Etablierung von Mikrosatellitenmarkern für die Pitcairnioideae (Bromeliaceae) und ihre Anwendung für populationsgenetische Fragestellungen Dissertation Tina Wöhrmann Etablierung von Mikrosatellitenmarkern für die Pitcairnioideae (Bromeliaceae) und ihre Anwendung für populationsgenetische Fragestellungen Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades eines Doktors der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.) angefertigt in der Abteilung Systematik und Morphologie der Pflanzen, Institut für Biologie, Fachbereich 10: Mathematik und Naturwissenschaften, Universität Kassel vorgelegt von Diplom-Biologin Tina Wöhrmann aus Waldeck-Dehringhausen (Hessen) Kassel, im März 2014 Betreuer: Prof. Dr. Kurt Weising Prüfungskommission: Prof. Dr. Kurt Weising (1. Gutachter) Prof. Dr. Georg Zizka (2. Gutachter) Prof. Dr. Ewald Langer (Beisitzer) Prof. Dr. Rüdiger Wagner (Beisitzer) Tag der Disputation: 14.04.2014 Für meine Eltern ’Nimm dir jeden Tag eine halbe Stunde Zeit für deine Sorgen und in dieser Zeit mach ein Schläfchen’ LAOTSE ’Man gewinnt Stärke, Mut und Selbstvertrauen aus jeder Erfahrung, bei der man innehält, um sich seinen Ängsten zu stellen. Man muss die Dinge tun, von denen man glaubt, sie nicht tun zu können’ ELEANOR ROOSEVELT ’Je steiler der Berg, je härter der Anstieg, desto besser die Aussicht am Ziel’ ANONYMER AUTOR ’Der Unterschied zwischen möglich und unmöglich liegt in der Entschlossenheit’ TOMMY LASORDA I. Danksagung Diese Dissertation gedruckt in Händen zu halten ist ein wunderbares Gefühl, vor allem deshalb, weil der Weg gerade am Anfang etwas steinig war. Eine ganze Reihe besonderer Persönlichkeiten ist am erfolgreichen Abschluss dieses Werks beteiligt, weshalb es mir sehr am Herzen liegt, zuallererst meine Anerkennung zum Ausdruck zu bringen. Mein tiefster Dank richtet sich an Prof. Dr. KURT WEISING, der es mir durch die Bereitstellung des Themas und sämtlicher Ressourcen überhaupt erst ermöglicht hat diese Arbeit zu verfassen. Vielen Dank für die zahlreichen konstruktiven Gespräche und Ideen, all die nützlichen Tipps und Ratschläge, die Aufmunterungen und vor allem die große Unterstützung beim Verfassen der Arbeit. Danke, dass Du immer an mich geglaubt hast! Ebenfalls ganz herzlich bedanken möchte ich mich bei Prof. Dr. GEORG ZIZKA für die wertvolle Kooperation, die vielen interessanten Diskussionen während unserer Bromelientreffen und für die Betreuung der Arbeit als Zweitgutachter. Vielen, vielen Dank dafür, dass Sie das Unmögliche möglich gemacht haben! Besondere Anerkennung gilt allen Mitgliedern der Arbeitsgruppe Systematik und Morphologie der Pflanzen für ein großartiges und freundschaftliches Arbeitsklima, eine produktive Zusammenarbeit und eine wirklich schöne Zeit. Danke vor allem an meine Kollegen/innen NATASCHA, DANIELA, FLORIAN, CHRISTINE, IRENE, NICOLE, MALTE, RONNY und Frau MAIER-STOLTE. Für eine wunderbare Atmosphäre im Büro, die unbezahlbare Hilfe bei diversen PC-bedingten Wehwehchen, die fachlichen genauso wie die nicht-fachlichen Gespräche und die gelegentlichen Päuschen an der frischen Luft möchte ich mich bei KAI bedanken. Aber unser Büroteam wäre nicht komplett ohne SINA, die mich stets mit ihrer ruhigen Art zurück auf den Boden der Tatsachen, mit ihrem trockenen Humor zum Lachen und mit ihrem Kaffee zum Hyperventilieren gebracht hat. Die Zeit mit euch beiden wird mir immer im Gedächtnis bleiben. Für die produktive Kooperation und die Bereitstellung von Pflanzenmaterial bedanke ich mich bei INGO, FLORIAN, DIEGO, NICOLE, JULE, GEYNER, RODRIGO, DANIELE, Dr. BRUNO HUETTEL, Dr. ELTON LEME, Prof. Dr. ANA MARIA BENKO-ISEPPON und Dr. MARIA DAS GRAÇAS LAPA WANDERLEY. Besonders für ihre Geduld bei der Beantwortung meiner zahlreichen Fosterella-Fragen und für die Bereitstellung von Bildmaterial richtet sich mein besonderer Dank an NATASCHA. Ein großes Dankeschön gilt natürlich auch allen Botanischen Gärten und Herbarien, die mir das Pflanzenmaterial für meine Analysen zur Verfügung gestellt haben. Zudem danke ich dem DAAD und der ZFF der Universität Kassel für die finanzielle Unterstützung. Eine extra Portion Dank gilt meiner Familie, auf deren Unterstützung und Hilfe ich mich in jeder Lebenslage verlassen konnte und kann. Meinen Eltern danke ich dafür, dass sie mir den nötigen Ehrgeiz mit auf den Weg gegeben und mich in all meinen Plänen unterstützt haben. Besonders bedanken möchte ich mich bei meiner Mutter. Danke, dass Du immer für mich da warst und bist, mir in Zeiten der Unsicherheit den richtigen Weg gewiesen und meine Gedanken genau dann sortiert hast, wenn es darauf ankam. Ohne dich, deine Zuversicht und dein Vertrauen wäre mir so einiges verwehrt geblieben, nicht zuletzt diese Arbeit. Auch bei meinem Mann CHRISTOPH möchte ich mich ganz, ganz herzlich bedanken. Du hast mir stets bedingungslos den Rücken frei gehalten, warst mein Motivator, meine Ablenkung, meine Quelle guter Laune oder auch einfach nur die Schulter, die ich gerade brauchte. Danke! Für tatkräftige Unterstützung, aufmunternde Worte sowie das ein oder andere leibliche Wohl bedanke ich mich bei MARTINA, EDITH, ILSE, WILLI, JÜRGEN, CARLO, MAXI, WILLI, ILSE, SANDRA, ULI, MICHAEL, ANDI, CARO und DENNIS. Und für all die netten Gespräche drinnen und draußen: hab Dank, THOMAS. Mein Dank richtet sich weiterhin an SABRINA, insbesondere für ihre Freundschaft, ihre ermutigenden Worte und ihr Verständnis für meine zeitlichen Engpässe besonders in der Endphase dieser Arbeit. Danke auch an all meine kleinen und großen Fellnasen, die seit so vielen Jahren täglich für meine Frischluftzufuhr sorgen und mich dabei immer wieder aufs Neue mit ihrer Lebensfreude und Unbeschwertheit infizieren. Nicht zuletzt sei auch den Mikrosatelliten gedankt, die mich – unabhängig von ihrem Perfektionsgrad, ihrer Länge, ihrem Hang zur Variabilität, der Natur ihrer Stotterbanden, ihrer Herkunft und ihrer genomischen Position – in all den Jahren so treu flankiert haben. II. Gliederung 1. Einleitung 12 1.1 Die Ananasgewächse (Bromeliaceae) 12 1.1.1 Die Unterfamilie Pitcairnioideae 14 1.2 Mikrosatelliten 18 1.2.1 Vorkommen und mögliche Funktionen von Mikrosatelliten 18 1.2.2 Mutabilität und Evolution von Mikrosatelliten 20 1.2.3 Mutationsmodelle 21 1.2.3.1 Das ’infinite alleles model’ (IAM, KIMURA & CROW 1964) 22 1.2.3.2 Das ’stepwise mutation model’ (SMM, KIMURA & OHTA 1978) 22 1.2.4 Mikrosatelliten als molekulare Marker 23 1.2.5 Isolierung von Mikrosatelliten und Etablierung von Mikrosatellitenmarkern 25 1.2.5.1 Traditionelle Verfahren 26 1.2.5.2 ’Expressed sequence tags’ (EST-Mikrosatelliten oder EST-SSRs) 26 1.2.5.3 454-Pyrosequenzierung (454-Mikrosatelliten oder 454-SSRs) 27 1.3 Mikrosatellitenmarker für Bromelien 28 1.4 Alles beginnt mit einer Idee 29 1.4.1 Dyckia SCHULT. & SCHULT.F. 29 1.4.1.1 Artabgrenzung innerhalb der Gattung Dyckia 30 1.4.2 Fosterella L.B.SM. 31 1.4.2.1 Artabgrenzung innerhalb der micrantha-Gruppe 32 1.4.2.2 Populationsgenetik von F. rusbyi 32 1.5 Zielsetzung 34 2. Material und Methoden 36 2.1 Das Pflanzenmaterial 36 2.2 Molekulare Methoden 37 2.2.1 DNA-Isolation 37 2.2.2 Herkünfte der auf Mikrosatelliten hin durchsuchten DNA-Sequenzen 38 2.2.2.1 ’Expressed sequence tags’ (ESTs) aus Ananas comosus 38 2.2.2.2 454-Sequenzen aus Arten der Gattungen Fosterella, Dyckia und Deuterocohnia 39 2.2.3 Etablierung von EST- und 454-Mikrosatellitenmarkern nukleären Ursprungs 40 2.2.3.1 Assemblierung der Rohsequenzen 40 2.2.3.2 Suche nach Mikrosatellitenmotiven und Primerdesign 40 2.2.3.3 Auswahl geeigneter Primerpaare 42 2.2.3.4 ’Basal local alignment search tool’ (BLAST) 42 2.2.4 Etablierung von 454-Mikrosatellitenmarkern plastidären Ursprungs 43 2.2.4.1 Extraktion der plastidären DNA aus dem Gesamtdatensatz 43 2.2.4.2 Suche nach Mikrosatellitenmotiven und Primerdesign 43 2.2.4.3 Suche nach Genfunktionen 44 2.2.5 Gelelektrophorese 44 2.2.5.1 Agarose-Gelelektrophorese 44 2.2.5.2 Polyacrylamid (PAA)-Gelelektrophorese 45 2.2.6 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) 46 2.2.6.1 Amplifizierung nukleärer Mikrosatellitenloci 47 2.2.6.2 Amplifizierung plastidärer Mikrosatellitenloci 48 2.2.7 Längenstandard und Fragmentlängenanalyse 49 2.2.8 Primertests und Charakterisierung der Mikrosatellitenmarker 50 2.3 Datenauswertung nukleärer Mikrosatellitenmarker 51 2.3.1 Genetische Diversität und Variabilität 51 2.3.2 Fixationsindizes 52 2.3.3 Nachweis ’privater’ Allele 53 2.3.4 ’Analysis of molecular variance’ (AMOVA) 53 2.3.5 MANTEL-Test 54 2.3.6 Distanzverfahren 54 2.3.6.1 Neighbour-Joining-Analyse und NeighbourNet 54 2.3.6.2 Hauptkoordinaten-Analyse (’principal coordinates analysis’, PCo-Analyse) 54 2.3.6.3 BAYES`sches Verfahren 55 2.4 Datenauswertung plastidärer Mikrosatellitenmarker 56 2.4.1 Genetische Diversität und Differenzierung 56 2.4.2 Haplotypen-Netzwerke 57 2.4.3 Berechnung der Koeffizienten Gst und Nst 58 2.4.4 Genetische Strukturierung 59 3. Ergebnisse 60 3.1 DNA-Isolation 60 3.2 In silico-Suche nach Mikrosatellitensequenzen und digitales Primerdesign 60 3.2.1 EST-Sequenzen 61 3.2.2 454-Sequenzen 61 3.2.3 Identifizierung, Häufigkeit und Charakterisierung der Mikrosatelliten 62 3.2.4 Digitales Primerdesign 64 3.3 Nukleäre Mikrosatellitenmarker 65 3.3.1 Acom-Loci (Ananas comosus, EST-Datenbank) 65 3.3.1.1 Pilotstudien 65 3.3.1.2 Assoziation der EST-Mikrosatelliten mit Genfunktionen 67 3.3.1.3 Anwendbarkeit der EST-Marker in den Gattungen Ananas und Pseudananas: Verwandtschaftsanalysen 67 3.3.1.4 Übertragbarkeit der EST-Mikrosatellitenmarker aus Ananas comosus auf andere Gattungen der Bromeliaceae 70 3.3.2 ngFos-Loci (Fosterella rusbyi, 454-Pyrosequenzierung) 73 3.3.2.1 Pilotstudien 73 3.3.2.2 Anwendbarkeit der ngFos-Marker für genetische Studien in Populationen von F. rusbyi 76 3.3.2.3 Übertragbarkeit der nukleären 454-Marker aus F. rusbyi auf andere Gattungen der Bromeliaceae 78 3.3.3 ngDy-Loci (Dyckia marnier-lapostollei var. estevesii, 454-Pyrosequenzierung) 81 3.3.3.1 Pilotstudien 81 3.3.3.2 Übertragbarkeit der nukleären 454-Marker aus Dy. marnier-lapostollei auf andere Gattungen der Bromeliaceae 82 3.4 Plastidäre Mikrosatellitenmarker 85 3.4.1 In silico-Extraktion des plastidären DNA-Anteils aus den verfügbaren 454-Sequenzen 85 3.4.2 cpFos-Loci (Fosterella rusbyi, 454-Pyrosequenzierung) 86 3.4.2.1 Pilotstudien 88 3.5 Artabgrenzung von Dy. dissitiflora, Dy. pernambucana, Dy. macedoi und Dy. limae 91 3.5.1 BAYES`sche Analyse zur Bestimmung der wahrscheinlichsten Anzahl an Gruppen 94 3.5.2 Hauptkoordinaten-Analyse (’principal coordinates analysis’, PCoA) 94 3.5.3 NeighbourNet und genetische Differenzierung 95 3.6 Artabgrenzung innerhalb der micrantha-Gruppe 98 3.6.1 BAYES`sche Analyse 100 3.6.2 Hauptkoordinaten-Analyse (PCoA) 101 3.6.3 Geographische Korrelation 103 3.7 Populationsgenetik von Fosterella rusbyi 104 3.7.1 Nukleäre Mikrosatellitenmarker 104 3.7.1.1 Genetische Diversität 105 3.7.1.2 Genetische Differenzierung 107 3.7.1.3 Hauptkoordinaten-Analyse (PCoA) 108 3.7.1.4 BAYES`sche Analyse 109 3.7.1.5 Distanzverfahren 111 3.7.1.6 AMOVA 113 3.7.1.7 MANTEL-Test 114 3.7.2 Plastidäre Mikrosatellitenmarker 116 3.7.2.1 Genetische Diversität und Haplotypen-Netzwerk 116 3.7.2.2 BAYES`sche Analyse und genetische Differenzierung 119 4. Diskussion 122 4.1 Methodische Aspekte 122 4.1.1 Ananas-ESTs als ergiebige Quelle für Mikrosatelliten 122 4.1.1.1 Verteilung der Mikrosatellitenmotive in ESTs 125 4.1.1.2 Etablierung von EST-Mikrosatellitenmarkern und Primervalidierung 126 4.1.1.3 Funktionalität der EST-Mikrosatellitenmarker und Verwandtschaftsstudien innerhalb der Gattung Ananas 127 4.1.1.4 Übertragbarkeit der EST-Mikrosatellitenmarker aus Ananas innerhalb Bromeliaceae 130 4.1.1.5 Anwendbarkeit der EST-Mikrosatellitenmarker aus Ananas in der Unterfamilie Pitcairnioideae 131 4.1.1.6 EST-Mikrosatellitenmarker: ein Résumé 132 4.1.2 Mikrosatelliten aus der 454-Sequenzierung: Effizienz der Methode 133 4.1.2.1 Assemblierung 135 4.1.2.2 Abundanz der Mikrosatelliten und Primerdesign für ausgewählte Loci 138 4.1.2.3 Funktionalität der nukleären 454-Mikrosatellitenmarker 139 4.1.2.4 Anteil der plastidären Sequenzen im 454-Gesamtdatensatz 142 4.1.2.5 Funktionalität der entwickelten plastidären 454-Mikrosatellitenmarker aus F. rusbyi 144 4.1.2.6 Mikrosatelliten aus 454-Daten: ein Résumé 145 4.1.3 Bromelien und Mikrosatelliten 147 4.2 Populationsgenetische Untersuchungen in Dyckia- und Fosterella-Arten 149 4.2.1 Potenzial der Mikrosatellitenmarker zur Abgrenzung von Arten 149 4.2.1.1 Artabgrenzung in der Artengruppe Dyckia dissitiflora-Dy. pernambucana-Dy. limae 149 4.2.1.2 Artabgrenzung in der Artengruppe Fosterella christophii-F. micrantha-F. villosula 152 4.2.2 Populationsgenetik von Fosterella rusbyi 154 4.2.2.1 Mutationsmodelle 155 4.2.2.2 Genetische Diversität basierend auf nukleären Mikrosatellitenmarkern 155 4.2.2.3 Genetische Diversität basierend auf den plastidären Mikrosatellitenmarkern 159 4.2.2.4 Genetische Differenzierung und Populationsstruktur in Fosterella rusbyi 160 4.2.2.5 Schlussfolgerungen 162 4.2.2.6 Fosterella rusbyi: eine Bromelie mit Pionier-Charakter? 