unabhängig voneinander über ganz Mittelamerika, so etwa die Hechtioideae. Die Vorläufer der Gattung Cottendorfia (Navioideae) und möglicherweise auch einige Linien der Tillandsioideae überbrückten die 3 Einleitung tieferen Landstriche und den Amazonas und gelangten direkt in die höheren Lagen des Brasilianischen Schildes. Die gemeinsamen Vorläufer der Bromelioideae, Pitcairnioideae und Puyoideae drangen vom Guayana-Schild aus nach Westen in die Anden vor. Von dort aus besiedelten sowohl die Bromelioideae als auch die Linie der Pitcairnioideae, die sich später in Dyckia und Encholirium auftrennte, unabhängig voneinander den Brasilianischen Schild (Givnish et al. 2004; 2007; 2011). 1.1.3 Die Unterfamilie Pitcairnioideae Die Unterfamilie Pitcairnioideae besteht in ihrer heutigen Form (sensu Givnish, im folgenden einfach als Pitcairnioideae bezeichnet) aus fünf anerkannten Gattungen (Abbildungen 3 und 4). Eine zumindest im plastidären Genom monophyletische Gruppe bilden die drei Gattungen Dyckia, Encholirium und Deuterocohnia (z. B. Givnish et al. 2011). Deren Vertreter zeichnen sich durch xeromorphe Anpassungen wie CAM-Photosynthese und stark 4 Abbildung 3: Systematik der Bromeliaceae Systematik der Bromeliaceae, vereinfacht nach Givnish et al. (2011). Der hier dargestellte Stammbaum beruht auf einer Parsimonieanalyse auf Basis von Sequenzen von acht plastidären Loci. Er wurde mittels des penalized likelihood in ultrametrische Form gebracht. Auf der rechten Seite sind die acht derzeit anerkannten, jeweils monophyletischen Unterfamilien markiert. Schwarze Balken stehen für die sechs Unterfamilien, die früher als Pitcairnioideae zusammengefasst wurden. Der hellgraue Balken steht für die Bromelioideae und der dunkelgraue Balken für die Tillandsioideae. 051520 10 Millionen Jahre in der Vergangenheit Dyckia ferox Dyckia dawsonii Encholirium irwinii Encholirium scrutor Deuterocohnia glandulosa Deuterocohnia lotteae Fosterella petiolata Deuterocohnia longipetala Pitcairnia corallina Fosterella penduliflora Pitcairnia poortmanii Pitcairnia hirtzii Pitcairnia orchidifolia Pitcairnia wendlandii Pitcairnia carinata Pitcairnia feliciana Pitcairnia heterophylla Brocchinioideae Lindmanioideae Tillandsioideae Hechtioideae Pitcairnioideae Navioideae Puyoideae Bromelioideae Einleitung bewehrte, derbe Blätter mit unterschiedlich ausgeprägter Sukkulenz aus. Crayn et al. (2004) fassten diese Gattungen informell als „Dyckia clade“ zusammen. Die überwiegend andin verbreitete Gattung Deuterocohnia enthält inklusive Abromeitiella aktuell 17 Arten (Schütz 2012). Für Encholirium werden derzeit 25 Arten anerkannt, Dyckia stellt mit 158 Arten die bei Weitem größte Gattung in dieser Gruppe dar (vgl. 1.2.4). Die Arten der beiden übrigen Gattungen der Unterfamilie, Fosterella und Pitcairnia, besitzen überwiegend mesophytischen Charakter und betreiben C3-Photosynthese. Die meisten Arten von Fosterella kommen in den Yungas Boliviens vor, insgesamt werden derzeit 31 Arten anerkannt (Peters 2009). Ungleich umfangreicher ist mit über 400 Arten die Gattung Pitcairnia (Luther 2008), deren Arten sich auf ein großes Verbreitungsgebiet in Mittel- und 5 Abbildung 4: Vertreter der Pitcairnioideae und deren Verbreitung Verbreitungsgebiet der fünf Gattungen der Unterfamilie Pitcairnioideae sowie Blüten, vegetative Organe und Samen von typischen Vertretern. Alle Samen sind im selben Maßstab gezeigt. A-D: Dyckia. A: Blüten von D. estevesii, B: Blattrosette von D. microcalyx, C: Verbreitung, D: Samen von D. remotiflora. E-H: Encholirium. E: Infloreszenz von E. spec., F: Blattrosette von E. spec., G: Verbreitung nach Forzza (2005), H: Samen von E. magalhaesii (links) und E. erectiflorum (rechts, jeweils Zeichnungen nach Forzza 2005). I-L: Deuterocohnia. I: Blüten von D. recurvipetala, J: Blattrosette von D. longipetala, K: Verbreitung nach Schütz (2012), L: Samen von D. recurvipetala. M-P: Fosterella. M: Blüten von F. robertreadii, N: Blattrosette von F. rusbyi, O: Verbreitung nach Peters (2009), P: Samen von F. penduliflora. Q-T: Pitcairnia. Q: Blüten von P. rubronigriflora, R: Blätter von P. spicata, S: Verbreitung modifiziert von Kai Schubert (persönliche Mitteilung) nach Smith & Downs (1974), T: Samen von P. maidifolia (links, Zeichnung nach Taylor & Robinson 1999) sowie P. turbinella (mittig) und P. agavifolia (rechts, Zeichnung wie vorherige nach Smith & Downs 1974). Bild E mit freundlicher Genehmigung von Kurt Weising. 5 mm A E I B F J C G K H LD M N O P Q R S T Einleitung Südamerika verteilen (Abbildung 4). Die umstrittene Gattung Pepinia wurde kürzlich wieder in Pitcairnia eingegliedert (Taylor & Robinson 1999). 1.2 Die Gattung Dyckia Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Gattung Dyckia, welche daher in den folgenden Abschnitten ausführlich vorgestellt wird. Die letzte umfassende Behandlung der Gattung erfolgte durch Smith & Downs (1974). Eine moderne Revision ist nicht verfügbar. 1.2.1 Morphologie Habitus Charakteristische vegetative Merkmale der Vertreter der Gattung Dyckia sind in Abbildung 5 zusammengestellt. Die Arten der Gattung besitzen ein dickes, oftmals kriechendes Rhizom und sprossbürtige Wurzeln (Winkler 1982). Viele Arten sind stammlos, einige besitzen jedoch besonders im Alter mehr oder weniger ausgeprägte Stämme. Ein Extrem stellt beispielsweise D. edwardii dar, deren Stamm bei einer Dicke von 17 cm bis zu 50 cm lang werden kann (Braun et al. 2008a). Die Blätter stehen in mehr oder weniger dichten Rosetten, deren Durchmesser typischerweise 15-100 cm beträgt. Als seltene Ausnahme kann ein Durchmesser von bis zu 300 cm bei freistehenden Rosetten von D. maritima gelten (Winkler 1982). Tote Blätter verbleiben häufig am Spross und umhüllen diesen, wie beispielsweise bei D. edwardii (Braun et al. 2008a). Durch die vegetative Vermehrung über Kindel bilden viele Dyckia-Arten Kolonien oder dichte Polster aus (Abbildung 5 A und E). Eine einzigartige Abweichung vom rosettenförmigen Wuchs kommt bei D. estevesii vor, deren Pflanzen teilweise distich beblättert sind (Abbildung 5 C). Dieses Merkmal variiert aber gelegentlich sogar innerhalb eines Individuums (Rauh 1987). Die Pflanzen erreichen inklusive ihrer Infloreszenzen typischerweise eine Höhe von 50-100 cm. Es kommen aber auch sehr kleine Vertreter vor, wie etwa D. odorata mit ca. 10 cm. Besonders groß werden Arten wie D. maritima und D. selloa mit 200 cm, D. irwinii mit 225 cm oder D. goiana mit bis zu 250 cm. Die Höhe der Infloreszenz ist aber auch innerartlich variabel, bei D. microcalyx wurde eine Bandbreite von 40-200 cm beobachtet (Smith & Downs 1974). Blätter Die Blätter sind deutlich in Spreite und Scheide unterteilt. Die Blattspreiten haben ein zumeist derbes Erscheinungsbild, entweder sind sie sehr starr oder aber ledrig und biegsam. 6 Einleitung Die Blattlänge reicht typischerweise von 10-50 cm. Bei D. nana sind die Blätter lediglich 3-5 cm lang (Leme et al. 2010), bei D. microcalyx dagegen bis 150 cm (Smith & Downs 1974). Ihre Breite variiert zwischen 5 mm bei den linealischen Blättern von D. choristaminea und mehr als 40 mm bei der großwüchsigen D. edwardii (Braun et al. 2008a). Farblich sind die Blattspreiten sehr variabel, so gibt es völlig silbrig-weiße Blätter bei stark beschuppten Arten. Ansonsten kommen hellgrüne bis sehr dunkelgrüne, leicht rötliche bis sehr dunkelrote oder bräunliche bis hin zu dunkel schokoladenbraunen Blättern vor. Die Farbe kann aber zum Teil innerartlich stark variieren und ist auch vom Standort abhängig. Solche Farbmorphen scheinen innerhalb der gesamten Bromeliaceae ohnehin häufig zu entstehen und sich zu verändern, ein in vielen Lebendsammlungen beobachtbares Phänomen (Barbará et al. 2007). Die Blattränder sind fast immer mit Stacheln bewehrt, nur selten finden sich völlig glatte Ränder. Aber auch sonst bestachelte Arten sind teilweise im oberen Bereich der Spreite glattrandig oder besitzen einzelne Blätter ganz ohne Stacheln. Bei einigen Arten finden sich eher kleine Stacheln, bei D. atratiflora sind sie nur etwa 1 mm lang, gerade und weich (Braun et al. 2009). Typisch sind jedoch deutlich größere Stacheln von etwa bei D. ferruginea bis zu 7 Abbildung 5: Die Gattung Dyckia: Vegetative Organe Vegetative Organe und Besonderheiten einiger Vertreter von Dyckia. A: Klonale Koloniebildung bei D. choristaminea, B: Wenig beschuppte, grüne Blätter bei D. microcalyx, C: Distiche Beblätterung bei D. estevesii. D: Die stark sukkulente und beschuppte D. marnier-lapostollei. E: Kindelbildung bei D. marnier- lapostollei. F: Rot pigmentierte Rosette bei D. goehringii. A B C D E F Einleitung 10 mm Länge (Smith & Downs 1974). Sie sind häufig gebogen, zum Teil in entgegengesetzte Richtungen, und extrem hart und stabil. Die Blätter von Dyckia-Arten zeigen eine unterschiedlich stark ausgeprägte Sukkulenz. So gibt es einerseits sehr dünne linealische Blätter, wie etwa bei D. choristaminea, die nur sehr wenig Feuchtigkeit speichern können (Abbildung 5 A). Besonders stark ausgeprägte Sukkulenz findet sich bei nordbrasilianischen Arten wie D. marnier-lapostollei (Abbildung 5 D und E) oder D. joanae-marcioi (Braun et al. 2008b). Weiterhin finden sich unterschiedliche Grade von Beschuppung. Es gibt völlig kahle, grüne Pflanzen, Arten mit ausschließlich abaxial beschuppten Blättern und extreme beidseitige Beschuppung bei nordbrasilianischen Arten wie D. marnier-lapostollei, D. braunii und D. joanae-marcioi, die im trockenen Zustand silbrig-weiß erscheinen (Smith & Downs 1974; Braun et al. 2008b). Die Blattscheiden sind zumeist stängelumfassend und 15-60 mm lang. Selten weisen sie Stacheln auf, zum Teil finden sich aber Schuppen. Form, Größe und Beschaffenheit der Blattscheiden werden oftmals als wichtiges Merkmal zur Artbestimmung angeführt (Smith & Downs 1974). Infloreszenzen Merkmale der Infloreszenzen von Dyckia sind in den Abbildungen 6 und 7 zusammengestellt. Die Infloreszenzen entspringen bei allen Arten der Gattung Dyckia lateral am Spross (Abbildung 6 D-F). Dies ist das sicherlich augenscheinlichste Unterscheidungsmerkmal zu Encholirium mit Ausnahme von E. heloisae, welche ebenfalls laterale Infloreszenzen bildet (Forzza 2005) und damit eine intermediäre Position zwischen den Gattungen einnimmt. Die Infloreszenzen sind bei Dyckia meist schlank und aufrecht, selten niedrig und gedrungen. In der Regel handelt es sich um einfache Trauben oder Ähren oder um zweifach zusammengesetzte Rispen. Eine mit nur 4-6 Blüten besonders armblütige Art ist D. nana (Leme et al. 2010), typischerweise finden sich aber deutlich mehr Blüten, beispielsweise über 200 bei D. floribunda (Abbildung 6 C, Vesprini et al. 2003). Mehrfach zusammengesetzte Rispen sind vergleichsweise selten und kommen etwa bei der großwüchsigen D. maritima vor (Winkler 1982). Der Verzweigungsgrad kann aber auch innerartlich variieren. So zeigen Arten welche am natürlichen Standort nur einfache Infloreszenzen ausbilden unter den besseren Bedingungen in Kultur teilweise verzweigte Blütenstände (Esteves & Hofacker 2011). Viele Vertreter von Dyckia weisen extraflorale 8 Einleitung 9 Abbildung 6: Die Gattung Dyckia: Infloreszenzen, Blüten und Früchte A: Typische orangerotblütige Dyckia-Infloreszenz bei D. remotiflora. B: Wenig verzweigte gelbblütige Infloreszenz bei D. choristaminea. C: Infrukteszenz der reichblütigen Art D. floribunda. D: Laterale Infloreszenzen zweier aufeinanderfolgender Jahre bei D. brevifolia. E: Längsschnitt durch dieselbe Achse. F: Teilweise abgeschnittene Infloreszenzen aus fünf verschiedenen Jahren bei D. estevesii. G: Früchte von D. brevifolia. H: Blütenorgane von D. brevifolia. Von links nach rechts: Florale Braktee, Sepale, Petale, aufgeschnittene Blüte mit sichtbarer Verwachsung von Petalen und Filamenten, zur Röhre verwachsene Stamina, Griffel mit Narbe. A B C D E G HF Einleitung Nektarien an verschiedenen Teilen ihrer Infloreszenzen auf (Bernadello et al. 1991; Vesprini et al. 2003). Der Blütenschaft, die Blütenstandsachse und die verschiedenen Typen von Brakteen können kahl, behaart oder beschuppt sein. Ihre Beschaffenheit sowie die Längen und Längenverhältnisse innerhalb der Infloreszenz gelten als häufig wichtige Merkmale zur Artunterscheidung (Smith & Downs 1974). Oft sind weder der Blütenschaft noch die Blütenschaft-Brakteen besonders auffällig gefärbt, wie es bei anderen Bromelien der Fall ist (Winkler 1982). Die Blütenstandsachse dagegen ähnelt häufig farblich den Blüten, kann aber auch ungefärbt grün sein. Die floralen Brakteen können aufrecht, zurückgeschlagen oder unscheinbar klein sein, bei einigen Arten überragen sie die Sepalen oder gar die Petalen. Blüten, Früchte und Samen Merkmale der Blüten, Früchte und Samen von Dyckia sind in den Abbildungen 6, 7 und 8 zusammengestellt. Die Blüten sind bei Dyckia wie bei fast allen Bromelien zwittrig. Nur bei einigen Arten, darunter D. hebdingii, D. maritima und D. selloa, kommen andromonözische oder eingeschlechtliche Blüten vor (Smith & Downs 1974; Winkler 1982; Robinson & Taylor 1999). Diese seltene Ausnahme war auch der Grund für die zeitweilige Ausgliederung in eine eigene Gattung Prionophyllum (Koch 1873). Die Blüten sind meistens sehr kurz gestielt oder sitzend, gelegentlich auch länger gestielt. Häufig verlängern sich die Blütenstiele zur Fruchtreife. Die Blüten können aufrecht an der Achse anliegen, abstehen oder zurückgeschlagen sein (Abbildungen 6 und 7). Die Sepalen zeigen über die Gattung hinweg eine große morphologische Bandbreite. So können sie kurz und unauffällig, beinahe so lang wie die Petalen oder in Ausnahmen, wie etwa bei D. ursina, teilweise sogar länger sein. Farblich ähneln sie meist in etwa den Petalen, wirken aber durch Schuppen oder Haare teilweise deutlich blasser. Die Petalen sind in der Regel intensiv gefärbt. Typisch sind kräftig leuchtende rote, orangerote, gelborangefarbene oder gelbe Töne. Dabei bilden rote Pigmente in den Petalen innerhalb der Bromeliaceae eine Ausnahme (Sazima et al. 1989). Bei Dyckia selten sind beinahe schwarze Blüten, etwa bei D. atratiflora (Braun et al. 2009), bräunliche, schwefelgelbe und gelbgrüne Blüten (Abbildung 7). Das Androeceum besteht aus zwei Kreisen mit jeweils drei Stamina (Abbildung 6 H). Die Filamente sind basal zu einer Röhre verwachsen, was ein wichtiger Unterschied zu Blüten von Encholirium ist. Diese Verwachsung kann basal begrenzt sein oder fast bin an die Antheren heranreichen, zudem kann eine Verwachsung mit den Petalen vorkommen. Grad 10 Einleitung und Typ der Verwachsung stellen wichtige Bestimmungsmerkmale dar (Smith & Downs 1974). Die Antheren können entweder in der Blüte eingeschlossen bleiben oder diese überragen. Das Gynoeceum ist ein aus drei verwachsenen Karpellen bestehender oberständiger Fruchtknoten. Die meist kurzen Griffel tragen eine dreilappige Narbe. Die dreifächrigen Kapselfrüchte (Abbildung 6 G) enthalten eine Vielzahl an Samen, etwa bei D. floribunda über 120 Stück (Vesprini et al. 2003). Die Samen sind mit bis zu 5 mm Durchmesser vergleichsweise groß und meist asymmetrisch geflügelt, selten kommen auch gleichmäßige Hautränder vor (Abbildung 8). Als Ausnahme gibt es längliche Samen mit schmaleren Rändern bei den ehemals unter der separaten Gattung Prionophyllum geführten 11 Abbildung 7: Die Gattung Dyckia: Blüten Blüten verschiedener in dieser Arbeit untersuchter Vertreter von Dyckia. A: D. goehringii. B: D. granmogulensis. C: D. estevesii. D: D. remotiflora. E: D. hebdingii. F: D. aff. leptostachya. G: D. choristaminea. H: D. brevifolia. I: D. spec. A B C D E G H I F Einleitung Arten wie D. maritima. Vereinzelt kommen auch untypisch kleine Samen mit stark reduzierten Hauträndern vor, so etwa bei D. delicata (Larocca & Sobral 2002). Die Form insbesondere geflügelter Samen ist stark durch die Fruchtwand beeinflusst und hängt von der individuellen Lage innerhalb der Frucht ab. 1.2.2 Lebensraum Informationen zu Klima, Ökoregionen und der Geländetopographie im Verbreitungsgebiet von Dyckia sind in Abbildung 9 zusammengefasst. Typische Habitate von Dyckia zeichnen sich durch zumindest saisonale Wasserknappheit und einen Mangel an Nährstoffen aus (Abbildung 10). Häufig gibt es eine ausgeprägte Trockenzeit zwischen Mai und August (z. B. Sazima et al. 1989). Die Sonnenexposition ist zumeist sehr stark und die Tagestemperaturen können hohe Werte erreichen, was durch die häufig nackten felsigen Böden noch verstärkt wird (Winkler 1980). 12 Abbildung 8: Die Gattung Dyckia: Samen Samen verschiedener Dyckia-Arten. Die Bilder A-H sind im selben Maßstab dargestellt, um die unterschiedlichen Samengrößen zu illustrieren. A: D. velascana, B: D. aff. leptostachya, C: D. choristaminea, D: D. floribunda, E: D. spec., F: D. remotiflora, G: D. maritima (Zeichnung nach Strehl & Beheregaray 2006), H: D. delicata (Zeichnung nach Larocca & Sobral 2002) I: Bandbreite der Variation von Form und Größe bei Samen von D. choristaminea innerhalb eines einzelnen Individuums. A C E B D F G H I 5 mm 10 mm Einleitung Verbreitungsgebiet Das Verbreitungsgebiet von Dyckia umfasst mehrere Ökoregionen nach Olson et al. (2001). Die weitaus meisten Arten sind im Cerrado beheimatet, einem großflächigen semiariden Savannengebiet im Südosten Brasiliens. Weiterhin kommen Vertreter der Gattung in Trockenwäldern und aridem Buschland Nordostbrasiliens (Caatinga), dem Atlantischen Regenwald Südostbrasiliens (Mata Atlântica), dem Chaco Boliviens, Nordargentiniens und Paraguays sowie der Pampa in Nordargentinien, Südbrasilien und Uruguay vor (Abbildung 9 B). Auch Grenzregionen, wie etwa der Brejo de Altitude genannte Übergang zwischen Caatinga und Mata Atlântica bieten Standorte für Dyckia. Allerdings ist Dyckia in der Regel auf azonale Standorten beschränkt und gehört nicht zur typischen zonalen Vegetation dieser Ökoregionen. Standorte für Dyckia finden sich von Meereshöhe bis hinauf auf 3.000 m, wo etwa D. velascana im der argentinischen Provinz La Rioja lebt. Die meisten Arten bewohnen aber mittlere Höhenlagen von 800-1.500 m, Höhen über 2.000 m sind eine sehr seltene Ausnahme (Smith & Downs 1974). Campos Rupestres Die Campos Rupestres (portugiesisch für „steinige Felder“) bilden das Zentrum der Diversität von Dyckia und auch Encholirium und beherbergen einen großen Teil der Arten (Smith & Downs 1974; Versieux & Wendt 2006; Versieux & Wendt 2007). Innerhalb der ohnehin artenreichen Neotropis gilt die azonale Vegetation dieser Habitate als besonders divers und reich an endemischen Arten. So sind beispielsweise zwei Drittel aller in der als Cerrado bezeichneten Ökoregion vorkommenden Gefäßpflanzen auf die Campos Rupestres beschränkt (Alves et al. 2007). Viele Pflanzenarten sind sogar nur von der Typuslokalität bekannt und kommen streng endemisch auf einzelne Berge beschränkt vor (Alves & Kolbek 1994). Typische Pflanzen dieser offenen, steinigen Savannen sind beispielsweise Vertreter der Eriocaulaceae, Velloziaceae und Xyridaceae (Alves & Kolbek 2010). Es handelt sich bei den Campos Rupestres um mehr oder weniger isolierte Habitate in den höheren Lagen des Cerrados, aber auch von Caatinga, Mata Atlântica und anderen Ökoregionen. Als Kern der Campos Rupestres bezeichnen Alves & Kolbek (2010) die Serra do Espinhaço in den brasilianischen Bundesstaaten Minas Gerais und Bahia. Aber auch in anderen Gebirgszügen wie der Serra da Mantiqueira, Serra do Mar, Serra de Diamantina und Serra da Canastra kommen Campos Rupestres in größerem Umfang vor. Viele der Plateaus (portugiesisch: Chapada) und Hochebenen (portugiesisch: Planalto) sind durch steile Abhänge von der Umgebung abgesetzt und haben somit mehr oder weniger insularen Charakter. Diese Regionen werden auch als Mar de Morros (portugiesisch für „Meer der 13 Einleitung 14 Abbildung 9: Klima, Biome und Geländehöhe im Verbreitungsgebiet von Dyckia A: Effektive Klimaklassifikation nach Köppen und Geiger (Karte nach Kottek et al. 2006; Peel et al. 2007). Die Legende enthält nur die drei in der Karte auftretenden Hauptgruppen. B: Haupt-Habitattypen (Biome) nach Olson et al. (2001). C: Reliefkarte basierend auf SRTM- und GTOPO30-Daten (erstellt nach Braxmeier 2012). Höhen über 2000 m sind auf die Anden beschränkt und grau dargestellt. D: Fundorte von Dyckia (grün: in dieser Arbeit analysierte Planzen, türkis: Fundorte nach GBIF(2007), blau: Fundorte nach Smith & Downs(1974)). Das auf Basis der Fundortdaten angenommene Verbreitungsgebiet ist grün hinterlegt. Siehe auch Abbildung 13. Legende zu B Legende zu C Legende zu A tropisches Regenklima Trockenklimate warmgemäßigte Klimate humid Monsun wintertrocken Wüste, heiß Wüste, kalt Steppe, heiß sommertrocken, heiß sommertrocken, warm Steppe, kalt wintertrocken, heiß wintertrocken, warm wintertrocken, kühl humid, heiß humid, warm humid, kühl tropische Savanne tropischer Regenwald montanes Grasland Mangrove temperate Savanne tropischer Trockenwald Wüsten, arides Buschland Feuchtsavanne temperater Laub-/Mischwald mediterranes Buschland 2000 m 1400 m 800 m 200 m A B C D Einleitung Hügel“) bezeichnet. Aber selbst weit entfernt von diesen Gegenden gibt es kleinere isolierte Campos Rupestres, so etwa in der Serra dos Carajas im Westen von Pará in Amazonien. Charakteristisch für die Campos Rupestres sind der felsige und flachgründige Untergrund, der aus Quarzit oder Sandstein, seltener aus Granitgneis oder Eisenstein besteht. Die aus der Verwitterung dieser Gesteine resultierenden Böden unterscheiden sich grundlegend von den Böden des umgebenden Cerrados, die überwiegend von nährstoffarmem Laterit mit hohen Konzentrationen an Eisen und Aluminium gebildet werden. Insbesondere Aluminium kann für Pflanzen problematisch sein (Haridasan 2008). In heutiger Zeit befinden sich die Campos Rupestres in Höhen von 800-2.000 m (Alves & Kolbek 1994; 2010). Antonelli et al. (2010) geben als Untergrenze 1.000 m an. Die meisten Vertreter von Dyckia leben typischerweise in Höhen zwischen 800-1.500 m, was sich mit der Verbreitung der Campos Rupestres deckt. Savannengebiete Die Campos Rupestres stellen ein sehr offenes Gelände mit exponiertem Fels und nur wenigen kleinen Sträuchern dar. In geringerer Vielfalt finden sich Arten von Dyckia auch in den die Campos Rupestres umgebenden Savannen, insbesondere dem Cerrado. Dabei finden sich unter den zur Ökoregion Cerrado zusammengefassten teils sehr unterschiedlichen Savannentypen gänzlich baumlose Grasländer bis hin zu halbimmergrünen Wäldern. Furley (1999) beschreibt fünf Untertypen, die vom gänzlich offenen Campo Limpo (portugiesisch für „sauberes Feld“), über die zunehmend mit Gehölzen bedeckten Typen Campo Sujo (portugiesisch für „schmutziges Feld“), Campo Cerrado (portugiesisch für „geschlossenes Feld“) und Cerrado sensu stricto (portugiesisch für „geschlossen“) bis hin zur Cerradão (portugiesisch für „großes Cerrado“) genannten Baumsavanne reichen. Sowohl die Nährstoffarmut der Böden als auch die Feuergefahr nehmen vom Grasland hin zum Cerradão ab. Arten von Dyckia kommen zumindest in den offeneren Formationen bis hin zum Cerrado sensu stricto vor, für gewöhnlich in besonders trockenen Gebieten. Beispielsweise D. irwinii wächst in offenem Buschland und Rändern von Büschen freier Bereiche in Höhen von 400-525 m, kommt in gänzlich offenen Gebieten aber nicht vor. Auch D. linearifolia ist auf offenes Buschland in 575-650 m beschränkt. D. grandidentata lebt in etwa 240 m Höhe auf felsigem Untergrund zwischen Bäumen und Sträuchern, also einem eher geschlossenen Cerrado (Braun & Pereira 2008). 15 Einleitung Azonale Standorte in anderen Ökoregionen Während Arten von Dyckia in den Campos Rupestres und auch Teilen der umgebenden Savannen zur typischen Vegetation gehören, sind sie in anderen Ökoregionen auf azonale Standorte mit untypischen Bedingungen beschränkt. Porembski et al. (1998) beschrieben Dyckia und auch Encholirium als Teil der Vegetation von Inselbergen der Mata Atlântica. 16 Abbildung 10: Lebensraum von Dyckia Verschiedene Vertreter von Dyckia im Habitat. A: D. edwardii in einem sehr xeromorphen Campo Cerrado (Typusstandort, nördliches Goiás, Brasilien). B: D. maritima auf exponiertem Fels nahe der Küste (Praia da Guarita, Torres, Rio Grande do Sul, Brasilien). C: D. brevifolia in einem saisonal ausgetrockneten Flussbett (Tal des Itajaí, Brasilien). D: D. julianae in einem eher mesomorphen Habitat. E: D. hebdingii in Gesellschaft mit Moosen und Flechten. Bild A aus Braun et al. (2008a) mit freundlicher Genehmigung von Pierre Braun (Kerpen, Deutschland), Bilder B und C mit freundlicher Genehmigung von Constantino Gastaldi (Joinville, Santa Catarina, Brasilien), Bilder D und E mit freundlicher Genehmigung von Holger Sachs (Hamburg, Deutschland). A B C D E Einleitung Selbst in Amazonien kommt Dyckia auf geeigneten felsigen Habitaten wie kleinflächigen Vorkommen von Cerrado und Campos Rupestres vor (Smith & Downs 1974), während ansonsten Regenwälder dominieren. Einige Vertreter von Dyckia leben nahezu auf Meereshöhe entlang der Atlantikküste im Süden Brasiliens und Uruguays. So finden sich beispielsweise D. maritima und D. encholirioides in felsigen Küstenhabitaten, zumeist in unmittelbarer Nähe zum Meer. Für den Süden Brasiliens, Uruguay und Teile Argentiniens ist ansonsten die Vegetation der Pampas typisch, durchsetzt von überwiegend granitischen Felskuppen (Olson et al. 2001; Overbeck et al. 2007). Winkler (1982) beschreibt die Pampa von Rio Grande do Sul, die den größten Teil dieses Bundesstaates bedeckt, als völlig frei von Vertretern der Bromeliaceae. Felsige Extrembiotope dieser Region werden dagegen fast immer von Dyckia besiedelt. Ein Beispiel ist die streng endemische D. choristaminea, welche auf Standorten bis zu 80 m über dem Meeresspiegel lebt. Weit verbreitet im südöstlichen Bolivien, dem nordöstlichen Argentinien, dem Süden Brasiliens und in Paraguay ist D. leptostachya, welche ebenfalls bis hinab auf Meereshöhe auftritt (Smith & Downs 1974). Schließlich kommen auch einige Vertreter von Dyckia bis hoch in die Vorgebirge der Anden vor. Beispiele sind D. floribunda und D. velascana, welche im Nordwesten Argentiniens weit verbreitet sind. Rheophyten Einen ungewöhnlichen Lebensraum besiedeln die rheophytischen Dyckia-Arten im Süden Brasiliens. Die Pflanzen wachsen in 30-400 m über Meereshöhe direkt in Flussbetten oder auf kleinen Sandbänken und überstehen die Regenzeit komplett untergetaucht. Für den Rest des Jahres zeichnen sich solche Biotope durch extreme Trockenheit aus (Abbildung 10 C). Zwei Arten finden sich am Rio Itajaí, D. ibiramensis ist ein strenger Endemit in einem kurzen Abschnitt des Oberlaufes um die Stadt Ibirama (Smith & Downs 1974; Hmeljevski et al. 2011). D. brevifolia besitzt ein größeres Verbreitungsgebiet flussabwärts bis nach Blumenau (Smith & Downs 1974; Rogalski 2007; Hmeljevski et al. 2011). Die ähnliche D. distachya kam geographisch deutlich getrennt von diesen beiden Arten an den Flüssen Rio Uruguay, Rio Parana und Rio Pelotas vor. Durch intensive Denaturierung der Flussläufe im Zuge von Dammbauten ist diese Art aber in ihrem natürlichen Habitat bis auf eine letzte Population ausgestorben (Smith & Downs 1974; Pompelli & Guerra 2004; 2005; Lobo et al. 2008; Wiesbauer 2008; Voltolini et al. 2009). 17 Einleitung 1.2.3 Physiologie, Ökologie und Fortpflanzungsbiologie Als Bewohner überwiegend trockener und heißer Standorte verfügen Vertreter von Dyckia über eine Reihe physiologischer und morphologischer Anpassungen. Wie auch Deuterocohnia und Encholirium betreiben alle bisher untersuchten Dyckia-Arten CAM- Photosynthese (Crayn et al. 2004). Eine vergleichende Studie zum Stoffwechsel von D. distachya und Vriesea platynema zeigte, dass D. distachya einen hohen Grad an Anpassungsfähigkeit und effektive Mechanismen zum Überleben unter widrigen Bedingungen aufweist (Uarrota et al. 2012 ). Als xeromorphe Anpassungen sind vor allem die Blattsukkulenz und der Fraßschutz durch die teils extreme Bestachelung zu nennen (Abbildung 11 A-C, vgl. 1.2.1). Ferner kann die starke Beschuppung vieler Arten als Schutz vor intensiver Strahlung und vor übermäßiger Verdunstung interpretiert werden. Die Bildung von Kolonien oder Polstern schafft ein günstiges Mikroklima und kann der Verdunstung auch aus dem unter der Pflanze befindlichen Substrat vorbeugen (Abbildung 11 D). Für die Pflanzengesellschaften des Cerrados stellen verheerende Flächenbrände eine ständige Bedrohung dar. Simon et al. (2009) vermuten eine Zunahme von Bränden in den letzten vier Millionen Jahren in Zusammenhang mit dem verstärkten Aufkommen leicht entzündlicher C4-Gräser in den Savannen. Widerstandsfähigkeit gegen Feuer stellt demnach eine wichtige Schlüsselinnovation für viele Bewohner dieser Lebensräume dar und mag auch als Motor zur schnellen Diversifizierung in vielen Pflanzengruppen gedient haben. Benzing (2000) beschreibt für die in den Campos Rupestres vorkommenden Vertreter von Dyckia und Encholirium eine ausgeprägte Resistenz gegen Feuer. So isolieren die stängelumfassenden Blattscheiden die Sprossachse gegen die Hitze, die Pflanzen können anschließend wieder austreiben. Teilweise bieten die Wände von mit den Pflanzen assoziierten Termitennestern zusätzlichen Schutz vor Feuer. Für D. maritima wurde eine besondere Anpassung an die teils extrem nährstoffarmen Böden beobachtet. So wachsen diese Pflanzen regelmäßig auf Nestern von Termiten der Art Cortaritermes silvestrii, welche ein ausreichendes Angebot an Nährstoffen bereitstellen. Diese Gemeinschaft ist ein gutes Beispiel für einen fakultativen Mutualismus, da die stark bewehrten Pflanzen einen guten Schutz für die Nester darstellen. Nur äußerst selten finden sich Termitennester ohne assoziierte Pflanzen von D. maritima (Waldemar & Irgang 2003). Auch für D. brasiliana wurde eine häufige Assoziation mit Termitennestern beschrieben (Smith 1966). Die Blütezeit der meisten Arten von Dyckia liegt meistens zwischen Oktober und Januar. Ausnahmen bilden beispielsweise D. reitzii sehr früh im September und D. selloa bis in den 18 Einleitung April hinein (Winkler 1982). Als Bestäuber fungieren insbesondere Kolibris (beispielsweise Colibri serrirostris, Clorostilbon aureoventris, Augastes scutatus oder Sappho sparganura), Bienen und Schmetterlinge (beispielsweise Papilio thoas), aber auch andere Insekten wie 19 Abbildung 11: Xeromorphe Anpassungen , extraflorale Nektarien und Bestäubung A: Stark bewehrte Blattränder als Fraßschutz bei D. goehringii, B: Querschnitt durch ein stark sukkulentes Blatt von D. marnier-lapostollei mit ausgedehntem Speichergewebe, C: Ausgeprägte Beschuppung bei D. marnier- lapostollei, D: Bildung einer dichten Kolonie aus Blattrosetten durch vegetative Proliferation bei D. rariflora. E: Nektartropfen aus extrafloralen Nektarien bei D. choristaminea . F: Zahlreiche Ameisen auf einer D. spec. in der Sammlung von Elton Leme (Teresópolis, Brasilien), G: Colibri serrirostris an Blüten von D. tuberosa. Bild F mit freundlicher Genehmigung von Nicole Schütz. Bild G mit freundlicher Genehmigung von Leandro Freitas (Rio de Janeiro, Brasilien). B C DA FE G Einleitung das Neozoon Apis melifera (Sazima et al. 1989; Bernadello et al. 1991; Vesprini et al. 2003; Freitas & Sazima 2006). Die meisten Arten gelten als selbstfertil, bei einigen Arten wie etwa D. tuberosa, D. mauriziae oder D. braunii konnte aber auch Selbstinkompatibilität beobachtet werden, was innerhalb der gesamten Bromeliaceae vergleichsweise selten ist (Vosgueritchian & Buzato 2006; Braun et al. 2008b; Esteves & Hofacker 2011). Die Spezifizität bezüglich der Bestäuber ist vermutlich meist gering. So wurden an D. distachya diverse Schmetterlingsarten, Schwebfliegen, verschiedene Bienenarten und Kolibris beobachtet (Wiesbauer 2008). Bei vielen Arten von Dyckia befinden sich extraflorale Nektarien entlang der Infloreszenzen (Abbildung 11 E). Die produzierte Menge an Nektar ist teils beträchtlich und stellt eine hohe Investition an Energie dar. Vesprini et al. (2003) beobachteten eine deutlich gesteigerte Samenproduktion bei D. floribunda, wenn die Pflanzen regelmäßig von Ameisen besucht werden. Dies wird auf die erfolgreiche Verteidigung der aggressiven Insekten gegen Herbivoren zurückgeführt. Im Gegensatz zu den unbewehrten und exponierten Infloreszenzen weisen die Blattrosetten keine extrafloralen Nektarien auf. Auch bei in botanischen Gärten kultivierten Pflanzen können häufig Ameisen auf den Infloreszenzen von Dyckia beobachtet werden (Abbildung 11 F). Alle Arten von Dyckia sind Windstreuer. Der Wind bewegt die elastischen Blütenstände und die Samen werden dann über kurze Distanzen geschleudert (Sitte et al. 2002). Boleochorie gilt jedoch als ineffektive Form der Samenverbreitung (Versieux & Wendt 2006), was in Anbetracht der verhältnismäßig großen Samen für Dyckia besonders zutreffend sein mag (vgl. Abbildung 4. Die Samen von Dyckia sind zur Keimung in völliger Dunkelheit fähig, während Encholirium ausschließlich im Licht keimt. Dieser Umstand kann beispielsweise relevant für die Keimung in Felsspalten sein (Tarré et al. 2007). Für D. encholirioides, welche nahe den Küsten des südlichen Brasiliens vorkommt, konnte eine hohe Resistenz der Samen gegen Salz gezeigt werden. Zwar reduziert ein salines Milieu die Keimfähigkeit, jedoch ist dieser Einfluss reversibel. So überleben die Samen und können erfolgreich keimen, wenn der Salzgehalt in der Umgebung abnimmt (Pompelli et al. 2006). 1.2.4 Taxonomische Geschichte Die gültige Erstbeschreibung der Gattung Dyckia lieferte 1830 Julius Hermann Schulte (*1804, †1840) durch die Publikation dreier Arten (Schultes & Schultes 1830). Er benannte die Gattung nach dem deutschen Adligen und Amateurbotaniker Joseph zu Salm- Reifferscheidt-Dyck (*1773, †1861). Von den drei publizierten Arten wurde erst sehr viel 20 Einleitung später D. densiflora als Lectotypus für die Gattung definiert (Smith 1979; Grant & Zijlstra 1998). Im selben Jahr beschrieb Karl Friedrich Philipp von Martius (*1794, †1868) die Gattung Encholirium als monotypisch mit dem einzigen Vertreter E. spectabile (Schultes & Schultes 1830). Karl Heinrich Koch (*1809, †1879) beschrieb 1873 Prionophyllum als monotypische Gattung mit dem einzigen Vertreter P. selloum und grenzte sie durch das Vorhandensein andromonözischer Blüten gegen Dyckia mit zwittrigen Blüten ab (Koch 1873). Wenig später synonymisierten George Bentham (*1800, †1884) und Joseph Dalton Hooker (*1817, †1911) Encholirium und Prionophyllum, was jedoch nie wieder aufgegriffen wurde. Ferner führten sie die griechische Schreibweise Encholirion ein, die zwar taxonomisch gesehen falsch ist, aber in der Literatur immer noch vereinzelt auftaucht (z. B. Terry et al. 1997). Im 1889 erschienenen Handbook of the Bromeliaceae (Baker 1889) findet sich eine erste umfassende taxonomische Bearbeitung von Dyckia. John Gilbert Baker (*1834, †1920) listet insgesamt 34 überwiegend von ihm selbst beschriebene Arten und drei Varietäten auf, verteilt auf fünf Untergattungen (Dyckia, Prionophyllum, Navia, Cephalonavia und Encholirion). Von diesen 34 Arten wurden viele im Laufe der Zeit in andere, teils weit entfernte Gattungen wie Connellia und Navia gestellt. Die Gattung Encholirium wurde später nie wieder in Dyckia mit einbezogen. Die nächste umfassende Bearbeitung von Dyckia veröffentlichte Carl Christian Mez (*1866, †1944) im dritten Band der Flora Brasiliensis (Mez 1894). Hier finden sich 46 Arten innerhalb von Dyckia, darunter 19 von Mez neu beschriebene. Prionophyllum wird in dieser Arbeit als eigenständige monotypische Gattung mit P. selloum geführt. Encholirium wird mit den zwei Arten E. spectabile und E. glaziovii erwähnt. Bereits kurze Zeit später führt Mez in einer eigenen Monographie der Bromeliaceae bereits 57 Arten für Dyckia auf, darunter 15 hier erstmals beschriebene (Mez 1896). Prionophyllum enthält mit der neu beschriebenen P. maritimum nun zwei Arten. Die 1851 als monotypisch beschriebene Gattung Garrelia (Gaudichaud-Beaupré 1851) wird als D. encholirioides nun zu Dyckia gestellt. Encholirium wird hier mit drei Arten angegeben, darunter die neu beschriebene E. subsecundum. Carl Christian Mez publizierte später noch eine weitere Monographie der gesamten Bromeliaceae (Mez 1935). Innerhalb von Dyckia zählt er 77 Arten auf. Prionophyllum wird 21 Einleitung hier unverändert mit zwei Arten angegeben. Encholirium enthält fünf Arten. Damit beschrieb Mez im Laufe seines Lebens insgesamt 49 Taxa innerhalb von Dyckia. In der folgenden Zeit machte sich in besonderem Maße Lyman Bradford Smith (*1904, †1997) um die Gattung Dyckia und die Bromeliaceae verdient. So beschrieb er insgesamt 55 Taxa innerhalb von Dyckia. Die bis heute umfassendste und aktuellste Monographie der Bromeliaceae und damit auch die bisher letzte Bearbeitung der Gattung Dyckia findet sich schließlich in Band 14 der Flora Neotropica (Smith & Downs 1974; 1977; 1979). Für Dyckia finden sich hier 106 Arten und sechs nicht typische Varietäten, Encholirium ist mit 14 Arten vertreten. Die drei ehemals zu Prionophyllum gestellten Arten sind nun in Dyckia enthalten. Seit 1991 publizierte Harry Luther regelmäßig neue Versionen einer Liste anerkannter Gattungen und Arten der Bromeliaceae. Die aktuelle und vermutlich finale 11. Ausgabe (Luther 2008) enthält für Dyckia 131 Arten und sieben nicht typische Varietäten. Seit deren Veröffentlichung wurden allerdings schon 27 weitere Arten für Dyckia neu beschrieben (Braun & Pereira 2008; Braun et al. 2008a; Strehl 2008; Braun & Pereira 2009; Braun et al. 2009; 2010; Leme 2010; Leme et al. 2010; Esteves & Hofacker 2011; Leme & Kollmann 2011; Guarçoni et al. 2012; Leme et al. 2012), so dass derzeit 158 gültige Arten und sieben 22 Abbildung 12: Historische Entwicklung der Anzahl anerkannter Arten von Dyckia und Encholirium Gezeigt ist der Umfang der Gattungen Dyckia und Encholirium in verschiedenen historischen Werken und heute. Die Jahreszahlen stehen für folgende Werke: Systema vegetabilum (Schultes & Schultes 1830), Handbook of the Bromeliaceae (Baker 1889), Flora Brasiliensis (Mez 1894), Monographiae Phanerogamarum (Mez 1896) und Flora Neotropica (Smith & Downs 1974). Die Angaben für 2012 beziehen die jüngste Literatur mit ein. 100 150 50 0 An za hl a ne rk an nt er Ta xa 1830 1889 1894 1896 1935 1974 2012 Jahr Dyckia Encholirium An za hl a ne rk an nt er Ta xa Einleitung Varietäten für Dyckia existieren. Während der gesamten taxonomischen Geschichte von Dyckia waren insgesamt über 240 Taxa beschrieben worden. Während die Flora Neotropica für Dyckia die letzte Bearbeitung darstellt, existiert für Encholirium eine aktuelle taxonomische Revision (Forzza 2005). Hier werden 23 der 47 während der gesamten taxonomischen Geschichte von Encholirium beschriebenen Arten anerkannt, eine davon mit vorläufiger Beschreibung (als E. sp. nov. ined.). Seitdem wurden drei weitere Arten beschrieben (Leme 2010; Forzza & Zappi 2011). Abschließend lässt sich feststellen, dass die Gattung Dyckia seit der letzten taxonomischen Bearbeitung von 112 auf 165 Taxa erweitert wurde. Insbesondere in jüngster Zeit hat die Publikation neuer Arten stark zugenommen, was eine umfassende taxonomische Revision der Gattung mehr als wünschenswert macht (Abbildung 12). 1.3 Ziele dieser Arbeit 1.3.1 Bisherige wissenschaftliche Arbeiten zu Dyckia Abgesehen von taxonomischen Bearbeitungen (vgl. 1.2.4) wurden bisher keine die gesamte Gattung umfassenden Arbeiten zu Dyckia durchgeführt. Nichtsdestotrotz lässt sich aus bisher zu den unterschiedlichsten Aspekten publizierten Arbeiten ein recht genaues Bild von Dyckia zeichnen. Insbesondere Erstbeschreibungen jüngeren Datums enthalten neben der Diagnose häufig eine Fülle weiterer Informationen zu Standort, Vergesellschaftung, Ökologie und mutmaßlichen Verwandtschaftskreisen innerhalb der Gattung (z. B. Rauh 1985; 1987; 1988; Till & W. Morawetz 1990; Rauh & Groß 1991; Braun et al. 2008a; 2008b; 2009; Strehl 2008; Leme et al. 2010; 2012). Informationen zur Gattung Dyckia finden sich auch in diversen Arbeiten, die sich mit den Bromeliaceae im Allgemeinen beschäftigen, wenngleich diese Arbeiten meist lokal begrenzte Gebiete abhandeln (Smith 1934; Winkler 1980; 1982; Versieux & Wendt 2006; 2007). Ferner gibt es Studien zur Keimungsfähigkeit von Dyckia und Encholirium unter verschiedenen Bedingungen und zum Einfluss von Lagerung und Kryokonservierung (Tarré et al. 2007). Ebenfalls einen Vergleich zwischen Dyckia und Encholirium zieht eine Arbeit zur Wurzelanatomie beider Gattungen (Pita & Menezes 2002). Immerhin 12 Vertreter von Dyckia wurden in eine Arbeit zur Samenmorphologie einbezogen (Strehl & Beheregaray 2006). In dieser Studie versuchten die Autoren, über biometrische Analysen die untersuchten Arten in Gruppen einzuteilen. 23 Einleitung Eine häufige Motivation, sich mit einzelnen Dyckia-Arten auseinanderzusetzen, liegt wohl in auch der anhaltenden Bedrohung ihrer natürlichen Standorte. So wurden an D. agudensis, D. distachya und D. maritima diverse Arbeiten zu ex situ-Konservierung, somatischer Embryogenese und Mikropropagation durchgeführt (Pompelli & Guerra 2004; 2005; Pompelli et al. 2005; Silva et al. 2007; 2008). Besonders interessant für die vorliegende Arbeit sind Studien zur Ökologie und Reproduktion von Dyckia. Für D. floribunda wurde beispielsweise der positive Einfluss von auf den Pflanzen lebenden Ameisen auf den Reproduktionserfolg erforscht (Vesprini et al. 2003). Bei D. maritima wurde ein fakultativer Mutualismus zwischen den Pflanzen und Termiten, auf deren Bauten sie wachsen, ausgemacht (Waldemar & Irgang 2003). An D. tuberosa wurden Blütenökologie und Bestäubung (Vosgueritchian & Buzato 2006) sowie das Keimungsverhalten ihrer Samen in Abhängigkeit von Licht und Temperatur studiert (Vieira et al. 2007). Für D. encholirioides wurde ebenfalls der Einfluss von unterschiedlichen Temperaturen und auch der Salzkonzentration auf das Keimungsverhalten untersucht (Pompelli et al. 2006). Für D. pseudococcinea schließlich existieren Arbeiten zur Beschaffenheit der Samen und der Entwicklung der Embryonen (Conceição et al. 2007; Mendes et al. 2010). Besonders gut untersucht sind die drei südbrasilianischen rheophytischen Arten D. brevifolia, D. distachya und D. ibiramensis betrachten. Hier gibt es ausgedehnte Studien zu anatomischen (Lobo 2007; Lobo et al. 2008; Voltolini et al. 2009) und ökologischen Besonderheiten (Rogalski 2007; Rogalski et al. 2009). Auch die Struktur von Populationen und der Genfluss zwischen solchen wurden an diesen Arten untersucht (Rogalski et al. 2007; Hmeljevski et al. 2011). Für D. distachya wurden detaillierte Untersuchungen zum Stoffwechsel durchgeführt (Uarrota et al. 2012 ). 1.3.2 Bisherige molekulare Arbeiten an Dyckia Größere molekulare Untersuchungen zur Phylogenie von Dyckia und auch Encholirium wurden bisher nicht durchgeführt. In Arbeiten, welche andere Gattungen oder die gesamte Familie der Bromeliaceae zum Gegenstand hatten, wurden jeweils nur eine, zwei oder maximal vier Akzessionen von Dyckia und Encholirium in die Untersuchungen eingeschlossen (Terry et al. 1997; Horres et al. 2000; Crayn et al. 2004; Givnish et al. 2004; 2007; 2011; Rex et al. 2009). Im Rahmen einer kürzlich als Dissertation publizierten taxonomischen Revision der Gattung Deuterocohnia wurden acht Akzessionen von Dyckia und zwei Arten von Encholirium in eine molekulare Phylogenie einbezogen, die allerdings nur eine geringe Auflösung zeigte (Schütz 2012). 24 Einleitung Die bisher umfangreichste Studie zu Dyckia wurde im Rahmen der Diplomarbeit des Verfassers durchgeführt und basiert auf den beiden plastidären Loci rpl32-trnL und matK (Krapp 2009). Eine begrenzte Auflösung und statistische Unterstützung der ermittelten Phylogenie sowie die limitierte Zahl an Proben, insbesondere von Encholirium, ließen aber keine belastbare Hypothesen zu. So konnten weder das Verhältnis von Dyckia und Encholirium zueinander geklärt werden, noch wurden Gruppierungen innerhalb von Dyckia mit ausreichender Unterstützung gefunden. Ferner brachte die Verwendung zahlreicher, aus Botanischen Gärten stammenden Pflanzen ohne gesicherte Dokumentation Probleme bezüglich der Interpretation mit sich. 1.3.3 Fragestellung Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Rekonstruktion der Phylogenie der Gattung Dyckia und ihre Evaluierung in Bezug auf folgende Fragen: Verhältnis von Dyckia und Encholirium • Stellen die Gattungen Dyckia und Encholirium jeweils monophyletische Abstammungsgemeinschaften dar und wie ist ihr Verhältnis zueinander? Wann und wo trennten sich die Gattungen voneinander? Verwandtschaftliche Beziehungen innerhalb von Dyckia • Können mittels vergleichender Sequenzierung plastidärer oder nukleärer DNA gut aufgelöste Phylogenien innerhalb von Dyckia rekonstruiert werden? Zeichnen sich Kladen innerhalb von Dyckia durch morphologische Synapomorphien aus? Historische Biogeographie von Dyckia • Auf welchen Wegen gelangten die rezenten Vertreter von Dyckia in ihre heutigen Verbreitungsgebiete? In welchem zeitlichen Rahmen spielten sich die Ausbreitung und Diversifizierung von Dyckia ab? Artenzahl und Artabgrenzung • Welche Faktoren führten zur außergewöhnlich hohen Artenzahl von Dyckia verglichen mit Encholirium? Gab es Radiationen? • Stellen die vielen beschriebenen Morphospezies distinkte genetische Abstammungseinheiten dar? Spiegelt sich die Plastizität morphologischer Merkmale auch in der genetischen Situation wider? 25 Einleitung 1.3.4 Einführung in die Methodik dieser Arbeit Zur Bearbeitung der gegebenen Fragestellung kamen molekulare Methoden zum Einsatz. Um die Auflösung der aus Sequenzdaten gewonnenen Phylogenien zu erhöhen, kamen neben der vergleichenden Sequenzierung von Bereichen des plastidären und des nukleären Genoms auch plastidäre Mikrosatellitenmarker zum Einsatz. Plastidäre Sequenzen Der große Vorteil plastidärer DNA ist die einfache Handhabbarkeit. Die hohe Kopienzahl des Plastoms pro Zelle erlaubt eine problemlose Amplifikation spezifischer Zielsequenzen mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) selbst aus DNA-Proben von geringer Qualität. Ferner tragen für gewöhnlich alle Plastiden einer Pflanze dieselbe Information. Dies liegt an der geringen Geschwindigkeit der Sequenzevolution, fehlenden Rekombinationsereignissen und den regelmäßigen genetischen Flaschenhälsen, die Plastiden-Populationen bei der Weitergabe über Samen durchlaufen (z. B. Small et al. 2004). Zudem bietet die strukturelle Uniformität sowie die hohe Konservierung von Sequenz und Abfolge von bestimmten Genen auf dem Plastom die Möglichkeit, universelle Primer zu entwickeln, die in vielen Pflanzengruppen funktionieren (Shaw et al. 2007; Knoop & Müller 2009). Die vergleichende Sequenzierung plastidärer Loci ist eine Standardmethode der Molekularsystematik bei Pflanzen und wurde innerhalb der Bromeliaceae für eine Vielzahl an Fragestellungen verwendet (z. B. Barfuss et al. 2005; Rex et al. 2009; Schulte et al. 2009; Givnish et al. 2011). Nukleäre Sequenzen Phylogenetische Analysen mit Sequenzen des Plastoms spiegeln nur die Evolution der maternalen Linie wider, da Plastiden in den meisten Angiospermen ausschließlich von der Mutterpflanze weitergegeben werden. Diese Art der Vererbung wird auch für die Bromeliaceae angenommen (z. B. Jabaily & Sytsma 2010). Um die Evolution sowohl der maternalen, als auch der paternalen Linie nachvollziehen zu können, müssen biparental vererbte Teile des Genoms untersucht werden, also das Genom des Zellkerns. Im Vergleich zur Sequenzierung von Abschnitten des Plastoms weisen nukleäre Loci allerdings eine Reihe von Besonderheiten und technischen Schwierigkeiten auf, die berücksichtigt werden müssen (vgl. 2.2.3.2). Trotz des höheren methodischen Aufwands rücken nukleäre Loci zunehmend in den Fokus für molekularsystematische Studien, auch innerhalb der Bromeliaceae (z. B. Schulte et al. 2009; Chew et al. 2010; Jabaily & Sytsma 2010; Sass & Specht 2010). 26 Einleitung Plastidäre Mikrosatelliten (SSRs) So genannte Mikrosatelliten (simple sequence repeats, SSRs) bestehen aus kurzen, tandemartig aufeinanderfolgenden repetitiven DNA-Sequenzmotiven. Es handelt sich dabei um besonders schnell evolvierende Bereiche des Genoms. Das Plastom der Pflanzen enthält insbesondere Mononukleotid-Wiederholungen vom Typ (A/T)n. Diese plastidären SSRs (cpSSRs) stellen oft wertvolle Werkzeuge für Studien auf niedrigem taxonomischem Niveau dar. So variiert ihre Länge häufig sogar zwischen Individuen der selben Population, wo DNA-Sequenzen anderer plastidärer Loci keinerlei Variabilität zeigen. Bei einem Mangel an Auflösung in auf Sequenzierung basierenden Phylogenien können cpSSRs auch mit Sequenzdaten kombiniert werden (z. B. Bänfer et al. 2006). Von Analysen variablerer Datensätze werden SSRs dagegen häufig ausgeschlossen (z. B. Rex et al. 2009). 27 Material und Methoden 2 Material und Methoden 2.1 Pflanzenmaterial Das für die vorliegende Arbeit verwendete Pflanzenmaterial umfasste neben der Gattung Dyckia auch Vertreter nahe verwandter Gattungen (Tabelle 1). Das für die vergleichende Sequenzierung verwendete 124 Proben umfassende Set enthielt 97 Akzessionen aus 58 verschiedene Arten von Dyckia. Dies entspricht einer Abdeckung von 37% aller 158 derzeit gültigen Arten. Auch das Verbreitungsgebiet von Dyckia ist durch diese Auswahl gut abgedeckt (vgl. Abbildung 13). Die Gattung Encholirium war mit neun Akzessionen vertreten, darunter vier verschiedene Arten und fünf nicht genau identifizierte Pflanzen. Eine weitere Probe (Gen. nov. spec. nov., FK0257) repräsentiert möglicherweise eine neue Gattung innerhalb der Unterfamilie Pitcairnioideae (Wanderley, unveröffentlichte Daten). Die Gattungen Deuterocohnia, Fosterella und Pitcairnia waren durch jeweils fünf Arten repräsentiert. Als Außengruppe für die Analysen plastidärer Daten wurden ferner zwei Arten der Gattung Puya eingeschlossen. Für die Pilotexperimente zur Charakterisierung plastidärer Loci wurde ein aus acht Dyckia- Proben bestehendes Testset (TS2) zusammengestellt (vgl. gekennzeichnete Proben in Tabelle 1). Weitere 28 Proben von Dyckia wurden für die Etablierung der cpSSR-Marker verwendet. Diese setzten sich aus je vier Individuen von je drei Populationen der Arten D. disstiflora und D. pernambucana sowie aus vier Individuen einer Population von D. limae zusammen (vgl. gekennzeichnete Proben in Tabelle 1). Für die Sequenzierung mittels 454- Technologie wurde eine Akzession von D. marnier-lapostollei var. estevesii (FK0030) ausgewählt. Dieses Individuum ist eine im Botanischen Garten Heidelberg kultivierte Nachkommenschaft des Typusexemplares und verfügt über eine ausgezeichnete Dokumentation. Weiterhin nimmt der Plastiden-Haplotyp dieser Pflanze eine zentrale Stellung in einem auf plastidären Daten basierenden phylogenetischen Netzwerk ein (vgl. 3.2.2). Dieser Umstand wurde als Indiz dafür gewertet, dass eine gute Übertragbarkeit von für diese Pflanze entwickelten cpSSR-Markern und flankierenden PCR-Primerpaaren auf andere Dyckia-Arten wahrscheinlich sein würde (vgl. auch 4.1.5). Bei Pflanzen aus Botanischen Gärten, insbesondere solchen, die schon lange in Kultur sind, ergeben sich oft Lücken in der Dokumentation. Pflanzen mit nicht eindeutig geklärter Herkunft wurden für diese Arbeit zumeist nicht verwendet. Nur in Ausnahmefällen wurde Akzessionen ohne Sammler-Nummer oder Fundortangaben eingeschlossen, etwa wenn die entsprechende Art anderweitig nicht verfügbar war. Ein Problem stellt auch der Austausch 28 Material und Methoden von Pflanzen der Botanischen Gärten untereinander dar, sofern keine eindeutigen Sammler- Nummern bekannt sind. Durch einen besonderen Augenmerk hierauf und den genauen Abgleich aller verfügbaren Daten konnte aber weitgehend ausgeschlossen werden, dass solche Duplikate im Probensatz enthalten waren. Die Gefahr, dass in Kultur befindliche Pflanzen hybridisieren und aus Samen gezogene Nachkommen somit die genetische Identität der Elternpflanze verloren haben, besteht für Dyckia kaum. Eine Vermehrung in Botanischen Gärten erfolgt in der Regel rein vegetativ, also durch vereinzelte Kindel oder Teilung von Horsten und Polstern. Aus Samen gezogene Pflanzen werden für gewöhnlich entsprechend gekennzeichnet und wurden in der vorliegenden Arbeit nicht verwendet. Anzumerken ist in diesem Zusammenhang auch, dass die Vermehrung über Samen wegen der maternalen Vererbung der Chloroplasten keinen Einfluss auf Analysen auf Basis plastidärer Daten hat. 29 Abbildung 13: Fundorte der in der vorliegenden Arbeit untersuchten Pflanzen von Dyckia Schwarz umrandete grüne Kreise markieren die Fundorte derjenigen 62 Akzessionen, für welche Koordinaten verfügbar waren. Für weitere 35 Pflanzen waren die Fundorte nicht ausreichend dokumentiert, um ihnen Koordinaten zuordnen zu können. Dies betraf 25 Pflanzen aus verschiedenen Bundesstaaten Brasiliens, vier aus Argentinien, zwei aus Paraguay und je eine aus Bolivien und Uruguay. Der hellgrün hinterlegte Bereich markiert das Verbreitungsgebiet von Dyckia. 500 km Wendekreis des Steinbocks Wendekreis des Krebses Brasilien Paraguay Bolivien Argentinien Uruguay 70° W 60° W 50° W 40° W 0° 10° S 20° S 30° S 40° S 50° S 10° N 20° N 30° N Material und Methoden Tabelle 1: Pflanzenmaterial Die nachstehende Tabelle listet alle im Rahmen dieser Arbeit verwendeten Pflanzen auf. Zuerst sind die untersuchten Vertreter von Dyckia in alphabetischer Reihenfolge aufgeführt, dann die Außengruppentaxa und zuletzt einige Populationsproben, die für die Charakterisierung plastidärer Mikrosatelliten (cpSSRs) verwendet wurden. Die in Klammern hinter den Artnamen angegebenen Abkürzungen (3-Buchstaben-Code) wurden für einige Abbildungen im Ergebnisteil verwendet. Die fortlaufend vergebene DNA-ID diente zur Identifikation der Proben im Labor und während der Datenanalyse (Ind.: Individuum-Nummer bei Populationen). Unter den DNA- IDs ist unter Verwendung der folgenden Abkürzungen vermerkt, für welche Projekte die entsprechenden Proben jeweils verwendet wurden (S: Sequenzierung an sechs plastidären Loci und phyC; C: Kombinierte Analyse von sechs plastidären Loci und 12 cpSSR-Loci, P: Entwicklung und Charakterisierung von cpSSR-Loci; T: Verwendung im Testset TS2 zur Etablierung von Loci zur Sequenzierung). Alle Fundorte sind jeweils als Kombination von Land (BR: Brasilien, BOL: Bolivien, DOM: Dominikanische Republik, MEX: Mexico, PE: Peru, PY: Paraguay, RA: Argentinien. RG: Guinea (Westafrika), ROU: Uruguay), Bundesstaat sowie Stadt oder Gegend angegeben (*: Lokalität wurde anhand der bekannten Verbreitung der jeweiligen Art angenommen). Die Sammler- Nummern sind angegeben, falls bekannt (s. n.: ohne bekannte Nummer). Für alle Pflanzen, die in Lebendsammlungen kultiviert wurden, ist die Garten-ID angegeben (B: Botanischer Garten Berlin-Dahlem, BGHD: Botanischer Garten Heidelberg, BONN: Botanischer Garten Bonn, KAS: Botanischer Garten der Universität Kassel, Leme: Lebendsammlung von Dr. Elton Leme (Teresópolis, Brasilien), MB: Botanischer Garten Marburg, WU: Botanischer Garten der Universität Wien). Verweise auf bekannte Herbarbelege enthalten den Namen des Herbariums und eine Nummer, soweit bekannt (Leme: Herbarbeleg angefertigt von Elton Leme (Aufbewahrungsort unbekannt), B: Herbarium des Botanischen Gartens Berlin-Dahlem, FR: Herbarium Senckenbergianum (Frankfurt), HD: Herbarium des Botanischen Gartens Heidelberg, HB: Herbarium Bradeanum (Universität Rio de Janeiro), LGBV/UPFE: Herbarium der Universität Pernambuco (Recife, Brasilien), RB: Herbarium des Botanischen Gartens Rio de Janeiro (Brasilien), SP: Herbarium der Universität Sao Paulo, WU: Herbarium der Universität Wien). Art Autor (Abkürzung) DNA-ID (Verwendung) Fundort (Koodinaten) Sammler-Nummer Garten-ID/Herbarbeleg Dyckia aurea L. B. Smith (aur) FK0194 (S) BR, Goiás, Cristalina (-16,7536; -47,4975) E. Leme 6445 Leme 6445 / (Leme) Dyckia beateae E. Gross & Rauh (bea) FK0091 (SC) BR, Mato Grosso do Sul, Coxim (-18,5; -54,75) E. Estenes s. n. Leme 1961 / (Leme) Dyckia beateae E. Gross & Rauh (bea) FK0044 (SC) BR, Mato Grosso, Araquainha (-16,8167; -53,0833) P. Braun 560 BONN 4338 / nicht vorhanden Dyckia brachyphylla L. B. Smith (brc) FK0045 (SC) BR, Minas Gerais, Itacambira (-17,0667; -43,3) P. Braun 836 BONN 3644 / nicht vorhanden Dyckia braunii Rauh (bra) FK0042 (SCT) BR, Goiás P. Braun 690 BONN 4339 / nicht vorhanden Dyckia brevifolia (aff.) Baker (bre) FK0010 (SCP) BR, Minas Gerais, Itacambira (-17,0667; -43,3) P. Braun 840 BGHD 130223 / HD 602993 Dyckia brevifolia Baker (bre) FK0067 (SC) BR s. n. KAS s. n. / nicht vorhanden Dyckia choristaminea Mez (cho) FK0021 (SC) BR*, Rio Grande do Sul* s. n. BGHD 130018 / nicht vorhanden Dyckia choristaminea Mez (cho) FK0040 (SC) BR*, Rio Grande do Sul* s. n. BONN 2410 / nicht vorhanden Dyckia cinerea Mez (cin) FK0047 (SC) BR*, Minas Gerais* s. n. BONN 4348 / nicht vorhanden Dyckia dawsonii L. B. Smith (daw) FK0043 (SC) BR*, Goiás* s. n. BONN 16540 / nicht vorhanden Dyckia delicata Larocca & Sobral (del) FK0184 (S) BR, Rio Grande do Sul E. Leme 6492 Leme 6492 / (Leme) Dyckia densiflora Schult. f. (den) FK0213 (S) BR, Minas Gerais, Serra da Piedade E. Leme 4249 Leme 4249 / (Leme) Dyckia distachya Hassl. (dit) FK0126 (S) PY, Paraguari, Chololo Ahlgrimm s.n. B 236-17-85-23 / Gartenherbarbeleg Berlin 26179 Dyckia elisabethae S. Winkl. (eli) FK0219 (S) BR, Rio Grande do Sul, Barra do Ribeiro (-30,2911; -51,3011) E. Leme 4461 Leme 4461 / (Leme) Dyckia encholirioides (Gaudichaud) Mez (enc) FK0095 (SC) BR E. Leme s. n. Leme s. n. / (Leme) Dyckia espiritosantensis Leme et al. (esp) FK0207 (S) BR, Espírito Santo, São Roque do Canaã (-19,7506; -40,7541) E. Leme 6930 Leme 6930 / (Leme) Dyckia estevesii var. braunii nom. nud. Rauh (bra) FK0004 (SC) BR, Goiás P. Braun s. n. BGHD 130025 / HD 602437 Dyckia estevesii Rauh (est) FK0005 (SCT) BR, Goiás, Caiaponia (-16,95; -51,8167) E. Esteves Pereira s. n. BGHD 105012 / HD 602151 Dyckia estevesii Rauh (est) FK0001 (SCPT) BR P. Braun s. n. BGHD 105188 / HD 602392 Dyckia estevesii Rauh (est) FK0033 (SC) BR*, Goiás* P. Braun s. n. BONN 1477 / nicht vorhanden Dyckia ferox Mez (fer) FK0027 (SC) BR, Bahia, Morro do Chapeu (-11,55; -41,15) L. Horst 375 BGHD 130028 / nicht vorhanden Dyckia ferox Mez (fer) FK0020 (SCPT) RA, Cordoba, Cerro Colorado (-30,1; -63,9333) W. Rauh 64237 BGHD 130031 / HD 602990 Dyckia ferox Mez (fer) FK0056 (SC) PY, Paraguari, Paraguari (-25,6333; -57,15) W. Till 6016 WU AB 60 / WU 0004637 Dyckia ferruginea Mez (feu) FK0090 (SC) BR, Mato Grosso do Sul E. Estenes s. n. Leme 1958 / (Leme) Dyckia floribunda Griseb. (flo) FK0107 (SC) RA, Cordoba, Dept. Jesus Maria, Ascochinga (-30,95; -64,2667) W. Till 5012 WU 52/90 / nicht vorhanden Dyckia floribunda Griseb. (flo) FK0052 (SC) RA, La Rioja, Patquia (-29,9; -67,15) W. Till 5069 WU 115/90 / nicht vorhanden 30 Material und Methoden Art Autor (Abkürzung) DNA-ID (Verwendung) Fundort (Koodinaten) Sammler-Nummer Garten-ID/Herbarbeleg Dyckia floribunda Griseb. (flo) FK0108 (SC) RA, San Juan, Chucuma (-31,0667; -67,3333) W. Till 5144 WU AB 17/90 / nicht vorhanden Dyckia fosteriana L. B. Smith (fos) FK0094 (SC) BR, Pará E. Leme 6461 Leme 6461 / (Leme) Dyckia goehringii E. Gross & Rauh (goe) FK0031 (SCP) BR, Minas Gerais, Diamantina (-18,25; -43,6) W. Rauh 67622 BGHD 105013 / HD 602160 Dyckia grandidentata Braun, P.J. & E. Esteves Pereira (grn) FK0183 (S) BR, Mato Grosso do Sul, Sete Quedas (-23,9702; -55,0356) E. Leme 6840 Leme 6840 / (Leme) Dyckia granmogulensis Rauh (gra) FK0007 (SCP) BR, Minas Gerais, Grao Mogol (-16,5667; -42,9) W. Rauh 56484 BGHD 130019 / HD 602161 Dyckia hebdingii L. B. Smith (heb) FK0013 (SCT) BR s. n. BGHD 103913 / nicht vorhanden Dyckia hebdingii L. B. Smith (heb) FK0038 (SC) BR*, Rio Grande do Sul* s. n. BONN 3259 / nicht vorhanden Dyckia hebdingii L. B. Smith (heb) FK0112 (SC) BR s. n. WU 130030 / nicht vorhanden Dyckia ibiramensis (aff.) Reitz (ibi) FK0025 (SCP) BR, Minas Gerais, Diamantina (-18,25; -43,6) L. Horst 1287 BGHD 130023 / HD 602979 Dyckia jonesiana Strehl (jon) FK0217 (S) BR, Rio Grande do Sul, Caçapava do Sul (-30,61; -53,4722) E. Leme 2959 Leme 2959 / (Leme) Dyckia leptostachya (aff.) Baker (lep) FK0035 (SC) RA, Cordoba, Dean Funes (-30,4333; -64,35) J. Piltz s. n. BONN 4355 / nicht vorhanden Dyckia leptostachya (aff.) Baker (lep) FK0016 (SC) RA, Cordoba, Cerro Colorado (-30,1; -63,9333) W. Rauh s. n. BGHD 130017 / nicht vorhanden Dyckia leptostachya (cf.) Baker (lep) FK0115 (SC) BOL, Santa Cruz, Mobote (-18,4167; -59,4167) H. Amerhauser 6 WU B 266/95 / WU 9962 Dyckia leptostachya Baker (lep) FK0053 (SCPT) PY, Cordillera, Caacupé (-25,3833; -57,15) H. Amerhauser s. n. WU B 395/96 / WU 0013898 Dyckia lindevaldae Rauh (lin) FK0019 (SCP) BR, Goiás, Alto Paraiso (-14,1167; -47,5167) P. Braun BR 691 BGHD 108614 / HD 600180 Dyckia lunaris Leme (lun) FK0193 (S) BR, Goiás, Alto Paraíso (-14,1167; -47,5167) E. Leme 4951 Leme 4951 / (Leme) Dyckia macedoi L. B. Smith (mac) FK0099 (SCP) BR, Minas Gerais, Santana do Riacho (-19,3539; -43,6237) R.B. Louzada, Sotero, D. & Medeiros, M. 151 Feldsammlung / RB Louzada - 151 Dyckia macedoi L. B. Smith (mac) FK0100 (SC) BR, Minas Gerais, Santana do Riacho (-19,3539; -43,6237) R.B. Louzada, Sotero, D. & Medeiros, M. 151 Feldsammlung / RB Louzada - 151 Dyckia macedoi L. B. Smith (mac) FK0101 (SC) BR, Minas Gerais, Santana do Riacho (-19,356; -43,608) R.B. Louzada, Sotero, D. & Medeiros, M. 153 Feldsammlung / SP 423596 Dyckia macedoi L. B. Smith (mac) FK0102 (SC) BR, Minas Gerais, Santana do Riacho (-19,356; -43,608) R.B. Louzada, Sotero, D. & Medeiros, M. 153 Feldsammlung / SP 423596 Dyckia machrisiana L. B. Smith (mah) FK0189 (S) BR, Goiás E. Esteves s. n. Leme 3291 / (Leme) Dyckia maracasensis Ule (maa) FK0087 (SC) BR, Bahia, Maracás (-13,4333; 40,45) G. Martinelli s. n. Leme 0274 / (Leme) Dyckia maritima Baker (mar) FK0092 (SC) BR, Rio Grande do Sul, Tôrres (-29,5; -50,1) E. Leme 3319 Leme 3319 / (Leme) Dyckia maritima Baker (mar) FK0113 (SC) BR* s. n. WU Genf / nicht vorhanden Dyckia marnier-lapostollei var. estevesii L. B. Smith/Rauh (man) FK0030 (SCP) BR, Goiás, Goiania (-16,6667; -49,2667) L. Horst 5 BGHD 130151 / HD 602165 Dyckia marnier-lapostollei var. marnier-lapostollei L. B. Smith (man) FK0029 (SCP) BR, Goiás, Cristalina (-16,75; -47,6) L. Horst 4 BGHD 130234 / HD 603051 Dyckia microcalyx (cf.) Baker (mic) FK0051 (SC) PY, Paraguari, Yaguarón (-25,6; -57,3) W. Till 6066 a WU AB 55 / WU 0004620 Dyckia microcalyx var. indet. Baker (mic) FK0009 (SC) PY, Paraguari, Acahay (-25,9167; -57,15) W. & S. Till 6021 BGHD 102970 / nicht vorhanden Dyckia microcalyx Baker (mic) FK0054 (SCP) PY, Paraguari, Acahay (-25,9167; -57,15) W. Till 6020 WU AB 57 / WU 0004631 Dyckia microcalyx Baker (mic) FK0111 (SC) PY, Paraguari, Yaguarón (-25,6; -57,3) W. Till 6066 WU AB 54 / nicht vorhanden Dyckia milagrensis Leme (mil) FK0096 (SC) BR, Bahia, Milagres (-12,9559; -39,8178) E. Leme s. n. Leme s. n. / (Leme) Dyckia mirandiana Leme & Z. J. G.Miranda (mir) FK0202 (S) BR, Goiás, Alto Paraíso (-14,1167; -47,5167) E. Leme 6379 Leme 6379 / (Leme) Dyckia monticola L. B. Smith & Reitz (mon) FK0088 (SC) BR, Santa Catarina, Campo Alegre (-26,1936; -49,2661) E. Leme 1664 Leme 1664 / (Leme) Dyckia nana Leme et al. (nan) FK0191 (S) BR, Minas Gerais, Diamantina (-18,3139; -43,8952) E. Leme 7485 Leme 7485 / (Leme) Dyckia niederleinii Mez (nie) FK0103 (SC) RA*, Misiones* s. n. MB 1982-166 / nicht vorhanden Dyckia niederleinii Mez (nie) FK0110 (SC) RA*, Misiones* s. n. WU 184/95 / nicht vorhanden Dyckia paraensis L. B. Smith (par) FK0190 (S) BR, Pará, Guarantan do Norte (-9,7875; -54,91) E. Leme 7647 Leme 7647 / (Leme) Dyckia pectinata L. B. Smith & Reitz (pec) FK0188 (S) BR, Minas Gerais E. Leme 6490 Leme 6490 / (Leme) Dyckia pernambucana L. B. Smith (per) FK0097 (SC) BR, Pernambuco, Brejo da Madre de Deus (-8,1894; -36,3931) Diego Pinangé Dyckia Pe-1 Feldsammlung / LGBV/UFPE DCKA - 09.2009 Dyckia pernambucana L. B. Smith (per) FK0098 (SC) BR, Pernambuco, Pesqueira (-8,32542; -36,7562) Diego Pinangé Dyckia Pe-2 Feldsammlung / LGBV/UFPE DCKA - 09.2009 Dyckia platyphylla L. B. Smith (pla) FK0209 (S) BR*, Bahia* E. Leme s.n. Leme s.n. / (Leme) Dyckia pulquinenses Wittm. (pul) FK0199 (S) BOL William Backer s. n. Leme 2415 / (Leme) Dyckia pumila (aff.) L. B. Smith (pum) FK0017 (SCP) BR, Mato Grosso, Ponte Branca (-16,45; -52,6667) P. Braun BR 696 BGHD 104592 / HD 603087 Dyckia pumila L. B. Smith (pum) FK0093 (SC) BR, Goiás, Caiaponia (-17,2; -51,7833) E. Leme 4706 Leme 4706 / (Leme) Dyckia rariflora Schult. f. (rar) FK0039 (SC) BR*, Minas Gerais* s. n. BONN 2411 / nicht vorhanden Dyckia reitzii (aff.) L. B. Smith (rei) FK0050 (SC) BR, Rio Grande do Sul, Cambará do Sul (-28,7; -50,4) A. Hofacker 386 WU B 02/62-1 / nicht vorhanden Dyckia remotiflora var. indet. Otto & A. Dietr. (rem) FK0015 (SC) BR L. Horst 345 BGHD 130010 / nicht vorhanden Dyckia remotiflora var. indet. Otto & A. Dietr. (rem) FK0011 (SCP) BR L. Horst s. n. BGHD 130009 / HD 603049 31 Material und Methoden Art Autor (Abkürzung) DNA-ID (Verwendung) Fundort (Koodinaten) Sammler-Nummer Garten-ID/Herbarbeleg