166 4.2.2.7 Ausblick 166 5. Zusammenfassung 168 6. Literaturverzeichnis 173 7. Anhang 190 8. Abbildungsverzeichnis 227 9. Tabellenverzeichnis 228 10. Abkürzungsverzeichnis 229 11. Verbrauchsmaterialien 232 11.1 Geräte 232 11.2 Reagenzien, Enzyme und Kits 232 11.3 Lösungen 233 12. Referenzen 234 12.1 Qualifikationsarbeiten 234 12.2 Publikationen in der Fachliteratur 234 12.3 Teilnahme an Fachtagungen durch Poster 235 12.4 Teilnahme an Fachtagungen durch Vorträge 235 13. Erklärung 236 Einleitung 1. Einleitung 1.1 Die Ananasgewächse (Bromeliaceae) Mit derzeit 3.352 anerkannten Arten aus 58 Gattungen bilden die monokotylen Bromeliaceen (Unterklasse Liliidae, Ordnung Poales) eine der größten Pflanzenfamilien der Neotropen (LUTHER 2012). Aufgrund molekularer Daten wurde die Familie von GIVNISH et al. (2007, 2011) in acht jeweils monophyletische Unterfamilien aufgeteilt, i.E. die Brocchinioideae (20 Arten), Bromelioideae (940), Hechtioideae (62), Lindmanioideae (45), Navioideae (107), Pitcairnioideae (623), Puyoideae (218) und Tillandsioideae (1.337). Die einzige in der Alten Welt beheimatete Art ist Pitcairnia feliciana aus der Unterfamilie der Pitcairnioideae. Diese Art ist im afrikanischen Fouta Djallon Bergland (Guinea) endemisch (POREMBSKY & BARTHLOTT 1999) und vermutlich via Fernausbreitung vor ca. 9 Millionen Jahren dorthin gelangt (GIVNISH et al. 2011). Bromelien sind ausdauernde, krautige Pflanzen, deren häufig stark bewehrte Blätter rosettenförmig angeordnet sind und deren Blüten einen dreizähligen Aufbau aufweisen (PETERS 2009). Die Blüten werden von verschiedenen Bestäubern, wie Insekten, Kolibris, Fledermäusen und einigen Sperlingsvögeln, besucht (GIVNISH et al. 2011). Früchte werden in Form von Deckelkapseln oder Beeren gebildet, die eher kleinen Samen sind entweder nackt, fedrig behaart oder geflügelt (PETERS 2009). Die wohl bekannteste Vertreterin der Familie ist die Ananas (A. comosus), die wirtschaftlich drittwichtigste kultivierte Frucht hinter der Banane und den Zitrusfrüchten (BOTELLA & SMITH 2008). Die Mitglieder der Bromeliaceae sind für ihre große ökologische, physiologische und morphologische Plastizität bekannt (BENZING 2000; CRAYN et al. 2004; SCHULTE et al. 2009; ZIZKA et al. 2009). Diese ermöglicht es ihnen, eine bemerkenswerte Vielzahl terrestrischer und vor allem epiphytischer Lebensräume zu besiedeln, darunter auch vergleichsweise lebensfeindliche und extreme Habitate. So dominiert zum Beispiel die für ihre Wasserversorgung ausschließlich auf nächtlichen Nebel und Tau angewiesene Tillandsia landbeckii das Erscheinungsbild der südamerikanischen Atacama-Wüste, einer der trockensten Landschaften weltweit (LATORRE et al. 2011). Die morphologische Variabilität der Bromelien ist oftmals sehr eindrucksvoll (vgl. Abbildung 1.1). So bildet Puya raimondii von allen Blütenpflanzen die mächtigsten Infloreszenzen (sechs bis acht Meter, SGORBATI et al. 2004), wohingegen die Blütenstände von zwergwüchsigen Deuterocohnia- oder Brocchinia-Arten nur wenige Zentimeter erreichen (GIVNISH et al. 2011). Mehrere Schlüssel- 12 Einleitung Innovationen wie zum Beispiel die CAM (’crassulacean acid metabolism’)-Photosynthese (GRIFFITHS & SMITH 1983; CRAYN et al. 2004; QUESEDA & GIANOLI 2011; SILVESTRO et al. 2014), xerophytische Anpassungen wie Sukkulenz (BENZING 2000) und die Ausbildung von speziellen Trichomen zur Wasseraufnahme (BENZING & BURT 1970) sind für das erstaunliche Maß an Diversität mit verantwortlich. Abbildung 1.1: Tuschezeichnungen von sechs Vertretern der Bromeliaceae. Obere Reihe (v.l.n.r.): Dyckia remotiflora (WATTS 1935, Bot. Reg. 1782), Pitcairnia heterophylla (BARDAY 1940, Bot. Reg. 71), Puya caerulea (BARDAY 1940, Bot. Reg. 11). Untere Reihe (v.j.n.r.): Vriesea psittacina (BARDAY 1943, Bot. Reg. 10), Tillandsia dianthoidea (WATTS 1930, Bot. Reg. 1338), Tillandsia geminiflora (BARDAY 1942, Bot. Reg. 63). Zeichnungen aus WATSON & DALLWITZ (1992). 13 Einleitung Manche der morphologischen Anpassungen haben auch eine große Bedeutung für die assoziierte Fauna. So dient die Bildung von Phytotelmata (Bromelientrichter) der Pflanze in erster Linie als Wasserreservoir (ZOTZ & THOMAS 1999), wird aber auch von zahlreichen Arthropoden (z.B. den Larven der invasiven Moskitoart Aedes aegypti, LOPEZ et al. 2011), Amphibien und Reptilien als Lebensraum genutzt, welche wiederum die Nahrungsgrundlage diverser Primaten und Vögel darstellen. Einige Bromelienarten sind als Pionierpflanzen an der Neubesiedlung noch vegetationsfreier Habitate beteiligt, so zum Beispiel Fernseea itatiaiae (SCARANO 2002), Ananas ananassoides (SILVEIRA et al. 2010), Guzmania monostachya (CASCANTE-MARÍN et al. 2006) und Hechtia schottii (RAMIREZ MORILLO et al. 2008). Im erstaunlichen Gegensatz zu der Vielfalt der ökologischen Anpassungen und morphologischen Merkmale erwiesen sich die Bromelien auf genetischer Ebene als eher wenig divers (u.a. GAUT et al. 1992; TERRY et al. 1997; MAIA et al. 2012; KRAPP et al. 2014), was vermutlich mit ihrem vergleichsweise geringen Alter zusammenhängt. Aufgrund fehlender Fossilien ist die zeitliche Rekonstruktion der Evolution von Bromelien zwar schwierig, basierend auf einer indirekten Kalibrierungsmethode und einem molekularen Stammbaum kamen GIVNISH et al. (2007) jedoch zu dem Schluss, dass die Diversifizierung der Kronengruppe der Bromeliaceae vor ca. 19 Millionen Jahren (im Miozän) einsetzte. Die Entstehung eines großen Artenreichtums in relativ kurzer Zeit wird generell mit einer raschen adaptiven Radiation erklärt (BENZING 2000; GIVNISH et al. 2011), was diese Pflanzenfamilie zu einem höchst interessanten Forschungsobjekt macht. Das rasch ansteigende Interesse an den Bromeliaceen wird unter anderem dadurch deutlich, dass von den derzeit 483 in GenBank, einer vom NCBI unterhaltenen Datenbank, registrierten Artikeln (Stand Januar 2014) mehr als die Hälfte innerhalb der letzten fünf Jahre veröffentlicht wurden. Eine beständig zunehmende Menge an verfügbaren Daten u.a. molekularer, morphologischer, anatomischer und physiologischer Natur sowie die Entwicklung neuer molekularer Techniken hat dazu geführt, dass das Wissen über die Phylogenie, Systematik und Evolution der Bromeliaceen enorm angewachsen ist (GIVNISH et al. 2011, 2014; MICHALAK 2013). 1.1.1 Die Unterfamilie Pitcairnioideae In Folge der Neueinteilung der Bromeliaceen durch GIVNISH et al. (2007, 2011) besteht die ca. 13,4 Millionen Jahre alte Unterfamilie der Pitcairnioideae derzeit aus fünf Gattungen. Die sogenannte ’Dyckia-clade’ (nach CRAYN et al. 2004; vgl. Abbildung 1.2) enthält die Gattungen Deuterocohnia (17 Arten; SCHÜTZ 2012), Dyckia (159 Arten; KRAPP 2012) und Encholirium (25 Arten; FORZZA 2005). Ein augenscheinliches Merkmal, welches die Vertreter dieser monophyletischen 14 Einleitung Abbildung 1.2: Morphologie einiger xeromorpher Arten aus der ’Dyckia-clade’. A: Blüten von Deuterocohnia meziana, B: Blüten von D. longipetala, C: Blattrosette und sitzende Blüten von D. lotteae, D: Habitus einer D. spec., E: stark bewehrte und sukkulente Blätter von Dyckia marnier-lapostollei, F: gelbblühende Infloreszenz von Dy. ferox, G: orange-rote Blüten von Dy. rojasii, H: stark bewehrte und sukkulente Blattrosette von Encholirium spectabile, I: grünliche Infloreszenz einer Encholirium-Art. Bilder mit freundlicher Genehmigung von K. WEISING. 15 Einleitung Gruppe verbindet sind die sukkulenten, robusten, stark bewehrten Blätter, deren Stacheln an Haifischzähne erinnern (vgl. Abbildung 1.2 E, H). Die Blätter enthalten ein unterschiedlich stark ausgeprägtes Hydrenchym, sodass die Individuen dieser drei Gattungen zusammen mit der Nutzung der CAM-Photosynthese sehr gut an hochgradig arides Klima angepasst sind (xerophytische Lebensweise). Während Encholirium ausschließlich in Brasilien – hier vor allem im Nordosten des Landes – beheimatet ist, sind die Arten der Gattung Dyckia außer in Brasilien auch in angrenzenden Ländern verbreitet. Deuterocohnia dagegen bewohnt vorrangig hoch gelegene Regionen der Anden in Argentinien, Bolivien, Chile und Peru. Die beiden übrigen Gattungen der Pitcairnioideae, Fosterella (31 Arten; PETERS 2009) und Pitcairnia (399 Arten; LUTHER 2012) betreiben C3-Photosynthese und zeichnen sich eher durch eine mesophytische Morphologie aus (vgl. Abbildung 1.3). Während die Vertreter von Fosterella neben wenigen disjunkten Verbreitungen hauptsächlich in den feuchten bolivianischen Bergwäldern, den Yungas vorkommen (PETERS 2009), erstreckt sich das Verbreitungsgebiet von Pitcairnia über große Teile Südamerikas (Verbreitungskarte vgl. KRAPP 2012). Abbildung 1.3: Morphologie einiger mesophytischer Arten der Gattungen Fosterella und Pitcairnia. A: Blüte von Fosterella petiolata mit zurückgebogenen, weißen Petalen, B: rötlich gefärbte Blüten von F. spectabilis, C: Infloreszenz von F. penduliflora, D: Blattrosette von F. christophii am natürlichen Standort, E: rot-schwarz gefärbte Blüten von Pitcairnia rubronigriflora, F: Rosette und orangefarbene Infloreszenz von P. tabuliformis, G: rötliche Infloreszenz von P. riparia, H: Habitus von P. villetaensis. Bilder mit freundlicher Genehmigung von K. WEISING (A, B, C, F, G), N. WAGNER (D) und F. KRAPP (E, H). Insgesamt weisen die fünf Gattungen der Unterfamilie sehr unterschiedliche Artenzahlen und Verbreitungsmuster auf. Warum dies so ist und was die Triebfeder der in den einzelnen Gattungen so unterschiedlich raschen Diversifizierung darstellt, ist eine spannende Frage und 16 Einleitung bisher weitgehend ungeklärt. Die Unterfamilie Pitcairnioideae bildet einen zentralen Forschungsschwerpunkt der AG Systematik und Morphologie der Pflanzen (Universität Kassel). So wurden innerhalb der letzten 15 Jahre zusammen mit Kooperationspartnern zahlreiche Arbeiten veröffentlicht, die sich sowohl auf Ebene der Beziehungen zwischen höheren Taxa (Systematik, Phylogenie, Evolutionsbiologie), als auch auf innerartlicher Ebene (Populationsgenetik, Phylogeographie, Artbildung) mit dieser Unterfamilie und ihren Gattungen auseinandersetzen. Die Evolution der Lebewesen hat ihren Ausgangspunkt auf der Ebene von Populationen, daher ist die Populationsgenetik ein wichtiges Werkzeug, um diejenigen evolutiven Prozesse zu durchleuchten, die die genetische Differenzierung bis hin zur Artbildung vorantreiben. Die Populationsgenetik erlaubt es, auf der Basis molekularer Daten Einblicke in die genetische Diversität, Differenzierung und Strukturierung von Populationen zu gewinnen, was wiederum Aussagen darüber erlaubt, wie stark der Genfluss zwischen geographisch getrennten Standorten ist und welche Faktoren ihn beeinflussen. Eine der maßgeblichen Größen für populationsgenetische Studien stellt die Verteilung der Allele und somit der genetischen Variation, innerhalb und zwischen den betrachteten Populationen dar. Die Kenntnis über das Ausmaß und die Verteilung der genetischen Variation ermöglicht wiederum Rückschlüsse auf die Biologie einer Art. Zum Nachweis und zur Analyse der genetischen Variation zwischen pflanzlichen Populationen steht eine Vielzahl unterschiedlicher molekularer Marker zur Verfügung. Eine kurze Übersicht der gebräuchlichsten Markertechniken liefern die folgenden Abschnitte. Zu den ältesten, auf Hybridisierung beruhenden Techniken zählen sowohl Protein-basierte Allozymmarker als auch DNA-basierte RFLPs (’restricted fragment length polymorphism’). Beide Markensysteme zeigen eine zur populationsgenetischen Anwendung vorteilhafte kodominante Merkmalsausprägung, weshalb beide Methoden bereits in zahlreichen Studien angewendet wurden (u.a. HAMRICK & GODT 1990; MILLER & TANKSLEY 1990). Obwohl einfach in der Handhabung, liegt ein entscheidender Nachteil der Allozymmarker sowohl in der beschränkten Anzahl unterschiedlicher Loci als auch der häufig geringen Variabilität zwischen nah verwandten Taxa (NYBOM et al. 2014). Zwar ist die Anzahl verschiedener Loci bei der RFLP-Analyse nahezu unbegrenzt, allerdings wirkt sich die große benötigte Menge hochwertiger DNA und das vergleichsweise aufwendige experimentelle Protokoll nachteilig auf diese Technik aus (AGARWAL et al. 2008). Die Erfindung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) durch MULLIS et al. (1986) eröffnete der molekularen Markertechnik neue Wege. So verwenden die ersten PCR-basierten Techniken einzelne Primer mit zufälliger oder semispezifischer Sequenz, um PCR-Fragmente der 17 Einleitung genomischen DNA zu produzieren. Neben diversen Modifikationen bilden die dominanten RAPD (’random amplified polymorphic DNA’, WILLIAMS et al. 1990)-, AFLP (’amplified fragment length polymorphism’, VOS et al. 1995)- und ISSR (’inter-simple sequence repeat’, GUPTA et al. 1994; ZIETKIEWICZ et al. 1994)-Marker die ursprünglichste Form dieser sogenannten ’Multilocus’-Marker. Während den RAPD-Markern eine verringerte Reproduzierbarkeit nachgesagt wird (WEISING et al. 2005) konnte dieses Risiko für AFLP- und ISSR-Marker durch stringentere PCR-Bedingungen minimiert werden. Neben der benötigten hochwertigen DNA ist die AFLP-Methode ähnlich der RFLP-Methode vergleichsweise aufwendig, wohingegen die ISSR-Methode einfach, schnell und kostengünstig angewendet werden kann. Allen drei Techniken gemeinsam ist allerdings das erhöhte Fehlerrisiko bei der Auswertung der multiplen und somit komplexen Bandenmuster. Hoch-sensitive, locusspezifische Mikrosatelliten besitzen gegenüber den o.g. Markersystemen bedeutende Vorteile und haben sich besonders im Rahmen der populationsgenetischen Anwendung als Marker der Wahl bewährt. Die Biologie der Mikrosatelliten, ihr Vorkommen und Mutationsverhalten sowie ihre Nutzbarkeit als molekulare Marker sollen in den folgenden Abschnitten vorgestellt werden. 1.2 Mikrosatelliten Mikrosatelliten (LITT & LUTY 1989), auch bekannt als ‘simple sequence repeats‘ (SSRs, JACOB et al. 1991), ‘simple sequence length polymorphism‘ (SSLPs, TAUTZ 1989) oder ‘short tandem repeats‘ (STRs, EDWARDS et al. 1991), sind tandemartige Wiederholungen von kurzen DNA-Sequenzmotiven, basierend auf einem variablen Grundgerüst aus mindestens einem und maximal sechs bis acht Basenpaar/en (z.B. ...GAGAGAGAGA...). Fasst man alle selbst-komplementären und überlappenden Motive zu einem einzigen zusammen, so ergeben sich insgesamt 501 Kombinationsmöglichkeiten redundanzfreier Mono- bis Hexanukleotid-Mikrosatellitenmotive (JURKA & PETHIYAGODA 1995). Basierend auf dem Perfektionsgrad werden drei Typen unterschieden (WEBER 1990). Perfekte Mikrosatelliten bestehen aus der regelmäßigen Abfolge eines einzigen Motivs, während in imperfekten Mikrosatelliten die Abfolge durch eine oder mehrere heterologe Basen unterbrochen ist. In zusammengesetzten Mikrosatelliten sind mehrere Motive perfekter oder imperfekter Abfolgen miteinander vermischt. 