Dyckia remotiflora Otto & A. Dietr. (rem) FK0055 (SC) unbekannt s. n. WU AB 3/86 / nicht vorhanden Dyckia remotiflora Otto & A. Dietr. (rem) FK0068 (SCT) ROU s. n. KAS s. n. / nicht vorhanden Dyckia rojasii Mez (roj) FK0195 (S) BR, Paraná, Rio Branco do Ivaí (-24,3241; -51,3125) E. Leme 6465 Leme 6465 / (Leme) Dyckia saxatilis Mez (oli) FK0036 (SC) BR, Minas Gerais, Serro (-18,6167; -43,3833) W. Barthlott 10327 BONN 4346 / nicht vorhanden Dyckia secunda L. B. Smith (sec) FK0192 (S) BR, Bahia, Contendas do Sincorá (-13,7958; -41,05) E. Leme 3682 Leme 3682 / (Leme) Dyckia spec. (Encholirium inerme) FK0086 (SC) BR, Minas Gerais, Diamantina (-18,25; -43,6) L. Horst 386 BGHD 130035 / HD 602169 Dyckia spec. FK0049 (SC) PY, Boquerón, Fortín Capitan Demattei (-22,7; -60,7667) H. Amerhauser 96-15 WU 401/96 / nicht vorhanden Dyckia spec. FK0024 (SC) RA, Catamarca, Belen (-27,65; -67,0333) Leuenberger, Arroyo & Eggli 4254 a BGHD 104100 / nicht vorhanden Dyckia spec. FK0116 (SC) unbekannt s. n. WU 1088 / nicht vorhanden Dyckia spec. FK0023 (SC) RA, Salta, Salta (-24,7833; -65,4167) W. Rauh 64142 BGHD 130026 / nicht vorhanden Dyckia tobatiensis Hassl. (tob) FK0018 (SCP) PY, Cordillera, Tobati (-25,25; -57,0667) W. & S. Till 6050 BGHD 102969 / WU 0004624 Dyckia tomentella Mez (tom) FK0114 (SC) PY* s. n. WU 210/91 / nicht vorhanden Dyckia tuberosa (aff.) (Vellozo) Beer (tub) FK0206 (S) BR, Paraná, São Gerônimo da Serra (-23,7275; -50,7411) E. Leme 6837 Leme 6837 / (Leme) Dyckia ursina L. B. Smith (urs) FK0089 (SC) BR, Minas Gerais, Jaboticatubas (-19,5; -43,75) E. Leme 1837 Leme 1837 / HB 75959 Dyckia ursina L. B. Smith (urs) FK0012 (SC) BR s. n. BGHD 103809 / nicht vorhanden Dyckia velascana (cf.) Mez (vel) FK0106 (SC) RA, Tucumán, Famaillá (-27,05; -65,4) W. Till 10245 WU B 13/93 / nicht vorhanden Dyckia velascana Mez (vel) FK0104 (SC) RA* s. n. WU 68/88 / nicht vorhanden Dyckia velascana Mez (vel) FK0105 (SC) RA* s. n. WU B 183/95 / nicht vorhanden Dyckia velascana Mez (vel) FK0006 (SCPT) RA, Cordoba, Ascochinga (-30,95; -64,2667) W. & S. Till 5012 BGHD 103740 / WU 1996 Dyckia vestita Hassl. (ves) FK0032 (SCP) PY, Paraguari, Paraguari (-25,6333; -57,15) W. & S. Till 6018 BGHD 103741 / WU 0004633 Dyckia vestita Hassl. (ves) FK0109 (SC) PY, Paraguari, Paraguari (-25,6333; -57,15) W. Till 6019 WU AB 59 / nicht vorhanden Encholirium erectiflorum L. B. Smith (Eer) FK0123 (SC) BR* P. Braun 4072 BGHD s. n. / nicht vorhanden Encholirium horridum L. B. Smith (Eho) FK0070 (SCP) BR, Minas Gerais, Pedra Azul (-15,9867; -41,4069) W. Schindhelm s. n. BGHD 108213 / HD 602384 Encholirium magalhaesii (crassiscapum) L. B. Smith (Ema) FK0122 (SCP) BR* s. n. BONN 4344 / nicht vorhanden Encholirium maximum Forzza & Leme (Emx) FK0124 (SC) BR* P. Braun 4063 BGHD s. n. / nicht vorhanden Encholirium spec. (Dyckia spec.) FK0014 (SC) BR, Bahia, Brumado (-14,2167; -41,6667) W. Rauh 56468 BGHD 130033 / nicht vorhanden Encholirium spec. (Esp) FK0078 (SC) BR* R. Schulz s. n. BGHD 125585 / nicht vorhanden Encholirium spec. (Esp) FK0079 (SC) BR* R. Schulz s. n. BGHD 143704 / nicht vorhanden Encholirium spec. (Esp) FK0080 (SC) BR* R. Schulz s. n. BGHD 112920 / nicht vorhanden Encholirium spec. (Esp) FK0125 (SC) BR* s. n. B 232-39-94-60 / nicht vorhanden Deuterocohnia brevifolia (Grisebach) M.A. Spencer & L. B. Smith FK0074 (S) BOL, Tarija, Aniceto Arce (-21,96015; -64,68135) N. Schütz 06/060 KAS NiSch 06/060 / FR Deuterocohnia brevispicata Rauh & L. Hromadnik (Dbr) FK0071 (SCP) BOL, Santa Cruz, Samaipata (-18,01537; -64,10005) N. Schütz 06/028 KAS NiSch 06/028 / FR Deuterocohnia cf. haumanii Castellanos FK0075 (S) RA, Salta, Cafayate (-25,67935; -65,69088) N. Schütz 06/122 KAS NiSch 06/122 / FR Deuterocohnia glandulosa E. Gross FK0072 (SP) BOL, Santa Cruz, Ipati (-19,70633; -63,65212) N. Schütz 06/019 KAS NiSch 06/019 / FR Deuterocohnia meziana Kuntze ex Mez (Dme) FK0073 (S) BOL, Chuquisaca, Monteagudo (-19,78683; -64,0397) N. Schütz 06/009 KAS NiSch 06/009 / FR Fosterella albicans (Grisebach) L. B. Smith FK0117 (S) BOL, Santa Cruz, Pampagrande (-18,1486; -63,93) J. Peters 06.0005 KAS JP06.0005 / HD 916972 (als JP 06.0003) Fosterella penduliflora (C.H. Wright) L. B. Smith FK0081 (S) BOL, Tarija, Aniceto Arce (-22,20639; -64,62306) J. Peters 06.0054 KAS JP06.0054 / HD Fosterella spectabilis H. Luther FK0118 (S) BOL, Chuquisaca, Monteagudo (-19,5386; -64,1244) J. Peters 06.0046 KAS JP06.0046 / HD 916948 (als JP 06.0047) Fosterella villosula (Harms) L. B. Smith FK0076 (SP) BOL, Cochabamba, Cochabamba (-17,0611; -65,6444) J. Peters 06.0105 KAS JP06.0105 / HD 916960 (als JP06.0108) Fosterella weddelliana (Brongniart ex Baker) L. B. Smith FK0077 (SP) BOL, Solacana M. Miyagawa s. n. BGHD 104866 / HD 602059 Gen. nov. spec. nov. Wanderley (Nov) FK0257 (S) BR, Piauí M. G. L. Wanderley & Sousa, G. M. 2630 Feldsammlung / SP Pitcairnia feliciana (A. Chevalier) Harms & Mildbraed FK0119 (SP) RG, Prefecture de Kindia, Kindia (10,0667; -12,85) I. Ebert & D. Bangoura s. n. ex coll. P. Bak WU s. n. / nicht vorhanden Pitcairnia fuertesii Mez FK0120 (S) DOM, Prov. Puerto Plata, Puerto Plata (19,7833; -70,7) W. Till 18087 WU s. n. / WU 0013678 Pitcairnia heterophylla (Lindley) Beer FK0083 (SP) MEX, Guerrero, Cruz de Ocotte (17,55; 99,8833) K. Senghas O-11230 BGHD 104945 / HD 104945 Pitcairnia pipenbringii Rauh & E. Gross FK0085 (S) BR, Bahia, Barreiras (-12,128; -44,989) W. Rauh 67430 BGHD 103786 / HD 602406 Pitcairnia pungens Link, Klotzsch & Otto FK0084 (S) PE, Lambayeque, valley of Olmos river W. Rauh 69140 BGHD 130648 / HD 130648 Puya ferruginea (Ruiz & Pavón) L. B. Smith FK0082 (SP) PE, valley of Rio Marañon W. Rauh s. n. BGHD 130165 / nicht vorhanden Puya herzogii Wittm. FK0121 (SP) BOL, Cochabamba, Carrasco (-17,1933; -64,9731) T. Krömer 6581 BGHD 105240 / HD 602390 32 Material und Methoden Art Autor (Abkürzung) DNA-ID (Verwendung) Fundort (Koodinaten) Sammler-Nummer Garten-ID/Herbarbeleg Dyckia dissitiflora (Population "Morrao") Schult. f. (dis) FK0153 (Ind. 02) FK0154 (Ind. 06) FK0155 (Ind. 10) FK0156 (Ind. 01) (P) BR, Bahia, Morro do Chapéu (-11,59014; -41,20722) A.M. Iseppon, Pinangé, D. & Cruz, G. 1562 Feldsammlung / LGBVl/UFPE 1562 Dyckia dissitiflora (Population "Lajes") Schult. f. (dis) FK0147 (Ind. 01) FK0148 (Ind. 02) FK0149 (Ind. 03) FK0150 (Ind. 04) (P) BR, Bahia, Morro do Chapéu (-11,60097; -41,16447) A.M. Iseppon, Pinangé, D. & Cruz, G. 1598 Feldsammlung / LGBV/UFPE 1598 Dyckia dissitiflora (Population "Cachocheira") Schult. f. (dis) FK0141 (Ind. 12) FK0143 (Ind. 06) FK0145 (Ind. 05) FK0244 (Ind. 19) (S (nur Ind. 12) P) BR, Bahia, Morro do Chapéu (-11,62792; -41,0005) A.M. Iseppon, Pinangé, D. & Cruz, G. 1605 Feldsammlung / LGBV/UFPE 1605 Dyckia limae (Population "Jerusalém") L. B. Smith (lim) FK0247 (Ind. 02) FK0248 (Ind. 04) FK0255 (Ind. 05) FK0256 (Ind. 06) (P) BR, Pernambuco, Buíque (-8,58372; -37,23836) A.M. Wanderley s.n. Feldsammlung / SP Dyckia pernambucana (Population "Papagaio") L. B. Smith (per) FK0251 (Ind. 01) FK0252 (Ind. 02) FK0253 (Ind. 03) FK0254 (Ind. 04) (P) BR, Pernambuco, Triunfo (-7,82275; -38,05536) A.M. Wanderley s.n. Feldsammlung / SP Dyckia pernambucana (Population "Aldeia") L. B. Smith (per) FK0171 (Ind. 01) FK0176 (Ind. 06) FK0249 (Ind. 08) FK0250 (Ind. 09) (P) BR, Pernambuco, Pesqueira (-8,32542; -36,75617) D. Pinangé, R.B.Louzada & Cruz, G. DCK1B (D90) Feldsammlung / LGBV/UFPE DCKB - 09.2009 Dyckia pernambucana (Population "Brejo") L. B. Smith (per) FK0178 (Ind. 03) FK0180 (Ind. 05) FK0181 (Ind. 06) FK0246 (Ind. 08) (P) BR, Pernambuco, Brejo da Madre de Deus (-8,18936; -36,39311) D. Pinangé, R.B.Louzada & Cruz, G. DCK3A Feldsammlung / LGBV/UFPE DCKA - 09.2009 2.2 Molekulare Methoden 2.2.1 DNA-Isolation Für einige Pflanzen (DNA-Nummern von FK0087-0102 und FK0141-0257 sowie alle Populationsproben von D. dissitiflora, D. limae und D. pernambucana, vgl. Tabelle 1) wurde die Gesamt-DNA von Kooperationspartnern isoliert. Hier kam ein gängiges Protokoll mit Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB) zur Lyse der Biomembranen zum Einsatz, das auf Murray & Thompson (1980) zurückgeht. Verwendet wurde eine abgewandelte Prozedur (Saghai-Maroof et al. 1984; Doyle & Doyle 1987), auf die an dieser Stelle aber nicht näher eingegangen werden soll. Für die übrigen Proben kam eine speziell für sukkulente Pflanzen angepasste Variante der CTAB-Methode zum Einsatz, welche auf Tel-Zur et. al. (1999) zurückgeht. Vor der Lyse der Zellmembranen wird hier in mehreren Waschschritten ein großer Teil von Cytoplasma und Vakuoleninhalt entfernt. Lösungen und Reagenzien: • Sorbitol-Puffer (100 mM Tris-HCl pH 8, 5 mM EDTA, 0,35 M Sorbitol) • Sorbitol-Waschpuffer (Sorbitol-Puffer zuzüglich 1% v/v 2-Mercaptoethanol, 1% w/v PVP-40) 33 Material und Methoden • Hoch-Salz 3x CTAB-Puffer, pH 8 (100 mM Tris-HCl, 20 mM EDTA, 3 M NaCl, 3% w/v CTAB) • Extraktionspuffer (Hoch-Salz 3x CTAB-Puffer zuzüglich 1% v/v 2-Mercaptoethanol, 1% w/v PVP-40) • Sarkosyl (30% wässrige Lösung) • Chloroform/Isoamylalkohol (24:1 v/v) • 3 M Natriumacetatlösung, pH 5,2 • Isopropanol • 70% Ethanol • TE-Puffer, pH 8 (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA) • RNase A (5 mg/ml, Invitrogen, Carlsbad, Kalifornien, USA) Durchführung: Von frischem oder gefrorenem Pflanzenmaterial wurden 500 mg, von Trockenmaterial 50 mg unter Zugabe von flüssigem Stickstoff gemörsert. Nach Überführung in ein 15 ml-Falcon- Röhrchen wurde 4 °C kalter Sorbitol-Waschpuffer bis zum Endvolumen von 14 ml zugegeben, geschüttelt und für 20 min auf Eis inkubiert. Die Konzentration des Zuckeralkohols Sorbitol entspricht in etwa der natürlichen physiologischen Osmolarität von Pflanzenzellen und verhindert ein Platzen der Zellorganellen durch osmotischen Wassereinstrom. Polyvinylpyrrolidon (PVP-40) dient der Absorption von Polyphenolen. Das Reduktionsmittel 2-Mercaptoethanol dient der Inhibition von Oxidationsprozesse und dem Schutz von Proteinen wie etwa Histonen. Durch Zentrifugation (4.000 rpm für 25 min bei 4 °C, Variofuge 3.0 R, Heraeus Instruments, München) wurden Zellwandtrümmer und Organellen sedimentiert, der Überstand verworfen. Dieser Waschschritt wurde zweimal wiederholt. Das nach der letzten Zentrifugation erhaltene Pellet wurde in 600 µl Extraktionspuffer und 30 µl 30%igem Sarkosyl gelöst und die verbliebenen Membranen für etwa 60 min bei 60 °C im Wasserbad lysiert. Die hohe Konzentration von NaCl vermindert die Kopräzipitation von Polysacchariden, das anionische Tensid Sarkosyl dient als salz-unempfindliches Detergens. Nach Zugabe von 600 ml Chloroform/Isoamylalkohol und Inkubation für 20 min unter Schwenken erfolgte eine Phasentrennung durch Zentrifugation (4.000 rpm für 20 min bei Raumtemperatur, Variofuge 3.0 R, Heraeus Instruments, München). Von der wässrigen oberen Phase wurden bis zu 1.000 µl in ein frisches 1,5 ml-Reaktionsgefäß überführt. Die Interphase, welche unter anderem Fasern und größere Gewebetrümmer enthielt, sowie die 34 Material und Methoden organische untere Phase, in welcher sich ein Großteil der Proteine und hydrophobe Substanzen wie Chlorophyll und Lipide angereichert hatten, wurden verworfen. Gelegentlich wurden auch Teile von organischer Phase und Interphase mit überführt, weshalb generell eine zweite Zentrifugation durchgeführt wurde (10.000 g für 10 min bei Raumtemperatur, Centrifuge 5804 R, Eppendorf, Hamburg). Bis zu 800 µl der danach erhaltenen wässrigen Phase wurden in ein neues 1,5 ml-Reaktionsgefäß überführt ohne ein eventuell vorhandenes Pellet zu stören. Aus dieser Lösung wurde die DNA durch Zugabe von 80 µl Natriumacetatlösung und 600 µl Isopropanol gefällt. Nach einer Inkubation bei 4 °C über Nacht erfolgte eine Zentrifugation (14.000 g für 20 min bei 4 °C, Centrifuge 5804 R, Eppendorf, Hamburg). Der resultierende Überstand wurde verworfen, dem Pellet wurden 500 µl 70% Ethanol zugegeben und es wurde erneut zentrifugiert (14.000 g für 10 min bei Raumtemperatur, Centrifuge 5804 R, Eppendorf, Hamburg). Dieser Waschschritt wurde einmal wiederholt, um letzte Reste des Extraktionspuffers und der enthaltenen Salze zu entfernen. Nach dem erneuten Abgießen des Überstandes wurde die DNA getrocknet (10 min bei 50 °C, Savant SpeedVac SPD101B, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA). Nach dem Lösen in 100 µl TE-Puffer wurden 2 µl RNase A zugegeben und die RNA über Nacht bei Raumtemperatur verdaut. Die Konzentration und Qualität der gewonnenen DNA wurde mittels Gelelektrophorese überprüft (vgl. 2.2.2). Die Lagerung erfolgte bei -20 °C. Für die meisten Anwendungen wurden Arbeitslösungen mit einer Verdünnung der Stammlösung von 1:10 in TE-Puffer verwendet. 2.2.2 Gelelektrophorese Mittels Gelelektrophorese lassen sich elektrisch geladene Makromoleküle nach Ladung oder Größe auftrennen. Nukleinsäuren besitzen in Lösung eine einheitliche negative Ladung pro Masse. Im elektrischen Feld werden DNA-Moleküle also gleichermaßen zur Anode hin beschleunigt. Passieren die Fragmente auf ihrem Weg eine hinreichend engmaschige Matrix, so werden sie in ihrer Bewegung gehindert. Je länger ein Fragment ist, desto langsamer bewegt es sich durch die Matrix hindurch. Für die Auftrennung großer DNA- Fragmente eignen sich weitmaschige Agarosegele, kleine Fragmente werden mittels engmaschiger Polyacrylamidgele (PAA) aufgetrennt (Polyacrylamidgelelektrophorese, PAGE). Nach der Auftrennung wird die DNA im Gel gefärbt. Hierzu wird meistens der Farbstoff Ethidiumbromid verwendet, der mit DNA interkaliert und bei Anregung mit UV-Licht fluoresziert. Es gibt auch alternative Farbstoffe, die wegen ihrer geringeren Giftigkeit 35 Material und Methoden heutzutage teilweise bevorzugt werden, aber auch viel teurer und häufig qualitativ nicht besser als Ethidiumbromid sind (Mülhardt 2006). Zur Abschätzung der Fragmentgrößen werden auf parallelen Bahnen DNA-Längenstandards (DNA-Ladder) aufgetragen, die aus einem Gemisch von Fragmenten bekannter Größe bestehen. Auf ähnliche Weise können DNA-Mengen abgeschätzt werden, indem Proben bekannter DNA-Konzentration als Referenzproben aufgetragen werden. Lösungen und Reagenzien: • 0,5x TBE-Puffer, pH 8 (45 mM Tris-Borat, 1 mM EDTA) • Agarose (Agarose NEEO Roti®garose, Carl Roth, Karlsruhe) • 6x Auftragspuffer (40% v/v Glycerin, 0,1% w/v Bromphenolblau, 0,1% w/v Xylencyanol in 0,5x TBE-Puffer • Ethidiumbromid-Färbelösung (1µg/ml Ethidiumbromid in 0,5x TBE-Puffer) • 100 bp Längenstandard (Invitrogen, Carlsbad, Kalifornien, USA) • 1 kb Längenstandard (Invitrogen, Carlsbad, Kalifornien, USA) • Phage λ-DNA (Fermentas, Burlington, Ontario, Canada) in den Konzentrationen 5, 10, 20, 50 und 100 ng/µl in TE-Puffer Durchführung: Die jeweilige Menge an Agarose wurde zunächst in 0,5x TBE-Puffer aufgekocht und anschließend auf etwa 60 °C gekühlt. Nach dem Gießen und einer Polymerisationszeit von mindestens 30 min wurden die Gele in einer Flachbettelektrophoreseapparatur mit 0,5x TBE- Puffer überschichtet und beladen. Sofern der Ladepuffer nicht schon im PCR-Ansatz enthalten war (vgl. 2.2.3) wurden je 2 µl der Probe mit 3 µl Wasser und 1 µl 6x Auftragspuffer vermischt. Nach erfolgter Elektrophorese wurden die Gele für etwa 10 min in Ethidiumbromid-Färbelösung geschwenkt und unter UV-Licht fotografiert (BioDocAnalyze, Biometra, Göttingen). PCR-Produkten wurden für gewöhnlich in 1,5%igen Gelen in einem elektrischen Feld von etwa 6 V/cm für 30-45 min aufgetrennt. Die Fragmentgrößenbestimmung erfolgte mittels eines komigrierenden 100 bp Längenstandards. Besonders große Produkte wurden in 1,0%igen Gelen für längere Zeit aufgetrennt und mit einem 1 kb Längenstandard verglichen. Aus DNA-Isolationen wurden jeweils 2 µl der erhaltenen Stammlösung in 0,8%igen Agarosegelen in einem elektrischen Feld von etwa 4 V/cm für etwa 30 min aufgetrennt. Die Abschätzung der aufgetragenen DNA-Menge und der Konzentration der Stammlösung 36 Material und Methoden erfolgte durch Vergleich mit jeweils 2 µl DNA bekannter Konzentration (5, 10, 20, 50 und 100 ng/µl) aus dem Phagen λ. 2.2.3 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Mittels der Polymerase-Kettenreaktion (polymerase chain reaction, PCR) können DNA- Abschnitte gezielt in vitro vervielfältigt werden (Mullis et al. 1986). Durch hohe Temperatur werden zunächst die Doppelstränge der zu kopierenden Templat-DNA in zwei Einzelstränge getrennt (Denaturierung). Nach Absenkung der Temperatur können sich die Primer, kurze einzelsträngige Oligodesoxynukleotide, an die Templat-DNA anlagern (Annealing). Das zu vervielfältigende Fragment wird durch die gewählten Primersequenzen determiniert, die komplementär zu den Flanken der Zielregion sind. Im Anschluss werden die Primer durch eine DNA-abhängige DNA-Polymerase verlängert (Elongation). Die Verwendung thermostabiler Polymerasen (Saiki et al. 1988) erlaubt die zyklische Wiederholung dieser drei Schritte und eine exponentielle Amplifikation der Zielregion (Mülhardt 2006). 2.2.3.1 Untersuchte plastidäre Loci Das als Plastom bezeichnete Genom der Plastiden verfügt in höheren Pflanzen über eine konservierte Struktur (Abbildung 14). Es handelt sich um ein zirkuläres Molekül doppelsträngiger DNA. In der Regel verfügt es über einen großen (large single-copy, LSC) und einen kleinen (small single-copy, SSC) Einzelkopiebereich, welche durch zwei inverse duplizierte Bereiche (inverted repeats, IR) voneinander getrennt sind. Die IRs besitzen normalerweise identische Sequenzen und dieser Zustand wird durch konzertierte Evolution aufrechterhalten. Wegen dieses Phänomens ist die Variabilität innerhalb der IRs allerdings um den Faktor 2,3 geringer als in den Einzelkopiebereichen (Perry & Wolfe 2002), was sie für phylogenetische Untersuchungen auf niedriger taxonomischer Ebene vergleichsweise wenig interessant macht. Prinzipiell gibt es auf dem Plastom drei Arten von Regionen, nämlich kodierende Bereiche (Exons von Genen), Introns und intergenische Bereiche. Die beiden letzteren gelten aufgrund des geringeren oder fehlenden Selektionsdrucks als deutlich variabler (z. B. Knoop & Müller 2009). An Genen finden sich etwa auf dem in Abbildung 14 dargestellten Plastom von Typha latifolia (Guisinger et al. 2010) solche für ribosomale Proteine (rpl, rps), eine RNA- Polymerase prokaryotischen Typs (rpo), eine ATP-abhängige Protease (clpP), Proteine der Photosysteme I und II (psa, psb), den Cytochrom-bf6-Komplex (pet), die große RuBisCo- Untereinheit (rbcL), eine NADH-Dehydrogenase (ndh) sowie einige offene Leseraster mit teilweise ungeklärter Funktion (ycf, ccsA, cemA). Ferner existiert eine große Zahl an Genen für tRNAs (trn) und für einige katalytische ribosomale RNAs (rrn). 37 Material und Methoden Im Folgenden werden die für die vorliegende Arbeit untersuchten Abschnitte des Plastoms kurz beschrieben: rpl 32 -trn L Das Gen rpl32 kodiert für ein Protein der großen ribosomalen Untereinheit, trnL kodiert für eine tRNA für die Aminosäure Leucin (Anticodon UAG). Der intergenische Bereich dazwischen wurde von Shaw et al. (2007) als besonders variabel identifiziert. Zur 38 Abbildung 14: Genkarte des Plastoms von Typha latifolia (nach Guisinger et al. 2010) Die Rechtecke im äußeren Kreis markieren diejenigen Bereiche des Plastoms, die im Rahmen der vorliegenden Arbeit auf ihre Eignung für die vergleichende Sequenzierung für Arten von Dyckia hin untersucht wurden. Die sechs für die endgültigen Analysen ausgewählten Loci sind dunkelgrün hervorgehoben. Die Rechtecke im zweiten Kreis von Innen markieren diejenigen Bereiche des Plastoms, in denen plastidäre Mikrosatelliten (cpSSRs) gefunden wurden und für die Primerpaare zur Amplifikation entworfen wurden. Die 12 für die endgültigen Analysen ausgewählten Loci sind rot hervorgehoben (vgl. 2.2.5 und 3.4). Typha latifolia Plastom 161.572 bp LSC: 89.140 bp SSC: 19.652 bp IR: je 26.390 bp Material und Methoden Amplifikation mittels PCR wurde von denselben Autoren ein universelles Primerpaar für Angiospermen publiziert. Der Locus rpl32-trnL wird seitdem zunehmend für phylogenetische Studien innerhalb der Bromeliaceae verwendet (z. B. Givnish et al. 2011; Schütz 2012; Wagner et al. 2012). Für die Amplifikation und Sequenzierung in zwei Teilstücken wurden zusätzliche interne Primer benutzt, die von Schütz (2012) entworfen wurden. rps 16- trn K Das Gen rps16 kodiert für ein Protein der kleinen ribosomalen Untereinheit, trnK kodiert für eine tRNA für die Aminosäure Lysin (Anticodon UUU). Zur Amplifikation des sehr variablen Bereiches dazwischen wurden ebenfalls universelle Primer publiziert (Shaw et al. 2007). Innerhalb der Bromeliaceae wurde der Locus bisher vor allem für die Gattungen Deuterocohnia und Fosterella (beide Pitcairnioideae) eingesetzt (Schütz 2012; Wagner et al. 2012). Zur Amplifikation und Sequenzierung in drei Teilstücken wurden im Rahmen der vorliegenden Arbeit zusätzliche interne Primerpaare entworfen (Tabelle 2). mat K Das Gen matK ist im trnK-Intron lokalisiert und codiert für die einzige Maturase des Plastoms. Diese spielt eine universale Rolle beim Spleißen von Klasse II-Introns (Hausner et al. 2006; Borsch & Quandt 2009). Obwohl es sich hierbei um eine kodierende Region handelt, zeigte matK in diversen Studien an Bromelien eine relativ hohe Variabilität mit einem hohen Anteil an Substitutionen (Barfuss et al. 2005; Rex 2007; Schulte et al. 2009). Für die vorliegende Arbeit wurde der Locus in drei Teilstücken amplifiziert und sequenziert. Für das 5'-Ende des Locus (Teil a) wurden wurden publizierte Bromelien-spezifische Primer verwendet (Crayn et al. 2000; Schulte et al. 2005). Für die Amplifikation des 3'-Endes (Teile b und c) wurden auf Basis publizierter Sequenzen (Crayn et al. 2004; Rex et al. 2009) neue Primerpaare entwickelt (Tabelle 2). rps 16 - Intron Sequenzen des Introns im rps16-Gen haben sich bereits in vielen phylogenetischen Arbeiten an diversen Bromeliaceae bewährt (z. B. Crayn et al. 2004; Barfuss et al. 2005; Rex et al. 2009; Jabaily & Sytsma 2010; Givnish et al. 2011; Schütz 2012). Zur Amplifikation wurden universelle Primer verwendet, die von von Oxelman et al. (1997) entwickelt wurden (Tabelle 2). 39 Material und Methoden Tabelle 2: PCR-Primer zur Amplifikation plastidärer DNA-Abschnitte Die Bezeichnungen für die aufgelisteten Primer entsprechen der von den jeweiligen Autoren verwendeten Nomenklatur. Für die Sequenzierung von PCR-Produkten wurden die Primer auch mit angehängten M13- Sequenzen verwendet (vgl. erste und zweite Tabellenzeile). Locus Primer Sequenz (5'-3') Quelle Programme M13 M13f M13r TGTAAAACGACGGCCAGT CAGGAAACAGCTATGACC Fartmann et al. 1999 Fartmann et al. 1999 n/a atpB-rbcL atpB_fwd atpB-rbcL a rev atpB-rbcL b fwd rbcL_rev GAAGTAGTAGGATTGATTCTC TATAATGATAGAGAAATGAAACAC ATTGCAAGTAGATGAAATCGTG CAACACTTGCTTTAGTCTCTG Manen et al. 1994 diese Arbeit diese Arbeit Manen et al. 1994 UniPCRFK atpF-Intron sak21F (exon/D1) sak22R (D5) AAAGGGAGTGTGTGYGAGTT CCCGAACCAAAYATGAATCTTTC Watts et al. 2008 Watts et al. 2008 UniPCRFK matK matK5(F) BROM1(R) matK_b_fwd matK_b_rev matK_c_fwd matK_c_rev ATACCCTGTTCTGACCATATTG GGTTCCAGAAGATGTTAATCG TCTGAATGYGAATTTKTATTCG TCTACATATCCGACCAAATCG GTACTGTATCGGGACACCC CACATATCAAATTTACATCCCG Crayn et al. 2000 Schulte et al. 2005 diese Arbeit diese Arbeit diese Arbeit diese Arbeit UniPCRFK (alle Teile), Crayn_2000 (Teil a) ndhA-Intron ndhAx1 ndhAx2 GCYCAATCWATTAGTTATGAAATACC GGTTGACGCCAMARATTCCA Shaw et al. 2007 Shaw et al. 2007 UniPCRFK ndhF ndhF 032F ndhF 745F ndhF 1101R ndhF 1927R TACCTTTTCTTCCACTTCCAGTT TGGTTACCTGATGCTATGGAAGG GGTGAATATCCAACAATAGGTTCC CACATTTTTTATTCGGTCCACAAG Terry et al. 1997 Terry et al. 1997 Terry et al. 1997 Terry et al. 1997 Wagner_2005 nhdF-rpl32 ndhF rpl32-R GAAAGGTATKATCCAYGMATATT CCAATATCCCTTYYTTTTCCAA Shaw et al. 2007 Shaw et al. 2007 UniPCRFK petB-Intron sak23F (exon/D1) sak24R (D5) GGARTATGAGTGTGTGACTTG ATRTGAGANTTTCATCTCGTAC Watts et al. 2008 Watts et al. 2008 UniPCRFK petD-Intron sak17F (exon/D1) sak18R (D6/exon) GGATTATGGGAGTGTRYGACTTG CTTTGTTATTGGGATAGGTGAA Watts et al. 2008 Watts et al. 2008 UniPCRFK psbA-trnH psbA fwd trnH rev GTTATGCATGAACGTAATGCTC CGCGCATGGTGGATTCACAAATC Sang et al. 1997 Sang et al. 1997 Wagner_2007 psbB-psbH psbBf psbHr AGATGTTTTTGCTGGTATTGA TTCAACAGTTTGTGTAGCCA Shinozaki et al. 1986 Shinozaki et al. 1986 Xu_2000 psbD-trnT psbD fwd trnT(GGU) rev CTCCGTARCCAGTCATCCATA CCCTTTTAACTCAGTGGTAG Shaw et al. 2007 Shaw et al. 2007 UniPCRFK psbJ-petA psbJ petA ATAGGTACTGTARCYGGTATT AACARTTYGARAAGGTTCAATT Shaw et al. 2007 Shaw et al. 2007 UniPCRFK rbcL rbcL 1F rbcL 636F rbcL 724R rbcL 1460R ATGTCACCACAAACAGAAACTAAAGC GCGTTGGAGAGATCGTTTCT TCGCATGTACCTGCAGTAGC TCCTTTTAGTAAAAGATTGGGCCGAG Fay et al. 1998 Fay et al. 1998 Fay et al. 1998 Fay et al. 1998 Barfuss_2007 rpl32-trnL rpl32-F trnL(UAG) rpl32 internal rev trnL internal fwd CAGTTCCAAAAAAACGTACTTC CTGCTTCCTAAGAGCAGCGT TTTCATATCTATCACAATTTCATCA GAGATTGAAACTCTTTTGTTATATGC Shaw et al. 2007 Shaw et al. 2007 Schütz 2012 Schütz 2012 UniPCRFK rpoB-trnC rpoB fwd trnCGCA rev CKACAAAAYCCYTCRAATTG CACCCRGATTYGAACTGGGG Ohsako & Ohnishi 2000 Ohsako & Ohnishi 2000 Wagner_2007 rps16-Intron rpsF (fwd) rpsR2 (rev) GTGGTAGAAAGCAACGTGCGACTT TGCGGATCGAACATCAATTGCAAC Oxelman et al. 1997 Oxelman et al. 1997 UniPCRFK rps16-trnK rps16x2F2 trnK(UUU)x1 rps16-trnK b fwd rps16-trnK a rev rps16-trnK c fwd rps16-trnK b rev AAAGTGGGTTTTTATGATCC TTAAAAGCCGAGTACTCTACC GGGAAGGGTAACTAGTATC AAGAAAAAGGAAAATGGTGTG CTTTTCCTTAATTTTTTCCATTCC AAAGACTTGTGTTGGATTGGC Shaw et al. 2007 Shaw et al. 2007 diese Arbeit diese Arbeit diese Arbeit diese Arbeit UniPCRFK trnD-trnT trnDGUC fwd trnTGGU rev ACCAATTGAACTACAATCCC CTACCACTGAGTTAAAAGGG Demesure et al. 1995 Demesure et al. 1995 Wagner_2007, UniPCRFK trnL-trnF TabC fwd TabF rev CGAAATCGGTAGACGCTACG ATTTGAACTGGTGACACGAG Taberlet et al. 1991 Taberlet et al. 1991 Wagner_2007 trnQ-5'rps16 trnQ(UUG) rps16x1 GCGTGGCCAAGYGGTAAGGC GTTGCTTTYTACCACATCGTTT Shaw et al. 2007 Shaw et al. 2007 UniPCRFK trnS-trnG trnS* fwd trnG* rev AACTCGTACAACGGATTAGCAATC GAATCGAACCCGCATCGTTAG Shaw et al. 2007 Shaw et al. 2007 Wagner_2007 trnV-ndhC trnV(UAC)x2 ndhC GTCTACGGTTCGARTCCGTA TATTATTAGAAATGYCCARAAAATATCATATTC Shaw et al. 2007 Shaw et al. 2007 UniPCRFK ycf3-trnS (rps4-trnT) rps4 fwd trnT2 rev TCSTATTCCTGCAGTACAGG CTGTAGGTGTAACCTTTCGC Saltonstall 2001 Saltonstall 2001 Saltonstall_2001 40 Material und Methoden Tabelle 3: PCR-Programme zur Amplifikation plastidärer DNA-Abschnitte Die Programme wurde teils von den angegeben Autoren übernommen, teils selbst entworfen. Nach Ablauf des jeweiligen Programmes wurden die Proben auf 10 °C heruntergekühlt. Programm Zeit Temperatur Zyklenzahl Quelle Verwendet für matK_Crayn_2000 90 s 30 s 60 s 120 s 94 °C 94 °C 42 °C 72 °C ┐ ├ 26x ┘ Crayn et al. 2000 matK Teil a ndhF_Wagner_2005 30 s 60 s 60 s 60 s 240 s 92 °C 92 °C 45 °C 72 °C 72 °C ┐ ├ 39x ┘ Wagner 2007 ndhF psbA-trnH_Wagner_2007 300 s 30 s 30 s 60 s 600 s 80 °C 94 °C 50 °C 72 °C 72 °C ┐ ├ 35x ┘ Wagner 2007 psbA-trnH psbB-psbH_Xu_2000 300 s 60 s 60 s 120 s 600 s 94 °C 94 °C 58 °C 72 °C 72 °C ┐ ├ 35x ┘ Xu et al. 2000 psbB-psbH rbcL_Barfuss_2007 180 s 60 s 60 s 120 s 840 s 94 °C 94 °C 48 °C 72 °C 72 °C ┐ ├ 36 x ┘ Barfuss et al. 2005 rbcL rpoB-trnC_Wagner_2007 300 s 60 s 120 s 180 s 300 s 80 °C 96 °C 52 °C 72 °C 72 °C ┐ ├ 35x ┘ Wagner 2007 rpoB-trnC trnD-trnT_Wagner_2007 300 s 45 s 60 s 60 s 600 s 80 °C 94 °C 52 °C 72 °C 72 °C ┐ ├ 30x ┘ Wagner 2007 trnD-trnT trnL-F_Wagner_2007 300 s 60 s 60 s 120 s 300 s 80 °C 94 °C 50 °C 72 °C 72 °C ┐ ├ 35x ┘ Wagner 2007 trnL-trnF trnS-trnG_Wagner_2007 300 s 60 s 60 s 120 s 600 s 80 °C 95 °C 50 °C 65 °C 65 °C ┐ ├ 35x ┘ Wagner 2007 trnS-trnG trnS-ycf3_Saltonstall_2001 300 s 60 s 60 s 150 s 600 s 80 °C 94 °C 52 °C 65 °C 65 °C ┐ ├ 35x ┘ Saltonstall 2001 trnS-ycf3 UniPCRFK 300 s 60 s 60 s 120 s 300 s 80 °C 95 °C 52 °C 65 °C 65 °C ┐ ├ 30 x ┘ diese Arbeit atpB-rbcL, atpF-Intron, matK Teil a, b und c, ndhA-Intron, nhdF-rpl32, petB-Intron, petD-Intron, psbD-trnT, psbJ-petA, rpl32-trnL, rps16-Intron, rps16-trnK, trnD-trnT, trnQ-5'rps16, trnV-ndhC pet D - Intron Für Klasse II-Introns wurde gezeigt, dass der größte Teil der hier auftretenden Variabilität auf Bereiche entfällt, welche sich bei der Ausbildung der Sekundärstruktur in ungepaarten Schleifen (loops) befinden (Kelchner & Wendel 1996; Löhne & Borsch 2005). Intramolekular paarende Bereiche sind dagegen stärker konserviert. Watts et al. (2008) entwickelten aus 41 Material und Methoden diesem Grund universelle Primerpaare (Tabelle 2), welche die Domäne IV diverser Introns amplifizieren, die eine besonders große Schleife enthält. Im trnK-Intron liegt in dieser Domäne das offene Leseraster für die Maturase matK, welches aber in allen anderen Introns degeneriert und funktionslos ist (Hausner et al. 2006). Die unterliegende Sequenz steht damit nicht unter Selektionsdruck und sollte neutral und schnell evolvieren (Watts et al. 2008). Das hier untersuchte Gen petD kodiert für ein Protein des Cytochrom-bf6-Komplexes und wurde für Studien innerhalb der Bromeliaceae bisher nicht verwendet. trn D -trn T Der Bereich zwischen den Genen für eine tRNA für Asparaginsäure (Anticodon GUC) und für eine tRNA für Threonin (Anticodon GGU) wird seit langem für phylogenetische Analysen in unterschiedlichsten Pflanzengruppen verwendet. Ein universelles Primerpaar (Demesure et al. 1995) erlaubt meistens eine problemlose Amplifikation (Tabelle 2). Für die Variabilität des Locus fanden Shaw et al. (2007) überdurchschnittliche Werte. Für Studien innerhalb der Bromeliaceae wurde bislang keine Arbeit mit diesem Locus publiziert. Tabelle 4: Zusammensetzung der PCR-Ansätze zur Amplifikation plastidärer DNA-Abschnitte Da die DNA-Konzentrationen nicht exakt bestimmt wurden, ist die Menge an zugefügter Templat-DNA als Richtwert zu verstehen (*). Zutat Stammkonzentration Volumen pro 20 µl-Ansatz Endkonzentration 5x Mango-Taq gefärbter Puffer (Bioline, Taunton) 5x 4,0 µl 1x MgCl2 50 mM 0,6 µl 1,5 mM dNTPs (Carl Roth, Karlsruhe) 2,5 mM 1,6 µl 0,2 mM Primer 1 10 µM 0,5 µl 0,25 µM Primer 2 10 µM 0,5 µl 0,25 µM BSA (Invitrogen, Carlsbad) 20 µg/ml 0,5 µl 0,5 µg/µl Mango-Taq DNA Polymerase (Bioline, Taunton) 5 U/µl 0,4 µl 0,1 U/µl DNA-Templat (Arbeitslösung) * 2,0 µl * Aqua bidest - 9,9 µl - Sonstige verwendete plastidäre Loci Im Rahmen von Pilotversuchen wurden ferner die intergenischen Bereiche atpB-rbcL, nhdF-rpl32, psbA-trnH, psbB-psbH, psbD-trnT, psbJ-petA, rpoB-trnC, trnS-ycf3 (von Saltonstall (2001) als rps4-trnT publiziert), trnL-trnF, trnQ-5'rps16, trnS-trnG und 3'trnV-ndhC, die exonischen Bereiche ndhF und rbcL, sowie die intronischen Bereiche atpF-Intron, ndhA-Intron und petB-Intron verwendet. Die dafür eingesetzten Primer sind Tabelle 2 zu entnehmen. Auf diese Regionen soll hier nicht im Detail eingegangen werden, da sie sich aus verschiedenen Gründen als nicht geeignet erwiesen und daher für die endgültigen Analysen nicht verwendet wurden. 42 Material und Methoden 2.2.3.2 Untersuchte nukleäre Loci Das Genom des Zellkerns bietet eine Vielzahl unterschiedlichster Loci, deren vergleichende Sequenzierung sich für phylogenetische Analysen prinzipiell eignet. Die klaren Vorteile sind die schnellere Evolution vieler Bereiche im Vergleich zum Plastom, die vielen unabhängigen Loci und die biparentale Vererbung. Methodisch ist die Untersuchung nukleärer DNA allerdings deutlich anspruchsvoller. Dies liegt zum einen in der allelischen Variation der allermeisten Loci begründet. In einem diploiden Organismus gibt es wenigstens zwei verschiedene Kopien (Allele) eines jeden nukleären DNA-Abschnitts. Unterscheiden sich diese Allele hinsichtlich ihrer Länge, so lassen sich die mit flankierenden Primerpaaren erzeugten PCR-Produkte nicht direkt sequenzieren, sondern müssen kloniert werden. Ferner muss bei nukleären Loci besonderes Augenmerk auf die Homologie verglichener Sequenzen gelegt werden. Durch Genduplikationen können zwei oder mehrere Paraloge entstehen, die dann unabhängig voneinander evolvieren. Daher muss stets beachtet werden, dass für phylogenetische Analysen nur orthologe Sequenzen verglichen werden (z. B. Small et al. 2004; Hughes et al. 2006; Knoop & Müller 2009). Im methodisch einfachsten Fall werden Gene untersucht, von denen es nur eine einzige Version (single copy) oder wenige Versionen (low copy) gibt. Zeigen die vorkommenden Allele keine Längenvariabilität innerhalb einzelner Akzessionen, so ist keine aufwändige Klonierung nötig. Für die in dieser Arbeit untersuchten nukleären Loci wurde aufgrund von publizierten Untersuchungen vermutet, dass sie als Einzelkopie vorliegen. Phytochrom C ( phy C) Gene der Phytochrom-Familie codieren für eine Reihe an Photorezeptor-Proteinen, welche in die Steuerung diverser Entwicklungsprozesse der Pflanzen involviert sind (Kutschera 2002). Alle Proteine der Genfamilie können in zwei unterschiedlichen Konformationen vorliegen und absorbieren dann entweder kurzwelliges (666 nm) oder langwelliges (730 nm) rotes Licht (in Arabidopsis thaliana, Sharrock & Quail 1989). Besonders gut erforscht sind die Proteine Phytochrom A und Phytochrom B. Phytochrom A wird bei Licht schnell abgebaut, kommt also insbesondere in etiolierten Pflanzen vor, während Phytochrom B photostabil ist. Das Protein Phytochrom C ist ebenfalls photostabil und hat in Arabidopsis thaliana bedeutenden Einfluss auf Blütezeit und Wachstumsantwort von Keimlingen (Balasubramanian et al. 2006). Für die Duplikation des Vorläufers aller Phytochrom-Gene wird ein Zeitpunkt vor der Trennung von monokotylen und dikotylen Pflanzen angenommen. Im paarweisen Vergleich der Aminosäuresequenzen der Phytochrome A, B und C zeigen sich lediglich Ähnlichkeiten von 49-52% (Sharrock & Quail 1989). Somit sind auch die 43 Material und Methoden paralogen Phytochrom-Gene ausreichend unterschiedlich, um einzelne Versionen gezielt und eindeutig durch spezifische PCR-Primerpaare anzusprechen und zu amplifizieren. Das Gen phyC wurde in der Vergangenheit mehrfach für phylogenetische Arbeiten sequenziert. Für monokotyle Pflanzen wurden beispielsweise Sequenzen von phyC verwendet, um bei allohexaploidem Weizen (Triticum aestivum) den evolutionären Zusammenhang seiner drei Vorläufer zu untersuchen (Devos et al. 2005). Bei phylogenetischen Untersuchungen in der dikotylen Familie Phyllanthaceae kam für phyC eine direkte Sequenzierung ohne Klonierung zum Einsatz (Kathriarachchi et al. 2005; Samuel et al. 2005). Für phylogenetische Studien innerhalb der Bromeliaceae erlebt phyC derzeit einen regelrechten Boom, da auch hier Amplifikation und Sequenzierung ohne vorherige Klonierung möglich sind. So wurde kürzlich eine auf dem phyC-Gen basierende Arbeit an Puya publiziert (Jabaily & Sytsma 2010). Für die Unterfamilien Tillandsioideae, Bromelioideae sowie alle weiteren Gattungen der Pitcairnioideae laufen derzeit ebenfalls Projekte mit phyC (z. B. Schütz et al., unveröffentlichte Daten). Tabelle 5: PCR-Primer zur Amplifikation nukleärer Loci Die Bezeichnungen für die aufgelisteten Primer entsprechen der von den jeweiligen Autoren verwendeten Nomenklatur. Für die Sequenzierung von PCR-Produkten wurden die Primer auch mit angehängten M13- Sequenzen verwendet (vgl. erste und zweite Tabellenzeile in Tabelle 2). Locus Primer Sequenz (5'-3') Quelle ETS ETS_Sass_fwd ETS_Sass_rev Baldwin_S26-IGS_fwd Baldwin_S18-IGS_rev Chew_Till1_fwd Chew_Till2_rev GTTTCGGCCTCCCAGTCTAGC CAACCAGGTAGCATGTCCTTTG GGATTGTTCACCCACCAATAGGGAACGTGAGCTG GAGACAAGCATATGACTACTGGCAGGATCAACCAG TCGCACGCCCCGYGGGCTCCCT CTCCCTGCCTCCGCGCAGYCGA Sass & Specht 2010 Sass & Specht 2010 Baldwin & Markos 1998 Baldwin & Markos 1998 Chew et al. 2010 Chew et al. 2010 ITS 5A 5.8SR 5.8SF 241R CCTTATCATTTAAGAGGAAGGAG ACGGGATTCTGCAATTCACAC TCACGGCAACGGATATCTCGG CAGTGCCTCGTGGTGCGACA Jabaily & Sytsma 2010 Jabaily & Sytsma 2010 Jabaily & Sytsma 2010 Jabaily & Sytsma 2010 Malatsynthase ms526f ms943r GGACTATAAGCTTCCATGACCTC GTCTTNACRTAGCTGAADATRTARTCCC Lewis & Doyle 2001 Lewis & Doyle 2001 Phytochrom C PHYC-F PHYC-R CCAGCTACTGATATACCTCAAGCTTC CCAGCTTCCATAAGGCTATCAGTACT Samuel et al. 2005 Samuel et al. 2005 Phytochrom C phyc515f2 phyc1699r2 phyc524f phyc1690r phyc974f2 phyc1145r AAGCCCTTYTACGCTATCCTGCACCG ATWGCATCCATTTCAACATCTTCCCA GCTATCCTGCACCGGATCGAYGT TCAACATCTTCCCAYGGGAGGCT GCTCCTCACGGCTGCCACGCTCA CCTGMARCARGAACTCACAAGCATATC Barfuss unpubliziert Barfuss unpubliziert Barfuss unpubliziert Barfuss unpubliziert Barfuss unpubliziert Barfuss unpubliziert Für die vorliegende Arbeit wurden Bereiche des ersten Exons von Phytochrom C verwendet. Als Primer wurden zunächst von Samuel et al. (2005) publizierte Sequenzen getestet, die bereits in Puya funktioniert hatten (fälschlicherweise als intronisch bezeichnet bei Jabaily & Sytsma 2010). Des weiteren kamen speziell für Bromeliaceae entwickelte Primer zum Einsatz, welche sowohl die Amplifikation eines etwa 1.200 bp langen Fragmentes von 44 Material und Methoden Exon 1 erlauben, als auch die Amplifikation von zwei Einzelteilen innerhalb dieses Bereiches (Michael Barfuss, Universität Wien, persönliche Mitteilung). Alle verwendeten Primer sind in Tabelle 5 zusammengestellt. Tabelle 6: PCR-Programme zur Amplikation nukleärer Loci Einige Programme wurden in verschiedenen Modifikationen verwendet, die durch hochgestellte Buchstaben markiert sind. So wurden für jedes Programm mit vorangestelltem Buchstaben jeweils diejenigen Parameter verwendet, die in den mittleren Spalten mit eben diesem Buchstaben gekennzeichnet sind. Zur genauen Identifikation ist das Datum der jeweils ersten Verwendung im Programmnamen enthalten. Nach Ablauf des jeweiligen Programms wurden die Proben auf 10 °C heruntergekühlt. Programm Zeit Temperatur Zyklenzahl Quelle ETS_HF High Fidelity (Rovalab HF) (für ETS Baldwin/Chew) 120 s 20 s 40 s 300 s 300 s 95 °C 95 °C 58 °C 72 °C 72 °C ┐ ├ 31x ┘ diese Arbeit ETS_Krapp 300 s 60 s 60 s 60 s 420 s 94 °C 94 °C 55 °C 72 °C 72 °C ┐ ├ 35x ┘ diese Arbeit MS_Lewis 240 s 60 s 60 s 120 s 420 s 94 °C 94 °C 55 °C 72 °C 72 °C ┐ ├ 35x ┘ Lewis & Doyle 2001 MS_Krapp 240 s 60 s 60 s 120 s 420 s 94 °C 94 °C 50 °C 72 °C 72 °C ┐ ├ 45x ┘ diese Arbeit PHYC_Samuel 120 s 60 s 30 s 60 s 600 s 94 °C 94 °C 48 °C 72 °C 72 °C ┐ ├ 35x ┘ Samuel et al. 2005 PHYC_Barfuss 120 s 15 s 30 s 120 s 15 s 30 s 120 s + 10 s/Zyklus 490 s 94 °C 94 °C 59 °C 70 °C ramp 1 °C/s 94 °C 59 °C 70 °C ramp 1 °C/s 70 °C ┐ ├ 15x ┘ ┐ ├ 20x ┘ Barfuss unpubliziert Einfache Amplifikation A: phyc_20100518 B: phyc_20100527 C: phyc_20100531 D: phyc_nest_1_20100906 E: phyc_bandstab_1_20101110 F: phyc_bandstab_1_20110121 120 s 15 s A, B, C, F, 30 s D, E 30 s 120 s 480 s 94 °C 94 °C 50 °C A, B, E, F, 55 °C C, 59 °C D 72 °C 72 °C ┐ ├ 40x A, 43x B, C, E, ┘ 35x D, 45x F diese Arbeit Zweistufige Amplifikation A: phyc_nest_1_20100608 B: phyc_nest_1_20100715 C: phyc_bandstab_1_20101111 D: phyc_20100607 120 s 15 s 30 s 120 s 15 s 30 s 120 s + 10 s/Zyklus 490 s 94 °C 94 °C 59 °C 70 °C ramp 1 °C/s 94 °C 59 °C 70 °C ramp 1 °C/s 70 °C ┐ ├ 15x A, B, C, 20x D ┘ ┐ ├ 20x A, D, 25x B, C ┘ diese Arbeit Reamplifikation nested PCR A: phyc_nest_2_20100608 B: phyc_nest_2_20100614 C: phyc_nest_2_20100906 120 s 15 s A, B, 30 s C 30 s 120 s 490 s A, B, 480 s C 94 °C 94 °C 59 °C 70 °C ramp 1 °C/s A, B, 72 °C C 70 °C A, B, 72 °C C ┐ ├ 30x A, 35x B, ┘ 25x C diese Arbeit Reamplifikation bandstab PCR A: phyc_bandstab_2_20101109 B: phyc_bandstab_2_20101110 120 s 15 s A, 30 s B 30 s 120 s 490 s A, 480 s B 94 °C 94 °C 59 °C A, 50 °C B 70 °C ramp 1 °C/s A, 72 °C B 70 °C A, 72 °C B ┐ ├ 25x ┘ diese Arbeit 45 Material und Methoden Tabelle 7: Zusammensetzung der PCR-Ansätze zur Amplikation nukleärer Loci Als Templat wurden entweder DNA-Stammlösungen, DNA-Arbeitslösungen, Aliquots kompletter PCR-Ansätze (nested PCR, vgl. Text) oder aus Agarosegel gestanzte Banden (band-stab-PCR, vgl. Text) verwendet. . Da die DNA-Konzentrationen nicht exakt bestimmt wurden, ist die Menge an zugefügter Templat-DNA als Richtwert zu verstehen (*). Rezept zur Verwendung mit Mango-Taq Zutat Stamm-konzentration Volumen pro 20 µl-Ansatz End- konzentration 5x Mango-Taq gefärbter Puffer (Bioline, Taunton) 5x 4,0 µl 1x MgCl2 50 mM 0,6 µl 1,5 mM dNTPs (Carl Roth, Karlsruhe) 2,5 mM 1,6 µl 0,2 mM Primer 1 10 µM 0,5 µl 0,25 µM Primer 2 10 µM 0,5 µl 0,25 µM DMSO (Carl Roth, Karlsruhe) 20 µg/ml 0,5 µl 0,5 µg/µl Mango-Taq DNA Polymerase (Bioline, Taunton) 5 U/µl 0,4 µl 0,1 U/µl DNA-Templat * 2,0 µl * Aqua bidest - 9,9 µl - Rezept zur Verwendung mit Long High Fidelity RCR Enzyme Mix Zutat Stamm-konzentration Volumen pro 20 µl-Ansatz End- konzentration 10x HF Reaction Buffer (Rovalab, Teltow) 10x 5,0 µl 1x dNTPs (Carl Roth, Karlsruhe) 2,5 mM 1,0 µl 0,05 mM Primer 1 10 µM 2,0 µl 0,4 µM Primer 2 10 µM 2,0 µl 0,4 µM Long High Fidelity PCR Enzyme Mix (Rovalab, Teltow) 2,5 U/µl 0,5 µl 0,025 U/µl DNA-Templat * 3,0 µl * Aqua bidest - 9,9 µl - Malatsynthase ( MS ) Das Protein Malatsynthase katalysiert im Glyoxylatzyklus die Bildung des vier Kohlenstoff- Atome enthaltenden Malatmoleküls aus zwei Molekülen Acetyl-Coenzym A (z. B. Kutschera 2002). Die entsprechende Genregion liegt beispielsweise bei den Palmen (Arecaceae) als Einzelkopie vor und eignet sich dort für phylogenetische Studien (Lewis & Doyle 2001). Die von diesen Autoren publizierten Primer zur Amplifikation eines exonischen Teilbereichs wurden für die vorliegende Arbeit getestet (Tabelle 5). ITS und ETS Eine Sonderstellung unter den nukleären Loci nehmen die Gencluster ein, die für die ribosomalen RNAs (rRNA) kodieren und als rDNA bezeichnet werden (Baldwin et al. 1995). Eine einzelne Einheit besteht bei Pflanzen aus einem externen transkribierten Spacer (ETS), der 18S-rDNA, dem ersten internen transkribierten Spacer (ITS1), der 5.8S-rDNA, dem zweiten internen transkribierten Spacer (ITS2) und der 26S-rRNA. Diese Einheiten finden sich in vielfacher, tandemartiger Wiederholung hintereinander, jeweils getrennt von einem nicht transkribierten Spacer (NTS). Da rDNA-Sequenzen in einigen hundert bis tausend Kopien im Kerngenom vorkommen, lassen sie sich für gewöhnlich einfach amplifizieren, 46 Material und Methoden vergleichbar mit plastidären Loci. Weiterhin existiert normalerweise nur eine prädominante Version dieser Region, die meisten Kopien sind identisch. Auftretende Mutationen werden rasch durch Rekombinationsereignisse angeglichen, es findet eine konzertierte Evolution statt (z. B. Knoop & Müller 2009). Allerdings gibt es auch Ausnahmen hiervon, was teils zu einer unerwarteten Diversität an Allelen führt (z. B. Small et al. 2004). Die hoch konservierten Sequenzen der kodierenden Regionen innerhalb der rDNA erlauben die Entwicklung von Primerpaaren, welche über weite taxonomische Gruppen hinweg universell funktionieren (Baldwin & Markos 1998). Mit deren Hilfe lassen sich die dazwischen liegenden Bereiche (ETS, ITS1 und ITS2) meist gut amplifizieren. Die konzertierte Evolution erlaubt ferner eine direkte Sequenzierung der PCR-Produkte ohne vorhergehende Klonierung, was einen großen methodischen Vorteil darstellt. Als nachteilig ist die mehr oder weniger zufällige Angleichung der Kopien aneinander zu sehen, wodurch phylogenetische Informationen während der Evolution verloren gehen. Wie bei plastidären Sequenzen liefert die vergleichende Sequenzierung der rDNA-Abschnitte nur Informationen über eine Abstammungslinie. Nach Hybridisierungsereignissen ist zumeist nicht klar, ob sich die paternale oder die maternale Version der rDNA im Rahmen der konzertierten Evolution durchsetzt. Ein weiteres Problem stellt die mögliche Existenz von Paralogen dar, welche bei direkter Sequenzierung nicht erkannt werden (Small et al. 2004). Die Amplifikation und Sequenzierung von ITS sowie die Auswertung der Daten gilt als problematisch innerhalb der Bromeliaceae (Michael Barfuss, Universität Wien, persönliche Mitteilung). Alle verwendeten Primer sind in Tabelle 5 zusammengestellt. 2.2.3.3 Verwendete Reagenzien und Durchführung Die PCR wurde zumeist in Volumina von 20 µl durchgeführt. Die Zusammensetzung der Ansätze ist den Tabellen 4 und 7 zu entnehmen. Sollten die PCR-Fragmente anschließend sequenziert werden, so wurden Primer mit M13-Anhängen eingesetzt (Fartmann et al. 1999). Dabei handelt es sich um bekannte Sequenzen, welche am 5'-Ende der eigentlichen PCR- Primer angehängt sind. Dies ermöglicht eine spätere Sequenzierreaktion mit universellen fluoreszenzmarkierten Primern. Eine Zusammenstellung der für die PCR verwendeten Primer findet sich in den Tabellen 2 und 5. Alle Reaktionen wurden in einem T-1 oder T-Gradient Thermocycler (Biometra, Göttingen) durchgeführt. Die verwendeten Programme sind in den Tabellen 3 und 6 aufgelistet. Welche Programme jeweils für die Amplifikation einzelner untersuchter plastidären Loci eingesetzt wurden, ist den Tabellen 2 und 3 zu entnehmen. 47 Material und Methoden Für den nukleären Locus phyC wurde zunächst eine PCR mit Primern nach Samuel et al. (2005) und dem von diesen Autoren beschriebenen Programm (PHYC_Samuel) durchgeführt. Ferner wurde die direkte Amplifikation und Sequenzierung sowohl des Gesamtfragmentes, als auch der beiden Einzelteile jeweils mit für die Bromeliaceae spezifischen Primern (Michael Barfuss, Universität Wien, persönliche Kommunikation) durchgeführt. Neben vielen Ausfällen, schwachen Amplifikaten und extrem schlechter Qualität der Sequenzierung zeigten sich häufig auch unspezifische und unerwünschte zusätzliche PCR-Produkte. Insgesamt fünf unterschiedliche Programme wurden zur direkten Amplifikation getestet (vgl. Tabelle 6: PHYC_Barfuss und alle Programme, deren Namen mit „phyc“ beginnen). Zur Optimierung der PCR-Amplikation des Locus phyC wurden diverse Proben eingesetzt und zwei unterschiedliche Methoden angewendet. Einerseits wurde eine verschachtelte (nested) PCR durchgeführt (z. B. Mülhardt 2006). Mit normaler DNA-Stammlösung als Templat wurde dazu jeweils zunächst eine erste PCR mit den Primern phyc515f und phyc1699r2 ohne M13-Anhang durchgeführt. Hierbei wurden ebenfalls verschiedene Programme eingesetzt (Programme phyc_nest_1... in Tabelle 6). Für die verschachtelte PCR wurde das Produkt dieser Reaktion als Templat für zwei zweite Reaktionen mit den Primern phyc524f und phyc1145r zur Amplifikation von Teil a einerseits und phyc974f2 und phyc1690r für Teil b andererseits verwendet. Hierfür kamen relativ kurze Programme zum Einsatz (Programme phyc_nest_2... in Tabelle 6). Alle in diesen Reaktionen verwendeten Primer trugen einen M13-Anhang und die Produkte wurden anschließend sequenziert. Für den zweiten Ansatz zur Optimierung kam die so genannte band-stab-Methode zum Einsatz (Bjourson & Cooper 1992). Zunächst erfolgte die Amplifikation des Gesamtfragmentes analog zum ersten Schritt der oben genannten verschachtelten PCR (Programme phyc_bandstab_1... in Tabelle 6). Für die zweite Reaktion wurden Reaktionsansätze entsprechend Tabelle 7 vorbereitet. Es wurden die gleichen Primer verwendet wie in der zweiten Reaktion der verschachtelten PCR, jedoch wurde der Anteil an Aqua bidest für jede Probe um 2 µl erhöht. Die Produkte der ersten Reaktion wurden auf Agarose aufgetrennt und mit Ethidiumbromid gefärbt (vgl. 2.2.2). Unter UV-Licht wurden mit sterilen Pipettenspitzen Bereiche des Gels ausgestanzt, in denen die Banden des erwarteten Fragmentes sichtbar waren. Die Spitzen wurden für etwa 10 min in die entsprechenden Reaktionsgefäße für die zweite PCR gestellt, wobei DNA aus den ausgestanzten Gelstückchen in den Reaktionsansatz diffundierte. Mit diesem wurde dann die Amplifikation der beiden einzelnen Abschnitte a und b aus dem Gesamtfragment durchgeführt (Programme phyc_bandstab_2... in Tabelle 6). 48 Material und Methoden Für die meisten Proben wurde die PCR des Locus phyC letztlich mittels der Bandstab- Methode durchgeführt. Dabei kamen die Programme phyc_bandstab_1_20101111 für die Amplifikation des Gesamtfragmentes und phyc_bandstab_2_20101110 für die zweite Reaktion zum Einsatz (Tabelle 6). Eine detaillierte Übersicht über alle verwendeten Kombinationen von Primern und Programmen findet sich in Anhang 1. Für den nukleären Locus MS wurde zunächst das von Lewis & Doyle (2001) zusammen mit den Primern publizierte Programm für das Testset TS2 verwendet. Danach wurde ein Programm mit reduzierter Annealingtemperatur und höherer Zyklenzahl für ein breiteres Probenset aus Arten von Dyckia (FK0001, FK0005, FK0006, FK0013), Deuterocohnia (FK0071), Fosterella (FK0081), Puya (FK0082) und Pitcairnia (FK0083) eingesetzt (Programme MS_Lewis und MS_Krapp in Tabelle 6). Für die Regionen ITS1 und ITS2 der rDNA wurden Reaktionen für das Testset TS2 unter Standardbedingungen (Programm UniPCRFK in Tabelle 3) durchgeführt. Für die ETS- Region wurde eine PCR mit für die Unterfamilie Bromelioideae etablierten Primern (Sass & Specht 2010) mit einem eigenen Programm (ETS_Krapp in Tabelle 6) für Proben der Gattungen Dyckia (FK0108-FK0111), Fosterella (FK0117-FK0118), Pitcairnia (FK0119) und Puya (FK0121) durchgeführt. Ferner kamen für die Gattung Tillandsia entwickelte Primer (Chew et al. 2010) zum Einsatz. Für die PCR der ETS-Region wurde aufgrund der erwarteten großen Fragmentlänge eine leistungsfähigere DNA-Polymerase (Long High Fidelity RCR Enzyme Mix, Rovalab, Teltow) mit angepasstem Rezept (Tabelle 7) und Programm (ETS_HF in Tabelle 6) verwendet. Die gleiche PCR wurde auch mit universellen Primern zur Amplifikation des gesamten Bereiches aus ETS und NTS (Baldwin & Markos 1998) durchgeführt. Für beide Ansätze wurde ein kleines Testset mit den Gattungen Dyckia (FK0108 und FK0109) und Pitcairnia (FK0119 und FK0120) verwendet. 2.2.4 DNA-Sequenzierung Die hier angewendete Art der Sequenzierung basiert auf einer Variante der Kettenabbruch- Synthese (Sanger et al. 1977). Wie bei einer PCR werden spezifische Primer an den Flanken der Zielregion angelagert und dann durch eine thermostabile DNA-abhängige DNA- Polymerase elongiert. Der essentielle Unterschied zur PCR ist der Zusatz geringer Mengen an 2'-3'-Didesoxyribonukleosidtriphosphaten (ddNTPs) neben den normalen dNTPs (vgl. 2.2.3). Da diesen die 3'-Hydroxygruppe fehlt, können an eingebaute ddNTPs keine weiteren Nukleotide angefügt werden, die Synthese bricht ab. In vier Ansätzen pro zu sequenzierender Probe wird jeweils ein Typ an ddNTPs für die Basen Adenin (A), Cytosin (C), Guanin (G) und Thymin (T) eingesetzt. Bei jedem Ansatz entstehen somit verkürzte 49 Material und Methoden Fragmente, die an ihrem Ende alle die gleiche Base aufweisen. Die in den vier Ansätzen synthetisierten Fragmente werden auf einem hochauflösenden Sequenziergel aus Polyacrylamid (PAA) in vier Spuren nebeneinander aufgetrennt. Dabei entsteht ein typisches Bandenmuster. Für jede Fragmentgröße existiert in genau einem der Ansätze eine Bande. Aus diesem Muster lässt sich die DNA-Sequenz der Probe ablesen. Lösungen und Reagenzien: • 1 μM M13-IRD700 fwd-Primer-Lösung • 1 μM M13-IRD800 rev-Primer-Lösung • Dimethylsulfoxid (DMSO) • Thermo Sequenase Primer Cycle Sequencing Kit (GE Healthcare, Little Chalfont, UK) • Formamid-Ladepuffer (98% (v/v) Formamid, 0,025% (v/v) basisches Fuchsin, 10 mM EDTA) • PAA-Gel (5 ml Ultra Pure SequaGel® Complete Buffer Reagent, 20 ml Ultra Pure SequaGel XR (beides National Diagnostics, Atlanta, Georgia, USA), 200 μl Ammoniumpersulfat-Lösung (APS) 100 mg/ml in Aqua bidest (Sigma, St. Louis, Missouri, USA) • 1x TBE-Puffer pH 8,3 (90 mM Tris-Borat, 2 mM EDTA) Durchführung: Aus ökonomischen Gründen wurden für alle Sequenzierreaktionen universelle Primer verwendet, die komplementär zu den beiden verschiedenen M13-Anhängen der für die PCR verwendeten Primer waren (vgl. 2.2.3.3). Beide Primer trugen eine Fluoreszenzmarkierung an ihrem 5'-Ende (IRDye 700 am Vorwärts-Primer M13-IRD700 fwd und IRDye 800 am Rückwärts-Primer M13-IRD800 rev). Für jede zu sequenzierende Probe wurden 3 µl des nicht aufgereinigten PCR-Produktes mit 3 µl der M13-IRD700 fwd-Primer-Lösung, 5 µl der M13-IRD800 rev-Primer-Lösung, 0,9 µl DMSO und 8,1 µl Aqua bidest vermischt. Je 4,5 ml davon wurden mit einer der vier Lösungen (A, C, G und T) des Thermo Sequenase-Kits vermischt. Es wurde jeweils 16 Proben gleichzeitig in einer Mikrotiterplatte mit 96 Reaktionsgefäßen verarbeitet. Die Sequenzierreaktionen wurden in einem T-1 oder T-Gradient Thermocycler (Biometra, Göttingen) durchgeführt. Nach einer initialen Denaturierung für 5 min bei 95 °C folgten 25 Synthese-Zyklen, bestehend aus jeweils 30 s Denaturierung bei 95 °C, 30 s Annealing bei 57 °C und 60 s Elongation bei 72 °C. Nach einer finalen Elongation für 10 min bei 72 °C wurden die Proben auf 10 °C gekühlt. Eine dauerhafte Denaturierung der Produkte wurde 50 Material und Methoden durch Zugabe von 5 µl Formamid-Ladepuffer pro Ansatz und Erhitzen für 5 min auf 85 °C erreicht. Pro Ansatz wurden 0,8 µl auf ein PAA-Sequenziergel (41 cm Länge, 0.2 mm Dicke, 64 Taschen, Haifischzahn-Kamm) des Sequenzierers geladen. Die Auftrennung der Fragmente erfolgte in Abhängigkeit der zu erwartenden Sequenzlänge für 3-8 Stunden auf einem automatischen Gel-Sequenzierer (IR2 DNA Sequenzierer Long Readir 4200, LI-COR Biosciences, Lincoln, Nebraska, USA) unter standardisierten Bedingungen (25 mA, 45 °C). 2.2.5 Plastidäre Mikrosatelliten (cpSSRs) Für die Identifizierung von Mikrosatelliten (SSRs) im Plastom von Dyckia wurden zwei unterschiedliche Strategien verfolgt. Zum einen wurden die Sequenzalignments der verschiedenen unter 2.2.3.1 beschriebenen Loci auf das Vorhandensein von SSRs hin überprüft. Zum anderen wurden zahlreiche durch 454-Sequenzierung (next-generation sequencing, NGS) erhaltene Sequenzen einer Art von Dyckia auf die Anwesenheit plastidärer SSRs untersucht. Diese Daten wurden in Rahmen eines Kooperationsprojektes mit T. Wöhrmann (Universität Kassel) und Dr. B. Huettel (MPI für Züchtungsforschung Köln) produziert. 2.2.5.1 Entwicklung von Primerpaaren für cpSSR-Loci Da die 454-Sequenzierung selbst nicht Bestandteil der vorliegenden Arbeit ist, soll hier nur am Rande darauf eingegangen werden. Aus Blattmaterial der Art Dyckia marnier-lapostollei var. estevesii (FK0030 in Tabelle 1) wurde in vier parallelen Ansätzen eine ausreichende Menge an Gesamt-DNA isoliert (nach 2.2.1). Davon wurden 5 µg DNA durch Zerstäubung fragmentiert und die Bruchstücke in eine vorgefertigte Bibliothek ligiert (entsprechend den Vorgaben im Rapid Library Preparation Method Manual, Roche Diagnostics, Mannheim). Die resultierende DNA-Bibliothek wurde mittels Fluorometrie quantifiziert (TBS-380, Turner Biosystems, Sunnyvale, Kalifornien, USA). Die Sequenzierung nach dem Schrotschuss- Prinzip erfolgte auf einem Roche 454 GSFLX mit dem Titanium Sequencing Kit XLR70 und dem Titanium PicoTiterPlate Kit (alles Roche Diagnostics, Mannheim) entsprechend den Angaben des Herstellers. Die Herstellung und 454-Sequenzierung der Bibliothek erfolgte durch einen Kooperationspartner am Max-Planck-Institut für Züchtungsforschung in Köln. Aus den resultierenden Einzelsequenzen wurden zunächst all jene plastidären Ursprungs ausgefiltert. Als Referenz diente das Plastom von Typha latifolia (GenBank-Nummer GU195652.1 Guisinger et al. 2010). Diese Art ist vermutlich der nächste Verwandte der Bromeliaceae, für die die komplette Sequenz des Plastoms publiziert ist (z. B. Givnish et al. 2010). Mittels der Software Geneious 5.4 (Drummond et al. 2011) wurde eine Datenbank aus allen Einzelsequenzen aus der 454-Analyse generiert. Gegen diese wurde dann das Plastom 51 Material und Methoden von T. latifolia mittels des BLAST-Algorithmus (Altschul et al. 1997) abgeglichen. Für signifikant ähnliche Sequenzen wurde angenommen, dass sie eine plastidäre Herkunft haben. Für alle diese wurde dann die Contig Assembly-Funktion von Geneious 5.4 genutzt, um überlappende Einzelsequenzen zu größeren Fragmenten zusammenzufassen. Dafür wurden Standardeinstellungen verwendet. Der endgültige Datensatz der plastidären Sequenzen von Dyckia marnier-lapostollei var. estevesii enthielt schließlich alle Contigs und alle jene Einzelsequenzen, die nicht in eine der Contigs eingeflossen waren. Dieser Datensatz wurde dann erneut mit dem Genom von T. latifolia verglichen, um die Abdeckung und Lage der Fragmente im Plastom zu überprüfen. Die Suche nach SSRs in diesem Datensatz wurde mit der Find-String-Suchfunktion von PhyDE 0.9971 (Müller et al. 2011) durchgeführt. Dabei wurden alle SSRs mit sieben oder mehr Adenin- oder Thymin-Basen berücksichtigt. Alle SSRs mit 10 oder mehr Wiederholungen wurden zur Entwicklung von cpSSR-Primerpaaren für Variabilitätstests ausgewählt, sofern flankierende Regionen für das Primerdesign vorhanden waren und die Loci noch nicht aus früheren Analysen (siehe 2.2.3.1) bekannt waren. Für diese Loci und die aus der Sanger-Sequenzierung bekannten cpSSR-Loci wurden manuell Primerpaare entwickelt. Als Kriterien für das Design von Primern wurden eine Länge von 20 Nukleotiden und ein hoher GC-Gehalt gefordert. Sofern möglich wurde das 3'-Ende der Primer jeweils so gewählt, dass es mindestens zwei Cytosin- oder Guanin-Basen aufwies. Für alle Primerpaare wurde jeweils auch die Kompatibilität ihrer 3'-Enden überprüft, um die Bildung von Primer-Dimeren in der PCR zu minimieren (z. B. Mülhardt 2006). 2.2.5.2 Primer-Tests und Charakterisierung Die neu entwickelten Primerpaare wurden zunächst in Pilotexperimenten auf ihre Funktionalität überprüft. Hierzu wurden PCR mit je einer Akzession von D. marnier- lapostollei var. estevesii (FK0030), D. dissitiflora (FK0141) und D. pernambucana (FK0171) durchgeführt. Als günstige Alternative zu direkt fluoreszenzmarkierten Primern wurde die indirekte Markierung nach Schuelke (2000) verwendet. Bei dieser Methode werden ein normaler Rückwärts-Primer, ein Vorwärts-Primer mit einer M13-Sequenz am 5´-Ende und ein M13-Vorwärts-Primer mit Fluoreszenzmarkierung kombiniert (siehe auch 2.2.3.3 und 2.2.4). Die Reaktionen wurden im 10 µl-Maßstab in einem T-1 oder T-Gradient Thermocycler (Biometra, Göttingen) durchgeführt (Tabelle 8). Dabei kam ein Standardprogramm (UniPCRFK in Tabelle 3) zum Einsatz. Das Ergebnis der PCR wurde mittels Agarose- Gelelektrophorese überprüft (siehe 2.2.2). 52 Material und Methoden Jeweils 1 µl der PCR-Ansätze wurden dann mit 30 µl Formamid-Ladepuffer vermischt und für 5 min bei 85 °C denaturiert. Jeweils 0,2-0,6 µl davon wurden auf einem PAA-Sequenziergel (41 cm Länge, 0.2 mm Dicke, 48 Taschen, Haifischzahn-Kamm) aufgetrennt. Hierfür kamen sowohl ein 4300 DNA Analyzer, als auch ein IR2 DNA Sequenzierer Long Readir 4200 (beide LI-COR Biosciences, Lincoln, Nebraska, USA) zum Einsatz. Elektrophoresebedingungen, Gelzusammensetzung und Pufferlösungen entsprachen den für die DNA-Sequenzierung verwendeten Parametern (2.2.4). Tabelle 8: Zusammensetzung der PCR-Ansätze zur Amplikation plastidärer Mikrosatelliten (cpSSRs) Da die DNA-Konzentrationen nicht exakt bestimmt wurden, ist die Menge an zugefügter Templat-DNA als Richtwert zu verstehen (*). Zutat Stamm-konzentration Volumen pro 10 µl-Ansatz End- konzentration 5x Mango-Taq gefärbter Puffer (Bioline, Taunton) 5x 2,0 µl 1x MgCl2 50 mM 0,3 µl 1,5 mM dNTPs (Carl Roth, Karlsruhe) 2,5 mM 0,8 µl 0,2 mM Primer fwd 10 µM 0,04 µl 0,04 µM Primer IRD700-M13-fwd 10 µM 0,16 µl 0,16 µM Primer rev 10 µM 0,16 µl 0,16 µM BSA (Invitrogen, Carlsbad) 20 µg/ml 0,25 µl 0,5 µg/µl Mango-Taq DNA Polymerase (Bioline, Taunton) 5 U/µl 0,1 µl 0,05 U/µl DNA-Templat (Arbeitslösung) * 1,0 µl * Aqua bidest - 5,19 µl - Neben den Proben wurde in einigen Spuren ein Fragmentlängenstandard aufgetragen, der eigens für diesen Zweck wie folgt hergestellt wurde. Zunächst wurde mit Templat-DNA von Fosterella villosula (FK0076) eine PCR für den Locus rps16-trnK Teil a durchgeführt (2.2.3.1 und 2.2.3.3). Das resultierende Produkt wurde für eine Sequenzierreaktion nur mit der T-Lösung des Thermo Sequenase-Kits verwendet (2.2.4). Deren Produkt wiederum wurde 1:1 mit Formamid-Ladepuffer vermischt und vor Gebrauch wie oben angegeben denaturiert. Anhand der bekannten Sequenz der Probe an diesem Locus konnten die Größen von komigrierenden PCR-Produkten im PAA-Gel unproblematisch abgeleitet werden. Das Prinzip fragmentreicher externer Längenstandards ist verbreitet für SSR-Analysen auf Gelsequenzierern (z. B. Guicking et al. 2008; Prinz et al. 2009; Wöhrmann & Weising 2011). Erfolgversprechende Loci wurden für eine weitergehende Charakterisierung ausgewählt. Als Auswahlkriterien dienten die gute Amplifizierbarkeit in allen drei Proben, das Ausmaß an Variabilität zwischen den drei Arten und die absolute Länge der SSRs. Für diese Loci wurde eine Fragmentlängenanalyse mit einem erweiterten Set von insgesamt 58 Proben durchgeführt, das je vier Individuen aus drei Populationen von D. dissitiflora, drei Populationen von D. pernambucana und einer Population von D. limae enthielt. Dieser 53 Material und Methoden Ansatz diente als Eignungstest der Loci für Populationsstudien an den genannten Arten. Ferner wurden 17 Akzessionen von 16 weiteren Dyckia-Arten verwendet, um die Eignung der cpSSR-Loci für Studien oberhalb der Artebene zu evaluieren. Je zwei Arten von Encholirium, Deuterocohnia, Fosterella, Pitcairnia (alles Pitcairnioideae) und Puya (Puyoideae), sowie je eine Akzession von Ananas (Bromelioideae), Hechtia (Hechtioideae) und Tillandsia (Tillandsioideae) dienten ferner dem Testen der Übertragbarkeit zwischen Gattungen und Unterfamilien. Alle verwendeten Pflanzen finden sich in Tabelle 1 oder Anhang 19. Für die Proben FK0030 und FK0178 wurden die PCR-Produkte aller cpSSR-Loci re- sequenziert (2.2.4). Hiermit wurde einerseits eine unabhängige Überprüfung der möglicherweise teils ungenauen 454-Daten gewährleistet. Andererseits konnte auf diese Weise die absolute Länge der aus Sanger-Sequenzen entwickelten SSRs ermittelt werden, welche aufgrund mangelnder Überschneidung mit dem Testset TS2 (siehe 2.2.3.3) noch nicht bekannt waren. Amplifikate aus der Probe FK0178 wurden bei allen folgenden Elektrophoresen als Referenzprobe aufgetragen. Durch direkten Vergleich konnte somit für alle anderen Proben die absolute Fragmentlänge ermittelt werden. Eine Fragmentlängenanalyse aller 12 cpSSR-Loci wurde noch für weitere Proben durchgeführt. Eine Übersicht über alle eingesetzten Proben findet sich in Tabelle 1. 2.3 Datenanalyse 2.3.1 DNA-Sequenzen, Alignments und Außengruppen Die Rohdaten aus den Sequenzierläufen wurden zunächst mittels der Software e-Seq 2.0 (LICOR Biotechnology, Lincoln, Nebraska, USA) automatisch ausgewertet. Die so erhaltenen Sequenzen wurden dann grob überprüft und gegebenenfalls von Hand nachbearbeitet, wobei qualitativ schlechte Bereiche entfernt wurden. Mittels der Computerprogramme AlignIR 1.2 und AlignIR 2.0 (beide LICOR Biotechnology, Lincoln, Nebraska, USA) wurden die Einzelsequenzen anschließend detailliert überprüft und editiert. Eventuell enthaltene Primer-Sequenzen wurden entfernt. Die Vorwärts- und Rückwärtssequenzen sowie die Einzelsequenzen bei geteilten Loci wurden für jede Probe einzeln aligniert. Nach einer visuellen Kontrolle und gegebenenfalls weiterer Editierung wurde für jede Probe und jeden Locus eine Konsensussequenz gebildet. Für das automatische Alignment der Konsensussequenzen für jeden Locus wurde zunächst der in AlignIR implementierte Algorithmus verwendet (Huang 1992; 1994). Nach Vergleich der Proben untereinander wurden eventuell noch vorhandene Fehler in den 54 Material und Methoden Einzelsequenzen bereinigt. Das endgültige Alignment für die einzelnen Loci und für die kombinierte Analyse wurde mit der Software PhyDE 0.9971 (Müller et al. 2011) durchgeführt. Nach einem automatischen Abgleich mittels des Algorithmus MUSCLE 3.8.31 (Edgar 2004) wurden uneindeutige Bereiche und Indels von Hand aligniert. Indels, variable SSRs und Inversionen wurden allesamt nicht kodiert und somit aus allen phylogenetischen Analysen ausgeschlossen. Als Außengruppen wurden für alle Analysen plastidärer Sequenzen Puya ferruginea (FK0082) und Puya herzogii (FK0121) verwendet. Für Analysen des phyC-Datensatzes wurden Pitcairnia feliciana (FK0119), P. fuertesii (FK0120), P. heterophylla (FK0083), P. piepenbringii (FK0085) und P. pungens (FK0084) als Außengruppentaxa angenommen. Dies war gerechtfertigt durch Ergebnisse einer ausgedehnten Analyse von phyC für ein erweitertes Probenset (Schütz et al., unveröffentlichte Daten), nach der alle untersuchten Vertreter von Puya zwischen den übrigen Gattungen der Pitcairnioideae stehen (vgl. Anhänge 2 und 3). Vergleichsweise kam für phyC auch die Mittelpunktsbewurzelung (midpoint rooting) zum Einsatz, welche lediglich mit den beobachteten Astlängen arbeitet, ohne eine zuvor definierte Außengruppe anzunehmen (vgl. Knoop & Müller 2009). Die Daten aus den Fragmentlängenanalysen plastidärer SSR-Loci wurden ebenfalls in die Form eines Sequenzalignments überführt. Für jeden Locus wurde zunächst ein leeres Alignment mit 25 Positionen Länge angelegt. In dieses wurden für jede Probe zunächst Adenin-Basen entsprechend der beobachteten SSR-Länge eingefügt. Dann wurden jeweils Thymin-Basen bis zu einer Gesamtlänge von 25 Nukleotiden aufgefüllt. Beispielsweise wurde so ein zwölf Adenin-Basen langer Mikrosatellit (A12) in der Form A12T13 notiert. Ausgefallene Proben wurden entsprechend als Lücke mit 25 Positionen Länge angegeben. Die einzelnen Blöcke wurden im Anschluss zu einem einzigen Alignment zusammengefügt. 