1.2.1 Vorkommen und mögliche Funktionen von Mikrosatelliten Zuerst zufällig in der Satelliten-DNA eines Einsiedlerkrebses (Pagurus pollicaris, SKINNER et al. 1974) 18 Einleitung entdeckt, erwiesen sich Mikrosatelliten im Genom der Eukaryoten als allgegenwärtig (TAUTZ & RENZ 1984). Auch im Genom zahlreicher Prokaryoten kommen Mikrosatelliten vor, jedoch weniger häufig und mit deutlich kürzeren Gesamtlängen als in Eukaryoten (HANCOCK 1996; FIELD & WILLS 1996; VAN BELKUM et al. 1998; MARCOTTE et al. 1999; LI et al. 2004). Im pflanzlichen Genom wurden Mikrosatelliten vor etwa 25 Jahren erstmals nachgewiesen (WEISING et al. 1989, 1992; BEYERMANN et al. 1992). Entgegen erster Erwartungen (LAGERCRANTZ et al. 1993) stellte sich bald heraus, dass Mikrosatelliten in pflanzlicher DNA ebenso häufig auftreten wie in tierischer DNA, wobei sich die Abundanz einzelner Motive allerdings stark unterscheiden kann (CARDLE et al. 2000; BECKMANN & WEBER 1992). Zahlreiche Studien belegen, dass in Pflanzen (AT)n das häufigste Motiv darstellt, gefolgt von (AG)n und (AAG)n (LAGERCRANTZ et al. 1993; MORGANTE & OLIVIERI 1993; WANG et al. 1994; TÓTH et al. 2000; MORGANTE et al. 2002). In Säugetieren hingegen überwiegen die Motive (AC)n und (A)n (HAMADA et al. 1982; AITMAN et al. 1991; BECKMANN & WEBER 1992; JURKA & PETHIYAGODA 1995). Neben dem Kerngenom enthält auch die DNA der meist maternal und ohne Rekombination vererbten Zellorganellen Mikrosatelliten, so findet man zum Beispiel im pflanzlichen Plastom überwiegend das Mononukleotid-Motiv (A)n (POWELL et al. 1995a; POWELL et al. 1995b). Auch im pflanzlichen Chondriom scheinen insbesondere Mononukleotid-Wiederholungen vorzukommen, hierzu gibt es aber bislang nur wenige Studien (z.B. SORANZO et al. 1999). Mikrosatelliten sind in kodierenden wie auch nicht-kodierenden Bereichen (z.B. in Introns) des Kerngenoms zu finden. Generell sind Mono- und Dinukleotid-Wiederholungen die häufigsten Mikrosatellitentypen, in Exons überwiegt jedoch die Anzahl an Tri- und Hexanukleotid-Wiederholungen (TÓTH et al. 2000). Der Grund dafür liegt darin, dass Motive mit einem Vielfachen von drei keinen Einfluss auf die Triplet-Periodizität des offenen Leserahmens nehmen: ein Verrutschen um drei bzw. sechs Basen führt nicht zu einer Rasterschubmutation und damit zum Einbau falscher Aminosäuren in das betreffende Protein (WEISING et al. 2005). MORGANTE et al. (2002) sprechen in diesem Zusammenhang von einer negativen Selektion, welche auf die kodierenden Sequenzen einwirkt und so das Ungleichgewicht der Motivtypen verursacht. Hingegen ist der Selektionsdruck, der auf die Mikrosatelliten aus dem nicht-kodierenden Bereich lastet, vergleichsweise schwach, so dass sie in diesem Fall als selektionsneutral eingestuft werden (QUELLER et al. 1993; JARNE & LAGODA 1996). Insgesamt lässt sich sagen, dass die Zusammensetzung der Mikrosatelliten im jeweiligen Genom stark von der untersuchten Spezies, der Genomgröße und dem jeweiligen genomischen Bereich (kodierend vs. nicht-kodierend) abhängt (BECKMANN & WEBER 1992; LAGERCRANTZ et al. 1993; TAUTZ & SCHLÖTTERER 1994, HANCOCK 1996). Die frühere Annahme einer mehr oder weniger zufälligen Verteilung im Genom (LUTY et al. 1990) wurde durch etliche Studien widerlegt (für nähere Angaben siehe LI et al. 2004 und OLIVEIRA et al. 2006). So fanden MORGANTE et al. (2002) heraus, dass 19 Einleitung Mikrosatelliten häufig mit der pflanzlichen ’single copy’-DNA, d.h. dem nicht-repetitiven und exprimierten Anteil der DNA assoziiert sind. Diese These wird durch das unerwartet häufige Auftreten von Mikrosatelliten in sog. ’expressed sequence tags’ (ESTs) unterstützt (vgl. Kapitel 1.2.5.2). LAROTA et al. (2005) vermuten, dass die häufige Präsenz von Mikrosatelliten in der Umgebung von Genen in einer regulatorischen Funktion in Bezug auf die Umstrukturierung des Chromatins und der DNA-Methylierung begründet sein könnte. Bereits seit längerem ist bekannt, dass eine Reihe von neurodegenerativen menschlichen Erbkrankheiten durch eine massive Erhöhung in der Anzahl an Wiederholungseinheiten eines Mikrosatelliten in oder in der unmittelbaren Umgebung eines Gens verursacht wird (GATCHEL & ZOGHBI 2005; BATRA et al. 2010; BOLAND & GOEL 2010; LOPEZ CASTEL et al. 2010). So wird beispielsweise die HUNTINGTON-Krankheit, eine Erbkrankheit des Gehirns, durch eine massive Expansion des (CAG)n-Motivs im HUNTINGTON-Gen auf dem vierten menschlichen Chromosom ausgelöst (MACDONALD et al. 1993). Trotz zahlreicher Arbeiten und Hypothesen, die sich mit diesem Thema beschäftigen, ist über die möglichen Funktionen von Mikrosatelliten im Genom noch wenig Sicheres bekannt. 1.2.2 Mutabilität und Evolution von Mikrosatelliten Eine herausragende Eigenschaft von Mikrosatelliten ist die hohe Variabilität in der Anzahl ihrer Wiederholungseinheiten. So treten innerhalb der gleichen Art oder gar der gleichen Population meist mehrere bis zahlreiche unterschiedliche Längenvarianten bzw. ’Allele’ an einem gegebenen Mikrosatellitenlocus auf. Es wird angenommen, dass die Variation in der Anzahl an Wiederholungseinheiten und die damit einhergehende Instabilität von Mikrosatelliten vor allem durch einen Mutationstyp mit der Bezeichnung ’slipped strand mispairing’ verursacht wird (SSM, FRESCO & ALBERTS 1960; LEVINSON & GUTMAN 1987). Während der Replikation liegt der Templat-Strang zeitweise und lokal als Einzelmolekül vor. Um den Replikationsprozess abzuschließen müssen der alte und der neu synthetisierte Strang zu 100% komplementär sein, andernfalls werden Mutationen erzeugt. Das SSM-Modell besagt, dass das Vorhandensein von Mikrosatelliten bzw. deren Wiederholungseinheiten in der Templat-DNA das Verrutschen der DNA-Polymerase und infolgedessen eine Schleifenbildung (’DNA loop’) während des Replikationsvorgangs begünstigt. So entstehen Fehlpaarungen, die entweder eine Zunahme (wenn der neu synthetisierte Strang betroffen ist), oder eine Abnahme (wenn der Templat-Strang betroffen ist) in der Anzahl der Wiederholungseinheiten in einem der Tochtermoleküle bewirken. Die Mutationsraten für die Entstehung neuer Mikrosatelliten-Längenvarianten sind um einige Größenordnungen höher als die Basensubstitutionsraten für die umliegenden Bereiche des 20 Einleitung Genoms (10-3 bis 10-4 gegenüber etwa 10-9 bis 10-10 Mutationen pro Locus und Generation; ELLEGREN 2000; LI et al. 2002, LOWE et al. 2004). Zahlreiche Faktoren beeinflussen diesen komplexen Prozess, eine Übersicht liefern hier unter anderem SCHLÖTTERER (2000), ELLEGREN (2004) und WEISING et al. (2005). Die Mutationsraten von Mononukleotid-Wiederholungen des Chloroplasten-Genoms scheinen generell etwas niedriger zu liegen (3,2 bis 7,9 x 10-5 in Pinus torreyana; PROVAN et al. 1999), aber auch hier fehlt es bisher an systematischen Studien. Die Mutationsraten sind oft positiv mit der Gesamtlänge eines Mikrosatelliten korreliert, sofern dieser dem perfekten Typ angehört (WEBER 1990; KELKAR et al. 2008). So weisen längere Mikrosatelliten meist auch eine höhere Anzahl unterschiedlicher Längenvarianten auf als kürzere. Werden perfekte Mikrosatelliten durch eine Basensubstitution unterbrochen, so geht die SSM-bedingte Mutationsrate wieder zurück. Je höher die Anzahl von Wiederholungseinheiten ist, desto größer ist auch die Wahrscheinlichkeit einer Unterbrechung, so dass sich die Mutationsraten an einem gegebenen Locus ständig ändern können (GUICHOUX et al. 2011). Man nimmt an, dass sowohl an der Entstehung als auch am Zerfall eines Mikrosatelliten jeweils zwei unterschiedlichen Mutationsereignisse beteiligt sind, MESSIER et al. (1996) und TAYLOR et al. (1999) verwenden in diesem Zusammenhang die beiden Begriffe ’Geburt’ und ’Tod’ eines Mikrosatelliten. Demnach erzeugt eine erste Mutation während der ’Geburt’ eines perfekten Mikrosatelliten zunächst ausreichend lange Wiederholungseinheiten, die dann den Ausgangspunkt für das anschließende ’slipped strand mispairing’ (SSM) darstellen. MESSIER et al. (1996) nehmen an, dass zum Beispiel bei Dinukleotid-Mikrosatellitenmotiven vier bis fünf Wiederholungseinheiten vorhanden sein müssen, während bei Tetranukleotid- Mikrosatellitenmotiven bereits zwei Wiederholungseinheiten ausreichen, damit das SSM einsetzen kann. Die zweite Mutation beruht schließlich auf dem SSM selbst und bewirkt die für einen Mikrosatelliten charakteristische Längenvariation. Als Ursache für den ’Tod’ eines Mikrosatelliten wird vermutet, dass die einst perfekte Wiederholungseinheit durch eine Mutation unterbrochen wird, wodurch der Mikrosatellit stabilisiert wird. Eine darauffolgende Mutation entfernt letztlich einen großen Teil der verbliebenen Einheiten und führt zum Zerfall des Mikrosatelliten. 1.2.3 Mutationsmodelle Mikrosatelliten werden häufig für populationsgenetische Analysen eingesetzt (vgl. folgende Kapitel). Die Interpretation der dabei erhobenen Daten hängt davon ab, welches Mutationsmodell man als treibende Kraft für die Evolution der Mikrosatelliten annimmt. Neben der Analyse der 21 Einleitung genetischen Diversität und deren Verteilung dienen solche Mutationsmodelle dazu, die erwartete Anzahl an Allelen in einer Population aus der beobachteten Heterozygotie (Ho) abzuleiten (OLIVEIRA et al. 2006). Zwei Modelle haben sich bei der Anwendung von Mikrosatelliten in zahlreichen populationsgenetischen Studien bewährt und werden nachfolgend in groben Zügen erläutert. 1.2.3.1 Das ’infinite alleles model’ (IAM, KIMURA & CROW 1964) Das zunächst für Allozym-basierte Populationsgenetik entwickelte ’infinite alleles’-Modell (IAM) besagt, dass jede neue Mutation eine zufällige Anzahl an Wiederholungseinheiten hervorbringt und dass die Größe (bzw. Länge) eines neu entstandenen Allels daher unabhängig von der Größe des Ursprungs-Allels ist. Demnach wäre ein Allel mit fünf Wiederholungseinheiten genetisch ebenso weit von einem Allel mit zwei solcher Einheiten entfernt wie von einem Allel mit vier, sieben oder elf Einheiten (Abbildung 1.4 links). Auf diesem Modell basieren WRIGHT’s (1946, 1951 und 1965) Fst and NEI’s (1977) Gst (populationsgenetische Parameter; vgl. Kapitel 2.3.2). Abbildung 1.4: Vergleichende Gegenüberstellung zweier Mutationsmodelle zur Evolution von Mikrosatelliten. Die grauen Boxen stehen für ein beliebiges Motiv, z.B. (AT). Die schwarzen Pfeile zeigen die Mutationsrichtung vom Ursprung (dunkelgraue Boxen = 5 Wiederholungseinheiten) hin zu kürzeren oder längeren Einheiten (hellgraue Boxen) an. Unter dem ’infinitive alleles model’ (links) kann ein Allel innerhalb eines einzigen Mutationsschrittes zu einem beliebigen anderen Allel mutieren. Unter dem ’stepwise mutatin model’ (rechts) wird angenommen, dass nur die Zu- oder Abnahme um eine Wiederholungseinheit pro Mutationsschritt möglich ist (Grafik verändert nach LOWE et al. 2004). 1.2.3.2 Das ’stepwise mutation model’ (SMM, KIMURA & OHTA 1978) Das ’stepwise mutation’-Modell (SMM) nimmt an, dass eine Mutation stets den Zugewinn oder den Verlust einer einzigen Wiederholungseinheit bewirkt, sodass die Variation ausgehend vom Ursprungs-Allel in die jeweilige Richtung schrittweise erzeugt wird (rechte Seite in Abbildung 1.4). Allelpaare, die sich in nur einer Wiederholungseinheit unterscheiden, sind danach näher miteinander verwandt als Allelpaare, die sich durch mehrere Einheiten unterscheiden. Nach dem SMM besteht daher sehr wohl ein Zusammenhang zwischen dem Größen- bzw. Längenunterschied zwischen zwei Mikrosatellitenallelen und der Zeit, die seit ihrer Divergenz 22 Einleitung vergangen ist. Um die genetische Distanz unter dem SMM zu kalkulieren, entwickelte SLATKIN (1995) das Fst-Analog Rst, in welchem die Unterschiede in der Allellänge mit der zeitlichen Komponente in Beziehung gesetzt werden (vgl. Kapitel 2.3.2). Es wird angenommen, dass sich die Anzahl an Wiederholungseinheiten im Rahmen der für Mikrosatelliten charakteristischen ’slipped strand mispairing’–Mutationen meist nur um eine Einheit ändert (LEVINSON & GUTMAN 1987). Infolgedessen scheint das SMM in Verbindung mit Mikrosatellitendaten die geeignetere Modellvariante darzustellen. In der Praxis wird aber meist eine vergleichende Analyse unter Verwendung sowohl des IAM- als auch des SMM-Modells vorgenommen (ANDERSON 2000; NOVICK et al. 2003; LEMES et al. 2003; BOWEN et al. 2005, WÖHRMANN 2008). 1.2.4 Mikrosatelliten als molekulare Marker Aufgrund ihrer hohen Mutationsrate und dem daraus resultierenden Längenpolymorphismus der Allele an einem gegebenen Locus eignen sich Mikrosatelliten hervorragend als molekulare Marker auf innerartlicher Ebene. Mittels locusspezifischer flankierender Primerpaare lassen sich Mikrosatellitenloci mittels PCR leicht und reproduzierbar amplifizieren, was in Pflanzen zuerst erfolgreich in der Sojabohne dokumentiert wurde (AKKAYA et al. 1992). Die resultierenden PCR- Produkte werden elektrophoretisch auf hochauflösenden Gelen oder Kapillaren aufgetrennt, so dass jedes Längenallel individuell identifiziert werden kann. Ein homozygoter Mikrosatellitenlocus in einem diploiden Organismus ist dadurch definiert, dass beide Chromosomen dieselbe Anzahl an Wiederholungseinheiten aufweisen, wohingegen ein heterozygoter Locus durch eine unterschiedliche Anzahl an Wiederholungen für jedes Allel gekennzeichnet ist. Mit Hilfe der o.g. Methode lassen sich homo- und heterozygoter Zustand leicht experimentell unterscheiden, da im ersteren Fall nur eine Bande zu sehen ist, im letzteren jedoch zwei (Eigenschaft eines kodominanten Markers, vgl. Abbildung 1.5). Abbildung 1.5: Exemplarische Gegenüberstellung der Bandenmuster an einem homozygoten Mikrosatellitenlocus mit nur je einer Bande pro Spur (ngFos_6 in elf Akzessionen) und einem heterozygoten Locus mit überwiegend zwei Banden je Spur (Acom_12.12 in 20 Akzessionen) auf hochauflösendem 6%-igen PAA-Gel; S: Längenstandard. 