2.3.2 Behandlung von Heterozygotie Bei der direkten Sequenzierung von PCR-Produkten nukleärer Loci stellt sich das Problem möglicher allelischer Variation. Besitzen alle amplifizierten Allele dieselbe Länge, liefert die direkte Sequenzierung eine durchweg lesbare Sequenz. Für Positionen, an welchen sich die Allele durch Basensubstitutionen unterscheiden, zeigen sich Banden in mehr als einer Spur des Gels, im diploiden Organismus in zwei Spuren. Die fertig editierte Konsensussequenz zeigt hier dann das entsprechende Symbol für eine Ambiguität. Im diploiden Organismus sind zwei Konstellationen möglich, die auf Transitionen zurückzuführen sind (R für A oder G, Y für C oder T). Vier Konstellationen können auf Transversionen zurückgeführt werden (S für C oder G, W für A oder T, M für A oder C und K für G oder T). 55 Material und Methoden In einem für den sequenzierten Locus homozygoten Organismus sind beide Allele identisch und die Sequenz ist eindeutig lesbar. Unterscheiden sich zwei Allele an exakt einer Position, so lassen sich die beiden der Überlagerung zugrunde liegenden Allele einfach rekonstruieren. Die überlagerte Sequenz wird dupliziert und an der betreffenden Stelle bekommt jede Tochtersequenz einen anderen der beiden Zustände zugeordnet. Unterscheiden sich zwei Allele an n Positionen, gibt es hingegen 2n verschiedene aus der Überlagerung ableitbare Sequenzen. Bei allen Konstellationen mit n>1 kann daher ohne Klonierung der PCR-Produkte nicht festgestellt werden, wie die Sequenz der beiden überlagerten Allele tatsächlich aussieht. Bei der beobachteten Heterozygotie handelt es sich um natürliche innerartliche Variation, solange keine künstlichen Hybride untersucht werden. Insbesondere bei einer Gattung wie Dyckia, wo offenbar weitgehende Interfertilität zwischen den meisten Arten und sogar mit Arten von Encholirium herrscht (Grant & Zijlstra 1998; Versieux & Wendt 2006), ist hier aber a priori keine sichere Annahme zu treffen. Bei innerartlicher Variation sind zwei Zustände zu unterscheiden. Unterschiedliche Allele im gleichen Individuum stellen für phylogenetische Untersuchungen dann kein Problem dar, wenn sie beide auf ein ursprüngliches Allel zurückzuführen sind, das bereits privat für die betreffende Art war. Ein Test auf diesen Zustand kann durchgeführt werden, indem zunächst alle heterozygoten Sequenzen in zwei Tochtersequenzen geteilt werden. An unsicheren Positionen werden die beiden möglichen Zustände zufällig den abgeleiteten Sequenzen zugeordnet. Werden alle abgeleiteten Sequenzen zur Rekonstruktion einer Phylogenie verwendet, sollten alle Paare abgeleiteter Sequenzen in einer gemeinsamen Klade vereinigt sein. Die Trennung sollte mehrfach wiederholt werden, da es sich um einen Zufallsprozess handelt und Wiederholungen unterschiedliche Ergebnisse hervorrufen (vgl. Jabaily & Sytsma 2010). Intraspezifische Variation, bei der die beteiligten Allele nicht exklusiv in einer Art vorkommen, wirkt sich dagegen negativ auf die Auflösung der Phylogenie aus. Dann gehören die jeweils beteiligten Allele eigentlich in zwei unterschiedliche Kladen der Phylogenie, was sich durch Klonierung und Sequenzierung zeigen lässt. Bei der Verwendung überlagerter Sequenzen ziehen sich die beiden betreffenden Kladen an und verschmelzen gegebenenfalls. Die Auflösung sinkt so unter Umständen massiv ab. Solche Zustände können entweder durch kürzliche Hybridisierung oder durch Introgression eines Allels durch Hybridisierung in der Vergangenheit verursacht werden. Oder aber es handelt sich um ursprüngliche allelische Variation (ancient alleles). Die ursprüngliche Allelvariation einer Klade entspricht der allelischen Variation innerhalb der letzten gemeinsamen Vorfahren derselben. Sie erklärt das 56 Material und Methoden Vorhandensein einzelner Allele in verschiedenen Arten, selbst wenn diese genetisch isoliert sind. Verlieren verschiedene abgeleitete Linien durch genetische Flaschenhälse und Gendrift nämlich unterschiedliche Teile des ursprünglichen Genpools, so wirken die Arten dieser Linien genetisch durchmischt, obwohl sie möglicherweise reproduktiv isoliert voneinander sind. Somit entspricht die Evolution der Allele eines Gens nicht unbedingt der Evolution der sie führenden Arten. Eine aus nukleären Sequenzen berechnete Phylogenie zeigt in erster Linie immer den Stammbaum der Allele, den Genbaum (gene tree). Wie dieser mit der Phylogenie der beteiligten Organismen (species tree) zusammenhängt, muss immer individuell betrachtet werden (z. B. Rosenberg & Nordborg 2002). Für das Sequenzalignment von phyC wurden verschiedene Methoden angewendet, um die Auflösung der Phylogenie zu optimieren und den Einfluss der Heterozygotie zu evaluieren. Zu diesem Zweck wurde die Software SeqSplitter 1.0 entwickelt, die das originale Alignment statistisch auswertet und modifiziert (die Spezifikationen sind Anhang 4 zu entnehmen). Einerseits wurden Positionen im Alignment gelöscht, die in mehr als einer bestimmten Zahl npos von Sequenzen Unsicherheiten enthielten. Für verschiedene Werte von npos (0, 1, 2, 5, 10) wurden mit den so modifizierten Datensätzen Bayes'sche Analysen (2.3.6) durchgeführt. Andererseits wurden Sequenzen gelöscht, die an mehr als einer bestimmten Zahl nseq an Positionen Unsicherheiten aufwiesen. Für unterschiedliche nseq (0, 1, 3, 5, 7, 10) wurden ebenfalls Bayes'sche Analysen gerechnet. In einem dritten Ansatz wurden alle Sequenzen von Dyckia und Encholirium mit nseq≤1 eindeutig in zwei Allele aufgeteilt. Diese waren für nseq=0 jeweils paarweise identisch, für nseq=1 unterschieden sie sich in einer Position und waren daher eindeutig identifizierbar. In einer weiteren Modifikation wurden schließlich Alignmentpositionen, die für exakt eine Probe heterozygot und für alle anderen uniform waren, manuell als nicht heterozygot gewertet. Dieses Vorgehen erhöhte die Anzahl an Sequenzen, die das Kriterium nseq≤1 erfüllten. Es erscheint dadurch gerechtfertigt,dass autapomorphe Merkmalsänderungen die interne Topologie eines Baumes generell nicht beeinflussen. Auch für die beiden letztgenannten Modifikationen wurden Bayes'sche Analysen durchgeführt. Allen diesen Vorgehensweisen lag die Bestrebung zugrunde, auch ohne eine vorherige Klonierung eine möglichst hohe Zahl der untersuchten Akzessionen für die Erstellung des Genbaums verwenden zu können. 2.3.3 Distanzanalysen, Bootstrap- und Jackknife-Verfahren Distanzanalysen sind unkomplizierte und schnelle Methoden zur Erstellung phylogenetischer Bäume. Im einfachsten Fall werden p-Distanzen, also prozentuale Sequenzunterschiede 57 Material und Methoden zwischen jeweils zwei Sequenzen verwendet. Es gibt aber auch aufwändigere Algorithmen, die die unterschiedlichen Wahrscheinlichkeiten des Auftretens verschiedener Mutationstypen in die Distanzberechnung mit einbeziehen (Knoop & Müller 2009). Alle Sequenzen des Datensatzes werden paarweise miteinander verglichen und in eine so genannte Distanzmatrix überführt. Nun werden die beiden ähnlichsten Sequenzen als Konsensussequenz zusammengefasst und eine neue Distanzmatrix mit dieser und den verbliebenen ungruppierten Sequenzen berechnet. Dieser Schritt wird wiederholt, bis alle Sequenzen in einem einzigen Cluster zusammengefasst sind. Das am häufigsten verwendete Clustering-Verfahren ist der Neighbour Joining-Algorithmus (NJ, Saitou & Nei 1987). Unter den Verfahren, Verzweigungen innerhalb von Phylogenien auf ihre Stabilität hin zu überprüfen, ist die Bootstrap-Analyse (BS, Felsenstein 1985) sicherlich die bekannteste. Für diese Methode kommt derselbe Algorithmus wie in der Einzelanalyse zum Einsatz, aber der Datensatz wird modifiziert. Beim Bootstrapping wird bei der Erstellung eines modifizierten Datensatzes n mal eine zufällige Spalte aus einem n Basen langen Original-Alignment gezogen („Ziehen mit Zurücklegen“). Anschließend wird mit dem modifizierten Datensatz eine phylogenetische Rekonstruktion durchgeführt. Dieses Vorgehen wird in mehreren Replikaten wiederholt. Für jeden Knoten der originalen Phylogenie wird dann überprüft, in welchem Prozentsatz der erhaltenen Bootstrap-Bäume er vorkommt. Dieser Prozentsatz heißt Bootstrap-Wert und stellt ein Maß für die statistische Absicherung einer einzelnen Verzweigung auf der Grundlage des verwendeten Datensatzes dar. Das Jackknife-Verfahren (JK) ist sehr ähnlich, hier werden die modifizierten Datensätze aber durch „Ziehen ohne Zurücklegen“ generiert. Praktisch wird dazu einfach ein gewisser Anteil an Alignmentpositionen gelöscht. Bei den in dieser Arbeit durchgeführten Jackknife-Analysen wurde für jedes Replikat die Hälfte des Datensatzes verworfen. Für beide Verfahren gelten Werte unter 50% als nicht gesicherte Knoten und werden häufig nicht angegeben. In der vorliegenden Arbeit wurden Neighbour Joining-Analysen mit dem Computerprogramm PAUP* 4.0 Beta 10 (Swofford 2003) durchgeführt. Es wurden jeweils unkorrigierte p-Distanzen verwendet. Außerdem wurden eine Bootstrap- und eine Jackknife-Analyse mit jeweils 10.000 Replikaten und den gleichen Einstellungen wie in der Einzelberechnung vorgenommen. 2.3.4 Parsimonieanalyse, Abschätzung von Homoplasie Das der Parsimonieanalyse (maximum parsimony, MP, Edwards & Cavalli-Sforza 1963a) zugrunde liegende Optimalitätskriterium ist das Sparsamkeitsprinzip, auch Ockhams 58 Material und Methoden Rasiermesser genannt. Demnach ist die einfachste Erklärung für ein Phänomen in der Regel auch als die wahrscheinlichste anzusehen. Übertragen auf phylogenetische Bäume bedeutet dies, dass derjenige Baum als der wahrscheinlichste gelten kann, der mit den wenigsten evolutiven Schritte den gegebenen Datensatz erklären kann, also am sparsamsten ist. Bei der in der Phylogenetik meistens verwendeten Fitch-Parsimonie entspricht ein evolutiver Schritt der Umwandlung von einem Nukleotid in ein anderes ohne Zwischenstufen. Alle denkbaren Übergänge zwischen den vier Basen werden gleich bewertet (Fitch 1971). Theoretisch müssen alle denkbaren Bäume erstellt und hinsichtlich ihrer Länge bewertet werden. Da mit steigender Zahl von Taxa n die Zahl der denkbaren Bäume mit (2n-3)!! rasant ansteigt, ist eine erschöpfende Baumsuche auch mit leistungsstarken Computern nur für sehr kleine Datensätze möglich. In der Praxis werden daher heuristische Baumsuchen durchgeführt, die ebenfalls eine Vielzahl an verschiedenen Bäumen liefern. Während der Suche werden aber wenig versprechende Pfade der Baumsuche frühzeitig abgebrochen, was viel Zeit erspart. Für gewöhnlich liefert eine Parsimonieanalyse nicht nur einen kürzesten Baum, sondern mitunter sehr viele verschiedene. Diese können durch Konsensbildung zusammengefasst werden. Der Strict-Konsensusbaum enthält nur diejenigen Verzweigungen, die in allen gefundenen kürzesten Bäumen enthalten sind. Im 50%-Majority Rule-Konsensusbaum sind alle Verzweigungen enthalten, die in mindestens der Hälfte der Einzelbäume vorkommen (Knoop & Müller 2009). Ein grundlegendes Problem bei allen phylogenetischen Analysen stellt Homoplasie dar. Darunter versteht man das Auftreten von identischen Merkmalszuständen, etwa Basenpositionen in einer DNA-Sequenz, das nicht auf eine gemeinsame Herkunft zurückzuführen ist, sondern zweimal oder mehrfach unabhängig entstanden ist. Homoplasie suggeriert demnach genetische Verwandtschaft, wo keine ist. Für Parsimonieanalysen lassen sich diverse Indizes zur Abschätzung des Anteils an Homoplasie im Datensatz berechnen. Eine einfache Maßzahl hierfür ist der Konsistenzindex (ensemble consistency index, CI). Er berechnet sich als Summe der theoretisch minimal möglichen Schrittzahlen aller Merkmale auf einem Baum, geteilt durch die Summe der tatsächlich beobachteten Schrittzahlen aller Merkmale. Ein von Homoplasie freier Datensatz hätte einen CI von eins. Direkt aus dem CI folgt der Homoplasieindex (homoplasy index, HI), er berechnet sich als eins minus dem CI. Problematisch bei diesen Indizes ist die mangelnde Vergleichbarkeit zwischen unterschiedlichen Datensätzen (vgl. Knoop & Müller 2009). Verbessert ist diese beim Retentionsindex (retention index, RI). Auch hier steht ein Wert von eins für einen von Homoplasie freien Datensatz. Der rescaled consistency index (RC) berechnet sich schließlich als Produkt von CI und RI. 59 Material und Methoden Für die Parsimonieanalysen wurde die Software PAUP* 4.0 Beta 10 (Swofford 2003) verwendet. Es wurden jeweils heuristische Baumsuchen durchgeführt. Durch schrittweises Hinzufügen von Sequenzen in zufälliger Reihenfolge (stepwise addition) wurden in 1.000 Replikaten Startbäume generiert. Ausgehend von jedem dieser Bäume wurde durch den Austausch von Ästen (branch swapping) eine Vielzahl an Bäumen generiert. Mittels des TBR-Algorithmus (tree bisection and reconnection) mit steepest-descent-Modifikation wurden diese Bäume dann rearrangiert. Nach allen Analysen wurden jeweils der Strict- und der 50% Majority Rule-Konsensusbaum generiert. Weiterhin wurden die vier verfügbaren Indizes (CI, HI, RI und RC) zur Abschätzung von Homoplasie berechnet. Ferner wurden jeweils eine Bootstrap- und eine Jackknife-Analyse mit 1.000 Replikaten durchgeführt. Um die Rechenzeit zu verringern, wurde die maximale Zahl pro Replikat gespeicherter Bäume auf 100 begrenzt und es wurden pro Replikat nur 10 Startbäume generiert. Ansonsten wurden die gleichen Einstellungen wie in der einfachen Analyse verwendet. In den Jackknife- Analysen wurden in jedem Replikat 50% der Merkmale gelöscht. 2.3.5 Maximum Likelihood-Analyse und Substitutionsmodelle Das der Maximum Likelihood (ML, Edwards & Cavalli-Sforza 1963b) zugrunde liegende Optimalitätskriterium ist das der höchsten Wahrscheinlichkeit eines Datensatzes angesichts eines phylogenetischen Baumes (Likelihood). Gesucht wird demnach der phylogenetische Baum, für den die zugrunde liegende Hypothese zur Evolution mit der größten Wahrscheinlichkeit zu dem beobachteten Datensatz geführt hätte. Dafür wird analog zur Parsimonieanalyse eine heuristische Baumsuche durchgeführt. Für jeden resultierenden Baum oder Teilbaum wird die Wahrscheinlichkeit berechnet, mit der der gegebene Datensatz aus der Topologie und den Astlängen des jeweiligen Baumes hervorgegangen ist (z. B. Knoop & Müller 2009). Diesen Berechnungen wird ein Substitutionsmodell zugrunde gelegt. Solche Modelle enthalten Annahmen, auf welche Art und Weise DNA-Sequenzen evolvieren. Ein häufig verwendetes Modell ist das sehr komplexe und damit auch sehr allgemeine GTR-Modell (general time reversible Tavaré 1986). Es erlaubt für alle Basenübergänge eine individuelle Substitutionsrate und berücksichtigt die unterschiedlichen Frequenzen, mit denen bestimmte Basen im Alignment auftauchen. Häufig findet eine Kombination mit der Berücksichtigung invarianter Alignmentpositionen statt (GTR+I). Ferner können für unterschiedliche Alignmentpositionen unterschiedliche Substitutionsraten angenommen werden (z. B. GTR+G oder GTR+CAT, siehe unten). Ein weiteres in dieser Arbeit verwendetes Modell ist das weniger komplexe HKY-Modell (Hasegawa et al. 1985). Hier werden ebenfalls 60 Material und Methoden unterschiedliche Basenfrequenzen berücksichtigt, bei den Basenübergängen werden aber nur Transitionen und Transversionen unterschieden. Für eine Analyse sollte aus der Vielzahl existierender Modelle stets jenes ausgewählt werden, welches mit der geringsten Zahl an Parametern auskommt und dabei trotzdem eine optimale Anpassungsgüte an den Datensatz liefert. Zu diesem Zweck werden vor den eigentlichen Analysen unterschiedliche Modelle auf einen Datensatz angewendet und die Ergebnisse verglichen. Die Anzahl verwendeter Parameter wird jeweils als Strafterm mit der Anpassungsgüte zu einem so genannten Informationskriterium kombiniert. Aus der Menge getesteter Modelle wird dann das mit dem höchsten Wert des Informationskriteriums ausgewählt. Praktisch werden also solche Modelle bevorzugt, die einen optimalen Kompromiss aus hoher Anpassungsgüte und niedriger Zahl an Parametern bieten. Das älteste und heute trotzdem noch regelmäßig verwendete Kriterium ist Akaikes Informationskriterium (AIC, Akaike 1973). Eine Phylogenierekonstruktion mittels des ML-Kriterium wurde mit der Software RAxML 7.2.6 durchgeführt (Stamatakis 2006b). Als Substitutionsmodell diente hier GTR+CAT (Stamatakis 2006a). Bei vielen Modellen wird eine Gamma-Verteilung der Substitutionsraten über die einzelnen Alignmentpositionen angenommen (z. B. GTR+G). Bei GTR+CAT (CAT für categorized) werden stattdessen einige wenige Kategorien von Positionen definiert, deren Substitutionsraten sich jeweils in gewissen Schranken bewegen. Diese Kategorien werden während der Laufzeit des Programms ständig angepasst. Die Verwendung von GTR+CAT stellt eine enorme Ersparnis an Rechenaufwand und vielfache Beschleunigung der Analysen dar. Ebenfalls mit RAxML 7.2.6 wurde jeweils eine schnelle Bootstrap-Analyse (rapid RAxML bootstrapping Stamatakis et al. 2008) mit 1.000 Wiederholungen durchgeführt. 2.3.6 Bayes'sche Analyse Bei einer ML-Analyse wird nach demjenigen einzigen Baum gesucht, der unter a priori zu definierenden Bedingungen wie dem Substitutionsmodell einen gegebenen Datensatz am wahrscheinlichsten reflektiert. Phylogenetische Analysen mittels Bayes'scher Statistik (Bayesian inference, BI) verfolgen einen anderen Ansatz. Statt nach einem simplen Baum wird hier nach einem optimalen Satz an Parametern gesucht, welcher neben Topologie und Astlängen weitere Größen wie Substitutionsparameter enthält. Aus einer großen Zahl an Parameterkombinationen, die einer so genannten Posterioriwahrscheinlichkeitsverteilung um die optimale Kombination folgen, wird eine hinreichend große Stichprobe gezogen. Aus dieser lassen sich dann nicht nur ein phylogenetischer Konsensusbaum, sondern auch die Mittelwerte der anderen Parameter ableiten, etwa der Substitutionsraten. Weiterhin kann 61 Material und Methoden auch das Glaubwürdigkeitsintervall (credibility interval) jeder dieser Größen errechnet werden. Eine vollständige Simulation der besagten Wahrscheinlichkeitsverteilung würde die Evaluierung aller möglichen Bäume nötig machen. Da dies für reale Datensätze rechnerisch nicht lösbar ist, werden die Stichproben durch so genannte Markov-Ketten (Markov Chain Monte Carlo, MCMC) generiert. Das in der vorliegenden Arbeit verwendete Programm MrBayes 3.2.1 (Huelsenbeck & Ronquist 2001) verwendet eine Variante der MCMC, die als Metropolis-Hastings-Green- Algorithmus bezeichnet wird. Ausgehend von einem Startzustand, beispielsweise einem zufällig generierten Baum mit zufälligen Astlängen und zufälligen Substitutionsparametern, wird in jeder Iteration der jeweils aktuelle Satz an Parametern leicht modifiziert. Dann werden die Posterioriwahrscheinlichkeiten des ursprünglichen und des neuen Zustandes miteinander verglichen. Besitzt der neue Zustand dieselbe oder eine höhere Posterioriwahrscheinlichkeit als der alte, wird er angenommen. Ist jedoch die Posterioriwahrscheinlichkeit des alten Satzes an Parametern höher, wird der neue Zustand nur mit einer bestimmten Wahrscheinlichkeit akzeptiert, welche umso kleiner ist, je mehr sich die Posterioriwahrscheinlichkeiten beider Zustände unterscheiden. In die Evaluierung jedes Zustandes fließt auch die jeweilige Likelihood des aktuellen Baumes ein (vgl. 2.3.5), deren Berechnung einen Großteil der insgesamt benötigten Rechenzeit ausmacht (Knoop & Müller 2009). Da es sich um einen Selbstoptimierungsprozess handelt, sollten sich die Zustände der Markov-Kette von einem beliebigen Startzustand ausgehend dem optimalen Zustand annähern und dann um diesen pendeln. Die Kette befindet sich dann in der stationären Phase. Werden dann nach Beendigung der Analyse die Mittelwerte und Konfidenzintervalle der Bäume und Parameter berechnet, so sollte der Teil der Stichprobe verworfen werden, welcher vor Erreichen der stationären Phase gezogen wurde. Diese Phase wird als Burn-in bezeichnet. Als problematisch wirkt sich wie bei anderen Analysemethoden das mögliche Vorhandensein lokaler Optima aus, welche nicht dem globalen Optimum entsprechen. Wenn der Umfang an Modifikationen, die in jeder Iteration durchgeführt werden, zu gering ist, um das lokale Optimum zu verlassen, ist die Markov-Kette gefangen. Dem begegnet MrBayes durch die Verwendung parallel laufender Ketten (Metropolis-coupled Markov Chain Monte Carlo, MC3). Jeweils eine dieser Ketten (heated chain) erhält künstlich erhöhte Posterioriwahrscheinlichkeiten für ihre Bäume, was die Variabilität ihrer Zustände stark erhöht. Alle Ketten laufen unabhängig voneinander, gelegentlich tauscht aber die erhitzte Kette ihre Identität mit einer der übrigen, was Sprünge in der 62 Material und Methoden Posterioriwahrscheinlichkeitsverteilung und damit das Verlassen lokaler Optima gewährleistet (Knoop & Müller 2009). Mit dem Programm MrModeltest 2.3 (Nylander 2004) wurde für jeden untersuchten Locus unabhängig das optimale Substitutionsmodell unter Akaikes Informationskriterium gesucht. Das kombinierte Alignment der plastidären Loci wurde partitioniert (rpl32-trnL, matK Teil a, rps16-trnK, rps16-Intron, petD-Intron und trnD-trnT) und für jeden Locus das entsprechende Substitutionsmodell definiert. Die Bayes'schen Analysen wurden mit der Software MrBayes 3.2.1 (Huelsenbeck & Ronquist 2001) durchgeführt. Dafür wurden alle Analyseparameter außer Topologie und Astlänge entkoppelt, durften also zwischen den verschiedenen Partitionen variieren. Pro Lauf wurden drei erhitzte Markov-Ketten (heated chains) mit einem Heizparameter von 0,2 und eine kalte Kette (cold chain) initialisiert. Für jede Analyse wurden jeweils zwei unabhängige Läufe mit je 2.500.000 Generationen durchgeführt, deren Resultate anschließend kombiniert wurden. Die Analysen der einzelnen plastidären Loci, der cpSSR-Daten und des kombinierten Datensatzes aus plastidären Sequenzdaten und cpSSR-Daten erfolgten jeweils in zwei Läufen mit je 1.000.000 Generationen. Nach jeweils 100 Generationen wurden der aktuelle Baum mit Astlängen sowie alle Analyseparameter gespeichert. Im Anschluss an den Lauf wurde ein Plot erstellt, bei dem die Likelihoods der resultierenden Einzelbäume gegen die Generationsnummer grafisch aufgetragen wurden (likelihood-by-generation plot), um den als Burn-in zu verwerfenden Teil des Datensatzes zu evaluieren. Für alle Analysen stellte sich ein Burn-in von 10% als ausreichend heraus. Aus den verbleibenden Bäumen wurde jeweils ein 50%- Majority Rule-Konsensusbaum erstellt. 2.3.7 Datierte Phylogenien mit BEAST Aus der Idee, dass sich DNA-Sequenzen im Laufe der Evolution mit konstanten Substitutionsraten ändern, wurde das Prinzip der strikten molekularen Uhr abgeleitet (Zuckerkandl & Pauling 1962; Margoliash 1963). Unter Annahme einer solchen lassen sich ultrametrische Bäume mit Zeitskala, also Chronogramme erstellen. Durch Kalibrierung anhand datierbarer Knoten, etwa durch Fossilien, lassen sich so Hypothesen zum zeitlichen Ablauf der Evolution einer Organismengruppe aufstellen. Zwar gilt das Modell der strikten Uhr heute als überholt, da eine Reihe von Faktoren erheblichen Einfluss auf die Substitutionsraten haben und diese somit keineswegs konstant sind (vgl. Ayala 1999). Durch unterschiedliche Methoden, welche Änderungen der Substitutionsraten berücksichtigen, ist dennoch eine Rekonstruktion des zeitlichen Ablaufs der Evolution möglich. Mittels NPRS (nonparametric rate smoothing, Sanderson 1997) und PL (penalized likelihood, Sanderson 2002) können bereits bestehende Phylogenien in ultrametrische Form überführt werden. 63 Material und Methoden Relativ jung ist der in der vorliegenden Arbeit verwendete Ansatz der Relaxed Phylogenetics (Drummond et al. 2006; Drummond & Rambaut 2007). Bei dieser Methode werden die Topologie des Chronogramms und die den Knoten zugeordneten Zeiten im gleichen Vorgang mit Hilfe von Bayes'scher Statistik generiert. Für den kombinierten Datensatz der Chloroplasten-Sequenzen wurde eine Analyse mit dem Programmpaket BEAST 1.6.1 (Drummond & Rambaut 2007) durchgeführt. Zunächst wurde mit dem Programm BEAUTi die XML-Datei für die Analyse in BEAST generiert. Als einziger Kalibrationspunkt wurde das von Givnish et al. (2011) für die Kronengruppe der Pitcairnioideae ermittelte Alter von 11,8 Millionen Jahren mit einer Standardabweichung in der Normalverteilung von ±0,5 Millionen Jahren verwendet. Als Substitutionsmodell wurde GTR+I+G mit empirisch determinierten Basenfrequenzen verwendet (vgl. 2.3.5). Für die a- priori-Wahrscheinlichkeiten des Baumes wurde als Speziationsmodell ein Yule-Prozess angenommen, bei dem eine konstante Rate an Verzweigungen existiert, die pro Zeiteinheit von einem Ast ausgehen. Die Analyse wurde unter Annahme logarithmisch normalverteilter, unkorrelierter Substitutionsraten durchgeführt (Drummond et al. 2006). Jede Analyse wurde viermal unabhängig mit jeweils 10.000.000 Generationen durchgeführt, wobei jeder eintausendste Baum gespeichert wurde. Die Konvergenz der Einzelanalysen und ihrer Parameter sowie die effektiven Stichprobengrößen aller Parameter wurden mit dem Programm Tracer 1.5 (Rambaut & Drummond 2009) überprüft. Für jeden der jeweils vier Läufe wurden die ersten 1.001 ermittelten Bäume als Burn-in verworfen und die übrigen mit dem Programm LogCombiner 1.6.1 in einer Datei zusammengefasst. Aus diesen Einzelbäumen wurde ein Konsensusbaum (maximum clade credibility tree) mit TreeAnnotator 1.6.1 erstellt. Bei der Konsensbildung wurden die mittleren Knotenalter (median node heights) verwendet und eine minimale Posterioriwahrscheinlichkeit (posterior probability limit) von 0,5 für annotierte Kladen vorausgesetzt. In einer zweiten Analyse wurden die Topologien der von BEAST generierten Bäume zunächst mit PAUP* 4.0 Beta 10 (Swofford 2003) einem 50%-Majority Rule-Konsensusbaum verrechnet. Die von BEAST ermittelten Substitutionsraten und mittleren Knotenalter wurden dann mittels TreeAnnotator 1.6.1 auf diesen Zielbaum projiziert. Die graphische Aufarbeitung erfolgte mit dem Programm FigTree 1.3.1 (Rambaut 2006) und in manueller Nacharbeit. 2.3.8 Netzwerke Bei phylogenetischen Bäumen spiegelt die Darstellung mit unbesetzten internen Knoten die Annahme wider, dass ursprüngliche Sequenzvarianten (Haplotypen) extinkt sind. Rezente Taxa stehen nur an den Endästen. Besitzt ein Endast die Länge null, steht das 64 Material und Methoden entsprechende Taxon zwar mit dem Knoten auf einer Höhe. Die Tatsache aber, dass dieses Taxon einen plesiomorphen Haplotyp repräsentiert, ist durch die Darstellungsweise nicht klar erkennbar. Bei der Darstellung als phylogenetisches Netzwerk wird direkt deutlich, wenn ursprüngliche Haplotypen in rezenten Taxa vorkommen. Insbesondere auf niedrigem taxonomischem Niveau haben sich phylogenetische Netzwerke als gute Alternative zu Bäumen erwiesen. Für intraspezifische und phylogeographische Untersuchungen ist die Erstellung von Netzwerken auf Basis von Haplotypen häufig die erste Wahl (z. B. Avise 2000; Posada & Crandall 2001). Ein solches Netzwerk besteht aus Kanten und Knoten. Jeder Knoten entspricht einem Haplotyp und wird zumeist als Kreis dargestellt. Je zwei benachbarte Knoten sind durch eine Kante verbunden, dargestellt als Linie. Jede Kante, die zwei Haplotypen verbindet, steht für exakt einen evolutiven Schritt. Unterscheiden sich zwei Haplotypen durch mehr als einen Schritt und der fehlende Knoten kann nicht durch eine real gefundene Sequenzvariante besetzt werden, so wird ein fehlender Haplotyp postuliert und meist durch einen kleineren Kreis dargestellt. Enthält der Datensatz Homoplasie, so gibt es zwischen manchen Haplotypen alternative Verbindungen und es entstehen Maschen. Die Anzahl und die Position solcher Maschen zeigen die Anwesenheit von Homoplasie direkt graphisch an. Durch Annahme mehrfacher unabhängiger Substitutionen lässt sich prinzipiell jeder Haplotyp mit jedem anderen verbinden. Nimmt man aber die einfachste Erklärung für den Datensatz als die wahrscheinlichste an, so können die meisten Verknüpfungen ausgeschlossen werden (Parsimonieprinzip, vgl. auch 2.3.4). Gesucht wird das Netzwerk, welches alle beobachteten Haplotypen enthält und miteinander verbindet, dabei aber insgesamt möglichst wenige Schritte und postulierte Haplotypen benötigt. Ein solches Netzwerk lässt sich mittels statistischer Parsimonie finden, auf welcher das Programm TCS 1.2.1 (Clement et al. 2000) beruht. Hier werden in Grenzen neben dem sparsamsten Netzwerk auch weniger parsimonische Alternativen berücksichtigt, um eine statistisch belastbare Hypothese abzuschätzen (Templeton et al. 1992). Eine Analyse mit TCS wurde für den kombinierten plastidären Datensatz durchgeführt. In die Analyse wurden lediglich die Gattungen Dyckia und Encholirium, sowie Deuterocohnia brevispicata (FK0071) und Deuterocohnia meziana (FK0073) eingeschlossen. Lücken im Alignment wurden als fehlende Information gewertet. Verbindungen zwischen Haplotypen wurden nur bis zu einer bestimmten Zahl an einzufügenden fehlenden Haplotypen und Substitutionen erstellt. Die Grenze hierfür wurde so hoch gelegt, wie durch das Parsimoniekriterium gerade noch gerechtfertigt ist (calculate 95% connection limit, siehe auch Templeton et al. 1992). 65 Ergebnisse 3 Ergebnisse 3.1 DNA-Isolation Die verwendete Variante der DNA-Isolationsmethode von Tel-Zur et al. (1999) lieferte gute Ergebnisse für alle Proben. In allen Fällen zeigte sich eine deutliche Bande im hochmolekularen Bereich und nur wenig niedermolekularer Schmier. Durch den Vergleich mit DNA aus dem Phagen λ wurden Konzentrationen von unter 5 ng/µl bis über 100 ng/µl ermittelt. Die entspricht einer Ausbeute von unter 0,5 µg bis über 10 µg DNA pro Isolation. Eine Zusammenstellung der Gelbilder aller isolierten Proben findet sich in Anhang 5. Für die von Kooperationspartnern nach der klassischen CTAB-Methode isolierte DNA wurde zumeist ein höherer Anteil an niedermolekularen Anteilen in den Proben beobachtet. Die gewonnene Menge an DNA war dabei in einigen Fällen so gering, dass sie nicht mehr durch Agarose-Gelelektrophorese nachgewiesen und quantifiziert werden konnte. Insbesondere die Amplifikation von phyC erwies sich für einige dieser Proben als problematisch (vgl. 3.3.1). Beispiele für von Kooperationspartnern isolierte DNA auf Agarose finden sich ebenfalls in Anhang 5. 3.2 Sequenzierung plastidärer Loci 3.2.1 Charakterisierung verschiedener plastidäre Loci Zu Beginn der Untersuchungen wurde die Amplifizierbarkeit und Sequenzierbarkeit sowie die Sequenzvariation an zahlreichen plastidären Loci innerhalb eines kleinen Testsets von acht Dyckia-Akzessionen bestimmt (zum Testset vgl. 2.1 und Tabelle 1, zu den verwendeten Loci vgl. Tabelle 2). Für 16 Loci konnten lesbare Sequenzen generiert werden, deren Variabilität im Testset in Abbildung 15 zusammengestellt ist. Auf Basis dieser Pilotexperimente wurden sechs Loci für die phylogenetischen Untersuchungen ausgewählt, nämlich rpl32-trnL, rps16-trnK, matK Teil a, rps16-Intron, petD-Intron und trnD-trnT (jeweils dunkelgrün markiert in Abbildung 14). Für diese sechs Loci wurden für 124 Akzessionen Sequenzdaten erzeugt und einem multiplen Alignment unterworfen. Wesentliche Eigenschaften der Alignments sind in Tabelle 9 zusammengestellt, ein beispielhafter Ausschnitt ist in Abbildung 16 gezeigt. Für jeden einzelnen Locus wurde eine separate Bayes'sche Analyse durchgeführt, um das jeweilige Auflösungsvermögen zu evaluieren (Abbildung 17, Anhang 13-18). Im Folgenden wird auf die einzelnen Loci detailliert eingegangen. 66 Ergebnisse rpl 32 -trn L Die für den in zwei Teilen amplifizierten Locus rpl32-trnL gewonnenen Sequenzen ließen sich in allen Fällen gut auswerten. Die assemblierten Sequenzen wiesen Längen von 860-952 bp auf (929-952 bp innerhalb von Dyckia, Tabelle 9). Innerhalb von Dyckia wurden drei variable SSRs (T6-7, T6-8 und A8-10) gefunden. Ferner wurde eine Region von sechs Nukleotiden Länge identifiziert, welche offenbar mehrfach unabhängig invertiert wurde. So finden sich in allen sechs untersuchten Gattungen jeweils zwei Versionen dieses Bereiches. Die invertierte Region wurde aus den nachfolgenden Berechnungen und aus dem Alignment ausgeschlossen. Über den vollen Datensatz und das gesamte Alignment von 1.002 Positionen Länge hinweg betrug die Variabilität von rpl32-trnL 12,4% (2,6% innerhalb von Dyckia). Die aus einer Bayes'schen Analyse dieses Locus resultierende Phylogenie zeigte wenig Auflösung innerhalb von Dyckia, keine größere Klade wurde gefunden. Allerdings konnten 12 sehr gut gestützte Verzweigungen und zwei früh abzweigende Linien identifiziert werden (Abbildung 17 und Anhang 13). 67 Abbildung 15: Sequenzvariabilität verschiedener plastidärer Loci innerhalb von acht Arten von Dyckia In den Vergleich einbezogen wurden jeweils Sequenzen aller acht Proben des Testsets TS2, mit Ausnahme von psbJ-petA, wo die Sequenzierung für zwei Proben nicht funktionierte. Die farbigen Balken auf der linken Seite geben die absolute Zahl an beobachteten Merkmalsänderungen an. Die Farben entsprechen den Farben der Legende auf der rechten Seite und zeigen an, welche Art von Mutationen der Merkmalsänderung zugrunde lagen. Die grauen Balken auf der rechten Seite geben die Variabilität als prozentualen Anteil von Merkmalsänderungen an, bezogen auf die Gesamtlänge des sequenzierten Abschnitts im Alignment. 10 5 0,2% 0,4% 0,6% 0,8% 1,0% 1,2% Variabilität des Locusvariable Elemente rpl32-trnL rps16-Intron psbJ-petA matK Teil a trnD-trnT ndhF Teil a ndhA-Intron trnF-ycf3 matK Teile b+c rbcL psbD-trnT rps16-trnK atpB-rbcL petB-Intron petD-Intron atpF-Intron Variable Mikrosatelliten Inversionen Indels Basensubstitutionen Ergebnisse rps 16- trn K Die für den in drei Teilen amplifizierten Locus rps16-trnK gewonnenen Sequenzen ließen sich in allen Fällen auswerten. Die assemblierten Sequenzen wiesen Längen von 848-861 bp auf (830-861 bp innerhalb von Dyckia, Tabelle 9). Innerhalb von Dyckia wurden zwei hoch variable SSRs von teilweise beträchtlicher Länge (A9-21und T9-18) gefunden. Ein Ausschnitt des Alignments mit den betreffenden Regionen ist in Abbildung 16 gezeigt. Jeweils eine der beiden SSR-Regionen befand sich in den Teilen a und b des Locus. Insbesondere bei Proben mit langen SSRs nahm die Sequenzqualität an diesen Bereichen jeweils abrupt ab. Durch die kurzen Fragmentlängen (Teil a: 236 bp, Teil b: 226 bp, Teil c: 486 bp, jeweils ohne Primer-Anteil im gesamten Alignment) und die bidirektionale Sequenzierung konnte jedoch in allen Fällen eine zuverlässige und eindeutige Sequenz gelesen werden. Über den vollen Datensatz und das gesamte Alignment von 896 Positionen Länge hinweg betrug die Variabilität von rps16-trnK 13,3% (3,7% innerhalb von Dyckia). Die aus einer Bayes'schen Analyse dieses Locus resultierende Phylogenie zeigte eine moderate Auflösung innerhalb von Dyckia. Zwei größere Kladen und 11 weitere Verzweigungen wurden identifiziert, dazu zwei früh abzweigende Linien (Abbildung 17 und Anhang 14). 68 Abbildung 16: Ausschnitt aus dem Alignment für den Locus rps16-trnK Gezeigt sind zwei Bereiche des Locus rps16-trnK, die jeweils einen besonders variablen Mikrosatelliten (cpSSR) enthalten. Der auf der linken Seite gezeigte SSR liegt in Teil a des Locus, der auf der rechten Seite gezeigte in Teil b. Die angegebenen Alignmentpositionen beziehen sich auf den kombinierten Datensatz aus allen sechs plastidären Loci. Ergebnisse 69 Abbildung 17: Bayes'sche Analyse der Einzel-Alignments der sechs sequenzierten plastidären Loci Gezeigt ist jeweils der 50% Majority Rule-Konsensusbaum aus einer Analyse mit MrBayes 3.2.1. Die Analysen wurden in zwei unabhängigen Läufen mit je 1.000.000 Generationen durchgeführt. Von den resultierenden Bäumen wurden je 10% als Burn-in verworfen. Über den Ästen finden sich die Posterioriwahrscheinlichkeiten. Die Astlängen repräsentieren die erwartete Zahl an Substitutionen, entsprechend der Maßstabsleiste unter dem jeweiligen Baum. Graue Flächen markieren Akzessionen von Dyckia. Pfeile markieren Linien von Encholirium, die im Baum eine Position innerhalb von Dyckia einnehmen. 0.3 0,84 0,71 0,9 1 0,7 0,82 0,99 0,82 0,78 0,91 0,891 0,9 0,71 0,96 0.3 0,9 0,93 1 1 0,98 0,8 0,99 0,94 0,71 0,67 0,95 0,99 0,91 0,94 1 1 0,93 0,98 1 1 0,95 0,94 0,97 0,96 1 0,99 1 0,95 0,95 1 1 1 0.3 0,88 1 1 0,96 0,96 1 1 0,97 0,97 1 0,99 0,68 0,94 1 0,99 1 0,98 0,99 1 0.3 0,88 0,961 1 1 0,99 0,95 1 1 0,62 1 0,98 1 0,94 0,98 1 0,94 0,94 0,95 1 0,96 0,96 0,9 0.3 1 0,77 0,96 1 0,99 1 1 0,95 0,77 1 0,93 1 0,97 0,95 0,67 1 0,94 0,96 0,77 0,98 0,63 1 0,95 0,97 1 0,94 1 0,99 0,94 1 0,77 0,94 0,98 0,95 0.3 0,65 0,86 0,99 0,75 0,88 0,72 1 0,94 0,79 0,91 0,96 1 1 0,94 0,58 1 0,68 0,75 1 1 rpl32-trnL rps16-trnK matK Teil a rps16-Intron petD-Intron trnD-trnT Ergebnisse mat K Teil a Die für matK Teil a gewonnenen Sequenzen ließen sich in allen Fällen gut auswerten. Es wurden Fragmentlängen von 775-796 bp beobachtet (konstant 786 bp innerhalb von Dyckia). Innerhalb von Dyckia wurden keinerlei Indels oder SSRs an diesem Locus gefunden. Über den vollen Datensatz und das gesamte Alignment von 803 Positionen Länge hinweg betrug die Variabilität von matK Teil a 9,2% (2,0% innerhalb von Dyckia). Die aus einer Bayes'schen Analyse dieses Locus resultierende Phylogenie zeigte eine sehr geringe Auflösung innerhalb von Dyckia. Lediglich eine größere Klade und vier weitere Verzweigungen wurden identifiziert (Abbildung 17 und Anhang 15). Die Teile b und c von matK ließen sich ebenfalls sehr gut sequenzieren und auswerten. Wegen des Mangels an Variabilität innerhalb des Testsets von acht Dyckia-Akzessionen wurden diese Bereiche aber nicht weiter verwendet (vgl. Abbildung 15). rps 16 - Intron Die für den Locus rps16-Intron gewonnenen Sequenzen ließen sich in allen Fällen gut auswerten. Es wurden Fragmentlängen von 810-884 bp (842-884 bp innerhalb von Dyckia, Tabelle 9) beobachtet. Innerhalb von Dyckia wurde ein variabler SSR (G7-8) identifiziert. Über den vollen Datensatz und das gesamte Alignment von 976 Positionen Länge hinweg betrug die Variabilität des Locus rps16-Intron 9,4% (2,0% innerhalb von Dyckia). Die aus einer Bayes'schen Analyse dieses Locus resultierende Phylogenie zeigte acht kleine Kladen mit Akzessionen von Dyckia. Encholirium und Deuterocohnia sind hier nicht von Dyckia getrennt (Abbildung 17 und Anhang 16). Einige Akzessionen von Encholirium stehen in abgeleiteter Position zwischen Vertretern von Dyckia (in Abbildung 17 durch Pfeile gekennzeichnet), beide Gattungen sind damit paraphyletisch. pet D - Intron Die für den Locus petD-Intron gewonnenen Sequenzen ließen sich in allen Fällen gut auswerten, einen einzelnen Ausfall gab es für die Probe von Puya fuertesii. Hier waren trotz Wiederholungen auch der PCR jeweils nur kurze Stücke in jede Richtung lesbar, danach wurde die Qualität schlagartig schlecht. Es wurden Fragmentlängen von 703-767 bp (719 bp innerhalb von Dyckia, Tabelle 9) beobachtet. Innerhalb von Dyckia wurden keinerlei Indels oder SSRs an diesem Locus gefunden. Über den vollen Datensatz und das gesamte Alignment von 788 Positionen Länge hinweg betrug die Variabilität des Locus petD-Intron 9,6% (0,9% innerhalb von Dyckia). Die aus 70 Ergebnisse einer Bayes'schen Analyse dieses Locus resultierende Phylogenie zeigte eine sehr geringe Auflösung innerhalb von Dyckia (Abbildung 17 und Anhang 17). Lediglich eine größere Klade und fünf weitere Verzweigungen wurden identifiziert. Alle Akzessionen von Dyckia und die meisten Akzessionen von Encholirium stehen in einer gemeinsamen unaufgelösten Polytomie. trn D -trn T Die für den Locus trnD-trnT gewonnenen Sequenzen ließen sich in den meisten Fällen gut auswerten. Für einige Proben der Gattungen Fosterella, Pitcairnia und Puya war der sequenzierte Bereich jedoch infolge von Insertionen deutlich länger als bei den übrigen Proben. Die Sequenzqualität im Bereich der Überlappung von Vorwärts- und Rückwärts- Sequenz war hier gerade noch ausreichend. Es wurden Fragmentlängen von 845-1.376 bp (845-907 bp innerhalb von Dyckia, Tabelle 9) beobachtet. Innerhalb von Dyckia wurde ein sehr variabler SSR (T9-17) identifiziert. Über den vollen Datensatz und das gesamte Alignment von 1.538 Positionen Länge hinweg betrug die Variabilität von trnD-trnT 8,3% (1,1% innerhalb von Dyckia). Die aus einer Bayes'schen Analyse dieses Locus resultierende Phylogenie zeigte eine sehr geringe Auflösung innerhalb von Dyckia. Lediglich sechs Verzweigungen wurden hier identifiziert (Abbildung 17 und Anhang 18). Sonstige verwendete plastidäre Loci Keine Amplifikate lieferte die PCR der Loci nhdF-rpl32, psbA-trnH und rpoB-trnC. Einige Ausfälle und generell schwache PCR-Banden wurden für ndhF Teil b beobachtet. Die Amplifikation der Loci trnQ-5'rps16, trnS-trnG und 3'trnV-ndhC resultierte in multiplen Banden auf dem Agarosegel. Für die intergenischen Bereiche atpB-rbcL, psbB-psbH, psbD-trnT, psbJ-petA, trnS-ycf3 und trnL-trnF, die exonischen Bereiche ndhF Teil a und rbcL sowie die intronischen Bereiche atpF-Intron, ndhA-Intron und petB-Intron zeigte sich nach der PCR jeweils eine diskrete Einzelbande auf dem Agarosegel. Die Sequenzierung der Fragmente für psbB-psbH und trnL-trnF lieferte jedoch keine auswertbaren Sequenzen. Für psbD-trnT konnten jeweils Teile der Vorwärts- und Rückwärts-Sequenzen gelesen werden (maximal 518 bp und 587 bp Länge), die schlechte Qualität erlaubte es aber nicht, den überlappenden Bereich zu rekonstruieren. Das Alignment der Fragmente an das Plastom von Typha latifolia wies eine Lücke von mindestens 48 bp zwischen den beiden Fragmenten auf. 71 Ergebnisse Für psbJ-petA waren ebenfalls nur Teile der Vorwärts- und Rückwärts-Sequenzen lesbar (maximal 483 bp und 327 bp Länge), die ebenfalls nicht assembliert werden konnten. Das Alignment der Fragmente an das Plastom von Typha latifolia wies eine Lücke von mindestens 320 bp zwischen den beiden Fragmenten auf. Für die intergenischen Bereiche atpB-rbcL und trnS-ycf3, die exonischen Bereiche ndhF Teil a und rbcL und die intronischen Bereiche atpF-Intron, ndhA-Intron und petB-Intron konnten jeweils Sequenzen für alle acht Proben des Testsets gewonnen werden. Eine Übersicht der beobachteten Variabilität dieser Loci findet sich in Abbildung 15. 3.2.2 Phylogenetische Untersuchungen Eigenschaften des kombinierten Alignments sechs plasdtidärer Loci Das kombinierte Alignment sechs plastidärer Loci zeigte eine Länge von 6.009 Positionen (Tabelle 9). Ein offenbar häufig invertierender Bereich von 6 bp Länge im Locus rpl32-trnL wurde aus den Analysen ausgeschlossen (siehe auch 3.2.1). Von den verbliebenen 6.003 Positionen waren 10,2% variabel (2,0% innerhalb von Dyckia). Insgesamt 293 Positionen erwiesen sich als parsimonie-informativ (61 innerhalb von Dyckia). Von insgesamt 76 identifizierten Indels (16 innerhalb von Dyckia) erwiesen sich nur fünf als parsimonie- informativ innerhalb von Dyckia. Von 22 gefundenen variablen SSRs (sieben innerhalb von Dyckia) waren sechs parsimonie-informativ innerhalb von Dyckia. Aufgrund des geringen Informationsgehaltes dieser wenigen Indels und des hohen Risikos von Homoplasie insbesondere bei SSRs, wurden bei den phylogenetischen Analysen weder Indels noch SSRs berücksichtigt (siehe auch 4.1.5). Tabelle 9: Alignment-Statistiken Gezeigt sind verschiedene Eigenschaften der Alignments von 124 Proben für unterschiedliche plastidäre Loci, den kombinierten plastidären Datensatz (cp total) und phyC. Werte ohne Klammern beziehen sich auf die enthaltenen Akzessionen von Dyckia, in Klammern sind jeweils die Werte für den gesamten Datensatz angegeben. Die angegebene Alignment-Länge bezieht sich jeweils auf das Alignment aller Proben. Für den Locus rpl32-trnL wurde eine 6 bp lange Inversion bei der Berechnung der Daten ausgeschlossen. Locus Sequenz-Längen Alignment- Länge Merkmale konstant Merkmale variabel Merkmale uninformativ Merkmale informativ Indels variable SSRs rpl32-trnL 923-946 (854-946) 1002 976 (878) 26 (124) 11 (62) 15 (62) 3 (10) 3 (4) rps16-trnK 848-861 (830-861) 896 863 (777) 33 (119) 15 (53) 18 (66) 6 (14) 2 (5) matK 786 (775-796) 803 787 (729) 16 (74) 10 (38) 6 (36) 0 (4) 0 (1) rps16-Intron 842-884 (810-884) 976 956 (884) 20 (92) 10 (50) 10 (42) 4 (18) 1 (4) petD-Intron 719 (703-767) 788 781 (712) 7 (76) 1 (51) 6 (25) 1 (9) 0 (1) trnD-trnT 845-907 (845-1376) 1538 1521 (1410) 17 (128) 11 (66) 6 (62) 2 (21) 1 (7) cp total 4973-5054 (4939-5449) 6003 5884 (5390) 119 (613) 58 (320) 61 (293) 16 (76) 7 (22) phyC 1159 (1159) 1159 1093 (970) 66 (189) 32 (75) 34 (114) 0 (0) 0 (0) 72 Ergebnisse Substitutionsmodelle für die Likelihood- und die Bayes'sche Analyse Mit dem Programm MrModeltest 2.3 (Nylander 2004) wurde als optimales Substitutionsmodell für den gesamten kombinierten Datensatz das Modell GTR+I+G ermittelt, welches in der BEAST-Analyse Verwendung fand. Für die Bayes'schen Analysen mit wurde mit MrModeltest für jeden Locus individuell ein optimales Substitutionsmodell gesucht. Insgesamt wurden drei verschiedene Modelle empfohlen, nämlich das HKY+G- Modell für matK und rps16-Intron, GTR+G für rpl32-trnL und GTR+I+G für rps16-trnK, trnD-trnT und petD-Intron. Topologie aus der BEAST-Analyse und statistische Unterstützung Das kombinierte Alignment mit 6.003 Positionen Länge wurde einer Reihe unterschiedlicher Algorithmen zur Rekonstruktion phylogenetischer Bäume unterworfen. Dabei handelte es sich um Neighbour Joining-Analysen (NJ, 2.3.3), Parsimonieanalysen (MP, 2.3.4), Maximum Likelihood-Analysen (RAxML, 2.3.5) und Bayes'sche Analysen mit den Programmen MrBayes (2.3.6) und BEAST (2.3.7). Die Topologie der mit den verschiedenen Methoden erhaltenen Phylogramme stimmten in fast allen Aspekten überein. Die folgende Beschreibung bezieht sich auf die datierte Phylogenie aus der BEAST-Analyse (Abbildung 18), deren Topologie repräsentativ für die Mehrzahl aller durchgeführten Analysen ist. Neben den in dieser Analyse ermittelten Posterioriwahrscheinlichkeiten (PP) sind auch die Bootstrap-Werte in Prozent aus der Parsimonieanalyse (MPBS) und der RAxML-Analyse (MLBS) in der Abbildung enthalten. Die Angabe dieser Werte im folgenden Text in der Form (PP/MPBS/MLBS) bezieht sich jeweils auf die unmittelbar zuvor getroffene Aussage. Nach Bewurzelung mit den beiden als Außengruppe dienenden Vertretern der Gattung Puya bildet die Unterfamilie Pitcairnioideae eine klar monophyletische Abstammungsgemeinschaft (1,00/100/100). Innerhalb der Pitcairnioideae finden sich drei Linien in einer Polytomie, darunter zwei jeweils monophyletische Gruppen von Pitcairnia (1,00/100/100 und 1,00/99/100) sowie eine Klade, in welcher alle übrigen Gattungen vereinigt sind (0,99/88/87). Innerhalb der letztgenannten Klade steht die eindeutig monophyletische Gattung Fosterella (1,00/100/100) in einer Schwestergruppenposition zu einer Klade aus den drei xerophytischen Gattungen Deuterocohnia, Dyckia und Encholirium (1,00/100/100). Deuterocohnia besteht aus zwei jeweils gut gestützten paraphyletischen Linien (1,00/100/100), die basal zu einer gemeinsamen Klade aus Dyckia und Encholirium abzweigen (0,95/84/91). Encholirium besteht aus drei paraphyletischen Linien, die durch zwei interne Knoten voneinander getrennt sind (1,00/66/80 und 0,68/-/54). Eine erst vor kurzem gefundene 73 Ergebnisse 74 Abbildung 18: Datierte Phylogenie auf Basis sechs plastidärer Loci Die hier dargestellte datierte Phylogenie wurde mit dem Programmpaket BEAST 1.6.1 erstellt. Als Kalibrationspunkt für die Datierung diente das von Givnish et al. (2011) ermittelte Alter der Unterfamilie Pitcairnioideae (11,8 Millionen Jahre). Die Skala am unteren Bildrand beschreibt das Alter in Millionen Jahren. Über den Ästen finden sich Posterioriwahrscheinlichkeiten der BEAST-Analyse, unter den Ästen Bootstrap-Werte aus je 1.000 Wiederholungen einer Parsimonieanalyse und einer RAxML-Analyse des gleichen Datensatzes (Parsimonieanalyse/RAxML-Analyse). ze nt ra lb ra si lia ni sc he K la de pa ra gu ay is ch e K la de sü db ra si lia ni sc he K la de ar ge nt in is ch e K la de P itc ai rn ia Fo st er el la D eu te ro c. E nc ho lir iu m Fosterella penduliflora (FK0081) Dyckia remotiflora (FK0055) Dyckia niederleinii (FK0103) Dyckia velascana (FK0104) Dyckia velascana (FK0105) Dyckia floribunda (FK0107) Dyckia velascana (FK0006) Dyckia remotiflora (FK0068) Dyckia hebdingii (FK0112) Dyckia maritima (FK0113) Dyckia monticola (FK0088) Dyckia fosteriana (FK0094) Dyckia ferruginea (FK0090) Dyckia marnier-lapostollei var. mar. (FK0029) Dyckia estevesii (FK0005) Dyckia lindevaldae (FK0019) Dyckia braunii (FK0042) Dyckia estevesii var. braunii (FK0004) Dyckia leptostachya (FK0053) Dyckia estevesii (FK0033) Dyckia pumila (FK0093) Dyckia choristaminea (FK0040) Dyckia remotiflora var. indet. (FK0015) Dyckia ursina (FK0012) Dyckia spec. (FK0023) Dyckia spec. (FK0024) Dyckia aff. pumila (FK0017) Dyckia aff. leptostachya (FK0035) Dyckia aff. leptostachya (FK0016) Dyckia floribunda (FK0108) Dyckia floribunda (FK0052) Dyckia spec. (FK0086) Dyckia aff. ibiramensis (FK0025) Dyckia rariflora (FK0039) Dyckia aff. brevifolia (FK0010) Dyckia hebdingii (FK0013) Dyckia cf. velascana (FK0106) Dyckia remotiflora var. indet. (FK0011) Dyckia hebdingii (FK0038) Dyckia tobatiensis (FK0018) Dyckia spec. (FK0049) Dyckia niederleinii (FK0110) Dyckia ferox (FK0020) Dyckia ferox (FK0056) Dyckia vestita (FK0109) Dyckia brachyphylla (FK0045) Dyckia beateae (FK0044) Dyckia goehringii (FK0031) Dyckia saxatilis (FK0036) Dyckia brevifolia (FK0067) Dyckia estevesii (FK0001) Dyckia cinerea (FK0047) Dyckia dawsonii (FK0043) Dyckia macedoi (FK0099) Dyckia macedoi (FK0100) Dyckia macedoi (FK0101) Dyckia macedoi (FK0102) Dyckia maracasensis (FK0087) Dyckia ursina (FK0089) Dyckia milagrensis (FK0096) Dyckia granmogulensis (FK0007) Puya herzogii (FK0121) Puya ferruginea (FK0082) Pitcairnia feliciana (FK0119) Pitcairnia fuertesii (FK0120) Pitcairnia pipenbringii (FK0085) Pitcairnia pungens (FK0084) Pitcairnia heterophylla (FK0083) Fosterella weddelliana (FK0077) Fosterella spectabilis (FK0118) Fosterella albicans (FK0117) Deuterocohnia cf. haumanii (FK0075) Deuterocohnia brevifolia (FK0074) Deuterocohnia meziana (FK0073) Deuterocohnia brevispicata (FK0071) Encholirium horridum (FK0070) Encholirium spec. (FK0014) Dyckia beateae (FK0091) Dyckia maritima (FK0092) Dyckia encholirioides (FK0095) Dyckia choristaminea (FK0021) Dyckia cf. leptostachya (FK0115) Dyckia spec. (FK0116) Dyckia ferox (FK0027) Dyckia microcalyx (FK0054) Dyckia microcalyx var. indet. (FK0009) Dyckia microcalyx (FK0111) Dyckia cf. microcalyx (FK0051) Dyckia tomentella (FK0114) Dyckia vestita (FK0032) Dyckia marnier-lapostollei var. est. (FK0030) Encholirium erectiflorum (FK0123) Encholirium maximum (FK0124) Encholirium spec. (FK0125) Dyckia pernambucana (FK0098) Dyckia pernambucana (FK0097) Encholirium spec. (FK0079) Encholirium spec. (FK0080) Encholirium spec. (FK0078) Encholirium magalhaesii (FK0122) Deuterocohnia glandulosa (FK0072) Fosterella villosula (FK0076) Dyckia aff. reitzii (FK0050) Gen. nov. spec. nov. (FK0257) Dyckia elisabethae (FK0219) Dyckia jonesiana (FK0217) Dyckia densiflora (FK0213) Dyckia platyphylla (FK0209) Dyckia espiritosantensis (FK0207) Dyckia tuberosa (aff.) (FK0206) Dyckia mirandiana (FK0202) Dyckia pulquinenses (FK0199) Dyckia rojasii (FK0195) Dyckia aurea (FK0194) Dyckia lunaris (FK0193) Dyckia secunda (FK0192) Dyckia nana (FK0191) Dyckia paraensis (FK0190) Dyckia machrisiana (FK0189) Dyckia pectinata (FK0188) Dyckia delicata (FK0184) Dyckia grandidentata (FK0183) Dyckia dissitiflora (FK0141) Dyckia distachya (FK0126) 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 Millionen Jahre 0,52 -/620,68 -/- 1 98/100 1 89/87 0,95 -/- 1 62/92 1 68/961 56/94 0,99 62/83 0,99 -/51 1 74/78 0,60 -/- 0,99 63/63 0,98 64/61 1 62/- 1 77/86 1 85/930,99 59/58 0,98 -/- 1 65/80 0,98 53/- 0,99 -/- 1 93/94 0,99 64/67 0,90 67/69 1 63/82 0,99 -/52 1 88/95 1 62/92 0,99 -/65 1 63/80 0,99 51/56 0,99 -/- 1 85/87 0,50 -/78 1 -/55 1 85/87 1 61/770,52 -/-1 -/- 1 74/81 1 90/93 0,95 64/66 1 99/100 0,55 -/- 0,68 -/54 1 93/95 1 97/96 1 99/100 1 98/100 1 100/100 1 66/80 0,91 -/75 0,91 61/67 1 89/94 0,95 84/91 1 100/100 0,99 88/87 1 100/100 1 99/100 1 100/100 1 100/100 1 100/100 1 100/100 1 100/100 Ergebnisse Pflanze, die möglicherweise eine neue Gattung repräsentiert (FK0257), steht gemeinsam mit E. erectiflorum in abgeleiteter Position in derjenigen Linie von Encholirium, welche Dyckia am nächsten steht. In den folgenden Ausführungen wird diese Pflanze jeweils zu Encholirium gerechnet. Die Monophylie von Dyckia wird sehr gut gestützt (1,00/93/95). Eine einzelne Akzession von D. beateae steht in Schwestergruppenposition zum monophyletischen Rest der Gattung (1,00/97/96). In diesem wiederum steht eine Linie, die D. mirandiana und D. espiritosantensis als Monophylum enthält (1,00/99/100), in Schwestergruppenposition zum gesamten monophyletischen Rest der Gattung (0,98/-/-), der von hier an als „Core- Dyckia“ bezeichnet wird und eine umfangreiche Polytomie aus diversen Kladen und einzelnen Akzessionen bildet. Vier Kladen sind relativ gut gestützt und zeigen eine deutliche Korrelation mit der geographischen Herkunft ihrer Vertreter. So gibt es eine große zentralbrasilianische Klade (1,00/77/86), die insgesamt 37 Akzessionen enthält. Die paraguayische Klade (0,99/-/65) enthält D. pulquinensis in Schwesterposition zu den übrigen 17 Akzessionen (0,90/67/69). In der südbrasilianischen Klade (0,99/-/-) findet sich eine Tritomie, deren Linien insgesamt 15 Akzessionen enthalten. Die argentinische Klade schließlich (0,98/53/-) umfasst 12 Akzessionen in zwei Schwestergruppen etwa gleicher Größe. Ferner gibt es eine nicht näher bezeichnete Klade, die aus fünf Akzessionen besteht (1,00/93/94). Die Auflösung innerhalb der genannten Gruppen ist jeweils sehr gering. Unterschiede in anderen Analysen Die Ergebnisse der Parsimonieanalyse (Abbildung 19 und Anhang 8), der RAxML-Analyse (Abbildung 20), der Bayes'schen Analyse (Abbildung 21) und der NJ-Analyse (Anhang 6 und Anhang 7) weisen nur einen einzigen nennenswerten Widerspruch gegenüber der BEAST- Analyse oder untereinander auf. Dieser besteht in der Stellung von E. horridum, welche in der BEAST-Analyse mit vier anderen Encholirium-Akzessionen eine schlecht gestützte Klade bildet (PP=0,55, Abbildung 18). In allen anderen Analysen bildet E. horridum entweder eine unabhängige Linie innerhalb der paraphyletischen Gattung Encholirium oder steht in einer unaufgelösten Polytomie mit anderen Linien. Alle übrigen topologischen Unterschiede zwischen den mit verschiedenen Analysemethoden erzeugten Bäumen betreffen nur die unterschiedlich gute Auflösung an einzelnen Knoten und die statistische Unterstützung von Verzweigungen. Während Pitcairnia in der BEAST- Analyse aus zwei Linien besteht, die mit den übrigen Pitcairnioideae in einer Tritomie stehen, ist die Gattung in allen anderen Analysen paraphyletisch (MrBayes PP=0,78, MPBS=78%, MLBS=92%, NJBS=97%). Innerhalb von Encholirium finden sich vier unabhängige Linien, 75 Ergebnisse 76 Abbildung 19: Einzelner kürzester Baum aus einer Parsimonieanalyse auf Basis sechs plastidärer Loci Der hier gezeigte Baum ist einer von 100.000 kürzesten Bäumen mit einer Schrittlänge von 807, die aus einer Parsimonieanalyse mit PAUP* 4.0b resultierten. Die Astlängen entsprechen der Zahl evolutiver Schritte entsprechend der Maßstabsleiste am unteren Ende der Abbildung. Fosterella penduliflora (FK0081) Dyckia remotiflora (FK0055) Dyckia niederleinii (FK0103) Dyckia velascana (FK0104) Dyckia velascana (FK0105) Dyckia floribunda (FK0107) Dyckia velascana (FK0006) Dyckia remotiflora (FK0068) Dyckia hebdingii (FK0112) Dyckia maritima (FK0113) Dyckia monticola (FK0088) Dyckia fosteriana (FK0094) Dyckia ferruginea (FK0090) Dyckia marnier-lapostollei var. mar. (FK0029) Dyckia estevesii (FK0005) Dyckia lindevaldae (FK0019) Dyckia braunii (FK0042) Dyckia estevesii var. braunii (FK0004) Dyckia leptostachya (FK0053) Dyckia estevesii (FK0033) Dyckia pumila (FK0093) Dyckia choristaminea (FK0040) Dyckia remotiflora var. indet. (FK0015) Dyckia ursina (FK0012) Dyckia spec. (FK0023) Dyckia spec. (FK0024) Dyckia aff. pumila (FK0017) Dyckia aff. leptostachya (FK0035) Dyckia aff. leptostachya (FK0016) Dyckia floribunda (FK0108) Dyckia floribunda (FK0052) Dyckia spec. (FK0086) Dyckia aff. ibiramensis (FK0025) Dyckia rariflora (FK0039) Dyckia aff. brevifolia (FK0010) Dyckia hebdingii (FK0013) Dyckia cf. velascana (FK0106) Dyckia remotiflora var. indet. (FK0011) Dyckia hebdingii (FK0038) Dyckia tobatiensis (FK0018) Dyckia spec. (FK0049) Dyckia niederleinii (FK0110) Dyckia ferox (FK0020) Dyckia ferox (FK0056) Dyckia vestita (FK0109) Dyckia brachyphylla (FK0045) Dyckia beateae (FK0044) Dyckia goehringii (FK0031) Dyckia saxatilis (FK0036) Dyckia brevifolia (FK0067) Dyckia estevesii (FK0001) Dyckia cinerea (FK0047) Dyckia dawsonii (FK0043) Dyckia macedoi (FK0099) Dyckia macedoi (FK0100) Dyckia macedoi (FK0101) Dyckia macedoi (FK0102) Dyckia maracasensis (FK0087) Dyckia ursina (FK0089) Dyckia milagrensis (FK0096) Dyckia granmogulensis (FK0007) Puya herzogii (FK0121) Puya ferruginea (FK0082) Pitcairnia feliciana (FK0119) Pitcairnia fuertesii (FK0120) Pitcairnia pipenbringii (FK0085) Pitcairnia pungens (FK0084) Pitcairnia heterophylla (FK0083) Fosterella weddelliana (FK0077) Fosterella spectabilis (FK0118) Fosterella albicans (FK0117) Deuterocohnia cf. haumanii (FK0075) Deuterocohnia brevifolia (FK0074) Deuterocohnia meziana (FK0073) Deuterocohnia brevispicata (FK0071) Encholirium horridum (FK0070) Encholirium spec. (FK0014) Dyckia beateae (FK0091) Dyckia maritima (FK0092) Dyckia encholirioides (FK0095) Dyckia choristaminea (FK0021) Dyckia cf. leptostachya (FK0115) Dyckia spec. (FK0116) Dyckia ferox (FK0027) Dyckia microcalyx (FK0054) Dyckia microcalyx var. indet. (FK0009) Dyckia microcalyx (FK0111) Dyckia cf. microcalyx (FK0051) Dyckia tomentella (FK0114) Dyckia vestita (FK0032) Dyckia marnier-lapostollei var. est. (FK0030) Encholirium erectiflorum (FK0123) Encholirium maximum (FK0124) Encholirium spec. (FK0125) Dyckia pernambucana (FK0098) Dyckia pernambucana (FK0097) Encholirium spec. (FK0079) Encholirium spec. (FK0080) Encholirium spec. (FK0078) Encholirium magalhaesii (FK0122) Deuterocohnia glandulosa (FK0072) Fosterella villosula (FK0076) Dyckia aff. reitzii (FK0050) Gen. nov. spec. nov. (FK0257) Dyckia elisabethae (FK0219) Dyckia jonesiana (FK0217) Dyckia densiflora (FK0213) Dyckia platyphylla (FK0209) Dyckia espiritosantensis (FK0207) Dyckia tuberosa (aff.) (FK0206) Dyckia mirandiana (FK0202) Dyckia pulquinenses (FK0199) Dyckia rojasii (FK0195) Dyckia aurea (FK0194) Dyckia lunaris (FK0193) Dyckia secunda (FK0192) Dyckia nana (FK0191) Dyckia paraensis (FK0190) Dyckia machrisiana (FK0189) Dyckia pectinata (FK0188) Dyckia delicata (FK0184) Dyckia grandidentata (FK0183) Dyckia dissitiflora (FK0141) Dyckia distachya (FK0126) 20 400 80 10060 120 Ergebnisse 77 Abbildung 20: RAxML-Analyse auf Basis sechs plastidärer Loci Gezeigt ist der beste gefundene Baum aus einer Maximum Likelihood-Analyse durchgeführt mit RAxML 7.2.6 unter Verwendung des GTR-CAT-Substitutionsmodells. Über den Ästen finden sich Bootstrap-Werte aus 1.000 rapid bootstrap-Replikaten, Werte unterhalb von 50% sind nur in Ausnahmefällen gezeigt und stehen dann in Klammern. Die Astlängen repräsentieren die erwartete Menge an substituierten Alignmentpositionen entsprechend der Maßstabsleiste am unteren Bildrand. Fosterella penduliflora (FK0081) Dyckia remotiflora (FK0055) Dyckia niederleinii (FK0103) Dyckia velascana (FK0104) Dyckia velascana (FK0105) Dyckia floribunda (FK0107) Dyckia velascana (FK0006) Dyckia remotiflora (FK0068) Dyckia hebdingii (FK0112) Dyckia maritima (FK0113) Dyckia monticola (FK0088) Dyckia fosteriana (FK0094) Dyckia ferruginea (FK0090) Dyckia marnier-lapostollei var. mar. (FK0029) Dyckia estevesii (FK0005) Dyckia lindevaldae (FK0019) Dyckia braunii (FK0042) Dyckia estevesii var. braunii (FK0004) Dyckia leptostachya (FK0053) Dyckia estevesii (FK0033) Dyckia pumila (FK0093) Dyckia choristaminea (FK0040) Dyckia remotiflora var. indet. (FK0015) Dyckia ursina (FK0012) Dyckia spec. (FK0023) Dyckia spec. (FK0024) Dyckia aff. pumila (FK0017) Dyckia aff. leptostachya (FK0035) Dyckia aff. leptostachya (FK0016) Dyckia floribunda (FK0108) Dyckia floribunda (FK0052) Dyckia spec. (FK0086) Dyckia aff. ibiramensis (FK0025) Dyckia rariflora (FK0039) Dyckia aff. brevifolia (FK0010) Dyckia hebdingii (FK0013) Dyckia cf. velascana (FK0106) Dyckia remotiflora var. indet. (FK0011) Dyckia hebdingii (FK0038) Dyckia tobatiensis (FK0018) Dyckia spec. (FK0049) Dyckia niederleinii (FK0110) Dyckia ferox (FK0020) Dyckia ferox (FK0056) Dyckia vestita (FK0109) Dyckia brachyphylla (FK0045) Dyckia beateae (FK0044) Dyckia goehringii (FK0031) Dyckia saxatilis (FK0036) Dyckia brevifolia (FK0067) Dyckia estevesii (FK0001) Dyckia cinerea (FK0047) Dyckia dawsonii (FK0043) Dyckia macedoi (FK0099) Dyckia macedoi (FK0100) Dyckia macedoi (FK0101) Dyckia macedoi (FK0102) Dyckia maracasensis (FK0087) Dyckia ursina (FK0089) Dyckia milagrensis (FK0096) Dyckia granmogulensis (FK0007) Puya herzogii (FK0121) Puya ferruginea (FK0082) Pitcairnia feliciana (FK0119) Pitcairnia fuertesii (FK0120) Pitcairnia pipenbringii (FK0085) Pitcairnia pungens (FK0084) Pitcairnia heterophylla (FK0083) Fosterella weddelliana (FK0077) Fosterella spectabilis (FK0118) Fosterella albicans (FK0117) Deuterocohnia cf. haumanii (FK0075) Deuterocohnia brevifolia (FK0074) Deuterocohnia meziana (FK0073) Deuterocohnia brevispicata (FK0071) Encholirium horridum (FK0070) Encholirium spec. (FK0014) Dyckia beateae (FK0091) Dyckia maritima (FK0092) Dyckia encholirioides (FK0095) Dyckia choristaminea (FK0021) Dyckia cf. leptostachya (FK0115) Dyckia spec. (FK0116) Dyckia ferox (FK0027) Dyckia microcalyx (FK0054) Dyckia microcalyx var. indet. (FK0009) Dyckia microcalyx (FK0111) Dyckia cf. microcalyx (FK0051) Dyckia tomentella (FK0114) Dyckia vestita (FK0032) Dyckia marnier-lapostollei var. est. (FK0030) Encholirium erectiflorum (FK0123) Encholirium maximum (FK0124) Encholirium spec. (FK0125) Dyckia pernambucana (FK0098) Dyckia pernambucana (FK0097) Encholirium spec. (FK0079) Encholirium spec. (FK0080) Encholirium spec. (FK0078) Encholirium magalhaesii (FK0122) Deuterocohnia glandulosa (FK0072) Fosterella villosula (FK0076) Dyckia aff. reitzii (FK0050) Gen. nov. spec. nov. (FK0257) Dyckia elisabethae (FK0219) Dyckia jonesiana (FK0217) Dyckia densiflora (FK0213) Dyckia platyphylla (FK0209) Dyckia espiritosantensis (FK0207) Dyckia tuberosa (aff.) (FK0206) Dyckia mirandiana (FK0202) Dyckia pulquinenses (FK0199) Dyckia rojasii (FK0195) Dyckia aurea (FK0194) Dyckia lunaris (FK0193) Dyckia secunda (FK0192) Dyckia nana (FK0191) Dyckia paraensis (FK0190) Dyckia machrisiana (FK0189) Dyckia pectinata (FK0188) Dyckia delicata (FK0184) Dyckia grandidentata (FK0183) Dyckia dissitiflora (FK0141) Dyckia distachya (FK0126) 1,0% 83 87 100 63 65 61 9251 96 94 78 86 81 54 100 50 93 94 91 80 65 69 95 (46) 92 87 87 55 82 (37) 100 96 56 80 52 95 67 94 (48) 66 93 58 77 80 100 100 100 100 100 92 100 100 100 75 100 87 100 67 Ergebnisse 78 Abbildung 21: Bayes'sche Analyse auf Basis sechs plastidärer Loci Gezeigt ist der 50% Majority Rule-Konsensusbaum aus einer Analyse mit MrBayes 3.2.1. Die Analyse wurde in zwei unabhängigen Läufen mit je 2.500.000 Generationen durchgeführt. Von den resultierenden Bäumen wurden 10% als Burn-in verworfen. Über den Ästen finden sich die Posterioriwahrscheinlichkeiten. Die Astlängen repräsentieren die erwartete Menge an substituierten Alignmentpositionen entsprechend der Maßstabsleiste am unteren Bildrand. Fosterella penduliflora (FK0081) Dyckia remotiflora (FK0055) Dyckia niederleinii (FK0103) Dyckia velascana (FK0104) Dyckia velascana (FK0105) Dyckia floribunda (FK0107) Dyckia velascana (FK0006) Dyckia remotiflora (FK0068) Dyckia hebdingii (FK0112) Dyckia maritima (FK0113) Dyckia monticola (FK0088) Dyckia fosteriana (FK0094) Dyckia ferruginea (FK0090) Dyckia marnier-lapostollei var. mar. (FK0029) Dyckia estevesii (FK0005) Dyckia lindevaldae (FK0019) Dyckia braunii (FK0042) Dyckia estevesii var. braunii (FK0004) Dyckia leptostachya (FK0053) Dyckia estevesii (FK0033) Dyckia pumila (FK0093) Dyckia choristaminea (FK0040) Dyckia remotiflora var. indet. (FK0015) Dyckia ursina (FK0012) Dyckia spec. (FK0023) Dyckia spec. (FK0024) Dyckia aff. pumila (FK0017) Dyckia aff. leptostachya (FK0035) Dyckia aff. leptostachya (FK0016) Dyckia floribunda (FK0108) Dyckia floribunda (FK0052) Dyckia spec. (FK0086) Dyckia aff. ibiramensis (FK0025) Dyckia rariflora (FK0039) Dyckia aff. brevifolia (FK0010) Dyckia hebdingii (FK0013) Dyckia cf. velascana (FK0106) Dyckia remotiflora var. indet. (FK0011) Dyckia hebdingii (FK0038) Dyckia tobatiensis (FK0018) Dyckia spec. (FK0049) Dyckia niederleinii (FK0110) Dyckia ferox (FK0020) Dyckia ferox (FK0056) Dyckia vestita (FK0109) Dyckia brachyphylla (FK0045) Dyckia beateae (FK0044) Dyckia goehringii (FK0031) Dyckia saxatilis (FK0036) Dyckia brevifolia (FK0067) Dyckia estevesii (FK0001) Dyckia cinerea (FK0047) Dyckia dawsonii (FK0043) Dyckia macedoi (FK0099) Dyckia macedoi (FK0100) Dyckia macedoi (FK0101) Dyckia macedoi (FK0102) Dyckia maracasensis (FK0087) Dyckia ursina (FK0089) Dyckia milagrensis (FK0096) Dyckia granmogulensis (FK0007) Puya herzogii (FK0121) Puya ferruginea (FK0082) Pitcairnia feliciana (FK0119) Pitcairnia fuertesii (FK0120) Pitcairnia pipenbringii (FK0085) Pitcairnia pungens (FK0084) Pitcairnia heterophylla (FK0083) Fosterella weddelliana (FK0077) Fosterella spectabilis (FK0118) Fosterella albicans (FK0117) Deuterocohnia cf. haumanii (FK0075) Deuterocohnia brevifolia (FK0074) Deuterocohnia meziana (FK0073) Deuterocohnia brevispicata (FK0071) Encholirium horridum (FK0070) Encholirium spec. (FK0014) Dyckia beateae (FK0091) Dyckia maritima (FK0092) Dyckia encholirioides (FK0095) Dyckia choristaminea (FK0021) Dyckia cf. leptostachya (FK0115) Dyckia spec. (FK0116) Dyckia ferox (FK0027) Dyckia microcalyx (FK0054) Dyckia microcalyx var. indet. (FK0009) Dyckia microcalyx (FK0111) Dyckia cf. microcalyx (FK0051) Dyckia tomentella (FK0114) Dyckia vestita (FK0032) Dyckia marnier-lapostollei var. est. (FK0030) Encholirium erectiflorum (FK0123) Encholirium maximum (FK0124) Encholirium spec. (FK0125) Dyckia pernambucana (FK0098) Dyckia pernambucana (FK0097) Encholirium spec. (FK0079) Encholirium spec. (FK0080) Encholirium spec. (FK0078) Encholirium magalhaesii (FK0122) Deuterocohnia glandulosa (FK0072) Fosterella villosula (FK0076) Dyckia aff. reitzii (FK0050) Gen. nov. spec. nov. (FK0257) Dyckia elisabethae (FK0219) Dyckia jonesiana (FK0217) Dyckia densiflora (FK0213) Dyckia platyphylla (FK0209) Dyckia espiritosantensis (FK0207) Dyckia tuberosa (aff.) (FK0206) Dyckia mirandiana (FK0202) Dyckia pulquinenses (FK0199) Dyckia rojasii (FK0195) Dyckia aurea (FK0194) Dyckia lunaris (FK0193) Dyckia secunda (FK0192) Dyckia nana (FK0191) Dyckia paraensis (FK0190) Dyckia machrisiana (FK0189) Dyckia pectinata (FK0188) Dyckia delicata (FK0184) Dyckia grandidentata (FK0183) Dyckia dissitiflora (FK0141) Dyckia distachya (FK0126) 1,0% 1 1 1 1 1 1 0,78 1 1 1 1 0,77 0,99 1 1 0,86 1 0,97 0,97 0,73 1 1 0,99 0,99 1 1 1 0,95 1 0,97 1 0,99 0,97 0,99 0,97 1 0,8 0,99 1 1 1 1 0,98 0,88 0,99 0,99 0,99 1 0,96 0,98 1 0,99 1 1 0,97 10,99 0,76 0,96 1 1 0,98 Ergebnisse zwei davon enthalten nur jeweils eine Akzession, nämlich E. horridum beziehungsweise E. spec. (FK0125). Der Zusammenhang zwischen diesen Linien und damit der Grad an Paraphylie von Encholirium variiert zwischen den Analysen. Eine basale Abspaltung von E. spec. (FK0125) wurde in allen Berechnungen mit Ausnahme der NJ-Analyse gefunden. In der Bayes'schen und der RAxML-Analyse sind alle vier erwähnten Linien durch gestützte Knoten gegeneinander getrennt. Das frühe Abzweigen von D. mirandiana und D. espiritosantensis von der als Core-Dyckia bezeichneten Gruppierung findet sich nur in der BEAST-Analyse und der Bayes'schen Analyse (jeweils gestützt mit PP=0,98). Der beste in der RAxML-Analyse gefundene Baum weist diese Verzweigung ebenfalls auf, die zugehörige Bootstrap-Analyse liefert aber keine Unterstützung (MLBS=37%). Die fünf großen, geographisch determinierten Kladen innerhalb von Core-Dyckia wurden in allen Analysen gefunden. Die RAxML-Analyse ergab allerdings keine statistische Unterstützung für die südbrasilianische (MLBS=46%) und die argentinische Klade (MLBS=48%). In der Parsimonieanalyse wiesen die südbrasilianische und die paraguayische Klade jeweils Bootstrap-Werte unter 50% auf. In den Ergebnissen der NJ- Analyse ist die argentinische Klade nicht durch Bootstrap-Werte gestützt und die Zugehörigkeit von D. pulquinensis zur paraguayischen Klade wurde nicht ermittelt, hier steht diese Akzession einzeln innerhalb der Polytomie von Core-Dyckia. Homoplasie-Indices aus der Parsimonieanalyse Die Zahl der aus der Parsimonieanalyse resultierenden kürzesten Bäume musste künstlich auf 100.000 begrenzt werden, da die Analyse sonst zu keinem Ende kam. Zur Abschätzung der im Datensatz enthaltenen Homoplasie wurden in der Parsimonieanalyse diverse Indices für die erhaltenen Bäume berechnet. Für die gefundenen kürzesten Bäume mit einer Schrittlänge von jeweils 807 wurden der Konsistenzindex (ensemble consistency index) mit CI=0,813 und der Homoplasieindex entsprechend mit 0,187 ermittelt. Für den Retentionsindex wurde ein Wert von RI=0,919 und für den rescaled consistency index ein Wert von RC=0,747 errechnet. Knotenalter und Substitutionsraten aus der BEAST-Analyse Für die Erzeugung der in Abbildung 18 und Abbildung 22 gezeigten Chronogramme im Rahmen der BEAST-Analyse wurde das von Givnish et al. (2011) geschätzten Alter der Kronengruppe der Pitcairnioideae (11,8 Millionen Jahre) als Kalibrationspunkt verwendet. Danach entstanden beide Gruppen von Pitcairnia nahezu gleichzeitig mit der Aufspaltung der Unterfamilie vor eben 11,8 Millionen Jahren. Die Stammgruppe von Fosterella ist etwa 10,5 Millionen Jahre alt, die Kronengruppe 6,2 Millionen Jahre. Die Klade aus den 79 Ergebnisse 80 Abbildung 22: In der BEAST-Analyse ermittelte Substitutionsraten Die hier gezeigte datierte Phylogenie wurde mit dem Programmpaket BEAST 1.6.1 erstellt. Als Kalibrationspunkt für die Datierung diente das von Givnish et al. (2011) ermittelte Alter der Unterfamilie Pitcairnioideae (11,8 Millionen Jahre). Die Skala am unteren Bildrand beschreibt das Alter in Millionen Jahren. Über den Ästen finden sich die vom Programm für den entsprechenden Ast ermittelten Substitutionsraten. Die Substitutionsraten der Endäste sind jeweils rechts neben diesen notiert. Unterschiedliche Bereiche von Substitutionsraten werden durch Farben kodiert, wie in der Legende links oben angezeigt. Alle Raten sind als Substitutionen pro Position im Alignment und pro Milliarden Jahren (substitutions per site per billion years, SSB) angegeben. 