23 Einleitung Innerhalb einer Population oder Art sind am selben Locus für gewöhnlich mehrere Allele mit unterschiedlichen Anzahlen an Wiederholungseinheiten vorhanden. Solche polymorphen Mikrosatelliten sind somit sehr gut geeignet, um Individuen, oder Gruppen von Individuen voneinander abzugrenzen und die genetische Diversität und Populationsstruktur auf verschiedenen Ebenen abzuschätzen. Diese hohe Sensitivität und das damit verbundene große Differenzierungspotenzial macht Mikrosatelliten für populationsgenetische Studien zum Marker der Wahl (BRUFORD & WAYNE 1993; CHASE et al. 1996; COLLEVATTI et al. 2001; ZHOU et al. 2003; WÖHRMANN & WEISING 2011; WÖHRMANN et al. 2011; GUICKING et al. 2013). Darüber hinaus gibt es zahlreiche weitere Einsatzgebiete für Mikrosatelliten, so unter anderem ∙ die Erstellung genetischer Karten (DIB et al. 1996; KNAPIK et al. 1998; RÖDER et al. 1998; ANDERSEN & LÜBBERSTEDT 2003; SHOKEEN et al. 2011; SARGENT et al. 2012; FARRELL et al. 2013), ∙ die Durchführung von Vaterschafts- und Verwandtschaftsstudien (QUELLER et al. 1993; KNIGHT et al. 1998; DE LA ROSA et al. 2013), ∙ die Forensik (REDD et al. 2002; JONES et al. 2002), ∙ die Artabgrenzung in nahe verwandten Artkomplexen (KARLIN et al. 2008; KIM et al. 2012; VANHAECKE et al. 2012), ∙ die Identifizierung von Hybriden und Kultivaren (GUILFORD et al. 1997; GEALY et al. 2002; RAJORA & RAHMAN 2003) und ∙ die Naturschutzgenetik (HEDRICK 2001; MAUDET et al. 2002; LEMES et al. 2003). Abschließend sei erwähnt, dass Mikrosatelliten mit gewissen Vorbehalten (siehe VERSIEUX et al. 2012) auch in phylogenetischen Studien ihre Anwendung finden (TAKEZAKI & NEI 1996; PETREN et al. 1999; BOWLES et al. 2010). Ihre große Popularität in den o.g. Anwendungsbereichen verdanken die Mikrosatellitenmarker vor allem den folgenden Eigenschaften: ∙ häufiges und ubiquitäres Vorkommen in Eu- und Prokaryoten, in Kern- und Organellen-DNA, in kodierenden und nicht-kodierenden Bereichen des Genoms, ∙ kodominante Vererbung und multiallelisches Verhalten, ∙ hoher Grad an leicht detektierbarem Polymorphismus, ∙ Selektionsneutralität in nicht-kodierenden Bereichen, ∙ PCR-basierte Amplifizierung mittels flankierender und spezifischer Primer und Interpretierbarkeit des Bandenprofils im Sinn von Loci und Allelen, ∙ geringe Mengen an Templat-DNA ausreichend (10 - 50 ng je PCR), ∙ ausgezeichnete Reproduzierbarkeit auch in unterschiedlichen Labors und 24 Einleitung ∙ Möglichkeit des Multiplexens bei PCR-Produkten mit ausreichendem Größenunterschied. Diesen Vorteilen stehen allerdings auch eine Reihe von Nachteilen gegenüber (vgl. Übersicht bei WEISING et al. 2005). Da Mikrosatellitenmarker locusspezifisch sind, ist Information über die flankierenden Sequenzen zur Primerentwicklung essentiell. In Abhängigkeit von der gewählten Methode (vgl. Kapitel 1.2.5) kann daher die Marker-Entwicklungsphase teuer und langwierig sein, während die Anzahl funktionaler Marker am Ende oftmals gering ist. In der Regel müssen Mikrosatellitenmarker für jede neue Verwandtschaftsgruppe neu etabliert werden; die Übertragbarkeit der Marker zwischen Arten und Gattungen ist oft problematisch (CORDEIRO et al. 2001; BARBARÁ et al. 2007a). Auch wenn Marker transferierbar sind, weisen sie im Zielorganismus oft nur eine reduzierte Variabilität auf. Ein mögliches technisches Problem ist das Auftreten so genannter Stotterbanden bei der Auftrennung der Allele auf Gelen oder Kapillaren. Stotterbanden sind durch zusätzliche PCR-Fragmente bedingt, die infolge eines Verrutschens der Taq DNA-Polymerase während der PCR entstehen und ein oder mehrere Wiederholungseinheiten kürzer oder länger sind als das eigentliche Allel. Überlappende Stotterbanden im heterozygoten Zustand können die fehlerfreie Genotypisierung erschweren. Die Auswertung von Mikrosatellitendaten kann ferner durch die mögliche Existenz von Nullallelen erschwert werden (CHAPUIS & ESTOUP 2006). Nullallele sind nicht amplifizierbare und daher unsichtbare Allele. Sie werden durch Mutationen in einer oder beiden Primerbindestellen hervorgerufen und können in der Überschätzung des Homozygoten-Anteils resultieren. Aufgrund der oftmals hohen Mutationsrate von Mikrosatelliten können die Ergebnisse durch Längen- Homoplasie verfälscht werden (ESTOUP et al. 2002). Diese tritt auf, wenn identische Fragmentlängen nicht vom gleichen Allel stammen sondern unterschiedlicher evolutiver Herkunft sind. Homoplasie kann zu einer Unterschätzung der im Datensatz vorhandenen genetischen Diversität führen. Schließlich sind die Kenntnisse über das zugrunde liegende Mutationsmodell nur begrenzt, so dass die erhaltenen Daten mit Vorsicht interpretiert werden müssen. 1.2.5 Isolierung von Mikrosatelliten und Etablierung von Mikrosatellitenmarkern Etliche Protokolle und Ideen wurden seit der Entdeckung von Mikrosatelliten entwickelt, um diese variablen Sequenzen zu isolieren und sie als vielseitige, molekulare Marker nutzbar zu machen. Einige dieser Verfahren sollen im folgenden näher erläutert werden. Eine detaillierte Übersicht der Methoden liefern u.a. ZANE et al. (2002), WEISING et al. (2005) und GUICHOUX et al. (2011). 25 Einleitung 1.2.5.1 Traditionelle Verfahren Um locusspezifische Primer zur Amplifikation von Mikrosatellitenloci zu generieren ist prinzipiell Sequenzinformation erforderlich. Traditionell werden Mikrosatelliten über die Klonierung von Restriktionsfragmenten aus genomischer DNA und anschließendem Screening (’southern blot hybridization’; RASSMANN et al. 1991) mit Mikrosatellitensonden gewonnen (z.B. ELLEGREN et al. 1992; RÖDER et al. 1998; Übersicht bei WEISING et al. 2005). Positive Klone werden mit der SANGER-Methode sequenziert (SANGER et al. 1977) und auf Basis der so gewonnenen Sequenzen werden Mikrosatelliten-flankierende Primerpaare für die PCR konstruiert. In abgewandelten Protokollen werden Mikrosatelliten vor der Klonierung über verschiedene Methoden angereichert (OSTRANDER et al. 1992; FISCHER & BACHMANN 1998; PAETKAU 1999). Ein wesentlicher Nachteil dieser Methoden liegt in einem hohen Kosten- und Zeitaufwand gepaart mit einer oftmals schlechten Ausbeute. Dies gilt besonders für solche Arten, die nur eine geringe Anzahl an Mikrosatelliten in ihrem Genom aufweisen (ZANE et al. 2002). 1.2.5.2 ’Expressed sequence tags’ (EST-Mikrosatelliten oder EST-SSRs) Eine weitere Möglichkeit der Isolation von Mikrosatelliten besteht in der Erstellung von cDNA (’complementary DNA’)-Bibliotheken, die mittels reverser Transkriptase auf Basis der ’messenger RNA’ (mRNA) erstellt werden. Durch partielle, unidirektionale Sequenzierung der cDNAs vom 5`- oder 3`-Ende aus werden so genannte ’expressed sequence tags’ (ESTs) mit einer Länge von durchschnittlich 700 bp generiert und in EST-Datenbanken niedergelegt. Solche EST-Banken enthalten in der Regel eine überraschend hohe Zahl genischer Mikrosatelliten, entweder in der kodierenden Region selbst oder in der 5`- oder 3`-untranslatierten Region (XU et al. 2004; PASHLEY et al. 2006). ESTs wurden zunächst meist für wirtschaftlich relevante, bzw. für Modell-Organismen angelegt und stehen dem Nutzer mittlerweile für eine Vielzahl unterschiedlichster Lebewesen ohne jeglichen Kostenaufwand in öffentlichen Datenbanken zur Verfügung. Beispielsweise enthielt GenBank im Januar 2013 rund 74 Millionen ESTs aus beinahe 2.500 Arten. Die Suche nach Mikrosatelliten in den ESTs sowie das anschließende Primerdesign nach eigens gewählten Kriterien erfolgt computerbasiert. Unter Verwendung geeigneter Software (z.B. SCIROKO; KOFLER et al. 2007) können alle vorhandenen Mikrosatellitenmotive im jeweiligen EST-Datensatz schnell und auf einfache Weise ermittelt werden, während bei den o.g. Anreicherungs-Techniken nur vordefinierte Motive erfasst werden (z.B. GUICKING et al. 2006). Aufgrund ihrer Assoziation mit exprimierten Genen repräsentieren EST-Mikrosatelliten 26 Einleitung sogenannte funktionelle Marker (ANDERSEN & LÜBBERSTEDT 2003), die besonders im Rahmen der markergestützten Selektion (’marker assisted selections’, MAS) in der Züchtungsgenetik von Bedeutung sind. Im Gegensatz zu ihren genomischen, anonymen Vertretern (CORDEIRO et al. 2001; CHAGNE et al. 2004; PASHLEY et al. 2006) sind EST-Mikrosatelliten oftmals über relativ weite taxonomische Distanzen übertragbar, d.h. nicht nur zwischen Arten, sondern auch Gattungen und sogar Unterfamilien hinweg (etliche Beispiele finden sich in ELLIS & BURKE 2007). Der Grund für die oftmals hohe Übertragbarkeit besteht darin, dass die Primerbindestellen überwiegend in kodierenden und daher höher konservierten genomischen Regionen liegen (DECROOCQ et al. 2003; SAHA et al. 2004; ELLIS & BURKE 2007; GUPTA & PRASAD 2009). Aus dem Grund wurde den EST- Mikrosatelliten, verglichen mit genomischen Mikrosatelliten, eine reduzierte Variabilität nachgesagt (VARSHNEY et al. 2005, ELLIS & BURKE 2007). Studien, in denen ein Vergleich beider Markertypen vorgenommen wurde, belegen allerdings, dass dies nicht unbedingt sein muss. So wurde zum Beispiel in der Kiwifrucht (FRASER et al. 2004) und in der Sonnenblume (PASHLEY et al. 2006) ein ähnlich hohes Maß an Variabilität für beide Markertypen dokumentiert. Während die Generierung von ESTs, bzw. die Sequenzierung der cDNAs für lange Zeit nur mittels der traditionellen SANGER-Methode (Fragmentlängen von ~1.000 bp, Fehlerrate 0,001%, 0,50 US$ pro kb; SHENDURE & JI 2008) möglich war, bot die Entwicklung neuer Hochdurchsatzverfahren (’next-generation sequencing’, NGS) schnellere, effizientere und kostengünstigere Alternativen. In der Transkriptomanalyse wurde von den verschiedenen NGS-Methoden zunächst bevorzugt die 454-Technologie verwendet (vgl. nachfolgendes Kapitel), da sie vergleichsweise lange Sequenzen von bis zu 400 bp liefert (MOROZOVA & MARRA 2008). Eine der ersten Publikationen in dieser Richtung stammt von CHEUNG et al. (2006) und beschreibt die Generierung von 252.384 ESTs eines 454-Durchlaufs aus Medicago truncatula, welche nach Assemblierung in 184.599 nicht- redundante Einzelsequenzen erfolgreich zur Gen-Kartierung eingesetzt wurden. Zahlreiche weitere Artikel dokumentieren die erfolgreiche Suche nach Mikrosatelliten und deren Isolation basierend auf de novo ESTs unterschiedlichster Organismen (LUO et al. 2010; ZENG et al. 2010; DUTTA et al. 2011; POOTAKHAM et al. 2012). 1.2.5.3 454-Pyrosequenzierung (454-Mikrosatelliten oder 454-SSRs) Die von MARGULIES et al. (2005) etablierte 454-Pyrosequenzierung repräsentiert die erste Generation der NGS-Technologien. Dieses Verfahren umgeht die arbeits- und zeitintensiven Schritte der Klonierung und Anreicherung, indem hunderttausende von unterschiedlichen DNA- Fragmenten parallel in einer Emulsions-PCR amplifiziert und nachfolgend auf Picotiterplatten 27 Einleitung sequenziert werden (vgl. Kapitel 2.2.2.2). Die Sequenzen dieser Fragmente brauchen dann nur noch in silico auf Mikrosatelliten hin durchsucht zu werden. Die ersten Artikel, die von einer erfolgreichen Anwendung der 454-Sequenzierung genomischer DNA zur Isolation von Mikrosatelliten berichteten erschienen im Jahr 2009 (ABDELKRIM et al. 2009; SANTANA et al. 2009; LEE et al. 2009; CSENCSICS et al. 2010). Seit dieser Zeit häufen sich die Publikationen, in denen Mikrosatelliten in den verschiedensten Organismen (einschließlich sog. ’non-model species’) mithilfe der 454-Methode einfach und schnell isoliert wurden (z.B. LEPAIS & BACLES 2011; MALAUSA et al. 2011; ALFADALA et al. 2013; ARROYO et al. 2013; SZCZECINSKA et al. 2013). Aufgrund der immensen Datenmenge werden in der Regel hunderte oder gar tausende von Mikrosatelliten gefunden. Aus diesen können die besten und erfolgversprechendsten Kandidaten selektiert werden, z.B. ausschließlich perfekte Mikrosatelliten in Verbindung mit ausreichend langen und qualitativ hochwertigen, GC-reichen flankierenden Sequenzen, die eine optimale Primergestaltung ermöglichen. Ein weiterer Vorteil der 454-Technik besteht in der Möglichkeit, bis zu 132 verschiedene DNA- Bibliotheken unterschiedlichsten Ursprungs innerhalb des gleichen Gerätedurchlaufs zu sequenzieren. Hierzu wird je einer von insgesamt 132 verfügbaren Adaptoren, sogenannte ’multiplex identifier’ (MIDs), mit einer Länge von elf Basenpaaren an jedes Fragment einer Templat-Bibliothek ligiert. Nach der parallelen Sequenzierung werden alle generierten Sequenzen digital entsprechend ihrer MIDs sortiert, einem DNA-Templat zugeordnet und anschließend von der MID-Sequenz befreit. Da während eines Gerätedurchlaufs nicht nur die Kern-, sondern auch die Organellen-DNA sequenziert wird, besteht durch den Vergleich (Assemblierung) mit einem bereits vorhandenen Genom einer möglichst nah verwandten Art die Möglichkeit, plastidäre, bzw. mitochondriale Anteile zu extrahieren und die Organellengenome nahezu komplett zu rekonstruieren. Dies gelang beispielsweise mit dem 454-Datensatz einer diözischen Pflanzenart (Amaranthus tuberculatus), in welchem neben 382 Mikrosatelliten das nahezu vollständige Plastom, viele mitochondriale Abschnitte, transposable Elemente sowie zahlreiche Gene nachgewiesen wurden (LEE et al. 2009). 1.3 Mikrosatellitenmarker für Bromelien Trotz der großen ökologischen Bedeutung der Bromeliaceen und des hohen wirtschaftlichen Stellenwerts der Ananas waren zu Beginn meiner Arbeit an der vorliegenden Dissertation (in 2010) nur vergleichsweise wenige genomischer Ressourcen für Vertreter dieser Familie verfügbar. So waren bis dato lediglich rund 3.000 Nukleotid-Sequenzen sowie 5.659 EST- 28 Einleitung Sequenzen einer einzigen Bibliothek für Ananas comosus (MOYLE et al. 2005) in GenBank eingetragen und mit insgesamt 55 Primerpaaren war auch die Anzahl publizierter Mikrosatellitenmarker vergleichsweise überschaubar. Diese Marker wurden nach dem in Kapitel 1.2.5.1 beschriebenen traditionellen Klonierungsverfahren inklusive Anreicherung und anschließender SANGER-Sequenzierung für sieben verschiedene Bromelienarten aus drei Unterfamilien entwickelt. Die beiden Pionier-Arbeiten in diesem Bereich präsentierten sieben Mikrosatelliten-marker für Pitcairnia geyskesii (Pitcairnioideae, SARTHOU et al. 2003), bzw. fünf Marker für Guzmania monostachya und Tillandsia fasciculata (Tillandsioideae, BONEH et al. 2003). Vier Jahre später folgten PALMA-SILVA et al. (2007) mit 15 Primerpaaren zur Amplifikation von Mikrosatellitenloci in Alcantarea imperialis und Vriesea gigantea (Tillandsioideae) und KINSUAT & KUMAR (2007) mit 20 spezifischen Primerpaaren für Ananas comosus var. comosus (Bromelioideae). Wiederum ein Jahr darauf publizierten PAGGI et al. (2008) Primersequenzen für acht Mikrosatellitenmarker aus Pitcairnia albiflos (Pitcairnioideae). 1.4 Alles beginnt mit einer Idee Der Grundgedanke zum Verfassen dieser Arbeit lässt sich ganz klar zweiteilen: der methodische Ansatz ist eine unmittelbare Folge des oben skizzierten Mangels an Mikrosatellitenmarkern für eine derart umfangreiche, variable und hoch interessante Pflanzengruppe wie die Bromelien. Meine Intention war die Isolation einer möglichst großen Zahl an Mikrosatelliten aus unterschiedlichsten genomischen Quellen, gefolgt von der Etablierung funktionaler und transferierbarer Mikrosatellitenmarker zur vielseitigen Anwendung innerhalb der Unterfamilie Pitcairnioideae. Über den umfangreichen, mit dem Testen der Marker in geeigneten Probensets verbundenen Etablierungsprozess hinaus war es meine Absicht, die neuen Mikrosatellitenmarker in einem angewandten Ansatz zur Beantwortung biologischer bzw. populationsgenetischer Fragestellungen innerhalb der Gattungen Dyckia und Fosterella in drei separaten Studien anzuwenden und am Ende vergleichend zu diskutieren. Nachfolgend werden die Eigenschaften der beiden Gattungen und der hier behandelten Arten sowie die der Fragestellung zugrunde liegende Thematik kurz erläutert. 