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 Millionen Jahre Fosterella penduliflora (FK0081) Dyckia remotiflora (FK0055) Dyckia niederleinii (FK0103) Dyckia velascana (FK0104) Dyckia velascana (FK0105) Dyckia floribunda (FK0107) Dyckia velascana (FK0006) Dyckia remotiflora (FK0068) Dyckia hebdingii (FK0112) Dyckia maritima (FK0113) Dyckia monticola (FK0088) Dyckia fosteriana (FK0094) Dyckia ferruginea (FK0090) Dyckia marnier-lapostollei var. mar. (FK0029) Dyckia estevesii (FK0005) Dyckia lindevaldae (FK0019) Dyckia braunii (FK0042) Dyckia estevesii var. braunii (FK0004) Dyckia leptostachya (FK0053) Dyckia estevesii (FK0033) Dyckia pumila (FK0093) Dyckia choristaminea (FK0040) Dyckia remotiflora var. indet. (FK0015) Dyckia ursina (FK0012) Dyckia spec. (FK0023) Dyckia spec. (FK0024) Dyckia aff. pumila (FK0017) Dyckia aff. leptostachya (FK0035) Dyckia aff. leptostachya (FK0016) Dyckia floribunda (FK0108) Dyckia floribunda (FK0052) Dyckia spec. (FK0086) Dyckia aff. ibiramensis (FK0025) Dyckia rariflora (FK0039) Dyckia aff. brevifolia (FK0010) Dyckia hebdingii (FK0013) Dyckia cf. velascana (FK0106) Dyckia remotiflora var. indet. (FK0011) Dyckia hebdingii (FK0038) Dyckia tobatiensis (FK0018) Dyckia spec. (FK0049) Dyckia niederleinii (FK0110) Dyckia ferox (FK0020) Dyckia ferox (FK0056) Dyckia vestita (FK0109) Dyckia brachyphylla (FK0045) Dyckia beateae (FK0044) Dyckia goehringii (FK0031) Dyckia saxatilis (FK0036) Dyckia brevifolia (FK0067) Dyckia estevesii (FK0001) Dyckia cinerea (FK0047) Dyckia dawsonii (FK0043) Dyckia macedoi (FK0099) Dyckia macedoi (FK0100) Dyckia macedoi (FK0101) Dyckia macedoi (FK0102) Dyckia maracasensis (FK0087) Dyckia ursina (FK0089) Dyckia milagrensis (FK0096) Dyckia granmogulensis (FK0007) Puya herzogii (FK0121) Puya ferruginea (FK0082) Pitcairnia feliciana (FK0119) Pitcairnia fuertesii (FK0120) Pitcairnia pipenbringii (FK0085) Pitcairnia pungens (FK0084) Pitcairnia heterophylla (FK0083) Fosterella weddelliana (FK0077) Fosterella spectabilis (FK0118) Fosterella albicans (FK0117) Deuterocohnia cf. haumanii (FK0075) Deuterocohnia brevifolia (FK0074) Deuterocohnia meziana (FK0073) Deuterocohnia brevispicata (FK0071) Encholirium horridum (FK0070) Encholirium spec. (FK0014) Dyckia beateae (FK0091) Dyckia maritima (FK0092) Dyckia encholirioides (FK0095) Dyckia choristaminea (FK0021) Dyckia cf. leptostachya (FK0115) Dyckia spec. (FK0116) Dyckia ferox (FK0027) Dyckia microcalyx (FK0054) Dyckia microcalyx var. indet. (FK0009) Dyckia microcalyx (FK0111) Dyckia cf. microcalyx (FK0051) Dyckia tomentella (FK0114) Dyckia vestita (FK0032) Dyckia marnier-lapostollei var. est. (FK0030) Encholirium erectiflorum (FK0123) Encholirium maximum (FK0124) Encholirium spec. (FK0125) Dyckia pernambucana (FK0098) Dyckia pernambucana (FK0097) Encholirium spec. (FK0079) Encholirium spec. (FK0080) Encholirium spec. (FK0078) Encholirium magalhaesii (FK0122) Deuterocohnia glandulosa (FK0072) Fosterella villosula (FK0076) Dyckia aff. reitzii (FK0050) Gen. nov. spec. nov. (FK0257) Dyckia elisabethae (FK0219) Dyckia jonesiana (FK0217) Dyckia densiflora (FK0213) Dyckia platyphylla (FK0209) Dyckia espiritosantensis (FK0207) Dyckia tuberosa (aff.) (FK0206) Dyckia mirandiana (FK0202) Dyckia pulquinenses (FK0199) Dyckia rojasii (FK0195) Dyckia aurea (FK0194) Dyckia lunaris (FK0193) Dyckia secunda (FK0192) Dyckia nana (FK0191) Dyckia paraensis (FK0190) Dyckia machrisiana (FK0189) Dyckia pectinata (FK0188) Dyckia delicata (FK0184) Dyckia grandidentata (FK0183) Dyckia dissitiflora (FK0141) Dyckia distachya (FK0126) 0,63 0,77 1,09 0,89 0,70 0,61 0,62 0,62 0,65 0,78 0,81 0,45 0,60 0,61 0,59 1,18 0,93 0,70 1,36 0,46 0,63 0,51 0,82 0,67 0,68 0,64 0,64 0,99 0,68 0,84 0,62 0,71 0,63 0,74 0,45 0,62 0,61 0,56 0,43 0,65 0,37 0,91 0,74 0,69 0,36 1,03 1,63 2,03 1,02 1,32 0,87 1,05 0,66 0,85 0,57 1,01 0,73 1,23 1,07 0,59 2,73 2,32 4,70 0,80 1,10 0,76 0,49 0,49 1,03 0,53 0,52 0,74 0,53 0,26 0,53 0,53 0,52 0,52 0,43 0,69 0,71 0,53 0,54 0,99 0,46 0,46 0,75 0,43 0,42 0,43 0,56 0,56 0,75 0,44 0,42 0,55 0,42 0,57 0,43 0,43 0,56 0,56 0,55 0,55 0,56 0,52 0,54 0,53 0,52 0,53 0,52 0,45 0,77 0,44 0,44 0,44 0,45 0,60 0,44 0,79 0,54 0,55 0,47 0,67 0,46 0,47 0,47 1,09 0,47 0,47 0,47 0,47 0,71 0,57 0,58 0,43 0,73 0,42 0,82 0,47 0,69 0,49 0,49 0,50 0,50 0,49 0,49 0,45 0,44 0,69 1,22 0,39 0,49 0,97 0,51 0,39 0,38 0,69 0,40 0,72 0,55 0,31 1,99 1,22 1,16 0,57 1,17 0,55 0,71 0,55 0,70 0,61 0,71 0,81 0,56 0,55 1,01 1,12 2,39 2,80 2,13 2,00 1,69 1,15 1,77 2,04 0,94 0,82 2,01 0,00-0,59 0,60-0,89 0,90-1,19 1,20-1,49 1,50-1,99 2,00-4,70 Ergebnisse xerophytischen Gattungen Deuterocohnia, Encholirium und Dyckia entstand also ebenfalls vor 10,5 Millionen Jahren, ihre hier untersuchten Vertreter begannen vor 8,7 Millionen Jahren sich zu diversifizieren. Zu diesem Zeitpunkt zweigte zunächst die eine der beiden paraphyletischen Linien von Deuterocohnia ab, die andere Linie trennte sich erst vor 6,2 Millionen Jahren vom gemeinsamen Vorfahren von Encholirium und Dyckia. Die Diversifizierung der untersuchten Vertreter der paraphyletischen Gattung Encholirium begann vor 5,6 Millionen Jahren. Vor 4,6 Millionen Jahren entstand dann die Linie, die zur heutigen Gattung Dyckia führte. Die Kronengruppe der untersuchten Vertreter von Dyckia entstand vor 4,0 Millionen Jahren mit der Abspaltung einer einzelnen Linie. Die Vertreter von Core-Dyckia begannen vor 2,9 Millionen Jahren, sich zu diversifizieren. Dabei entstanden innerhalb kürzester Zeit 11 unterschiedliche Linien, die in den Abbildungen 18-22 eine gering aufgelöste Polytomie bilden. Über den gesamten Baum hinweg variieren die in der BEAST-Analyse abgeschätzten Substitutionsraten der einzelnen Äste zwischen 0,26 und 4,70 Substitutionen pro Alignment- Position und pro Milliarden Jahren (substitutions per site per billion years, SSB, Abbildung 22). Die durchschnittlichen Raten innerhalb der Kronengruppen der monophyletischen Gattungen betragen 1,42 SSB für Puya, 2,00 SSB für Fosterella und 0,57 SSB für Core- Dyckia. Innerhalb von Dyckia sind die Raten in den verschiedenen Kladen recht ähnlich, mit 0,58 SSB in der zentralbrasilianischen Klade, 0,57 SSB in der paraguayischen Klade, 0,59 SSB in der südbrasilianischen Klade und 0,58 SSB in der argentinischen Klade. Für die paraphyletischen und unaufgelösten Gattungen fanden sich unter Berücksichtigung aller internen Äste Werte von 0,88 SSB für Encholirium, 1,27 SSB für Pitcairnia und 1,02 SSB für Deuterocohnia. Wird der lange Ast, der die beiden paraphyletischen Linien von Deuterocohnia verbindet, von der Berechnung ausgenommen, ergibt sich ein deutlich geringerer Wert von 0,79 SSB. Phylogenetisches Netzwerk Zusätzlich zu den phylogenetischen Bäumen wurde mittels statistischer Parsimonie (TCS, 2.3.8) ein phylogenetisches Netzwerk erstellt (Abbildung 23). Das darin gefundene Verknüpfungsmuster und die einzelnen Gruppen bestätigen die Ergebnissen der anderen phylogenetischen Analysen. Eine Version des Netzwerkes mit DNA-Nummern findet sich im Anhang 9. Mit Deuterocohnia als Außengruppe zweigen zunächst vier unabhängige Linien von Encholirium ab. Innerhalb der somit deutlich paraphyletischen Gattung Encholirium finden sich 94 verschiedene Haplotypen, von denen lediglich 10 durch untersuchte Pflanzen besetzt 81 Ergebnisse sind. Einer dieser Haplotypen wurde in einer Pflanze gefunden die möglicherweise als neue Gattung beschrieben wird. Die zwei am weitesten voneinander entfernten besetzten Haplotypen von Encholirium (E. horridum und E. spec. FK0125) trennen 34 Sequenzunterschiede. Zwischen den am nächsten liegenden, aber jeweils hypothetischen Haplotypen von Encholirium und Dyckia liegen fünf evolutive Schritte. Die am nächsten verwandten Haplotypen der beiden Gattungen, die durch untersuchte Pflanzen besetzt sind (Dyckia beateae und Encholirium maximum) trennen 18 evolutive Schritte. Der hypothetische Haplotyp, über den die als erstes abzweigende Linie von Dyckia und die übrigen Dyckia-Haplotypen mit Encholirium verknüpft sind, ist durch neun Sequenzunterschiede vom zentralen Haplotypen von Core-Dyckia entfernt. Der hypothetische Haplotyp, an welchem die aus D. mirandiana und D. espiritosantensis gebildete Linie abzweigt, ist durch drei evolutive Schritte vom zentralen Haplotypen von Core-Dyckia entfernt. 82 Abbildung 23: Haplotyp-Netzwerk auf Basis sechs plastidärer Loci Das hier gezeigte Haplotyp-Netzwerk wurde mittels des Computerprogramms TCS 1.21 (Clement et al. 2000) erstellt, welches auf statistischer Parsimonie beruht. Das Ergebnis wurde mit den Ergebnissen aus der Bayes'schen Analyse und Parsimonieanalyse abgeglichen. In die Berechnungen einbezogen wurden nur Akzessionen von Dyckia und Encholirium, sowie Deuterocohnia brevispicata und Deuterocohnia meziana zur Bewurzelung. Die Farbcodierung der Haplotypen entspricht den geographischen Herkünften der sie tragenden Pflanzen wie auf der kleinen Karte rechts oben angezeigt. Die Abkürzungen für die einzelnen Arten können aus Tabelle 1 entnommen werden. enc est pum mar rei jon mar sp.ibi cho heb bre rar heb rem sp. vel, rem nie, vel, vel, flo vel flo flo urs sp. Eho bea Esp Emx EspEer par lep pum leplep grn mic mic fer ves fer sp. ves ves tom mic mic dit tob, nie lep, sp. roj pul Dbr Dmr Esp Esp Esp Ema Nov esp mir bra lin bra est estcinlun daw bre urs per per maa sec mil gra mac mac mac mac man, man bea, mon fos, den goefer sax brc dis nan del aur pla tub pec rem, rem cho, heb mah, eli Ergebnisse Innerhalb von Core-Dyckia enthält das Netzwerk 99 Haplotypen, von denen 60 besetzt sind. Hier zweigen neun unterschiedliche Linien sternförmig von einem einzelnen zentralen Haplotypen ab, der durch jeweils eine Akzession von D. reitzii und D. jonesiana besetzt ist. Die neun Linien finden sich allesamt auch in den anderen Analysen wieder (vgl. Abbildung 18). Neben den bereits erwähnten fünf großen, geographisch assoziierten Kladen (zentralbrasilianische, paraguayische, südbrasilianische, argentinische und eine weitere Klade) gehen vier weitere, jeweils nur einen oder zwei Haplotypen enthaltende Linien von dem zentralen Haplotypen aus. Ein deutlich sternförmiges Verzweigungsmuster findet sich auch innerhalb der zentralbrasilianischen Klade. Hier leiten sich 11 Linien aus einem zentralen Haplotyp ab, welcher durch fünf Akzessionen aus vier Arten besetzt ist. Eine mögliche basale Stellung von D. brachyphylla und möglicherweise zusätzlich D. tuberosa innerhalb der zentralbrasilianischen Klade ist aufgrund einer nicht aufgelösten Masche des Netzwerkes nicht zu klären. In der paraguayischen Klade findet sich ebenfalls ein zentraler Haplotyp, welcher durch fünf Akzessionen aus mindestens vier Arten besetzt ist. Von diesem aus entspringen fünf abgeleitete Linien. D. pulquinensis zweigt innerhalb dieser Klade in basaler Stellung ab. Innerhalb der südbrasilianischen Klade existiert ein durch sechs Akzessionen aus fünf Arten besetzter Haplotyp, von welchem sich vier Linien ableiten. Eine zentrale Stellung dieser Sequenzvariante wird aber nicht deutlich. Die argentinische Klade weist keinen deutlichen zentralen Haplotypen auf. Die unterschiedlichen plastidären Haplotypen zeigen nur eine geringe Korrespondenz zu den sie beherbergenden Arten. Von allen untersuchten Arten von Dyckia waren 19 durch jeweils mehr als eine Akzession repräsentiert. Aber nur in zwei Fällen, bei D. marnier-lapostollei und D. pernambucana, tragen jeweils alle untersuchten Akzessionen denselben Haplotypen. Für D. marnier-lapostollei findet sich dieser Haplotyp aber auch in anderen Arten wieder. Die vier Akzessionen von D. macedoi tragen Plastiden, deren Haplotypen ein Monophylum bilden und exklusiv in dieser Art vorkommen. Die Arten D. choristaminea, D. ferox, D. floribunda, D. hebdingii, D. microcalyx, D. velascana und D. vestita tragen jeweils verschiedene Haplotypen, die zwar jeweils nahe miteinander verwandt sind, aber keine Monophyla bilden. Einige Arten von Dyckia sind im Netzwerk durch weit voneinander entfernte Haplotypen repräsentiert. So taucht D. beateae sowohl außerhalb von Core-Dyckia als auch in der zentralbrasilianischen Klade auf. Plastiden aus jeweils zwei unterschiedlichen der acht Linien von Core-Dyckia tragen die Arten D. brevifolia, D. estevesii, D. leptostachya, D. maritima, D. niederleinii, D. pumila, D. remotiflora und D. ursina. Andererseits gibt es auch viele Haplotypen, die in mehr als einer Art vorkommen, darunter beispielsweise die zentralen Haplotypen der zentralbrasilianischen und der paraguayischen Klade. 83 Ergebnisse Geographisches Muster Die mit Hilfe der Analysen plastidärer DNA innerhalb von Dyckia identifizierten Kladen spiegeln überwiegend die geographischen Herkünfte der untersuchten Pflanzen wider (Abbildung 23, vgl. auch Abbildung 37). Die Akzession von D. beateae, die in der vorliegenden Studie die ursprünglichste Linie der Gattung bildet, stammt aus der Gegend um die Stadt Coxim im brasilianischen Bundesstaat Mato Grosso do Sul. Die beiden anderen ursprünglichen Vertreter von Dyckia stammen aus Alto Paraíso im Bundesstaat Goiás (D. mirandiana) und São Roque do Canaã im Bundesstaat Espírito Santo (D. espiritosantensis). Innerhalb von Core-Dyckia ist der im Netzwerk zentrale Haplotyp durch eine Akzession von D. reitzii aus der Nähe von Cambará und eine von D. jonesiana aus der Region Caçapava do Sul besetzt. Beide Fundorte liegen im südlichsten brasilianischen Bundesstaat Rio Grande do Sul. Auch zwei der vier kleineren, vom zentralen Haplotypen abgehenden Linien wurden in südbrasilianischen Pflanzen gefunden. Eine diese Linien wird von einer D. maritima aus dem nahe gelegenen Torres gebildet. Eine weitere Linie führt zu einer Akzession von D. encholirioides, diese Art ist endemisch für die Küstenregionen der südlichsten Bundesstaaten Brasiliens. Die dritte kleinere Linie beherbergt mit D. estevesii und D. pumila zwei Pflanzen aus dem zentralbrasilianischen Bundesstaat Goiás. Eine vierte Linie wird von D. paraensis aus dem Bundesstaat Pará im äußersten Norden Brasiliens gebildet, was deutlich außerhalb des Hauptverbreitungsgebietes von Dyckia liegt. In der kleinsten der fünf großen Kladen innerhalb von Core-Dyckia finden sich Pflanzen aus den Bundesstaaten Mato Grosso und Mato Grosso do Sul in Zentralbrasilien, dem Departamento Cordillera in Paraguay und der Provinz Córdoba in Argentinien. Innerhalb dieser Gruppe ist keine klare geographische Verbindung ersichtlich. Die zentralbrasilianische Klade enthält eine Pflanze aus der Gegend um Campo Allegre im Bundesstaat Santa Catarina in Südbrasilien. Diese trägt den innerhalb der Klade zentralen Haplotypen. Zwei der vom zentralen Haplotypen ausgehenden Linien enthalten je eine weitere Pflanze aus dem südlichen Brasilien, nämlich D. delicata aus Rio Grande do Sul und D. tuberosa aus São Gerônimo da Serra in Paraná. Alle anderen Haplotypen der zentralbrasilianischen Klade wurden ausschließlich im Pflanzen aus brasilianischen Bundesstaaten nördlich von Paraná gefunden. Innerhalb der argentinischen Klade findet sich in abgeleiteter Positionen eine Akzession der für den zentralbrasilianischen Bundesstaat Minas Gerais endemischen Art D. ursina. Für eine Akzession von D. remotiflora innerhalb der Klade ist der Fundort unbekannt, die Art 84 Ergebnisse kommt weit verbreitet in Südbrasilien, Uruguay und Argentinien vor. Alle anderen Haplotypen der argentinischen Klade sind durch Pflanzen aus Argentinien besetzt. Die paraguayische Klade enthält überwiegend Pflanzen aus Paraguay. Außerdem wurden Haplotypen dieser Klade in je einer Pflanze aus dem Bundesstaat Bahia in Zentralbrasilien, aus Pará im Norden Brasiliens, der Provinz Córdoba in Argentinien und dem Departamento Santa Cruz in Bolivien gefunden. Für drei weitere Akzessionen fehlen Fundortangaben, darunter ist allerdings eine für Paraguay endemische D. tomentella. Die ursprünglichste Linie innerhalb der paraguayischen Klade bildet eine D. pulquinensis aus Bolivien. Die südbrasilianische Klade enthält mehrheitlich Haplotypen, die in Pflanzen aus dem Süden Brasiliens gefunden wurden. Ein zusammenhängendes Sub-Netzwerk bilden zehn Vertreter von D. choristaminea, D. hebdingii, D. maritima, D. remotiflora, D. elisabethae und D. machrisiana. Bis auf die ausschließlich in Goiás vorkommende D. machrisiana sind alle zehn Pflanzen endemisch für den äußersten Süden Brasiliens. Lediglich für D. remotiflora gibt es auch Fundorte weiter nördlich und in Uruguay. Weiterhin finden sich in der südbrasilianischen Klade drei Pflanzen aus Minas Gerais in Zentralbrasilien, eine Pflanze aus Uruguay und eine weitere ohne Fundortangaben. 3.3 Sequenzierung nukleärer Loci 3.3.1 Pilotexperimente Phytochrom C ( phy C) Die Amplifikation von Teilbereichen des ersten Exons des Phytochrom C-Gens aus Arten von Dyckia erwies sich zunächst als schwierig (vgl. 2.2.3.2 und 2.2.3.3). So erbrachte die PCR mit Primern nach Samuel et al. (2005) mit dem verwendeten Programm keine Amplifikate. Eine direkte PCR und anschließende Sequenzierung mit Primern von Michael Barfuss (Universität Wien, persönliche Kommunikation, Tabelle 5) lieferte weder für das Gesamtfragment, noch für die beiden Einzelteile zufriedenstellende Ergebnisse. So zeigten sich bei Annealingtemperaturen von 50 °C viele zusätzliche Banden. Eine Erhöhung der Annealingtemperatur auf 55 °C beziehungsweise 59 °C schlug sich jeweils negativ auf die Qualität der Sequenzen von Teil a aus, die dann nicht mehr eindeutig zu lesen waren. Teil b konnte teilweise ausgewertet werden, die Qualität der Sequenzen war jedoch nur mäßig gut. Die verschachtelte (nested) PCR ergab mit der Kombination der Programme phyc_nest_1_20100608 und phyc_nest_2_20100614 (Tabelle 6) zunächst gut auswertbare Sequenzen für beide Teilstücke. Bei der Wiederholung der ersten Amplifikationsstufe für weitere Proben zeigten sich jedoch auf den Agarosegelen in allen Fällen starke 85 Ergebnisse Zusatzbanden mit Längen von etwa 80 bp und deren Vielfachem, in einigen Proben bis über 800 bp. Obwohl die zweite Amplifikationsstufe jeweils deutliche distinkte Einzelfragmente der erwarteten Größe lieferte, war die Sequenzierung nicht möglich. Weder der Austausch aller Reagenzien, noch die Nutzung anderer Thermocycler oder die Verwendung von Positivkontrollen, also Proben, die vorher bereits einmal funktioniert hatten, lösten dieses Problem. Auch weitere Modifikationen der Programme und die Verwendung von Programmen, welche bereits zuvor funktioniert hatten, waren erfolglos. Bei der schließlich eingesetzten band-stab-Methode (vgl. 2.2.3.3, Bjourson & Cooper 1992) zeigten sich ebenfalls besagte Zusatzbanden in der ersten Amplifikation. Nach der gelelektrophoretischen Auftrennung und dem Ausstanzen des Zielfragmentes wurden in der zweiten Amplifikationsstufe aber keine zusätzlichen Banden mehr beobachtet. Die Sequenzierung dieser Fragmente war in allen Fällen erfolgreich und lieferte für beide Einzelteile jeweils in beide Richtungen bis zum Ende lesbare Sequenzen. Für einige Proben konnte das Gesamtfragment nicht gewonnen werden, vermutlich aufgrund mangelnder DNA- Qualität. Die DNA dieser Proben (Proben FK0090-94, 100-102, 141, 184, 188-195, 199, 200, 202, 207, 209, 213, 217, 219, 236, 241 und 257) war von Kooperationspartnern mit einer einfachen Isolationsmethode extrahiert worden (vgl. 2.2.1). Für diese Proben wurden im ersten Amplifikationsschritt die beiden Einzelfragmente a und b unter Verwendung von Primern ohne M13-Anhang getrennt amplifiziert, so dass am Ende auch hier die vollständige Sequenz erhalten wurde. Eine detaillierte Übersicht über alle verwendeten Kombinationen von Primern und Programmen und die damit erhaltenen deren Ergebnisse finden sich in Anhang 1. Malatsynthase ( MS ), ITS und ETS Alle Versuche, den Locus MS mit einem der beiden verwendeten Programme (MS_Krapp und MS_Lewis in Tabelle 6) und den verwendeten Primern (Lewis & Doyle 2001) in einer der untersuchten Pflanzen in Pilotexperimenten zu amplifizieren, schlugen fehl. Der Locus wurde daher nicht weiter verwendet. Ebenso wenig gelang es, die Regionen ITS1 und ITS2 von Dyckia-Arten mit den von Jabaily & Sytsma (2010) konstruierten Primerpaaren zu amplifizieren. Für die Amplifikation der ETS-Region wurden Primerpaare verwendet, die von Sass & Specht (2010) für die Unterfamilie Bromelioideae entworfen und dort erfolgreich eingesetzt wurden. Für Vertreter der Pitcairnioideae und Puyoideae konnten mit diesen Primer jedoch keine PCR-Produkte erzeugt werden. Der Einsatz einer leistungsfähigeren DNA-Polymerase in Verbindung mit für die Gattung Tillandsia spezifischen Primern (Chew et al. 2010) lieferte 86 Ergebnisse zwar je ein Amplifikat für die untersuchten Proben von Pitcairnia, nicht jedoch für Dyckia. Die Agarose-Gelelektrophorese zeigte schwache distinkte Einzelbanden auf einer Höhe entsprechend etwa 1.500 bp. Eine Sequenzierung wurde wegen der großen Länge des Fragmentes und der geringen Menge an Produkt nicht durchgeführt. Die Amplifikation der gesamten ETS-NTS-Region mit universellen Primern (Baldwin & Markos 1998) erbrachte für Dyckia keine Fragmente, für Pitcairnia feliciana eine schwache Bande auf Höhe von 1.300 bp und für P. fuertesii eine starke Bande auf Höhe von etwa 1.100 bp. Versuche diese PCR-Produkten zu sequenzieren schlugen fehl. 3.3.2 Phylogenie auf Basis von phyC Eigenschaften des Alignments und Heterozygotie Alle 124 für den gewählten Bereich von phyC erzeugten Sequenzen einschließlich der Außengruppen wiesen eine identische Länge von 1159 bp auf. Somit enthielt das Alignment keinerlei Lücken. Die Sequenzvariabilität betrug 16,3% für das gesamte Probenset und 5,7% innerhalb von Dyckia. Es waren insgesamt 114 parsimonie-informative Positionen enthalten, davon 34 innerhalb von Dyckia. Ein Ausschnitt des Alignments von Position 159 bis 249 ist in Abbildung 24 gezeigt. Als problematisch erwies sich der in vielen Proben hohe Anteil von heterozygoten Positionen, die sich in Form von nahezu gleichstarken Signalen in zwei Spuren äußerte (vgl. 2.3.2 und Abbildung 25). Von allen 124 gewonnenen Sequenzen für phyC zeigten 87 Abbildung 24: Ausschnitt des Alignments für den Locus phyC In dem hier gezeigten Ausschnitt des Alignments am Locus phyC sind die Positionen 175 und 230 bemerkenswert. Sie zeigen ein extremes Maß an Variabilität und Heterozygotie. Ergebnisse 35 Sequenzen keinerlei heterozygote Positionen, insgesamt 28 wiesen an exakt einer Alignmentposition einen heterozygoten Zustand auf. Insgesamt fünf Sequenzen zeigten 10 oder mehr heterozygote Positionen, darunter eine Dyckia leptostachya mit 21 und eine Fosterella villosula mit 18 Positionen. Von den insgesamt 189 variablen Positionen im Alignment wiederum zeigten 145 in mindestens einer Probe einen heterozygoten Zustand. Insgesamt 16 Positionen zeigten für fünf oder mehr Proben einen heterozygoten Zustand bis hin zu einem Extrem von 27 Sequenzen, welche an Position 521 des Alignments einen heterozygoten Merkmalszustand (A oder G) aufweisen (Abbildung 25). Substitutionsmodelle für die Likelihood- und die Bayes'sche Analyse Mit dem Programm MrModeltest 2.3 (Nylander 2004) wurde als optimales Substitutionsmodell für phyC das Modell GTR+I+G ermittelt, welches in der BEAST-Analyse und der Bayes'schen Analyse Verwendung fand. Topologie aus den durchgeführten Analysen und statistische Unterstützung Das Alignment mit 1.159 Positionen Länge wurde einer Reihe unterschiedlicher Algorithmen zur Rekonstruktion phylogenetischer Bäume unterworfen. Dabei handelte es sich um Neighbour Joining-Analysen (NJ, 2.3.3), Parsimonieanalysen (MP, 2.3.4), Maximum Likelihood-Analysen (RAxML, 2.3.5) und Bayes'sche Analysen (2.3.6). Zum Teil ergaben 88 Abbildung 25: Beobachtete Heterozygotie am Locus phyC Das linke Diagramm zeigt, wie viele Sequenzen jeweils mit bestimmten Zahlen an heterozygoten Positionen gefunden wurden. Im rechten Diagramm ist gezeigt, wie viele Positionen des Alignments jeweils heterozygote Zustände in einer bestimmten Zahl an Sequenzen enthielten. Es wurden 1.014 Alignment-Positionen völlig ohne heterozygote Sequenzen gefunden. 90 Alignmentpositionen wiesen in jeweils einer Sequenz einen heterozygoten Zustand auf (in beiden Fällen sind die Balken verkürzt dargestellt). Zahl an Sequenzen mit heterozygotem Zustand 0 5 10 1913 27 Za hl P os iti on en 10 20 Za hl a n Se qu en ze n Heterozygote Positionen pro Sequenz 0 5 10 2118 10 20 30 13 Za hl P os iti on en Za hl P os iti on en Za hl a n Se qu en ze n Za hl a n Se qu en ze n Ergebnisse sich dabei Unterschiede bezüglich der Topologie der Phylogramme und der statistischen Unterstützung der einzelnen Äste. Im Folgenden diskutiert werden die Parsimonieanalyse (Abbildung 26 und Anhang 12), die Likelihood-Analyse (Abbildung 27) und die Bayes'sche Analyse (Abbildung 28). Die Angaben zu Posterioriwahrscheinlichkeiten (PP) aus der Bayes'schen Analyse und zu den Bootstrap-Werte in Prozent aus der Parsimonieanalyse (MPBS) und der RAxML-Analyse (MLBS) beziehen sich jeweils auf die unmittelbar zuvor getroffene Aussage (jeweils notiert als PP/MPBS/MLBS). Eine Bewurzelung der Phylogenie mit Pitcairnia als Außengruppe einerseits und Mittelpunktsbewurzelung andererseits zeigten ein identisches Bild. Die Bewurzelung mit Pitcairnia wurde wegen der Stellung von Puya innerhalb der Pitcairnioideae in anderen Analysen durchgeführt (vgl. 2.3.1). Mit Pitcairnia als Außengruppe bilden die übrigen vier Gattungen der Unterfamilie Pitcairnioideae gemeinsam mit Puya ein Monophylum (1/100/100). In diesem stehen zwei Kladen in Schwestergruppenverhältnis zueinander. Die eine davon ist mäßig gestützt (0,76/62/65) und enthält die monophyletische (1/99/100) Gattung Fosterella und die ebenfalls monophyletische (1/97/98) Gattung Deuterocohnia. Die andere Klade ist nur schwach gestützt (0,65/58/-) und enthält die monophyletische Gattung Puya (0,99/74/81) als Schwestergruppe zu einem Monophylum aus Dyckia und Encholirium (1/93/99). Die Gattung Encholirium ist in allen Analysen paraphyletisch. Die Arten E. erectiflorum, E. horridum, E. maximum sowie eine weitere unbestimmte Akzession stehen in der RAxML- Analyse und der Bayes'schen Analyse jeweils außerhalb einer Klade, die die möglicherweise eine neue Gattung repräsentierenden Akzession FK0257 (vgl. 2.1), alle verbleibenden Encholirium-Proben und alle Dyckia-Akzessionen vereinigt (PP=0,59, MLBS=63%). Innerhalb der letztgenannten Klade befindet sich die in den Abbildungen provisorisch als Gen. nov. spec. nov. bezeichnete FK0257 in Schwestergruppenposition zu einer Klade aus allen übrigen Pflanzen (PP=0,83, MLBS=90%). In der Parsimonieanalyse steht FK0257 mit den vier basal abzweigenden Encholirium-Akzessionen und der Klade aller verbleibender Proben von Encholirium und Dyckia (MPBS=50%) in einer unaufgelösten Polytomie. Innerhalb der zuletzt genannten Klade nimmt E. magalhaesii in der Bayes'schen Analyse und der Parsimonieanalyse jeweils eine vom monophyletischen Rest (PP=0,90, MPBS=52%) getrennte ursprüngliche Stellung ein. In der RAxML-Analyse steht diese Probe hingegen in abgeleiteter Position gemeinsam mit anderen Proben von Dyckia und Encholirium. Somit ist Dyckia in dieser Analyse paraphyletisch, jedoch ohne Unterstützung aus der Bootstrap- Analyse. In den übrigen Analysen kann über eine Monophylie oder Paraphylie von Dyckia keine Aussage getroffen werden, da die Gattung nicht deutlich von Encholirium getrennt ist. 89 Ergebnisse 90 Abbildung 26: Einzelner Baum aus einer Parsimonieanalyse auf Basis von phyC Gezeigt ist einer von 100.000 kürzesten Bäumen mit einer Schrittlänge von 285 aus einer Parsimonieanalyse durchgeführt mit PAUP* 4.0b. Die Astlängen entsprechen der Zahl evolutiver Schritte entsprechend der Maßstabsleiste am unteren Ende der Abbildung. Fosterella penduliflora (FK0081) Dyckia remotiflora (FK0055) Dyckia niederleinii (FK0103) Dyckia velascana (FK0104) Dyckia velascana (FK0105) Dyckia floribunda (FK0107) Dyckia velascana (FK0006) Dyckia remotiflora (FK0068) Dyckia hebdingii (FK0112) Dyckia maritima (FK0113) Dyckia monticola (FK0088) Dyckia fosteriana (FK0094) Dyckia ferruginea (FK0090) Dyckia marnier-lapostollei var. mar. (FK0029) Dyckia estevesii (FK0005) Dyckia lindevaldae (FK0019) Dyckia braunii (FK0042) Dyckia estevesii var. braunii (FK0004) Dyckia leptostachya (FK0053) Dyckia estevesii (FK0033) Dyckia pumila (FK0093) Dyckia choristaminea (FK0040) Dyckia remotiflora var. indet. (FK0015) Dyckia ursina (FK0012) Dyckia spec. (FK0023) Dyckia spec. (FK0024) Dyckia aff. pumila (FK0017) Dyckia aff. leptostachya (FK0035) Dyckia aff. leptostachya (FK0016) Dyckia floribunda (FK0108) Dyckia floribunda (FK0052) Dyckia spec. (FK0086) Dyckia aff. ibiramensis (FK0025) Dyckia rariflora (FK0039) Dyckia aff. brevifolia (FK0010) Dyckia hebdingii (FK0013) Dyckia cf. velascana (FK0106) Dyckia remotiflora var. indet. (FK0011) Dyckia hebdingii (FK0038) Dyckia tobatiensis (FK0018) Dyckia spec. (FK0049) Dyckia niederleinii (FK0110) Dyckia ferox (FK0020) Dyckia ferox (FK0056) Dyckia vestita (FK0109) Dyckia brachyphylla (FK0045) Dyckia beateae (FK0044) Dyckia goehringii (FK0031) Dyckia saxatilis (FK0036) Dyckia brevifolia (FK0067) Dyckia estevesii (FK0001) Dyckia cinerea (FK0047) Dyckia dawsonii (FK0043) Dyckia macedoi (FK0099) Dyckia macedoi (FK0100) Dyckia macedoi (FK0101) Dyckia macedoi (FK0102) Dyckia maracasensis (FK0087) Dyckia ursina (FK0089) Dyckia milagrensis (FK0096) Dyckia granmogulensis (FK0007) Puya herzogii (FK0121) Puya ferruginea (FK0082) Pitcairnia feliciana (FK0119) Pitcairnia fuertesii (FK0120) Pitcairnia pipenbringii (FK0085) Pitcairnia pungens (FK0084) Pitcairnia heterophylla (FK0083) Fosterella weddelliana (FK0077) Fosterella spectabilis (FK0118) Fosterella albicans (FK0117) Deuterocohnia cf. haumanii (FK0075) Deuterocohnia brevifolia (FK0074) Deuterocohnia meziana (FK0073) Deuterocohnia brevispicata (FK0071) Encholirium horridum (FK0070) Encholirium spec. (FK0014) Dyckia beateae (FK0091) Dyckia maritima (FK0092) Dyckia encholirioides (FK0095) Dyckia choristaminea (FK0021) Dyckia cf. leptostachya (FK0115) Dyckia spec. (FK0116) Dyckia ferox (FK0027) Dyckia microcalyx (FK0054) Dyckia microcalyx var. indet. (FK0009) Dyckia microcalyx (FK0111) Dyckia cf. microcalyx (FK0051) Dyckia tomentella (FK0114) Dyckia vestita (FK0032) Dyckia marnier-lapostollei var. est. (FK0030) Encholirium erectiflorum (FK0123) Encholirium maximum (FK0124) Encholirium spec. (FK0125) Dyckia pernambucana (FK0098) Dyckia pernambucana (FK0097) Encholirium spec. (FK0079) Encholirium spec. (FK0080) Encholirium spec. (FK0078) Encholirium magalhaesii (FK0122) Deuterocohnia glandulosa (FK0072) Fosterella villosula (FK0076) Dyckia aff. reitzii (FK0050) Gen. nov. spec. nov. (FK0257) Dyckia elisabethae (FK0219) Dyckia jonesiana (FK0217) Dyckia densiflora (FK0213) Dyckia platyphylla (FK0209) Dyckia espiritosantensis (FK0207) Dyckia tuberosa (aff.) (FK0206) Dyckia mirandiana (FK0202) Dyckia pulquinenses (FK0199) Dyckia rojasii (FK0195) Dyckia aurea (FK0194) Dyckia lunaris (FK0193) Dyckia secunda (FK0192) Dyckia nana (FK0191) Dyckia paraensis (FK0190) Dyckia machrisiana (FK0189) Dyckia pectinata (FK0188) Dyckia delicata (FK0184) Dyckia grandidentata (FK0183) Dyckia dissitiflora (FK0141) Dyckia distachya (FK0126) 10 200 40 5030 Ergebnisse 91 Abbildung 27: RAxML-Analyse auf Basis von phyC Gezeigt ist der beste gefundene Baum aus einer Maximum Likelihood-Analyse durchgeführt mit RAxML 7.2.6 unter Verwendung des GTR-CAT-Substitutionsmodells. Über den Ästen finden sich Bootstrap-Werte aus 1.000 rapid bootstrap-Replikaten, Werte unter 50% sind nicht gezeigt. Die Astlängen repräsentieren die erwartete Menge an substituierten Alignmentpositionen entsprechend der Maßstabsleiste am unteren Bildrand. 2,0% Fosterella penduliflora (FK0081) Dyckia remotiflora (FK0055) Dyckia niederleinii (FK0103) Dyckia velascana (FK0104) Dyckia velascana (FK0105) Dyckia floribunda (FK0107) Dyckia velascana (FK0006) Dyckia remotiflora (FK0068) Dyckia hebdingii (FK0112) Dyckia maritima (FK0113) Dyckia monticola (FK0088) Dyckia fosteriana (FK0094) Dyckia ferruginea (FK0090) Dyckia marnier-lapostollei var. mar. (FK0029) Dyckia estevesii (FK0005) Dyckia lindevaldae (FK0019) Dyckia braunii (FK0042) Dyckia estevesii var. braunii (FK0004) Dyckia leptostachya (FK0053) Dyckia estevesii (FK0033) Dyckia pumila (FK0093) Dyckia choristaminea (FK0040) Dyckia remotiflora var. indet. (FK0015) Dyckia ursina (FK0012) Dyckia spec. (FK0023) Dyckia spec. (FK0024) Dyckia aff. pumila (FK0017) Dyckia aff. leptostachya (FK0035) Dyckia aff. leptostachya (FK0016) Dyckia floribunda (FK0108) Dyckia floribunda (FK0052) Dyckia spec. (FK0086) Dyckia aff. ibiramensis (FK0025) Dyckia rariflora (FK0039) Dyckia aff. brevifolia (FK0010) Dyckia hebdingii (FK0013) Dyckia cf. velascana (FK0106) Dyckia remotiflora var. indet. (FK0011) Dyckia hebdingii (FK0038) Dyckia tobatiensis (FK0018) Dyckia spec. (FK0049) Dyckia niederleinii (FK0110) Dyckia ferox (FK0020) Dyckia ferox (FK0056) Dyckia vestita (FK0109) Dyckia brachyphylla (FK0045) Dyckia beateae (FK0044) Dyckia goehringii (FK0031) Dyckia saxatilis (FK0036) Dyckia brevifolia (FK0067) Dyckia estevesii (FK0001) Dyckia cinerea (FK0047) Dyckia dawsonii (FK0043) Dyckia macedoi (FK0099) Dyckia macedoi (FK0100) Dyckia macedoi (FK0101) Dyckia macedoi (FK0102) Dyckia maracasensis (FK0087) Dyckia ursina (FK0089) Dyckia milagrensis (FK0096) Dyckia granmogulensis (FK0007) Puya herzogii (FK0121) Puya ferruginea (FK0082) Pitcairnia feliciana (FK0119) Pitcairnia fuertesii (FK0120) Pitcairnia pipenbringii (FK0085) Pitcairnia pungens (FK0084) Pitcairnia heterophylla (FK0083) Fosterella weddelliana (FK0077) Fosterella spectabilis (FK0118) Fosterella albicans (FK0117) Deuterocohnia cf. haumanii (FK0075) Deuterocohnia brevifolia (FK0074) Deuterocohnia meziana (FK0073) Deuterocohnia brevispicata (FK0071) Encholirium horridum (FK0070) Encholirium spec. (FK0014) Dyckia beateae (FK0091) Dyckia maritima (FK0092) Dyckia encholirioides (FK0095) Dyckia choristaminea (FK0021) Dyckia cf. leptostachya (FK0115) Dyckia spec. (FK0116) Dyckia ferox (FK0027) Dyckia microcalyx (FK0054) Dyckia microcalyx var. indet. (FK0009) Dyckia microcalyx (FK0111) Dyckia cf. microcalyx (FK0051) Dyckia tomentella (FK0114) Dyckia vestita (FK0032) Dyckia marnier-lapostollei var. est. (FK0030) Encholirium erectiflorum (FK0123) Encholirium maximum (FK0124) Encholirium spec. (FK0125) Dyckia pernambucana (FK0098) Dyckia pernambucana (FK0097) Encholirium spec. (FK0079) Encholirium spec. (FK0080) Encholirium spec. (FK0078) Encholirium magalhaesii (FK0122) Deuterocohnia glandulosa (FK0072) Fosterella villosula (FK0076) Dyckia aff. reitzii (FK0050) Gen. nov. spec. nov. (FK0257) Dyckia elisabethae (FK0219) Dyckia jonesiana (FK0217) Dyckia densiflora (FK0213) Dyckia platyphylla (FK0209) Dyckia espiritosantensis (FK0207) Dyckia tuberosa (aff.) (FK0206) Dyckia mirandiana (FK0202) Dyckia pulquinenses (FK0199) Dyckia rojasii (FK0195) Dyckia aurea (FK0194) Dyckia lunaris (FK0193) Dyckia secunda (FK0192) Dyckia nana (FK0191) Dyckia paraensis (FK0190) Dyckia machrisiana (FK0189) Dyckia pectinata (FK0188) Dyckia delicata (FK0184) Dyckia grandidentata (FK0183) Dyckia dissitiflora (FK0141) Dyckia distachya (FK0126) 100 100 100 94 64 62 69 66 66 100 65 98 81 99 63 90 60 59 75 65 95 62 75 74 64 Ergebnisse 92 Abbildung 28: Bayes'sche Analyse auf Basis von phyC Gezeigt ist der 50% Majority Rule-Konsensusbaum aus einer Analyse mit MrBayes 3.2.1. Die Analyse wurde in zwei unabhängigen Läufen mit je 2.500.000 Generationen durchgeführt. Von den resultierenden Bäumen wurden 10% als Burn-in verworfen. Über den Ästen finden sich die Posterioriwahrscheinlichkeiten aus dieser Analyse, unter den Ästen Bootstrap-Werte aus je 1.000 Wiederholungen einer Parsimonieanalyse und einer RAxML- Analyse des gleichen Datensatzes (Parsimonieanalyse/RAxML-Analyse). Die Astlängen repräsentieren die erwartete Menge an substituierten Alignmentpositionen entsprechend der Maßstabsleiste am unteren Bildrand. 0,99 51/59 0,68 -/- 0,68 57/75 0,66 -/- 0,52 -/- 0,82 -/74 0,79 -/- 0,67 -/- 1 64/60 0,66 -/- 0,99 -/75 0,95 63/640,54 -/- 0,64 -/- 0,98 -/62 1 94/95 0,67 -/-0,61 63/65 0,57 -/- 1 99/100 0,90 -/- 0,56 74/98 0,70 70/- 0,59 -/63 0,83 -/90 0,98 62/64 0,99 74/81 0,65 58/- 1 93/99 0,94 83/941 99/1001 100/100 1 100/100 0,81 -/- 0,76 62/65 0,88 -/62 1 97/98 0,73 58/660,91 66/66 0,87 -/69 Fosterella penduliflora (FK0081) Dyckia remotiflora (FK0055) Dyckia niederleinii (FK0103) Dyckia velascana (FK0104) Dyckia velascana (FK0105) Dyckia floribunda (FK0107) Dyckia velascana (FK0006) Dyckia remotiflora (FK0068) Dyckia hebdingii (FK0112) Dyckia maritima (FK0113) Dyckia monticola (FK0088) Dyckia fosteriana (FK0094) Dyckia ferruginea (FK0090) Dyckia marnier-lapostollei var. mar. (FK0029) Dyckia estevesii (FK0005) Dyckia lindevaldae (FK0019) Dyckia braunii (FK0042) Dyckia estevesii var. braunii (FK0004) Dyckia leptostachya (FK0053) Dyckia estevesii (FK0033) Dyckia pumila (FK0093) Dyckia choristaminea (FK0040) Dyckia remotiflora var. indet. (FK0015) Dyckia ursina (FK0012) Dyckia spec. (FK0023) Dyckia spec. (FK0024) Dyckia aff. pumila (FK0017) Dyckia aff. leptostachya (FK0035) Dyckia aff. leptostachya (FK0016) Dyckia floribunda (FK0108) Dyckia floribunda (FK0052) Dyckia spec. (FK0086) Dyckia aff. ibiramensis (FK0025) Dyckia rariflora (FK0039) Dyckia aff. brevifolia (FK0010) Dyckia hebdingii (FK0013) Dyckia cf. velascana (FK0106) Dyckia remotiflora var. indet. (FK0011) Dyckia hebdingii (FK0038) Dyckia tobatiensis (FK0018) Dyckia spec. (FK0049) Dyckia niederleinii (FK0110) Dyckia ferox (FK0020) Dyckia ferox (FK0056) Dyckia vestita (FK0109) Dyckia brachyphylla (FK0045) Dyckia beateae (FK0044) Dyckia goehringii (FK0031) Dyckia saxatilis (FK0036) Dyckia brevifolia (FK0067) Dyckia estevesii (FK0001) Dyckia cinerea (FK0047) Dyckia dawsonii (FK0043) Dyckia macedoi (FK0099) Dyckia macedoi (FK0100) Dyckia macedoi (FK0101) Dyckia macedoi (FK0102) Dyckia maracasensis (FK0087) Dyckia ursina (FK0089) Dyckia milagrensis (FK0096) Dyckia granmogulensis (FK0007) Puya herzogii (FK0121) Puya ferruginea (FK0082) Pitcairnia feliciana (FK0119) Pitcairnia fuertesii (FK0120) Pitcairnia pipenbringii (FK0085) Pitcairnia pungens (FK0084) Pitcairnia heterophylla (FK0083) Fosterella weddelliana (FK0077) Fosterella spectabilis (FK0118) Fosterella albicans (FK0117) Deuterocohnia cf. haumanii (FK0075) Deuterocohnia brevifolia (FK0074) Deuterocohnia meziana (FK0073) Deuterocohnia brevispicata (FK0071) Encholirium horridum (FK0070) Encholirium spec. (FK0014) Dyckia beateae (FK0091) Dyckia maritima (FK0092) Dyckia encholirioides (FK0095) Dyckia choristaminea (FK0021) Dyckia cf. leptostachya (FK0115) Dyckia spec. (FK0116) Dyckia ferox (FK0027) Dyckia microcalyx (FK0054) Dyckia microcalyx var. indet. (FK0009) Dyckia microcalyx (FK0111) Dyckia cf. microcalyx (FK0051) Dyckia tomentella (FK0114) Dyckia vestita (FK0032) Dyckia marnier-lapostollei var. est. (FK0030) Encholirium erectiflorum (FK0123) Encholirium maximum (FK0124) Encholirium spec. (FK0125) Dyckia pernambucana (FK0098) Dyckia pernambucana (FK0097) Encholirium spec. (FK0079) Encholirium spec. (FK0080) Encholirium spec. (FK0078) Encholirium magalhaesii (FK0122) Deuterocohnia glandulosa (FK0072) Fosterella villosula (FK0076) Dyckia aff. reitzii (FK0050) Gen. nov. spec. nov. (FK0257) Dyckia elisabethae (FK0219) Dyckia jonesiana (FK0217) Dyckia densiflora (FK0213) Dyckia platyphylla (FK0209) Dyckia espiritosantensis (FK0207) Dyckia tuberosa (aff.) (FK0206) Dyckia mirandiana (FK0202) Dyckia pulquinenses (FK0199) Dyckia rojasii (FK0195) Dyckia aurea (FK0194) Dyckia lunaris (FK0193) Dyckia secunda (FK0192) Dyckia nana (FK0191) Dyckia paraensis (FK0190) Dyckia machrisiana (FK0189) Dyckia pectinata (FK0188) Dyckia delicata (FK0184) Dyckia grandidentata (FK0183) Dyckia dissitiflora (FK0141) Dyckia distachya (FK0126) 1,0% Ergebnisse Innerhalb von Dyckia finden sich in allen Bäumen diverse Gruppierungen, jedoch gibt es zwischen den einzelnen Analysen teils gravierende Unterschiede bezüglich Auflösung und statistischer Unterstützung dieser Gruppen. Strenge Widersprüche zwischen den mit den verschiedenen Methoden erzeugten Bäumen gibt es aber nur wenige. Die geringste Auflösung zeigt der Strict-Konsensusbaum der Parsimonieanalyse (Anhang 12). Hier wurden innerhalb von Dyckia lediglich acht Verzweigungen gefunden, von denen wiederum nur vier Äste Bootstrap-Werte von über 50% aufweisen. Die Bayes'sche Analyse ergibt innerhalb von Dyckia 13 zumeist kleine Kladen, die mit allen übrigen Vertretern von Dyckia und einigen von Encholirium in einer großen unaufgelösten Polytomie stehen (Abbildung 28). Eine höhere Auflösung ergibt sich aus der RAxML-Analyse, jedoch liegen die Bootstrap-Werte der meisten Knoten unter 50% und keine der tieferen Verzweigungen ist durch die Bootstrap- Analyse gestützt (Abbildung 27). Topologische Unterschiede in der Neighbour Joining-Analyse Die ebenfalls durchgeführte NJ-Analyse zeigt Puya als paraphyletisch (62% Bootstrap-Wert) außerhalb einer Klade aus Fosterella, Deuterocohnia, Encholirium und Dyckia (81% BS, Anhang 10 und Anhang 11). Das erwähnte Schwestergruppenverhältnis von Fosterella und Deuterocohnia tritt hier nicht auf. Die Gattungen Encholirium und Dyckia bilden wie in den anderen Analysen ein gemeinsames Monophylum (93% BS). Encholirium besteht aus drei paraphyletischen Linien, die jeweils durch schwach gestützte Äste voneinander getrennt sind (52% und 55% BS). Die vier Encholirium-Proben, die in den übrigen Analysen zu Dyckia gruppieren, stehen auch hier in einer gemeinsamen Klade mit den Dyckia-Proben. Indices und Einzelbäume aus der Parsimonieanalyse Die Zahl der aus der Parsimonieanalyse resultierenden kürzesten Bäume musste künstlich auf 100.000 begrenzt werden, da die Analyse sonst zu keinem Ende kam. Für die gefundenen Bäume mit einer Schrittlänge von jeweils 299 wurden der Konsistenzindex (ensemble consistency index) mit CI=0,689 und der Homoplasieindex entsprechend mit HI=0,311 ermittelt. Für den Retentionsindex wurde ein Wert von RI=0,890 und für den rescaled consistency index ein Wert von RC=0,613 errechnet. Beobachtete Heterozygotie und Analysen mit reduziertem Datensatz Es wurden mehrere Versuche unternommen, der Problematik des hohen Anteils von heterozygoten Alignmentpositionen zu begegnen. Einerseits wurden Positionen gelöscht, die in vielen Proben Heterozygotie aufwiesen. Andererseits wurden ganze Sequenzen solcher 93 Ergebnisse Akzessionen entfernt, die einen besonders hohen Anteil an heterozygoten Positionen aufwiesen. Das Löschen von Alignmentpositionen, die in mehr als npos Sequenzen Unsicherheiten enthielten (mit npos = 0, 1, 2, 5, 10), brachte keine Verbesserung der Auflösung oder statistischen Unterstützung. Selbst für hohe Werte von npos, was einer geringen Zahl gelöschter Positionen entspricht, sank die Auflösung in der Bayes'schen Analyse dagegen ab (keine Abbildung). Die vollständige Entfernung aller derjenigen Sequenzen, die an mehr als einer bestimmten Zahl nseq heterozygote Positionen aufwiesen (mit nseq = 0, 1, 3, 5, 7, 10) wirkte sich dagegen positiv auf Auflösung und statistische Unterstützung aus. So resultierte die Entfernung der 26 Sequenzen mit dem größten Anteil heterozygoter Positionen (nseq = 5) in der Bayes'schen Analyse in zusätzliche Verzweigungen und generell erhöhten Posterioriwahrscheinlichkeiten (keine Abbildung). Eine zufällige Aufteilung überlagerter Sequenzen in Allele mit dem Programm SeqSplitter erwies sich als nicht praktikabel (vgl. 2.3.2). Aufgrund der teils stark heterozygoten Proben führte diese Methode bei unabhängigen Wiederholungen regelmäßig zu widersprüchlichen Topologien (keine Abbildungen). Als optimaler Weg zur Erhöhung der mit phyC erzielbaren Auflösung erwies sich eine kombinierte Methode. Zunächst wurde der Datensatz auf 107 Akzessionen von Dyckia und Encholirium beschränkt, was die Gesamtzahl an Alignmentpositionen mit heterozygoten Proben erheblich reduzierte. In diesem Datensatz waren 28 vollständig homozygote Sequenzen enthalten sowie 25 Sequenzen, die an exakt einer Position einen heterozygoten Zustand aufwiesen. Innerhalb des verbliebenen Datensatzes wurden alle heterozygoten Positionen, die auf autapomorphe Merkmalsänderungen zurückzuführen waren, als nicht heterozygot gewertet (zur Erläuterung vgl. 2.3.2). Dies erlaubte die Einbeziehung sieben weiterer Proben. Auf diese Weise konnten insgesamt 60 Proben von Dyckia und Encholirium identifiziert werden, deren Sequenzen sich eindeutig in zwei Allele aufteilen ließen. Inklusive aller sequenzierter Außengruppentaxa entsprachen 70 Proben diesen Kriterien. Die Bayes'sche Analyse des so modifizierten Datensatzes ausschließlich für Dyckia und Encholirium ist in Abbildung 29 gezeigt. Wie in der Analyse des kompletten Datensatzes ist Encholirium auch hier paraphyletisch. Drei Encholirium-Proben bilden die Schwestergruppe zu einer Klade aus der Akzession FK0257, den übrigen drei Encholirium-Proben und allen Akzessionen von Dyckia (Posterioriwahrscheinlichkeit von 0,73). Innerhalb dieser steht die als Gen. nov. spec. nov. bezeichnete FK0257 in Schwestergruppenposition zu einem 94 Ergebnisse 95 Abbildung 29: Bayes'sche Analyse auf Basis von phyC mit reduziertem Probenset Gezeigt ist der 50% Majority Rule-Konsensusbaum aus einer Analyse mit MrBayes 3.2.1. Verwendet wurde ein reduziertes Set von Dyckia- und Encholirium-Sequenzen mit geringem Grad an Heterozygotie. Die Analyse wurde in zwei unabhängigen Läufen mit je 2.500.000 Generationen durchgeführt. Von den resultierenden Bäumen wurden 10% als Burn-in verworfen. Über den Ästen finden sich die Posterioriwahrscheinlichkeiten. Die Astlängen repräsentieren die erwartete Menge an substituierten Alignmentpositionen entsprechend der Maßstabsleiste am unteren Bildrand. Dyckia remotiflora (FK0055) Dyckia niederleinii (FK0103) Dyckia velascana (FK0104) Dyckia floribunda (FK0107) Dyckia velascana (FK0006) Dyckia ferruginea (FK0090) Dyckia estevesii (FK0005) Dyckia lindevaldae (FK0019) Dyckia braunii (FK0042) Dyckia estevesii (FK0033) Dyckia pumila (FK0093) Dyckia ursina (FK0012) Dyckia spec. (FK0023) Dyckia spec. (FK0024) Dyckia floribunda (FK0108) Dyckia floribunda (FK0052) Dyckia spec. (FK0086) Dyckia aff. ibiramensis (FK0025) Dyckia cf. velascana (FK0106) Dyckia remotiflora var. indet. (FK0011) Dyckia ferox (FK0056) Dyckia vestita (FK0109) Dyckia brachyphylla (FK0045) Dyckia beateae (FK0044) Dyckia brevifolia (FK0067) Dyckia estevesii (FK0001) Dyckia cinerea (FK0047) Dyckia dawsonii (FK0043) Dyckia macedoi (FK0101) Dyckia macedoi (FK0102) Dyckia ursina (FK0089) Dyckia milagrensis (FK0096) Dyckia granmogulensis (FK0007) Encholirium horridum (FK0070) Encholirium spec. (FK0014) Dyckia beateae (FK0091) Dyckia microcalyx (FK0054) Dyckia microcalyx var. indet. (FK0009) Dyckia microcalyx (FK0111) Dyckia tomentella (FK0114) Dyckia vestita (FK0032) Encholirium erectiflorum (FK0123) Dyckia pernambucana (FK0098) Dyckia pernambucana (FK0097) Encholirium spec. (FK0079) Encholirium spec. (FK0080) Encholirium magalhaesii (FK0122) Gen. nov. spec. nov. (FK0257) Dyckia jonesiana (FK0217) Dyckia densiflora (FK0213) Dyckia espiritosantensis (FK0207) Dyckia mirandiana (FK0202) Dyckia aurea (FK0194) Dyckia secunda (FK0192) Dyckia nana (FK0191) Dyckia paraensis (FK0190) Dyckia pectinata (FK0188) Dyckia delicata (FK0184) Dyckia dissitiflora (FK0141) Dyckia distachya (FK0126) 0,61 0,80 0,73 0,64 0,690,72 0,80 0,91 0,94 0,68 1 0,97 0,97 0,67 0,77 0,99 0,50 0,66 0,98 0,50 0,63 1,0 0,93 0,73 0,91 1,0% Ergebnisse moderat gestützten Monophylum (Posterioriwahrscheinlichkeit von 0,93) aus allen verbleibenden Proben von Encholirium und Dyckia. Aus der Analyse des reduzierten Probensets ergeben sich tiefere Verzweigungen und eine tendenziell bessere statistische Unterstützung im Vergleich zur Analyse des vollständigen Datensatzes. Eine komplette Auflösung wird jedoch nicht erreicht. Drei große Kladen von Dyckia, dazu eine kleinere Klade und zwei einzelne Pflanzen sowie eine von Dyckia und Encholirium gemeinsam gebildete Klade stehen in einer großen Polytomie. Infolge der gemeinsamen Gruppierung von D. pectinata mit einigen Vertretern von Encholirium wird Dyckia paraphyletisch, allerdings mit schlechter Unterstützung (Posterioriwahrscheinlichkeit von 0,63). 3.4 Plastidäre Mikrosatelliten (cpSSRs) 3.4.1 Etablierung von cpSSR-Loci Bereits aus der optischen Kontrolle der Alignments aller unter 2.2.3.1 angegebenen plastidären Loci ergaben sich insgesamt neun Bereiche mit variablen SSRs ausreichender Länge (Tabelle 10, markierte Loci in Abbildung 14). Bei einem der so identifizierten cpSSRs handelte es sich um einen zusammengesetzten Mikrosatelliten am Locus atpB-rbcL (DSSR- L01). Hier war ein Poly-A-Bereich durch ein einzelnes Cytosin oder Guanin von einem Poly- T-Bereich abgegrenzt (vgl. auch 3.2.1). Tabelle 10: Gefundene cpSSR-Loci und entwickelte Primer aus Alignments Basis für das Design der Primer war jeweils die Konsensussequenz aus acht Dyckia-Akzessionen (Testset TS2). Die Angabe des Motivs bezieht sich auf das zugehörige Alignment. Die Lage und die zugehörigen Positionen der Loci beziehen sich auf das Plastom von Typha latifolia (Guisinger et al. 2010) und wurden durch Alignments mit diesem ermittelt. Locus Lage(T. latifolia) Positionen (T. latifolia) Motiv Primer-Name Primer-Sequenz (5'-3') Fragment- längen DSSR-L01 atpB-rbcL 58112-58188 (T)9-13S(A)8-13 DSSR-L01_fwdDSSR-L01_rev GTCAATTTTCAAGTTCAGCC TCACGATTTCATCTACTTGC 70-77 DSSR-L02 atpB-rbcL 58275-58354 (T)11-16 DSSR-L02_fwdDSSR-L02_rev TTATTTCGATCTTATTGGCC AGGGTATAATATAAAGACGG 75-80 DSSR-L03 atpF-Intron 13435-13503 (A)11-14 DSSR-L03_fwdDSSR-L03_rev ACAGAAAAGAGAGGGCAGGC TTTTTGTTATGGGTATTCCC 66-69 DSSR-L04 ndhA-Intron 126918-127011 (T)9-12 DSSR-L04_fwdDSSR-L04_rev AAAGGATGAGATCAATTCGG AAGATACATCGGAAAGTCCC 91-94 DSSR-L05 petB-Intron 80446-80554 (A)9-10...(A)11-21 DSSR-L05_fwdDSSR-L05_rev AGAGTAAATTTGCAGTACGC TATGTTGATCGTTACAGGCC 98-108 DSSR-L06 trnKUUU-rps16 4526-4602 (T)11-16 DSSR-L06_fwdDSSR-L06_rev ATTGATTGAATAAACCGGGG TAAATAAGAAATTGGAATGG 72-77 DSSR-L07 trnKUUU-rps16 4719-4803 (A)10-18 DSSR-L07_fwdDSSR-L07_rev AACTTCGAGTTAATTAAAGG AGATACTAGTTACCCTTCCC 78-86 DSSR-L08 ycf3-Intron 1 46913-46982 (T)9-10 DSSR-L08_fwdDSSR-L08_rev CCTATTACAGAGATGGTGCG TTTCTCGTAAGACTGAGGGC 69-70 DSSR-L09 trnEUUC-trnTGGU 33645-33767 (T)11-16 DSSR-L09_fwdDSSR-L09_rev AGATCCAAAAAGTCTTTCCC ATTCAGGACCAAAAAATGGG 118-123 96 Ergebnisse Weitere cpSSRs konnten durch 454-Sequenzierung einer Akzession der Art Dyckia marnier- lapostollei in Kooperation mit T. Wöhrmann (Universität Kassel) und Dr. B. Huettel (MPI für Züchtungsforschung Köln) ermittelt werden (vgl. 2.2.5.1). Die 454-Sequenzierung lieferte insgesamt 59.624 Einzelsequenzen. Der Abgleich des Plastoms von Typha latifolia gegen diesen Datensatz mittels des BLAST-Algorithmus (Altschul et al. 1997) identifizierte 3.826 (6,4%) der Sequenzen als plastidären Ursprungs. Die Assemblierung der plastidären Sequenzen lieferte 77 Contigs mit Längen zwischen 89 und 14.880 bp. Insgesamt 12 Fragmente blieben als Singletons übrig. Diese insgesamt 89 Sequenzen wiesen zusammen eine Länge von 139.839 bp auf. Bei einer Länge des Plastoms von T. latifolia von 161.572 bp entspricht dies einer Abdeckung von 86,55%, wenn die aus IR-Bereichen stammenden Sequenzen doppelt gezählt werden (vgl. 2.2.3.1). Die Suche nach Mononukleotid-Repeats in diesem Datensatz resultierte in einer Gesamtzahl von 181 SSRs mit sieben oder mehr Einheiten. Eine Übersicht über deren Längenverteilung findet sich in Tabelle 11. Von den 30 gefundenen SSRs mit 10 oder mehr Nukleotiden Länge waren drei schon aus den mit Sanger-Sequenzierung gewonnenen Alignments bekannt (Tabelle 10). Zwei weitere befanden sich am unmittelbaren Anfang oder Ende der Sequenzen, flankierende Regionen fehlten. Für die 25 verbliebenen cpSSRs wurden flankierende Primerpaare entwickelt (Tabelle 12, markierte Loci in Abbildung 14). Tabelle 11: Gefundene SSRs im 454-Datensatz Gezeigt ist, wie viele Mononukleotid-Repeats (A- oder T-Motive) bestimmter Länge innerhalb des mittels 454-Pyrosequenzierung gewonnenen Datensatzes für Dyckia marnier-lapostollei gefunden wurden. SSR-Länge 7 bp 8 bp 9 bp 10 bp 11 bp 12 bp 13 bp 14 bp 15 bp 16 bp ≥7 bp ≥ 10 bp Anzahl 88 37 26 12 7 6 1 1 1 2 181 30 Die Amplifikationstests lieferten für 30 der 34 untersuchten Loci distinkte Einzelbanden für alle drei untersuchten Arten (Abbildung 30 und Tabelle 13). Neun Loci zeigten keine Längenvariabilität zwischen den drei Arten, in acht Fällen waren die Mononukleotid-Repeats in D. dissitiflora und D. pernambucana teils deutlich kürzer als in D. marnier-lapostollei. In einem Fall (DSSR-L05) waren die SSR-Bereiche insgesamt deutlich kürzer als erwartet. Die zehn Loci, die für alle Proben Amplifikate zeigten und gleichzeitig Längenpolymorphismen aufwiesen, wurden zur genaueren Charakterisierung weiter verwendet. Weitere zwei Loci waren zwar innerhalb der drei Arten zwar nicht variabel, wiesen aber vielversprechende absolute SSR-Längen auf und wurden daher ebenfalls als aussichtsreiche Kandidaten angesehen und weiter verwendet. 97 Ergebnisse Tabelle 12: Gefundene cpSSR-Loci und entwickelte Primer aus 454-Daten Die Lage und die zugehörigen Positionen der Loci beziehen sich auf das Plastom von Typha latifolia (Guisinger et al. 2010) und wurden durch Alignments mit diesem ermittelt. Für weiter verwendete Loci wurde das Motiv durch Re-Sequenzierung verifiziert (*). Der Locus DSSR-N22 liegt in den IR-Regionen des Plastoms, weshalb zwei Positionen angegeben sind. Locus Lage(T. latifolia) Positionen (T. latifolia) Motiv Primer-Name Primer-Sequenz (5'-3') Fragment- länge DSSR-N01 rpoC1-Intron 24007-24108 (T)14* DSSR-N01_fwdDSSR-N01_rev GTTCCCAGTAAGAACCAACC CTCAATAATTTCACATTTCC 102 DSSR-N02 psaA-ycf3 45054-45150 (T)10N DSSR-N02_fwdDSSR-N02_rev TTTATTTGATTGATGGATCC GGTTGAAAATCACGAAGCGC 97 DSSR-N03 atpF-Intron 13648-13745 N(T)12C(T)8Y(T)2 DSSR-N03_fwdDSSR-N03_rev TATAATCAACNATGNTTTCC CCAATGCCGAATCGACGACC 98 DSSR-N04 clpP-Intron 1 76254-76340 (T)11* DSSR-N04_fwdDSSR-N04_rev GAAATCAATGTGTCGATTCC TTTNAATAGAAAGAAGACCC 87 DSSR-N05 clpP-Intron 1 76345-76429 (A)12* DSSR-N05_fwdDSSR-N05_rev TGAGATGAGTTTTGGCTCCC AACAATACATCAATGATAGG 85 DSSR-N06 psbB-psbT 79072-79134 (T)10 DSSR-N06_fwdDSSR-N06_rev TTGTTGTGGTATCTTTCGCC CAAGATTTCTCTGATACCCG 63 DSSR-N07 trnPUGG-psaJ 71717-71790 (A)13* DSSR-N07_fwdDSSR-N07_rev ATTATATACATCTGAAACCC CTTCCTCCTGAGCATTACGG 74 DSSR-N08 rpl20-rps12 74198-74261 (A)10N DSSR-N08_fwdDSSR-N08_rev GGAAATAAGAAATTAGAACG CCATAGAAACGATGGAACCC 64 DSSR-N09 clpP-Intron 2 75545-75624 TN(T)12 DSSR-N09_fwdDSSR-N09_rev CAAAGTTTCCTTTTGATACG GCTATGTCAGAAAGAGTACG 80 DSSR-N10 clpP-Intron 2 75828-75906 (T)10* DSSR-N10_fwdDSSR-N10_rev TNAATCAATATGGCGAAGGC ATTCCCTCACGCTTGGCGCC 79 DSSR-N11 ndhG-ndhI 125148-125247 (A)18* DSSR-N11_fwdDSSR-N11_rev ATAGATAAAATTATCGGGCC AAATTTAAACTACATATTCC 100 DSSR-N12 trnGGCC-Intron 10253-10317 N(T)10 DSSR-N12_fwdDSSR-N12_rev CAACTTAAATAGTTAAGGGG GAAATAAAGTTTTTGATCGG 65 DSSR-N13 atpF-Intron 13436-13507 (N)3(T)10 DSSR-N13_fwdDSSR-N13_rev TTTTTGTTATGGGTATTCCC ACAAACAGAAAAGAGAGGGC 72 DSSR-N14 ndhK/nhdC 53433-53515 N(T)10 DSSR-N14_fwdDSSR-N14_rev CAATGTAATCTTTTCCTTCC ATGCATGGCGAAAAGGAGCG 84 DSSR-N15 rpl16-Intron 87614-87677 (T)11* DSSR-N15_fwdDSSR-N15_rev CTTCCATTTATCCATATCCC AAAATAAATCTGATTATGGG 64 DSSR-N16 rpl16-rps3 87898-87987 (T)13* DSSR-N16_fwdDSSR-N16_rev TTATACCAAATGATCAATCG ACTCTTTCATTCTTTTTCCG 90 DSSR-N17 rps3-rpl22 88679-88847 (T)12 DSSR-N17_fwdDSSR-N17_rev GTGGATTTATTTTTTGTCCC AGACCCCGGGCTCGAGGACG 169 DSSR-N18 psbK-psbI 8104-8166 (A)15* DSSR-N18_fwdDSSR-N18_rev AAATAGGTAATCTATTCCCC GTAAGCATTACACAATCTCC 63 DSSR-N19 accD-psaI 62553-62645 (T)10N DSSR-N19_fwdDSSR-N19_rev CAGTTATTTTATTTGTAGCG AAAGTGTAACTTATATCACC 93 DSSR-N20 petA-psbJ 67780-67879 (W)2(T)11 DSSR-N20_fwdDSSR-N20_rev TCTTGTGTCGTCTTNGTATC AGGAGTTCCGATAGACCCGG 100 DSSR-N21 rps11-rpl36 84628-64688 (T)10 DSSR-N21_fwdDSSR-N21_rev ATCCATTTCATGAGGATCCC GACTTTCTAAAATAAGTACC 61 DSSR-N22 ycf2 92144-92221158484-158856 (T)10 DSSR-N22_fwd DSSR-N22_rev TATAGAAAGAAGGAAGCCCC ATATTTCATATTAACAATCG 78 DSSR-N23 trnMCAU-atpE 55856-55960 (T)15 DSSR-N23_fwdDSSR-N23_rev TTAGATACCATTGATTCCGG GACAGCATGTTTTGATTCCG 105 DSSR-N24 atpB 57242-57338 (T)11 DSSR-N24_fwdDSSR-N24_rev ATTTGACCATAGACTAGAGC GGGGAACGTACTCGTGAAGG 97 DSSR-N25 petB-Intron 80181-80240 (A)10 DSSR-N25_fwdDSSR-N25_rev TATTCAGACCTCGCAACCGG CGTTTGATTTAGGAAATACC 60 98 Ergebnisse Tabelle 13: Test aller entwickelter cpSSR-Primer auf Funktionalität und Variabilität Beobachtete Amplifizierbarkeit von cpSSR-Bereichen mittels spezifisch entwickelter flankierender Primer und Variabilität zwischen den drei Arten Dyckia marnier-lapostollei (FK0030), D. dissitiflora (FK0141) und D. pernambucana (FK0171). Legende: 1: Die Länge des cpSSRs für D. marnier-lapostollei ist nicht bekannt, angegeben ist die Längenvariabilität innerhalb von acht Akzessionen des Testsets TS2 (vgl. 2.1). 2: Die Länge des cpSSRs für D. marnier-lapostollei wurde aus dem 454-Datensatz entnommen, obwohl die Primer aus dem Alignment des Testsets TS2 entwickelt wurden. 