1.4.1 Dyckia SCHULT. & SCHULT.F. Die 159 Arten der Gattung Dyckia bilden terrestrische oder epilithische, ausdauernde Rosetten die durch einen xeromorphen Habitus und auffallend gelbe, rote oder orangefarbene Blüten 29 Einleitung charakterisiert sind (SMITH & DOWNS 1974). Dyckia-Arten sind im östlichen Südamerika verbreitet, wobei ihr Diversitätszentrum im brasilianischen Cerrado von Minas Gerais liegt (VERSIEUX & WENDT 2007). Sie besiedeln azonale, aride und meist felsige Standorte, die sich durch Wasserknappheit, hohe Temperaturen und eine starke Sonneneinstrahlung auszeichnen. Die Bestäubung erfolgt hauptsächlich durch Insekten (Entomophilie) oder Kolibris (Ornithophilie). Die geflügelten Samen bleiben bis zur Reife in einer Kapselfrucht eingeschlossen und werden nach Freisetzung durch Wind verbreitet (Anemochorie). Viele Dyckia-Arten zeichnen sich durch ein kleines Verbreitungsgebiet aus; von zahlreichen Lokalendemiten wiederum sind einige nur durch das Typusexemplar bekannt (SMITH & DOWNS 1974). Aus diesem Grund ist der Bestand vieler Dyckia- Arten gefährdet (VERSIEUX & WENDT 2007; HMELJEVSKI et al. 2011). Auf Basis von sechs plastidären Loci und einem Kernmarker erstellten KRAPP (2012) bzw. KRAPP et al. (2014) erste molekulare Phylogenien von Dyckia. Aufgrund geringer Sequenzvariation blieben die Phylogenien weitgehend unaufgelöst, es zeigte sich jedoch eine geographische Abhängigkeit in der Verteilung der Plastidenvarianten. Wie die Anwendung einer molekularen Uhr bestätigte, kann die geringe Sequenzvariation zumindest teilweise mit dem jungen Alter der Gattung begründet werden (Entstehung vor ca. 4,5-4 Millionen Jahren, KRAPP 2012). Über Verwandtschaftsverhältnisse innerhalb von Dyckia ist daher weiterhin wenig bekannt, gleiches gilt für den Genfluss innerhalb und zwischen Arten sowie die Artbildungsmechanismen. Das o.g. Problem der hochgradigen morphologischen Plastizität der Bromelien macht auch die Artabgrenzung in Dyckia zu einem schwierigen Unterfangen (SMITH 1934; KRAPP et al. 2014). Nukleäre Mikrosatelliten erwiesen sich bereits in anderen Bromeliengattungen wie Alcantarea (BARBARÁ et al. 2007b; VERSIEUX et al. 2012) und Pitcairnia (PALMA-SILVA et al. 2011) als ausreichend sensitive Marker, um populationsgenetische Parameter zu erheben und Artgrenzen zu ermitteln. 1.4.1.1 Artabgrenzung innerhalb der Gattung Dyckia Die gefährdeten Arten Dyckia pernambucana und Dy. limae wachsen als Lokalendemiten in den ‘Brejos de Altitudes’ im Bundesstaat Pernambuco im Nordosten Brasiliens. Diese ökologisch sehr heterogene Region enthält Elemente der Caatinga, des Cerrado und des Atlantischen Regenwaldes (SIQUEIRA-FILHO et al. 2006). Beide Arten sind nach morphologischen Kriterien sehr nah miteinander verwandt, unterscheiden sich allerdings in einigen geringfügigen Eigenschaften der Blüten, der Blätter und der Stacheln entlang der Blattränder. Sie wurden als typisches Beispiel für zwei Arten ausgewählt, die sich aufgrund der Plastizität ihrer Morphologie nicht eindeutig unterscheiden, bzw. abgrenzen lassen. Dyckia dissitiflora ist vermutlich eine nahe Verwandte dieser beiden Arten 30 Einleitung mit einem vergleichsweise großen Verbreitungsgebiet in der Chapada Diamantina des Bundesstaats Bahia und der Caatinga im brasilianischen Nordosten (CONCEIÇÃO & PIRANI 2007). Als vierte Art wurde die ebenfalls bedrohte (MERCIER & KERBAUY 1993) Dy. macedoi ausgewählt, die in Minas Gerais, dem Diversitätszentrum von Dyckia, zu finden ist. Obwohl nicht näher mit Dy. pernambucana, Dy. limae und Dy. dissitiflora verwandt, diente Dy. macedoi zur Validierung der Markerfunktionalität. Die Studien in Dyckia wurden im Rahmen eines Kooperationsprojekts zwischen der Universität Kassel und dem Forschungsinstitut SENCKENBERG (Frankfurt am Main) mit der Universität Pernambuco (Brasilien) durchgeführt. Das Probenmaterial der Dyckia-Arten wurde in Form von DNA-Lösungen von brasilianischer Seite zur Verfügung gestellt. Die von mir generierten Mikrosatellitenprofile sind auch Bestandteil der Dissertation von PINANGÉ (2013) und werden derzeit in Kombination mit AFLP-Daten desselben Probensets zu einer gemeinsamen Publikation vorbereitet. 1.4.2 Fosterella L.B.SM. Die Gattung Fosterella enthält derzeit 31 Arten terrestrisch wachsender, krautiger Pflanzen, deren Blätter bromelientypisch rosettenförmig angeordnet sind (PETERS 2009). Die dreizähligen Blüten sind meist weißlich gefärbt, Ausnahmen bilden F. gracilis (gelb) und F. spectabilis (rot). Die Vertreter der Gattung sind von Argentinien im Süden bis nach Peru im Norden mit einem Diversitätszentrum in den Tälern und an den Osthängen der bolivianischen Anden und angrenzender Gebiete verbreitet (PETERS 2009). Zwei Arten zeigen eine disjunkte Verbreitung: so kommt Fosterella micrantha ausschließlich in Zentralamerika und F. batistana im zentralen Amazonasgebiet von Brasilien vor (PETERS 2009). In Fosterella sind hauptsächlich Insekten an der Bestäubung beteiligt, lediglich die Blüten von F. spectabilis werden von Vögeln besucht. Wie in Dyckia werden als Früchte Kapseln gebildet, die bei Reife kleine, geflügelte Samen zur Anemochorie freisetzen. Da ein Drittel der Fosterella-Arten nur sehr kleinflächig verbreitet ist (PETERS 2009), bildet die Gattung Fosterella eine gutes Modell um die Entstehung von Endemismus in den hoch gelegenen Regionen der Anden zu studieren. Fosterella ist nach allen bisher verfügbaren molekularsystematischen Studien eindeutig monophyletisch (REX et al. 2007, 2009; WAGNER 2012; WAGNER & SILVESTRO et al. 2013). Es ist allerdings analog zur Situation in Dyckia bislang nur wenig über die genetische Struktur und Variation innerhalb der Arten, den inter- und intraspezifischen Genfluss, die Fortpflanzungsstrategien sowie die Artbildungsprozesse bekannt. In Fosterella wurden bislang nur zwei Gruppen (penduliflora- und micrantha-Gruppe) 31 Einleitung populationsgenetisch untersucht, dafür wurden AFLP-Daten verwendet (WAGNER 2012), Mikrosatellitenmarker wurden bislang noch nicht eingesetzt. 1.4.2.1 Artabgrenzung innerhalb der micrantha-Gruppe Die micrantha-Gruppe ist eine von sechs monophyletischen Artengruppen innerhalb von Fosterella, die im Rahmen von molekularsystematischen Analysen identifiziert werden konnten (REX et al. 2009; WAGNER & SILVESTRO et al. 2013). Sie besteht aus den drei Arten F. christophii, F. micrantha und F. villosula. Nach WAGNER & SILVESTRO et al. (2013) fand die Trennung und Diversifizierung der drei Arten erst vor etwa 1,3 Millionen Jahren statt, es handelt sich um eine der jüngsten Artengruppen innerhalb der Gattung. Morphologisch sind die drei Arten der micrantha-Gruppe nur schwer voneinander zu trennen, sodass die Ökologie und die Verbreitung zur Differenzierung und Diagnose der Arten hinzugezogen wurden (PETERS 2009). Fosterella villosula bevorzugt feuchte Habitate innerhalb der bolivianischen Departamentos Beni, Cochabamba und La Paz. Die in Mexiko, Guatemala und El Salvador verbreitete F. micrantha ist in trockenen bis subtropisch saisonalen Wäldern anzutreffen und der Lokalendemit F. christophii ist auf kleine Trockenwald-Areale der Departamentos Santa Cruz und La Paz beschränkt (PETERS 2009; WAGNER 2012). Für die micrantha-Gruppe standen umfangreiche Populationsproben zur Verfügung, die auf Exkursionen der Universität Kassel (N. WAGNER und N. SCHÜTZ in 2009 sowie N. SCHÜTZ in 2011) und des Forschungsinstituts SENCKENBERG (I. MICHALAK in 2010) gesammelt wurden. Die Isolation der DNA aus dem getrockneten Blattmaterial erfolgte in Deutschland. Eine von WAGNER (2012) auf der Basis von AFLP-Markern durchgeführte populationsgenetische Studie dieser Proben lieferte kein klares Bild bezüglich der Differenzierung der drei Arten. Der Einsatz hoch-sensitiver Mikrosatellitenmarker sollte hier zusätzliche Informationen und Einblicke bezüglich der Artabgrenzung liefern. 1.4.2.2 Populationsgenetik von F. rusbyi Die in Abbildung 1.6 vorgestellte Art Fosterella rusbyi zählt zu den bolivianischen Endemiten und wurde bislang nur in den beiden Departamentos La Paz und Cochabamba nachgewiesen (vgl. Abbildung A6 im Anhang). Humide, subandine Wälder sowie trockenere Wälder der andinen Täler werden von den Pflanzen als Lebensraum bevorzugt (PETERS 2009). Hier besiedeln sie hauptsächlich die steilen Böschungen entlang von Straßen oder Flüssen, wobei der jeweilige 32 Einleitung Standort sowohl exponiert und trocken als auch schattig und feucht sein kann. Da das Verbreitungsmuster von F. rusbyi inselartig fragmentiert ist (PETERS 2009), stellt sich die Frage, ob die einzelnen Populationen an verschiedenen Lokalitäten signifikant über Genfluss miteinander verbunden sind oder ob sich die einzelnen Populationen infolge mangelnden Austauschs genetisch voneinander differenziert haben und auf dem Wege zur allopatrischen Artbildung neuer Lokalendemiten sind. Dies lässt sich mittels polymorpher Mikrosatellitenmarker analysieren. Abbildung 1.6: Morphologie von Fosterella rusbyi. A-B: Blüten mit zurückgerollten Petalen, C-D: Blattrosetten. Bilder mit freundlicher Genehmigung von N. WAGNER. Aufgrund der Verfügbarkeit von Lebendpflanzen von F. rusbyi im Gewächshaus der Universität Kassel wurde die DNA dieser Art zur 454-Sequenzierung und der Etablierung artspezifischer Mikrosatellitenmarker – sowohl aus dem Kern- als auch dem Chloroplastengenom – ausgewählt. Das Pflanzenmaterial für die Analyse stand in Form natürlicher Populationsproben von 30 verschiedenen bolivianischen Fundorten (253 Individuen) zur Verfügung. Das Material war während dreier Freilandaufenthalte in 2006 (J. PETERS, Universität Kassel), 2009 (N. WAGNER, 33 Einleitung Universität Kassel) und 2010 (I. MICHALAK, Forschungsinstitut SENCKENBERG) gesammelt worden. Die im Rahmen eines Kooperationsprojektes mit dem Forschungsinstitut SENCKENBERG von mir generierten Mikrosatellitenprofile der nukleären Loci bilden in Verbindung mit AFLP-Daten das Fundament der populationsgenetischen Analysen von MICHALAK (2013) und werden derzeit gemeinsam zur Publikation vorbereitet. 1.5 Zielsetzung Ein wesentliches Ziel der vorliegenden Arbeit bestand in der Etablierung einer möglichst hohen Anzahl nukleärer und plastidärer Mikrosatellitenmarker für populationsgenetische Studien und andere Untersuchungen innerhalb der Unterfamilie Pitcairnioideae. Hierbei galt es mithilfe innovativer Verfahren, speziell der Nutzung einer EST-Datenbank der Ananas (UF Bromelioideae, MOYLE et al. 2005) und der erstmaligen Generierung zehntausender genomischer Sequenzen aus drei Arten von drei Gattungen der Pitcairnioideae (Deuterocohnia longipetala, Dyckia marnier- lapostollei var. estevesii, Fosterella rusbyi) mit Hilfe der 454-Pyrosequenzierung, ein optimales Kosten-Nutzen-Verhältnis zu erzielen. Im Rahmen dieses eher methodischen Ansatzes war es meine Intention, die folgenden Aspekte zu evaluieren: Abundanz der Mikrosatelliten in EST- und 454-Datensätzen ∙ Welches sind die vorherrschenden Mikrosatellitenmotive innerhalb des jeweiligen Datensatzes und gibt es artspezifische Unterschiede? Übertragbarkeitsstudien ∙ Wie gut sind die Mikrosatellitenmarker zwischen Arten, Gattungen und Unterfamilien transferierbar und gibt es diesbezüglich Unterschiede zwischen genischen Mikrosatelliten, die aus ESTs stammen und anonymen Mikrosatelliten aus der 454-Sequenzierung? ∙ Wie variabel sind die EST- und 454-Mikrosatellitenmarker in heterologen Arten? Extraktion des plastidären Anteils aus den 454-Sequenzen ∙ Wie hoch ist der Anteil plastidärer DNA in den 454-Sequenzen von D. longipetala, Dy. marnier- lapostollei und F. rusbyi und lässt sich das Plastom möglichst vollständig rekonstruieren? 34 Einleitung Der angewandte Aspekt meiner Arbeit bezog sich auf die Applikation der neu etablierten Mikrosatellitenmarker unter folgenden Fragestellungen: Artabgrenzung ∙ Sind die EST-Mikrosatellitenmarker zur Artabgrenzung und für populationsgenetische Studien in der Gattung Ananas geeignet? ∙ Erlauben die neu etablierten EST- und 454-Mikrosatellitenmarker eine Abgrenzung der nah verwandten Arten Dy. pernambucana und Dy. limae, sowie den entfernter verwandten Arten Dy. dissitiflora und Dy. macedoi? ∙ Ist eine Abgrenzung der drei morphologisch wie genetisch sehr ähnlichen Arten der micrantha-Gruppe innerhalb der Gattung Fosterella möglich, oder ergibt sich wie im Fall der AFLP-Analysen von WAGNER (2012) ein geographisches Muster in Bezug auf die Allelverteilung? Populationsgenetik von Fosterella rusbyi ∙ Wie ausgeprägt ist der Genfluss von nukleärer und plastidärer DNA zwischen den Populationen? ∙ Ist das fragmentierte Verbreitungsmuster der Art mit einer genetischen Differenzierung zwischen den einzelnen Populationen verbunden? ∙ Können mittels der plastidären Mikrosatellitendaten Aussagen über die Mobilität der Samen von F. rusbyi getroffen werden? 35 Material und Methoden 2. Material und Methoden 2.1 Das Pflanzenmaterial Das in der vorliegenden Dissertation bearbeitete Pflanzenmaterial umfasste 108 verschiedene Arten aus sechs der derzeit beschriebenen acht Unterfamilien der Bromeliaceae, in unterschiedlichen experimentellen Ansätzen wurden insgesamt 702 Pflanzenproben genotypisiert. Nicht vertreten waren Arten aus den beiden Unterfamilien Navioideae und Lindmanioideae. Der Hauptteil derjenigen Arten, die nur durch jeweils ein Individuum repräsentiert waren, dienten den Übertragbarkeitsstudien im Rahmen der Entwicklung von EST- Mikrosatellitenmarkern. Detaillierte Angaben zum verwendeten Pflanzenmaterial wie die DNA- Identifizierungsnummern (ID), die Sammler-, Garten- und Herbarbelegsnummern, die Zuordnung zu der jeweiligen Unterfamilie und die Herkunft inklusive GPS-Koordinaten (soweit bekannt) sind in Tabelle T1 im Anhang aufgeführt. Das Blattmaterial stammt sowohl aus Freilandaufsammlungen als auch aus Botanischen Gärten. In Tabelle T2 in Anhang sind alle Probensets (1-15) aufgeführt, die im Rahmen der einzelnen Primer- und Übertragbarkeitstests sowie der populationsgenetischen Untersuchungen zusammengestellt und analysiert wurden. Im Ergebnisteil wird an entsprechender Stelle auf Tabelle T2 verwiesen, sodass die Auftragsreihenfolge auf Agarose- und Polyacrylamidgelen anhand der Nummerierung nachvollziehbar wird und die einzelnen Spuren, bzw. Banden der exemplarisch gezeigten Gelbilder (teils im Ergebnisteil, teils im Anhang) einer entsprechenden Probe zuzuordnen sind. Für die Validierung der Primer-Übertragbarkeit innerhalb der Bromeliaceae wurden meist nur einzelne oder wenige Pflanzenproben pro Taxon verwendet. Zur eingehenderen Beurteilung der Markerfunktionalität wurden hingegen Populationsproben eingesetzt. Populationsproben dienten auch zur Beantwortung der eingangs thematisierten Fragestellungen in ausgewählten Arten der Gattungen Dyckia und Fosterella. Die Dyckia-Proben wurden von D. SOTERO (Universität Pernambuco, Brasilien) zur Verfügung gestellt. Die Fosterella-Proben stammten zum Teil aus der Lebendsammlung der Universität Kassel, z.T. aus Freilandaufsammlungen, die von N. SCHÜTZ, J. PETERS und N. WAGNER (Universität Kassel) sowie von I. MICHALAK (Forschungsinstitut SENCKENBERG, Frankfurt am Main) in den Jahren 2006, 2009 und 2010 getätigt worden waren. Die in der vorliegenden Arbeit generierten Mikrosatellitenprofile der Populationsproben von Fosterella rusbyi, F. christophii, F. micrantha, F. villosula, Dyckia dissitiflora, Dy. limae, Dy. macedoi und Dy. pernambucana werden derzeit mit den Kooperationspartnern zur gemeinsamen Publikation vorbereitet (MICHALAK & WÖHRMANN et al., SOTERO & WÖHRMANN et al.). 