3: Die Länge des cpSSRs für D. marnier-lapostollei wurde durch klassische Sequenzierung ermittelt. Locus Name FK0030 FK0141 FK0171 Bemerkungen charakterisiert DSSR-L01 75 73 75 ja DSSR-L02 762 69 71 deutlich kürzer in FK0141 und FK0171 - DSSR-L03 66-691 ±0 ±0 monomorph zwischen drei Arten - DSSR-L04 94 98 99 ja DSSR-L05 98-1081 ±0 -5 insgesamt kurze SSR-Längen - DSSR-L06 77 79 78 ja DSSR-L07 78-861 -5 -5 deutlich kürzer in FK0141 und FK0171 - DSSR-L08 69-701 ±0 ±0 monomorph zwischen drei Arten - DSSR-L09 1193 117 117 kürzer in FK0141 und FK0171 - DSSR-N01 102 102 102 monomorph zwischen drei Arten ja DSSR-N02 97 96 96 kürzer in FK0141 und FK0171 - DSSR-N03 98 Ausfall Ausfall keine Amplifikate für FK0141 und FK0171 - DSSR-N04 87 91 91 ja DSSR-N05 85 86 85 ja DSSR-N06 63 63 63 monomorph zwischen drei Arten - DSSR-N07 74 74 74 monomorph zwischen drei Arten ja DSSR-N08 64 63 63 kürzer in FK0141 und FK0171 - DSSR-N09 80 78 78 kürzer in FK0141 und FK0171 - DSSR-N10 79 81 79 ja DSSR-N11 100 99 97 ja DSSR-N12 65 63 63 kürzer in FK0141 und FK0171 - DSSR-N13 72 72 72 monomorph zwischen drei Arten - DSSR-N14 83 83 83 monomorph zwischen drei Arten - DSSR-N15 64 65 65 ja DSSR-N16 90 90 90 ja DSSR-N17 169 166 166 kürzer in FK0141 und FK0171 - DSSR-N18 63 68 66 ja DSSR-N19 93 90 95 schwaches Amplifikat für FK0141 - DSSR-N20 100 100 100 schwaches Amplifikat für FK0030 - DSSR-N21 61 61 61 monomorph zwischen drei Arten - DSSR-N22 78 Ausfall Ausfall keine Amplifikate für FK0141 und FK0171 - DSSR-N23 105 Ausfall 110 schwaches Amplifikat für FK0030, kein Amplifikat für FK0141 - DSSR-N24 97 97 97 zwei Banden, jeweils monomorph - DSSR-N25 60 60 60 monomorph zwischen drei Arten - Die 12 ausgewählten Loci wurden für den gesamten unter 2.2.5.2 beschriebenen Probensatz analysiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 14 zusammengestellt, die Lage dieser Loci auf dem Plastom ist in Abbildung 14 durch rote Rechtecke gekennzeichnet. Innerhalb von Dyckia wurden bei 540 einzelnen Reaktionen lediglich sechs Ausfälle beobachtet. Von den 156 Reaktionen für Außengruppentaxa ergaben 29 kein Produkt. Innerhalb von D. dissitiflora waren sieben der 12 Loci monomorph. Drei Loci zeigten je zwei verschiedene Allele und zwei Loci jeweils drei verschiedene Allele. Für die vier Proben von D. limae waren neun Loci 99 Ergebnisse monomorph und drei zeigten jeweils zwei verschiedene Allele. Innerhalb von D. pernambucana waren sechs Loci monomorph. Vier Loci zeigten je zwei verschiedene Allele und zwei Loci jeweils drei verschiedene Allele. Die Variabilität innerhalb aller 45 untersuchten Dyckia-Proben aus 19 Arten lag je nach Locus zwischen drei und 10 verschiedenen Allelen (Tabelle 14). Innerhalb der übrigen Pitcairnioideae lag die Erfolgsquote für Encholirium bei 96%, für Deuterocohnia bei 79%, für Fosterella bei 71% und für Pitcairnia bei 79%. Die Übertragbarkeit der cpSSR-Marker war auch für Mitglieder anderer Unterfamilien hoch. Für Puya lieferten 79% der Reaktionen ein Produkt, für Ananas 83%, für Hechtia 92% und für Tillandsia 75% (Tabelle 14 und Anhang 19). Die Sequenzierung der PCR-Produkte aller 12 Loci für die Proben FK0030 (D. marnier- lapostollei) und FK0178 (D. pernambucana) verlief in allen Fällen erfolgreich und die Sequenzen waren gut auswertbar. Insbesondere die Länge der SSR-Bereiche ließ sich in allen Fällen eindeutig bestimmen. Durch Vergleich der so für D. marnier-lapostollei (FK0030) 100 Abbildung 30: Amplifikation von cpSSR-Loci für ein Set aus drei Dyckia-Arten Pro Locus ist jeweils das PCR-Produkt von D. marnier-lapostollei var. estevesii (FK0030), D. dissitiflora (FK0141) und D. pernambucana (FK0171) aufgetragen (von links nach rechts). Die Elektrophorese erfolgte auf Polyacrylamid-Sequenziergel. Als Längenstandard wurde hier abweichend von anderen Analysen die T-Sequenzierreaktion am Locus ccmp2 (Weising & Gardner 1999) von Macaranga indistincta verwendet (GenBank-Nummer: DQ358512). L01 L02 L03 L04 L05 L06 L07 L08 L09 N08N01 N02 N03 N04 N05 N06 N07 N09 N10 N11 N12 N13 N14 N15 N16 N17 N18 N19 N20 N21 N22 N23 N24 N25 Ergebnisse gewonnenen Sequenzen mit den 454-Daten ließen sich Rückschlüsse auf die Qualität letzterer ziehen. So wurde deutlich, dass die mittels der 454-Methode gewonnenen Sequenzen in Bereichen von Mononukleotid-Repeats häufig weniger Nukleotide aufwiesen als gemäß der Re-Sequenzierung tatsächlich vorhanden waren. Die Ergebnisse der Re-Sequenzierung wurden zur Eichung aller gewonnenen Daten verwendet, indem die für FK0178 sequenzierten Produkte auf allen Gelen als Referenz mit aufgetragen wurden. Die absoluten Fragmentlängen aller anderen Proben wurden dann durch Vergleich mit dieser Probe bestimmt. Für D. marnier-lapostollei (FK0030) wurden Sequenzen aller 12 Loci in der GenBank hinterlegt (GenBank-Nummern JQ743912-JQ743923). Tabelle 14: Eigenschaften 12 näher charakterisierter cpSSR-Loci Angegeben sind jeweils die Zahl der gefundenen Allele und der Bereich beobachteter Längen. Für D. dissitiflora wurden drei Populationen mit je vier Individuen untersucht. Für D. limae wurde eine Population mit vier Individuen und von D. pernambucana drei Populationen mit je vier Individuen untersucht. Die Variabilität innerhalb von Dyckia bezieht sich auf alle 28 Proben von D. dissitiflora, D. limae und D. pernambucana zuzüglich 17 weiterer Akzessionen aus 16 verschiedenen Arten der Gattung, also insgesamt 19 Arten in 45 Akzessionen. Für weitere Gattungen der Unterfamilien Pitcairnioideae (En: Encholirium, De: Deuterocohnia, Fo: Fosterella, Pi: Pitcairnia), Puyoideae (Pu: Puya), Bromelioideae (An: Ananas), Hechtioideae (He: Hechtia) und Tillandsioideae (Ti: Tillandsia) wurde lediglich angegeben, ob aus der PCR für wenigstens eine Probe ein Fragment in der erwarteten Größenordnung resultierte. D. dissitiflora D. limae D. pernambucana Dyckia En De Fo Pi Pu An He Ti Allele Längen Allele Längen Allele Längen Allele Längen DSSR-L01 2 75, 76 2 76, 77 3 75, 76, 77 9 70-78 + + + + + + + - DSSR-L04 1 98 1 99 3 97, 98, 99 6 94-99 + + + + + + + + DSSR-L06 2 79, 80 1 78 1 78 8 73-82 + + + + + + + + DSSR-N01 1 102 1 102 1 102 8 98-109 + + + + + + + + DSSR-N04 1 91 1 91 2 91, 92 8 87-98 + + - - - - - - DSSR-N05 1 86 2 85, 86 2 85, 86 4 84-87 + + + + + + + + DSSR-N07 1 74 1 74 1 74 5 71-75 + + - + + + + + DSSR-N10 2 79, 81 1 79 1 79 3 79-81 + + + + + + + + DSSR-N11 3 96, 99, 100 1 98 2 97, 98 10 94-104 + + + - - - + - DSSR-N15 1 65 1 65 1 65 3 64-66 + + + + + + + + DSSR-N16 1 90 1 90 1 90 5 87-91 + + + + + + + + DSSR-N18 3 68, 72, 73 2 62, 66 2 66, 67 9 62-73 + + + + + + + + 3.4.2 Anwendung ausgewählter cpSSRs für Verwandtschaftsanalysen Die 12 etablierten cpSSR-Loci wurden für weitere Proben von Dyckia und Encholirium untersucht. Insgesamt ergab sich ein Satz von 77 Akzessionen von Dyckia, neun von Encholirium und einer Deuterocohnia brevispicata, für die sowohl Sequenzen sechs plastidärer Loci sowie Daten aller cpSSR-Loci vorlagen (vgl. Tabelle 1). Für diese 87 Proben wurden Bayes'sche Analysen sowohl des reinen cpSSR-Datensatzes (Abbildung 31), als auch des kombinierten Datensatzes aus Sequenzdaten und cpSSR-Daten durchgeführt (Abbildung 32). Für diesen Zweck wurden die Daten in die Form eines Alignments überführt 101 Ergebnisse 102 Abbildung 31: Bayes'sche Analyse auf Gattungsebene mit 12 cpSSR-Loci Gezeigt ist der 50% Majority Rule-Konsensusbaum aus einer Analyse mit MrBayes 3.2.1. Die Analyse wurde in zwei unabhängigen Läufen mit je 1.000.000 Generationen durchgeführt. Von den resultierenden Bäumen wurden 10% als Burn-in verworfen. Über den Ästen finden sich die Posterioriwahrscheinlichkeiten. Die Astlängen repräsentieren die erwartete Menge an substituierten Alignmentpositionen entsprechend der Maßstabsleiste am unteren Bildrand. Die Markierungen am rechten Bildrand entsprechen denen aus Abbildung 18. Nummern verweisen auf Gruppenzugehörigkeit (1: zentralbrasilianische Klade, 2: südbrasilianische Klade, 3: basale Linie, 4: zueinander gehörig). Dyckia remotiflora (FK0055) Dyckia niederleinii (FK0103) Dyckia velascana (FK0104) Dyckia velascana (FK0105) Dyckia floribunda (FK0107) Dyckia velascana (FK0006) Dyckia remotiflora (FK0068) Dyckia hebdingii (FK0112) Dyckia maritima (FK0113) Dyckia monticola (FK0088) Dyckia fosteriana (FK0094) Dyckia ferruginea (FK0090) Dyckia marnier-lapostollei var. mar. (FK0029) Dyckia estevesii (FK0005) Dyckia lindevaldae (FK0019) Dyckia braunii (FK0042) Dyckia estevesii var. braunii (FK0004) Dyckia leptostachya (FK0053) Dyckia estevesii (FK0033) Dyckia pumila (FK0093) Dyckia choristaminea (FK0040) Dyckia remotiflora var. indet. (FK0015) Dyckia spec. (FK0024) Dyckia aff. pumila (FK0017) Dyckia aff. leptostachya (FK0035) Dyckia aff. leptostachya (FK0016) Dyckia floribunda (FK0108) Dyckia floribunda (FK0052) Dyckia rariflora (FK0039) Dyckia aff. brevifolia (FK0010) Dyckia hebdingii (FK0013) Dyckia cf. velascana (FK0106) Dyckia remotiflora var. indet. (FK0011) Dyckia hebdingii (FK0038) Dyckia brachyphylla (FK0045) Dyckia beateae (FK0044) Dyckia goehringii (FK0031) Dyckia oligantha var. oligantha (FK0036) Dyckia brevifolia (FK0067) Dyckia estevesii (FK0001) Dyckia cinerea (FK0047) Dyckia dawsonii (FK0043) Dyckia macedoi (FK0099) Dyckia macedoi (FK0100) Dyckia macedoi (FK0101) Dyckia macedoi (FK0102) Dyckia maracasensis (FK0087) Dyckia ursina (FK0089) Dyckia milagrensis (FK0096) Dyckia granmogulensis (FK0007) Deuterocohnia brevispicata (FK0071) Encholirium horridum (FK0070) Encholirium spec. (FK0014) Dyckia beateae (FK0091) Dyckia maritima (FK0092) Dyckia encholirioides (FK0095) Dyckia choristaminea (FK0021) Dyckia marnier-lapostollei var. est. (FK0030) Encholirium erectiflorum (FK0123) Encholirium maximum (FK0124) Encholirium spec. (FK0125) Dyckia pernambucana (FK0098) Dyckia pernambucana (FK0097) Encholirium spec. (FK0079) Encholirium spec. (FK0080) Encholirium spec. (FK0078) Encholirium magalhaesii (FK0122) Dyckia aff. reitzii (FK0050) Dyckia spec. (FK0086) Dyckia aff. ibiramensis (FK0025) Dyckia tobatiensis (FK0018) Dyckia spec. (FK0049) Dyckia niederleinii (FK0110) Dyckia ferox (FK0020) Dyckia cf. leptostachya (FK0115) Dyckia spec. (FK0116) Dyckia ferox (FK0027) Dyckia microcalyx (FK0054) Dyckia microcalyx var. indet. (FK0009) Dyckia microcalyx (FK0111) Dyckia cf. microcalyx (FK0051) Dyckia ferox (FK0056) Dyckia vestita (FK0109) Dyckia tomentella (FK0114) Dyckia vestita (FK0032) Dyckia ursina (FK0012) Dyckia spec. (FK0023) 0,85 0,67 0,75 1,00 0,53 0,85 0,66 0,63 1,00 0,71 1,00 1,00 0,66 0,78 0,98 0,98 1,00 0,53 0,95 1,00 0,97 0,51 0,81 0,78 0,85 0,86 0,59 0,72 0,98 0,64 0,73 0,73 0,88 1,00 0,95 0,73 0,87 0,99 0,86 0,98 0,65 1,00 1,00 0,53 0,99 0,55 0,98 0,90 0,92 0,99 0,90 1,00 0,881,00 1,00 0,75 0,70 1,0% ze nt ra lb ra si lia ni sc he K la de 1 pa ra gu ay is ch e K la de ar ge nt in is ch e Kl ad e E nc ho lir iu m sü db ra si lia ni sc he K la de 2 2 3 1 4 4 Ergebnisse 103 Abbildung 32: Kombinierte Bayes'sche Analyse von cpSSR- und Sequenzdaten Untersucht wurden 12 cpSSR-Loci und die sechs sequenzierten plastidären Loci. Gezeigt ist der 50% Majority Rule-Konsensusbaum aus einer Analyse mit MrBayes 3.2.1. Die Analyse wurde in zwei unabhängigen Läufen mit je 1.000.000 Generationen durchgeführt. Von den resultierenden Bäumen wurden 10% als Burn-in verworfen. Über den Ästen finden sich die Posterioriwahrscheinlichkeiten. Die Astlängen repräsentieren die erwartete Menge an substituierten Alignmentpositionen entsprechend der Maßstabsleiste am unteren Bildrand. Die Markierungen am rechten Bildrand entsprechen denen aus Abbildung 18. ze nt ra lb ra si lia ni sc he K la de pa ra gu ay is ch e K la de ar ge nt in is ch e K la de E nc ho lir iu m sü db ra si lia ni sc he K la de Dyckia remotiflora (FK0055) Dyckia niederleinii (FK0103) Dyckia velascana (FK0104) Dyckia velascana (FK0105) Dyckia floribunda (FK0107) Dyckia velascana (FK0006) Dyckia remotiflora (FK0068) Dyckia hebdingii (FK0112) Dyckia maritima (FK0113) Dyckia leptostachya (FK0053) Dyckia estevesii (FK0033) Dyckia pumila (FK0093) Dyckia choristaminea (FK0040) Dyckia remotiflora var. indet. (FK0015) Dyckia ursina (FK0012) Dyckia spec. (FK0023) Dyckia spec. (FK0024) Dyckia aff. pumila (FK0017) Dyckia aff. leptostachya (FK0035) Dyckia aff. leptostachya (FK0016) Dyckia floribunda (FK0108) Dyckia floribunda (FK0052) Dyckia spec. (FK0086) Dyckia aff. ibiramensis (FK0025) Dyckia rariflora (FK0039) Dyckia aff. brevifolia (FK0010) Dyckia hebdingii (FK0013) Dyckia cf. velascana (FK0106) Dyckia remotiflora var. indet. (FK0011) Dyckia hebdingii (FK0038) Deuterocohnia brevispicata (FK0071) Encholirium horridum (FK0070) Encholirium spec. (FK0014) Dyckia beateae (FK0091) Dyckia maritima (FK0092) Dyckia encholirioides (FK0095) Dyckia choristaminea (FK0021) Encholirium erectiflorum (FK0123) Encholirium maximum (FK0124) Encholirium spec. (FK0125) Encholirium spec. (FK0079) Encholirium spec. (FK0080) Encholirium spec. (FK0078) Encholirium magalhaesii (FK0122) Dyckia aff. reitzii (FK0050) Dyckia monticola (FK0088) Dyckia fosteriana (FK0094) Dyckia ferruginea (FK0090) Dyckia lindevaldae (FK0019) Dyckia braunii (FK0042) Dyckia estevesii var. braunii (FK0004) Dyckia brachyphylla (FK0045) Dyckia beateae (FK0044) Dyckia goehringii (FK0031) Dyckia oligantha var. oligantha (FK0036) Dyckia brevifolia (FK0067) Dyckia cinerea (FK0047) Dyckia dawsonii (FK0043) Dyckia macedoi (FK0099) Dyckia macedoi (FK0100) Dyckia macedoi (FK0101) Dyckia macedoi (FK0102) Dyckia maracasensis (FK0087) Dyckia ursina (FK0089) Dyckia milagrensis (FK0096) Dyckia granmogulensis (FK0007) Dyckia pernambucana (FK0098) Dyckia pernambucana (FK0097)1,00 0,92 0,92 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 0,50 0,86 0,54 0,93 1,00 Dyckia marnier-lapostollei var. mar. (FK0029) Dyckia estevesii (FK0005) Dyckia estevesii (FK0001) Dyckia marnier-lapostollei var. est. (FK0030) 1,00 1,00 0,58 0,53 0,70 1,00 1,00 1,00 1,00 0,56 0,92 0,99 0,64 0,93 1,00 0,54 0,92 1,00 1,00 0,67 0,68 0,86 0,58 0,90 0,54 1,00 0,74 1,00 0,96 0,51 1,00 0,87 0,96 0,831,00 0,81 1,00 1,00 0,89 1,0% Dyckia tobatiensis (FK0018) Dyckia spec. (FK0049) Dyckia niederleinii (FK0110) Dyckia ferox (FK0020) Dyckia ferox (FK0056) Dyckia vestita (FK0109) Dyckia cf. leptostachya (FK0115) Dyckia spec. (FK0116) Dyckia ferox (FK0027) Dyckia microcalyx (FK0054) Dyckia microcalyx var. indet. (FK0009) Dyckia microcalyx (FK0111) Dyckia cf. microcalyx (FK0051) Dyckia tomentella (FK0114) Dyckia vestita (FK0032)1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 0,96 0,86 0,71 0,990,84 0,69 Ergebnisse wie in 2.3.1 beschrieben. Als Substitutionsmodell für die cpSSR-Daten kam jeweils GTR+I+G zum Einsatz, für die übrigen Loci jeweils das optimale gefundene Modell (vgl. 3.2.2). Der reine cpSSR-Datensatz wies 106 variable Merkmale auf, von denen 91 potentiell parsimonie- informativ waren. Der kombinierte Datensatz zeigte 262 variable Merkmale, von denen 157 parsimonie-informativ waren. Die Analyse der reinen cpSSR-Daten (Abbildung 31) zeigt gewisse Übereinstimmungen mit den auf Basensubstitutionen beruhenden Bäumen (Abbildungen 18-21) insbesondere in abgeleiteten kleineren Kladen, aber auch gravierende Unterschiede. In allen Analysen ist Dyckia monophyletisch und Encholirium paraphyletisch. Die Reihenfolge, in der die einzelnen Linien von Encholirium zwischen Deuterocohnia brevispicata und Dyckia angeordnet sind, unterscheidet sich allerdings. Innerhalb der monophyletischen Gattung Dyckia (PP=0,92) zweigen zwei frühe Linien ab. Die sich zuerst abspaltende Linie wird von D. leptostachya (FK0053) gebildet, welche in den anderen Bäumen innerhalb einer kleinen Klade von Core-Dyckia steht. Eine weitere früh abzweigende Linie fasst vier Akzessionen zusammen, die sonst innerhalb der zentralbrasilianischen und der südbrasilianischen Klade stehen. Alle übrigen Akzessionen von Dyckia bilden ein gestütztes Monophylum (PP=0,86). Die in den auf Substitutionen beruhenden Bäumen außerhalb von Core-Dyckia stehende D. beateae (FK0091) steht hier in abgeleiteter Position gemeinsam mit einigen Vertretern der zentralbrasilianischen Klade. Weder die zentralbrasilianische noch die südbrasilianische Klade werden in der Analyse der reinen cpSSR-Daten gefunden. Die argentinische und die paraguayische Klade bleiben dagegen mit schwacher bis moderater statistischer Unterstützung (PP=0,95 und PP=0,78) erhalten. Die Analyse des kombinierten Datensatzes weist keine wesentlichen Widersprüche zur Analyse der reinen Sequenzdaten auf, stellenweise unterscheiden sich aber Auflösung und statistische Unterstützung (Abbildung 33). Dyckia beateae (FK0091) steht wie in der Analyse der reinen Sequenzdaten in Schwestergruppenposition zum Monophylum von Core-Dyckia (PP=1). Hierin nehmen D. aff. reitzii (FK0050) und D. maritima (FK0092) eine Stellung als Schwestergruppe zu den übrigen Proben ein, was aber kaum gestützt ist (PP=0,53). Alle übrigen größeren Kladen innerhalb von Core-Dyckia sind identisch mit der Analyse der reinen Sequenzdaten. Innerhalb der paraguayischen Klade finden sich keinerlei Widersprüche zwischen allen drei Analysen. Die Klade selbst und die meisten Verzweigungen werden in beiden Einzelanalysen gefunden, der kombinierte Datensatz liefert die beste Auflösung und Unterstützung. Die Topologie innerhalb der argentinischen Klade widerspricht sich teilweise 104 Ergebnisse zwischen den Analysen. Die kombinierte Analyse zeigt allerdings keine Widersprüche zur ausschließlich auf Sequenzdaten beruhenden Phylogenie. 105 Diskussion 4 Diskussion 4.1 Methodische Aspekte 4.1.1 DNA-Isolation Das Protokoll zur DNA-Isolation mit vorhergehenden Waschschritten nach Tel-Zur et al. (1999) war bereits in der vorausgegangenen Diplomarbeit optimiert und ausgiebig getestet worden (Krapp 2009). Die Qualität der mit dieser Methode isolierten DNA erwies sich auch in der vorliegenden Arbeit als durchgehend sehr hoch. So zeigte sich auf den Agarosegelen kaum niedermolekularer Schmier. Die deutet auf eine sehr effektive Verhinderung von Degradation durch DNasen hin, was in den vorgeschalteten Waschschritten begründet sein mag. Ferner zeigte sich nach dem Trocknen der DNA während der Isolation regelmäßig ein völlig hyalines Pellet, ein Indiz für besonders reine DNA. Nach der Lösung der DNA in TE-Puffer zeigte sich jeweils eine völlig klare Lösung. Somit scheint die Entfernung cytoplasmatischer Bestandteile und des Vakuoleninhalts vor der Lyse der Organellen sehr gut funktioniert zu haben. Aus sämtlichen DNA-Lösungen ließen sich alle für die phylogenetischen Studien verwendeten verwendeten plastidären und nukleären Loci gut mittels PCR amplifizieren. Dies zeigt die konstante Qualität bezüglich der Menge an hochmolekularer DNA und der erfolgreichen Entfernung PCR-inhibitorischer Bestandteile des Pflanzengewebes. Für die von Kooperationspartnern nach der klassischen CTAB-Methode nach Doyle & Doyle (1987) isolierte DNA zeigte die Mengenanalyse auf Agarosegelen stark variierende Konzentrationen. Einige Proben zeigten gar keine detektierbaren Mengen an DNA. Der Anteil an degradierter DNA, der als Schmier im niedermolekularen Bereich sichtbar wurde, war in vielen Fällen recht hoch. Die PCR für plastidäre Loci funktionierte für die meisten dieser Proben gleichwohl recht gut. Dagegen erwies sich die Amplifikation des nukleären Locus phyC teilweise als schwierig. Ein Einfluss inhibitorischer Stoffe erscheint hier eher unwahrscheinlich, da auch die Verdünnung der Templat-DNA in der PCR keine Verbesserung brachte. Eine Erhöhung der eingesetzten Templatmenge hingegen verbesserte die Ergebnisse für die meisten Proben in ausreichendem Maße. In einigen Fällen gelang die Amplifikation von phyC jedoch nur für die beiden Teilabschnitte a und b, das Gesamtfragment war nicht zu gewinnen. Dies könnte in einer zu geringen Konzentration an Templat-DNA oder einem Mangel an ausreichend hochmolekularen DNA-Fragmenten begründet sein. 106 Diskussion Im direkten Vergleich damit zeigt die Variante der CTAB-Methode mit vorgeschalteten Waschschritten nach Tel-Zur et al. (1999) die eindeutig besseren Ergebnisse. Während die DNA-Ausbeute in der gleichen Größenordnung liegt wie bei der Anwendung der klassischen CTAB-Methode für andere Bromelienarten (z. B. Wagner 2007), ist die DNA deutlich weniger degradiert und zeigt keine auf Kontaminationen hindeutende Verfärbung. Die Amplifikation insbesondere nukleärer Loci wie phyC erfordert eine solche hohe DNA-Qualität, was den hohen Aufwand der verwendeten Methode rechtfertigt und nötig macht. 4.1.2 Charakterisierung verschiedener plastidärer Loci rpl 32 -trn L Die in dieser Arbeit mit 12,4% beobachtete Variabilität über den gesamten Probensatz inklusive Außengruppen hinweg deckt sich in etwa mit den Erwartungen für die Familie der Bromeliaceae, die ja generell für eine geringe Variabilität im Plastom bekannt ist (Givnish et al. 2011). Die Akzessionen von Dyckia zeigen mit 2,6% aber nur wenige Sequenzunterschiede. In einem anderen Verwandtschaftskreis (Cistaceae) wurde ein vergleichbar niedriger Wert von 2,2% bereits innerhalb einer einzelnen Art, Cistus creticus, gefunden (Falchi et al. 2009). Innerhalb von drei auf Hawaii endemischen Arten der Gattung Plantago (Plantaginaceae) ermittelten Dunbar-Co et al. (2008) sogar eine beachtliche Variabilität von 8,4%. Unter den in der vorliegenden Arbeit verwendeten Loci zeigt rpl32-trnL gleichwohl die zweithöchste Variabilität. Zwar ist der methodische Aufwand infolge der Notwendigkeit einer Sequenzierung in zwei Teilstücken sehr hoch, dennoch liefert der Locus einen wertvollen Beitrag zum gesamten Datensatz. rps 16- trn K Der Locus rps16-trnK wurde bisher selten in phylogenetischen Studien eingesetzt, obwohl Shaw et al. (2007) ihn als überdurchschnittlich variabel diagnostizierten. Die Sequenzierung in drei Teilstücken stellt einen erheblichen methodischen Aufwand dar, ist aber aufgrund der zwei teils sehr langen und für die Sequenzierung problematischen SSR-Bereiche erforderlich. Der Aufwand erscheint dadurch gerechtfertigt, dass rps16-trnK unter den getesteten plastidären Loci die mit Abstand höchste für Dyckia beobachtete Variabilität von 3,7% aufweist und einen großen Teil der aus dem gesamten Datensatz resultierenden Auflösung beisteuert. mat K Teil a Schulte et al. (2009) ermittelten für matK eine Variabilität von 7,5% innerhalb von 48 Taxa der Bromelioideae. Dieser Wert ist durchaus mit dem hier für die Pitcairnioideae und Puya 107 Diskussion beobachteten Wert von 9,2% vergleichbar. Die Variabilität innerhalb von Dyckia liegt mit 2,0% im Vergleich mit den übrigen hier untersuchten Loci im Mittelfeld. Verglichen mit anderen Pflanzengruppen ist Dyckia aber auch hier sehr merkmalsarm. So fanden Müller & Borsch (2005) innerhalb der Gattung Utricularia (Lentibulariaceae) eine Variation von 10,5%. Der Locus matK ist einfach zu amplifizieren und die Sequenzqualität ist durchweg hoch. Zwar ist die ausschließlich mit diesem Locus erzielte Auflösung gering, dennoch steuert matK wertvolle Merkmale zum gesamten Datensatz bei. rps 16 - Intron Für 122 Proben aus drei Unterfamilien der Bromeliaceae beobachteten Barfuss et al. (2005) eine Variabilität innerhalb des rps16-Introns von 20,5%. Berücksichtigt man die größere taxonomische Spannweite in der Arbeit von Barfuss et al. (2005), so ist dies durchaus mit dem hier für die Pitcairnioideae und Puya ermittelten Wert von 9,4% vergleichbar. Watts et al. (2008) ermittelten im Vergleich von sechs Arten der Gattung Chusquea (Poaceae) eine Variabilität von 3,8% für die als besonders variabel geltende Domäne IV dieses Introns. Innerhalb von Dyckia zeigt sich mit 2,0% lediglich knapp die Hälfte dieses Wertes. Unter den verwendeten Loci liegt das rps16-Intron damit im Mittelfeld, liefert aber wichtige Merkmale insbesondere zur Identifikation kleinerer Kladen innerhalb von Dyckia. pet D - Intron Das petD-Intron wurde von Watts et al. (2008) als weniger variabel im Vergleich zu anderen Klasse II-Introns des Plastoms beschrieben. Zwischen sechs Arten der Gattung Chusquea (Poaceae) zeigte sich bei Watts et al. (2008) eine Variabilität von lediglich 1,2%. Bei den Vortests in Dyckia erwies sich der Locus aber als durchschnittlich variabel und technisch sehr einfach handhabbar. Die Variabilität des petD-Introns ist innerhalb von Dyckia mit nur 0,9% allerdings geringer als in allen anderen verwendeten Loci. Nichtsdestotrotz stützen die Sequenzdaten dieses Locus einige Kladen. Mit 9,6% Variabilität im gesamten Probensatz liefert das petD-Intron auch wichtige Merkmale für Beziehungen zu den Außengruppen. Auch die einfache Amplifikation und hohe Sequenzqualität rechtfertigen die Verwendung. trn D -trn T Für den Locus trnD-trnT wurde von Watts et al. (2008) eine Variabilität von 4,0% zwischen sechs Arten der Gattung Chusquea (Poaceae) gefunden. Auch Shaw et al. (2007) beschrieben den Locus als überdurchschnittlich variabel. Innerhalb von Dyckia ist die Variabilität mit 1,1% aber sehr gering. Auch für den gesamten Probensatz zeigt sich mit 8,3% ein besonders geringer Wert. Relativiert werden diese Werte aber durch die große 108 Diskussion Länge des Alignments, die aus großen Insertionen in Sequenzen von Außengruppentaxa resultiert. Betrachtet man die absolute Zahl an Substitutionen, so ist trnD-trnT durchaus vergleichbar mit matK. Eignung der ausgewählten Loci Die Sequenzvariabilität der Plastome innerhalb der Gattung Dyckia ist offenbar generell sehr gering. So wurden vergleichbare Werte für andere Pflanzengruppen teilweise schon innerhalb einzelner Arten gefunden. Innerhalb von Gattungen anderer Pflanzenfamilien wurden häufig vielfach höhere Werte beobachtet. Innerhalb der Bromeliaceae ist die Variabilität des Plastoms zwar ohnehin bekanntermaßen gering (z. B. Givnish et al. 2011), doch Dyckia scheint selbst für diese Verhältnisse ein ausgesprochen uniformes Plastom zu besitzen. Unter den hier untersuchten Bereichen des Plastoms erwiesen sich die sechs letztlich ausgewählten Loci als vergleichsweise vielversprechend. Allerdings reicht auch die in den über 6.000 bp Alignment-Länge enthaltene Information noch nicht aus, um eine bis ins Detail aufgelöste Phylogenie von Dyckia zu rekonstruieren. Eine vergleichbare Datenmenge lieferte für die gleichfalls zu den Pitcairnioideae zählenden Gattung Fosterella sehr viel besser aufgelöste Bäume (Rex et al. 2009; Wagner et al. 2012). Für eine deutliche Erhöhung der Auflösung wäre entweder die intensive Suche nach weiteren besonders variablen Loci oder die vergleichende Sequenzierung kompletter Plastome nötig. Ob sich dieser enorme Aufwand aber lohnen würde, bleibt fraglich. 4.1.3 Phytochrom C (phyC) Der Locus phyC wurde bereits bei einer breiten Palette von Pflanzenarten sequenziert, unter anderem auch bei Bromelien. Jabaily & Sytsma (2010) sequenzierten das Exon 1 von phyC für ein Probenset aus Puyoideae, Bromelioideae, Pitcairnioideae und einer Hechtia und beobachteten eine Variabilität von 17,0%. Innerhalb von Puya alleine zeigte sich ein Wert von 5,6%. Innerhalb der 75 von Jabaily & Sytsma (2010) untersuchten Proben wiesen 24 Sequenzen allelische Variation auf. Diese enthielten dann jeweils 1-15 heterozygote Positionen (durchschnittlich 3,5) pro Sequenz. Edwards et al. (2005) ermittelten innerhalb von 34 Vertretern der Cactaceae eine Variabilität von 35,3% im Exon 1 von phyC. Die PCR-Produkte wurden für diese Arbeit vor der Sequenzierung kloniert und die allelische Variation wurde als gering angegeben. Innerhalb von 91 Akzessionen der Gattungen Macaranga und Mallotus sowie einiger weiterer Euphorbiaceae fanden Kulju et al. (2007) für ein kürzeres Stück des Exons 1 von phyC einen 109 Diskussion Anteil parsimonie-informativer Merkmale von 18,5%. Die allelische Variation innerhalb einzelner Sequenzen, sofern vorhanden, betrug bis zu 14 Positionen. In der vorliegenden Arbeit wurden mit 16,3% Variabilität für den gesamten Probensatz und 5,7% innerhalb von Dyckia beinahe identische Werte wie bei Jabaily & Sytsma (2010) für Puya ermittelt. Innerhalb von Dyckia wiesen 74% der Sequenzen zwischen einer und 21 heterozygote Positionen auf (durchschnittlich 3,9). Auf den gesamten Probensatz bezogen zeigten 72% der Sequenzen durchschnittlich 4,2 heterozygote Positionen. Somit scheint der Umfang heterozygoter Positionen pro Sequenz zwischen Gattungen und Unterfamilien der Bromeliaceae vergleichbar zu sein. Auch für die Euphorbiaceae wurden vergleichbare Werte gefunden. Der Anteil völlig homozygoter Proben ist aber für Dyckia und andere Pitcairnioideae offenbar sehr viel geringer als beispielsweise für Puya. Für das Exon 1 des nukleären Gens phyC konnten letztlich für alle untersuchten Proben gute Sequenzdaten produziert werden. Als besonders günstig erwies sich der Umstand, dass auf die Klonierung der PCR-Produkte verzichtet werden konnte. Die teilweise schwierige Amplifikation, die hohen Ansprüche an die Qualität der Templat-DNA und die nötige besonders sorgfältige Editierung machen Untersuchungen dieses Locus dennoch sehr aufwändig. Bedauerlicherweise wurde trotz der hohen Sequenzvariabilität nur eine recht geringe Auflösung der Phylogenien beobachtet, insbesondere innerhalb der Gattung Dyckia selbst. Bisher wurde aber noch kein nukleärer Locus identifiziert, der für Dyckia besser geeignet wäre. Zwar konnte Klein (2012) im Rahmen einer Diplomarbeit zeigen, dass die Loci g3pdh (kodierend für Glyceraldehyd-3-Phosphodehydrogenase) und rpb2 (kodierend für die große Untereinheit der RNA-Polymerase II) für Dyckia prinzipiell verwendbar sind, die bisher erzielte Auflösung ist jedoch für beide Loci noch geringer als bei phyC. 4.1.4 Verwendete Methoden zur Datenanalyse Alignment und Behandlung von Indels Das Alignment der plastidären Sequenzen war in fast allen Fällen zweifelsfrei möglich. In sehr wenigen Fällen gab es mehr als eine Möglichkeit, einzelne Bereiche unter Annahme eines Minimums zur Erklärung nötiger evolutiver Schritte zu alignieren. Zumeist fanden sich solche Probleme bei Substitutionen innerhalb von SSR-Bereichen, welche ohnehin nicht in die Analysen einbezogen wurden. Eine Veränderung der erzielten phylogenetischen Bäume durch abweichendes Alignment einzelner Bereiche kann aber faktisch ausgeschlossen werden. Für den Locus phyC wurden keinerlei Indels beobachtet, was das Alignment ohnehin eindeutig macht. 110 Diskussion Indels und SSRs wurden in allen Analysen generell nicht berücksichtigt. Innerhalb von Dyckia fanden sich ohnehin nur fünf potentiell informative Indels. Eine versuchsweise durchgeführte Bayes'sche Analyse unter Berücksichtigung dieser Bereiche durch Kodierung zeigte keine zusätzliche Auflösung (keine Abbildung). Bei der Verwertung von cpSSRs als potentiell phylogenetisch informative Merkmale tritt das Problem eines erhöhten Risikos von Homoplasie auf (vgl. 4.1.5). Daher wurde auch hier von einer Kodierung abgesehen. Vergleich verschiedener Algorithmen zur Phylogenierekonstruktion Die mit verschiedenen Analysemethoden aus dem Datensatz plastidärer Sequenzen erstellten phylogenetischen Bäume und Netzwerke enthalten keine wesentlichen Widersprüche in der Topologie (vgl. 3.2.2). Hinsichtlich der Auflösung zeigen sich leichte Unterschiede. Die Darstellung als Netzwerk ist für Dyckia besonders vorteilhaft, da erfolgte Radiationen hier als sternförmige Verzweigungsmuster erkennbar sind. Bei der Analyse des Datensatzes von nukleären phyC-Sequenzen zeigte sich hingegen eine Reihe an Unterschieden in der Topologie von Bäumen, die nach unterschiedlichen Algorithmen berechnet wurden. Insbesondere die Parsimonieanalyse scheint für einen Datensatz mit vielen heterozygoten Positionen nicht gut geeignet zu sein. Die einzelnen gefundenen Bäume widersprechen sich insbesondere bei den Verzweigungen innerhalb von Dyckia. Dies äußert sich in einer extrem schlechten Auflösung des Konsensusbaumes. Auch in der schnellen Bootstrap-Analyse mit RAxML zeigen sich starke Unterschiede zwischen den einzelnen gefundenen Bäumen. Dies resultiert in einer äußerst geringen Zahl an gestützten Knoten des besten in der RAxML-Analyse gefundenen Baumes, der eine moderate Auflösung zeigt. Als guter Kompromiss kann der aus der Bayes'schen Analyse gewonnene Baum gesehen werden, da hier Knoten ohne Unterstützung nicht enthalten sind. Qualität der absoluten Datierung Die Datierung ultrametrischer molekularer Bäume erfordert neben der mit Unsicherheiten belasteten Abschätzung der Evolutionsraten auch eine Kalibrierung etwa mittels eindeutig zuordenbarer Fossilien. Eine solche Kalibrierung und damit absolute Datierung von phylogenetischen Bäumen der Bromeliaceae ist nicht ohne weiteres möglich, da es innerhalb der Familie an Fossilien mangelt. Ein auf etwa 36 Millionen Jahre vor heute datiertes Fossil aus Costa Rica steht wohl außerhalb der Kronengruppe der Bromeliaceae, was eine Nutzung zur Kalibrierung ausschließt (Smith & Till 1998; Givnish et al. 2011). Somit ist eine indirekte Kalibrierung über Fossilien aus anderen Familien der monokotylen Pflanzen derzeit die einzige Option. Givnish et al. (2011) ermittelten auf diese Weise ein Alter der 111 Diskussion Stammgruppe der Bromeliaceae von etwa 100 Millionen Jahren und der Kronengruppe von etwa 19 Millionen Jahren. Das mit der Methode von Givnish et al. (2011) ermittelte relativ geringe Alter der Kronengruppe im Vergleich zur Stammgruppe lässt den Ansatz der indirekten Datierung bei Bromeliaceae zunächst als höchst unzuverlässig erscheinen. Interessanterweise findet sich aber eine Reihe an gut datierbaren geologischen Ereignissen, deren vermutliche klimatische Folgen mit der ermittelten Phylogenie der Bromeliaceae in Verbindung zu bringen sind (vgl. 4.3.2). Möglicherweise noch aussagekräftiger ist der Vergleich mit datierten Phylogenien anderer Organismen. Zeitlich sehr gut korreliert ist die zweifache unabhängige Entstehung von Blatttrichtern mit zwei Diversifizierungswellen darin lebender endemischer Schwimmkäfer (Balke et al. 2008; Givnish et al. 2011). Weitere Untersuchungen an verschiedenen tierischen und pflanzlichen Organismen geben unabhängige Hinweise auf den zeitlichen Rahmen der Entstehung von Cerrado und Mata Atlântica in Brasilien, die sich ebenfalls grob mit den von Givnish et al. (2011) angegebenen Daten decken (Berry et al. 2004; Almeida et al. 2007; Elias et al. 2009; Maraví 2010; Roncal et al. 2011). Insgesamt ist es als wahrscheinlich anzunehmen, dass die von Givnish et al. (2011) vorgenommene Datierung recht gut mit den tatsächlichen Werten übereinstimmt. Zumindest gravierende Abweichungen können wohl weitgehend ausgeschlossen werden. Demnach kann auch die für die vorliegenden Arbeit durchgeführte Datierung als recht zuverlässig gelten. 4.1.5 Plastidäre Mikrosatelliten (cpSSRs) Etablierung von cpSSR-Loci Die verwendete Methode zur Identifikation plastidärer SSRs mittels 454-Sequenzierung erwies sich als zuverlässig und effizient. Da das primäre Ziel bei der 454-Sequenzierung die Entwicklung nukleärer SSRs war, wurde das Verfahren nicht auf die Gewinnung plastidärer DNA hin optimiert. Durch Anreicherung von Plastiden vor der DNA-Isolation könnte der Anteil an Sequenzen plastidären Ursprungs im gesamten Datensatz stark erhöht werden. Naheliegend wäre beispielsweise die Isolation von Plastiden mittels Saccharose- Dichtegradientenzentifugation, welche häufig zu diesem Zweck angewendet wird (z. B. Guisinger et al. 2010). Innerhalb der durch 454-Sequenzierung gewonnenen Daten fanden sich 30 cpSSRs mit 10 oder mehr Wiederholungen in etwa 87% des Plastoms. Somit ist für das gesamte Plastom eine Zahl von etwa 35 cpSSRs anzunehmen. Dieser Wert deckt sich mit Zahlen solcher Mikrosatelliten in Plastomen anderer monokotyler Pflanzenfamilien, welche zwischen sechs und 51 betragen (Ebert & Peakall 2009). 112 Diskussion Aufgrund der überschaubaren Zahl an identifizierten SSRs ausreichender Länge erwies sich das Design flankierender Primer von Hand als praktikable Methode. Die Primer wurden jeweils so gewählt, dass sie einen möglichst hohen GC-Gehalt aufwiesen. Bei einer Länge von jeweils 20 bp resultierte dies in generell hohen theoretischen Schmelz- und Annealingtemperaturen. Für jedes der entwickelten Primerpaare konnte dasselbe PCR- Programm mit einheitlicher Annealingtemperatur verwendet werden, was einen großen methodischen Vorteil darstellte. Eine Optimierung der PCR-Bedingungen war nicht erforderlich, es traten keine unspezifischen Zusatzbanden auf. Der hohe Anteil an funktionierenden Primerpaaren (88%) und die offensichtlich hohe Spezifizität zeigen, dass die manuelle Erstellung von Primern durchaus erfolgreich ist und der Einsatz von spezieller Software wie etwa Primer3 (Rozen & Skaletsky 2000) zumindest für plastidäre DNA nicht unbedingt notwendig ist. Anwendung von cpSSRs für Verwandtschaftsuntersuchungen Phylogenetische Analysen ausschließlich mit cpSSR-Markern werden offenbar nur selten durchgeführt. Für die Gattung Anthyllis (Fabaceae) untersuchten Nanni et al. (2004) sieben von Weising & Gardner (1999) publizierte cpSSR-Loci. Die aus diesen Daten gewonnene Phylogenie deckte sich grob mit Erkenntnissen aus Untersuchungen der ITS-Region. Ob die beobachteten Längenpolymorphismen der PCR-Fragmente aber aus Unterschieden in der Zahl an Mononukleotid-Wiederholungen in den SSRs oder aber in Mutation in den flankierenden Regionen begründet waren, wurde nicht untersucht. Cubas et al. (2005) verwendeten die von Weising & Gardner (1999) publizierten universellen Primerpaare zur Amplifikation möglicher cpSSRs in verschiedenen Arten der Gattung Ulex (Fabaceae). Durch Sequenzierung einiger PCR-Produkte zeigten sie, dass die Längenvariation weitgehend durch Unterschiede in der Zahl an Mononukleotid- Wiederholungen in den SSRs verursacht wird. Die Plastiden einzelner Arten von Ulex stellten jeweils keine monophyletischen Abstammungslinien dar. Vielmehr zeigte sich eine extreme Diskrepanz zwischen der plastidären Phylogenie einerseits und den taxonomischen Artgrenzen andererseits. Da keine anderen plastidären Loci sequenziert wurden, ist jedoch schwer zu beurteilen, wie zuverlässig die alleine aus den cpSSR-Daten gewonnenen Erkenntnisse sind. Ein Grund für die Entwicklung von cpSSR-Markern für Dyckia in der vorliegenden Arbeit war, diese zur Verbesserung von Auflösung und Unterstützung der Phylogenie aus plastidären Sequenzen zu nutzen. Dahinter steckte die Idee, den erstaunlich invarianten Datensatz der 113 Diskussion 114 Abbildung 33: Einfluss von cpSSR-Daten auf den Datensatz aus plastidären Sequenzen Gezeigt ist jeweils der 50% Majority Rule-Konsensusbaum aus einer Analyse mit MrBayes 3.2.1 (vgl. 3.2.2 und 3.4.2). Auf der linken Seite ist der Baum gezeigt, welcher aus dem kombinierten Datensatz aus plastidären Sequenzen und cpSSRs resultierte. Rechts ist das Ergebnis der Analyse ausschließlich der Sequenzdaten gezeigt. Dyckia remotiflora (FK0068) Dyckia hebdingii (FK0112) Dyckia maritima (FK0113) Dyckia monticola (FK0088) Dyckia fosteriana (FK0094) Dyckia ferruginea (FK0090) Dyckia marnier-lapostollei var. mar. (FK0029) Dyckia estevesii (FK0005) Dyckia lindevaldae (FK0019) Dyckia braunii (FK0042) Dyckia estevesii var. braunii (FK0004) Dyckia leptostachya (FK0053) Dyckia estevesii (FK0033) Dyckia pumila (FK0093) Dyckia remotiflora var. indet. (FK0015) Dyckia aff. pumila (FK0017) Dyckia aff. leptostachya (FK0035) Dyckia aff. leptostachya (FK0016) Dyckia rariflora (FK0039) Dyckia aff. brevifolia (FK0010) Dyckia hebdingii (FK0013) Dyckia remotiflora var. indet. (FK0011) Dyckia hebdingii (FK0038) Dyckia tobatiensis (FK0018) Dyckia spec. (FK0049) Dyckia niederleinii (FK0110) Dyckia ferox (FK0020) Dyckia ferox (FK0056) Dyckia vestita (FK0109) Dyckia brachyphylla (FK0045) Dyckia beateae (FK0044) Dyckia goehringii (FK0031) Dyckia oligantha var. oligantha (FK0036) Dyckia brevifolia (FK0067) Dyckia estevesii (FK0001) Dyckia cinerea (FK0047) Dyckia dawsonii (FK0043) Dyckia macedoi (FK0099) Dyckia macedoi (FK0100) Dyckia macedoi (FK0101) Dyckia macedoi (FK0102) Dyckia maracasensis (FK0087) Dyckia ursina (FK0089) Dyckia milagrensis (FK0096) Dyckia granmogulensis (FK0007) Deuterocohnia brevispicata (FK0071) Encholirium horridum (FK0070) Encholirium spec. (FK0014) Dyckia beateae (FK0091) Dyckia maritima (FK0092) Dyckia choristaminea (FK0021) Dyckia cf. leptostachya (FK0115) Dyckia spec. (FK0116) Dyckia ferox (FK0027) Dyckia microcalyx (FK0054) Dyckia microcalyx var. indet. (FK0009) Dyckia microcalyx (FK0111) Dyckia cf. microcalyx (FK0051) Dyckia tomentella (FK0114) Dyckia vestita (FK0032) Dyckia marnier-lapostollei var. est. (FK0030) Encholirium erectiflorum (FK0123) Encholirium maximum (FK0124) Encholirium spec. (FK0125) Dyckia pernambucana (FK0098) Dyckia pernambucana (FK0097) Encholirium spec. (FK0079) Encholirium spec. (FK0080) Encholirium spec. (FK0078) Encholirium magalhaesii (FK0122) Dyckia aff. reitzii (FK0050) Dyckia remotiflora (FK0055) Dyckia niederleinii (FK0103) Dyckia velascana (FK0104) Dyckia velascana (FK0105) Dyckia floribunda (FK0107) Dyckia velascana (FK0006) Dyckia ursina (FK0012) Dyckia spec. (FK0023) Dyckia spec. (FK0024) Dyckia floribunda (FK0108) Dyckia floribunda (FK0052) Dyckia cf. velascana (FK0106) Dyckia encholirioides (FK0095) Dyckia choristaminea (FK0040) Dyckia spec. (FK0086) Dyckia aff. ibiramensis (FK0025) 1,00 1,00 0,97 0,93 0,89 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 0,99 1,00 0,98 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 0,97 1,00 1,00 0,98 1,00 1,00 0,79 1,00 0,71 0,61 0,99 1,00 0,98 0,62 0,98 0,76 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 0,96 0,86 0,71 0,990,84 1,00 0,92 0,92 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 0,50 0,86 0,54 0,93 1,00 1,00 1,00 0,58 0,53 0,70 1,00 1,00 1,00 1,00 0,56 0,92 0,99 0,64 0,93 1,00 0,54 0,92 1,00 1,00 0,67 0,68 0,86 0,58 0,90 0,54 1,00 0,74 1,00 0,96 0,51 1,00 0,87 0,96 0,83 1,00 0,81 1,00 1,00 0,89 0,69 Diskussion DNA-Sequenzen mit den sehr viel variableren cpSSR-Daten zu kombinieren. Da beide Datensätze aus dem Plastom resultieren, sollte dieses Vorgehen legitim sein. Die ausschließlich aus cpSSR-Daten rekonstruierte Phylogenie (Abbildung 31) zeigt deutliche Unterschiede gegenüber den auf Substitutionen in den DNA-Sequenzen basierten Phylogenien (Abbildungen 18-21). Während kleinere Kladen und jüngere Knoten häufig identisch sind, finden sich vor allem bei den tieferen Knoten Widersprüche. Dies ist wahrscheinlich darin begründet, dass der Einfluss der Homoplasie im Laufe der Zeit zunimmt. In älteren Teilen der Phylogenie erreicht der Anteil an Homoplasie unter den cpSSR-Längenpolymorphismen ein kritisches Maß. Gleiche Fragmentlängen sind dann häufig kein Indiz mehr für Verwandtschaft, sondern zufällig entstanden. Somit ist eine Nutzung der 12 cpSSR-Marker als ausschließliche Datenquelle für phylogenetische Studien zwischen Arten der Gattung Dyckia nicht empfehlenswert. Eine Kombination der Daten aus Sequenzierung plastidärer DNA und cpSSR-Analyse resultierte hingegen in einer verbesserten Auflösung insbesondere der terminalen Kladen (Abbildung 32). Ein direkter Vergleich der kombinierten Analyse mit der Phylogenie, die ausschließlich auf Substitutionen beruht, ist in Abbildung 33 gezeigt. Die Zahl der Widersprüche ist gering und das Rückgrat der beiden Phylogenien ist sogar identisch. Die in den cpSSRs enthaltene Homoplasie scheint im kombinierten Baum nur wenig störenden Einfluss zu haben. Eine mögliche Vorgehensweise wäre es, die cpSSR-Daten nur jeweils innerhalb einzelner Kladen zu verwenden und bei der Berechnung des Rückgrates der Phylogenie auszuschließen. Die Zahl an Substitutionen im Plastom von Dyckia ist zur Rekonstruktion hoch aufgelöster Stammbäume offenbar zu gering. Dies resultiert in einem Mangel an Auflösung insbesondere in den jüngeren Teilen der Phylogenie. Im Gegensatz dazu ist die Rate, mit der einzelnen Nukleotidbausteine innerhalb längerer cpSSRs hinzukommen oder verlorengehen, für verlässliche Verwandtschaftsanalysen offenbar zu hoch. Die daraus resultierende Homoplasie führt damit zu Fehleinschätzungen insbesondere im Bereich des Rückgrates der Phylogenie. Die mangelnde Auflösung der Bäume auf Basis plastidärer DNA-Sequenzdaten ist zwar wenig befriedigend, resultiert aber offenbar aus der interessanten Natur und dem jungen Alter der Gattung Dyckia. Durch Homoplasie verursachte Fehler und Unsicherheiten sind dagegen nicht akzeptabel. Deshalb wurde von der weiteren Anwendung der cpSSRs in der vorliegenden Untersuchung abgesehen. 115 Diskussion Mögliche zukünftige Anwendungen Die entwickelten 12 cpSSR-Loci für die Gattung Dyckia stellen gleichwohl wertvolle Werkzeuge für zukünftige Studien auf einem sehr niedrigen taxonomischen Niveau dar, insbesondere auf Populationsebene und bei sehr nahe verwandten Arten. Die Chloroplasten der Dyckia-Arten sind ja offenbar nach einem recht strikten geographischen Muster verteilt (vgl. Abbildung 23). Daher sollten Studien mit cpSSRs in mehr oder weniger eng begrenzten geographischen Arealen gute Aussichten auf Erfolg haben. Eine vergleichbare Arbeit existiert bereits für Populationen von vier Arten von Pitcairnia, die auf engem Raum in der Umgebung von Rio de Janeiro sympatrisch vorkommen (Palma-Silva et al. 2011). 4.2 Phylogenetische Untersuchungen 4.2.1 Erzielte Auflösung der Phylogenien Wie die hier vorgenommenen Analysen zeigen, ist die genetische Variabilität innerhalb der Gattung Dyckia außerordentlich gering, insbesondere für die plastidären Loci. Somit ist auch die erzielte Auflösung der Phylogenien weniger detailliert als bei vielen vergleichbaren Studien. Einzelne und kombinierte plastidäre Datensätze Die mit der vergleichenden Sequenzierung einzelner plastidärer Loci erzielte Auflösung und statistische Stützung ist in vielen Studien insbesondere auf geringem taxonomischem Niveau häufig sehr begrenzt. Insbesondere junge Gruppen, die noch wenig Zeit zur genetischen Differenzierung hatten, und Gruppen, die aus raschen Radiationsereignissen resultieren, erweisen sich hier als schwierig (Dunbar-Co et al. 2008; Antonelli et al. 2010). Aber auch in älteren und vergleichsweise artenarmen Gruppen, wie etwa der im Vergleich zu Dyckia älteren Gattung Fosterella liefern einzelne plastidäre Loci nur selten informative Ergebnisse (Rex 2007). In Fosterella ergab erst die kombinierte Analyse von vier plastidären Loci eine gut aufgelöste Phylogenie mit gestützten Ästen (Rex et al. 2009). Für die artenreiche Unterfamilie der Tillandsioideae konnte nur durch die Kombination von sieben Loci eine Phylogenie mit akzeptabler Auflösung und Unterstützung erzeugt werden (Barfuss et al. 2005). Sogar auf Familienebene kommen für die Bromeliaceae aufwändige Analysen zum Einsatz, etwa mit acht unterschiedlichen Loci bei Givnish et al. (2011). Die gesamte Familie wird häufig als Produkt einer adaptiven Radiation angesehen (Benzing 2000). Durch die Kombination sechs plastidärer Loci konnten auch für Dyckia aussagekräftige Phylogenien rekonstruiert werden, jedoch mit einer teils sehr eingeschränkten Auflösung. Die Ursache dafür ist vermutlich in dem geringen Alter und der raschen Diversifizierung der 116 Diskussion Gattung zu suchen. Somit ist die Natur von Dyckia, welche die Gattung so interessant und erforschenswert macht, verantwortlich für die auf den ersten Blick erschreckend geringe Auflösung. Aufgrund der extremen Armut an variablen Merkmalen erwies sich die Darstellung als phylogenetisches Netzwerk als besonders günstig. Phytochrom C (phy C ) Die im Vergleich zu Sequenzen des Plastoms recht hohe Variabilität von phyC innerhalb von Dyckia ließ zunächst eine ordentliche Auflösung in den phylogenetischen Analysen erwarten. Dies war jedoch nicht der Fall, es zeigte sich eine weitgehend unaufgelöste Polytomie mit nur wenigen kleinen Kladen. Auch ist die statistische Unterstützung von Verzweigungen innerhalb von Dyckia und Encholirium sehr gering, nur wenige Verzweigungen zeigen Posterioriwahrscheinlichkeiten von 0,90 und darüber. Die aus den Bootstrap-Analysen (MPBS und MLBS) resultierenden Werte liegen überwiegend unter 50%. Die selektive Entfernung von Proben mit hoher allelischer Variation resultierte in einer massiven Verbesserung sowohl der Auflösung als auch der statistischen Unterstützung (vgl. Abbildungen 28 und 29). Daraus lässt sich folgern, dass ein Mangel an Variabilität nicht die Hauptursache für die unbefriedigende Auflösung der auf dem kompletten Datensatz beruhenden Bäume ist. Vermutlich würde sich durch Klonierung der PCR-Produkte von Proben mit einem höheren Anteil an heterozygoten Positionen eine halbwegs gut aufgelöste Phylogenie für alle Proben finden lassen. Dieses wäre dann aber keine Phylogenie der Arten (species tree), sondern einer Phylogenie der heute existenten Allele von phyC (gene tree). Teilweise zeigen die beiden im gleichen Individuum von Dyckia gefunden Allele sehr große Unterschiede und würden demzufolge an unterschiedlichen Stellen des Baums stehen. Es ist daher sehr zweifelhaft, ob es einen klar erkennbaren Zusammenhang zwischen der Phylogenie der Allele von phyC und der hypothetischen Phylogenie der sie tragenden Vertreter von Dyckia gibt. Von ausgedehnten Klonierungsexperimenten wurde infolgedessen abgesehen. 4.2.2 Phylogenie auf Basis plastidärer Sequenzen Die durch die Analyse sechs plastidärer Loci gewonnenen Erkenntnisse zur Phylogenie innerhalb der Pitcairnioideae decken sich weitgehend mit den in früheren Arbeiten erzielten Befunden. Die Monophylie der Unterfamilie wurde bisher in praktisch jeder Untersuchung von Sequenzen des Plastoms einschließlich der vorliegenden Studie gezeigt (Terry et al. 1997; Givnish et al. 2004; 2007; 2011; Rex 2007; Rex et al. 2009) und kann als gesichert gelten. 117 Diskussion Verwandtschaft innerhalb der Pitcairnioideae und Monophylie der Gattungen Der Status von Pitcairnia wurde auch in der Vergangenheit nicht restlos aufgeklärt, eine Monophylie kann aber als wahrscheinlich angenommen werden. Eine paraphyletische Gattung Pitcairnia ermittelten Horres et al. (2000) und Rex et al. (2009). In anderen Arbeiten mangelte es an ausreichender Probenzahl oder phylogenetischer Auflösung (z. B. Terry et al. 1997; Crayn et al. 2004). Eine Monophylie von Pitcairnia ermittelten dagegen Givnish et al. (2004; 2007; 2011). Die relativ hohe Probenzahl und die Verwendung acht plastidärer Loci kennzeichnen die Arbeit von Givnish et al. (2011) als die bisher aussagekräftigste Studie. Erste belastbare Ergebnisse einer derzeit im Rahmen einer Doktorarbeit am Institut für Biologie der Universität Kassel laufenden Untersuchung zur Phylogenie von Pitcairnia deuten ebenfalls auf eine monophyletische Abstammung der Plastiden von Pitcairnia hin (Schubert, unveröffentlichte Daten). In dieser Arbeit kristallisiert sich auch die Existenz zweier großer Kladen innerhalb von Pitcairnia heraus. Diese trennten sich wohl bereits kurz nach der Entstehung der Gattung. In der vorliegenden Arbeit zeigte sich Pitcairnia in der Bayes'schen Analyse, der Parsimonieanalyse und der RAxML-Analyse jeweils paraphyletisch mit schlechter statistischer Unterstützung (PP=0,74, MPBS=78%, MLBS=92%). In der BEAST-Analyse mangelt es hier an Auflösung (Abbildungen 18-21). Die beobachtete Monophylie von Fosterella, die Paraphylie von Deuterocohnia sowie die gemeinsame Monophylie der drei xerophytischen Gattungen Deuterocohnia, Encholirium und Dyckia deckt sich mit Ergebnissen früherer Arbeiten (Horres et al. 2000; Crayn et al. 2004; Givnish et al. 2004; 2007; 2011; Rex 2007; Rex et al. 2009; Schütz 2012; Wagner et al. 2012). Status von Encholirium Zum Status von Encholirium existierten in der Literatur bisher keine belastbaren Aussagen. Nur in einer einzigen Arbeit wurde bisher überhaupt mehr als eine Pflanze dieser Gattung untersucht (Givnish et al. 2011). Dort zeigte sich eine Paraphylie der beiden untersuchten Proben, die statistische Unterstützung war aber ausgesprochen schlecht. Die in der vorliegenden Arbeit ermittelten Phylogenien zeigen für nur neun untersuchte Akzessionen von Encholirium drei (Abbildungen 18, 19 und 21) oder vier (Abbildungen 20 und 23) unabhängige paraphyletische Linien. Damit kann ein paraphyletischer Ursprung der Plastiden von Encholirium als gesichert angenommen werden. Verwandtschaftsbeziehungen innerhalb der Gattung Dyckia Ein monophyletischer Ursprung der in Dyckia vorkommenden Plastiden kann derzeit als wahrscheinlich angenommen werden. Allerdings ist insbesondere aufgrund der 118 Diskussion offensichtlichen Nähe zu Encholirium nicht auszuschließen, dass bei Einbeziehung weiterer Akzessionen auch weitere zusätzliche früh abzweigende Linien identifiziert werden. Durch Ereignisse wie incomplete lineage sorting (z. B. Jakob 2005) könnten Plastiden jüngerer Linien auch in Arten von Encholirium gelangt sein, wodurch beide Gattungen jeweils Plastiden paraphyletischen Ursprungs tragen würden. Derzeit sprich jedoch alles für eine Monophylie der Plastiden in Dyckia. Die phylogenetischen Beziehungen der Plastiden innerhalb von Dyckia spiegeln recht genau die geographische Verteilung der sie tragenden Pflanzen wider. Eine detaillierte Hypothese zur Interpretation dieses Musters findet sich unter 4.3.1. Dagegen ist eine jeweils monophyletische Abstammung der in einzelnen Arten vorkommenden Plastiden offenbar keinesfalls die Regel. Vielmehr tragen unterschiedliche Akzessionen ein und derselben Art häufig Plastiden paraphyletischen Ursprungs, die teilweise nur entfernt verwandt sind (vgl. 4.3.5). Die Phylogenie auf Basis plastidärer Sequenzen weist erhebliche Unterschiede zur Phylogenie auf Basis des nukleären Gens phyC auf (Abbildung 34), die in Abschnitt 4.2.3 näher diskutiert werden. Deutliche Unterschiede finden sich ebenfalls im Vergleich mit einer noch unveröffentlichten AFLP-Analyse (Pinangé et al., unveröffentlichte Daten, Abbildung 35). Der in der AFLP- Analyse verwendete Probensatz überschneidet sich mit demjenigen, der für die vorliegende Arbeit eingesetzt wurde. Insgesamt 44 Akzessionen wurden jeweils in beiden Studien untersucht, im übrigen wurden unterschiedliche Proben verwendet. Die auf AFLP-Daten basierte Phylogenie zeigt eine Reihe an Kladen, welche sich nicht mit denen der plastidären Phylogenie aus der vorliegenden Arbeit decken (gekennzeichnet durch kleine Buchstaben an den terminalen Ästen von Abbildung 35). Sowohl ein erheblicher Mangel an Auflösung in der auf AFLP-Daten basierten Phylogenie als auch die unvollständige Überschneidung der Probensätze lassen detaillierte Rückschlüsse an dieser Stelle aber nicht zu. 4.2.3 Phylogenie auf Basis von phyC Die aus der Untersuchung von phyC resultierende Phylogenie zeigt eine Reihe von gravierenden Unterschieden zur Phylogenie der Plastiden (Abbildung 34). Insbesondere ist die Unterfamilie Pitcairnioideae hier paraphyletisch, da auch die beiden untersuchten Vertreter von Puya darin enthalten sind. Verwandtschaft innerhalb der Pitcairnioideae und Monophylie der Gattungen Mit Ausnahme von Encholirium sind alle Gattungen der Pitcairnioideae in allen durchgeführten Analysen auf Basis von phyC monophyletisch mit jeweils sehr hoher 119 Diskussion 120 Abbildung 34: Vergleich der Phylogenien aus plastidären Daten und phyC Gezeigt ist das Ergebnis der Bayes'schen Analyse von phyC (für weitere Informationen siehe Abbildung 28). Die kleinen Buchstaben am rechten Rand indizieren, in welcher Klade der plastidären Phylogenie die jeweilige Probe steht (z: zentralbrasilianisch, s: südbrasilianisch, p: paraguayisch, a: argentinisch, -: zu keiner der vier großen Kladen gehörig). Die Karte oben links zeigt die entsprechenden Verbreitungsgebiete. Falls die entsprechende Akzession zu keiner der vier großen Kladen gehört ist jeweils rechts daneben in Klammern angegeben, mit welcher Klade sich der Fundort der jeweiligen Probe deckt. Die in Dyckia gefundenen Kladen sind mit Buchstaben A-M beschriftet. 0,99 51/59 0,68 -/- 0,68 57/75 0,66 -/- 0,52 -/- 0,82 -/74 0,79 -/- 0,67 -/- 1 64/60 0,66 -/- 0,99 -/75 0,95 63/640,54 -/- 0,64 -/- 0,98 -/62 1 94/95 0,67 -/-0,61 63/650,57 -/- 0,90 -/- 0,56 74/98 0,70 70/- 0,59 -/63 0,83 -/90 Dyckia remotiflora (FK0055) Dyckia niederleinii (FK0103) Dyckia velascana (FK0104) Dyckia velascana (FK0105) Dyckia floribunda (FK0107) Dyckia velascana (FK0006) Dyckia remotiflora (FK0068) Dyckia hebdingii (FK0112) Dyckia maritima (FK0113) Dyckia monticola (FK0088) Dyckia fosteriana (FK0094) Dyckia ferruginea (FK0090) Dyckia marnier-lapostollei var. mar. (FK0029) Dyckia estevesii (FK0005) Dyckia lindevaldae (FK0019) Dyckia braunii (FK0042) Dyckia estevesii var. braunii (FK0004) Dyckia leptostachya (FK0053) Dyckia estevesii (FK0033) Dyckia pumila (FK0093) Dyckia choristaminea (FK0040) Dyckia remotiflora var. indet. (FK0015) Dyckia ursina (FK0012) Dyckia spec. (FK0023) Dyckia spec. (FK0024) Dyckia aff. pumila (FK0017) Dyckia aff. leptostachya (FK0035) Dyckia aff. leptostachya (FK0016) Dyckia floribunda (FK0108) Dyckia floribunda (FK0052) Dyckia spec. (FK0086) Dyckia aff. ibiramensis (FK0025) Dyckia rariflora (FK0039) Dyckia aff. brevifolia (FK0010) Dyckia hebdingii (FK0013) Dyckia cf. velascana (FK0106) Dyckia remotiflora var. indet. (FK0011) Dyckia hebdingii (FK0038) Dyckia tobatiensis (FK0018) Dyckia spec. (FK0049) Dyckia niederleinii (FK0110) Dyckia ferox (FK0020) Dyckia ferox (FK0056) Dyckia vestita (FK0109) Dyckia brachyphylla (FK0045) Dyckia beateae (FK0044) Dyckia goehringii (FK0031) Dyckia saxatilis (FK0036) Dyckia brevifolia (FK0067) Dyckia estevesii (FK0001) Dyckia cinerea (FK0047) Dyckia dawsonii (FK0043) Dyckia macedoi (FK0099) Dyckia macedoi (FK0100) Dyckia macedoi (FK0101) Dyckia macedoi (FK0102) Dyckia maracasensis (FK0087) Dyckia ursina (FK0089) Dyckia milagrensis (FK0096) Dyckia granmogulensis (FK0007) Encholirium horridum (FK0070) Encholirium spec. (FK0014) Dyckia beateae (FK0091) Dyckia maritima (FK0092) Dyckia encholirioides (FK0095) Dyckia choristaminea (FK0021) Dyckia cf. leptostachya (FK0115) Dyckia spec. (FK0116) Dyckia ferox (FK0027) Dyckia microcalyx (FK0054) Dyckia microcalyx var. indet. (FK0009) Dyckia microcalyx (FK0111) Dyckia cf. microcalyx (FK0051) Dyckia tomentella (FK0114) Dyckia vestita (FK0032) Dyckia marnier-lapostollei var. est. (FK0030) Encholirium erectiflorum (FK0123) Encholirium maximum (FK0124) Encholirium spec. (FK0125) Dyckia pernambucana (FK0098) Dyckia pernambucana (FK0097) Encholirium spec. (FK0079) Encholirium spec. (FK0080) Encholirium spec. (FK0078) Encholirium magalhaesii (FK0122) Dyckia aff. reitzii (FK0050) Gen. nov. spec. nov. (FK0257) Dyckia elisabethae (FK0219) Dyckia jonesiana (FK0217) Dyckia densiflora (FK0213) Dyckia platyphylla (FK0209) Dyckia espiritosantensis (FK0207) Dyckia tuberosa (aff.) (FK0206) Dyckia mirandiana (FK0202) Dyckia pulquinenses (FK0199) Dyckia rojasii (FK0195) Dyckia aurea (FK0194) Dyckia lunaris (FK0193) Dyckia secunda (FK0192) Dyckia nana (FK0191) Dyckia paraensis (FK0190) Dyckia machrisiana (FK0189) Dyckia pectinata (FK0188) Dyckia delicata (FK0184) Dyckia grandidentata (FK0183) Dyckia dissitiflora (FK0141) Dyckia distachya (FK0126) 1,0% (z) (z) (z) (z) (s) (z) (s) (a) (z) A B C D E F G H I J K L M z z z z z z z z z z z z z - z a a a a a a a a z z - z z - z - p p p p p p z z z z z s s s p p z z - z - s a s - s s z s z a a z z - p - - s s - - p - p s s z p - p s z z - z - a p p p z s z p p Encholirium z p a s Diskussion 121 Abbildung 35: Vergleich der Phylogenien aus AFLP- und plastidären Daten Gezeigt ist das Ergebnis einer Bayes'schen Analyse von AFLP-Daten diverser Akzessionen von Dyckia und anderen Gattungen der Pitcairnioideae (Pinangé et al., unveröffentlichte Daten). Schwarze Endäste mit Beschriftung verweisen auf Proben, welche auch in der vorliegenden Arbeit untersucht wurden. Graue Äste weisen auf Proben hin, welche für die vorliegende Arbeit nicht untersucht wurden. Dreiecke repräsentieren jeweils mehr als eine Probe, weitere eventuell darin enthaltene Verzweigungen sind nicht gezeigt. Die Buchstaben links der Taxon-Namen indizieren die Gruppenzugehörigkeit in der Analyse plastidärer Sequenzdaten (z: zentralbrasilianisch, s: südbrasilianisch, p: paraguayisch, a: argentinisch, -: zu keiner der vier großen Kladen gehörig). Die Karte oben links zeigt die entsprechenden Verbreitungsgebiete. 0,77 0,85 0,83 0,74 1 0,83 1 0,66 0,90 0,99 0,87 1 1 1 0,90 0,92 0,52 0,52 0,52 0,64 0,79 0,53 0,55 0,54 1 1 0,98 0,85 0,91 0,62 0,72 0,52 0,78 0,67 0,62 0,52 0,75 0,51 0,99 0,71 0,72 0,99 0,98 Dyckia niederleinii (FK0103) Dyckia velascana (FK0104) Dyckia velascana (FK0006) Dyckia estevesii (FK0005) Dyckia lindevaldae (FK0019) Dyckia braunii (FK0042) Dyckia floribunda (FK0108) Dyckia floribunda (FK0052) Dyckia remotiflora var. indet. (FK0011) Dyckia tobatiensis (FK0018) Dyckia ferox (FK0020) Dyckia ferox (FK0056) Dyckia brachyphylla (FK0045) Dyckia brevifolia (FK0067) Dyckia cinerea (FK0047) Dyckia dawsonii (FK0043) Dyckia macedoi (FK0099) Dyckia macedoi (FK0100) Dyckia granmogulensis (FK0007) Dyckia microcalyx (FK0054) Dyckia microcalyx (FK0111) Dyckia tomentella (FK0114) Dyckia vestita (FK0032) Dyckia elisabethae (FK0219) Dyckia jonesiana (FK0217) Dyckia densiflora (FK0213) Dyckia platyphylla (FK0209) Dyckia espiritosantensis (FK0207) Dyckia tuberosa (aff.) (FK0206) Dyckia mirandiana (FK0202) Dyckia pulquinenses (FK0199) Dyckia rojasii (FK0195) Dyckia aurea (FK0194) Dyckia lunaris (FK0193) Dyckia secunda (FK0192) Dyckia nana (FK0191) Dyckia paraensis (FK0190) Dyckia machrisiana (FK0189) Dyckia pectinata (FK0188) Dyckia delicata (FK0184) Dyckia grandidentata (FK0183) Deuterocohnia brevispicata (FK0071) Fosterella villosula (FK0076) Gen. nov. spec. nov. (FK0257) z z z z z z z z z - z s - s p p p p p a a z a a p z - z z z - p z p - z p a z z s Encholirium z p a s Diskussion Unterstützung. Größere Untersuchungen mit weiteren nukleären Genen wurden innerhalb der Pitcairnioideae bisher nur in der Gattung Deuterocohnia durchgeführt (Klein 2012; Schütz 2012). Diese Gattung ist im plastidären Baum paraphyletisch, in einem nukleären Baum auf Basis des Locus PRK hingegen monophyletisch (Schütz 2012). In einer auf dem nukleären Locus rpb2 basierenden Arbeit von Klein (2012) wiederum erwies sich Deuterocohnia als paraphyletisch. Eine Akzession von Deuterocohnia chrysantha bildete die Schwestergruppe zu Dyckia und Encholirium, während die übrigen Akzessionen von Deuterocohnia außerhalb dieser Klade standen. Alle diese Beobachtungen sprechen dafür, dass die gemeinsamen Vorläufer von Dyckia und Encholirium noch lange nach der Abspaltung von Deuterocohnia in sporadischem Austausch von genetischem Material standen (vgl. auch Schütz 2012). Ein unerwarteter Unterschied zur plastidären Phylogenie findet sich bei der Stellung von Deuterocohnia innerhalb der Unterfamilie Pitcairnioideae. Diese Gattung findet sich in allen für phyC durchgeführten Analysen in Schwestergruppenposition zu Fosterella, die statistische Unterstützung ist allerdings jeweils schwach. Dies steht in deutlichem Widerspruch zu ökophysiologischen und morphologischen Merkmalen. So sprechen vor allem die Ausprägung der CAM-Photosynthese und der stark xerophytische Charakter von Deuterocohnia, Encholirium und Dyckia für eine gemeinsame Monophylie dieser drei Gattungen (vgl. auch 4.2.4). Die geringe genetische Distanz der in Deuterocohnia und Fosterella gefundenen Allele von phyC ist möglicherweise auf Ereignisse wie incomplete lineage sorting oder Introgression zurückzuführen, die tatsächlichen Verwandtschaftsverhältnisse der kompletten Genome spiegeln sich hier vermutlich nicht wider. Offenbar sind die Phylogenien unterschiedlicher nukleärer Loci innerhalb der Pitcairnioideae generell widersprüchlich. Für den Locus rpb2 etwa zeigt sich ein klares gemeinsames Monophylum von Fosterella und Pitcairnia (Klein 2012). Dies steht im Widerspruch zu den Phylogenien sowohl auf Basis von phyC, als auch auf Basis plastidärer Loci. In Anbetracht des gemeinsamen mesophytischen Charakters der beiden Gattungen erscheint diese Beobachtung jedoch durchaus plausibel. Stellung von Puya Der gravierendste Unterschied zu allen bisherigen Erkenntnissen ist die gut gestützte Stellung der in Puya gefundenen Allele von phyC inmitten derer der Pitcairnioideae (vgl. Abbildungen 26-28). Zum einen wirft dieser Umstand die Frage auf, ob sich einzelne besonders variable nukleäre Loci überhaupt für Studien auf diesem taxonomischen Niveau 122 Diskussion eignen. Insbesondere der Verzicht auf eine Klonierung der PCR-Produkte kann hier offenbar negative Einflüsse haben (z. B. Samuel et al. 2005). Über die relative Stellung von Puyoideae und Pitcairnioideae in nukleären Phylogenien können aus anderen Arbeiten kaum Erkenntnisse gezogen werden, da in keine der bisherigen Studien genügend Proben aus beiden Unterfamilien einbezogen wurden. Klein (2012) rekonstruierte eine Phylogenie der Pitcairnioideae auf Basis eines kurzen Abschnitts des PRK-Gens und fand ebenfalls eine Stellung der sieben untersuchten Akzessionen von Puya innerhalb der Pitcairnioideae, wenngleich ohne statistische Unterstützung. In der auf phyC basierenden Arbeit von Jabaily & Sytsma (2010) wiederum bilden Puyoideae und Bromelioideae ein Monophylum, es wurden aber lediglich zwei Akzessionen von Pitcairnia analysiert. Zur Aufklärung dieser Problematik ist eine Sequenzierung mehrerer unabhängiger nukleärer Loci für Vertreter der gesamten Bromeliaceae wünschenswert. Die plastidäre Phylogenie von Givnish et al. (2011) legt nahe, dass sich die drei Unterfamilien Pitcairnioideae, Puyoideae und Bromelioideae innerhalb eines sehr kurzen Zeitraums voneinander trennten. Auch Jabaily & Sytsma (2010) verweisen auf die kurzen Astlängen in denjenigen Bereichen der Phylogenie, wo sich die ersten Linien innerhalb der Puyoideae und Bromelioideae voneinander trennen. Die Phylogenie der Plastiden der Pitcairnioideae zeigt für die Trennung von Pitcairnia vom Rest der Unterfamilie und die Entstehung der beiden großen Kladen dieser Gattung ein ähnliches Bild (vgl. auch 4.2.2). Es ist demnach durchaus wahrscheinlich, dass auch einige Zeit nach der Trennung der drei Linien Pitcairnioideae, Puyoideae und Bromelioideae noch gelegentlich genetisches Material zwischen Vertretern dieser Unterfamilien ausgetauscht wurde (vgl. auch 4.3.5). Wie bei Deuterocohnia könnten auch hier Plastiden und Allele einzelner nukleärer Gene durch Introgression in andere Linien gelangt sein. Je nachdem, wie intensiv dieser Austausch war, könnte eine ganze Reihe an unabhängigen Loci nötig sein, um hier zuverlässige Hypothesen aufzustellen. Status von Encholirium Trotz der geringen Auflösung kann Encholirium für den Locus phyC als klar paraphyletisch bezeichnet werden. In der Bayes'schen Analyse stützen insgesamt drei interne Äste mit Posterioriwahrscheinlichkeiten von 0,59, 0,83 und 0,90 diese Aussage (Abbildung 28). Eine Paraphylie von Encholirium findet sich auch an allen anderen bisher untersuchten nukleären Loci, wie etwa PRK (Schütz 2012) und rpb2 (Klein 2012). Verwandtschaftsbeziehungen innerhalb der Gattung Dyckia Die durch die Bayes'sche Analyse von phyC erzielte Auflösung innerhalb von Dyckia ist sehr gering (Abbildungen 28 und 34). In einer großen Polytomie finden sich 13 meist kleine 123 Diskussion Kladen (A-M in Abbildung 34), 28 einzelne Proben von Dyckia und fünf von Encholirium. Keine der größeren Kladen der plastidären Phylogenie taucht hier auf (vgl. die Buchstaben an den terminalen Ästen in Abbildung 34). Andererseits stehen einige der bei der Analyse von phyC gefundenen Kladen in einem gewissen Einklang mit den Ergebnissen der Untersuchung plastidärer DNA. So enthalten die phyC-Kladen A, C, E und K jeweils nur Pflanzen aus der zentralbrasilianischen cpDNA-Klade oder wenigstens aus dem Verbreitungsgebiet der zentralbrasilianischen cpDNA-Klade. Die phyC-Klade B enthält acht der 12 Akzessionen der argentinischen cpDNA-Klade. Die phyC-Klade D enthält sechs der 18 Akzessionen der paraguayischen cpDNA-Klade. Die phyC-Klade F ist praktisch nicht gestützt, enthält aber eine gut gesicherte Subklade mit drei weiteren Akzessionen der cpDNA-paraguayischen Klade. Die phyC-Kladen G, H, I, J und L enthalten jeweils Akzessionen, die zu unterschiedlichen cpDNA-Kladen gehören. Der Mangel an Auflösung und statistischer Unterstützung der auf phyC basierten Phylogenie macht es unmöglich, gesicherte Hypothesen über verwandtschaftliche Beziehungen zwischen den untersuchten Pflanzen von Dyckia aufzustellen. Es ist nicht auszuschließen, dass bei verbesserter Auflösung etwa durch Sequenzierung weiterer Teile des phyC-Gens einige der schlecht gestützten Widersprüche verschwinden. Andererseits finden sich aber auch in den wenigen sehr gut gestützten Verzweigungen der auf phyC basierten Phylogenie deutliche Widersprüche zur Phylogenie der Plastiden. Als Beispiel kann hier die enge Beziehung von D. cinerea und D. aurea innerhalb der phyC-Klade A genannt werden. Diese beiden Arten sind in der plastidären Phylogenie klar voneinander getrennt. Noch deutlicher ist der Widerspruch bezüglich der Stellung von D. remotiflora (FK0055), deren Plastiden eindeutig der argentinischen cpDNA-Klade zuzuordnen sind. In der auf phyC basierten Phylogenie findet sich diese Pflanze hingegen gemeinsam mit zwei südbrasilianischen Vertretern in phyC-Klade H. Abschließend lässt sich festhalten, dass aus der hier vorgenommenen Analyse des nukleären Gens phyC eine Phylogenie resultiert, die innerhalb von Dyckia extrem schlecht aufgelöst ist. Zwar finden sich eine Reihe an Parallelen zur plastidären Phylogenie, aber auch zahlreich teils gut gestützte Widersprüche. Auch die ungewöhnlich hohe allelische Variation und die dadurch häufig vorkommenden heterozygoten Alignmentpositionen schränken die Möglichkeiten zur Interpretation der Topologie der gefundenen Phylogenie erheblich ein. Jedenfalls sprechen die Daten dafür, dass in Dyckia ein reger Austausch von genetischem Material auch nach der Trennung einzelner Arten erfolgt (vgl. 4.3.5). 