36 Material und Methoden 2.2 Molekulare Methoden 2.2.1 DNA-Isolation Die Isolation hochmolekularer DNA aus jeweils ca. 50 mg lyophilisiertem oder 500 mg frischem Blattmaterial erfolgte nach einer modifizierten Version der für Pflanzen häufig genutzten CTAB (Cetyltrimethylammoniumbromid)-Methode. Dazu wurde das Blattmaterial zunächst mithilfe von Mörser, Pistill und flüssigem Stickstoff pulverisiert, im CTAB-Extraktionspuffer suspendiert und bei ca. 60°C inkubiert. Die Nukleinsäuren wurden durch Aufschüttelung mit Chloroform- Isoamylalkohol zur Fällung mit Isopropanol aufgereinigt. Nach einer abschließenden RNAse- Behandlung wurden die Proben in TE-Puffer gelöst und bei -20°C aufbewahrt (WEISING et al. 2005). Verwendete Geräte, Materialien und Reagenzien Waage (SARTORIUS BP 310S) 2 ml-Reaktionsgefäße mit Rundboden 1,5 ml-Reaktionsgefäße Thermomixer (EPPENDORF Thermomixer compact) STUART SCIENTIFIC Block Heater Wasserbad Zentrifuge (EPPENDORF Centrifuge 5804 R) Zentrifuge (HERAEUS Variofuge 3.0 R) SpeedVac-Zentrifuge DNA-Isolationspuffer: 2% w/v Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB), sterilfiltriert 1,4 M NaCl 0,1 M Tris-HCl, pH 8,0 20 mM EDTA 1% v/v Polyvinylpyrrolidon 40 0,2% v/v ß-Mercaptoethanol (Zugabe kurz vor Gebrauch) Chloroform / Isoamylalkohol (Verhältnis 24:1) 100% Isopropanol 70% Ethanol TE-Puffer (pH 8,0): 10 mM Tris-HCl 1 mM EDTA RNAseA-Stammlösung (10 mg/ml, QIAGEN) 0,1 mg/ml in der Arbeitslösung In der Standardmethode wurde das pulverisierte Pflanzenmaterial in 600 µl CTAB- Extraktionspuffer (inklusive 0,2 % Mercaptoethanol) suspendiert und für 30-60 min bei 60 °C in einem Wasserbad inkubiert. Die durch das Detergenz CTAB bewirkte Zerstörung von Zellmembranen, Organellen und Kernstrukturen führt zur Freisetzung der DNA. Durch die Zugabe von 600 µl eines Chloroform:Isoamylalkohol-Gemisches (24:1), einer anschließenden Inkubation von mindestens 20 min auf einem Rotationsschüttler und einer 20-minütigen Zentrifugation (4.000 rpm, Raumtemperatur) wurde eine Phasentrennung erreicht. Die untere, organische Phase enthält u.a. Chlorophyll, Lipide und gelöste Proteine, die obere, wässrige Phase Nukleinsäuren und Polysaccharide. Zwischen den beiden Schichten bildete sich häufig eine Schicht aus Zellresten und ungelösten Proteinen. Die wässrige Phase wurde vorsichtig 37 Material und Methoden abpipettiert und für 5 min zur Abtrennung verbliebener unlöslicher Bestandteile zentrifugiert (13.500 rpm, Raumtemperatur). Die klare, wässrige Phase wurde in ein neues Reaktionsgefäß überführt und die darin enthaltenen Nukleinsäuren durch Zugabe von 80 µl 3 M Natriumacetatlösung und 600 µl kaltem Isopropanol und nachfolgender guter Durchmischung ausgefällt. Nach einer Inkubation von mindestens 60 min bei -20 °C wurde zentrifugiert (13.500 rpm, 20 min, 4 °C). Dabei entstand ein Pellet, welches nach Abgießen des Überstandes mit 500 µl 70%-igem Ethanol versetzt, erneut zentrifugiert (13.500 rpm, 10 min, Raumtemperatur) und vorsichtig durch Abschütten vom Überstand befreit wurde. Dieser Waschschritt wurde noch einmal wiederholt bevor das Pellet in einer SpeedVac-Zentrifuge (10-15 min, 50 °C) getrocknet und über Nacht bei Raumtemperatur in 100 µl TE-Puffer gelöst wurde, der 0,1 mg/ml RNase A enthielt. Die isolierte DNA wurde bis zum Gebrauch bei -20 °C aufbewahrt. Für die zur 454-Pyrosequenzierung ausgewählten Proben wurde der CTAB-Extraktion ein zusätzlicher Inkubationsschritt in einem isotonischen Sorbitolpuffer vorgeschaltet, wie bei TEL- ZUR et al. (1999) und KRAPP et al. (2012) näher beschrieben wird. Auf diese Weise wurden cytoplasmareiche Komponenten wie z.B. Polysaccharide bereits im Vorfeld der CTAB-Extraktion entfernt und damit eine erhöhte Qualität der DNA erreicht. Um für die 454-Pyrosequenzierung eine möglichst große Ausbeute an hochmolekularer DNA und gleichzeitig ausreichende Mengen an Referenz-DNA sicherzustellen wurden die Blattproben von Fosterella rusbyi (JP 06.0078), Dyckia marnier-lapostollei var. estevesii (BT_121) und Deuterocohnia longipetala (BT_123) mengenmäßig jeweils in einem vierfachen Ansatz isoliert. Für alle anderen Blattproben wurde ein einfacher Ansatz durchgeführt. 2.2.2 Herkünfte der auf Mikrosatelliten hin durchsuchten DNA-Sequenzen 2.2.2.1 ’Expressed sequence tags’ (ESTs) aus Ananas comosus Expressed sequence tags (ESTs) gehen auf mRNA-Moleküle zurück, die mithilfe einer reversen Transkriptase zunächst in doppelsträngige cDNA (complementary DNA) übersetzt und dann kloniert und vom 5`oder 3`-Ende aus ansequenziert werden. Je nach ursprünglich eingesetztem Material repräsentieren die entstehenden Bibliotheken die transkribierten Gene von Zellen, Geweben oder Organismen (NAGARAJ et al. 2006). In zahlreichen Organismen erwiesen sich ESTs als reiche Quelle für Mikrosatelliten (ELLIS & BURKE 2007; SIMKO 2009; DURAND et al. 2010). Als Ausgangspunkt für die Suche nach potenziellen Mikrosatellitenloci in Bromelien und dem nachfolgenden Primerdesign dienten EST-Sequenzen, die auf der Homepage der NCBI (GenBank) für das Herunterladen im FASTA-Format zur Verfügung standen. Für die Familie der 38 Material und Methoden Bromeliaceae enthielt diese Datenbank zum Zeitpunkt des Downloads (Dezember 2010) 5.659 EST-Sequenzen, die von MOYLE et al. (2005) aus der wirtschaftlich bedeutsamen Obstpflanze Ananas (Ananas comosus (L.) MERR.) entwickelt worden waren. Von diesen Autoren wurden drei Bibliotheken erstellt, die aus Zellen von nicht-infizierten Wurzelspitzen, aus dem von Gallen infizierten Zentralzylinder (frühe und späte Infektionsstadien) sowie aus grünen und reifen Früchten stammten. Die cDNA-Klone waren vom 5`-Ende aus ansequenziert und von dem für die mRNA am 3`-Ende typischen Poly(A)-Schwanz befreit worden (’trimming’). ESTs mit einer Länge von weniger als 150 bp waren von MOYLE et al. (2005) aus dem Datensatz entfernt worden. 2.2.2.2 454-Sequenzen aus Arten der Gattungen Fosterella, Dyckia und Deuterocohnia Wie in Abschnitt 1.2.5.3 ausführlich dargestellt, eignet sich die sogenannte shotgun- Sequenzierung mit Hilfe des ’next-generation sequencing’ (NGS) hervorragend für die Isolation von Mikrosatellitenmarkern, insbesondere aus solchen Arten, für die noch wenig oder keine genomische Information vorliegt (ZALAPA et al. 2012). Ein Vergleich der verschiedenen Plattformen wie 454, Illumina, SOLiD und Ion Torrent zeigt, dass das auf der Pyrosequenzierung beruhende 454-Verfahren (ROCHE) mit durchschnittlich 400 bp die längsten Sequenzen generiert (GLENN 2011). Da auf diese Weise eine vergleichsweise große Auswahl für das Design flankierender Primer besteht, wurden Mikrosatellitenmarker bisher am häufigsten über die 454-Methode isoliert (ZALAPA et al. 2012). In der 454-Pyrosequenzierung werden mehrere Enzym-gekoppelte Reaktionen sowie die Biolumineszenz genutzt, um Pyrophosphat – welches bei jedem Nukleotid-Einbau während der DNA-Synthese freigesetzt wird – zu detektieren. Durch die zyklisch wiederholte Zugabe der vier dNTPs wird das jeweils erzeugte Lichtsignal von einer speziellen Kamera wahrgenommen und im weiteren Verlauf in die zugrunde liegende DNA-Sequenz übersetzt (MARGULIES et al. 2005). Von der DNA bis hin zur Sequenz müssen vier Schritte durchlaufen werden: (1) Erzeugung einer Bibliothek einzelsträngiger DNA der Zielart, bzw. der Zielarten, (2) Emulsions-PCR zur ’massiv- parallelen’, klonalen Amplifizierung der Sequenzmatrizen aus der Bibliothek, (3) die Pyrosequenzierung selbst und (4) die bioinformatische Aufarbeitung der Daten. Für die vorliegende Arbeit wurden sämtliche Schritte exklusive der DNA-Isolation von unserem Kooperationspartner Dr. B. HUETTEL im MAX-PLANCK-Institut für Pflanzenzüchtungsforschung in Köln durchgeführt. Zunächst wurde je ein 5 µg DNA-Aliquot von Fosterella rusbyi, Dyckia marnier- lapostollei var. estevesii und Deuterocohnia longipetala mittels eines Nebulisierers fragmentiert. Im 39 Material und Methoden Rahmen der Bibliothek-Erzeugung nach dem ’rapid library preparation method’-Protokoll (ROCHE Diagnostics) wurde an das 3`-Ende der jeweiligen Fragmente ein artspezifischer MID (’multiplex identifier’)-Adapter von 11 bp Länge ligiert (F. rusbyi ACGTAGATCGT; Dy. marnier-lapostollei var. estevesii ACGACACGTAT; D. longipatala ACACTACTCGT). Somit konnten alle drei Bibliotheken gleichzeitig amplifiziert und die Sequenzen der jeweiligen Art im Nachhinein eindeutig zugeordnet werden. Anschließend wurden die beiden Bibliotheken mittels eines Fluorometers (TBS-380, TURNER BIOSYSTEMS, Sunnyvale, Californien) quantifiziert und auf einem ROCHE 454 GS- FLX-Gerät nach Herstellerangaben sequenziert. Hierzu wurde das ’titanium sequencing’-Kit XLR70 sowie das ’titanium picotiter plate’-Kit (ROCHE Diagnostics) verwendet. 2.2.3 Etablierung von EST- und 454-Mikrosatellitenmarkern nukleären Ursprungs Da sich die in der vorliegenden Arbeit verfolgte Strategie der Etablierung polymorpher Mikrosatellitenmarker auf der Basis von EST- bzw. 454-Sequenzen kaum voneinander unterscheidet, wird sie in den folgenden Kapiteln gemeinsam abgehandelt. Auf etwaige Unterschiede wird explizit hingewiesen. 2.2.3.1 Assemblierung der Rohsequenzen Um die Redundanz der in Kapitel 2.2.2.1 und 2.2.2.2 vorgestellten Sequenzen zu minimieren wurden überlappende, bzw. homologe Sequenzen – z.B. desselben Transkripts eines Gens – in Contigs zusammengefasst (Assemblierung). Die Contigs wurden anschließend mit den verbleibenden einzigartigen Sequenzen (Singletons) zu sogenannten Unigenes kombiniert. In der vorliegenden Arbeit dienten ausschließlich Unigenes als Grundlage der Mikrosatellitensuche, die für alle vier Datensätze unter den gleichen, stringenten Bedingungen erfolgte (höchste Sensitivität / 100% Identität). Dazu wurde die in der Software GENEIOUS Version 5.0 (DRUMMOND et al. 2010) implementierte ’assembly’-Funktion eingesetzt. 2.2.3.2 Suche nach Mikrosatellitenmotiven und Primerdesign Um einen Eindruck des mengenmäßigen Vorkommens von Mikrosatelliten innerhalb der assemblierten Datensätze der jeweiligen Bromelienart zu erhalten und somit eine statistische Aussage zur Frequenz der einzelnen Motivklassen treffen zu können wurde die Software SCIROKO Version 3.4 (KOFLER et al. 2007) verwendet. Diese äußerst benutzerfreundliche Software erlaubt neben fünf wählbaren Optionen zur Suche nach perfekten Mikrosatelliten auch die Wahl 40 Material und Methoden zwischen zwei statistischen Methoden zur Auswertung (’fully standardized’ / ’partially standardized’). In der vorliegenden Arbeit wurde die ’PerfectMISA’-Option verwendet, um die jeweils minimale Anzahl an Wiederholungseinheiten der sechs Mikrosatelliten-Arten (Mono- bis Hexanukleotid- Wiederholungen) festzulegen. Der Tabelle 2.1 sind die jeweils gewählten unteren Grenzen der Such-Einstellung für die EST- und 454-Mikrosatelliten zu entnehmen. Zur statistischen Analyse aller detektierten Mikrosatelliten wurde die Option ’fully standardized’ gewählt. Unter Berücksichtigung der rückwärts gerichteten Gegensequenzen (’reverse complements’) wurden hier beispielsweise die dimeren Mikrosatellitenmotive (TC), (CT), (AG) und (GA) in der Kategorie (AG) zusammengefasst, wohingegen bei der partiell standardisierten Option nur (AG) und (GA) in derselben Kategorie vereinigt worden wären. Tabelle 2.1: Übersicht der verwendeten Such-Einstellungen (minimale Anzahl an Wiederholungseinheiten) für Mikrosatelliten innerhalb der EST- und 454-Sequenzen (Unigenes) Art des Mikrosatelliten Anzahl Wiederholungseinheiten (EST) Anzahl Wiederholungseinheiten (454) Mononukleotid-Wiederholung 15 15 Dinukleotid-Wiederholung 7 7 Trinukleotid-Wiederholung 5 6 Tetranukleotid-Wiederholung 5 5 Pentanukleotid-Wiederholung 5 4 Hexanukleotid-Wiederholung 5 4 Nach Beendigung eines Suchlaufs und Speichern sämtlicher Ergebnisse wurden alle Mikrosatelliten-enthaltenden Unigenes über die Funktion ’SCIROKO`s little helper’ aus dem Gesamtdatensatz extrahiert. Da SCIROKO keine Option für das direkte Primerdesign bietet, wurden die extrahierten Sequenzen in das Programm PRIMER3 (ROZEN & SKALETSKY 2000) importiert, welches in der Internet-Anwendung BATCHPRIMER3 (YOU et al. 2008) implementiert ist. BATCHPRIMER3 lässt nur eine maximale Anzahl von 500 Sequenzen pro Aktion zu, sodass die jeweilige Input-Datei in Blöcke von ≤ 500 Sequenzen aufgeteilt werden musste. Diese Blöcke wurden separat analysiert und die Ergebnisse im Anschluss wieder zusammengefügt. Innerhalb der Option ’SSR screening and primers’ wurden die Kriterien zur Mikrosatellitensuche – ohne Berücksichtigung der Mononukleotid-Wiederholungen – analog zur Suche in SCIROKO eingestellt (siehe Tabelle 2.1). Für das Primerdesign wurden folgende Einstellungen festgelegt: Primerlänge zwischen 18 und 23 bp (20 bp als Optimum), Größe des PCR-Produkts zwischen 100 bp und 300 bp (150 bp als Optimum), Anlagerungs-Temperatur zwischen 50 °C und 70 °C (55 °C als Optimum), GC-Gehalt zwischen 30% und 70% (50% als Optimum). Für die verbleibenden Parameter wurden die Standard-Einstellungen beibehalten. 41 Material und Methoden 2.2.3.3 Auswahl geeigneter Primerpaare Mit Hilfe der o.g. Methoden wurde eine große Zahl von Mikrosatellitenloci identifiziert, die sich für die Konstruktion von flankierenden Primerpaaren eignen. Für die Laboruntersuchungen konnte davon nur ein kleiner Teil eingesetzt werden. Um eine möglichst hohe Variabilität sowie eine gute Übertragbarkeit der Marker zu erhalten, wurden hauptsächlich perfekte Di- und Trinukleotid-Wiederholungen verschiedener Zusammensetzung ausgewählt (GUICHOUX et al. 2011). Als Auswahlkriterium für die in Frage kommenden Primerpaare dienten ferner eine geringe Wahrscheinlichkeit zur Selbstanlagerung und Dimer-Bildung, die Abwesenheit von mikrosatellitenähnlichen Motiven im Primer selbst sowie das Vorhandensein eines einzigen, perfekten Mikrosatelliten innerhalb des erwarteten PCR-Produkts. 