124 Diskussion 4.2.4 Schlussfolgerungen zur Phylogenie von Dyckia und Encholirium Monophylie der der xerophytischen Klade aus Dyckia , Encholirium und Deuterocohnia Innerhalb der Pitcairnioideae zeichnen sich die drei Gattungen Deuterocohnia, Encholirium und Dyckia durch eine Reihe an Synapomorphien gegenüber den überwiegend mesophytischen Gattungen Fosterella und Pitcairnia aus. Dazu zählen die in parallelen Reihen angeordneten Trichome der Blätter und deren ausgedehnte Überlappung, die Präsenz internen Wasserspeichergewebes im Chlorenchym sowie das Fehlen einer Differenzierung in Schwamm- und Palisadenparenchym (Givnish et al. 2007). Ein weiteres wichtiges Merkmal stellt der CAM-Photosyntheseweg dar, der als synapomorph für die drei xerophytischen Gattungen gilt (z. B. Crayn et al. 2004). Auch rein habituell unterscheiden sich die Vertreter von Deuterocohnia, Encholirium und Dyckia durch ihre xeromorphen Anpassungen deutlich von den Vertretern der beiden mesophytischen Gattungen. Dazu zählen insbesondere robuste, meist stark sukkulente Blätter mit mehr oder weniger stark bewehrten Rändern. Schließlich kann auch die ausgeprägte Tendenz zur vegetativen Vermehrung über die Bildung von Kolonien und Polstern hier angeführt werden. Trotz der für phyC beobachteten Nähe von Deuterocohnia zu Fosterella ist eine gemeinsame Monophylie der drei xerophytischen Gattungen als xerophytische Klade wohl sehr wahrscheinlich. Aus den Untersuchungen auf Basis von PRK (Schütz 2012) und rpb2 (Klein 2012) lässt sich aufgrund zu geringer Probenzahl und Auflösung keine fundierte Aussage hierzu ableiten. In Zukunft besonders interessant könnte eine genauere Untersuchung der in der vorliegenden Arbeit als Gen. nov. spec. nov. bezeichneten Pflanze mit der DNA-Nummer FK0257 sein. Sowohl in der plastidären als auch in der aus phyC basierten Phylogenie steht diese Pflanze inmitten von Encholirium. Morphologisch ähnelt sie aber eher Arten von Deuterocohnia (Wanderley, persönliche Mitteilung). In einer noch unveröffentlichten AFLP- Analyse steht diese Pflanze ganz außerhalb der xerophytischen Klade (Pinangé et al., unveröffentlichte Daten, siehe auch Abbildung 35). Hier stellt sich allerdings die Frage, inwieweit sich hoch sensible Marker wie AFLPs für die Aufklärung verwandtschaftlicher Beziehungen zwischen Gattungen eignen. Gemeinsame Monophylie von Dyckia und Encholirium Die drei Gattungen der xerophytischen Klade lassen sich durch eine Reihe von Merkmalen voneinander differenzieren. Als plesiomorphe Zustände können terminale, nicht verholzende und einjährige Infloreszenzen, das Fehlen von Petalenanhängseln sowie nicht verwachsene Filamente angesehen werden. Diese Merkmalszustände sind auch typisch für die Arten von Fosterella und Pitcairnia (z. B. Smith & Downs 1974). Als Synapomorphien für 125 Diskussion Deuterocohnia gelten die verholzende mehrjährige Infloreszenz und die eine einzelne Schuppe tragenden Petalenanhängsel. Auf Deuterocohnia beschränkt, aber nicht in allen Arten vorkommend ist außerdem die ausgeprägte Polsterbildung der ehemals zur Gattung Abromeitiella gezählten Arten (Schütz 2012). Ein synapomorphes Merkmal der gemeinsamen Klade aus Encholirium und Dyckia wurde bisher nicht beschrieben, in den gängigen Schlüsseln zu den Gattungen der Bromeliaceae war eine solche Abgrenzung aber auch nie nötig (Smith 1967; Smith & Downs 1974; Robinson & Taylor 1999). Die Abgrenzung zu Deuterocohnia erfolgt daher durch die Präsenz der für die gesamte xerophytische Klade synapomorphen Merkmalsausprägungen in Verbindung mit der Abwesenheit der für Deuterocohnia spezifischen Eigenschaften. Alle bisher durchgeführten molekularen Studien auf Basis plastidärer und nukleärer DNA-Sequenzen inklusive der vorliegenden Untersuchung bestätigen den gemeinsamen monophyletischen Ursprung von Encholirium und Dyckia (Givnish et al. 2004; 2007; 2011; Rex et al. 2009; Klein 2012; Schütz 2012). Das gleiche gilt für die Analyse von AFLP-Daten (Pinangé et al., unveröffentlichte Daten, Abbildung 35). Es gibt daher derzeit keine Veranlassung, die gemeinsame Monophylie der beiden Gattungen anzuzweifeln. Paraphylie von Encholirium In den molekularen Untersuchungen von Givnish et al. (2011) waren nur zwei Arten von Encholirium einbezogen, gleichwohl deutete sich bereits eine Paraphylie der Gattung mit zwei unabhängigen plastidären Linien an. Auch in der vorliegenden Arbeit sind die Plastiden der Gattung Encholirium deutlich paraphyletisch. So zeigen die Phylogenien für nur neun untersuchte Akzessionen von Encholirium je nach Analysemethode drei (Abbildungen 18, 19 und 21) oder vier (Abbildungen 20 und 23) unabhängige paraphyletische Linien. Auch für die in Encholirium gefundenen Allele des nukleären Gens phyC konnte ein paraphyletischer Ursprung deutlich gezeigt werden (Abbildungen 26-28). Ebenfalls paraphyletisch zeigte sich Encholirium bei der Sequenzanalyse der nukleären Gene rpb2 (Klein 2012) und PRK (Klein 2012; Schütz 2012) sowie in einer AFLP-Analyse (Pinangé et al., unveröffentlichte Daten). Bei nur vier untersuchten Proben zeigen sich in der AFLP-Studie drei unabhängige Linien, die durch zwei sehr gut gestützte interne Äste voneinander getrennt sind (Abbildung 35). Unter Berücksichtigung all dieser molekularen Befunde muss die Gattung Encholirium nach dem derzeitigen Kenntnisstand als paraphyletisch angesehen werden. Diese Paraphylie wird auch von der Ausprägung morphologischer Merkmale nahe gelegt (Forzza 2001). So wurde bisher kein einziges morphologisches oder anderweitiges Merkmal beschrieben, das für Encholirium einen eindeutig synapomorphen Zustand aufweisen würde. Dagegen existiert mit E. heloisae ein morphologisches Intermediat zwischen den übrigen Vertretern von 126 Diskussion Encholirium und allen Arten von Dyckia (siehe auch 1.2.1). Bezeichnenderweise wurde E. heloisae ursprünglich als Dyckia heloisae beschrieben und auch erst kürzlich zu Encholirium gestellt (Forzza & Wanderley 1998; Forzza 2005). Die Gattung Encholirium wird demnach lediglich durch Symplesiomorphien definiert, wie etwa die nicht miteinander verwachsenen Filamente. Das im Vergleich zu Dyckia offensichtlichere Merkmal der terminalen Infloreszenz kann eben nicht angeführt werden, da letztere auch in E. heloisae auftritt. Der Umstand, dass sich die laterale Infloreszenz innerhalb der Gattung Encholirium entwickelte, ist ein weiterer deutlicher Hinweis auf eine abgeleitete Stellung von Dyckia innerhalb von Encholirium. Die Prinzipien der kladistischen Systematik verlangen monophyletische Taxa. Legt man sie streng aus, dann ist Encholirium als eigene Gattung nicht akzeptabel. Vielmehr müssten alle derzeit in Encholirium und Dyckia enthaltenen Arten gemeinsam in Dyckia gestellt werden. Zwar wurden beide Gattungen zeitgleich publiziert, (Schultes & Schultes 1830), womit die einfache Prioritätsregel der biologischen Nomenklatur nicht greift (McNeill 2006). Da jedoch Baker (1889) die beiden Gattungen erstmals vereinte und dabei den Gattungsnamen Dyckia wählte, hat dieser Name Priorität (Artikel 11.5 in McNeill 2006). Die vermutliche Paraphylie von Encholirium und die damit verbundenen notwendigen taxonomischen Konsequenzen wurden bereits zuvor von Forzza (2001) diskutiert. Eine Vereinigung mit Dyckia wurde bisher aber nicht durchgeführt und von zukünftigen Studien abhängig gemacht (Forzza 2005). Eine offizielle Zusammenfassung der beiden Gattungen wäre zum derzeitigen Zeitpunkt vermutlich immer noch verfrüht und würde zu Kontroversen führen. Hier kann insbesondere die mangelnde Berücksichtigung der morphologisch intermediären E. heloisae sowie der geographisch isolierten E. lymanianum als problematisch gesehen werden. Obwohl Encholirium nicht durch synapomorphe Merkmalsausprägungen definiert werden kann, sind ihre Vertreter in der Praxis recht gut als Encholirium zugehörig zu erkennen. Zukünftige phylogenetische Untersuchungen unter Einbeziehung zusätzlicher Arten insbesondere von Encholirium und unabhängiger nukleärer Marker könnten eine Vereinigung der beiden Gattungen aber sinnvoll machen. Monophylie von Dyckia Für Dyckia stellt die Verwachsung der Filamente sowohl mit den Petalen als auch untereinander die einzige derzeit beschriebene Synapomorphie dar. Die für Dyckia typischen lateralen Infloreszenzen können nicht als Synapomorphie bezeichnet werden, da sie auch bei Encholirium heloisae auftreten. Die von Robinson & Taylor (1999) angeführten löffelförmigen Petalen stellen keinen uniformen Zustand innerhalb der Gattung dar und die 127 Diskussion Eingrenzung der Farbe der Petalen in selbiger Arbeit auf gelb oder orange kann nur als falsch bezeichnet werden (siehe 1.2.1). Eine Reihe von Merkmalsausprägungen sind innerhalb der xerophytischen Klade auf Dyckia beschränkt, kommen aber bei weitem nicht bei allen Arten dieser Gattung vor. Darunter fallen beispielsweise die roten oder orangefarbenen Kronblätter vieler Dyckia-Arten. Derzeit gibt es keinerlei Indizien, eine monophyletische Abstammung aller Arten von Dyckia anzuzweifeln. Auch Forzza (2001) beschreibt Dyckia auf Basis morphologischer Studien als monophyletisch. Eine Monophylie von Dyckia wird durch die vergleichende Sequenzierung plastidärer Sequenzen im Rahmen der vorliegenden Arbeit klar gestützt. Die auf phyC basierende Phylogenie kann mangels Auflösung zur Klärung dieser Frage nicht herangezogen werden. Ebenfalls deutlich monophyletisch zeigen sich die jeweils untersuchten Vertreter von Dyckia in zwei Studien des nukleären Locus PRK (Klein 2012; Schütz 2012). Die Sequenzierung des nukleären Locus rpb2 zeigte keine ausreichende Auflösung. Auch die Ergebnisse der AFLP-Analyse sprechen deutlich für eine monophyletische Gattung Dyckia (Pinangé et al., unveröffentlichte Daten, Abbildung 35). Alle derzeit verfügbaren Erkenntnisse auf Basis morphologischer und molekularer Merkmale sprechen damit für eine Monophylie von Dyckia. Die verwandtschaftliche Nähe und mangelnde räumliche Trennung zu Encholirium macht einen zumindest sporadischen Austausch von genetischem Material zwischen den beiden Gattungen aber durchaus wahrscheinlich. Auch wenn hypothetische F1-Hybride vermutlich nicht genügend konkurrenzfähig sind, um stabile Hybridpopulationen zu etablieren, könnten bei Rückkreuzung mit einem der Eltern Plastiden oder nukleäre Gene durch Introgression in eine andere Linie gelangen. 4.2.5 Phylogenie und Merkmalsevolution innerhalb von Dyckia Verwandtschaftsverhältnisse innerhalb von Dyckia Wie bereits in vorhergegangen Kapiteln näher erläutert wurde, lassen sich die Verwandtschaftsverhältnisse innerhalb von Dyckia durch die vergleichende Sequenzierung sechs plastidärer Loci und des nukleären Locus phyC nicht erschöpfend rekonstruieren. Während zur historischen Biogeographie der Gattung Dyckia und ihrer plastidären Evolutionslinien gleichwohl interessante Schlüsse gezogen werden können, bieten die bisherigen Erkenntnisse für eine detaillierte Diskussion der Beziehung zwischen den einzelnen Arten keine solide Basis. Problematisch sind sowohl der Mangel an Auflösung als auch die Gruppierung verschiedener Akzessionen einzelner Arten in unterschiedlichen Kladen (vgl. 4.3.5). 128 Diskussion Nichtsdestotrotz bieten wenigstens die gut gestützten Kladen aus der Analyse plastidärer Sequenzen einen Ansatzpunkt für die Evaluation morphologischer Merkmale. Durch Kartierung der Zustände von Merkmalen mit möglicher systematischer Relevanz auf die Phylogenie können Zusammenhänge zwischen der Verwandtschaft der Plastiden und gemeinsamen Merkmalszuständen einzelner Kladen aufgedeckt werden (z. B. Rex et al. 2009). Die Ergebnisse der Kartierung einiger auffälliger Merkmale auf die plastidäre Phylogenie sind in Abbildung 36 dargestellt. Aufgrund der hohen allelischen Variation innerhalb einzelner Pflanzen und der ausgesprochen schlechten statistischen Unterstützung der gefundenen Kladen wurde für die auf phyC basierte Phylogenie von einer Kartierung abgesehen. Evolution der Farbe der Petalen innerhalb von Dyckia Typisch für einen großen Teil der Dyckia-Arten sind leuchtend orangefarbene oder rote Petalen. Dies stellt einen deutlichen Unterschied zu Encholirium dar, deren Arten vorwiegend grünliche und gelbe Farben aufweisen (siehe auch 1.2.1 und 4.2.4). Allerdings kommen rote Petalen auch in einzelnen anderen Arten der Pitcairnioideae vor, wie etwa in Deuterocohnia lotteae, Fosterella spectabilis und in zahlreichen Arten von Pitcairnia. Die Fähigkeit zur Synthese roter Pigmente in den Petalen könnte daher innerhalb der Unterfamilie als plesiomorpher Zustand angesehen werden. Nichtsdestotrotz stellen die auffälligen Blüten von Dyckia und die damit verbundene Bestäubung durch Kolibris vermutlich ein wichtiges Schlüsselmerkmal dar. Der Vergleich zwischen der plastidären Phylogenie und der Blütenfarbe der untersuchten Pflanzen von Dyckia zeigt kein klares Muster (Abbildung 36). In allen vier großen Kladen kommen jeweils sowohl gelbe auch als orangefarbene Petalen vor. Die beiden untersuchten Pflanzen mit braunen Petalen gruppieren in unterschiedliche Kladen. Analoges gilt für die beiden Pflanzen mit grünlichen Petalen. Deutlich rote Petalen kommen ausschließlich in der zentralbrasilianischen Klade vor sowie in zwei Pflanzen, die außerhalb der großen Kladen stehen. Zusätzlich ist zu bemerken, dass die rote Petalenfarbe nicht immer für alle Individuen der betreffenden Art zutrifft. So kommen in Dyckia tuberosa neben roten Petalen auch orangefarbene vor, und in D. encholirioides und D. aff reitzii sind neben roten Petalen auch gelbe Petalen zu finden. Hier zeigen sich also jeweils zwei unterschiedliche Merkmalszustände in ein und derselben Art. Die beiden zuerst abzweigenden und vermutlich ursprünglichsten untersuchten Vertreter von Dyckia weisen jeweils orangefarbene Petalen auf. 129 Diskussion 130 Abbildung 36: Merkmalskartierung auf die plastidäre Phylogenie Der gezeigte phylogenetische Baum entspricht dem aus der BEAST-Analyse (Abbildung 18). Die linke Spalte farbiger Rechtecke repräsentiert die Farbe der Petalen (braun, rot, orange, gelb, gelbgrün). In einigen Fällen ist die Farbe innerartlich variabel, hier sind beide Zustände angegeben. In der rechten Spalte farbiger Rechtecke ist die Höhe über dem Meeresspiegel kodiert (grün: 0-599-m, gelb: 600-1.199, orange: 1.200-3.000 m). Zahlen ohne Klammern stammen aus individuellen Fundortangaben, Werte in Klammern aus Literaturquellen, Fragezeichen und fehlende Rechtecke verweisen auf mangelnde Daten. Die Karte oben links zeigt die Verbreitungsgebiete der markierten Kladen ( z: zentralbrasilianisch, s: südbrasilianisch, p: paraguayisch, a: argentinisch). Dyckia remotiflora (FK0055) Dyckia niederleinii (FK0103) Dyckia velascana (FK0104) Dyckia velascana (FK0105) Dyckia floribunda (FK0107) Dyckia velascana (FK0006) Dyckia remotiflora (FK0068) Dyckia hebdingii (FK0112) Dyckia maritima (FK0113) Dyckia monticola (FK0088) Dyckia fosteriana (FK0094) Dyckia ferruginea (FK0090) Dyckia marnier-lapostollei var. mar. (FK0029) Dyckia estevesii (FK0005) Dyckia lindevaldae (FK0019) Dyckia braunii (FK0042) Dyckia estevesii var. braunii (FK0004) Dyckia leptostachya (FK0053) Dyckia estevesii (FK0033) Dyckia pumila (FK0093) Dyckia choristaminea (FK0040) Dyckia remotiflora var. indet. (FK0015) Dyckia ursina (FK0012) Dyckia spec. (FK0023) Dyckia spec. (FK0024) Dyckia aff. pumila (FK0017) Dyckia aff. leptostachya (FK0035) Dyckia aff. leptostachya (FK0016) Dyckia floribunda (FK0108) Dyckia floribunda (FK0052) Dyckia spec. (FK0086) Dyckia aff. ibiramensis (FK0025) Dyckia rariflora (FK0039) Dyckia aff. brevifolia (FK0010) Dyckia hebdingii (FK0013) Dyckia cf. velascana (FK0106) Dyckia remotiflora var. indet. (FK0011) Dyckia hebdingii (FK0038) Dyckia tobatiensis (FK0018) Dyckia spec. (FK0049) Dyckia niederleinii (FK0110) Dyckia ferox (FK0020) Dyckia ferox (FK0056) Dyckia vestita (FK0109) Dyckia brachyphylla (FK0045) Dyckia beateae (FK0044) Dyckia goehringii (FK0031) Dyckia saxatilis (FK0036) Dyckia brevifolia (FK0067) Dyckia estevesii (FK0001) Dyckia cinerea (FK0047) Dyckia dawsonii (FK0043) Dyckia macedoi (FK0099) Dyckia macedoi (FK0100) Dyckia macedoi (FK0101) Dyckia macedoi (FK0102) Dyckia maracasensis (FK0087) Dyckia ursina (FK0089) Dyckia milagrensis (FK0096) Dyckia granmogulensis (FK0007) Dyckia beateae (FK0091) Dyckia maritima (FK0092) Dyckia encholirioides (FK0095) Dyckia choristaminea (FK0021) Dyckia cf. leptostachya (FK0115) Dyckia spec. (FK0116) Dyckia ferox (FK0027) Dyckia microcalyx (FK0054) Dyckia microcalyx var. indet. (FK0009) Dyckia microcalyx (FK0111) Dyckia cf. microcalyx (FK0051) Dyckia tomentella (FK0114) Dyckia vestita (FK0032) Dyckia marnier-lapostollei var. est. (FK0030) Dyckia pernambucana (FK0098) Dyckia pernambucana (FK0097) Dyckia aff. reitzii (FK0050) Dyckia elisabethae (FK0219) Dyckia jonesiana (FK0217) Dyckia densiflora (FK0213) Dyckia platyphylla (FK0209) Dyckia espiritosantensis (FK0207) Dyckia tuberosa (aff.) (FK0206) Dyckia mirandiana (FK0202) Dyckia pulquinenses (FK0199) Dyckia rojasii (FK0195) Dyckia aurea (FK0194) Dyckia lunaris (FK0193) Dyckia secunda (FK0192) Dyckia nana (FK0191) Dyckia paraensis (FK0190) Dyckia machrisiana (FK0189) Dyckia pectinata (FK0188) Dyckia delicata (FK0184) Dyckia grandidentata (FK0183) Dyckia dissitiflora (FK0141) Dyckia distachya (FK0126) 0,52 -/620,68 -/- 1 98/100 1 89/87 0,95 -/- 1 62/92 1 68/96 1 56/94 0,99 62/83 0,99 -/51 1 74/78 0,60 -/- 0,99 63/63 0,98 64/61 1 62/- 1 77/86 1 85/930,99 59/58 0,98 -/- 1 65/80 0,98 53/- 0,99 -/- 1 93/94 0,99 64/67 0,90 67/69 1 63/82 0,99 -/52 1 88/95 1 62/92 0,99 -/65 1 63/80 0,99 51/56 0,99 -/- 1 85/87 0,50 -/78 1 -/55 1 85/87 1 61/770,52 -/-1 -/- 1 99/100 1 93/95 1 97/96 900 1004 900 748 1060 1040 1288 858 858 837 837 1145 1100 711 1166 791 1190 813 557 1016 1300 88 500 500 500 500 165 450 984 245 92 200 610 1015 1190 1000 580 700 1200 1183 1256 678 800 550 680 381 92 116 949 196 900 (80) (80) ? (1950) (1070-1200) ? (800-1200) (<500) ? ? ? (1400) ? ? (793) ? (1400) (30-400) (350) ? (<600) ? (10-800) (1700-1900) (<100) ? (<100) (30-50) (950) (<100) (<100) ? (1000) ? (1100-1400) (<600) (750-3000) (750-3000) (240) (<100) (600) (400-500) ? ? ? ? a s p z PF Höhe z p a s Diskussion Unter der Annahme, dass die Phylogenie der Plastiden von Dyckia zumindest annähernd die Phylogenie der Arten repräsentiert, besitzt das Merkmal der Blütenfarbe keine systematische Relevanz auf der betrachteten Ebene. Auch das Verzweigungsmuster der Infloreszenz und die relative Länge der Staubblätter im Vergleich zur gesamten Blüte zeigen keinen ersichtlichen Zusammenhang mit der plastidären Phylogenie (hier nicht gezeigt, vgl. Krapp 2009). Zusammenhänge zwischen der Höhenverbreitung und der Phylogenie Vertreter von Dyckia kommen in Höhen vom Meeresspiegel bis hinauf auf 3.000 m vor. Allerdings wachsen die meisten Arten im Tiefland und Höhen über 2.000 m werden nur selten erreicht (Smith & Downs 1974). Die Arten von Encholirium sind in Hinsicht auf ihre Höhenverbreitung sehr viel weniger variabel. Lediglich zwei Arten, E. horridum und E. spectabile kommen unterhalb von 600 m vor, als maximale Höhe gibt Forzza (2005) 1.480 m für E. vogelii an. Die Fähigkeit zum Leben in besonders geringen oder großen Höhen scheint daher erst innerhalb von Dyckia entstanden zu sein, wobei bisher unklar ist, welche Faktoren und möglichen Schlüsselmerkmale hier eine Rolle spielen. Auch innerhalb von Dyckia gibt es zwischen der plastidären Phylogenie und der Höhenverbreitung der untersuchten Pflanzen einige Zusammenhänge (Abbildung 36). So wachsen die Vertreter der paraguayischen Klade fast ausschließlich unterhalb von 600 m Höhe. Lediglich D. pulquinensis, die Schwestergruppe aller anderen Vertreter dieser Klade, kommt in einer selbst für Dyckia außergewöhnlich großen Höhe von 1.700 m und darüber vor. Innerhalb der südbrasilianischen Klade wachsen alle diejenigen Pflanzen, die auch tatsächlich aus den drei südlichsten Bundesstaaten Brasiliens stammen unter 100 m Höhe und bilden eine gut gestützte Subklade. Die beiden anderen Subkladen der südbrasilianischen Klade enthalten dagegen Pflanzen, die aus weiter nördlich gelegenen Regionen stammen und in 1.000-1.200 m Höhe wachsen. In der zentralbrasilianischen und der argentinischen Klade dominieren jeweils Pflanzen, die oberhalb von 600 m wachsen, zumeist in Höhen von 800-1.000 m. Von den Pflanzen, die keiner der vier großen Kladen von Core-Dyckia angehören, wachsen fünf unterhalb von 600 m. Eine der beiden Pflanzen, die den zentralen Haplotypen des cpDNA Netzwerkes trägt (vgl. Abbildung 23) wurde in 949 m Höhe gefunden. Von den beiden innerhalb von Dyckia zuerst abzweigenden kleinen Linien stammt D. espiritosantensis aus 196 m im Tiefland, D. beateae aus 900 m Höhe. Diese Zusammenhänge zwischen Phylogenie und Höhe der Standorte stehen grob im Einklang mit der in 4.3.1 aufgestellten Hypothese zur historischen Biogeographie. Demnach migrierten die Vorläufer von Core-Dyckia nach der Trennung von Encholirium in die tieferen 131 Diskussion Regionen des südlichen Brasiliens. Dabei ist für die frühen Vorläufer eine Anpassung an mittlere Höhen wie bei Encholirium anzunehmen, wie sie in der zuerst abzweigenden Linie beobachtet wurde. Danach entwickelten sich die für das Leben im Tiefland nötigen Errungenschaften und die Radiation von Core-Dyckia begann. Dies spiegelt sich darin wieder, dass sowohl die Schwestergruppe von Core-Dyckia als auch sieben der 10 Linien innerhalb von Core-Dyckia Bewohner tiefer gelegener Regionen sind. Somit lebten die ursprünglichen Vertreter von Dyckia im Hochland, die ursprünglichen Vertreter von Core- Dyckia dagegen im Tiefland. Generelle Anmerkungen zur Merkmalskartierung in Dyckia Eine Kartierung insbesondere morphologischer Merkmale auf die in dieser Arbeit ermittelte plastidäre Phylogenie bringt diverse Probleme mit sich. Zum einen stellt sich die Frage, inwiefern die ermittelte Phylogenie der Plastiden überhaupt die verwandtschaftlichen Beziehungen zwischen den Arten widerspiegelt. Zweitens ist die Auflösung insbesondere innerhalb der großen Kladen von Core-Dyckia sehr begrenzt. Drittens bestand bei einigen der untersuchten Pflanzen keine Möglichkeit, blühende Exemplare zu untersuchen. In diesen Fällen musste die Blütenfarbe aus den angegebenen Artnamen über Literaturrecherchen ermittelt werden (z. B. Smith & Downs 1974; Winkler 1982). Im Falle der Blütenfarbe besteht das besondere Problem, dass viele Arten von Dyckia ausschließlich auf Basis von Herbarbelegen beschrieben wurden und Farben nicht angegeben sind. Auch bei vielen anderen Merkmalen sind die Beschreibungen stark von ihren Autoren abhängig und häufig unvollständig. Die genannten Unsicherheiten werden schließlich noch dadurch verschärft, dass viele Arten von Dyckia mit den verfügbaren Schlüsseln ausgesprochen schwer zu bestimmen sind (vgl. 1.2.4). Im Falle einer Fehlbestimmung und anschließender Rekonstruktion von Merkmalen durch Literaturarbeit ergeben sich nicht abschätzbare Fehler. Weniger gravierend sind die oben genannten Probleme bezüglich der Höhenverbreitung, da Fundorte zumeist gut dokumentiert sind. Trotzdem musste die Höhe in einigen Fällen aus Literaturangaben über die jeweilige Art abgeschätzt werden, sofern solche Angaben überhaupt existierten (Smith & Downs 1974). Abschließend lässt sich festhalten, dass die Datenlage für belastbare Hypothesen zur Evolution morphologischer Merkmale innerhalb von Dyckia derzeit nicht ausreicht. Sowohl eine höher aufgelöste Phylogenie als auch die direkte Beobachtung der unter vergleichbaren Bedingungen kultivierten Lebendpflanzen sind nötig um hier gesicherte Erkenntnisse zu erlangen. 132 Diskussion 4.3 Evolution und Geschichte von Dyckia 4.3.1 Historische Biogeographie von Dyckia und Encholirium Aus den bisher verfügbaren Daten, insbesondere der plastidären Phylogenie und dem Haplotypennetzwerk, lässt sich eine Hypothese zur historischen Biogeographie entwickeln, die im Folgenden näher ausgeführt und in Abbildung 37 illustriert wird. Nach der Trennung von Deuterocohnia, vermutlich in Bolivien, gelangten die gemeinsamen Vorläufer von Dyckia und Encholirium vor 6,2-5,6 Millionen Jahren nach Zentralbrasilien (Abbildung 37 A). Danach begann die zunächst vergleichsweise langsame Differenzierung von Encholirium (Abbildung 37 B). Die drei beziehungsweise vier in dieser Arbeit gefundenen Hauptlinien von Encholirium entstanden vermutlich in der Zeit bis vor 4,6 Millionen Jahren. Die weitere Diversifizierung dieser Linien erfolgte dann innerhalb der letzten 3,0 Millionen Jahre. Wo genau die Abtrennung des Vorläufers aller heutigen Dyckia-Arten von Encholirium stattfand, lässt sich aus den gewonnenen Daten nicht folgern. Zur Klärung dieser Frage wäre eine Einbeziehung von E. lymanianum in die Untersuchung von besonderem Interesse. Diese Art kommt disjunkt in Mato Grosso und Mato Grosso do Sul vor, also in genau jenem Gebiet, das auch die Heimat der zuerst abgespaltene Linie von Dyckia ist. Allerdings ist E. lymanianum nur schwer von Vertretern von Dyckia in dieser Region zu unterscheiden. Forzza (2005) mutmaßt, dass E. lymanianum, D. exserta und D. ferruginea tatsächlich ein und dieselbe Art repräsentieren könnten. In diesem Fall wäre der ursprünglichste Vertreter von Dyckia wohl von Goiás oder Minas Gerais ausgehend nach Süden gelangt. Leider stand von E. lymanianum kein Material für die vorliegende Untersuchung zur Verfügung. Die rezenten Arten von Dyckia begannen vor etwa 4,0 Millionen Jahren, sich zu diversifizieren (Abbildung 37 C). Die nur drei gefundenen rezenten Vertreter der zwei zuerst abgespaltenen Linien leben heute in den zentralbrasilianischen Bundesstaaten Mato Grosso do Sul, Goiás und Espírito Santo. Der zentrale Haplotyp von Core-Dyckia finden sich heute in Pflanzen aus dem südlichsten Brasilien (Abbildung 23). Die massive Radiation, während der alle großen Hauptlinien von Core-Dyckia entstanden, fand demnach vor etwa 2,9 Millionen Jahren vom Süden Brasiliens ausgehend statt (Abbildung 37 D). Die weitere Diversifizierung der Gattung ereignete sich dann innerhalb der letzten 2,5 Millionen Jahre. Die vier großen Kladen begannen mit der Besiedlung ihrer jeweiligen Verbreitungsgebiete, die heute klar voneinander getrennt sind und sich nicht überlappen (Abbildung 37 E, vgl. auch 4.2.2). Für die zentralbrasilianische Klade kann eine intensive sekundäre Radiation angenommen werden. In den übrigen Kladen verlief die Diversifizierung 133 Diskussion offensichtlich langsamer. Aus jeder der vier großen Kladen verließen nur einzelne kleinere Linien innerhalb der letzten 2,5 Millionen Jahre das jeweilige Verbreitungsgebiet (Abbildung 37 F). Insgesamt ist die strikte Limitierung von plastidär definierten Kladen auf distinkte Regionen bemerkenswert. Zur Erklärung können zwei sich ergänzende Erklärungen herangezogen werden. Zum einen sind die Kladen innerhalb von Dyckia außergewöhnlich jung. Somit war nur wenig Zeit etwa für Fernausbreitungsereignisse oder anderweitige zu Durchmischung führende Mechanismen. Zum anderen scheint die Samenausbreitung bei Dyckia recht ineffektiv zu sein (vgl. 1.2.3) und plastidäre DNA wird in den Bromeliaceae vermutlich wie in den meisten anderen Angiospermen nur maternal, also über die Samen verbreitet. Die aus 134 Abbildung 37: Hypothese zur historischen Biogeographie Gezeigt ist das aus den in der vorliegenden Arbeit gezeigten Daten rekonstruierte Szenario der Diversifizierung von Dyckia und Encholirium. Die Farbkodierung entspricht in den Bildern A-D den drei gezeigten Gattungen. In den Bildern E und F ist ausschließlich Dyckia gezeigt, die Farbkodierung weist auf die gefundenen Kladen innerhalb von Dyckia hin, entsprechend der Legende am unteren Rand. Kleine Sterne stehen für beginnende Diversifizierungsereignisse, große Sterne für fortgeschrittene. Gepunktete Linien verweisen auf Unsicherheiten über Besiedelungswege. A: Ausbreitung des gemeinsamen Vorläufers von Dyckia und Encholirium von Bolivien ausgehend nach Brasilien. B: Entstehung der Hauptlinien von Encholirium. C: Abspaltung von Dyckia und Ausbreitung nach Süden unter Abspaltung zweier heute wenig diversifizierter Linien. D: Erste Radiation von Dyckia im Süden Brasiliens, Entstehung aller Hauptlinien. E: Verbreitungsgebiete der vier großen Kladen in heutiger Zeit. F: Fernausbreitung oder Migration einzelner Linien nach Etablierung der großen Kladen. zentralbras. Klade südbras. Klade paraguay. Klade argentin. Klade Deuterocohnia Encholirium DyckiaA-D: E-F: A B C D E F 6,2-5,6 Ma 5,6-4,6 Ma 4,6-2,9 Ma 2,9-2,5 Ma 2,5 Ma-heute 2,5 Ma-heute Diskussion der Sequenzierung des nukleären Locus phyC gewonnenen Erkenntnisse weisen hingegen auf einen vielfach höheren Austausch von genetischem Material des Zellkerns hin (vgl. 4.3.5). Dieses wird über Pollen und über Samen ausgebreitet. Extinktionen, weitere Fernausbreitungsereignisse, Migrationen und möglicherweise neue Diversifizierungswellen werden vermutlich dazu führen, dass sich dieses derzeit klare geographische Muster in der Zukunft langsam auflöst. Eine ähnliche Situation wie bei Dyckia findet sich in Deuterocohnia (Schütz 2012). Die beiden Kronengruppen dieser in der plastidären Phylogenie paraphyletischen Gattung sind ebenfalls sehr jung. Die Samen von Deuterocohnia haben stark reduzierte Anhängsel und sind vermutlich ebenfalls wenig mobil. Für die ältere Gattung Fosterella zeigt sich hingegen eine weniger klare geographische Limitierung der gefundenen Kladen (Wagner et al. 2012). In ersten Untersuchungen an Pitcairnia wurde kein erkennbarer Bezug zwischen der Plastiden-Phylogenie und der geographischen Verbreitung beobachtet (Schubert, unveröffentlichte Daten). Dies kann einerseits durch das höhere Alter, aber auch durch die möglicherweise mobileren Samen von Pitcairnia erklärt werden (vgl. Abbildung 4). 4.3.2 Klima- und Habitatgeschichte im Verbreitungsgebiet von Dyckia Klimageschichte in Miozän, Pliozän und Pleistozän Der Ursprung der Kronengruppe der Bromeliaceae liegt nach den Berechnungen von Givnish et al. (2011) etwa 19 Millionen Jahre zurück. Dieser Zeitpunkt liegt in der Serie des Miozän, das sich über den Zeitraum von 20,03-5,332 Millionen Jahren vor heute erstreckte (Gradstein et al. 2004). Die meisten der heutigen Unterfamilien der Bromeliaceae entstanden vor etwa 16 bis 14 Millionen Jahren (Givnish et al. 2011). Während dieser Zeit, nämlich vor 15 Millionen Jahren, trat ein klimatisches Optimum mit hohen Temperaturen und hoher Feuchtigkeit auf (Zachos et al. 2001). Danach wurde es zunehmend kühler und trockener (Abbildung 38). Zwischen 10 und 6 Millionen Jahren vor heute fand die bisher letzte rapide Phase der Auffaltung der Anden statt (Ghosh et al. 2006). Als direkte Folge der Anhebung der Anden und den damit einhergehenden Veränderungen der Windsysteme wurde das Klima im atlantischen Regenwald und der Serra do Mar entlang der Küste des südlichen Brasiliens gegen Ende des Miozäns lokal kühler, aber auch feuchter (Ehlers & Poulsen 2009). Die auf das Miozän folgende Serie des Pliozän (5,332-2,588 Millionen Jahre vor heute, Gradstein et al. 2004) zeichnete sich durch ein relativ stabiles Klima aus. Die globale Durchschnittstemperatur lag immer noch etwa 5 °C über der heutigen (Lisiecki & Raymo 2005). In diesen Zeitraum fällt auch die Schließung des Isthmus von Panama vor etwa 3,5 135 Diskussion Millionen Jahren (Antonelli et al. 2009), was teils gravierende Veränderungen insbesondere der Fauna Südamerikas nach sich zog. Als prägendes Ereignis für das Cerrado muss die in dieser Periode erfolgende rapide Ausbreitung von C4-Photosynthese betreibenden Gräsern gesehen werden. Während diese Pflanzen in Savannen in anderen Teilen der Welt schon früher dominant geworden waren (z. B. Zachos et al. 2001), setzten sie sich im Cerrado wohl erst vor etwa 4 Millionen Jahren großflächig durch (Simon et al. 2009). Als drastischer Umbruch wird in diesem Zusammenhang die Zunahme von Bränden gesehen, denn die weiten mit Gräsern bestandenen Flächen sind besonders anfällig für die Entzündung durch 136 Abbildung 38: Klimaentwicklung während der Geschichte von Dyckia Im oberen Bereich der Abbildung ist die datierte Phylogenie aus der BEAST-Analyse gezeigt (vgl. 3.2.2). Die Farbkodierung der Gattungen ist im linken oberen Teil erklärt. Der Graph im unteren Bereich zeigt die Entwicklung der globalen Durchschnittstemperatur, rekonstruiert aus Verhältnissen von Sauerstoffisotopen in benthischen Sedimentbohrkernen. Für die Zeit von 13,0-5,5 Millionen Jahren ist die gemittelte Temperatur als Linie und der Schwankungsbereich als graue Fläche dargestellt (Zachos et al. 2001). Für die Zeit von 5,5 Millionen Jahren bis heute ist der exakte Temperaturverlauf gezeigt (Lisiecki & Raymo 2005). Die Temperaturskala wurde mit Daten aus Eisbohrkernen geeicht (Petit et al. 1999; EPICA community 2004). Angegeben ist die Abweichung von der mit 0 °C bezeichneten heutigen globalen Durchschnittstemperatur. Die erdgeschichtlichen Zeitabschnitte entsprechen der Definition von Gradstein et al. (2004). 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 PleistozänPliozänMiozän 0 °C -4 °C -8 °C 4 °C Dyckia Encholirium Deuterocohnia Fosterella Pitcairnia Puya Diskussion Blitzschlag. Der Einfluss von Feuer wurde bereits mehrfach als prägend für die Vegetation des Cerrados beschrieben (z. B. Abreu Ferreira et al. 2010). Die Serie des Pleistozän (2,588 Millionen-11.672 Jahre vor heute,Gradstein et al. 2004) zeichnete sich durch eine starke Verringerung der globalen Durchschnittstemperatur aus. Weiterhin war die durchschnittliche Temperatur starken Schwankungen unterworfen (Abbildung 38). So wechselten sich in zyklischen Abständen Warm- und Kaltzeiten ab. Innerhalb dieser Zyklen, welche innerhalb der letzten 1 Million Jahre etwa 100.000 Jahre, davor etwa 41.000 Jahre dauerten, variierte die globale Durchschnittstemperatur teils um mehr als 5 °C innerhalb kürzester Zeit (Lisiecki & Raymo 2005). Das Klima während der Trennung von Dyckia , Encholirium und Deuterocohnia Die globale Abkühlung gegen Ende des Miozäns eröffnete möglicherweise Korridore für die Migration an Trockenheit angepasster Pflanzen und Tiere in den tieferen Regionen Boliviens und im Westen Brasiliens. So dehnten sich trockene Habitate von den Höhenlagen zunehmend ins Tiefland hin aus und ermöglichten xerophytischen Pflanzen, sich dort zu etablieren (z. B. Winkler 1986). Es ist anzunehmen, dass die gemeinsamen Vorläufer von Dyckia und Encholirium durch solche Korridore von Bolivien ausgehend ins heutige Brasilien gelangten. Über die Gründe, warum Deuterocohnia sich nicht in diese Richtung ausbreiten konnte, kann nur spekuliert werden (Schütz 2012). Eine mögliche Erklärung könnte in den verholzenden Infloreszenzen von Deuterocohnia zu suchen sein. Hier investieren die Pflanzen viel Energie in die Ausbildung eines mehrjährigen Blütenstandes. Sollten die Infloreszenzen aber im Tiefland in verstärktem Maße der Gefahr der Zerstörung durch Feuer oder große Herbivoren ausgesetzt sein, könnten einjährige Blütenstände einen Selektionsvorteil bedeuten. Forzza (2005) beobachtete beispielsweise an Infloreszenzen von Encholirium vogelii häufig starke Zerstörungen durch Tierfraß. Das erste Auftreten des gemeinsamen Vorläufers von Dyckia und Encholirium im Osten Brasiliens fällt in die Zeit nach dem Abschluss der letzten raschen Phase der Hebung der Anden. Zu diesem Zeitpunkt hatte sich das Klima dort vermutlich stärker als im globalen Mittel abgekühlt und es war feuchter geworden, dennoch lag die Durchschnittstemperatur noch über der heutigen. Ein Grund für das Durchsetzen und dauerhafte Verbleiben des Vorläufers der beiden Gattungen und seiner Nachkommen in ihrem neuen Verbreitungsgebiet mag die Resistenz gegen die im späteren Pliozän verstärkt auftretenden Brände gewesen sein (vgl. 1.2.3). Die Trennung der Hauptlinien von Encholirium, die Entstehung von Dyckia und die Abspaltung zweier bis heute kaum diversifizierter Linien innerhalb von Dyckia verliefen fast komplett im Pliozän. Also fällt diese Phase langsamer 137 Diskussion Diversifizierung in einen Zeitraum stabilen Klimas. Die Radiationen von Dyckia, aber auch die weitere Diversifizierung von Encholirium ereigneten sich dagegen fast komplett im Pleistozän, einem Zeitalter rapider Klimaschwankungen. Diese Zusammenhänge legen den Schluss nahe, dass der periodische Wechsel von Warm- und Kaltzeiten eine treibende Kraft hinter der raschen Diversifizierung insbesondere von Dyckia war. Historische Entwicklung der Campos Rupestres Antonelli et al. (2010) modellierten die Ausdehnung der Campos Rupestres während kühlerer Perioden der Erdgeschichte. Während diese Ökoregion heute für gewöhnlich auf Höhenlagen oberhalb von 1.000 m Höhe beschränkt ist, lag ihre Untergrenze während der Kaltzeiten der letzten Millionen Jahre vermutlich bei etwa 800 m. Diese Absenkung resultierte in einer enormen Flächenzunahme und Verschmelzung vieler heute isolierter Fragmente der Campos Rupestres (Abbildung 39). Für Dyckia und Encholirium geeignete Habitate im Osten Brasiliens waren zu diesen Zeiten demnach weniger fragmentiert als heute. In der Serra do Caiapó im äußersten Westen des Bundesstaates Goiás gibt es zudem große Bereiche in 800-1000 m Meereshöhe, auf denen sich in kälteren Zeiten potentiell Campos Rupestres etablieren konnten. Selbst im Südosten von Mato Grosso existieren solche Gebiete, kleinere Fragmente finden sich verstreut bis in den Südwesten an die Grenze Boliviens, die Heimat von Deuterocohnia. Möglicherweise dienten diese Gebiete als Trittsteine für die Migration des gemeinsamen Vorläufers von Dyckia und Encholirium nach Osten (blau unterlegte Bereiche in Abbildung 39). Allerdings lag die globale Durchschnittstemperatur in dieser Periode nicht deutlich unter der heutigen. Es ist aber durchaus möglich, dass auch andere, derzeit ungeklärte Faktoren eine Ausdehnung der Campos Rupestres bewirkt haben könnten. Die Frequenz der periodischen Ausdehnung und Kontraktion der Campos Rupestres war zweifellos im Pleistozän am höchsten (Antonelli et al. 2010). Dasselbe ist für die entsprechenden Areale der Arten von Dyckia anzunehmen. In kälteren und trockeneren Zeiten bildeten sich möglicherweise Korridore zwischen ansonsten isolierten Habitaten. Durch solche Korridore konnte Dyckia einerseits bis dato unbesiedelte Campos Rupestres erreichen. Andererseits dürften solche Verbindungen auch zu verstärktem Genfluss und sogar der Verschmelzung von Arten infolge von sekundärem Kontakt geführt haben. Stebbins (1984) postulierte für solche Szenarien eine verstärkte Artbildungsrate durch Hybridisierung und Polyploidisierung. Länger voneinander isolierte Populationen könnten demnach divergente Umstrukturierungen ihrer Chromosomen anhäufen. Bei sekundärem Kontakt würde dies in einer reduzierten Fitness von Hybriden resultieren, was durch Polyploidisierung aber umgangen würde. Für Dyckia scheint dieser Mechanismus wohl keine 138 Diskussion große Rolle gespielt zu haben, da polyploide Arten wohl eher selten sind (Sharma & Ghosh 1969; Brown & Gilmartin 1989; Cotias-de-Oliveira et al. 2000; Gitaí et al. 2005). Eine umfassende Studie zu Chromosomenzahlen und Genomgrößen in Dyckia und Encholirium existiert allerdings nicht. Der offenbar dennoch gravierende Einfluss der Klimaschwankungen auf die Evolution von Dyckia wird in Abschnitt 4.3.5 diskutiert. 4.3.3 Diversifizierung anderer Pflanzengruppen im Verbreitungsgebiet von Dyckia Bisher haben sich nur wenige molekulare Untersuchungen mit Organismengruppen befasst, die im gleichen Verbreitungsgebiet wie Dyckia vorkommen und ähnlich rasche Diversifikationen erfahren haben. Beheregaray (2008) moniert gar einen generellen Mangel an phylogeographischen Studien für Organismengruppen der südlichen Hemisphäre. Zudem sind nicht viele zuverlässig datierte Phylogenien verfügbar (z. B. Antonelli & Sanmartín 2011). Von besonderer Relevanz für einen Vergleich mit Dyckia sind Studien an Pflanzengruppen mit ähnlicher Verbreitung und Standortansprüchen, etwa andere Bewohner der Campos Rupestres. Solche Vergleiche könnten Hinweise auf mögliche 139 Abbildung 39: Modellierung der Ausdehnung von Campos Rupestres in vergangener Zeit Gezeigt sind die Höhenstufen im Verbreitungsgebiet von Dyckia (mit dicken schwarzen Linien umrandet). Rot markiert sind Bereiche über 1.000 m, wo sich die Campos Rupestres in heutiger Zeit zumeist befinden. Blau eingefärbt sind Höhen von 800-1.000 m, in die sich die Campos Rupestres während der Klimaschwankungen des Pleistozäns zeitweise ausdehnten (z. B. Antonelli et al. 2010). Höhen über 2.000 m sind grau dargestellt. Im Übrigen entsprechen die Farben der am linken unteren Rand gezeigten Legende. Im rechten Bildteil ist die Region um den Bundesstaat Minas Gerais, das Diversitätszentrum von Dyckia, vergrößert dargestellt. Reliefkarte basierend auf SRTM- und GTOPO30-Daten (erstellt nach Braxmeier 2012). 2000 m 1400 m 800 m 200 m Diskussion Schlüsselinnovationen und Speziationsmechanismen geben. Aber auch andere Organismengruppen können von Interesse sein. Hoffmannseggella (Antonelli et al. 2010; Gustafsson et al. 2010 ) Ein typischer Bestandteil der Vegetation der Campos Rupestres sind Vertreter der Gattung Hoffmannseggella (Orchidaceae). Basierend auf einer Analyse der nukleären ITS-Region erstellten Antonelli et al. (2010) eine datierte Phylogenie der Gattung. Das erhaltene Alignment ist mit weniger als 700 bp vergleichsweise kurz und die erhaltene Auflösung des Stammbaums extrem gering. Eine BEAST-Analyse des Datensatzes mit einem einzelnen sekundären Kalibrierungspunkt deutet auf ein Alter der Gattung von etwa 11 Millionen Jahren hin (Gustafsson et al. 2010). Das 95%-Konfidenzintervall dieses Wertes wird allerdings mit 5-20 Millionen Jahren angegeben. Trotz der erheblichen Mängel der Analyse hinsichtlich erzielter Auflösung und Zuverlässigkeit der Datierung können interessante Vergleiche zu Dyckia gezogen werden. Antonelli et al. (2010) beschreiben die zuvor erwähnte rhythmische Ausdehnung und Kontraktion der Campos Rupestres als treibende Kraft hinter der Diversifizierung von Hoffmannseggella (siehe auch 4.3.2). So spalteten sich die neun zu Beginn des Pliozäns existenten Linien bis heute in insgesamt 41 verschiedene Arten auf. Die immer stärker werdenden periodischen Klimaschwankungen zu Beginn des Pliozäns und deren besondere Intensivierung im Pleistozän (vgl. Abbildung 38) werden als Ursache hierfür angegeben. Da sich Dyckia überwiegend im Pleistozän diversifizierte, hatten diese Veränderungen sicher auch einen Einfluss auf die Ausdehnung passender Habitate für Dyckia. Ein direkter Vergleich mit Hoffmannseggella ist aber nur bedingt zulässig. Ein wesentlicher Unterschied zwischen Hoffmannseggella und Dyckia liegt im jeweiligen Ursprung der Pflanzen. Die frühen Vertreter von Hoffmannseggella wuchsen offenbar schon im heutigen Verbreitungsgebiet, bevor das Cerrado, die Mata Atlântica und wohl auch die Campos Rupestres ihre heutige Form annahmen. Die Vorläufer von Dyckia und Encholirium hingegen gelangten erst vor etwa 6 Millionen Jahren in diese Region, als die vorerst letzte Phase der Auffaltung der Anden gerade abgeschlossen war und die periodischen Klimaschwankungen zunahmen (siehe 4.3.1). Die Rückkehr von Dyckia in die Campos Rupestres nach der zwischenzeitlichen Migration ins Tiefland im Süden Brasiliens fand gar erst vor weniger als 3 Millionen Jahren statt. Somit kann Hoffmannseggella als Beispiel für eine Gattung dienen, deren Anpassungen sich bereits vor oder spätestens mit der Entstehung des Habitates entwickelten. Die Diversifizierung erfolgte dann im Kontext der zunächst nur langsam einsetzenden 140 Diskussion klimatischen Veränderungen. Dagegen entwickelten sich zumindest einige wichtige Eigenschaften von Dyckia vermutlich außerhalb der Campos Rupestres, nämlich einerseits vor und kurz nach der Trennung von Deuterocohnia in Bolivien und später im Tiefland im Süden Brasiliens. Bei der Ankunft der Vorgänger der zentralbrasilianischen Klade in den Campos Rupestres dürften diese Habitate ihrem heutigen Erscheinungsbild bereits stark geähnelt haben. Die oszillierenden Klimaveränderungen waren ferner bereits in vollem Gange. Es ist also von einer Radiation der Gattung Dyckia in ein bestehendes Ökosystem hinein auszugehen. Sukkulente Caryophyllales (Arakaki et al. 2011 ) Arakaki et al. (2011) publizierten eine sehr umfassende datierte Phylogenie sukkulenter Pflanzen der Caryophyllales, insbesondere der Cactaceae. Innerhalb der Cactaceae bilden die Notocactaceae und die Cereeae gemeinsam eine große, auf Südamerika beschränkte Klade. Deren Diversifizierung begann mit der Aufspaltung in zwei Linien vor etwa 15 Millionen Jahren, die meisten Linien entstanden aber deutlich später. Für die nahezu auf Brasilien beschränkten Cereinae wird ein Alter von 7,5-6,5 Millionen Jahren angegeben, die meisten Linien entstanden innerhalb der letzten 5 Millionen Jahre. In diesem Zusammenhang kann auch die Arbeit von Roncal et al. (2011) genannt werden. Hier wird die Palmenart Geonoma brevispatha (Arecaceae) als Indikatorart für das Cerrado identifiziert und das Alter dieser Ökoregion darauf basierend mit 5,2 Millionen Jahren angegeben. Innerhalb der Caryophyllales ist die Präadaption zur Ausbildung von Sukkulenz offenbar sehr alt. Daher sehen Arakaki et al. (2011) in der Ausbildung sukkulenter Sprosse keine Schlüsselinnovation für eine rapide Diversifizierung. Vielmehr wird die rasche Ausbreitung arider Habitate als Motor zur Diversifizierung gesehen. Resistenzen gegen Feuer in Fabaceae und Melastomataceae (Simon et al. 2009 ) Simon et al. (2009) verglichen datierte Phylogenien der Gattungen Mimosa, Andira und Lupinus (alle Fabaceae) und des Tribus Microlicieae (Melastomataceae). Die Diversifizierung der innerhalb dieser Gattungen im Cerrado auftretenden Linien begann hier jeweils vor weniger als 10 Millionen Jahren, der weitaus größte Teil der Linien entstand jedoch erst innerhalb der letzten 4 Millionen Jahre. Die Autoren der Studie nehmen an, dass die Ausbildung von Resistenzen gegen Feuer die Schlüsselinnovation für den Erfolg und die Diversifizierung insbesondere der artenreichen Gattung Mimosa und der Microlicieae war (siehe auch Fritsch et al. 2004). Solche Resistenzen entstanden innerhalb von Mimosa und Andira mehrfach. Die Autoren gehen davon aus, dass sich diese Innovationen jeweils in situ, 141 Diskussion also innerhalb des Cerrados entwickelten. Eine Einwanderung bereits an Feuer angepasster Linien in das entstehende Cerrado wird dagegen als unwahrscheinlich angesehen. Rückschlüsse in Bezug auf Dyckia Für Organismengruppen insbesondere des Cerrados, aber auch der Mata Atlântica und der Campos Rupestres gibt es letztlich doch eine ganze Reihe an datierten Phylogenien (Berry et al. 2004; Fritsch et al. 2004; Almeida et al. 2007; Elias et al. 2009; Simon et al. 2009; Antonelli et al. 2010; Gustafsson et al. 2010; Maraví 2010; Arakaki et al. 2011; Roncal et al. 2011). Als Konsens aus der Mehrzahl dieser Arbeiten kann eine parallele Entstehung dieser drei eng miteinander verbundenen und verzahnten Ökoregionen angenommen werden. Viele der untersuchten Organismengruppen traten vor etwa 10 Millionen Jahren erstmals in der Region auf, so etwa Hoffmannseggella (Antonelli et al. 2010; Gustafsson et al. 2010), Fuchsia (Berry et al. 2004), Mimosa, Andira, Lupinus und die Microlicieae (Simon et al. 2009). Eine teils starke Erhöhung der Diversifizierungsraten wurde ab etwa 6 Millionen Jahren vor heute beobachtet, so für die dort lebenden Vertreter der Bromelioideae (Bromeliaceae, Givnish et al. 2011) und die Gattung Hoffmannseggella (Gustafsson et al. 2010). Dies fällt in etwa mit dem vermutlichen Zeitpunkt der Entstehung der Habitate dieser Region in ihrer heutigen Form zusammen (Ehlers & Poulsen 2009; Givnish et al. 2011; Roncal et al. 2011). Einige der Organismengruppen zeigen ferner eine stark zunehmende Diversifizierung ab etwa 3 Millionen Jahren vor heute, so beispielsweise Mimosa (Simon et al. 2009). Dies markiert in etwa die beginnende Intensivierung der Klimaschwankungen des Pleistozäns. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit decken sich sehr gut mit den anhand anderer Organismengruppen gewonnenen Erkenntnissen. So fällt die beginnende Diversifizierung der gemeinsamen Vorläufer von Dyckia und Encholirium in die Zeit der Entstehung der Pflanzengesellschaften dieser Gegend. In der Phase bis zur beginnenden Radiation von Dyckia durchliefen diese Pflanzen eine ähnliche Diversifizierung wie andere dort heimische Lebewesen. Die vor etwa 2,6 Millionen Jahren einsetzenden rapiden Klimaschwankungen des Pleistozäns spiegeln sich auch in der Phylogenie anderer Pflanzengattungen wider. Eine explosive Radiation wie bei Dyckia bleibt aber in den bisher untersuchten Taxa eine sehr seltene Ausnahme. Hypothesen über die Gründe für die rasche Diversifizierung wurden bereits für einige Pflanzengruppen erörtert, die in den trockenen Habitaten Brasiliens Radiationen durchlaufen haben. Im Cerrado stellt eine in situ entwickelte Resistenz gegen Feuer sicherlich eine plausible Erklärung für den Erfolg dar. Die heutigen Habitate von Dyckia und Encholirium 142 Diskussion sind weniger stark durch regelmäßige Brände beeinflusst (vgl. 1.2.2, 1.2.3 und 4.3.2). Obwohl die Arten beider Gattungen eine gewisse Widerstandsfähigkeit gegen Feuer zeigen, spielten Brände für die beginnende Diversifizierung des Komplexes aus Dyckia und Encholirium wohl keine so große Rolle. Wichtiger war sicherlich der in kurzen zeitlichen Abständen abwechselnd schrumpfende und sich ausdehnende Lebensraum. Dieser exogene Faktor wird auch für Vertreter der Caryophyllales dieser Region angenommen (Arakaki et al. 2011). Die Pflanzen mussten also im Wesentlichen die Fähigkeit zur xerophytischen Lebensweise mitbringen. Für die besonders schnelle Radiation von Dyckia, aber auch für die zunehmende Diversifizierung von Encholirium findet sich in der von Antonelli et al. (2010) rekonstruierten Geschichte der Campos Rupestres eine plausible Begründung. Sowohl Hoffmannseggella als auch Dyckia und Encholirium gelten als typische Bewohner der Campos Rupestres. Diese stellen allerdings kein einheitliches Ökosystem dar, sondern vielmehr eine fragmentierte Ansammlung zumindest floristisch stark unterschiedlicher Habitate (vgl. Alves & Kolbek 2010). Dies wird auch bei der Betrachtung der enormen Biodiversität im Vergleich zur recht geringen von Campos Rupestres bedeckten Fläche deutlich (siehe 1.2.2). Aufgrund der Heterogenität der Campos Rupestres ist unklar, wie ähnlich die Habitate von Dyckia und Hoffmannseggella tatsächlich sind. Selbst zwischen Dyckia und Encholirium scheinen bisher unerkannte Unterschiede in den besiedelten Habitaten zu bestehen. Und so ist nicht auszuschließen, dass die Ausdehnung und Kontraktion der Habitate für jede der Gattungen ein unterschiedliches Maß erreichte. 4.3.4 Die besonders hohe Diversität von Dyckia Die hohe Artenzahl von Dyckia ist bemerkenswert. Zwar sind die Neotropis und insbesondere die hochgradig fragmentierten Campos Rupestres bekanntermaßen Zentren außergewöhnlicher Biodiversität. Auch die Bromeliaceae als Ganzes sind ein beeindruckendes Beispiel für eine diverse neotropische Organismengruppe. Selbst innerhalb der Pitcairnioideae existiert mit Pitcairnia ein weiteres Beispiel von besonders intensiver Diversifikation. Aber nicht zuletzt der Vergleich von Dyckia mit den am nächsten verwandten und sehr ähnlichen Gattungen Encholirium und Deuterocohnia wirft Fragen auf. So ist die Artenzahl von Dyckia um ein Vielfaches höher als jene der beiden anderen Gattungen, obwohl Dyckia vermutlich die jüngste Linie innerhalb dieser xerophytischen Klade darstellt. Die Diversität von Dyckia im Vergleich mit Encholirium Die hohe Artenzahl von Dyckia resultiert möglicherweise in großem Maße aus den Eigenschaften und der Geschichte der besiedelten Habitate. So stellt sich nun einerseits die 143 Diskussion Frage, was die Arten von Dyckia dazu befähigte, sich in diesem Lebensraum zu behaupten. Andererseits scheint sich Dyckia aber auch viel schneller diversifiziert zu haben als Encholirium. So muss es zwischen den beiden Gattungen Unterschiede geben, welche dieses Phänomen erklären. Die Zahl offensichtlicher Unterschiede zwischen den beiden Gattungen ist gering. Am augenscheinlichsten ist die Präsenz anderer Blütenfarben und die tendenziell intensivere Blütenfärbung bei Dyckia. Dies könnte gegenüber von Encholirium zur Anlockung von zusätzlichen oder anderen Bestäubern geführt haben. Ein anderer bemerkenswerter Umstand ist, dass Encholirium ausschließlich nördlich des 21. südlichen Breitengrades vorkommt. Dyckia wächst dagegen in Uruguay und Argentinien bis hinunter zum 35. südlichen Breitengrad. Zwar liegt das Biodiversitätszentrum von Dyckia im Überlappungsbereich mit Encholirium in Minas Gerais, das erste große Radiationsereignis ging aber offenbar vom Flachland im Süden Brasiliens in der Gegend um den 30. Breitengrad herum aus (vgl. 4.2.5). So scheint es, als wäre die Gattung Dyckia erst nach ihrer Migration in den Süden vor etwa 3 Millionen Jahren zu ihrer enormen Diversifizierung fähig gewesen. Encholirium war offenbar zu keiner Zeit in der Lage, so weit nach Süden zu gelangen. Möglicherweise sind die gleichen Schlüsselinnovationen, die die Migration in den Süden ermöglichten, auch der Motor für die rapide Diversifikation von Dyckia nach der Rückkehr nach Zentralbrasilien vor etwa 2 Millionen Jahren. Ein eher trivialer Grund für die höhere Artenzahl bei Dyckia im Vergleich zu Encholirium ist sicherlich die schiere Größe des Verbreitungsgebietes. So kommen viele Dyckia-Arten auch oder nur in Argentinien, Paraguay, Bolivien, Uruguay und dem südlichen Brasilien vor, während Encholirium auf Zentral- und Ostbrasilien beschränkt ist. Aber auch dort, wo beide Gattungen gemeinsam vorkommen, ist Dyckia artenreicher. In Minas Gerais etwa, wo beide Gattungen ihre Diversitätszentren haben, existieren 42 Arten von Dyckia, aber nur 15 Arten von Encholirium (Versieux & Wendt 2006; 2007), obwohl Encholirium hier nach Maßgabe der plastidären Phylogenie deutlich mehr Zeit zur Diversifizierung hatte. Unterschiedliche Höhenverbreitung Die Arten von Encholirium besiedeln ähnliche Standorte wie die Arten von Dyckia, wenngleich die Gattungen selten oder fast niemals sympatrisch auftreten (Pinangé, persönliche Mitteilung). Einige Vertreter von Dyckia wachsen jedoch in größeren Höhen als Encholirium (z. B. Smith & Downs 1974; Forzza 2005). Inwiefern Dyckia vielleicht eine gesteigerte Resistenz gegen Kälte aufweist, ist unbekannt. Interessanterweise bezeichnete aber schon Beer (1857) Dyckia rariflora als die Art mit der höchsten Widerstandsfähigkeit 144 Diskussion gegen Kälte innerhalb der gesamten Bromeliaceae. Zu dieser Zeit war allerdings erst ein Bruchteil der heute beschriebenen Bromelien bekannt. In Botanischen Gärten kultivierte Vertreter einiger Dyckia-Arten erwiesen sich als resistent gegen leichten Frost (Jenkins 1998). Im Vergleich zu Vertretern von Deuterocohnia konnte Dyckia teilweise sogar noch etwas geringere Temperaturen ohne größere Schäden verkraften. Dies ist insofern bemerkenswert, als Deuterocohnia in teils sehr viel höher gelegenen Habitaten lebt. Arten von Encholirium wurden in diesem Zusammenhang leider nicht untersucht. Der Umstand, dass Dyckia so weit in den deutlich kälteren Süden vordrang und erst danach zur Radiation in Zentralbrasilien fähig war, macht mögliche zukünftige Untersuchungen zur Kälteresistenz aber äußerst interessant. Effektiverer Genfluss bei Encholirium Da Arten von Encholirium generell in geringeren Höhen vorkommen als Vertreter von Dyckia im jeweils selben Gebiet, sind die Habitate der Arten von Encholirium möglicherweise weniger stark voneinander isoliert (vgl. auch 4.3.2). Dies könnte in einem im Vergleich zu Dyckia verstärkten Genfluss zwischen einzelnen Populationen führen. Eine aktuelle Studie an E. spectabile weist auf einen sehr effektiven Genfluss hin (Gonҫalves-Oliveira & Benko- Iseppon, unveröffentlichte Daten). Eine kürzlich durchgeführte Studie an den sympatrisch lebenden Arten E. heloisae und E. vogelii demonstriert die große Bedeutung unterschiedlicher Strategien zur Bestäubung für die Trennung von Arten (Christianini et al. 2012). Während die divergierende Phänologie und die Fähigkeit zur Selbstung nicht ausschlaggebend zu sein scheint, spielen die Chiropteriphilie und Sphingophilie bei E. vogelii im Gegensatz zur ausschließlich ornithophilen E. heloisae bei der genetischen Isolation dieser beiden Arten möglicherweise eine entscheidende Rolle. Die Bestäubung durch Fledermäuse kommt in Encholirium häufiger vor, fehlt aber offenbar in Dyckia (Sazima et al. 1989). Ein infolge geringerer geographischer Distanzen effizienterer Genfluss innerhalb der Arten in Verbund mit einem höheren Grad an Isolation zwischen den Arten, vermittelt durch unterschiedliche Bestäuber, könnten Schlüsselfaktoren für den besseren Zusammenhalt der Arten von Encholirium im Vergleich zu Dyckia sein. All dies würde die offenbar deutlich geringeren Diversifikationsraten bei Encholirium erklären. Somit würde die Vielfalt von Dyckia nicht etwa aus einer gesteigerten Fitness, sondern aus der geringeren Fähigkeit zum Austausch von genetischem Material zwischen Populationen, einer somit höheren Speziationsrate und daraus folgendem vermehrtem Endemismus resultieren. Zwar stehen möglicherweise selbst entfernt verwandte Arten von Dyckia noch in genetischem Kontakt miteinander. Ein Verschmelzen der Arten findet aber offenbar nicht statt (vgl. auch 4.3.5). 145 Diskussion 4.3.5 Artkonzepte für Dyckia Hinweise auf genetische Durchmischung bei Arten von Dyckia Innerhalb der ermittelten Phylogenien auf Basis plastidärer Sequenzen und des nukleären Locus phyC sind die untersuchten Arten von Dyckia häufig paraphyletischen Ursprungs. Von den 19 durch jeweils mehr als eine Akzession repräsentierten Arten trugen lediglich zwei Arten Plastiden eindeutig monophyletischen Ursprungs. In acht Fällen mangelte es für eine solche Aussage an Auflösung und in neun Fällen trugen Arten klar paraphyletische Plastiden. Im Falle von phyC wurden nur in einer einzigen Art Allele monophyletischen Ursprungs gefunden, nämlich den beiden Varietäten von D. marnier-lapostollei. In vier Fällen kann aufgrund mangelnder Auflösung keine Aussage getroffen werden, aber in 14 Arten waren phyC-Allele klar paraphyletischen Ursprungs. In Einzelfällen könnten durchaus Fehlbestimmungen die Ursache hierfür sein. Die Häufigkeit, mit der die untersuchten Arten nicht monophyletischen Ursprungs sind, deutet aber auf ein generelles Phänomen hin. Dafür spricht auch auch die extreme allelische Variation des Locus phyC innerhalb einzelner Individuen (siehe 3.3.2 und 4.1.3, Abbildung 25). So gehören die beiden innerhalb der gleichen Pflanze gefundenen Allele von phyC manchmal ganz unterschiedlichen Kladen innerhalb der Phylogenie an. Auch die deutlich erhöhte Auflösung der Phylogenie mit reduziertem Probensatz (Abbildung 29) spricht gegen einen jeweils monophyletischen Ursprung der beiden Allele bei heterozygoten Proben. Dies alles gilt für im Freiland gesammelte Pflanzen in gleichem Maße wie für in Botanischen Gärten kultivierte Akzessionen. Zwischen der Phylogenie der Plastiden und der Phylogenie von Allelen des Gens phyC treten teils erhebliche Diskrepanzen auf. Aufgrund der nicht monophyletischen Abstammung der Arten ist außerdem davon auszugehen, dass keiner der beiden Bäume die tatsächliche hypothetische Phylogenie der Arten von Dyckia (species tree) widerspiegelt. Demnach ist von einem gewissen Grad von genetischer Durchmischung auszugehen. Für einige dieser Unterschiede kann vermutlich incomplete lineage sorting verantwortlich gemacht werden (vgl. 4.2.2 und 4.2.3). In anderen Fällen könnte ein gelegentlicher Genfluss zwischen Arten und Introgression durch Hybridisierung und Rückkreuzung verantwortlich sein. Hierunter fällt auch der häufig als chloroplast capture bezeichnete Fall der Introgression von Plastiden (z. B. Tsitrone et al. 2003; Bänfer et al. 2006). Introgression oder incomplete lineage sorting? Zwischen Introgression und incomplete lineage sorting zu unterscheiden, ist sehr schwierig, beide Mechanismen können ähnliche Phänomene bewirken (Holder et al. 2001). Eine 146 Diskussion zuverlässige Aussage darüber, welche der Möglichkeiten für spezifische Inkongruenzen zwischen Phylogenien verantwortlich ist, ist nur durch hohen methodischen Aufwand zu treffen. Rückschlüsse können etwa über einen Vergleich mehrerer, durch Untersuchung unterschiedlicher Loci gewonnener Phylogenien gewonnen werden (z. B. Buckley et al. 2006). Dabei kann jedoch unter Umständen eine große Zahl an verschiedenen nukleären Loci nötig sein (Holder et al. 2001). Bei Dyckia sprechen eine Reihe an Erkenntnissen und Überlegungen für den Mechanismus der Introgression als dominierenden Faktor. Hier ist zum einen die bekannte Interfertilität zwischen Arten von Dyckia und auch mit Vertretern von Encholirium zu nennen (Grant & Zijlstra 1998; Versieux & Wendt 2006). Die räumliche Nähe vieler Arten zueinander in Verbindung mit wenig spezifischer Bestäubung und großer Reichweite einiger Bestäuber machen einen sporadischen Austausch von genetischem Material über Pollen sehr wahrscheinlich (siehe 1.2.3). Auch die häufig hohe allelische Variation bei phyC innerhalb einzelner Individuen ist durch einen eher kürzlichen Austausch von genetischem Material besser zu erklären als durch das Überdauern alter Allele. Eine Introgression über große Distanzen der Phylogenie hinweg wird auch als Grund für die Paraphylie der Plastiden in Deuterocohnia angenommen (Schütz 2012). Auch bei der Gattung Puya wurde Introgression als Erklärung für Widersprüche zwischen Phylogenien auf Basis von plastidären Daten und phyC angeführt (Jabaily & Sytsma 2010). Eine periodische Ausdehnung und Kontraktion der Habitate im Pleistozän könnte ein wichtiger, die Introgression begünstigender Faktor gewesen sein (vgl. 4.3.2). So kamen zuvor getrennte Populationen auf periodisch auftretenden Korridoren immer wieder in sekundären Kontakt miteinander (Antonelli et al. 2010). Dabei hatten Arten regelmäßig die Möglichkeit, in die Verbreitungsgebiete anderer getrennter Arten einzudringen. Excoffier et al. (2009) beschreiben für solche Fälle eine massive Introgression von lokalen Genen in das Genom der invasiven Arten. Auf diese Art und Weise könnten auch Plastiden in zuvor klar getrennte Linien gelangt sein, die ansonsten durch die limitierte Fähigkeit zur Samenausbreitung wenig mobil sind (vgl. 1.2.3 und 4.3.1). Weiterhin könnte der genetische Fluss zwischen den Arten in solchen Episoden deutlich höher gewesen sein, als dies aufgrund der heute stark isolierten Habitate erwartet würde. Zusammenhalt der Arten trotz regelmäßigen Genflusses Die Arten von Dyckia sind im allgemeinen morphologisch schwer auseinanderzuhalten. Einzelne diagnostische Merkmale überlappen sich regelmäßig und erst ihre Kombination erlaubt eine mehr oder minder gute Abgrenzung (z. B. Smith & Downs 1974; Winkler 1986). 