2.2.3.4 ’Basal local alignment search tool’ (BLAST) Eine oft angewendete Methode, um Ähnlichkeiten und Übereinstimmungen zwischen Nukleotid- oder Proteinsequenzen derselben oder verschiedener Organismen zu ermitteln bietet die BLAST- Analyse (ALTSCHUL et al. 1997). Üblicherweise wird dabei eine Suchsequenz (’query’) definiert, die mit allen Sequenzen in einer Datenbank paarweise verglichen und auf Sequenzhomologien hin untersucht wird. Mit Hilfe von BLAST ist es z.B. möglich, redundante Sequenzen zu detektieren, Rückschlüsse auf die Funktion unbekannter Gene zu erhalten, neue Genfamilien zu prognostizieren oder evolutionäre Verwandtschaften zu erforschen (MADDEN 2002). Grundlage sind lokale Alignments, die von BLAST mittels heuristischer Algorithmen vorgenommen werden. Die besten Ergebnisse, bzw. Treffer solcher BLAST-Analysen z.B. einer Nukleotidsequenz gegen eine Referenzdatenbank werden durch einen sogenannten ’bit score’ und den erwarteten Wert (’E-value’) gekennzeichnet. Der ’bit score’ drückt die Qualität eines Alignments aus und je höher dieser Wert ist, desto perfekter ist auch das Alignment. Der ’E-value’ repräsentiert die statistische Signifikanz eines paarweisen Alignments innerhalb einer Datenbank bestimmten Umfangs. Je niedriger der ’E-value’-Wert, desto höher ist die Signifikanz des Treffers und desto geringer ist die Wahrscheinlichkeit, dass die Sequenzhomologie auf Zufall beruht. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde eine BLAST-Analyse dazu eingesetzt, um mögliche Genfunktionen der den entsprechenden Mikrosatellitenmarkern zugrunde liegenden Sequenzen des Kerngenoms zu ermitteln. Dazu wurden alle Unigenes, auf deren Basis die Primerpaare generiert wurden, als Suchsequenzen verwendet und über den NCBI-Server mit einer nicht- redundanten Referenz-Proteindatenbank von Oryza sativa (Reis) verglichen. BLASTx übersetzt die 42 Material und Methoden Suchsequenzen in jedes der sechs möglichen Leseraster und erzeugt in Folge eine kombinierte Statistik zur Signifikanz sämtlicher Treffer gegen die entsprechende Datenbank. 2.2.4 Etablierung von 454-Mikrosatellitenmarkern plastidären Ursprungs Neben der Suche nach geeigneten Mikrosatellitenmarkern des Kerngenoms eignen sich die durch die 454-Technik generierten Sequenzen auch zur Analyse der plastidären DNA und der Etablierung sogenannter cpSSRs, also Plastom-spezifischer Mikrosatellitenmarker (vgl. 1.2.5.3). Hierzu wurden analog zur Vorgehensweise von KRAPP et al. (2012) im Rahmen der vorliegenden Arbeit ausschließlich die 454-Sequenzen von Fosterella rusbyi (JP 06.0078) verwendet. 2.2.4.1 Extraktion der plastidären DNA aus dem Gesamtdatensatz Die Identifizierung und Extraktion des plastidären Anteils aus den 454-Datensätzen von Fosterella rusbyi und Deuterocohnia longipetala erfolgte mithilfe der Sequenzdaten von Typha latifolia (Typhaceae). Diese Art wurde als Referenz (GenBank-Nummer GU195652.1; GUISINGER et al. 2010) gewählt, da sie die nächste Verwandte zu den Bromelien darstellt, deren Plastom zum Zeitpunkt der Analyse vollständig sequenziert zur Verfügung stand (GIVNISH et al. 2010). Zunächst wurden sämtliche Sequenzen von F. rusbyi und D. longipetala separat innerhalb der ’sequence search’- Option von GENEIOUS als Datenbank definiert. Anschließend erfolgte eine separate BLAST- Analyse des Typha-Plastoms gegen beide Datenbanken. Zum Typha-Plastom signifikant ähnliche 454-Sequenzen wurden anschließend aus dem Gesamtdatensatz extrahiert und als Bestandteil des plastidären Genoms der jeweiligen Art definiert. 2.2.4.2 Suche nach Mikrosatellitenmotiven und Primerdesign Da die Etablierung von plastidären Mikrosatellitenmarkern für Dy. marnier-lapostollei (KRAPP et al. 2012) und D. longipetala nicht Teil der vorliegenden Arbeit war, erfolgte die Suche nach Mikrosatelliten ausschließlich innerhalb des Fosterella-Datensatzes. Dieser wurde unter Verwendung von SCIROKO vornehmlich nach Mononukleotid-Wiederholungen (Poly-A/T und Poly-C/G) mit einer Mindestlänge von 10 bp durchsucht (’PerfectMISA’-Option; vgl. Kapitel 2.2.3.2). Die Extraktion der Mikrosatelliten-enthaltenden Sequenzen erfolgte auch in diesem Fall mittels der Funktion ’SCIROKO`s little helper’. Um die Präsenz homologer Mikrosatellitenloci auszuschließen und um überlappende Regionen zusammenzufassen wurde die ’assembly’-Option von GENEIOUS unter Standard-Einstellungen angewendet. Die daraus resultierenden nicht- 43 Material und Methoden redundanten Sequenzen inklusive der enthaltenen Mikrosatelliten waren die Grundlage des Primerdesigns mittels PRIMER3. Die hierzu verwendeten Einstellungen sind Kapitel 2.2.3.2 zu entnehmen. 2.2.4.3 Suche nach Genfunktionen Um den Anteil der zum Typha-Plastom signifikant ähnlichen Fosterella-Sequenzen bezogen auf das gesamte Chloroplastengenom abschätzen zu können wurde eine Assemblierung mittels GENEIOUS unter Standard-Einstellungen vorgenommen. Die auf diese Weise generierte Consensus-Sequenz erlaubt Aussagen über den prozentualen Anteil der 454-Sequenzen am Typha-Plastom. Analog zu der in Kapitel 2.2.3.4 beschriebenen Vorgehensweise wurden auch die plastidären Markersequenzen jeweils einer BLASTx Analyse gegen die Proteindatenbank von T. latifolia unterzogen. Dies erlaubte die Ermittlung der genauen Lage auf dem Chloroplastengenom sowie der jeweiligen Genfunktion. 2.2.5 Gelelektrophorese Durch die negative Ladung der Phosphatgruppen im Zucker-Phosphat-Rückgrat wandert die DNA in einem elektrischen Feld von der Kathode (-) zur Anode (+). Die Verwendung eines entsprechenden Mediums, wie z.B. Agarose oder Polyacrylamid, ermöglicht die Auftrennung verschiedener DNA-Fragmente in Abhängigkeit von ihrer Größe. Um neben der Länge einer bestimmten DNA-Probe oder eines PCR-Produkts auch die jeweilige Konzentration abschätzen zu können, wird parallel zu den eigentlichen Proben ein geeigneter Standard mit DNA-Fragmenten bekannter Länge und Konzentration aufgetragen. 2.2.5.1 Agarose-Gelelektrophorese Die Überprüfung frisch isolierter, genomischer DNA und von PCR-Produkten hinsichtlich ihrer Konzentration und ihres Molekulargewichts erfolgte über eine elektrophoretische Auftrennung auf 0,8%-igen bzw. 1,5%-igen Agarosegelen. Der Abstand zwischen den beiden Elektroden einer Gelkammer definierte hierbei die Höhe der angelegten Spannung (5 V/cm). Zum Auftragen wurden 4 µl einer DNA-Lösung mit 1 µl Auftragspuffer vermischt. Der Auftragspuffer enthält Glycerin und Farbstoffe, um ein schnelles Absinken in die Geltaschen und eine optische Kontrolle während der Elektrophorese zu gewährleisten. Zur Abschätzung der Quantität genomischer DNA wurden mehrere Proben von Lambda-DNA (je 4 µl) mit variierender Konzentration zwischen 5- 44 Material und Methoden 50 ng/µl parallel aufgetragen. Für die Bestimmung der Länge von PCR-Produkten diente eine 100 bp Leiter, von der stets 1,5 µl aufgetragen wurden. Die DNA in den Gelen wurde mittels einer Ethidiumbromid-Lösung gefärbt und die Banden anschließend unter Verwendung von UV-Licht und einem entsprechenden Dokumentationssystem visualisiert. Verwendete Geräte, Materialien und Reagenzien Laufpuffer (0,5 x TBE): 45,5 mM Tris 45,5 mM Borsäure 1 mM EDTA pH 8,3 DNA-Auftragspuffer: 40 % v/v Glycerin 0,1 % w/v Bromphenolblau 0,1 % w/v Xylencyanol Färbelösung: 1 µg / ml Ethidiumbromid in 0,5 x TBE Agarose: 0,8 % w/v oder 1,5 % w/v (NEOO Ultra Quality; ROTH) in 0,5 x TBE DNA-Marker: 100 bp DNA ladder (ROTH) λ-DNA (5, 20, 50, 100, 150 ng/µl) Dokumentationssystem: BioDocAnalyze (BIOMETRA) 2.2.5.2 Polyacrylamid (PAA)-Gelelektrophorese Zur Bestimmung der Längen der an den einzelnen Mikrosatellitenloci erzeugten PCR-Fragmente wurden zwei Modelle eines automatischen Gel-Sequenzierers (IR2 DNA Sequencer Long Readir 4200 / 4300 DNA Analyzer, LI-COR BIOSCIENCES, Lincoln) in Verbindung mit hochauflösenden und denaturierenden 6 %igen Polyacrylamid (PAA)-Gelen verwendet. Als Elektrophoresepuffer diente 1 x TBE. Der eigentlichen Gelelektrophorese (im Folgenden als ’Run’ bezeichnet) ist der so genannte ’PreRun’ vorgeschaltet. Während des ’PreRuns’ werden Heizplatte und Gel erwärmt, außerdem erfolgt die automatische Justierung und Fokussierung des Lasers sowie des Detektors. Während des Runs wandern die mit den Fluorochromen IRDye700 und IRDye800 markierten DNA-Fragmente im Gel an einem Laser vorbei, der sie zur Fluoreszenz angeregt. Das durch die beiden Farbstoffe emittierte Licht liegt in einem Bereich von 700 bzw. 800 nm, somit im Dunkelrot- und Infrarot-Bereich und kann vom Detektor des Analysegeräts auf zwei Kanälen gleichzeitig aufgezeichnet werden. Die Parameter sowohl des PreRuns als auch des eigentlichen Runs können je nach Gellänge und gewünschter Trenngenauigkeit verändert werden. Das Mischverhältnis für ein Polyacrylamidgel betrug 100:25:1 für die Bestandteile SequaGel ®- Lösung, SequaGel®-Puffer und Ammoniumpersulfat-Lösung (APS). Um eine ausreichende Trennschärfe zu gewährleisten wurden Gele mit einer Länge von 41 cm und einer Dicke von 0,2 mm benutzt. Vor dem Beladen der insgesamt 48 Geltaschen pro Elektrophorese erfolgte eine Verdünnung der PCR-Produkte mit einem Formamid-Ladepuffer (1:10 bis 1:20) und eine anschließende Denaturierung für 5 min bei 85 °C in einem Thermocycler. Die Geltaschen wurden 45 Material und Methoden entweder mit 0,6 µl (LI-COR 4200) oder 0,3 µl (LI-COR 4300) verdünnter DNA-Lösung beladen und die Elektrophorese unter folgenden Bedingungen ausgeführt: Spannung 2.000 V, Stromstärke 25 mA, Leistung 50 W, Temperatur 45 °C, PreRun-Dauer 30 min, moderate Scanner- Geschwindigkeit. Verwendete Geräte, Materialien und Reagenzien LI-COR® IR2 DNA Sequencer Long Readir 4200 oder 4300 2 LI-COR® Glasplatten (41 cm) 2 LI-COR® Spacer (0,2 mm) 2 LI-COR® Rails LI-COR® Casting-Platte LI-COR® Haifischzahn-Kamm (0,2 mm) HAMILTON 8-Kanal Pipette (0,1 bis 10 µl) Aqua bidest Isopropanol ULTRA PURE SequaGel® Complete Buffer Reagent ULTRA PURE SequaGel® XR 10 % Ammoniumpersulfat (APS): 150 mg APS (1 Kapsel von SIGMA®) 1,5 ml Aqua bidest Laufpuffer (1 x TBE, pH 8,3): 90 mM Tris 90 mM Borsäure 2 mM EDTA Formamid-Ladepuffer: 98% v/v Formamid 0,025% v/v basisches Fuchsin 10 mM EDTA 2.2.6 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Die erstmals von MULLIS et al. (1986) vorgestellte Methode dient der zyklischen und temperaturabhängigen in vitro-Vervielfachung bestimmter, in der Regel durch zwei flankierende Primer definierter, DNA-Sequenzbereiche mittels einer hitzestabilen DNA-Polymerase (z.B. Taq DNA-Polymerase aus dem thermophilen Bakterium Thermus aquaticus). Verwendete Geräte, Materialien und Reagenzien: Reaktionsgefäße: Mikrotiterplatte (96-well PCR-Platte, BIOZYM) Sealmat (BIOZYM) Thermocycler: TGradient und T1 (BIOMETRA, Göttingen) Lösungen: 10x PCR Mango-Buffer (BIOLINE) 50 mM MgCl2 (BIOLINE) Mango-Taq DNA-Polymerase (BIOLINE, 1 U/µl) Bovine Serum Albumin (BSA, MBI FERMENTAS; 20 µg/µl) dNTP-Lösung: 1:1:1:1 dATP, dGTP, dCTP, dTTP je 2,5 mM (ROTH) Oligonukleotide = Primer 100 µM (METABION) Templat-DNA: 5 – 10 ng/µl in 1x TE-Puffer 46 Material und Methoden 2.2.6.1 Amplifizierung nukleärer Mikrosatellitenloci In der vorliegenden Arbeit wurden für die PCR zur Amplifizierung der nukleären Mikrosatellitenloci zwei leicht unterschiedliche PCR-Mixe eingesetzt (Mix 1 und Mix 2 in Tabelle 2.2). Tabelle 2.2: Zusammensetzung der PCR-Ansätze (Mix 1 und Mix 2) zur Amplifikation von nukleären Mikrosatellitenloci mit einem Endvolumen von 12,5 µl pro Ansatz. Mix 2 enthält im Gegensatz zu Mix 1 die 2-fache Menge an Taq DNA-Polymerase. PCR-Komponenten Konzentration der Stammlösung Endkonzentration/ Menge Volumina pro Ansatz (Mix 1) Volumina pro Ansatz (Mix 2) PCR-Puffer 5x 1x 2,5 µl 2,5 µl BSA 20 µg/µl 0,2 µg/µl 0,125 µl 0,125 µl MgCl2 50 mM 1,5 mM 0,375 µl 0,375 µl dNTPs je 2,5 mM je 0,1 mM 0,5 µl 0,5 µl forward Primer 10 µM 0,4 µM 0,5 µl 0,5 µl reverse Primer 10 µM 0,4 µM 0,5 µl 0,5 µl Taq DNA-Polymerase 5 U/µl 0,02 U/µl 0,05 µl 0,1 µl Aqua bidest 7,45 µl 7,4 µl Templat-DNA 5 – 10 ng/µl 5 – 10 ng/µl 0,5 µl 0,5 µl Summe 12,5 µl 12,5 µl Im Hinblick auf einen möglichst niedrigen Kostenaufwand wurde in beiden PCR-Ansätzen eine relativ geringe Konzentration von Taq DNA-Polymerase gewählt und das Gesamtvolumen gegenüber der üblichen 25 µl halbiert (Tabelle 2.2; Mix 1). Mix 1 wurde in über 95% der Fälle erfolgreich angewendet. Nur in wenigen Fällen musste die Menge an Taq DNA-Polymerase verdoppelt werden, um auch hier ein spezifisches Bandenmuster zu erhalten (Tabelle 2.2; Mix 2). Mix 2 wurde zudem immer in Verbindung mit dem ’touch-down’ PCR-Protokoll ’TD 64-50’ (Tabelle 2.4) benutzt. Alle PCR-Reaktionen wurden entweder in einem BIOMETRA (T1; TGradient)- oder BIOZYM (BioER)-Thermocycler durchgeführt. Aufgrund der großen Anzahl durchzuführender PCR wurde darauf verzichtet, für jedes neu entwickelte Primerpaar ein individuelles PCR- Programm mit individueller Anlagerungs-Temperatur zu kreieren. Stattdessen wurden sämtliche Reaktionen mit einem ’touch-down’ PCR-Protokoll durchgeführt (DON et al. 1991). Der Vorteil dieser Methode gegenüber der Standard-PCR liegt darin, dass die Anlagerungs-Temperatur individuell in jedem neuen Zyklus um einen definierten Wert erniedrigt werden kann. Begonnen wird einige Grad Celsius oberhalb der für das jeweilige Primerpaar berechneten optimalen Anlagerungs-Temperatur. Durch diesen Vorgang wird die Spezifität der PCR bei gleicher Ausbeute erhöht und die Wahrscheinlichkeit unspezifischer Bindungen eines oder beider Primer an die Zielsequenz herabgesetzt. Zur Amplifizierung der EST-Mikrosatellitenloci wurde ausschließlich das Protokoll ’TD 64-54’ (Tabelle 2.3) angewendet, für die nukleären 454- Mikrosatellitenloci das Protokoll ’TD 64-50’ (Tabelle 2.4). 