147 Diskussion Ferner zeigt sich eine enorme innerartliche Variation bei vielen der Merkmale. Es drängt sich daher die Vermutung auf, dass nur die allerwenigsten der beschriebenen Morphospezies auch dem biologischen Artkonzept nach Mayr (1963) genügen. Dieses würde eine strikte reproduktive Isolation voraussetzen. Die unscharfen Grenzen zwischen den einzelnen Arten von Dyckia spiegeln sich auch in den molekularen Daten wider. So gibt es Hinweise auf regelmäßigen und intensiven Austausch von genetischem Material selbst zwischen phylogenetisch weit entfernten Arten. Mit welcher Regelmäßigkeit sich Linien von Dyckia aufspalten oder fusionieren, lässt sich anhand der gewonnenen Daten schwer abschätzen. Allerdings spricht vieles dafür, dass zuvor getrennte Linien bei sekundärem Kontakt nicht wieder komplett miteinander verschmelzen. Vielmehr scheinen die Arten ihre Gene in großem Umfang miteinander auszutauschen, ohne ihre phänotypische Identität als eigene Art zu verlieren. Über die exakten Mechanismen, welche diese Kohäsion der Arten trotz Genfluss bewirken, können derzeit noch keine zuverlässigen Aussagen gemacht werden. Ein ähnliches Phänomen wurde aber auch bei vielen anderen sympatrisch vorkommenden Arten beobachtet, etwa innerhalb der Gattung Pitcairnia (Palma- Silva et al. 2011; Southcott & Ostevik 2011). Das biologische Artkonzept erwies sich in der Vergangenheit schon für viele Organismen als problematisch, insbesondere bei Pflanzen. Besonders in tropischen Pflanzen scheinen reproduktive Barrieren zwischen nahe verwandten Arten häufig zu fehlen (Lexer & Widmer 2008). Die Ausbildung einer vollständigen, Genom-weiten reproduktiven Isolation zwischen Arten scheint demnach außerhalb des Tierreichs keinesfalls die Regel zu sein. Vielmehr deutet sich an, dass vielfach nur eine kleine Zahl von phänotypisch relevanten Genen für die Identität einer Art verantwortlich ist. Die übrigen Teile der Genome sind hingegen mehr oder weniger frei zwischen Arten austauschbar, einschließlich der plastidären Gene (porous genome concept, Wu 2001; Morjan & Rieseberg 2004; Wu & Ting 2004). Die wenigen Loci, welche eine Art ausmachen, tragen jeweils ein Set an koadaptierten Allelen. Diese bewirken ihrer Gesamtheit die spezifische Anpassung und Konkurrenzfähigkeit. Gelangen Allele dieser Gene durch Introgression aus anderen Arten in ein solches Set, so kann das empfindliche Gleichgewicht gestört werden. Die Hybride zeichnen sich dann in Bezug auf das spezielle Habitat durch eine reduzierte Fitness aus. 4.4 Ausblick Die vorliegende Arbeit hat gezeigt, dass die Rekonstruktion einer Phylogenie der Arten von Dyckia (species tree) mit Hilfe vergleichender DNA-Sequenzierung von Genen und nicht- kodierenden Abschnitten der nukleären und plastidären Genome nicht ohne weiteres 148 Diskussion möglich ist. Wie weiter oben diskutiert wurde, könnten diese Probleme auf andauernden interspezifischen Genfluss im Sinne des porous genome concepts zurückzuführen sein, nach dem eine Art durch einen Satz koadaptierter Allele definiert ist und der Rest austauschbar ist. Möglicherweise würde die vergleichende Sequenzierung eines Gens mit Einfluss auf den Phänotyp in einer Phylogenie resultieren, die sich mit der Phylogenie der Arten deckt. Da eine neutrale Evolution selbst nicht-kodierender Bereiche solcher Gene aber nicht zu erwarten ist, könnte bei diesem Vorgehen wiederum ein erhöhtes Maß an Homoplasie und Konvergenz zu fehlerhaften Ergebnissen führen. Ein denkbarer Ausweg aus diesem Dilemma stellt die kombinierte Analyse vieler unabhängiger nukleärer Loci dar, mit ihr ist noch am ehesten eine Phylogenie zu erwarten, die die tatsächlichen Verwandtschaftsbeziehungen zwischen den Arten von Dyckia reflektiert. Dies würde jedoch einen kaum zu rechtfertigenden Aufwand bedeuten. Ein wichtiger Ansatzpunkt für zukünftige Untersuchungen ist auch eine detaillierte ökophysiologische Charakterisierung unterschiedlicher Arten von Dyckia. Selbst wenn sich Arten morphologisch stark ähneln, könnten sie durchaus an völlig unterschiedliche Habitate angepasst sein. Faktoren wie Bodeneigenschaften, Nährstoffversorgung oder Zusammensetzung des Nektars und damit verbundene Anpassung an bestimmte Bestäuber könnten sich zwischen morphologisch und molekular ähnlichen Arten unterscheiden. Solche hypothetischen Unterschiede könnten dann auch Hinweise auf Gene liefern, die an der Kohäsion einzelner Arten beteiligt sind. Ein vielversprechender Ansatz könnte darin bestehen, die Verwandtschaftsuntersuchungen auf ein relativ kleines geographisches Gebiet mit einem überschaubaren Artenspektrum zu konzentrieren. In diesem Fall wäre die Problematik der schwierigen Identifikation der Arten weniger gravierend. Von jeder Art sollten mehrere Populationen besammelt und mit sensiblen Werkzeugen wie AFLP- und Mikrosatelliten-Markern untersucht werden. Bei beiden Methoden werden jeweils viele unabhängige Loci untersucht, was der in 4.3.5 erwähnten Problematik der porösen reproduktiven Barrieren entgegenwirken könnte. Erste interessante Ergebnisse wurden bereits mit beiden Methoden gewonnen (Wöhrmann et al. 2012; Pinangé et al., unveröffentlichte Daten). Ein besseres Verständnis der Dynamik von Populationen und Arten könnte neue Wege aufzeigen, die letztlich zu einer umfassenden Phylogenie der Gattung Dyckia führen. 149 Zusammenfassung 5 Zusammenfassung Die in Südamerika heimische Pflanzengattung Dyckia (Bromeliaceae) weist mit derzeit 158 anerkannten Arten eine besonders hohe Biodiversität auf. Insbesondere im Vergleich zur am nächsten verwandten Gattung Encholirium ist diese Artenzahl erstaunlich hoch. Bisher wurden an der taxonomisch als äußerst schwierig geltenden Gattung Dyckia keine detaillierten Untersuchungen zur Phylogenie durchgeführt. Selbst das Verhältnis zu Encholirium und die Monophylie der beiden Gattungen waren bisher weitestgehend unverstanden. Erste Hinweise auf eine geringe genetische Variabilität und ein junges Alter von Dyckia fanden sich im Rahmen einer vorausgegangenen Diplomarbeit (Krapp 2009). Die vorliegende Arbeit bietet nun deutlich tiefere Einblicke in die Natur und die Geschichte der interessanten Gattung Dyckia und stellt zukünftige Studien auf eine solide Basis. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden 58 Arten von Dyckia in 97 Akzessionen sowie 27 Vertreter nahe verwandter Gattungen untersucht. Für alle Pflanzen wurde eine vergleichende DNA-Sequenzierung von insgesamt sechs Abschnitten des Plastoms sowie des Exons 1 aus dem nukleären Gen Phytochrom C (phyC) durchgeführt. Die Länge der Alignments betrug 6.009 bp für den plastidären Datensatz und 1.159 bp für phyC. Aus den gewonnenen Daten wurden mittels verschiedener Algorithmen phylogenetische Bäume erstellt. Auf Basis der plastidären Sequenzen wurden zudem eine datierte Phylogenie und ein Haplotyp-Netzwerk zur Rekonstruktion der historischen Biogeographie der Gattung Dyckia ermittelt. Ferner wurde ein Set von 12 Primerpaaren zur Untersuchung längenpolymorpher plastidärer Mikrosatelliten (cpSSRs) entwickelt und dessen Einsetzbarkeit zur Verbesserung der phylogenetischen Auflösung geprüft. Zu den Fragen, die die wichtigsten Zielsetzungen der vorliegenden Arbeit markieren, konnten folgende Ergebnisse und daraus folgende Hypothesen erarbeitet werden: • Stellen die Gattungen Dyckia und Encholirium jeweils monophyletische Abstammungsgemeinschaften dar und wie ist ihr Verhältnis zueinander? Die ermittelten Phylogenien auf Basis plastidärer und nukleärer Sequenzdaten sowie morphologische Merkmale sprechen deutlich für eine Paraphylie von Encholirium. Dagegen ist die weitaus größere Gattung Dyckia aller Wahrscheinlichkeit nach monophyletisch und entstand aus Encholirium heraus. • Wann und wo trennten sich die Gattungen voneinander? 150 Zusammenfassung Die beiden Gattungen trennten sich vor etwa 4,0-4,5 Millionen Jahren. Die letzten gemeinsamen Vorfahren lebten vermutlich in Zentralbrasilien. Früh abzweigende Linien von Dyckia wurden in Mato Grosso do Sul nahe Paraguay und in Minas Gerais gefunden. • Können mittels vergleichender Sequenzierung plastidärer oder nukleärer DNA gut aufgelöste Phylogenien innerhalb von Dyckia rekonstruiert werden? Zeichnen sich Kladen innerhalb von Dyckia durch morphologische Synapomorphien aus? Die außergewöhnlich geringe Variabilität der Genome von Dyckia erlaubte es nicht, mittels der untersuchten Loci gut aufgelöste Phylogenien zu erzeugen. Der weitaus größte Teil der untersuchten Arten und Akzessionen bildete eine, hier als Core-Dyckia bezeichnete terminale Polytomie aus einzelnen Linien und größeren, geographisch definierten Gruppen. Die mangelnde Auflösung erschwerte auch die Identifikation möglicher Synapomorphien. In exemplarischen Merkmalskartierungen konnten keine Merkmale mit systematischer Relevanz auf Gattungsebene identifiziert werden. • Auf welchen Wegen gelangten die rezenten Vertreter von Dyckia in ihre heutigen Verbreitungsgebiete? Innerhalb von Dyckia zeigt sich eine sehr deutliche Korrelation zwischen der Phylogenie der Plastiden und dem geographischen Verbreitungsmuster. Ein phylogenetisches Netzwerk basierend auf plastidären Haplotypen erlaubt den Schluss, dass die allermeisten rezenten Linien vom äußersten Süden Brasiliens ausgehend in ihre heutigen Verbreitungsgebiete eingewandert sind. • In welchem zeitlichen Rahmen spielten sich die Ausbreitung und Diversifizierung von Dyckia ab? Eine erste, noch langsame Diversifizierung begann vermutlich vor 4,0 Millionen Jahren und wird nur durch die Abspaltung zweier kleiner rezenter Linien bezeugt. Alle Hauptlinien von Core-Dyckia entstanden etwa gleichzeitig vor etwa 2,9 Millionen Jahren. Die Diversifizierung der vier großen Kladen von Dyckia fand erst innerhalb der letzten 2,5 Millionen Jahre statt. • Welche Faktoren führten zur außergewöhnlich hohen Artenzahl von Dyckia verglichen mit Encholirium? Ein wesentlicher Grund für die höhere Artenzahl von Dyckia im Vergleich zu Encholirium ist zweifelsohne das größere Verbreitungsgebiet. Über weitere Gründe kann bisher nur spekuliert werden. So könnten die kleinräumigen Habitate von Dyckia-Arten stärker von den Klimaschwankungen des Pleistozäns beeinflusst worden sein. 151 Zusammenfassung • Gab es Radiationen? Innerhalb von Dyckia kam es mindestens zweimal zu besonders intensiven Diversifizierungswellen. Eine führte zur Entstehung aller Hauptlinien von Core-Dyckia im Süden Brasiliens. Die zweite große Radiation fand innerhalb der zentralbrasilianischen Klade statt und legte den Grundstein für die extrem hohe heutige Diversität insbesondere in den Campos Rupestres dieser Region. • Stellen die vielen beschriebenen Morphospezies distinkte genetische Abstammungseinheiten dar? Spiegelt sich die Plastizität morphologischer Merkmale auch in der genetischen Situation wider? Die Mehrzahl der einzelnen Morphospezies sind weder in der plastidären noch in der nukleären Phylogenie genetisch distinkt. Deutliche Unterschiede zwischen plastidärer und nukleärer Phylogenie sowie eine hohe allelische Variation am Locus phyC und das Auftreten zahlreicher heterozygoter Individuen sprechen für einen bemerkenswerten Grad an genetischer Durchmischung. Insofern spiegelt sich die Plastizität morphologischer Merkmale auch in der genetischen Situation wider. 152 Literaturverzeichnis 6 Literaturverzeichnis Abreu Ferreira, P. M. d., S. C. Müller, I. I. Boldrini & L. Eggers (2010): Floristic and vegetation structure of a granitic grassland in Southern Brazil. Revista Brasil. Bot. 33 (1): 21- 36. Akaike, H. (1973): Information theory and an extension of the maximum likelihood principle. In: B. N. Petrov and F. Csaki (Hrsg.) (1973): Proceedings of the Second International Symposium on Information Theory. Akademiai Kiado, Budapest. 267-281. Almeida, F. C., C. R. Bonvicino & P. Cordeiro-Estrela (2007): Phylogeny and temporal diversification of Calomys (Rodentia, Sigmodontinae): Implications for the biogeography of an endemic genus of the open/dry biomes of South America. Mol. Phylogenet. Evol. 42: 449- 466. Altschul, S. F., T. L. Madden, A. A. Schäffer, J. Zhang, Z. Zhang, W. Miller & D. J. 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Blüten.................................................................................................................11 Abbildung 8: Die Gattung Dyckia: Samen...............................................................................................................12 Abbildung 9: Klima, Biome und Geländehöhe im Verbreitungsgebiet von Dyckia..................................................14 Abbildung 10: Lebensraum von Dyckia...................................................................................................................16 Abbildung 11: Xeromorphe Anpassungen , extraflorale Nektarien und Bestäubung...............................................19 Abbildung 12: Historische Entwicklung der Anzahl anerkannter Arten von Dyckia und Encholirium......................22 Abbildung 13: Fundorte der in der vorliegenden Arbeit untersuchten Pflanzen von Dyckia....................................29 Abbildung 14: Genkarte des Plastoms von Typha latifolia (nach Guisinger et al. 2010).........................................38 Abbildung 15: Sequenzvariabilität verschiedener plastidärer Loci innerhalb von acht Arten von Dyckia................67 Abbildung 16: Ausschnitt aus dem Alignment für den Locus rps16-trnK.................................................................68 Abbildung 17: Bayes'sche Analyse der Einzel-Alignments der sechs sequenzierten plastidären Loci...................69 Abbildung 18: Datierte Phylogenie auf Basis sechs plastidärer Loci.......................................................................74 Abbildung 19: RAxML-Analyse auf Basis sechs plastidärer Loci............................................................................77 Abbildung 20: Einzelner kürzester Baum aus einer Parsimonieanalyse auf Basis sechs plastidärer Loci..............76 Abbildung 21: Bayes'sche Analyse auf Basis sechs plastidärer Loci......................................................................78 Abbildung 22: In der BEAST-Analyse ermittelte Substitutionsraten........................................................................80 Abbildung 23: Haplotyp-Netzwerk auf Basis sechs plastidärer Loci........................................................................82 Abbildung 24: Ausschnitt des Alignments für den Locus phyC...............................................................................87 Abbildung 25: Beobachtete Heterozygotie am Locus phyC....................................................................................88 Abbildung 26: Einzelner Baum aus einer Parsimonieanalyse auf Basis von phyC.................................................90 Abbildung 27: RAxML-Analyse auf Basis von phyC................................................................................................91 Abbildung 28: Bayes'sche Analyse auf Basis von phyC..........................................................................................92 Abbildung 29: Bayes'sche Analyse auf Basis von phyC mit reduziertem Probenset...............................................95 Abbildung 30: Amplifikation von cpSSR-Loci für ein Set aus drei Dyckia-Arten....................................................100 Abbildung 31: Kombinierte Bayes'sche Analyse von cpSSR- und Sequenzdaten................................................103 Abbildung 32: Bayes'sche Analyse auf Gattungsebene mit 12 cpSSR-Loci.........................................................102 Abbildung 33: Einfluss von cpSSR-Daten auf den Datensatz aus plastidären Sequenzen...................................114 Abbildung 35: Vergleich der Phylogenien aus AFLP- und plastidären Daten........................................................121 Abbildung 34: Vergleich der Phylogenien aus plastidären Daten und phyC.........................................................120 Abbildung 36: Merkmalskartierung auf die plastidäre Phylogenie.........................................................................130 Abbildung 37: Hypothese zur historischen Biogeographie....................................................................................134 Abbildung 38: Klimaentwicklung während der Geschichte von Dyckia.................................................................136 Abbildung 39: Modellierung der Ausdehnung von Campos Rupestres in vergangener Zeit.................................139 169 Tabellenverzeichnis 8 Tabellenverzeichnis Tabelle 1: Pflanzenmaterial.....................................................................................................................................30 Tabelle 2: PCR-Primer zur Amplifikation plastidärer DNA-Abschnitte.....................................................................40 Tabelle 3: PCR-Programme zur Amplifikation plastidärer DNA-Abschnitte ............................................................41 Tabelle 4: Zusammensetzung der PCR-Ansätze zur Amplifikation plastidärer DNA-Abschnitte.............................42 Tabelle 5: PCR-Primer zur Amplifikation nukleärer Loci..........................................................................................44 Tabelle 6: PCR-Programme zur Amplikation nukleärer Loci ..................................................................................45 Tabelle 7: Zusammensetzung der PCR-Ansätze zur Amplikation nukleärer Loci...................................................46 Tabelle 8: Zusammensetzung der PCR-Ansätze zur Amplikation plastidärer Mikrosatelliten (cpSSRs).................53 Tabelle 9: Alignment-Statistiken..............................................................................................................................72 Tabelle 10: Gefundene cpSSR-Loci und entwickelte Primer aus Alignments.........................................................96 Tabelle 11: Gefundene SSRs im 454-Datensatz.....................................................................................................97 Tabelle 12: Gefundene cpSSR-Loci und entwickelte Primer aus 454-Daten..........................................................98 Tabelle 13: Test aller entwickelter cpSSR-Primer auf Funktionalität und Variabilität..............................................99 Tabelle 14: Eigenschaften 12 näher charakterisierter cpSSR-Loci.......................................................................101 170 Abkürzungsverzeichnis 9 Abkürzungsverzeichnis A Adenin aff. affinis (lat., ähnlich mit, eng verwandt mit (aber nicht identisch)) AFLP amplified fragment-length polymorphism AIC Akaike information criterion, Akaikes Informationskriterium Aqua bidest zweifach destilliertes Wasser bp base pairs, Basenpaare BI Bayesian inference, Bayes'sche Statistik BS Bootstrap-Analyse/Bootstrap-Wert BSA bovine serum albumine C Cytosin CAM Crassulacean acid metabolism +CAT categorized distribution (bei Substitutionsmodellen) cf. collectio formarum (lat., ähnlich mit (Formenkreis)) CI ensemble consistency index, Konsistenzindex cpSSR chloroplast simple sequence repeat CTAB Cetyltrimethylammoniumbromid D. Dyckia ddNTPs Didesoxyribonukleosidtriphosphate DNA Desoxyribonukleinsäure dNTPs Desoxyribonukleosidtriphosphate E. Encholirium EDTA Ethylendiamintetraessigsäure ETS external transcribed spacer fwd forward, vorwärts G Guanin +G Gamma-Verteilung (bei Substitutionsmodellen) GTR general time reversible GTRCAT general time reversible, categorized HI homoplasy index, Homoplasieindex HKY Substitutionsmodell nach Hasegawa, Kushino & Yano +I invariant sites (bei Substitutionsmodellen) IR inverted repeat ITS internal transcribed spacer JK Jackknife-Analyse/Jackknife-Wert lat. lateinisch, aus dem Lateinischen LSC large single-copy MCMC Markov Chain Monte Carlo MC3 Metropolis-coupled Markov Chain Monte Carlo ML Maximum Likelihood MLBS Bootstrap-Wert aus einer Maximum Likelihood-Analyse MP maximum parsimony, Parsimonieanalyse 171 Abkürzungsverzeichnis MPBS Bootstrap-Wert aus einer Parsimonieanalyse NGS next-generation sequencing NJ Neighbour Joining nom. nud. nomen nudum (lat., ungültiger Name) NJBS Neighbour Joining Bootstrap-Wert NPRS non-parametric rate smoothing NTS non-transcribed spacer P. je nach Zusammenhang entweder Prionophyllum oder Pitcairnia PAA Polyacrylamid PAGE Polyacrylamidgelelektrophorese PCR polymerase chain reaction, Polymerasekettenreaktion PIC potentially parsimony-informative character PL penalyzed likelihood PP posterior probability PVP Polyvinylpyrrolidon RC rescaled consistency index rDNA ribosomale DNA rev reverse, rückwärts RI retention index, Retentionsindex RNA Ribonukleinsäure rpm rounds per minute rRNA ribosomale RNA s. n. sine nomine (lat., ohne Namen) spec. species (lat., (unbekannte) Art) SSB substitutions per site per billion years SSC small single-copy SSR simple sequence repeat T Thymin TBE Tris-Borat-EDTA TBR tree bisection and reconnection TE Tris-HCl-EDTA Tris Tris(hydroxymethyl)-aminomethan tRNA Transfer-RNA var. varietas (lat., Varietät) vgl. vergleiche v/v volume per volume, Volumen pro Gesamtvolumen w/v weight per volume, Gewicht pro Gesamtvolumen z. B. zum Beispiel 172 Anhang 10 Anhang 10.1 Elektronischer Anhang Im elektronischen Anhang befinden sich folgende Daten: • kombiniertes Alignment sechs plastidärer Loci für alle 124 Proben im NEXUS-Format (alignment_cp_kombiniert.nex) • Alignment der phyC-Sequenzen für alle 124 Proben im NEXUS-Format (alignment_phyc.nex) • cpSSR-Daten in Tabellenform (Tabstopp-getrenntes Textformat, cpssr.txt) 10.2 Übrige Anhänge Anhang 1: Verwendete Primer-Programm-Kombinationen für phyC.....................................................................174 Anhang 2: Phylogenie auf Basis von phyC für ein erweitertes Probenset.............................................................175 Anhang 3: Erweitertes Probenset für phyC: Pflanzentabelle.................................................................................176 Anhang 4: Spezifikationen der Software SeqSplitter 1.0.......................................................................................178 Anhang 5: Gelelektrophoretische Auftrennung der isolierten DNA-Proben...........................................................180 Anhang 6: Kombinierter plastidärer Datensatz: Neighbour Joining-Analyse.........................................................181 Anhang 7: Kombinierter plastidärer Datensatz: NJ Bootstrap-/Jackknife-Analyse................................................182 Anhang 8: Kombinierter plastidärer Datensatz: Parsimonieanalyse: Strict-Konsensusbaum...............................183 Anhang 9: Kombinierter plastidärer Datensatz: Haplotyp-Netzwerk mit DNA-Nummern......................................184 Anhang 10: PhyC-Datensatz: Neighbour Joining-Analyse....................................................................................185 Anhang 11: PhyC-Datensatz: Neighbour Joining Bootstrap-/Jackknife-Analyse...................................................186 Anhang 12: PhyC-Datensatz: Parsimonieanalyse: Strict-Konsensusbaum...........................................................187 Anhang 13: Einzelner plastidärer Locus: rpl32-trnL: Bayes'sche Analyse.............................................................188 Anhang 14: Einzelner plastidärer Locus: rps16-trnK: Bayes'sche Analyse...........................................................189 Anhang 15: Einzelner plastidärer Locus: matK: Bayes'sche Analyse....................................................................190 Anhang 16: Einzelner plastidärer Locus: rps16-Intron: Bayes'sche Analyse.........................................................191 Anhang 17: Einzelner plastidärer Locus: petD-Intron: Bayes'sche Analyse..........................................................192 Anhang 18: Einzelner plastidärer Locus: trnD-trnT: Bayes'sche Analyse..............................................................193 Anhang 19: Detaillierte Ergebnisse der cpSSR-Analyse.......................................................................................194 173 Anhang Anhang 1: Verwendete Primer-Programm-Kombinationen für phyC Die Ansätze sind chronologisch geordnet, die ältesten Versuche stehen ganz oben. In der ersten Spalte ist die Art des Ansatzes vermerkt (D: direkt, N: nested PCR, B: band-stab-Methode). Die Programme finden sich in Tabelle 6, die Primer in Tabelle 5. Nicht durchgeführte oder nicht zutreffende Schritte sind mit n/a gekennzeichnet. Die angegebenen Änderungen sind jeweils gegenüber dem vorhergehenden Programm zu verstehen (TA: Annealingtemperatur, n: Zyklenzahl, ↑: Erhöhung, ↓: Verringerung, Stammlösung: Verwendung von zehnfach höher konzentrierter DNA in der ersten Stufe als sonst, Teil-Loci: Amplifikation der Einzelteile anstatt des Gesamtfragmentes in der ersten Stufe einer band-stab-PCR). Typ Programm 1. Stufe Primer 1. Stufe Ergebnis 1. Stufe Programm 2. Stufe Primer 2. Stufe Ergebnis 2. Stufe Sequenzierung Änderung D PHYC_Barfuss komplett keine Banden n/a n/a n/a n/a D phyc_20100518 komplett Teil a Teil b gut gut gut n/a n/a n/a n/a n↑, TA↓ D phyc_20100527 M13-komplett M13-Teil a M13-Teil b viele Zusatzbanden einige Zusatzbanden kaum Zusatzbanden n/a n/a n/a n/a schwach schlecht n↑, +M13 D phyc_20100531 M13-Teil a M13-Teil b gut gut n/a n/a n/a schwach, Ausfälle ok TA↑ D phyc_20100607 M13-Teil a M13-Teil b gut gut n/a n/a n/a schwach, Ausfälle ok TA↑ N phyc_nest_1_ 20100608 komplett sehr schwach phyc_nest_2_ 20100608 M13-Teil a M13-Teil b gut gut einige Ausfälle einige Ausfälle N phyc_nest_1_ 20100608 komplett sehr schwach phyc_nest_2_ 20100614 M13-Teil a M13-Teil b gut gut ok, schwach ok, schwach 2. PCR n↑ N phyc_nest_1_ 20100715 komplett starke Stotterbanden phyc_nest_2_ 20100608 M13-Teil a M13-Teil b gut gut schlecht schlecht 1. PCR n↑ N phyc_nest_1_ 20100608 komplett starke Stotterbanden phyc_nest_2_ 20100608 M13-Teil a M13-Teil b gut gut schlecht schlecht 1. PCR n↓ N phyc_nest_1_ 20100906 komplett sehr schwach phyc_nest_2_ 20100906 M13-Teil a M13-Teil b gut gut n/a 2. PCR n↓ N phyc_20100518 komplett Teil a Teil b starke Stotterbanden kein Fragment gut n/a n/a n/a n/a TA↓ B phyc_20100518 komplett starke Stotterbanden phyc_bandstab_2_ 20101109 M13-Teil a M13-Teil b Ausfälle ok n/a schwach Stamm- lösung B phyc_bandstab_1_ 20101110 Teil a Teil b keine Fragmente keine Fragmente n/a n/a n/a n/a Teil-Loci in 1. PCR B phyc_bandstab_1_ 20101111 komplett gut, Stotterbanden phyc_bandstab_2_ 20101110 M13-Teil a M13-Teil b gut gut gut gut 2. PCR TA↓ B phyc_bandstab_1_ 20110121 Teil a Teil b gut, Zusatzbanden gut, Zusatzbanden phyc_bandstab_2_ 20101110 M13-Teil a M13-Teil b gut gut gut gut Teil-Loci in 1. PCR 174 Anhang 175 Anhang 2: Phylogenie auf Basis von phyC für ein erweitertes Probenset Gezeigt ist der 50% Majority Rule-Konsensusbaum aus einer Analyse mit MrBayes 3.1.2. Die Analyse wurde in zwei unabhängigen Läufen mit je 2.500.000 Generationen durchgeführt. Von den resultierenden Bäumen wurden 10% als Burn-in verworfen. Über den Ästen finden sich die Posterioriwahrscheinlichkeiten. Die Astlängen repräsentieren die erwartete Menge an substituierten Alignmentpositionen entsprechend der Maßstabsleiste am unteren Bildrand. Unter den Ästen Bootstrap-Werte aus je 1.000 Wiederholungen einer Parsimonieanalyse und einer RAxML-Analyse des gleichen Datensatzes (Parsimonieanalyse/RAxML-Analyse). Deuterocohnia brevispicata N 160 Deuterocohnia longipetala N 116 Deuterocohnia scapigera N 215 Deuterocohnia chrysantha C 156 Deuterocohnia strobilifera N 167 Fosterella hatschbachii B033 Fosterella vasquesii 063b Deuterocohnia glandulosa N 134 Fosterella rusbyi B020 Fosterella albicans 062a Fosterella kroemeri 028b Fosterella spectabilis B025 Fosterella windischii B021 Deuterocohnia schreiteri N 201 Deuterocohnia digitata N 141 Deuterocohnia longipetala N 176 Deuterocohnia digitata N 192 Fosterella robertreadii B018 Fosterella albicans B010 Deuterocohnia pedicellata N 293 Deuterocohnia brevispicata N 112 Fosterella caulescens 003a Fosterella rexiae 009d Deuterocohnia schreiteri N 197 Deuterocohnia chrysantha C 159 Fosterella albicans 064a Fosterella yuvinkae 072a Fosterella christophii B012 Fosterella gracilis 117a Fosterella graminea 071a Deuterocohnia brevifolia N 106 Deuterocohnia recurvipetala N 144 Fosterella windischii 139b Deuterocohnia meziana N 244 Fosterella petiolata B017 Deuterocohnia brevifolia N 120 Fosterella batistana 129a Deuterocohnia brevifolia N 138 Deuterocohnia strobilifera N 177 Fosterella micrantha B034 Pitcairnia rectiflora Pit 28 Pitcairnia villetaensis Pit 09 Pitcairnia x darblayana Pit 32 Pitcairnia jimenezii Pit 14 Pitcairnia utcubambensis Pit 15 Pitcairnia yaupi bajaensis Pit 12 Ochagavia elegans BT58 Pitcairnia heterophylla Pit 03 FK0083 Pitcairnia atrorubens Pit 20 Pitcairnia breedlovei Pit 21 Puya herzogii FK0121 Pitcairnia aff. calderonii Pit 18 Pitcairnia feliciana Pit xx FK0119 Puya ferruginea FK0082 Pitcairnia riparia Pit 08 Pitcairnia integrifolia Pit 24 Pitcairnia pseudoundulata Pit 27 Pitcairnia aff. lopezii Pit 01 Pitcairnia riparia Pit 11 Pitcairnia atrorubens Pit 16 Pitcairnia grafii Pit 23 Pitcairnia lignosa Pit 25 Pitcairnia piepenbringii Pit 07 FK0085 Pitcairnia flammea Pit 22 Pitcairnia heterophylla Pit 04 Pitcairnia spicata Pit 17 Pitcairnia abundans Pit 06 Pitcairnia aff. calderonii Pit 19 Pitcairnia sulfhurea Pit 31 Pitcairnia aff. pungens Pit 02 FK0084 Pitcairnia rubronigriflora Pit 29 Pitcairnia aff. calderonii Pit 05 Fosterella vasquezii 023b Fosterella weberbaueri 138b Tillandsia usneoides BT70 Puya lineata* Puya bicolor* Puya goudotiana* Puya alpestris* Puya raimondii* Puya boliviensis* Puya chilensis* Puya gilmartiniae* Puya dyckioides* Puya ultima* Puya venusta* Puya angusta* Puya coerulea* Billbergia euphemiae* Billbergia laxiflora* Aechmea nudicaulis* Portea fosteriana* Pitcairnia sanguinea* Pitcairnia orchidifolia* Ananas comosus* Cryptanthus bromelioides* Neoregelia cruenta* Ananas nanus* Orthophytum gurkenii* Bromelia balansae* Cryptanthus dorothyae* Bromelia agavifolia* Deinacanthon urbanianum* Greigia spec.* Bromelia flemingii* Ochagavia elegans* 0.2 1 85/870.99 62/711 80/851 53/65 1 99/99 0.69 -/- 0.79 -/- 1 99/100 1 97/99 0.97 71/75 0.60 -/- 0.57 -/- 0.88 -/- 0.58 -/- 0.76 -/- 0.54 -/- 0.98 64/70 0.99 -/90 1 86/96 0.6 -/82 0.65 -/- 0.66 55/71 1 89/92 0.61 -/- 0.99 59/70 1 83/93 1 63/95 0.98 63/64 0.55 -/- 1 87/93 1 99/100 0.66 -/- 0.5 -/- 1 97/99 1 80/830.9853/60 0.83 63/61 0.81 50/61 0.62 -/- 0.71 -/- 1 88/93 1 99/100 1 97/1001 99/100 0.98 53/64 0.98 66/71 0.65 -/56 0.64 55/69 0.72 -/- 1 64/85 1 91/96 1 99/100 1 100/100 1 100/100 1 86/910.58 -/60 0.79 -/58 1 88/90 0.76 65/71 0.98 60/65 1 100/100 0.98 70/91 1 100/100 Dyckia microcalyx FK0054 Dyckia estevesii FK0001 Dyckia leptostachya FK0053 Dyckia velascana FK0006 Dyckia marnier lapostollei FK0030 Dyckia ferox FK0020 Dyckia brachyphylla FK0045 Dyckia aff. ibiramensis FK0025 Encholirium spec. FK0080 Dyckia aff. pumila FK0017 Encholirium horridum FK0070 Dyckia ursina FK0012 Dyckia cinerea FK0047 Dyckia tobatiensis FK0018 Dyckia oligantha FK0036 Dyckia dawsonii FK0043 Dyckia vestita FK0032 Dyckia remotiflora FK0068 Dyckia estevesii FK0005 Dyckia choristaminea FK0021 Dyckia beateae FK0044 Dyckia aff. reitzii FK0050 Encholirium spec. FK0014 Dyckia brevifolia FK0067 Dyckia floribunda FK0052 Encholirium spec. FK0078 Dyckia rariflora FK0039 Dyckia lindevaldae FK0019 Encholirium spec. FK0079 Dyckia braunii FK0042 Dyckia hebdingii FK0013 Dyckia goehringii FK0031 Dyckia granmogulensis FK0007 Dyckia marnier lapostollei FK0029 1 95/99 0.99 -/780.96-/59 0.65 -/- 0.66 -/- 0.97 64/860.84-/- 0.56 -/- 0.56 -/- 0.68 52/90 0.99 72/84 0.99 63/880.8361/- 0.89 75/82 0.57 -/- 0.52 -/- 1 96/99 0.62 -/50 Anhang Anhang 3: Erweitertes Probenset für phyC: Pflanzentabelle Gezeigt ist eine Auflistung aller im erweiterten Probenset für phyC enthaltenen Pflanzen (Anhang 2). Die Sammler-Nummern sind angegeben, falls bekannt (s. n.: ohne bekannte Nummer). Die Garten-ID ist für in Lebendsammlungen kultivierte Pflanzen angegeben (B: Botanischer Garten Berlin-Dahlem, BGHD: Botanischer Garten Heidelberg, BONN: Botanischer Garten Bonn, FAN: Fundacion Amigos de la Naturaleza (Santa Cruz, Bolivia), KAS: Botanischer Garten der Universität Kassel, Leme: Lebendsammlung von Dr. Elton Leme (Teresópolis, Brasilien), MB: Botanischer Garten Marburg, WU: Botanischer Garten der Universität Wien). Fundorte sind jeweils als Kombination von Land (BR: Brasilien, BOL: Bolivien, CO: Kolumbien, DOM: Dominikanische Republik, EC: Ecuador, GT: Guatemala, HN: Honduras MEX: Mexico, PE: Peru, PY: Paraguay, RA: Argentinien, RCH: Chile, RG: Guinea (Westafrika), ROU: Uruguay, YV: Venezuela) und Bundesstaat angegeben. Die DNA-ID dient der eindeutigen Identifizierung der Proben im Labor, FK-Nummern entsprechen denen aus Tabelle 1. Im Falle der aus der Publikation von Jabaily & Sytsma (2010) entnommenen Sequenzen sind jeweils nur die GenBank-Nummern vermerkt. Art, Autor Sammler-Nummer, Lebendpflanze Genbankeintrag Fundort DNA-ID Publikation Aechmea nudicaulis (L.) Grisebach FJ968256 Jabaily & Sytsma (2010) Ananas comosus (L.) Merr. FJ968247 Jabaily & Sytsma (2010) Ananas nanus (l.B. Smith) L.B. Smith FJ968242 Jabaily & Sytsma (2010) Billbergia euphemiae E.Morren FJ968246 Jabaily & Sytsma (2010) Billbergia laxiflora L.B. Smith FJ968236 Jabaily & Sytsma (2010) Bromelia agavifolia Brongniart ex Houllet FJ968241 Jabaily & Sytsma (2010) Bromelia balansae Mez FJ968248 Jabaily & Sytsma (2010) Bromelia flemingii I.Ramírez & Carnevali FJ968240 Jabaily & Sytsma (2010) Cryptanthus bromelioides Otto & Dietrich FJ968245 Jabaily & Sytsma (2010) Cryptanthus dorothyae Leme FJ968238 Jabaily & Sytsma (2010) Deinacanthon urbanianum (mez) Mez FJ968244 Jabaily & Sytsma (2010) Deuterocohnia brevifolia (Griseb.) M.A. Spencer & L.B. Sm. s. n., B 118-02-74-83 unbekannt N 120 Schütz (2012) Deuterocohnia brevifolia (Griseb.) M.A. Spencer & L.B. Sm. M. Balfanz 075 , BGHD 107170 BOL, Tarija N 138 Schütz (2012) Deuterocohnia brevifolia (Griseb.) M.A. Spencer & L.B. Sm. s. n., KAS NiSch 106 unbekannt N 106 Schütz (2012) Deuterocohnia brevispicata Rauh & L. Hrom. L. Hromadnik 5213, B 164-09-98-30 BOL, Chuquisaca N 112 Schütz (2012) Deuterocohnia brevispicata Rauh & L. Hrom. N. Schütz 06-022, Feldsammlung BOL, Santa Cruz N 160 Schütz (2012) Deuterocohnia chrysantha (Phil.) Mez G. Zizka 8156, Feldsammlung RCH, Antofagasta C 156 Schütz (2012) Deuterocohnia chrysantha (Phil.) Mez G. Zizka 8159, Feldsammlung RCH, Antofagasta C 159 Schütz (2012) Deuterocohnia digitata L.B. Sm. W. Rauh 64142 , BGHD 130000 RA, Salta N 141 Schütz (2012) Deuterocohnia digitata L.B. Sm. N. Schütz 06-098, Feldsammlung RA, Salta N 192 Schütz (2012) Deuterocohnia glandulosa E. Gross L. Hromadnik 5167 , BGHD 103854 BOL, Tarija N 134 Schütz (2012) Deuterocohnia longipetala Mez s. n., B 285-01-89-83 unbekannt N 116 Schütz (2012) Deuterocohnia longipetala Mez N. Schütz 06-067, Feldsammlung BOL, Tarija N 176 Schütz (2012) Deuterocohnia meziana ssp. pedicellata (W. Till) N. Schütz N. Schütz 09 / 009, Feldsammlung BOL, Chuquisaca N 293 Schütz (2012) Deuterocohnia recurvipetala E. Gross W. Rauh 64236 , BGHD 130120 RA N 144 Schütz (2012) Deuterocohnia sanctae-crucis (R. Vásquez & Ibisch) N. Schütz R. Müller 259 , Privatsammlung R. Vásquez BOL, Santa Cruz N 215 Schütz (2012) Deuterocohnia schreiteri A. Cast. N. Schütz 06-104, Feldsammlung RA, Salta N 197 Schütz (2012) Deuterocohnia schreiteri A. Cast. N. Schütz 06-108, Feldsammlung RA, Salta N 201 Schütz (2012) Deuterocohnia strobilifera Mez N. Schütz 06-046, Feldsammlung BOL, Chuquisaca N 167 Schütz (2012) Deuterocohnia strobilifera Mez N. Schütz 06-072, Feldsammlung BOL, Chuquisaca N 177 Schütz (2012) Deuterocohniam meziana ssp. meziana Kuntze ex Mez E. Gouda 95-21, BGHD 104977 BOL, Santa Cruz N 244 Schütz (2012) Dyckia aff. ibiramensis Reitz L. Horst 1287, BGHD 130023 BR, Minas Gerais FK0025 diese Arbeit Dyckia aff. pumila L.B. Sm. P. Braun BR 696, BGHD 104592 BR, Mato Grosso FK0017 diese Arbeit Dyckia aff. reitzii L.B. Sm. A. Hofacker 386, WU B 02/62-1 BR, Rio Grande do Sul FK0050 diese Arbeit Dyckia beateae E. Gross & Rauh P. Braun 560, BONN 4338 BR, Mato Grosso FK0044 diese Arbeit Dyckia brachyphylla L.B. Sm. P. Braun 836, BONN 3644 BR, Minas Gerais FK0045 diese Arbeit Dyckia braunii Rauh P. Braun 690, BONN 4339 BR, Goiás FK0042 diese Arbeit Dyckia brevifolia Baker s. n., KAS s. n. BR FK0067 diese Arbeit Dyckia choristaminea Mez s. n., BGHD 130018 BR, Rio Grande do Sul FK0021 diese Arbeit Dyckia cinerea Mez s. n., BONN 4348 BR, Minas Gerais FK0047 diese Arbeit Dyckia dawsonii L.B. Sm. s. n., BONN 16540 BR, Goiás FK0043 diese Arbeit Dyckia estevesii Rauh E. Esteves Pereira s. n., BGHD 105012 BR, Goiás FK0005 diese Arbeit Dyckia estevesii Rauh P. Braun s. n., BGHD 105188 BR, Goiás FK0001 diese Arbeit Dyckia ferox Mez W. Rauh 64237, BGHD 130031 RA, Cordoba FK0020 diese Arbeit Dyckia floribunda Grieseb. W. Till 5069, WU 115/90 RA, La Rioja FK0052 diese Arbeit Dyckia goehringii E. Gross & Rauh W. Rauh 67622, BGHD 105013 BR, Minas Gerais FK0031 diese Arbeit Dyckia granmogulensis Rauh W. Rauh 56484, BGHD 130019 BR, Minas Gerais FK0007 diese Arbeit Dyckia hebdingii L.B. Sm. s. n., BGHD 103913 BR, Rio Grande do Sul FK0013 diese Arbeit Dyckia leptostachya Baker H. Amerhauser s. n., WU B 395/96 PY, Cordillera FK0053 diese Arbeit Dyckia lindevaldae Rauh P. Braun BR 691, BGHD 108614 BR, Goiás FK0019 diese Arbeit Dyckia marnier-lapostollei var. estevesii Rauh L. Horst 5, BGHD 130151 BR, Goiás FK0030 diese Arbeit Dyckia marnier-lapostollei var. marnier-lapostollei L.B. Sm. L. Horst 4, BGHD 130234 BR, Goiás FK0029 diese Arbeit Dyckia microcalyx Baker W. Till 6020, WU AB 57 PY, Paraguari FK0054 diese Arbeit Dyckia oligantha L.B. Sm. W. Barthlott 10327, BONN 4346 BR, Minas Gerais FK0036 diese Arbeit Dyckia rariflora Schult f. s. n., BONN 2411 BR, Minas Gerais FK0039 diese Arbeit Dyckia remotiflora Otto & A. Dietr. s. n., KAS s. n. ROU FK0068 diese Arbeit Dyckia tobatiensis Hassl. W. & S. Till 6050, BGHD 102969 PY, Cordillera FK0018 diese Arbeit Dyckia ursina L.B. Sm. s. n., BGHD 103809 BR, Minas Gerais FK0012 diese Arbeit Dyckia velascana Mez W. & S. Till 5012, BGHD 103740 RA, Cordoba FK0006 diese Arbeit Dyckia vestita Hassl. W. & S. Till 6018, BGHD 103741 PY, Paraguari FK0032 diese Arbeit Encholirium horridum L.B. Sm. W. Schindhelm s. n., BGHD 108213 BR, Minas Gerais FK0070 diese Arbeit Encholirium spec. R. Schulz s. n., BGHD 112920 BR FK0080 diese Arbeit Encholirium spec. R. Schulz s. n., BGHD 125585 BR FK0078 diese Arbeit Encholirium spec. W. Rauh 56468, BGHD 130033 BR, Bahia FK0014 diese Arbeit Encholirium spec. R. Schulz s. n., BGHD 143704 BR FK0079 diese Arbeit Fosterella albicans (Griseb.) L.B.Smith P. Ibisch 98.0204, FAN PI 98.0204 BOL, Santa Cruz 064a Wagner et al. (2012) Fosterella albicans (Griseb.) L.B.Smith R. Vàsquez 3617, FAN RV 3617 BOL, La Paz 062a Wagner et al. (2012) Fosterella albicans (Griseb.) L.B.Smith J. Peters 06.0005, KAS JP06.005 BOL, Santa Cruz B010 Wagner et al. (2012) Fosterella batistana Ibisch, Leme & J.Peters F. da Silva s. n., Leme 5078 BR, Pará 129a Wagner et al. (2012) Fosterella caulescens Rauh W. Rauh 40579 a, FRP 99-18434-3 BOL, La Paz 003a Wagner et al. (2012) Fosterella christophii Ibisch, R.Vásquez & J.Peters P. Ibisch 02.0002, KAS PI 0.0002 BOL, Santa Cruz B012 Wagner et al. (2012) Fosterella gracilis (Rusby) L.B.Smith RS 281002-6, FAN RS 281002-6 BOL, Beni 117a Wagner et al. (2012) Fosterella graminea (L.B.Smith) L.B.Smith Müller 216, FAN RM 216 BOL, La Paz 071a Wagner et al. (2012) Fosterella hatschbachii L.B.Smith & R.W.Read E. Leme 7100, Leme 7100 BR, Mato Grosso B033 Wagner et al. (2012) 176 Anhang Art, Autor Sammler-Nummer, Lebendpflanze Genbankeintrag Fundort DNA-ID Publikation Fosterella kroemeri Ibisch, R.Vásquez & J.Peters THO 1398b, FAN TK 1398b BOL, La Paz 028b Wagner et al. (2012) Fosterella micrantha (Lindl.) L.B.Smith Welz 3124, BGHD 103726 GCA, Suchitepequez B034 Wagner et al. (2012) Fosterella petiolata (Mez) L.B.Smith J. Peters 06.0115, KAS JP 06.0115 PE, Cusco B017 Wagner et al. (2012) Fosterella rexiae Ibisch, R.Vásquez & E.Gross R. Vàsquez 3673, FAN RV 3673 BOL, La Paz 009d Wagner et al. (2012) Fosterella robertreadii Ibisch & J.Peters J. Peters 06.0126, KAS JP 06.0126 PE, Cuzco B018 Wagner et al. (2012) Fosterella rusbyi (Mez) L.B.Smith J. Peters 06.0076, KAS JP06.0076 BOL, La Paz B020 Wagner et al. (2012) Fosterella spectabilis H.Luther J. Peters 06.0045, KAS JP 06.0045 BOL, Chuquisaca B025 Wagner et al. (2012) Fosterella vasquesii E.Gross & Ibisch P. Ibisch 98.0116, FAN PI 98.0116 BOL, Santa Cruz 063b Wagner et al. (2012) Fosterella vasquesii E.Gross & Ibisch P. Ibisch 98.0117, FAN PI 98.0117 BOL, Santa Cruz 023b Wagner et al. (2012) Fosterella weberbaueri (Mez) L.B.Smith T. Krömer 7286, BGHD 105332 BOL, Cochabamba 138b Wagner et al. (2012) Fosterella windischii L.B.Smith & R.W.Read P. Ibisch 03.0016, FAN PI 03.0016 BOL, Santa Cruz 139b Wagner et al. (2012) Fosterella windischii L.B.Smith & R.W.Read E. Leme 7144, Leme 7144 BR, Mato Grosso B021 Wagner et al. (2012) Fosterella yuvinkae Ibisch, R.Vásquez, E.Gross & S.Reichle S. Reichle SR1, FAN SR1 BOL, Santa Cruz 072a Wagner et al. (2012) Greigia spec. FJ968284 Jabaily & Sytsma (2010) Neoregelia cruenta (Graham) L.B.Sm. FJ968239 Jabaily & Sytsma (2010) Ochagavia elegans Phil. D. Bruhin s. n., BGHD 102663 RCH, Valparaiso BT 58 Krapp, unveröffentlicht Ochagavia elegans Phil. FJ968237 Jabaily & Sytsma (2010) Orthophytum gurkenii Hutchison FJ968272 Jabaily & Sytsma (2010) Pitcairnia abundans L.B. Sm. s. n., BGHD 130636 unbekannt Pit_06 Krapp, unveröffentlicht Pitcairnia aff. calderonii Standl. & L.B. Sm. W. Rauh s. n., BGHD 130607 unbekannt Pit_05 Krapp, unveröffentlicht Pitcairnia aff. calderonii Standl. & L.B. Sm. G. Noller s. n., BGHD 132607 MEX, Chiapas Pit_18 Krapp, unveröffentlicht Pitcairnia aff. calderonii Standl. & L.B. Sm. E. Kamm, BGHD 132612 HN Pit_19 Krapp, unveröffentlicht Pitcairnia aff. lopezii L.B. Sm. Goebel s. n., BGHD 130622 PE, La Libertad Pit_01 Krapp, unveröffentlicht Pitcairnia aff. pungens Kunth W. Rauh 69140, BGHD 130648 PE, Lambayeque FK0084 diese Arbeit Pitcairnia atrorubens (Beer) Baker W. Rauh 38861, BGHD 104598 GCA, Escuintla Pit_20 Krapp, unveröffentlicht Pitcairnia atrorubens (Beer) Baker s. n., BGHD 130379 unbekannt Pit_16 Krapp, unveröffentlicht Pitcairnia breedlovei L.B. Sm. W. Rauh 52598, BGHD 132652 MEX, Oaxaca Pit_21 Krapp, unveröffentlicht Pitcairnia feliciana (A. Chev.) Harms & Mildbr. I. Ebert & D. Bangoura s. n., WU s. n. RG, Monte Gangan FK0119 diese Arbeit Pitcairnia flammea Lindl. var. glabrior L.B. Sm. R. Kautzky s. n., BGHD 130368 BR Pit_22 Krapp, unveröffentlicht Pitcairnia grafii Rauh E. Graf s. n., BGHD 102579 YV, Tachira Pit_23 Krapp, unveröffentlicht Pitcairnia heterophylla Beer K. Senghas 11230, BGHD 104945 MEX, Guerrero FK0083 diese Arbeit Pitcairnia heterophylla Beer s. n., BGHD 130626 unbekannt Pit_04 Krapp, unveröffentlicht Pitcairnia integrifolia Ker Gawl. C. Innes s. n., BGHD 132666 St. Vincent (Kleine Antillen) Pit_24 Krapp, unveröffentlicht Pitcairnia jimenezii L.B. Sm. L. Ariza-Julia s. n., BGHD 104140 unbekannt Pit_14 Krapp, unveröffentlicht Pitcairnia lignosa L.B. Sm. Leist s. n., BGHD 103586 EC, Imbabura/Carchi Pit_25 Krapp, unveröffentlicht Pitcairnia orchidifolia Mez FJ968253 Jabaily & Sytsma (2010) Pitcairnia piepenbringii Rauh & Gross Rauh 67430, BGHD 103786 BR, Bahia FK0085 diese Arbeit Pitcairnia pseudoundulata Rauh W. Rauh 40159, BGHD 132642 PE, Amazonas Pit_27 Krapp, unveröffentlicht Pitcairnia rectiflora Rauh W. Rauh 53673, BGHD 103565 PE, San Martin Pit_28 Krapp, unveröffentlicht Pitcairnia riparia Mez M. Miyagawa s. n., BGHD 103060 BOL, Beni Pit_11 Krapp, unveröffentlicht Pitcairnia riparia Mez K. Senghas, BGHD 103083 EC, Morona Santiago Pit_08 Krapp, unveröffentlicht Pitcairnia rubronigriflora Rauh W. Rauh 53676, BGHD 103787 PE, San Martin Pit_29 Krapp, unveröffentlicht Pitcairnia sanguinea (H. Luther) D.C. Taylor & H. Robinson FJ968252 Jabaily & Sytsma (2010) Pitcairnia spicata (Lam.) Mez L. Ariza-Julia s. n., BGHD 130021 Martinique (Kleine Antillen) Pit_17 Krapp, unveröffentlicht Pitcairnia sulphurea Mez s. n., BGHD 104601 unbekannt Pit_31 Krapp, unveröffentlicht Pitcairnia utcubambensis Rauh W. Rauh 53566, BGHD 104868 PE, Amazonas Pit_15 Krapp, unveröffentlicht Pitcairnia villetaensis Rauh W. Rauh 37089, BGHD 104225 CO, Cundinamarca Pit_09 Krapp, unveröffentlicht Pitcairnia x darblayana Sallier s. n., BGHD 132641 unbekannt Pit_32 Krapp, unveröffentlicht Pitcairnia yaupi-bajaensis Rauh W. Rauh 25718, BGHD 103785 PE, Pasco Pit_12 Krapp, unveröffentlicht Portea fosteriana L.B.Smith FJ968235 Jabaily & Sytsma (2010) Puya alpestris (Poeppig) Gay FJ968269 Jabaily & Sytsma (2010) Puya angusta L.B. Smith FJ968288 Jabaily & Sytsma (2010) Puya bicolor Mez FJ968282 Jabaily & Sytsma (2010) Puya boliviensis Baker FJ968270 Jabaily & Sytsma (2010) Puya chilensis Molina FJ968268 Jabaily & Sytsma (2010) Puya coerula Lindl. FJ968263 Jabaily & Sytsma (2010) Puya dyckioides (Baker) Mez FJ968258 Jabaily & Sytsma (2010) Puya ferruginea (Ruiz & Pav.) L.B. Sm. W. Rauh s. n., BGHD 130165 PE, Valley of Rio Marañon FK0082 diese Arbeit Puya gilmartiniae G.S.Varadarajan & Flores FJ968262 Jabaily & Sytsma (2010) Puya goudotiana Mez FJ968281 Jabaily & Sytsma (2010) Puya herzogii Wittm. T. Krömer 6581, BGHD 135240 BOL, Cochabamba FK0121 diese Arbeit Puya lineata Mez FJ968283 Jabaily & Sytsma (2010) Puya raimondii Harms FJ968293 Jabaily & Sytsma (2010) Puya ultima L.B. Smith FJ968251 Jabaily & Sytsma (2010) Puya venusta R. Philippi FJ968267 Jabaily & Sytsma (2010) Tillandsia usneoides L. W. Rauh s. n., BGHD 130959 RA, Yungas Cachi BT70 Krapp, unveröffentlicht 177 Anhang Anhang 4: Spezifikationen der Software SeqSplitter 1.0 Einsatzgebiet des Programms Das Programm SeqSplitter 1.0 dient der Auswertung und Modifikation von Sequenzalignments. Einsatz findet es für durch direkte Sequenzierung von PCR-Produkten gewonnene Daten, welche überlagerte Sequenzen von Allelen identischer Länge enthalten. Das Programm wurde in der Entwicklungsumgebung Lazarus (Version 0.9.30 win 64, GPL/LGPL-Lizenz) für die Programmiersprache Free Pascal (Version 2.4.2 win 64, GPL/LGPL-Lizenz) entwickelt. SeqSplitter 1.0 ist ausschließlich für das Betriebssystem Microsoft Windows 7 Home Premium (64 Bit) getestet worden. Abbildung: Benutzeroberfläche von SeqSplitter 1.0 unter Microsoft Windows 7 Auf der linken Seite finden sich die originalen Sequenzdaten, auf der rechten Seite die modifizierten Daten. Im unteren Bereich werden die Arbeitsschritte protokolliert. Funktionen File → Load fasta Lädt ein Sequenzalignment im Fast-Format, welches dann im linken Teil des Fensters dargestellt wird. File → Quit Beendet das Programm. Actions → Log sequence statistics Diese Funktion analysiert jede Sequenz einzeln und schreibt diverse Eigenschaften in eine Tabelle (Tabstopp- getrenntes Textformat, standardmäßig als statistics_output.txt). Für jede Sequenz werden angegeben: Name (Sequence name), Länge (Length), GC-Gehalt (GC value), Anzahl homozygoter Positionen (Homozygous positions), Anzahl heterozygoter Positionen insgesamt (Heterozygous positions), Zahl unsicherer Positionen mit zwei möglichen Nukleotiden (BiState postions), Zahl unsicherer Positionen mit drei möglichen Nukleotiden (TriState positions) und Vorkommen der einzelnen Nukleotide in der Sequenz (A, C, G, T, M, R, W, S, Y, K, B, D, H, V, N, Gaps, unbekannte (nicht-IUPAC-) Symbole). Actions → Split and export as fasta Jede der geladenen Sequenzen wird in zwei Tochtersequenzen (Allele) zerlegt. An eindeutigen Positionen (A, C, G, T und Gap (-, . oder ?)) erhält die Tochtersequenz das entsprechende Nukleotid. Dasselbe gilt für die uneindeutigen Symbole, welche mehr als zwei mögliche Nukleotide repräsentieren (B, D, H, V und N, sowie unbekannte (nicht-IUPAC-) Symbole). Für die übrigen (M, R, W, S, Y und K) erhält jede Tochtersequenz nach 178 Anhang dem Zufallsprinzip je ein anderes der beiden möglichen Nukleotide. Die generierten Sequenzen werden direkt im Fasta-Format abgespeichert (standardmäßig als splitted_output.fas). Actions → Reduce to homozygous positions Diese Funktion löscht alle Positionen des geladenen Alignments, an der mehr als n Sequenzen ein uneindeutiges Nukleotid aufweisen (M, R, W, S, Y, K, B, D, H oder V). Der Wert n entspricht der Einstellung „Reduction threshold“ (siehe unten). Ein Wert von n=0 entspricht der Einstellung „Reduce any heterozygous position“. Das modifizierte Alignment wird direkt im Fasta-Format abgespeichert (standardmäßig als reduced_output.fas). Actions → Save log to file Speichert alle Informationen, welche im unteren Bereich des Fensters protokolliert wurden, als Textdokument (standardmäßig als log.txt). Settings → Randomize/Use seed ()/Set seed Diese Einstellungen betreffen den Zufallsgenerator des Programms. Wird die „Randomize“-Funktion verwendet, wird der Zufallsgenerator mit einem zufälligen Wert initialisiert. Jede wiederholte Modifikation (die zufällige Aufspaltung in zwei Allele, „Funktion Split and export as fasta“) des gleichen Datensatzes führt dann zu unterschiedlichen Ergebnissen. Wird die „Use seed“-Funktion verwendet, führt die wiederholte Modifikation eines Datensatzes mit demselben Startwert immer zum selben Ergebnis. Mit der „Set seed“-Funktion kann ein beliebiger Startwert des Zufallsgenerators ausgewählt werden. Settings → Reduce any heterozygous position/Reduction threshold ()/Set reduction threshold Hier kann eingestellt werden, welche Art von Alignmentpositionen mit der Funktion „Reduce to homozygous positions“ gelöscht werden (siehe auch dort). 179 Anhang 180 Anhang 5: Gelelektrophoretische Auftrennung der isolierten DNA-Proben Es wurden jeweils 2 µl der erhaltenen Stammlösung in 0,8%igen Agarosegelen in einem elektrischen Feld von etwa 4 V/cm für etwa 30 min aufgetrennt. Zur groben Quantifizierung wurden ebenfalls jeweils 2 µl DNA-Standard bekannter Konzentration (5, 10, 20, 50 und 100 ng/µl) aus dem Phagen λ aufgetragen. Die Bilder wurden teilweise zerschnitten und wieder zusammengefügt. Proben, welche auf einem gemeinsamen Gel aufgetrennt wurden und die zugehörigen Standards sind durch Rahmen markiert. Gezeigt sind 103 von 124 Proben von Dyckia und Außengruppen, welche für die vergleichende Sequenzierung verwendet wurden. Die Proben FK0087- FK0102 wurden von Kooperationspartnern nach einem abweichenden Protokoll isoliert. Für die Probe FK086 wurde keine Elektrophorese durchgeführt. λ 5 ng /µ l λ 10 n g/ µl λ 20 n g/ µl λ 50 n g/ µl λ 10 0 ng /µ l FK 00 01 FK 00 04 FK 00 05 FK 00 06 FK 00 07 λ 5 ng /µ l λ 10 n g/ µl λ 20 n g/ µl λ 50 n g/ µl λ 10 0 ng /µ l FK 00 09 FK 00 10 FK 00 11 FK 00 12 FK 00 13 FK 00 14 FK 00 15 FK 00 16 λ 5 ng /µ l λ 10 n g/ µl λ 20 n g/ µl λ 50 n g/ µl λ 10 0 ng /µ l FK 00 17 FK 00 18 FK 00 19 FK 00 20 FK 00 21 FK 00 23 FK 00 24 λ 5 ng /µ l λ 10 n g/ µl λ 20 n g/ µl λ 50 n g/ µl λ 10 0 ng /µ l FK 00 25 FK 00 27 FK 00 29 FK 00 30 FK 00 31 FK 00 32 λ 5 ng /µ l λ 10 n g/ µl λ 20 n g/ µl λ 50 n g/ µl λ 10 0 ng /µ l FK 00 33 FK 00 35 FK 00 36 FK 00 38 FK 00 39 FK 00 40 λ 5 ng /µ l λ 10 n g/ µl λ 20 n g/ µl λ 50 n g/ µl λ 10 0 ng /µ l FK 00 42 FK 00 43 FK 00 44 FK 00 45 FK 00 47 λ 5 ng /µ l λ 10 n g/ µl λ 20 n g/ µl λ 50 n g/ µl λ 10 0 ng /µ l FK 00 49 FK 00 50 FK 00 51 FK 00 52 FK 00 53 FK 00 54 FK 00 55 FK 00 56 λ 5 ng /µ l λ 10 n g/ µl λ 20 n g/ µl λ 50 n g/ µl λ 10 0 ng /µ l FK 00 67 FK 00 68 λ 5 ng /µ l λ 10 n g/ µl λ 20 n g/ µl λ 50 n g/ µl λ 10 0 ng /µ l FK 00 70 FK 00 71 FK 00 72 FK 00 73 FK 00 74 FK 00 75 FK 00 76 FK 00 77 FK 01 26 λ 5 ng /µ l λ 10 n g/ µl λ 20 n g/ µl λ 50 n g/ µl λ 10 0 ng /µ l FK 01 03 FK 01 04 FK 01 05 FK 01 06 FK 01 07 FK 01 08 FK 01 09 FK 01 10 λ 5 ng /µ l λ 10 n g/ µl λ 20 n g/ µl λ 50 n g/ µl λ 10 0 ng /µ l FK 01 11 FK 01 12 FK 01 13 FK 01 14 FK 01 15 FK 01 16 FK 01 17 FK 01 18 FK 01 19 FK 01 20 FK 01 21 λ 5 ng /µ l λ 10 n g/ µl λ 20 n g/ µl λ 50 n g/ µl λ 10 0 ng /µ l FK 01 22 FK 01 23 FK 01 24 FK 01 25 λ 5 ng /µ l λ 10 n g/ µl λ 20 n g/ µl λ 50 n g/ µl λ 10 0 ng /µ l FK 00 78 FK 00 79 FK 00 80 FK 00 81 FK 00 82 FK 00 83 FK 00 84 FK 00 85 λ 5 ng /µ l λ 10 n g/ µl λ 20 n g/ µl λ 50 n g/ µl λ 10 0 ng /µ l FK 00 87 FK 00 88 FK 00 89 FK 00 90 FK 00 91 FK 00 92 FK 00 93 FK 00 94 λ 5 ng /µ l λ 10 n g/ µl λ 20 n g/ µl λ 50 n g/ µl λ 10 0 ng /µ l FK 00 95 FK 00 96 FK 00 97 FK 00 98 FK 00 99 FK 01 00 FK 01 01 FK 01 02 λ 5 ng /µ l λ 10 n g/ µl λ 20 n g/ µl λ 50 n g/ µl λ 10 0 ng /µ l FK 00 01 FK 00 04 FK 00 05 FK 00 06 FK 00 07 λ 5 ng /µ l λ 10 n g/ µl λ 20 n g/ µl λ 50 n g/ µl λ 10 0 ng /µ l FK 00 09 FK 00 10 FK 00 11 FK 00 12 FK 00 13 FK 00 14 FK 00 15 FK 00 16 λ 5 ng /µ l λ 10 n g/ µl λ 20 n g/ µl λ 50 n g/ µl λ 10 0 ng /µ l FK 00 17 FK 00 18 FK 00 19 FK 00 20 FK 00 21 FK 00 23 FK 00 24 λ 5 ng /µ l λ 10 n g/ µl λ 20 n g/ µl λ 50 n g/ µl λ 10 0 ng /µ l FK 00 01 FK 00 04 FK 00 05 FK 00 06 FK 00 07 λ 5 ng /µ l λ 10 n g/ µl λ 20 n g/ µl λ 50 n g/ µl λ 10 0 ng /µ l FK 00 09 FK 00 10 FK 00 11 FK 00 12 FK 00 13 FK 00 14 FK 00 15 FK 00 16 λ 5 ng /µ l λ 10 n g/ µl λ 20 n g/ µl λ 50 n g/ µl λ 10 0 ng /µ l FK 00 17 FK 00 18 FK 00 19 FK 00 20 FK 00 21 FK 00 23 FK 00 24 λ 5 ng /µ l λ 10 n g/ µl λ 20 n g/ µl λ 50 n g/ µl λ 10 0 ng /µ l FK 00 25 FK 00 27 FK 00 29 FK 00 30 FK 00 31 FK 00 32 λ 5 ng /µ l λ 10 n g/ µl λ 20 n g/ µl λ 50 n g/ µl λ 10 0 ng /µ l FK 00 33 FK 00 35 FK 00 36 FK 00 38 FK 00 39 FK 00 40 λ 5 ng /µ l λ 10 n g/ µl λ 20 n g/ µl λ 50 n g/ µl λ 10 0 ng /µ l FK 00 42 FK 00 43 FK 00 44 FK 00 45 FK 00 47 λ 5 ng /µ l λ 10 n g/ µl λ 20 n g/ µl λ 50 n g/ µl λ 10 0 ng /µ l FK 00 25 FK 00 27 FK 00 29 FK 00 30 FK 00 31 FK 00 32 λ 5 ng /µ l λ 10 n g/ µl λ 20 n g/ µl λ 50 n g/ µl λ 10 0 ng /µ l FK 00 33 FK 00 35 FK 00 36 FK 00 38 FK 00 39 FK 00 40 λ 5 ng /µ l λ 10 n g/ µl λ 20 n g/ µl λ 50 n g/ µl λ 10 0 ng /µ l FK 00 42 FK 00 43 FK 00 44 FK 00 45 FK 00 47 λ 5 ng /µ l λ 10 n g/ µl λ 20 n g/ µl λ 50 n g/ µl λ 10 0 ng /µ l FK 00 49 FK 00 50 FK 00 51 FK 00 52 FK 00 53 FK 00 54 FK 00 55 FK 00 56 λ 5 ng /µ l λ 10 n g/ µl λ 20 n g/ µl λ 50 n g/ µl λ 10 0 ng /µ l FK 00 67 FK 00 68 λ 5 ng /µ l λ 10 n g/ µl λ 20 n g/ µl λ 50 n g/ µl λ 10 0 ng /µ l FK 00 70 FK 00 71 FK 00 72 FK 00 73 FK 00 74 FK 00 75 FK 00 76 FK 00 77 λ 5 ng /µ l λ 10 n g/ µl λ 20 n g/ µl λ 50 n g/ µl λ 10 0 ng /µ l FK 00 49 FK 00 50 FK 00 51 FK 00 52 FK 00 53 FK 00 54 FK 00 55 FK 00 56 λ 5 ng /µ l λ 10 n g/ µl λ 20 n g/ µl λ 50 n g/ µl λ 10 0 ng /µ l FK 00 67 FK 00 68 λ 5 ng /µ l λ 10 n g/ µl λ 20 n g/ µl λ 50 n g/ µl λ 10 0 ng /µ l FK 00 70 FK 00 71 FK 00 72 FK 00 73 FK 00 74 FK 00 75 FK 00 76 FK 00 77 FK 01 26 λ 5 ng /µ l λ 10 n g/ µl λ 20 n g/ µl λ 50 n g/ µl λ 10 0 ng /µ l FK 01 03 FK 01 04 FK 01 05 FK 01 06 FK 01 07 FK 01 08 FK 01 09 FK 01 10 λ 5 ng /µ l λ 10 n g/ µl λ 20 n g/ µl λ 50 n g/ µl λ 10 0 ng /µ l FK 01 11 FK 01 12 FK 01 13 FK 01 14 FK 01 15 FK 01 16 FK 01 17 FK 01 18 FK 01 19 FK 01 20 FK 01 21 λ 5 ng /µ l λ 10 n g/ µl λ 20 n g/ µl λ 50 n g/ µl λ 10 0 ng /µ l FK 01 22 FK 01 23 FK 01 24 FK 01 25 λ 5 ng /µ l λ 10 n g/ µl λ 20 n g/ µl λ 50 n g/ µl λ 10 0 ng /µ l FK 00 78 FK 00 79 FK 00 80 FK 00 81 FK 00 82 FK 00 83 FK 00 84 FK 00 85 λ 5 ng /µ l λ 10 n g/ µl λ 20 n g/ µl λ 50 n g/ µl λ 10 0 ng /µ l FK 00 87 FK 00 88 FK 00 89 FK 00 90 FK 00 91 FK 00 92 FK 00 93 FK 00 94 λ 5 ng /µ l λ 10 n g/ µl λ 20 n g/ µl λ 50 n g/ µl λ 10 0 ng /µ l FK 00 95 FK 00 96 FK 00 97 FK 00 98 FK 00 99 FK 01 00 FK 01 01 FK 01 02 λ 5 ng /µ l λ 10 n g/ µl λ 20 n g/ µl λ 50 n g/ µl λ 10 0 ng /µ l FK 00 78 FK 00 79 FK 00 80 FK 00 81 FK 00 82 FK 00 83 FK 00 84 FK 00 85 λ 5 ng /µ l λ 10 n g/ µl λ 20 n g/ µl λ 50 n g/ µl λ 10 0 ng /µ l FK 00 87 FK 00 88 FK 00 89 FK 00 90 FK 00 91 FK 00 92 FK 00 93 FK 00 94 λ 5 ng /µ l λ 10 n g/ µl λ 20 n g/ µl λ 50 n g/ µl λ 10 0 ng /µ l FK 00 95 FK 00 96 FK 00 97 FK 00 98 FK 00 99 FK 01 00 FK 01 01 FK 01 02 Anhang 181 Anhang 6: Kombinierter plastidärer Datensatz: Neighbour Joining-Analyse Gezeigt ist der Baum aus einer Neighbour Joining-Analyse durchgeführt mit PAUP* 4.0b. Die Astlängen repräsentieren p-Distanzen entsprechend der Maßstabsleiste am unteren Ende der Abbildung. 0,01 Dyckia aurea FK0194 Puya ferruginea FK0082 Dyckia lunaris FK0193 Dyckia macedoi FK0101 Dyckia pumila aff FK0017 Dyckia spec FK0024 Dyckia milagrensis FK0096 Dyckia macedoi FK0099 Dyckia platyphylla FK0209 Dyckia spec FK0049 Encholirium magalhaesii FK0122 Dyckia pectinata FK0188 Pitcairnia pipenbringii FK0085 Dyckia spec FK0023 Dyckia reitzii aff FK0050 Dyckia brevifolia aff FK0010 Dyckia pernambucana FK0097 Dyckia ferox FK0056 Pitcairnia pungens FK0084 Dyckia ibiramensis aff FK0025 Puya herzogii FK0121 Dyckia beateae FK0091 Dyckia marnier lapostollei var marnier lapostollei FK0029 Pitcairnia feliciana FK0119 Dyckia paraensis FK0190 Dyckia granmogulensis FK0007 Dyckia maritima FK0092 Dyckia floribunda FK0107 Encholirium spec FK0080 Dyckia microcalyx cf FK0051 Dyckia nana FK0191 Deuterocohnia meziana FK0073 Dyckia rojasii FK0195 Dyckia pernambucana FK0098 Dyckia maracasensis FK0087 Dyckia tomentella FK0114 Encholirium spec FK0079 Dyckia velascana FK0104 Fosterella villosula FK0076 Dyckia encholirioides FK0095 Dyckia secunda FK0192 Dyckia grandidentata FK0183 Dyckia dawsonii FK0043 Dyckia floribunda FK0108 Encholirium horridum FK0070 Dyckia delicata FK0184 Dyckia hebdingii FK0038 Encholirium maximum FK0124 Dyckia beateae FK0044 Dyckia remotiflora FK0068 Dyckia remotiflora FK0055 Dyckia niederleinii FK0103 Dyckia pumila FK0093 Dyckia spiritu santense FK0207 Deuterocohnia brevispicata FK0071 Dyckia goehringii FK0031 Encholirium spec FK0125 Dyckia cinerea FK0047 Dyckia densiflora FK0213 Dyckia microcalyx var indet FK0009 Pitcairnia fuertesii FK0120 Dyckia lindevaldae FK0019 Dyckia brevifolia FK0067 Dyckia leptostachya cf FK0115 Dyckia remotiflora var indet FK0011 Fosterella weddelliana FK0077 Dyckia tuberosa aff FK0206 Encholirium spec FK0014 Dyckia monticola FK0088 Dyckia pulquinenses FK0199 Dyckia elisabethae FK0219 Dyckia leptostachya FK0053 Dyckia ursina FK0089 Dyckia ferox FK0027 Dyckia vestita FK0032 Dyckia microcalyx FK0054 Dyckia hebdingii FK0013 Dyckia estevesii FK0005 Dyckia maritima FK0113 Dyckia saxatilis FK0036 Dyckia rariflora FK0039 Deuterocohnia cf haumanii FK0075 Fosterella albicans FK0117 Dyckia fosteriana FK0094 Deuterocohnia brevifolia FK0074 Dyckia leptostachya aff FK0016 Dyckia mirandiana FK0202 Dyckia marnier lapostollei var estevesii FK0030 Dyckia vestita FK0109 Dyckia macedoi FK0100 Pitcairnia heterophylla FK0083 Dyckia dissitiflora FK0141 Dyckia remotiflora var indet FK0015 Dyckia ferruginea FK0090 Dyckia velascana FK0105 Deuterocohnia glandulosa FK0072 Dyckia choristaminea FK0021 Gen nov spec nov FK0257 Dyckia braunii FK0042 Dyckia choristaminea FK0040 Dyckia ursina FK0012 Dyckia machrisiana FK0189 Dyckia distachya FK0126 Dyckia microcalyx FK0111 Dyckia estevesii FK0001 Dyckia estevesii var braunii nom nud FK0004 Fosterella spectabilis FK0118 Dyckia floribunda FK0052 Dyckia hebdingii FK0112 Encholirium erectiflorum FK0123 Dyckia leptostachya aff FK0035 Dyckia velascana FK0006 Dyckia ferox FK0020 Dyckia jonesiana FK0217 Dyckia tobatiensis FK0018 Dyckia velascana cf FK0106 Dyckia niederleinii FK0110 Dyckia spec FK0116 Dyckia macedoi FK0102 Dyckia brachyphylla FK0045 Dyckia spec FK0086 Dyckia estevesii FK0033 Encholirium spec FK0078 Fosterella penduliflora FK0081 Anhang 182 Anhang 7: Kombinierter plastidärer Datensatz: NJ Bootstrap-/Jackknife-Analyse Gezeigt ist ein 50% Majority Rule-Konsensusbaum aus 10.000 Bootstrap-Replikaten durchgeführt mit PAUP* 4.0b. Bootstrap-Werte finden sich über den Ästen. Jackknife-Werte aus 10.000 Replikaten finden sich unter den Ästen, Werte unter 50% sind nicht gezeigt. 87 87 97 97 93 92 97 97 100 100 95 94 91 89 97 95 71 70 64 50 Dyckia estevesii FK0001 Dyckia estevesii FK0005 87 76 64 57 Dyckia estevesii var braunii nom nud FK0004 Dyckia lindevaldae FK0019 Dyckia braunii FK0042 99 96 Dyckia aurea FK0194 Dyckia platyphylla FK0209 Dyckia granmogulensis FK0007 Dyckia marnier lapostollei var marnier lapostollei FK0029 Dyckia marnier lapostollei var estevesii FK0030 Dyckia goehringii FK0031 59 Dyckia saxatilis FK0036 61 51 Dyckia brevifolia FK0067 Dyckia delicata FK0184 63 Dyckia dawsonii FK0043 50 Dyckia cinerea FK0047 Dyckia lunaris FK0193 Dyckia beateae FK0044 Dyckia brachyphylla FK0045 56 73 59 Dyckia maracasensis FK0087 Dyckia secunda FK0192 Dyckia dissitiflora FK0141 Dyckia monticola FK0088 Dyckia ursina FK0089 Dyckia ferruginea FK0090 Dyckia fosteriana FK0094 Dyckia milagrensis FK0096 69 56 Dyckia pernambucana FK0097 Dyckia pernambucana FK0098 77 76 92 83 Dyckia macedoi FK0099 Dyckia macedoi FK0100 71 57 Dyckia macedoi FK0101 Dyckia macedoi FK0102 Dyckia pectinata FK0188 Dyckia nana FK0191 Dyckia tuberosa aff FK0206 Dyckia densiflora FK0213 78 63 Dyckia velascana FK0006 Dyckia remotiflora FK0055 Dyckia niederleinii FK0103 Dyckia velascana FK0104 Dyckia velascana FK0105 Dyckia floribunda FK0107 72 66 57 64 51 Dyckia microcalyx var indet FK0009 Dyckia microcalyx FK0054 Dyckia distachya FK0126 Dyckia tobatiensis FK0018 Dyckia ferox FK0027 52 94 85 Dyckia vestita FK0032 Dyckia vestita FK0109 Dyckia tomentella FK0114 Dyckia ferox FK0056 Dyckia spec FK0049 64 50 Dyckia microcalyx cf FK0051 Dyckia microcalyx FK0111 Dyckia niederleinii FK0110 Dyckia leptostachya cf FK0115 Dyckia spec FK0116 Dyckia rojasii FK0195 Dyckia ferox FK0020 53 90 88 64 50 Dyckia brevifolia aff FK0010 Dyckia rariflora FK0039 Dyckia remotiflora FK0068 51 Dyckia remotiflora var indet FK0011 Dyckia hebdingii FK0013 Dyckia remotiflora var indet FK0015 99 98 Dyckia choristaminea FK0021 Dyckia hebdingii FK0038 Dyckia choristaminea FK0040 Dyckia hebdingii FK0112 Dyckia maritima FK0113 Dyckia machrisiana FK0189 Dyckia elisabethae FK0219 92 80 Dyckia ibiramensis aff FK0025 Dyckia spec FK0086 53 55 93 83 Dyckia ursina FK0012 Dyckia spec FK0023 Dyckia spec FK0024 68 68 56 Dyckia floribunda FK0052 Dyckia floribunda FK0108 Dyckia velascana cf FK0106 94 87 86 74 56 54 Dyckia leptostachya aff FK0016 Dyckia leptostachya aff FK0035 Dyckia pumila aff FK0017 Dyckia grandidentata FK0183 Dyckia leptostachya FK0053 65 52 Dyckia estevesii FK0033 Dyckia pumila FK0093 Dyckia reitzii aff FK0050 Dyckia maritima FK0092 Dyckia encholirioides FK0095 Dyckia paraensis FK0190 Dyckia pulquinenses FK0199 100 99 Dyckia mirandiana FK0202 Dyckia spiritu santense FK0207 Dyckia jonesiana FK0217 Dyckia beateae FK0091 81 80 55 91 83 Encholirium spec FK0014 Encholirium maximum FK0124 Encholirium erectiflorum FK0123 Gen nov spec nov FK0257 Encholirium horridum FK0070 99 96 64 52 Encholirium spec FK0078 Encholirium spec FK0080 Encholirium spec FK0079 Encholirium magalhaesii FK0122 Encholirium spec FK0125 81 80 Deuterocohnia brevispicata FK0071 Deuterocohnia meziana FK0073 100 100 Deuterocohnia glandulosa FK0072 100 100 Deuterocohnia brevifolia FK0074 Deuterocohnia cf haumanii FK0075 100 100 53 53 Fosterella villosula FK0076 100 100 Fosterella albicans FK0117 Fosterella spectabilis FK0118 56 57 Fosterella weddelliana FK0077 Fosterella penduliflora FK0081 100 100 Pitcairnia heterophylla FK0083 Pitcairnia pungens FK0084 54 54 Pitcairnia pipenbringii FK0085 Pitcairnia feliciana FK0119 Pitcairnia fuertesii FK0120 Puya ferruginea FK0082 Puya herzogii FK0121 Anhang 183 Anhang 8: Kombinierter plastidärer Datensatz: Parsimonieanalyse: Strict-Konsensusbaum Gezeigt ist der Strict-Konsensusbaum aus 100.000 kürzesten Bäumen mit einer Schrittlänge von 807 aus einer Parsimonieanalyse durchgeführt mit PAUP* 4.0b. Über den Ästen finden sich Bootstrap-Werte, unter den Ästen Jackknife-Werte aus jeweils 1.000 Replikaten. Werte unter 50% sind nicht gezeigt. Fosterella penduliflora (FK0081) Dyckia remotiflora (FK0055) Dyckia niederleinii (FK0103) Dyckia velascana (FK0104) Dyckia velascana (FK0105) Dyckia floribunda (FK0107) Dyckia velascana (FK0006) Dyckia remotiflora (FK0068) Dyckia hebdingii (FK0112) Dyckia maritima (FK0113) Dyckia monticola (FK0088) Dyckia fosteriana (FK0094) Dyckia ferruginea (FK0090) Dyckia marnier-lapostollei var. mar. (FK0029) Dyckia estevesii (FK0005) Dyckia lindevaldae (FK0019) Dyckia braunii (FK0042) Dyckia estevesii var. braunii (FK0004) Dyckia leptostachya (FK0053) Dyckia estevesii (FK0033) Dyckia pumila (FK0093) Dyckia choristaminea (FK0040) Dyckia remotiflora var. indet. (FK0015) Dyckia ursina (FK0012) Dyckia spec. (FK0023) Dyckia spec. (FK0024) Dyckia aff. pumila (FK0017) Dyckia aff. leptostachya (FK0035) Dyckia aff. leptostachya (FK0016) Dyckia floribunda (FK0108) Dyckia floribunda (FK0052) Dyckia spec. (FK0086) Dyckia aff. ibiramensis (FK0025) Dyckia rariflora (FK0039) Dyckia aff. brevifolia (FK0010) Dyckia hebdingii (FK0013) Dyckia cf. velascana (FK0106) Dyckia remotiflora var. indet. (FK0011) Dyckia hebdingii (FK0038) Dyckia tobatiensis (FK0018) Dyckia spec. (FK0049) Dyckia niederleinii (FK0110) Dyckia ferox (FK0020) Dyckia ferox (FK0056) Dyckia vestita (FK0109) Dyckia brachyphylla (FK0045) Dyckia beateae (FK0044) Dyckia goehringii (FK0031) Dyckia saxatilis (FK0036) Dyckia brevifolia (FK0067) Dyckia estevesii (FK0001) Dyckia cinerea (FK0047) Dyckia dawsonii (FK0043) Dyckia macedoi (FK0099) Dyckia macedoi (FK0100) Dyckia macedoi (FK0101) Dyckia macedoi (FK0102) Dyckia maracasensis (FK0087) Dyckia ursina (FK0089) Dyckia milagrensis (FK0096) Dyckia granmogulensis (FK0007) Puya herzogii (FK0121) Puya ferruginea (FK0082) Pitcairnia feliciana (FK0119) Pitcairnia fuertesii (FK0120) Pitcairnia pipenbringii (FK0085) Pitcairnia pungens (FK0084) Pitcairnia heterophylla (FK0083) Fosterella weddelliana (FK0077) Fosterella spectabilis (FK0118) Fosterella albicans (FK0117) Deuterocohnia cf. haumanii (FK0075) Deuterocohnia brevifolia (FK0074) Deuterocohnia meziana (FK0073) Deuterocohnia brevispicata (FK0071) Encholirium horridum (FK0070) Encholirium spec. (FK0014) Dyckia beateae (FK0091) Dyckia maritima (FK0092) Dyckia encholirioides (FK0095) Dyckia choristaminea (FK0021) Dyckia cf. leptostachya (FK0115) Dyckia spec. (FK0116) Dyckia ferox (FK0027) Dyckia microcalyx (FK0054) Dyckia microcalyx var. indet. (FK0009) Dyckia microcalyx (FK0111) Dyckia cf. microcalyx (FK0051) Dyckia tomentella (FK0114) Dyckia vestita (FK0032) Dyckia marnier-lapostollei var. est. (FK0030) Encholirium erectiflorum (FK0123) Encholirium maximum (FK0124) Encholirium spec. (FK0125) Dyckia pernambucana (FK0098) Dyckia pernambucana (FK0097) Encholirium spec. (FK0079) Encholirium spec. (FK0080) Encholirium spec. (FK0078) Encholirium magalhaesii (FK0122) Deuterocohnia glandulosa (FK0072) Fosterella villosula (FK0076) Dyckia aff. reitzii (FK0050) Gen. nov. spec. nov. (FK0257) Dyckia elisabethae (FK0219) Dyckia jonesiana (FK0217) Dyckia densiflora (FK0213) Dyckia platyphylla (FK0209) Dyckia espiritosantensis (FK0207) Dyckia tuberosa (aff.) (FK0206) Dyckia mirandiana (FK0202) Dyckia pulquinenses (FK0199) Dyckia rojasii (FK0195) Dyckia aurea (FK0194) Dyckia lunaris (FK0193) Dyckia secunda (FK0192) Dyckia nana (FK0191) Dyckia paraensis (FK0190) Dyckia machrisiana (FK0189) Dyckia pectinata (FK0188) Dyckia delicata (FK0184) Dyckia grandidentata (FK0183) Dyckia dissitiflora (FK0141) Dyckia distachya (FK0126) - - 98 93 74 66 - - 62 50 56 - 68 54 62 5089 77 64 50 62 52 63 50 77 69 88 7451 - 62 50 63 - 63 51 - - 67 56 - - 85 82 85 74 61 - - - - - 97 95 85 7159 - - - 53 - 64 -93 86 65 - 93 90 66 66 84 79 100 100 100 100 88 86 78 70 100 100 100 100 99 9799 99 100 100 98 9861 59100 100 100 99100 100 89 85 74 60 64 5990 81 99 97 Anhang 184 Anhang 9: Kombinierter plastidärer Datensatz: Haplotyp-Netzwerk mit DNA-Nummern Das Haplotyp-Netzwerk wurde mittels des Computerprogramms TCS 1.21 erstellt. Verwendet wurden nur Akzessionen von Dyckia und Encholirium, sowie Deuterocohnia brevispicata und Deuterocohnia meziana zur Bewurzelung. Die gezeigten Nummern entsprechen den DNA-Nummern der Proben. 095 033 093 092 050 217 113 086025 021 038 010 039 013 068 024 006, 055 103, 104 105, 107 106 108 052 012 023 070 091 125 124 014123 190 053 017 016035 183 051 111 020 027 056 049 032 109 114 009 054 126 018, 110 115, 116 195 199 071 073 079 080 078 122 257 207 202 042 019 004 001 005047193 043 067 089 097 098 087 192 096 007 099 100 101 102 029, 030 044, 088 094, 213 031090 036 045 141 191 184 194 209 206 188 011, 015 040, 112 189, 219 Anhang 185 Anhang 10: PhyC-Datensatz: Neighbour Joining-Analyse Gezeigt ist der Baum aus einer Neighbour Joining-Analyse durchgeführt mit PAUP* 4.0b. Die Astlängen repräsentieren p-Distanzen entsprechend der Maßstabsleiste am unteren Ende der Abbildung. 0,01 Dyckia paraensis FK0190 Dyckia hebdingii FK0112 Dyckia ibiramensis aff FK0025 Gen nov spec nov FK0257 Dyckia tomentella FK0114 Dyckia remotiflora var indet FK0011 Dyckia remotiflora FK0055 Dyckia estevesii FK0033 Dyckia choristaminea FK0021 Dyckia floribunda FK0052 Dyckia leptostachya cf FK0115 Dyckia beateae FK0044 Dyckia dissitiflora FK0141 Dyckia elisabethae FK0219 Pitcairnia feliciana FK0119 Dyckia distachya FK0126 Dyckia granmogulensis FK0007 Dyckia grande dentata FK0183 Dyckia velascana FK0006 Dyckia macedoi FK0102 Pitcairnia pipenbringii FK0085 Pitcairnia fuertesii FK0120 Pitcairnia heterophylla FK0083 Encholirium spec FK0079 Dyckia remotiflora var indet FK0015 Dyckia platyphylla FK0209 Encholirium spec FK0125 Dyckia lindevaldae FK0019 Dyckia ursina FK0012 Dyckia pectinata FK0188 Dyckia niederleinii FK0110 Encholirium horridum FK0070 Deuterocohnia brevifolia FK0074 Dyckia pumila FK0093 Dyckia brevifolia aff FK0010 Dyckia estevesii FK0001 Dyckia microcalyx cf FK0051 Dyckia maritima FK0092 Dyckia leptostachya FK0053 Dyckia spiritu santense FK0207 Dyckia pernambucana FK0098 Dyckia macedoi FK0099 Encholirium maximum FK0124 Dyckia ferox FK0020 Dyckia reitzii aff FK0050 Dyckia floribunda FK0107 Dyckia delicata FK0184 Dyckia hebdingii FK0038 Dyckia lunaris FK0193 Dyckia tuberosa aff FK0206 Dyckia braunii FK0042 Dyckia marnier lapostollei var estevesii FK0030 Dyckia goehringii FK0031 Dyckia beateae FK0091 Dyckia pernambucana FK0097 Dyckia aurea FK0194 Puya ferruginea FK0082 Dyckia brevifolia FK0067 Deuterocohnia glandulosa FK0072 Fosterella albicans FK0117 Deuterocohnia brevispicata FK0071 Dyckia pulquinenses FK0199 Encholirium spec FK0014 Dyckia jonesiana FK0217 Dyckia machrisiana FK0189 Dyckia encholirioides FK0095 Dyckia brachyphylla FK0045 Dyckia densiflora FK0213 Puya herzogii FK0121 Dyckia nana FK0191 Dyckia macedoi FK0100 Fosterella villosula FK0076 Dyckia hebdingii FK0013 Dyckia tobatiensis FK0018 Dyckia rojasii FK0195 Dyckia monticola FK0088 Dyckia oligantha var oligantha FK0036 Dyckia floribunda FK0108 Dyckia spec FK0023 Dyckia ferox FK0027 Dyckia cinerea FK0047 Dyckia estevesii var braunii nom nud FK0004 Dyckia microcalyx var indet FK0009 Dyckia ferruginea FK0090 Deuterocohnia cf haumanii FK0075 Fosterella spectabilis FK0118 Deuterocohnia meziana FK0073 Dyckia vestita FK0109 Dyckia rariflora FK0039 Dyckia remotiflora FK0068 Dyckia spec FK0116 Dyckia niederleinii FK0103 Dyckia spec FK0086 Dyckia leptostachya aff FK0016 Dyckia secunda FK0192 Dyckia maracasensis FK0087 Dyckia velascana cf FK0106 Dyckia marnier lapostollei var marnier lapostollei FK0029 Dyckia leptostachya aff FK0035 Dyckia mirandiana FK0202 Dyckia choristaminea FK0040 Dyckia spec FK0024 Fosterella penduliflora FK0081 Dyckia microcalyx FK0111 Dyckia dawsonii FK0043 Dyckia milagrensis FK0096 Dyckia estevesii FK0005 Dyckia fosteriana FK0094 Dyckia microcalyx FK0054 Dyckia velascana FK0105 Dyckia velascana FK0104 Dyckia ursina FK0089 Dyckia pumila aff FK0017 Fosterella weddelliana FK0077 Dyckia ferox FK0056 Encholirium spec FK0080 Encholirium erectiflorum FK0123 Dyckia vestita FK0032 Dyckia maritima FK0113 Dyckia spec FK0049 Pitcairnia pungens FK0084 Dyckia macedoi FK0101 Encholirium spec FK0078 Encholirium magalhaesii FK0122 Anhang 186 Anhang 11: PhyC-Datensatz: Neighbour Joining Bootstrap-/Jackknife-Analyse Gezeigt ist ein 50% Majority Rule-Konsensusbaum aus 10.000 Bootstrap-Replikaten durchgeführt mit PAUP* 4.0b. Bootstrap-Werte finden sich über den Ästen. Jackknife-Werte aus 10.000 Replikaten finden sich unter den Ästen, Werte unter 50% sind nicht gezeigt. 100 62 61 81 79 93 92 52 50 55 53 52 50 56 51 63 56 52 Dyckia velascana FK0006 Dyckia ursina FK0012 Dyckia spec FK0023 Dyckia spec FK0024 Dyckia floribunda FK0052 Dyckia floribunda FK0107 Dyckia floribunda FK0108 Dyckia velascana cf FK0106 Dyckia niederleinii FK0110 70 56 95 88 73 61 Dyckia remotiflora FK0055 Dyckia spec FK0086 Dyckia ibiramensis aff FK0025 Dyckia jonesiana FK0217 58 56 59 Dyckia beateae FK0044 Dyckia ferruginea FK0090 Dyckia estevesii FK0001 Dyckia estevesii FK0033 83 81 99 96 Dyckia brevifolia FK0067 Dyckia niederleinii FK0103 Dyckia velascana FK0105 62 51 Dyckia remotiflora var indet FK0011 Dyckia remotiflora var indet FK0015 Dyckia choristaminea FK004054 Dyckia tobatiensis FK0018 Dyckia vestita FK003287 72 Dyckia dawsonii FK0043 Dyckia paraensis FK019059 55 Encholirium spec FK0080 Encholirium spec FK0125 Dyckia estevesii var braunii nom nud FK0004 Dyckia estevesii FK0005 Dyckia granmogulensis FK0007 Dyckia microcalyx var indet FK0009 Dyckia brevifolia aff FK0010 Dyckia hebdingii FK0013 Dyckia leptostachya aff FK0016 Dyckia pumila aff FK0017 Dyckia lindevaldae FK0019 Dyckia ferox FK0020 Dyckia choristaminea FK0021 Dyckia ferox FK0027 Dyckia marnier lapostollei var marnier lapostollei FK0029 Dyckia marnier lapostollei var estevesii FK0030 Dyckia goehringii FK0031 Dyckia leptostachya aff FK0035 Dyckia saxatilis FK0036 Dyckia hebdingii FK0038 Dyckia rariflora FK0039 Dyckia braunii FK0042 Dyckia brachyphylla FK0045 Dyckia cinerea FK0047 Dyckia spec FK0049 Dyckia reitzii aff FK0050 Dyckia microcalyx cf FK0051 Dyckia leptostachya FK0053 Dyckia microcalyx FK0054 Dyckia ferox FK0056 Dyckia remotiflora FK0068 Encholirium spec FK0078 Encholirium spec FK0079 Dyckia maracasensis FK0087 Dyckia monticola FK0088 Dyckia ursina FK0089 Dyckia beateae FK0091 Dyckia maritima FK0092 Dyckia pumila FK0093 Dyckia fosteriana FK0094 Dyckia encholirioides FK0095 Dyckia milagrensis FK0096 Dyckia pernambucana FK0097 Dyckia pernambucana FK0098 Dyckia macedoi FK0099 Dyckia macedoi FK0100 Dyckia macedoi FK0101 Dyckia macedoi FK0102 Dyckia velascana FK0104 Dyckia vestita FK0109 Dyckia microcalyx FK0111 Dyckia hebdingii FK0112 Dyckia maritima FK0113 Dyckia tomentella FK0114 Dyckia leptostachya cf FK0115 Dyckia spec FK0116 Dyckia distachya FK0126 Dyckia dissitiflora FK0141 Dyckia grandidentata FK0183 Dyckia delicata FK0184 Dyckia pectinata FK0188 Dyckia machrisiana FK0189 Dyckia nana FK0191 Dyckia secunda FK0192 Dyckia lunaris FK0193 Dyckia aurea FK0194 Dyckia rojasii FK0195 Dyckia pulquinenses FK0199 Dyckia mirandiana FK0202 Dyckia tuberosa aff FK0206 Dyckia spiritu santense FK0207 Dyckia platyphylla FK0209 Dyckia densiflora FK0213 Dyckia elisabethae FK0219 Encholirium magalhaesii FK0122 Encholirium maximum FK012478 75 Encholirium spec FK0014 Encholirium erectiflorum FK0123 Encholirium horridum FK0070 Gen nov spec nov FK0257 98 97 72 71 57 57 76 74 Deuterocohnia glandulosa FK0072 Deuterocohnia cf haumanii FK0075 Deuterocohnia meziana FK0073 Deuterocohnia brevifolia FK0074 Deuterocohnia brevispicata FK0071 100 100 Fosterella villosula FK0076 Fosterella weddelliana FK0077 Fosterella penduliflora FK0081 Fosterella albicans FK0117 Fosterella spectabilis FK0118 Puya herzogii FK0121 Puya ferruginea FK0082 100 100 100 59 57 83 77 Pitcairnia pungens FK0084 Pitcairnia fuertesii FK0120 Pitcairnia pipenbringii FK0085 Pitcairnia heterophylla FK0083 Pitcairnia feliciana FK0119 Anhang 187 Anhang 12: PhyC-Datensatz: Parsimonieanalyse: Strict-Konsensusbaum Gezeigt ist der Strict-Konsensusbaum aus 100.000 kürzesten Bäumen mit einer Schrittlänge von 285 aus einer Parsimonieanalyse durchgeführt mit PAUP* 4.0b. Über den Ästen finden sich Bootstrap-Werte, unter den Ästen Jackknife-Werte aus jeweils 1.000 Replikaten. Werte unter 50% sind nicht gezeigt. Fosterella penduliflora (FK0081) Dyckia remotiflora (FK0055) Dyckia niederleinii (FK0103) Dyckia velascana (FK0104) Dyckia velascana (FK0105) Dyckia floribunda (FK0107) Dyckia velascana (FK0006) Dyckia remotiflora (FK0068) Dyckia hebdingii (FK0112) Dyckia maritima (FK0113) Dyckia monticola (FK0088) Dyckia fosteriana (FK0094) Dyckia ferruginea (FK0090) Dyckia marnier-lapostollei var. mar. (FK0029) Dyckia estevesii (FK0005) Dyckia lindevaldae (FK0019) Dyckia braunii (FK0042) Dyckia estevesii var. braunii (FK0004) Dyckia leptostachya (FK0053) Dyckia estevesii (FK0033) Dyckia pumila (FK0093) Dyckia choristaminea (FK0040) Dyckia remotiflora var. indet. (FK0015) Dyckia ursina (FK0012) Dyckia spec. (FK0023) Dyckia spec. (FK0024) Dyckia aff. pumila (FK0017) Dyckia aff. leptostachya (FK0035) Dyckia aff. leptostachya (FK0016) Dyckia floribunda (FK0108) Dyckia floribunda (FK0052) Dyckia spec. (FK0086) Dyckia aff. ibiramensis (FK0025) Dyckia rariflora (FK0039) Dyckia aff. brevifolia (FK0010) Dyckia hebdingii (FK0013) Dyckia cf. velascana (FK0106) Dyckia remotiflora var. indet. (FK0011) Dyckia hebdingii (FK0038) Dyckia tobatiensis (FK0018) Dyckia spec. (FK0049) Dyckia niederleinii (FK0110) Dyckia ferox (FK0020) Dyckia ferox (FK0056) Dyckia vestita (FK0109) Dyckia brachyphylla (FK0045) Dyckia beateae (FK0044) Dyckia goehringii (FK0031) Dyckia saxatilis (FK0036) Dyckia brevifolia (FK0067) Dyckia estevesii (FK0001) Dyckia cinerea (FK0047) Dyckia dawsonii (FK0043) Dyckia macedoi (FK0099) Dyckia macedoi (FK0100) Dyckia macedoi (FK0101) Dyckia macedoi (FK0102) Dyckia maracasensis (FK0087) Dyckia ursina (FK0089) Dyckia milagrensis (FK0096) Dyckia granmogulensis (FK0007) Puya herzogii (FK0121) Puya ferruginea (FK0082) Pitcairnia feliciana (FK0119) Pitcairnia fuertesii (FK0120) Pitcairnia pipenbringii (FK0085) Pitcairnia pungens (FK0084) Pitcairnia heterophylla (FK0083) Fosterella weddelliana (FK0077) Fosterella spectabilis (FK0118) Fosterella albicans (FK0117) Deuterocohnia cf. haumanii (FK0075) Deuterocohnia brevifolia (FK0074) Deuterocohnia meziana (FK0073) Deuterocohnia brevispicata (FK0071) Encholirium horridum (FK0070) Encholirium spec. (FK0014) Dyckia beateae (FK0091) Dyckia maritima (FK0092) Dyckia encholirioides (FK0095) Dyckia choristaminea (FK0021) Dyckia cf. leptostachya (FK0115) Dyckia spec. (FK0116) Dyckia ferox (FK0027) Dyckia microcalyx (FK0054) Dyckia microcalyx var. indet. (FK0009) Dyckia microcalyx (FK0111) Dyckia cf. microcalyx (FK0051) Dyckia tomentella (FK0114) Dyckia vestita (FK0032) Dyckia marnier-lapostollei var. est. (FK0030) Encholirium erectiflorum (FK0123) Encholirium maximum (FK0124) Encholirium spec. (FK0125) Dyckia pernambucana (FK0098) Dyckia pernambucana (FK0097) Encholirium spec. (FK0079) Encholirium spec. (FK0080) Encholirium spec. (FK0078) Encholirium magalhaesii (FK0122) Deuterocohnia glandulosa (FK0072) Fosterella villosula (FK0076) Dyckia aff. reitzii (FK0050) Gen. nov. spec. nov. (FK0257) Dyckia elisabethae (FK0219) Dyckia jonesiana (FK0217) Dyckia densiflora (FK0213) Dyckia platyphylla (FK0209) Dyckia espiritosantensis (FK0207) Dyckia tuberosa (aff.) (FK0206) Dyckia mirandiana (FK0202) Dyckia pulquinenses (FK0199) Dyckia rojasii (FK0195) Dyckia aurea (FK0194) Dyckia lunaris (FK0193) Dyckia secunda (FK0192) Dyckia nana (FK0191) Dyckia paraensis (FK0190) Dyckia machrisiana (FK0189) Dyckia pectinata (FK0188) Dyckia delicata (FK0184) Dyckia grandidentata (FK0183) Dyckia dissitiflora (FK0141) Dyckia distachya (FK0126) 99 99 83 69 74 67 64 54 62 50 99 98 66 58 58 - 97 93 62 53 100 100 93 94 58 - 100 100 50 - 52 - 63 51 94 86 51 - Anhang 188 Anhang 13: Einzelner plastidärer Locus: rpl32-trnL: Bayes'sche Analyse Gezeigt ist der 50% Majority Rule-Konsensusbaum aus einer Analyse mit MrBayes 3.2.1. Die Analyse wurde in zwei unabhängigen Läufen mit je 1.000.000 Generationen durchgeführt. Von den resultierenden Bäumen wurden 10% als Burn-in verworfen. Über den Ästen finden sich die Posterioriwahrscheinlichkeiten. Die Astlängen repräsentieren die erwartete Menge an substituierten Alignmentpositionen entsprechend der Maßstabsleiste am unteren Bildrand. 0.3 Dyckia pumila (aff.) FK0017 Dyckia marnier-lapostollei var. estevesii FK0030 Dyckia spec. FK0086 Dyckia estevesii FK0005 Fosterella albicans FK0117 Dyckia velascana FK0105 Deuterocohnia (cf.) haumanii FK0075 Dyckia rojasii FK0195 Dyckia leptostachya (cf.) FK0115 Pitcairnia heterophylla FK0083 Encholirium spec. FK0079 Dyckia ferox FK0056 Dyckia cinerea FK0047 Dyckia estevesii var. braunii nom. nud. FK0004 Dyckia tobatiensis FK0018 Dyckia lunaris FK0193 Dyckia macedoi FK0099 Deuterocohnia brevispicata FK0071 Dyckia ursina FK0089 Deuterocohnia meziana FK0073 Dyckia saxatilis FK0036 Puya ferruginea FK0082 Dyckia granmogulensis FK0007 Dyckia braunii FK0042 Dyckia tomentella FK0114 Puya herzogii FK0121 Dyckia machrisiana FK0189 Dyckia beateae FK0091 Dyckia ferruginea FK0090 Dyckia pulquinenses FK0199 Dyckia floribunda FK0052 Dyckia monticola FK0088 Dyckia leptostachya FK0053 Dyckia marnier-lapostollei var. marnier-lapostollei FK0029 Dyckia platyphylla FK0209 Dyckia microcalyx (cf.) FK0051 Dyckia pernambucana FK0097 Dyckia jonesiana FK0217 Pitcairnia pungens FK0084 Encholirium spec. FK0125 Dyckia remotiflora FK0068 Dyckia macedoi FK0102 Dyckia macedoi FK0101 Dyckia maracasensis FK0087 Dyckia hebdingii FK0038 Dyckia beateae FK0044 Dyckia choristaminea FK0021 Dyckia pectinata FK0188 Dyckia densiflora FK0213 Deuterocohnia glandulosa FK0072 Dyckia lindevaldae FK0019 Dyckia remotiflora FK0055 Dyckia microcalyx var. indet FK0009 Dyckia remotiflora var. indet FK0015 Dyckia ferox FK0020 Dyckia reitzii (aff.) FK0050 Dyckia ibiramensis (aff.) FK0025 Encholirium horridum FK0070 Pitcairnia pipenbringii FK0085 Pitcairnia feliciana FK0119 Dyckia maritima FK0113 Dyckia tuberosa (aff.) FK0206 Dyckia hebdingii FK0013 Dyckia estevesii FK0033 Dyckia nana FK0191 Dyckia spec. FK0023 Dyckia leptostachya (aff.) FK0035 Dyckia niederleinii FK0103 Dyckia microcalyx FK0054 Dyckia leptostachya (aff.) FK0016 Dyckia secunda FK0192 Dyckia floribunda FK0108 Fosterella villosula FK0076 Deuterocohnia brevifolia FK0074 Dyckia remotiflora var. indet FK0011 Dyckia choristaminea FK0040 Encholirium spec. FK0014 Dyckia rariflora FK0039 Dyckia estevesii FK0001 Dyckia milagrensis FK0096 Dyckia floribunda FK0107 Dyckia dissitiflora FK0141 Dyckia ferox FK0027 Encholirium spec. FK0078 Encholirium spec. FK0080 Fosterella penduliflora FK0081 Dyckia velascana (cf.) FK0106 Dyckia vestita FK0109 Dyckia delicata FK0184 Dyckia spec. FK0049 Dyckia macedoi FK0100 Dyckia mirandiana FK0202 Dyckia brachyphylla FK0045 Encholirium magalhaesii FK0122 Dyckia dawsonii FK0043 Dyckia fosteriana FK0094 Dyckia aurea FK0194 Dyckia goehringii FK0031 Dyckia niederleinii FK0110 Pitcairnia fuertesii FK0120 Dyckia pernambucana FK0098 Dyckia encholirioides FK0095 Dyckia espiritosantensis FK0207 Dyckia elisabethae FK0219 Dyckia hebdingii FK0112 Dyckia brevifolia FK0067 Dyckia spec. FK0116 Dyckia velascana FK0006 Dyckia spec. FK0024 Encholirium erectiflorum FK0123 Dyckia paraensis FK0190 Gen. nov. spec. nov. FK0257 Dyckia distachya FK0126 Dyckia grandidentata FK0183 Dyckia microcalyx FK0111 Fosterella weddelliana FK0077 Dyckia vestita FK0032 Fosterella spectabilis FK0118 Dyckia maritima FK0092 Encholirium maximum FK0124 Dyckia ursina FK0012 Dyckia velascana FK0104 Dyckia pumila FK0093 Dyckia brevifolia (aff.) FK0010 0,9 0,93 1 1 0,98 0,8 0,99 0,94 0,71 0,67 0,95 0,99 0,91 0,94 1 1 0,93 0,98 1 1 0,95 0,94 0,97 0,96 1 0,99 1 0,95 0,95 1 1 1 Anhang 189 Anhang 14: Einzelner plastidärer Locus: rps16-trnK: Bayes'sche Analyse Gezeigt ist der 50% Majority Rule-Konsensusbaum aus einer Analyse mit MrBayes 3.2.1. Die Analyse wurde in zwei unabhängigen Läufen mit je 1.000.000 Generationen durchgeführt. Von den resultierenden Bäumen wurden 10% als Burn-in verworfen. Über den Ästen finden sich die Posterioriwahrscheinlichkeiten. Die Astlängen repräsentieren die erwartete Menge an substituierten Alignmentpositionen entsprechend der Maßstabsleiste am unteren Bildrand. 0.3 Deuterocohnia brevispicata FK0071 Fosterella villosula FK0076 Dyckia beateae FK0091 Dyckia lunaris FK0193 Dyckia fosteriana FK0094 Dyckia spec. FK0086 Encholirium maximum FK0124 Dyckia macedoi FK0099 Dyckia microcalyx (cf.) FK0051 Dyckia hebdingii FK0112 Dyckia dawsonii FK0043 Dyckia microcalyx FK0111 Dyckia grandidentata FK0183 Encholirium spec. FK0079 Dyckia leptostachya (aff.) FK0016 Dyckia leptostachya FK0053 Dyckia remotiflora var. indet FK0011 Dyckia pumila FK0093 Dyckia leptostachya (aff.) FK0035 Dyckia granmogulensis FK0007 Dyckia tobatiensis FK0018 Dyckia maracasensis FK0087 Dyckia tomentella FK0114 Dyckia choristaminea FK0021 Dyckia floribunda FK0052 Dyckia velascana FK0105 Dyckia delicata FK0184 Dyckia braunii FK0042 Dyckia pernambucana FK0097 Dyckia brevifolia FK0067 Dyckia remotiflora var. indet FK0015 Dyckia spec. FK0024 Dyckia pulquinenses FK0199 Dyckia choristaminea FK0040 Encholirium spec. FK0078 Dyckia niederleinii FK0110 Dyckia encholirioides FK0095 Dyckia platyphylla FK0209 Dyckia ursina FK0012 Dyckia velascana FK0006 Dyckia secunda FK0192 Dyckia mirandiana FK0202 Dyckia estevesii FK0001 Dyckia ferruginea FK0090 Encholirium erectiflorum FK0123 Pitcairnia feliciana FK0119 Dyckia monticola FK0088 Dyckia brevifolia (aff.) FK0010 Dyckia jonesiana FK0217 Dyckia floribunda FK0107 Deuterocohnia (cf.) haumanii FK0075 Encholirium horridum FK0070 Dyckia macedoi FK0102 Dyckia brachyphylla FK0045 Dyckia velascana FK0104 Fosterella spectabilis FK0118 Dyckia elisabethae FK0219 Encholirium spec. FK0125 Dyckia pumila (aff.) FK0017 Dyckia vestita FK0032 Dyckia macedoi FK0100 Pitcairnia fuertesii FK0120 Dyckia milagrensis FK0096 Dyckia densiflora FK0213 Encholirium magalhaesii FK0122 Dyckia lindevaldae FK0019 Deuterocohnia meziana FK0073 Dyckia ferox FK0020 Dyckia ibiramensis (aff.) FK0025 Dyckia estevesii var. braunii nom. nud. FK0004 Fosterella weddelliana FK0077 Dyckia goehringii FK0031 Dyckia hebdingii FK0038 Dyckia ferox FK0056 Dyckia rariflora FK0039 Dyckia microcalyx var. indet FK0009 Dyckia estevesii FK0005 Dyckia espiritosantensis FK0207 Encholirium spec. FK0014 Dyckia beateae FK0044 Dyckia marnier-lapostollei var. estevesii FK0030 Dyckia dissitiflora FK0141 Dyckia vestita FK0109 Pitcairnia pungens FK0084 Dyckia cinerea FK0047 Dyckia remotiflora FK0055 Dyckia ferox FK0027 Dyckia aurea FK0194 Dyckia microcalyx FK0054 Gen. nov. spec. nov. FK0257 Dyckia maritima FK0092 Encholirium spec. FK0080 Dyckia marnier-lapostollei var. marnier-lapostollei FK0029 Pitcairnia heterophylla FK0083 Dyckia reitzii (aff.) FK0050 Dyckia macedoi FK0101 Dyckia spec. FK0049 Puya ferruginea FK0082 Fosterella albicans FK0117 Deuterocohnia brevifolia FK0074 Dyckia paraensis FK0190 Puya herzogii FK0121 Dyckia spec. FK0023 Dyckia ursina FK0089 Dyckia leptostachya (cf.) FK0115 Dyckia floribunda FK0108 Dyckia nana FK0191 Pitcairnia pipenbringii FK0085 Dyckia machrisiana FK0189 Dyckia rojasii FK0195 Dyckia spec. FK0116 Dyckia velascana (cf.) FK0106 Dyckia saxatilis FK0036 Dyckia remotiflora FK0068 Dyckia pectinata FK0188 Dyckia maritima FK0113 Dyckia niederleinii FK0103 Dyckia estevesii FK0033 Deuterocohnia glandulosa FK0072 Dyckia pernambucana FK0098 Dyckia distachya FK0126 Fosterella penduliflora FK0081 Dyckia tuberosa (aff.) FK0206 Dyckia hebdingii FK0013 1 0,77 0,96 1 0,99 1 1 0,95 0,77 1 0,93 1 0,97 0,95 0,67 1 0,94 0,96 0,77 0,98 0,63 1 0,95 0,97 1 0,94 1 0,99 0,94 1 0,77 0,94 0,98 0,95 Anhang 190 Anhang 15: Einzelner plastidärer Locus: matK: Bayes'sche Analyse Gezeigt ist der 50% Majority Rule-Konsensusbaum aus einer Analyse mit MrBayes 3.2.1. Die Analyse wurde in zwei unabhängigen Läufen mit je 1.000.000 Generationen durchgeführt. Von den resultierenden Bäumen wurden 10% als Burn-in verworfen. Über den Ästen finden sich die Posterioriwahrscheinlichkeiten. Die Astlängen repräsentieren die erwartete Menge an substituierten Alignmentpositionen entsprechend der Maßstabsleiste am unteren Bildrand. 0.3 Dyckia macedoi FK0101 Dyckia leptostachya (cf.) FK0115 Dyckia ibiramensis (aff.) FK0025 Dyckia beateae FK0044 Dyckia machrisiana FK0189 Deuterocohnia meziana FK0073 Dyckia grandidentata FK0183 Fosterella weddelliana FK0077 Dyckia distachya FK0126 Dyckia dawsonii FK0043 Dyckia elisabethae FK0219 Dyckia estevesii FK0005 Dyckia ferruginea FK0090 Dyckia maracasensis FK0087 Dyckia remotiflora var. indet FK0011 Fosterella albicans FK0117 Dyckia pulquinenses FK0199 Dyckia goehringii FK0031 Dyckia brevifolia FK0067 Dyckia velascana (cf.) FK0106 Puya herzogii FK0121 Dyckia maritima FK0113 Gen. nov. spec. nov. FK0257 Dyckia pernambucana FK0097 Dyckia niederleinii FK0110 Dyckia pumila (aff.) FK0017 Dyckia ferox FK0056 Puya ferruginea FK0082 Pitcairnia fuertesii FK0120 Encholirium spec. FK0079 Dyckia remotiflora FK0068 Dyckia rariflora FK0039 Dyckia microcalyx var. indet FK0009 Dyckia choristaminea FK0021 Dyckia secunda FK0192 Deuterocohnia brevispicata FK0071 Dyckia leptostachya (aff.) FK0016 Dyckia reitzii (aff.) FK0050 Dyckia microcalyx (cf.) FK0051 Dyckia pernambucana FK0098 Encholirium maximum FK0124 Dyckia marnier-lapostollei var. marnier-lapostollei FK0029 Dyckia niederleinii FK0103 Dyckia pectinata FK0188 Dyckia espiritosantensis FK0207 Dyckia tobatiensis FK0018 Pitcairnia pungens FK0084 Dyckia microcalyx FK0054 Dyckia encholirioides FK0095 Dyckia brachyphylla FK0045 Dyckia ursina FK0012 Dyckia tomentella FK0114 Encholirium magalhaesii FK0122 Dyckia jonesiana FK0217 Dyckia monticola FK0088 Dyckia microcalyx FK0111 Dyckia remotiflora FK0055 Deuterocohnia glandulosa FK0072 Fosterella penduliflora FK0081 Dyckia saxatilis FK0036 Deuterocohnia (cf.) haumanii FK0075 Dyckia estevesii var. braunii nom. nud. FK0004 Dyckia spec. FK0116 Dyckia granmogulensis FK0007 Dyckia dissitiflora FK0141 Dyckia leptostachya FK0053 Fosterella villosula FK0076 Encholirium erectiflorum FK0123 Dyckia ursina FK0089 Encholirium spec. FK0078 Dyckia aurea FK0194 Dyckia choristaminea FK0040 Dyckia spec. FK0023 Fosterella spectabilis FK0118 Dyckia fosteriana FK0094 Dyckia macedoi FK0099 Pitcairnia pipenbringii FK0085 Dyckia ferox FK0027 Dyckia delicata FK0184 Dyckia beateae FK0091 Dyckia vestita FK0032 Dyckia brevifolia (aff.) FK0010 Pitcairnia feliciana FK0119 Dyckia hebdingii FK0038 Dyckia spec. FK0024 Dyckia velascana FK0104 Dyckia floribunda FK0107 Dyckia estevesii FK0001 Dyckia estevesii FK0033 Encholirium horridum FK0070 Pitcairnia heterophylla FK0083 Dyckia paraensis FK0190 Dyckia velascana FK0105 Dyckia maritima FK0092 Dyckia pumila FK0093 Dyckia ferox FK0020 Dyckia velascana FK0006 Dyckia spec. FK0049 Dyckia vestita FK0109 Dyckia marnier-lapostollei var. estevesii FK0030 Dyckia floribunda FK0052 Dyckia remotiflora var. indet FK0015 Dyckia nana FK0191 Dyckia platyphylla FK0209 Dyckia cinerea FK0047 Dyckia densiflora FK0213 Dyckia floribunda FK0108 Dyckia rojasii FK0195 Dyckia braunii FK0042 Dyckia milagrensis FK0096 Encholirium spec. FK0125 Dyckia tuberosa (aff.) FK0206 Dyckia mirandiana FK0202 Encholirium spec. FK0080 Dyckia hebdingii FK0112 Encholirium spec. FK0014 Dyckia hebdingii FK0013 Dyckia leptostachya (aff.) FK0035 Dyckia lunaris FK0193 Dyckia macedoi FK0102 Dyckia macedoi FK0100 Dyckia spec. FK0086 Dyckia lindevaldae FK0019 Deuterocohnia brevifolia FK0074 0,88 1 1 0,96 0,96 1 1 0,97 0,97 1 0,99 0,68 0,94 1 0,99 1 0,98 0,99 1 Anhang 191 Anhang 16: Einzelner plastidärer Locus: rps16-Intron: Bayes'sche Analyse Gezeigt ist der 50% Majority Rule-Konsensusbaum aus einer Analyse mit MrBayes 3.2.1. Die Analyse wurde in zwei unabhängigen Läufen mit je 1.000.000 Generationen durchgeführt. Von den resultierenden Bäumen wurden 10% als Burn-in verworfen. Über den Ästen finden sich die Posterioriwahrscheinlichkeiten. Die Astlängen repräsentieren die erwartete Menge an substituierten Alignmentpositionen entsprechend der Maßstabsleiste am unteren Bildrand. 0.2 Deuterocohnia glandulosa FK0072 Encholirium spec. FK0125 Encholirium erectiflorum FK0123 Dyckia choristaminea FK0021 Deuterocohnia (cf.) haumanii FK0075 Dyckia hebdingii FK0013 Dyckia granmogulensis FK0007 Puya ferruginea FK0082 Fosterella penduliflora FK0081 Dyckia ferox FK0056 Dyckia grandidentata FK0183 Pitcairnia fuertesii FK0120 Dyckia maritima FK0092 Dyckia leptostachya (aff.) FK0016 Dyckia rojasii FK0195 Dyckia beateae FK0044 Dyckia spec. FK0086 Dyckia delicata FK0184 Fosterella albicans FK0117 Pitcairnia pipenbringii FK0085 Dyckia estevesii FK0005 Dyckia remotiflora var. indet FK0011 Dyckia ursina FK0012 Dyckia pernambucana FK0098 Dyckia maritima FK0113 Dyckia tobatiensis FK0018 Encholirium horridum FK0070 Dyckia spec. FK0024 Dyckia niederleinii FK0110 Dyckia floribunda FK0108 Dyckia spec. FK0023 Dyckia microcalyx var. indet FK0009 Dyckia pernambucana FK0097 Fosterella weddelliana FK0077 Dyckia brevifolia FK0067 Dyckia saxatilis FK0036 Dyckia machrisiana FK0189 Dyckia estevesii FK0033 Encholirium maximum FK0124 Dyckia ibiramensis (aff.) FK0025 Dyckia distachya FK0126 Pitcairnia heterophylla FK0083 Dyckia macedoi FK0099 Dyckia niederleinii FK0103 Dyckia reitzii (aff.) FK0050 Dyckia monticola FK0088 Dyckia braunii FK0042 Dyckia leptostachya (cf.) FK0115 Dyckia ferruginea FK0090 Dyckia macedoi FK0102 Dyckia mirandiana FK0202 Deuterocohnia meziana FK0073 Dyckia marnier-lapostollei var. marnier-lapostollei FK0029 Gen. nov. spec. nov. FK0257 Dyckia ursina FK0089 Dyckia dissitiflora FK0141 Dyckia velascana FK0104 Fosterella villosula FK0076 Dyckia velascana FK0105 Dyckia aurea FK0194 Dyckia microcalyx (cf.) FK0051 Dyckia vestita FK0032 Dyckia dawsonii FK0043 Dyckia densiflora FK0213 Deuterocohnia brevispicata FK0071 Dyckia paraensis FK0190 Dyckia microcalyx FK0054 Dyckia tuberosa (aff.) FK0206 Dyckia remotiflora FK0068 Pitcairnia feliciana FK0119 Pitcairnia pungens FK0084 Dyckia lindevaldae FK0019 Dyckia estevesii var. braunii nom. nud. FK0004 Encholirium spec. FK0080 Dyckia ferox FK0020 Dyckia remotiflora var. indet FK0015 Dyckia maracasensis FK0087 Dyckia macedoi FK0101 Dyckia jonesiana FK0217 Dyckia tomentella FK0114 Encholirium magalhaesii FK0122 Dyckia fosteriana FK0094 Fosterella spectabilis FK0118 Dyckia hebdingii FK0038 Dyckia macedoi FK0100 Dyckia espiritosantensis FK0207 Dyckia ferox FK0027 Dyckia cinerea FK0047 Puya herzogii FK0121 Dyckia beateae FK0091 Dyckia velascana (cf.) FK0106 Dyckia goehringii FK0031 Dyckia secunda FK0192 Dyckia pectinata FK0188 Dyckia velascana FK0006 Dyckia leptostachya (aff.) FK0035 Dyckia brachyphylla FK0045 Encholirium spec. FK0079 Dyckia spec. FK0049 Dyckia microcalyx FK0111 Dyckia nana FK0191 Encholirium spec. FK0078 Dyckia pulquinenses FK0199 Dyckia pumila (aff.) FK0017 Dyckia remotiflora FK0055 Dyckia milagrensis FK0096 Dyckia choristaminea FK0040 Dyckia hebdingii FK0112 Dyckia spec. FK0116 Dyckia brevifolia (aff.) FK0010 Dyckia leptostachya FK0053 Dyckia lunaris FK0193 Deuterocohnia brevifolia FK0074 Dyckia floribunda FK0052 Dyckia pumila FK0093 Dyckia floribunda FK0107 Dyckia encholirioides FK0095 Dyckia platyphylla FK0209 Dyckia marnier-lapostollei var. estevesii FK0030 Dyckia elisabethae FK0219 Encholirium spec. FK0014 Dyckia estevesii FK0001 Dyckia vestita FK0109 Dyckia rariflora FK0039 0,88 0,96 1 1 1 0,99 0,95 1 1 0,62 1 0,98 1 0,94 0,98 1 0,94 0,94 0,95 1 0,96 0,96 0,9 Anhang 192 Anhang 17: Einzelner plastidärer Locus: petD-Intron: Bayes'sche Analyse Gezeigt ist der 50% Majority Rule-Konsensusbaum aus einer Analyse mit MrBayes 3.2.1. Die Analyse wurde in zwei unabhängigen Läufen mit je 1.000.000 Generationen durchgeführt. Von den resultierenden Bäumen wurden 10% als Burn-in verworfen. Über den Ästen finden sich die Posterioriwahrscheinlichkeiten. Die Astlängen repräsentieren die erwartete Menge an substituierten Alignmentpositionen entsprechend der Maßstabsleiste am unteren Bildrand. 0.3 Puya herzogii FK0121 Dyckia secunda FK0192 Dyckia densiflora FK0213 Encholirium spec. FK0078 Encholirium spec. FK0014 Dyckia saxatilis FK0036 Dyckia hebdingii FK0038 Dyckia estevesii FK0005 Dyckia macedoi FK0100 Dyckia ferox FK0056 Encholirium erectiflorum FK0123 Encholirium spec. FK0079 Dyckia paraensis FK0190 Dyckia lindevaldae FK0019 Dyckia velascana FK0006 Dyckia delicata FK0184 Dyckia elisabethae FK0219 Dyckia spec. FK0086 Deuterocohnia brevifolia FK0074 Dyckia leptostachya (aff.) FK0016 Dyckia leptostachya FK0053 Dyckia espiritosantensis FK0207 Dyckia ferruginea FK0090 Dyckia macedoi FK0102 Encholirium maximum FK0124 Dyckia monticola FK0088 Dyckia tuberosa (aff.) FK0206 Dyckia floribunda FK0052 Dyckia velascana FK0104 Pitcairnia heterophylla FK0083 Dyckia pernambucana FK0098 Dyckia pectinata FK0188 Dyckia ibiramensis (aff.) FK0025 Fosterella spectabilis FK0118 Puya ferruginea FK0082 Dyckia remotiflora FK0055 Dyckia brachyphylla FK0045 Dyckia aurea FK0194 Dyckia encholirioides FK0095 Dyckia ferox FK0020 Encholirium spec. FK0080 Dyckia velascana FK0105 Dyckia tomentella FK0114 Dyckia ursina FK0012 Pitcairnia pungens FK0084 Dyckia microcalyx FK0054 Gen. nov. spec. nov. FK0257 Dyckia velascana (cf.) FK0106 Dyckia machrisiana FK0189 Dyckia marnier-lapostollei var. estevesii FK0030 Fosterella weddelliana FK0077 Dyckia brevifolia FK0067 Dyckia dawsonii FK0043 Dyckia rariflora FK0039 Dyckia choristaminea FK0040 Encholirium magalhaesii FK0122 Dyckia jonesiana FK0217 Dyckia microcalyx var. indet FK0009 Encholirium horridum FK0070 Dyckia nana FK0191 Dyckia grandidentata FK0183 Dyckia spec. FK0024 Dyckia brevifolia (aff.) FK0010 Dyckia remotiflora var. indet FK0011 Pitcairnia fuertesii FK0120 Dyckia dissitiflora FK0141 Dyckia floribunda FK0107 Dyckia distachya FK0126 Dyckia pernambucana FK0097 Dyckia estevesii FK0033 Dyckia vestita FK0032 Dyckia braunii FK0042 Dyckia pumila FK0093 Dyckia beateae FK0044 Dyckia microcalyx (cf.) FK0051 Dyckia lunaris FK0193 Deuterocohnia brevispicata FK0071 Pitcairnia feliciana FK0119 Dyckia leptostachya (aff.) FK0035 Dyckia mirandiana FK0202 Dyckia rojasii FK0195 Dyckia microcalyx FK0111 Fosterella penduliflora FK0081 Dyckia spec. FK0023 Dyckia marnier-lapostollei var. marnier-lapostollei FK0029 Dyckia ursina FK0089 Dyckia maritima FK0113 Dyckia estevesii var. braunii nom. nud. FK0004 Dyckia remotiflora var. indet FK0015 Deuterocohnia glandulosa FK0072 Dyckia tobatiensis FK0018 Deuterocohnia meziana FK0073 Dyckia spec. FK0116 Fosterella villosula FK0076 Dyckia reitzii (aff.) FK0050 Dyckia ferox FK0027 Dyckia estevesii FK0001 Dyckia maracasensis FK0087 Dyckia fosteriana FK0094 Dyckia floribunda FK0108 Pitcairnia pipenbringii FK0085 Dyckia niederleinii FK0110 Dyckia macedoi FK0099 Dyckia platyphylla FK0209 Dyckia niederleinii FK0103 Dyckia choristaminea FK0021 Dyckia pumila (aff.) FK0017 Dyckia milagrensis FK0096 Dyckia pulquinenses FK0199 Dyckia granmogulensis FK0007 Dyckia macedoi FK0101 Dyckia goehringii FK0031 Deuterocohnia (cf.) haumanii FK0075 Encholirium spec. FK0125 Dyckia hebdingii FK0013 Dyckia beateae FK0091 Dyckia cinerea FK0047 Dyckia leptostachya (cf.) FK0115 Dyckia vestita FK0109 Dyckia maritima FK0092 Fosterella albicans FK0117 Dyckia remotiflora FK0068 Dyckia hebdingii FK0112 Dyckia spec. FK0049 0,84 0,71 0,9 1 0,7 0,82 0,99 0,82 0,78 0,91 0,891 0,9 0,71 0,96 Anhang 193 Anhang 18: Einzelner plastidärer Locus: trnD-trnT: Bayes'sche Analyse Gezeigt ist der 50% Majority Rule-Konsensusbaum aus einer Analyse mit MrBayes 3.2.1. Die Analyse wurde in zwei unabhängigen Läufen mit je 1.000.000 Generationen durchgeführt. Von den resultierenden Bäumen wurden 10% als Burn-in verworfen. Über den Ästen finden sich die Posterioriwahrscheinlichkeiten. Die Astlängen repräsentieren die erwartete Menge an substituierten Alignmentpositionen entsprechend der Maßstabsleiste am unteren Bildrand. 0.3 Dyckia ferox FK0056 Dyckia pernambucana FK0097 Fosterella penduliflora FK0081 Dyckia saxatilis FK0036 Encholirium spec. FK0125 Dyckia pectinata FK0188 Dyckia densiflora FK0213 Dyckia rariflora FK0039 Deuterocohnia brevispicata FK0071 Dyckia brevifolia FK0067 Encholirium magalhaesii FK0122 Dyckia tobatiensis FK0018 Gen. nov. spec. nov. FK0257 Dyckia braunii FK0042 Dyckia pulquinenses FK0199 Dyckia leptostachya (aff.) FK0016 Dyckia elisabethae FK0219 Dyckia espiritosantensis FK0207 Dyckia velascana (cf.) FK0106 Dyckia ibiramensis (aff.) FK0025 Dyckia platyphylla FK0209 Dyckia beateae FK0091 Encholirium erectiflorum FK0123 Dyckia macedoi FK0101 Dyckia estevesii FK0005 Encholirium horridum FK0070 Deuterocohnia glandulosa FK0072 Dyckia spec. FK0116 Dyckia milagrensis FK0096 Dyckia floribunda FK0108 Dyckia microcalyx (cf.) FK0051 Dyckia estevesii var. braunii nom. nud. FK0004 Dyckia velascana FK0006 Dyckia leptostachya (cf.) FK0115 Dyckia velascana FK0104 Dyckia maracasensis FK0087 Dyckia choristaminea FK0040 Dyckia lindevaldae FK0019 Dyckia brachyphylla FK0045 Dyckia marnier-lapostollei var. estevesii FK0030 Dyckia cinerea FK0047 Dyckia spec. FK0086 Dyckia niederleinii FK0110 Dyckia estevesii FK0033 Dyckia pumila FK0093 Encholirium spec. FK0014 Dyckia leptostachya (aff.) FK0035 Dyckia tomentella FK0114 Dyckia velascana FK0105 Fosterella villosula FK0076 Dyckia maritima FK0092 Dyckia delicata FK0184 Dyckia hebdingii FK0112 Dyckia choristaminea FK0021 Dyckia floribunda FK0052 Dyckia marnier-lapostollei var. marnier-lapostollei FK0029 Dyckia reitzii (aff.) FK0050 Dyckia leptostachya FK0053 Dyckia maritima FK0113 Dyckia ferox FK0020 Dyckia pumila (aff.) FK0017 Dyckia ferruginea FK0090 Dyckia tuberosa (aff.) FK0206 Puya herzogii FK0121 Encholirium spec. FK0080 Dyckia niederleinii FK0103 Dyckia macedoi FK0099 Dyckia microcalyx FK0111 Dyckia secunda FK0192 Pitcairnia fuertesii FK0120 Dyckia microcalyx var. indet FK0009 Fosterella spectabilis FK0118 Dyckia spec. FK0024 Dyckia fosteriana FK0094 Dyckia brevifolia (aff.) FK0010 Dyckia macedoi FK0100 Encholirium spec. FK0078 Dyckia hebdingii FK0013 Dyckia remotiflora FK0055 Encholirium maximum FK0124 Dyckia monticola FK0088 Pitcairnia heterophylla FK0083 Dyckia vestita FK0109 Dyckia granmogulensis FK0007 Dyckia mirandiana FK0202 Pitcairnia feliciana FK0119 Fosterella weddelliana FK0077 Dyckia ursina FK0012 Dyckia hebdingii FK0038 Dyckia remotiflora var. indet FK0015 Dyckia rojasii FK0195 Dyckia floribunda FK0107 Deuterocohnia meziana FK0073 Dyckia spec. FK0023 Dyckia nana FK0191 Dyckia beateae FK0044 Dyckia machrisiana FK0189 Pitcairnia pipenbringii FK0085 Dyckia ursina FK0089 Dyckia jonesiana FK0217 Dyckia macedoi FK0102 Dyckia lunaris FK0193 Dyckia aurea FK0194 Fosterella albicans FK0117 Puya ferruginea FK0082 Dyckia dissitiflora FK0141 Dyckia goehringii FK0031 Dyckia vestita FK0032 Dyckia pernambucana FK0098 Dyckia dawsonii FK0043 Dyckia remotiflora var. indet FK0011 Dyckia distachya FK0126 Encholirium spec. FK0079 Pitcairnia pungens FK0084 Dyckia remotiflora FK0068 Dyckia paraensis FK0190 Deuterocohnia (cf.) haumanii FK0075 Dyckia estevesii FK0001 Dyckia encholirioides FK0095 Dyckia microcalyx FK0054 Dyckia spec. FK0049 Dyckia grandidentata FK0183 Deuterocohnia brevifolia FK0074 Dyckia ferox FK0027 0,65 1 0,86 0,99 0,75 0,88 0,72 1 0,94 0,79 0,91 0,96 1 1 0,94 0,58 1 0,68 0,75 1 1 Anhang Anhang 19: Detaillierte Ergebnisse der cpSSR-Analyse Für jede Akzession wurden 12 verschiedene cpSSR-Loci untersucht. Hinter den Artnamen sind die jeweiligen DNA-Nummern vermerkt (FK-Nummern entsprechend Tabelle 1). BT- und D-Nummern verweisen auf nicht im Rahmen der vorliegenden Arbeit isolierte Proben (Details vgl. Krapp et al. 2012). Angegeben sind jeweils die absolute Fragmentlänge und in Klammern die vermutliche Zahl der Mononukleotid-Wiederholungen. Letztere wurde jeweils durch Re-Sequenzierung der PCR-Produkte für D. pernambucana (FK0178) und Vergleich der absoluten Fragmentlängen abgeschätzt. Fehlgeschlagene PCR sind mit einem n markiert. Akzession DSSR-L01 DSSR- L04 DSSR- L06 DSSR- N01 DSSR- N04 DSSR- N05 DSSR- N07 DSSR- N10 DSSR- N11 DSSR- N15 DSSR- N16 DSSR- N18 Ananas ananasoides (BT27) 70 (9) 95 (10) 73 (9) 98 (10) n 82 (9) 72 (11) 82 (13) n 63 (10) 89 (12) 64 (16) Deuterocohnia brevispicata (FK0071) 74 (13) 94 (9) 72 (8) 100 (12) 85 (9) 82 (9) 77 (16) 79 (10) 93 (11) 63 (10) 86 (9) 61 (13) Deuterocohnia glandulosa (FK0072) 74 (13) 94 (9) n 99 (11) n 82 (9) n 79 (10) 92 (10) 76 (23) n n Dyckia beateae (FK0044) 73 (12) 94 (9) 77 (13) 104 (16) 89 (13) 85 (12) 74 (13) 80 (11) 96 (14) 65 (12) 90 (13) 71 (23) Dyckia beateae (FK0091) 72 (11) 94 (9) 79 (15) 103 (15) 90 (14) 85 (12) 76 (15) 81 (12) n 64 (11) 91 (14) 63 (15) Dyckia brachyphylla (FK0045) 73 (12) 94 (9) 77 (13) 102 (14) 93 (17) 85 (12) 75 (14) 79 (10) 98 (16) 65 (12) 90 (13) 69 (21) Dyckia braunii (FK0042) 73 (12) 94 (9) 75 (11) 102 (14) 90 (14) 85 (12) 75 (14) 79 (10) 93 (11) 65 (12) 90 (13) 66 (18) Dyckia brevifolia (aff.) (FK0010) 72 (11) 97 (12) 75 (11) 102 (14) 88 (12) 85 (12) 75 (14) 79 (10) 94 (12) 65 (12) 88 (11) 65 (17) Dyckia brevifolia (FK0067) 72 (11) 94 (9) 75 (11) 105 (17) 88 (12) 86 (13) 74 (13) 80 (11) 96 (14) 67 (14) 90 (13) 69 (21) Dyckia choristaminea (FK0021) 70 (9) 97 (12) 76 (12) 101 (13) 92 (16) 85 (12) 72 (11) 79 (10) 95 (13) 65 (12) 89 (12) 65 (17) Dyckia choristaminea (FK0040) 70 (9) 97 (12) 76 (12) 101 (13) 92 (16) 85 (12) 72 (11) 79 (10) 95 (13) 65 (12) 89 (12) 65 (17) Dyckia cinerea (FK0047) 72 (11) 95 (10) 77 (13) 104 (16) 91 (15) 86 (13) 75 (14) 81 (12) 97 (15) 64 (11) 90 (13) 67 (19) Dyckia dawsonii (FK0043) 71 (10) 95 (10) 76 (12) 102 (14) 91 (15) 86 (13) 74 (13) 81 (12) 96 (14) 64 (11) 89 (12) 65 (17) Dyckia dissitiflora Pop. 01 (FK0141) 73 (12) 98 (13) 79 (15) 102 (14) 91 (15) 86 (13) 74 (13) 81 (12) 99 (17) 65 (12) 90 (13) 68 (20) Dyckia dissitiflora Pop. 01 (FK0143) 73 (12) 98 (13) 79 (15) 102 (14) 91 (15) 86 (13) 74 (13) 81 (12) 99 (17) 65 (12) 90 (13) 68 (20) Dyckia dissitiflora Pop. 01 (FK0145) 73 (12) 98 (13) 79 (15) 102 (14) 91 (15) 86 (13) 74 (13) 81 (12) n 65 (12) 90 (13) 68 (20) Dyckia dissitiflora Pop. 01 (D39) 73 (12) 98 (13) 79 (15) 102 (14) 91 (15) 86 (13) 74 (13) 81 (12) 99 (17) 65 (12) 90 (13) 68 (20) Dyckia dissitiflora Pop. 02 (FK0147) 73 (12) 98 (13) 80 (16) 102 (14) 91 (15) 86 (13) 74 (13) 79 (10) 100 (18) 65 (12) 90 (13) 72 (24) Dyckia dissitiflora Pop. 02 (FK0148) 74 (13) 98 (13) 79 (15) 102 (14) 91 (15) 86 (13) 74 (13) 79 (10) 96 (14) 65 (12) 90 (13) 73 (25) Dyckia dissitiflora Pop. 02 (FK0149) 74 (13) 98 (13) 79 (15) 102 (14) 91 (15) 86 (13) 74 (13) 79 (10) 96 (14) 65 (12) 90 (13) 73 (25) Dyckia dissitiflora Pop. 02 (FK0150) 74 (13) 98 (13) 79 (15) 102 (14) 91 (15) 86 (13) 74 (13) 79 (10) 96 (14) 65 (12) 90 (13) 73 (25) Dyckia dissitiflora Pop. 03 (FK0153) 73 (12) 98 (13) 79 (15) 102 (14) 91 (15) 86 (13) 74 (13) 81 (12) 99 (17) 65 (12) 90 (13) 68 (20) Dyckia dissitiflora Pop. 03 (FK0154) 74 (13) 98 (13) 80 (16) 102 (14) 91 (15) 86 (13) 74 (13) 79 (10) n 65 (12) 90 (13) 72 (24) Dyckia dissitiflora Pop. 03 (FK0155) 74 (13) 98 (13) 79 (15) 102 (14) 91 (15) 86 (13) 74 (13) 81 (12) 99 (17) 65 (12) 90 (13) 72 (24) Dyckia dissitiflora Pop. 03 (FK0156) 73 (12) 98 (13) 79 (15) 102 (14) 91 (15) 86 (13) 74 (13) 81 (12) 99 (17) 65 (12) 90 (13) 68 (20) Dyckia encholirioides (FK0095) 71 (10) 94 (9) n 103 (15) 91 (15) 85 (12) 73 (12) 80 (11) n 64 (11) 89 (12) 63 (15) Dyckia estevesii (FK0001) 74 (13) 94 (9) 80 (16) 102 (14) 94 (18) 86 (13) 75 (14) 79 (10) 97 (15) 65 (12) 91 (14) 63 (15) Dyckia estevesii (FK0005) 74 (13) 94 (9) 80 (16) 102 (14) 94 (18) 86 (13) 75 (14) 79 (10) 97 (15) 65 (12) 91 (14) 63 (15) Dyckia estevesii (FK0033) 71 (10) 95 (10) 76 (12) 101 (13) 91 (15) 85 (12) 74 (13) 80 (11) 97 (15) 65 (12) 88 (11) 66 (18) Dyckia estevesii var. braunii nom. nud. (FK0004) 75 (14) 94 (9) 78 (14) 101 (13) 90 (14) 85 (12) 76 (15) 79 (10) 95 (13) 65 (12) 90 (13) 67 (19) Dyckia ferox (FK0020) 77 (16) 94 (9) 76 (12) 109 (21) 94 (18) 86 (13) 72 (11) 80 (11) 102 (20) 66 (13) 88 (11) 71 (23) Dyckia ferox (FK0027) 77 (16) 94 (9) 76 (12) 101 (13) 92 (16) 86 (13) 72 (11) 79 (10) 101 (19) 66 (13) 88 (11) 69 (21) Dyckia ferox (FK0056) 78 (17) 94 (9) 77 (13) 105 (17) 92 (16) 87 (14) 71 (10) 79 (10) 104 (22) 65 (12) 89 (12) 66 (18) Dyckia ferruginea (FK0090) 72 (11) 97 (12) 75 (11) 103 (15) 89 (13) 86 (13) 72 (11) 79 (10) 95 (13) 63 (10) 87 (10) 65 (17) Dyckia floribunda (FK0052) 71 (10) 94 (9) n 99 (11) 91 (15) 86 (13) 74 (13) 79 (10) 93 (11) 66 (13) 89 (12) 62 (14) Dyckia floribunda (FK0107) 71 (10) 94 (9) 75 (11) 102 (14) n 86 (13) 73 (12) 79 (10) 93 (11) 66 (13) 88 (11) 62 (14) Dyckia floribunda (FK0108) 71 (10) 94 (9) 74 (10) 103 (15) 91 (15) 86 (13) 74 (13) 79 (10) 93 (11) 66 (13) 88 (11) 62 (14) Dyckia fosteriana (FK0094) 73 (12) 95 (10) 79 (15) 100 (12) 90 (14) 87 (14) 74 (13) 79 (10) n 64 (11) 90 (13) 68 (20) Dyckia goehringii (FK0031) 72 (11) 95 (10) 82 (18) 98 (10) 89 (13) 86 (13) 73 (12) 79 (10) 94 (12) 65 (12) 89 (12) 65 (17) Dyckia granmogulensis (FK0007) 72 (11) 99 (14) 78 (14) 104 (16) 90 (14) 86 (13) 73 (12) 80 (11) 100 (18) 65 (12) 90 (13) 67 (19) Dyckia hebdingii (FK0013) 70 (9) 97 (12) 76 (12) 101 (13) 93 (17) 85 (12) 73 (12) 79 (10) 95 (13) 65 (12) 89 (12) 64 (16) Dyckia hebdingii (FK0038) 70 (9) 97 (12) 76 (12) 101 (13) 93 (17) 85 (12) 73 (12) 79 (10) 95 (13) 65 (12) 89 (12) 64 (16) Dyckia hebdingii (FK0112) 70 (9) 97 (12) 76 (12) 101 (13) 93 (17) 85 (12) 73 (12) 79 (10) 95 (13) 65 (12) 89 (12) 64 (16) Dyckia ibiramensis (aff.) (FK0025) 70 (9) 94 (9) 76 (12) 102 (14) 92 (16) 85 (12) 74 (13) 80 (11) 99 (17) 65 (12) 89 (12) 68 (20) Dyckia leptostachya (aff.) (FK0016) 71 (10) 94 (9) 76 (12) 103 (15) 88 (12) 85 (12) 73 (12) 79 (10) 96 (14) 64 (11) 88 (11) 67 (19) Dyckia leptostachya (aff.) (FK0035) 73 (12) 94 (9) 77 (13) 102 (14) 89 (13) 85 (12) 73 (12) 79 (10) 96 (14) 65 (12) 88 (11) 68 (20) Dyckia leptostachya (cf.) (FK0115) 76 (15) 94 (9) 76 (12) 108 (20) 91 (15) 86 (13) 72 (11) 79 (10) 102 (20) 66 (13) 88 (11) 70 (22) Dyckia leptostachya (FK0053) 75 (14) 96 (11) 75 (11) 101 (13) 90 (14) 86 (13) 73 (12) 79 (10) 95 (13) 64 (11) 88 (11) 63 (15) Dyckia limae Pop. 01 (D182) 74 (13) 99 (14) 78 (14) 102 (14) 91 (15) 85 (12) 74 (13) 79 (10) 98 (16) 65 (12) 90 (13) 62 (14) Dyckia limae Pop. 01 (D183) 75 (14) 99 (14) 78 (14) 102 (14) 91 (15) 85 (12) 74 (13) 79 (10) 98 (16) 65 (12) 90 (13) 66 (18) Dyckia limae Pop. 01 (D185) 74 (13) 99 (14) 78 (14) 102 (14) 91 (15) 86 (13) 74 (13) 79 (10) 98 (16) 65 (12) 90 (13) 66 (18) Dyckia limae Pop. 01 (D186) 74 (13) 99 (14) 78 (14) 102 (14) 91 (15) 86 (13) 74 (13) 79 (10) 98 (16) 65 (12) 90 (13) 62 (14) Dyckia lindevaldae (FK0019) 73 (12) 95 (10) 79 (15) 100 (12) 90 (14) 85 (12) 75 (14) 79 (10) 96 (14) 65 (12) 91 (14) 65 (17) Dyckia macedoi (FK0099) 73 (12) 94 (9) 78 (14) 102 (14) 89 (13) 84 (11) 74 (13) 79 (10) 97 (15) 66 (13) 90 (13) 68 (20) Dyckia macedoi (FK0099) 72 (11) 94 (9) 78 (14) 102 (14) 89 (13) 85 (12) 74 (13) 79 (10) 97 (15) 66 (13) 90 (13) 68 (20) Dyckia macedoi (FK0100) 72 (11) 94 (9) 78 (14) 102 (14) 89 (13) 85 (12) 74 (13) 79 (10) 97 (15) 66 (13) 90 (13) 68 (20) Dyckia macedoi (FK0101) 73 (12) 94 (9) 79 (15) 102 (14) 90 (14) 84 (11) 74 (13) 79 (10) 96 (14) 66 (13) 90 (13) 68 (20) Dyckia macedoi (FK0101) 72 (11) 94 (9) 79 (15) 102 (14) 90 (14) 85 (12) 74 (13) 79 (10) 96 (14) n 90 (13) 68 (20) Dyckia macedoi (FK0102) 72 (11) 94 (9) 79 (15) 102 (14) 90 (14) 85 (12) 74 (13) 79 (10) n n 90 (13) 68 (20) Dyckia maracasensis (FK0087) 73 (12) 98 (13) 79 (15) 101 (13) 91 (15) 87 (14) 74 (13) 79 (10) n n 90 (13) 69 (21) Dyckia maritima (FK0092) 71 (10) 94 (9) n n 90 (14) 85 (12) 76 (15) 79 (10) n 64 (11) 88 (11) 66 (18) Dyckia maritima (FK0113) 72 (11) 94 (9) n 101 (13) 93 (17) 85 (12) 72 (11) 79 (10) 94 (12) 66 (13) 90 (13) 67 (19) Dyckia marnier-lapostollei var. estevesii (FK0030) 75 (14) 94 (9) 77 (13) 102 (14) 87 (11) 85 (12) 74 (13) 79 (10) 100 (18) 64 (11) 90 (13) 63 (15) Dyckia marnier-lapostollei var. marnier-lapostollei (FK0029) 74 (13) 95 (10) 77 (13) 102 (14) 87 (11) 86 (13) 74 (13) 79 (10) 99 (17) 65 (12) 90 (13) 63 (15) Dyckia microcalyx (cf.) (FK0051) 76 (15) 94 (9) 75 (11) 104 (16) 94 (18) 86 (13) 72 (11) 80 (11) 104 (22) 65 (12) 88 (11) 69 (21) Dyckia microcalyx (FK0054) 76 (15) 94 (9) 75 (11) 102 (14) n 86 (13) 71 (10) 79 (10) 101 (19) 65 (12) 88 (11) 65 (17) Dyckia microcalyx (FK0111) 76 (15) 94 (9) 75 (11) n 94 (18) 86 (13) 72 (11) 80 (11) 104 (22) 65 (12) 88 (11) 69 (21) Dyckia microcalyx var. indet. (FK0009) 76 (15) 94 (9) 75 (11) 102 (14) 92 (16) 86 (13) 71 (10) 79 (10) 101 (19) 65 (12) 88 (11) 65 (17) Dyckia milagrensis (FK0096) 73 (12) 100 (15) 77 (13) 104 (16) 91 (15) 87 (14) 73 (12) 81 (12) n 65 (12) 89 (12) 66 (18) Dyckia monticola (FK0088) 71 (10) 94 (9) 79 (15) 104 (16) 90 (14) 86 (13) 74 (13) 80 (11) 97 (15) 66 (13) 90 (13) 64 (16) Dyckia niederleinii (FK0103) 72 (11) 94 (9) 75 (11) 103 (15) 91 (15) 86 (13) 73 (12) 79 (10) 96 (14) 66 (13) 88 (11) 61 (13) Dyckia niederleinii (FK0110) 76 (15) 94 (9) 76 (12) 101 (13) 91 (15) 86 (13) 72 (11) 79 (10) 102 (20) 65 (12) 88 (11) 69 (21) Dyckia oligantha var. oligantha (?) (FK0036) 72 (11) 94 (9) 78 (14) 102 (14) 90 (14) 86 (13) 76 (15) 79 (10) 98 (16) 66 (13) 91 (14) 69 (21) Dyckia pernambucana (FK0097) 73 (12) 97 (12) n 102 (14) 92 (16) 86 (13) 74 (13) 79 (10) 98 (16) 65 (12) 90 (13) 66 (18) Dyckia pernambucana (FK0098) 73 (12) 97 (12) 78 (14) 102 (14) 92 (16) 86 (13) 74 (13) 79 (10) n 65 (12) 90 (13) 66 (18) Dyckia pernambucana Pop. 01 (FK0171) 75 (14) 99 (14) 78 (14) 102 (14) 91 (15) 85 (12) 74 (13) 79 (10) 97 (15) 65 (12) 90 (13) 66 (18) Dyckia pernambucana Pop. 01 (FK0176) 75 (14) 99 (14) 78 (14) 102 (14) 91 (15) 86 (13) 74 (13) 79 (10) 97 (15) 65 (12) 90 (13) 66 (18) Dyckia pernambucana Pop. 01 (D97) 75 (14) 99 (14) 78 (14) 102 (14) 91 (15) 86 (13) 74 (13) 79 (10) 97 (15) 65 (12) 90 (13) 66 (18) Dyckia pernambucana Pop. 01 (D98) 75 (14) 99 (14) 78 (14) 102 (14) n 86 (13) 74 (13) 79 (10) 97 (15) 65 (12) 90 (13) 66 (18) Dyckia pernambucana Pop. 02 (FK0178) 73 (12) 97 (12) 78 (14) 102 (14) 92 (16) 86 (13) 74 (13) 79 (10) 98 (16) 65 (12) 90 (13) 66 (18) Dyckia pernambucana Pop. 02 (FK0180) 74 (13) 97 (12) 78 (14) 102 (14) 92 (16) 86 (13) 74 (13) 79 (10) 98 (16) 65 (12) 90 (13) 66 (18) Dyckia pernambucana Pop. 02 (FK0181) 74 (13) 97 (12) 78 (14) 102 (14) 92 (16) 86 (13) 74 (13) 79 (10) 98 (16) 65 (12) 90 (13) 66 (18) Dyckia pernambucana Pop. 02 (D-8A) 74 (13) 97 (12) 78 (14) 102 (14) 92 (16) 85 (12) 74 (13) 79 (10) 98 (16) 65 (12) 90 (13) n Dyckia pernambucana Pop. 03 (D161) 75 (14) 98 (13) 78 (14) 102 (14) 91 (15) 86 (13) 74 (13) 79 (10) 98 (16) 65 (12) 90 (13) 67 (19) 194 Anhang Akzession DSSR-L01 DSSR- L04 DSSR- L06 DSSR- N01 DSSR- N04 DSSR- N05 DSSR- N07 DSSR- N10 DSSR- N11 DSSR- N15 DSSR- N16 DSSR- N18 Dyckia pernambucana Pop. 03 (D162) 75 (14) 98 (13) 78 (14) 102 (14) 91 (15) 86 (13) 74 (13) 79 (10) 98 (16) 65 (12) 90 (13) 67 (19) Dyckia pernambucana Pop. 03 (D163) 75 (14) 98 (13) 78 (14) 102 (14) 91 (15) 86 (13) 74 (13) 79 (10) 98 (16) 65 (12) 90 (13) 67 (19) Dyckia pernambucana Pop. 03 (D164) 75 (14) 98 (13) 78 (14) n 91 (15) 86 (13) 74 (13) 79 (10) 98 (16) 65 (12) 90 (13) 67 (19) Dyckia pumila (aff.) (FK0017) 71 (10) 94 (9) 73 (9) 100 (12) 98 (22) 87 (14) 74 (13) 80 (11) 97 (15) 66 (13) 89 (12) 65 (17) Dyckia pumila (FK0093) 72 (11) 96 (11) 77 (13) 101 (13) 91 (15) 85 (12) 74 (13) 81 (12) 97 (15) 64 (11) 88 (11) 66 (18) Dyckia rariflora (FK0039) 72 (11) 97 (12) 76 (12) 102 (14) 88 (12) 84 (11) 75 (14) 79 (10) 94 (12) 65 (12) 88 (11) 65 (17) Dyckia reitzii (aff.) (FK0050) 71 (10) 94 (9) n 104 (16) 90 (14) 85 (12) 76 (15) 79 (10) 96 (14) 64 (11) 88 (11) 66 (18) Dyckia remotiflora (FK0055) 72 (11) 94 (9) 75 (11) 102 (14) 91 (15) 86 (13) 73 (12) 79 (10) 94 (12) 66 (13) 88 (11) 62 (14) Dyckia remotiflora (FK0068) n 97 (12) 76 (12) 102 (14) 88 (12) 84 (11) 75 (14) 79 (10) 94 (12) 65 (12) 88 (11) 65 (17) Dyckia remotiflora var. indet. (FK0011) 70 (9) 95 (10) 76 (12) 101 (13) 92 (16) 85 (12) 73 (12) 80 (11) 95 (13) 65 (12) 90 (13) 68 (20) Dyckia remotiflora var. indet. (FK0015) 70 (9) 95 (10) 76 (12) 101 (13) 92 (16) 85 (12) 73 (12) 80 (11) 95 (13) 65 (12) 90 (13) 68 (20) Dyckia spec. (Encholirium inerme) (FK0086) 70 (9) 94 (9) 76 (12) 102 (14) 92 (16) 85 (12) 74 (13) 80 (11) 99 (17) 65 (12) 89 (12) 68 (20) Dyckia spec. (FK0023) 72 (11) 94 (9) 76 (12) 102 (14) 92 (16) 87 (14) 74 (13) 80 (11) 95 (13) 67 (14) 89 (12) 62 (14) Dyckia spec. (FK0024) 71 (10) 94 (9) 74 (10) 104 (16) 92 (16) 86 (13) 74 (13) 80 (11) 94 (12) 68 (15) 88 (11) 62 (14) Dyckia spec. (FK0049) 76 (15) 95 (10) 76 (12) 102 (14) 92 (16) 86 (13) 71 (10) 79 (10) 101 (19) 66 (13) 88 (11) 70 (22) Dyckia spec. (FK0116) 72 (11) 94 (9) 76 (12) 106 (18) 92 (16) 87 (14) 73 (12) 80 (11) 101 (19) 65 (12) 89 (12) 68 (20) Dyckia tobatiensis (FK0018) 72 (11) 94 (9) 76 (12) 106 (18) 92 (16) 87 (14) 73 (12) 80 (11) 99 (17) 65 (12) 89 (12) 68 (20) Dyckia tomentella (FK0114) 78 (17) 94 (9) 77 (13) 105 (17) 92 (16) 87 (14) 71 (10) 79 (10) 104 (22) 65 (12) 89 (12) 62 (14) Dyckia ursina (FK0012) 72 (11) 94 (9) 76 (12) 102 (14) 92 (16) 87 (14) 74 (13) 80 (11) 95 (13) 67 (14) 89 (12) 62 (14) Dyckia ursina (FK0089) 74 (13) 94 (9) 79 (15) 103 (15) 91 (15) 87 (14) 73 (12) 79 (10) 97 (15) 65 (12) 90 (13) 68 (20) Dyckia velascana (cf.) (FK0106) 71 (10) 94 (9) 76 (12) 104 (16) 92 (16) 85 (12) 74 (13) 80 (11) 93 (11) 66 (13) 88 (11) 62 (14) Dyckia velascana (FK0006) 71 (10) 94 (9) 75 (11) 102 (14) 90 (14) 86 (13) 73 (12) 79 (10) 94 (12) 66 (13) 87 (10) 62 (14) Dyckia velascana (FK0104) 72 (11) 94 (9) 75 (11) 103 (15) 91 (15) 86 (13) 73 (12) 79 (10) 96 (14) 66 (13) 88 (11) 61 (13) Dyckia velascana (FK0105) 72 (11) 94 (9) 75 (11) 103 (15) 91 (15) 86 (13) 73 (12) 79 (10) 96 (14) 66 (13) 88 (11) 61 (13) Dyckia vestita (FK0032) 78 (17) 94 (9) 77 (13) 105 (17) 92 (16) 87 (14) 71 (10) 79 (10) 104 (22) 65 (12) 89 (12) 62 (14) Dyckia vestita (FK0109) 78 (17) 94 (9) 77 (13) 105 (17) 92 (16) 87 (14) 71 (10) 79 (10) 104 (22) 65 (12) 89 (12) 62 (14) Encholirium erectiflorum (FK0123) n 94 (9) 74 (10) 102 (14) 86 (10) 83 (10) 74 (13) 78 (9) 91 (9) 64 (11) 86 (9) 65 (17) Encholirium horridum (FK0070) 76 (15) 96 (11) 74 (10) 101 (13) n 81 (8) 74 (13) 80 (11) 95 (13) 62 (9) 87 (10) 66 (18) Encholirium magalhaesii (crassiscapum) (FK0122) 81 (20) 98 (13) 73 (9) 102 (14) 92 (16) 83 (10) 72 (11) 79 (10) 97 (15) 62 (9) 86 (9) 64 (16) Encholirium maximum (FK0124) 75 (14) 94 (9) 75 (11) 99 (11) 85 (9) 83 (10) 79 (18) 80 (11) 92 (10) 64 (11) 87 (10) 67 (19) Encholirium spec. (Dyckia spec.) (FK0014) 76 (15) 94 (9) 75 (11) 100 (12) 86 (10) 83 (10) 77 (16) 78 (9) 97 (15) 65 (12) 86 (9) 62 (14) Encholirium spec. (FK0078) 85 (24) 97 (12) 73 (9) 101 (13) 92 (16) 83 (10) 71 (10) 80 (11) 96 (14) 63 (10) 86 (9) 63 (15) Encholirium spec. (FK0079) 85 (24) 98 (13) 73 (9) 101 (13) 89 (13) 83 (10) 71 (10) 79 (10) 96 (14) 62 (9) 86 (9) 64 (16) Encholirium spec. (FK0080) 82 (21) 97 (12) 73 (9) 101 (13) 92 (16) 83 (10) 71 (10) 79 (10) 94 (12) 62 (9) 86 (9) 62 (14) Encholirium spec. (FK0125) 76 (15) 95 (10) 75 (11) 101 (13) 86 (10) 84 (11) 71 (10) 78 (9) 98 (16) 63 (10) 88 (11) 65 (17) Fosterella villosula (FK0076) 70 (9) 93 (8) 73 (9) 99 (11) n 81 (8) n 79 (10) n 60 (7) 87 (10) 61 (13) Fosterella weddelliana (FK0077) n 96 (11) n 101 (13) n 81 (8) n 80 (11) 101 (19) 61 (8) 87 (10) 61 (13) Gen. nov. (Graca Wanderley) n 96 (11) 77 (13) 104 (16) 85 (9) 83 (10) 79 (18) 81 (12) n 64 (11) 87 (10) 62 (14) Hechtia caerula (BT49) 67 (6) 93 (8) 73 (9) 99 (11) n 83 (10) 72 (11) 81 (12) 90 (8) 65 (12) 91 (14) 61 (13) Pitcairnia feliciana (FK0119) 65 (4) 93 (8) 72 (8) 98 (10) n 83 (10) 73 (12) 78 (9) n 63 (10) 85 (8) 60 (12) Pitcairnia heterophylla (FK0083 (Pit_03)) n 94 (9) 73 (9) 100 (12) n 82 (9) 73 (12) 80 (11) n 63 (10) 88 (11) 62 (14) Puya ferruginea (FK0082) 70 (9) 96 (11) 72 (8) 99 (11) n 86 (13) 73 (12) 81 (12) n 63 (10) 86 (9) 64 (16) Puya herzogii (FK0121) n 98 (13) 72 (8) 102 (14) n 86 (13) 73 (12) 79 (10) n 63 (10) 87 (10) 63 (15) Tillandsia usneoides (BT70) n 92 (7) 72 (8) 109 (21) n 83 (10) 72 (11) 79 (10) n 64 (11) 87 (10) 63 (15) 195 Referenzen 11 Referenzen 11.1 Curriculum vitae Person Name: Florian Krapp Geburtsdatum: 13.05.1980 Geburtsort: Kassel Schule 1986-1990 Grundschule Auefeldschule, Kassel 1990-1999 Gymnasium Albert-Schweitzer-Schule, Kassel Abschluss: 18.06.1999 (Abitur) 1999-2000 Zivildienst Studium 2000-2002 Studium der Ingenieurinformatik an der TU Ilmenau 2002-2007 Studium der Informatik an der Universität Kassel 2003-2009 Studium der Biologie an der Universität Kassel Abschluss: 20.08.2009 (Diplom, Dipl.-Biol.) 2007-2009 Wissenschaftliche Hilfskraft an der Universität Kassel Promotion 2009-2012 Promotion in der Abteilung Systematik und Morphologie der Pflanzen, Universität Kassel (Zulassung zur Promotion: 08.01.2010) 2009-2010 Wissenschaftlicher Mitarbeiter, Wissenschaftliche Hilfskraft und Lehrauftrag an der Universität Kassel 2010-2012 Promotionsstipendium des Otto-Braun-Fonds 196 Referenzen 11.2 Qualifikationsarbeiten Krapp, F. (2009): Molekulare Verwandtschaftsanalysen in der Gattung Dyckia (Bromeliaceae). Diplomarbeit. Systematik und Morphologie der Pflanzen, Fachbereich 18, Naturwissenschaften, Universität Kassel, Kassel. 11.3 Publikationen in Fachzeitschriften (chronologisch) Wöhrmann, T., N. Wagner, F. Krapp, B. Huettel & K. Weising (2012): Development of microsatellite markers in Fosterella rusbyi (Mez) L.B. Sm. (Bromeliaceae) using 454 pyrosequencing. Am. J. Bot. 99 (4): e160–e163. Krapp, F., T. Wöhrmann, D. S. d. B. Pinangé, A. M. Benko-Iseppon, B. Huettel & K. Weising (2012): A set of plastid microsatellite loci for the genus Dyckia (Bromeliaceae) derived from 454 pyrosequencing. Am. J. Bot. 99 (12): e470-473. Wöhrmann, T., D. S. d. B. Pinangé, F. Krapp, A.-M. Benko-Iseppon, B. Huettel & K. Weising (2012): Development of 15 nuclear microsatellite markers in the genus Dyckia (Pitcairnioideae; Bromeliaceae) using 454 pyrosequencing. Conserv. Genet. Resour.: Online first (DOI 10.1007/s12686-012-9738-y). Krapp, F.: The silver ghost of Serra do Lenheiro: Dyckia mezii, nom. nov. Im Druck (Ann. Bot. Fennici). Krapp, F., G. A. d. S. Cruz, T. Wöhrmann, A. M. Benko-Iseppon & K. Weising: A set of variable plastid SSR loci for the genus Cryptanthus (Bromeliaceae). In Vorbereitung. Krapp, F., D. S. d. B. Pinangé, A. M. Benko-Iseppon, E. M. C. Leme & K. Weising: Phylogeny and evolutionary history of the large genus Dyckia (Bromeliaceae) in eastern South America, inferred from chloroplast and nuclear sequence data. In Vorbereitung. Schütz, N., N. Wagner, F. Krapp & K. Weising: Detailed phylogeny of subfamily Pitcairnioideae s.str. (Bromeliaceae). In Vorbereitung. Pinangé, D. S. d. B., A. M. Benko-Iseppon, E. M. C. Leme, F. Krapp, K. Weising & G. Zizka: AFLP analysis of genetic relationships in the genus Dyckia (Bromeliaceae). In Planung. Pinangé, D. S. d. B., T. Wöhrmann, F. Krapp, K. Weising, G. Zizka & A. M. Benko- Iseppon: Population genetic analysis of different species of Dyckia (Bromeliaceae) based on AFLP analysis and highly variable nuclear and chloroplast microsatellites. In Planung. 11.4 Vorträge und Poster auf Konferenzen (chronologisch) Krapp, F. & K. Weising (2010): Phylogeny and biogeography of Dyckia (Bromeliaceae). 19th International Symposium "Biodiversity and Evolutionary Biology" of the German Botanical Society (DBG). Wien, 16.-19. September 2010. Krapp, F. & K. Weising (2011): Young and successful: Phylogeny and evolutionary history of the large genus Dyckia (Bromeliaceae) inferred from chloroplast and nuclear sequence data. BioSystematics Berlin 2011. Berlin, 21.-27. Februar 2011. 197 Referenzen Krapp, F. & K. Weising (2011): Extreme levels of homoplasy among chloroplast SSRs within the genetically invariant genus Dyckia (Bromeliaceae). BioSystematics Berlin 2011. Berlin, 21.-27. Februar 2011. Weising, K., N. Schütz, N. Wagner, F. Krapp, S. Blank, I. Michalak, D. Silvestro, G. Zizka, P. Ibisch & K. Schulte (2011): Phylogeny and evolutionary history of Pitcairnioideae s. str. (Bromeliaceae) inferred from chloroplast and nuclear data. XVIII International Botanical Congress. Melbourne, 23.-30. Juli 2011. Krapp, F. & K. Weising (2011): Phylogeny and evolutionary history of the large genus Dyckia (Pitcairnioideae; Bromeliaceae) in eastern South America, inferred from chloroplast and nuclear sequence data. XVIII International Botanical Congress. Melbourne, 23.-30. Juli 2011. Wöhrmann, T., F. Krapp, B. Huettel & K. Weising (2011): Development of large sets of simple sequence repeat (SSR) markers for three species of subfamily Pitcairnioideae (Bromeliaceae) using high-throughput 454 pyrosequencing. XVIII International Botanical Congress. Melbourne, 23.-30. Juli 2011. Krapp, F., J. Wojacki & K. Weising (2011): Phylogeny and evolutionary history of Dyckia (Bromeliaceae) in eastern South America, inferred from chloroplast and nuclear sequence data. Botanikertagung 2011. Berlin, 18.-23. September 2011. Schütz, N., F. Krapp, N. Wagner, G. Zizka & K. Weising (2011): Phylogeny and evolutionary history of Pitcairnioideae s.str. (Bromeliaceae) inferred from chloroplast and nuclear data. Botanikertagung 2011. Berlin, 18.-23. September 2011. Wöhrmann, T., F. Krapp, B. Huettel, S. Möller & K. Weising (2011): Development of microsatellite markers for three species of subfamily Pitcairnioideae (Bromeliaceae) using high-throughput pyrosequencing. Botanikertagung 2011. Berlin, 18.-23. September 2011. Weising, K., F. Krapp, D. S. d. B. Pinangé, G. Zizka & A. M. Benko-Iseppon (2012): Phylogeny and evolution of Dyckia (Pitcairnioideae; Bromeliaceae): understanding rapid diversification in the Brazilian Cerrado. 21st International Symposium „Biodiversity and Evolutionary Biology“ of the German Botanical Society (DBG). Mainz, 16.-19. September 2012. Wöhrmann, T., D. S. d. B. Pinangé, F. Krapp, B. Huettel, S. Möller, A. M. Benko-Iseppon & K. Weising (2012): A set of nuclear microsatellite markers for the genus Dyckia (Bromeliaceae) developed by 454 pyrosequencing. 21st International Symposium „Biodiversity and Evolutionary Biology“ of the German Botanical Society (DBG). Mainz, 16.- 19. September 2012. 11.5 Stipendien und Auszeichnungen • Promotionsstipendium des Otto-Braun-Fonds (01.10.2010-30.09.2012) • 2. Posterpreis bei der BioSystematics Berlin 2011 (12. Jahrestagung der GfBS) 198 Erklärung Erklärung Hiermit versichere ich, dass ich die vorliegende Dissertation selbständig und ohne unerlaubte Hilfe angefertigt und andere als die in der Dissertation angegebenen Hilfsmittel nicht benutzt habe. Alle Stellen, die wörtlich oder sinngemäß aus veröffentlichten oder unveröffentlichten Schriften entnommen sind, habe ich als solche kenntlich gemacht. Kein Teil dieser Arbeit ist in einem anderen Promotions- oder Habilitationsverfahren verwendet worden. Kassel, den 26. Oktober 2012 199 Danksagung Danksagung Für die finanzielle Unterstützung durch ein Stipendium aus dem Otto-Braun-Fonds und die damit verbundene Unabhängigkeit danke ich der Firma B. Braun (Melsungen). Herrn Prof. Dr. Kurt Weising danke ich herzlich für die gute Betreuung und konstruktive Zusammenarbeit, die eingeräumten Freiheiten bei der Konzeption und Durchführung meines Projektes und die Hilfe beim Verfassen dieser Arbeit. Der gesamten Arbeitsgruppe Morphologie und Systematik der Pflanzen sowie den Mitarbeitern der Gewächshausanlage der Universität Kassel danke ich für ihre Unterstützung und das hervorragende Arbeitsklima. Besonderer Dank gilt Tina Wöhrmann, Natascha Wagner, Nicole Schütz und Kai Schubert für die gute Zusammenarbeit auf dem Gebiet der Forschung an Bromelien und die gemeinschaftliche Publikationstätigkeit. Herrn Prof. Dr. Georg Zizka danke ich für die wertvolle Kooperation und die Betreuung der vorliegenden Arbeit als Zweitgutachter. Für regen Austausch von Erfahrungen und fruchtbare Kooperationen sowie die Bereitstellung von Pflanzenmaterial, Literatur und Bildern danke ich Dr. Elton Leme, Diego Sotero de Barros Pinangé, Timm Stolten, Prof. Dr. Walter Till, Dr. Jule Peters, Dr. Pierre Braun, Dr. Urs Eggli, Michael Barfuss, Geyner Alves dos Santos Cruz, Prof. Dr. Ana Maria Benko-Iseppon, Dr. Maria das Graças Lapa Wanderley, Corinna Klein, Holger Sachs, Constantino Gastaldi und Leandro Freitas sowie der Abteilung Botanik und molekulare Evolutionsforschung der Universität Frankfurt, dem Botanischen Garten der Universität Heidelberg, den Botanischen Gärten der Rheinischen Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn, dem Botanischen Garten der Universität Wien, dem Botanischen Garten und Botanischen Museum Berlin-Dahlem, dem Botanischen Garten der Ruhr-Universität Bochum, dem Botanischen Garten Marburg sowie den Royal Botanic Gardens in Kew. Dem DAAD danke ich für die finanzielle Förderung des Projektes im Rahmen des Programmes PROBRAL. Besonderer Dank gilt meiner Familie. Meinem Vater und meinen Schwiegereltern danke ich für die großartige Unterstützung in jeglicher Hinsicht. Meinen Söhnen Constantin und Jonathan danke ich dafür, dass sie meine Aufmerksamkeit immer wieder auf die wirklich wichtigen Dinge gelenkt haben. Meiner Frau Monika danke ich für ihre Liebe, den bedingungslosen Rückhalt und dafür, dass ich mich immer auf sie verlassen kann. 200