47 Material und Methoden Tabelle 2.3: Protokoll des ’touch-down’ PCR-Programms ’TD 64-54’ zur Amplifikation von nukleären EST-Mikrosatellitenloci. Anzahl der Zyklen Teilschritt Temperatur in °C Teilschritt-Dauer 1 x Initiale Denaturierung 94 6 min Denaturierung 94 45 sec 10 x Anlagerung 64 bis 54 30 sec Verlängerung 72 45 sec Denaturierung 94 45 sec 20 x Anlagerung 54 30 sec Verlängerung 72 45 sec 1 x Finale Verlängerung 72 10 min 1 x Kühlen / Aufbewahren 10 ∞ Tabelle 2.4: Protokoll des ’touch-down’ PCR-Programms ’TD 64-50’ zur Amplifikation von nukleären Mikrosatellitenloci aus der 454- Pyrosequenzierung. Anzahl der Zyklen Teilschritt Temperatur in °C Teilschritt-Dauer 1 x Initiale Denaturierung 94 6 min Denaturierung 94 45 sec 14 x Anlagerung 64 bis 50 30 sec Verlängerung 72 45 sec Denaturierung 94 45 sec 20 x Anlagerung 50 30 sec Verlängerung 72 45 sec 1 x Finale Verlängerung 72 10 min 1 x Kühlen / Aufbewahren 10 ∞ 2.2.6.2 Amplifizierung plastidärer Mikrosatellitenloci Um den Kostenaufwand so gering wie möglich zu halten wurde bei der Amplifizierung plastidärer Mikrosatellitenloci auf die direkte Fluoreszenzmarkierung von einem der beiden Primer pro Locus verzichtet und statt dessen eine indirekte Markierung nach SCHUELKE et al. (2000) vorgenommen. Grundlage hierzu ist das Anligieren einer universellen M13-Sequenz (’M13-tail’) am 5`-Ende entweder des Vorwärts- oder des Rückwärtsprimers. Im Falle des getailten Vorwärtsprimers erfolgt innerhalb der PCR die Kombination mit einem Standard- Rückwärtsprimer ohne M13-tail und einem entsprechend fluoreszenzmarkierten (IRDye700) M13-Vorwärtsprimer (vgl. Tabelle 2.5a). Folglich ergibt dies bei Einsatz eines M13-getailten Rückwärtsprimers die Kombination mit einem Standard-Vorwärtsprimer und einem fluoreszenzmarkierten (IRDye800) Rückwärtsprimer (vgl. Tabelle 2.5b). Auf diese Weise werden beide Kanäle des Plattensequenzierers ausgenutzt (vgl. 2.2.5.2). Die PCR-Reaktionen zur Amplifikation der plastidären Mikrosatellitenloci wurden sowohl in einem TGradient-, bzw. T1-Thermocycler (BIOMETRA, Göttingen) als auch in einem BioER- Thermocycler (BIOZYM, Hessisch Oldendorf) durchgeführt. Das Protokoll dieser Reaktion ist in Tabelle 2.6 zusammengestellt, es handelt sich dabei um eine Standard-PCR bei konstanter Anlagerungs-Temperatur von 52 °C und einer Anzahl von 30 Zyklen (nach SHAW et al. 2007). 48 Material und Methoden Tabelle 2.5a: Zusammensetzung des PCR-Ansatzes zur Amplifikation von plastidären Mikrosatellitenloci mit einem Endvolumen von 10 µl pro Ansatz für die Nutzung im 700er Kanal des Plattensequenzierers. PCR- Komponenten Konzentration der Stammlösung Endkonzentration/ Menge Volumina pro Ansatz PCR-Puffer 5x 1x 2,0 µl BSA 20 µg/µl 0,5 µg/µl 0,25 µl MgCl2 50 mM 1,5 mM 0,3 µl dNTPs je 2,5 mM je 0,2 mM 0,8 µl forward Primer 10 µM 0,04 µM 0,04 µl reverse Primer 10 µM 0,16 µM 0,16 µl forward Primer mit M13 (IRDye700) 10 µM 0,16 µM 0,16 µl Taq DNA-Polymerase 5 U/µl 0,05 U/µl 0,1 µl Aqua bidest 5,19 µl Templat-DNA 5 – 10 ng/µl 5 – 10 ng/µl 1 µl Summe 10 µl Tabelle 2.5b: Zusammensetzung des PCR-Ansatzes zur Amplifikation von plastidären Mikrosatellitenloci mit einem Endvolumen von 10 µl pro Ansatz für die Nutzung im 800er Kanal des Plattensequenzierers. PCR- Komponenten Konzentration der Stammlösung Endkonzentration/ Menge Volumina pro Ansatz PCR-Puffer 5x 1x 2,0 µl BSA 20 µg/µl 0,5 µg/µl 0,25 µl MgCl2 50 mM 1,5 mM 0,3 µl dNTPs je 2,5 mM je 0,2 mM 0,8 µl forward Primer 10 µM 0,16 µM 0,16 µl reverse Primer 10 µM 0,04 µM 0,04 µl reverse Primer mit M13 (IRDye800) 10 µM 0,16 µM 0,16 µl Taq DNA-Polymerase 5 U/µl 0,05 U/µl 0,1 µl Aqua bidest 5,19 µl Templat-DNA 5 – 10 ng/µl 5 – 10 ng/µl 1 µl Summe 10 µl Tabelle 2.6: Protokoll des PCR-Programms ’cpSSR’ zur Amplifikation von plastidären Mikrosatellitenloci (verändert nach SHAW et al. 2007). Anzahl der Zyklen Teilschritt Temperatur in °C Teilschritt-Dauer 1 x Initiale Denaturierung 80 5 min Denaturierung 95 60 sec 30 x Anlagerung 50 60 sec Verlängerung 65 2 min 1 x Finale Verlängerung 65 5 min 1 x Kühlen / Aufbewahren 10 ∞ 2.2.7 Längenstandard und Fragmentlängenanalyse Die verschiedenen Fragmentlängen von PCR-amplifizierten Mikrosatellitenloci basieren auf der variablen Anzahl der Wiederholungseinheiten und werden z.B. wie in der vorliegenden Arbeit in hochauflösenden PAA-Gelen nachgewiesen. Infolge der Kodominanz von nukleären Mikrosatellitenmarkern erhält man in einem diploiden Organismus nach der Auftrennung der jeweiligen PCR-Produkte entweder eine einzelne Bande, welche den homozygoten Status widerspiegelt, oder zwei Banden, die den heterozygoten Status repräsentieren. Im Fall der plastidären Mikrosatellitenmarker ist das Produkt der PCR stets eine Einzelbande. 49 Material und Methoden Als externer Längenstandard zur visuellen Größenbestimmung der aufgetrennten PCR- Fragmente diente eine bekannte Sequenz von ca. 280 bp Länge, die nach der Methode von SANGER et al. (1977) aus der chloroplastidären AT-reichen psbL-trnS Region (ccmp2-Locus; WEISING & GARDNER 1999) einer Akzession von Macaranga indistincta WHITMORE (GenBank-Nummer DQ358512) generiert wurde (BÄNFER et al. 2006). Statt einer typischen thermozyklischen DNA-Sequenzierung (’cycle sequencing’) mit vier – zum Abbruch der synthetisierten DNA-Ketten führenden – ddNTPs wurde dabei nach der SNSA- (’single nucleotide sequence analysis’) Methode (GUICKING et al. 2008) nur die T-Reaktion (ddTTP) in Anwesenheit von markierten ccmp2-Primern (vorwärts = IRDye700 und rückwärts = IRDye800) durchgeführt. Ein Volumen von 0,6 µl (LI-COR 4200) bzw. 0,3 µl (LI-COR 4300) dieser Standard-Sequenz wurde abhängig vom DNA-Probenset in fünf bis acht regelmäßig über das Gel verteilten Spuren aufgetragen. Zusätzlich wurde in jedem Gel sowohl eine Positivkontrolle (Mikrosatellitenfragment bekannter Größe) als auch eine Negativkontrolle (keine Templat-DNA in der PCR) aufgetragen. 2.2.8 Primertests und Charakterisierung der Mikrosatellitenmarker Um die Funktionalität sowie die Übertragbarkeit der entwickelten Primerpaare auf heterologe Arten zu ermitteln, wurden je nach Fragestellung und entsprechend der verschiedenen Herkünfte der Mikrosatellitenmarker individuelle Testsets mit geringem Probenumfang zusammengestellt. Im Falle der EST- und 454-Mikrosatelliten erfolgten diese Tests zunächst mit unmarkierten PCR-Primern und einer anschließenden Auftrennung der amplifizierten Produkte auf Agarosegelen. Basierend auf den dabei erhaltenen Ergebnissen erfolgte eine erste Selektion derjenigen Primerpaare, die für weiterführende Untersuchungen als geeignet eingestuft wurden. Hauptkriterium für diese Auswahl war das Vorhandensein einer klar definierten, deutlichen und einzelnen Bande je Probe im Rahmen der erwarteten Fragmentlänge. In zweiter Priorität dienten die manchmal bereits auf Agarosegelen erkennbaren Längenunterschiede zwischen den Fragmenten einzelner Proben als Kriterium. Im nächsten Schritt wurden die PCRs mit fluoreszenzmarkierten Primern innerhalb eines erweiterten Testsets wiederholt und die Fragmentlängen auf hochauflösenden PAA-Gelen überprüft. Diese Testserie diente zur Selektion derjenigen Primerpaare, die je nach Fragestellung und Verwendung Fragmentlängen-Unterschiede (Polymorphismen) z.B. innerhalb einer Art (populationsgenetische Analysen), zwischen Arten derselben Gattung (Untersuchungen zur Artabgrenzung) oder auch zwischen Arten verschiedener Gattungen (Übertragbarkeitsstudien) aufwiesen. 50 Material und Methoden Mit den ausgewählten Primerpaaren erfolgte schließlich die Genotypisierung des für die jeweilige Hauptanalyse bestimmten Probenmaterials. Im Fall der plastidären Mikrosatellitenloci wurde die PCR-Amplifizierung direkt mittels markierter Primer vorgenommen (vgl. Tabelle 2.5), sodass eine unmittelbare Überprüfung der Fragmente auf hochauflösenden PAA-Gelen möglich war. Da dieser Markertyp hauptsächlich im Rahmen von populationsgenetischen Studien an Fosterella rusbyi zum Einsatz kommen sollte, wurden die Marker entsprechend ihrer Variabilität innerhalb dieser Fosterella-Art selektiert und die potenziellen Kandidaten anschließend direkt in den Populationsproben angewendet. 2.3 Datenauswertung nukleärer Mikrosatellitenmarker 2.3.1 Genetische Diversität und Variabilität Zum Nachweis der Funktionalität eines Mikrosatellitenmarkers für populationsgenetische Anwendungen wurden mittels der Software ARLEQUIN Version 3.5.1.2 (EXCOFFIER & LISCHER 2010) und FSTAT Version 2.9.3.2 (GOUDET 2002) verschiedene Standard-Parameter kalkuliert. So geben die Allelfrequenzen, beobachtete und erwartete Heterozygotie sowie die Gesamtzahl der detektierten Allele pro Locus bereits Aufschluss über die genetische Diversität einer Art. Je mehr Allele vorhanden sind und je gleichmäßiger diese innerhalb der untersuchten Population verteilt sind, desto höher ist die genetische Variabilität derselben einzuschätzen. Die Heterozygotie beschreibt den Anteil heterozygoter Individuen in einer Population und dient als Indikator für die genetische Variabilität. Die beobachtete Heterozygotie (Ho) repräsentiert dabei den tatsächlich in der Population ermittelten Anteil heterozygoter Individuen und basiert auf reinem Auszählen. Die erwartete Heterozygotie (He) beruht auf den Allelfrequenzen und entspricht der Wahrscheinlichkeit, dass zwei zufällig der Population entnommene Allele unterschiedlich sind. Sie ergibt sich aus eins minus der Summe der einzelnen Allelfrequenzen an diesem Locus zum Quadrat: H e=1−∑ i=1 i=K p i 2 . Hierbei ist p die Frequenz des i-ten Allels aus insgesamt K Allelen an dem betreffenden Locus. Die erwartete Heterozygotie, oder auch ’gene diversity’, kann Werte von null bis eins annehmen, wobei der Wert mit zunehmender Allelzahl und bei zunehmend gleichmäßiger Verteilung der Allele ansteigt (NEI 1987). Die entsprechenden Datensätze, bestehend aus Populationsproben geeigneten Umfangs wurden zusätzlich auf Abweichungen vom HARDY-WEINBERG Gleichgewicht (HWG) untersucht. 51 Material und Methoden 2.3.2 Fixationsindizes Die F-Statistik geht auf S. WRIGHT (WRIGHT 1946, 1951 und 1965) zurück. Mit Hilfe der sogenannten Fixationsindizes kann das Ausmaß genetischer Differenzierung bzw. die Reduktion der Heterozygotenrate auf verschiedenen hierarchischen Stufen quantifiziert werden, so z.B. zwischen Populationen verschiedener Regionen. Für jede Stufe der Hierarchie (z.B. Individuen, Einzelpopulationen oder Arten) können die Indizes anhand der Allelfrequenzen kalkuliert werden. Der Vergleich zwischen den Allelen eines einzelnen Individuums (i) in Bezug auf die Allele der Gesamtpopulation (t) wird durch Fit dargestellt. Als Maß für den Vergleich zwischen den Genen innerhalb einer Population (s) in Bezug auf die Gene der Gesamtpopulation dient Fst. Die Beziehung zwischen den Genen eines Individuums und den Genen der dazugehörigen Teilpopulation wird durch Fis ausgedrückt. Im Allgemeinen steht Fis für das Heterozygoten-Defizit innerhalb einer Population (auch als Inzuchtskoeffizient bezeichnet), Fst für die Differenzierung zwischen Populationen (WRIGHT 1931; WRIGHT 1969; EXCOFFIER 2001) und Fit für das globale Defizit an Heterozygoten (WRIGHT 1931 & 1969; EXOFFIER 2001). Zur Beschreibung multipler Allele wurde die F-Statistik erweitert (NEI 1977). NEI bewies, dass die angeführten Fixationsindizes auch als das Verhältnis von beobachteter und erwarteter Heterozygotie dargestellt werden können. Daraus ergibt sich Fis = (Hs-Ho)/Hs Fit = (Ht-Ho)/Ht Fst = (Ht-Hs)/Ht wobei Ho für die beobachtete Heterozygotierate in einer Population (gemittelt über alle Loci) steht, Hs die erwartete Heterozygotie der Einzelpopulationen (gemittelt über alle Loci) und Ht die erwartete Heterozygotierate in der Gesamtpopulation (über alle Loci gemittelt) darstellt. Der von NEI (1977) eingeführte Parameter Gst (’coefficient of genic differentiation’) ist ein Schätzwert für Fst und ermöglicht die Quantifizierung des Anteils genetischer Diversität, der auf die Variation innerhalb einer Einzelpopulation bzw. auf genetischer Differenzierung zwischen Populationen beruht. Die Indizes und deren Signifikanzen wurden unter Verwendung von GENEPOP Version 1.2 (RAYMOND & ROUSSET 1995) und FSTAT berechnet. Der Fst-Wert wurde dabei sowohl gemittelt über alle Loci und Populationen als auch im paarweisen Vergleich einzelner Populationen erhoben. Im letzteren Fall können die Fst-Werte auch als Maß genetischer Divergenz betrachtet werden. Ist Fst = 0, dann ist Ht = Hs. Die Populationen sind dann nicht voneinander zu trennen, was auf hohen Genfluss zwischen den Populationen hindeutet. Ist der Fst-Wert dagegen signifikant größer als null, so deutet dies auf genetische Differenzierung zwischen den Einzelpopulationen infolge eines 52 Material und Methoden Mangels an Genfluss hin. Unterschiedliche Populationsgrößen können in der Berechnungspraxis zu leicht negativen Fst-Werten führen (LOWE et al. 2004), diese wurden in der vorliegenden Arbeit gleich Null gesetzt. Die Berechnung des Gst-Wertes erfolgte gemittelt über alle Populationen. Da die bisher genannten Parameter der F- und G-Statistik ursprünglich für Allozym-Analysen entwickelt worden sind und das IAM (’infinite alleles model’, KIMURA & CROW 1964) voraussetzen (vgl. Kapitel 1.2.3), wurde ein zusätzlicher Parameter einbezogen, welcher dem SMM (’stepwise mutation model’, KIMURA & OHTA 1978) folgt: das Fst-Analog Rst (SLATKIN 1995) basierend auf der Formel Rst = (S – Sw)/S. Hierin repräsentiert S die durchschnittliche Differenz der Allelgröße zwischen allen Allelpaaren und Sw die durchschnittliche Differenz innerhalb einer Population. Da sich sowohl Fst, Gst als auch Rst zur Analyse zahlreicher Allele eignen und beide Mutationsmodelle von der Populationsgröße, der Allelzahl und der Anzahl untersuchter Loci abhängig sind, ermöglicht ein Vergleich der Werte einen umfassenden Einblick in die Populationsstruktur einer Art. 2.3.3 Nachweis ’privater’ Allele Kommt ein Allel nur in einer einzigen der untersuchten Populationen vor, erhält es den Status eines ’privaten’ Allels. Existenz und Anzahl privater Allele bieten neben den bereits genannten Indizes eine Möglichkeit, die genetische Abgrenzbarkeit bzw. Differenzierung von Populationen darzustellen. Als Grundlage zur Identifizierung eines solchen Allels dienten die Allelfrequenzen je Locus und Population (SLATKIN 1985). 2.3.4 ’Analysis of molecular variance’ (AMOVA) Neben der Verwendung der F-Statistik wurde die genetische Struktur der untersuchten Populationen anhand der molekularen Varianzen ermittelt. Die Allelfrequenzen sind die Basis für eine hierarchische Analyse der Varianzen, wobei genetische Differenzen zwischen mehreren Komponenten oder Partitionen (Individuen, Populationen, höhere Gruppierungsebenen) herausgearbeitet werden. In der vorliegenden Arbeit wurde die Software ARLEQUIN genutzt, um die Varianzen zwischen und innerhalb der Populationen zu berechnen. Die Signifikanzen wurden in einem nicht-parametrischen (verteilungsfreien) Permutationsverfahren mit 1.000 Permutationsschritten berechnet. 53 Material und Methoden 2.3.5 MANTEL-Test Ein MANTEL-Test (MANTEL 1967, MANTEL & VALAND 1970) ist eine vielseitige statistische Methode mit zahlreichen Anwendungsmöglichkeiten, der generell dazu dient, die Korrelation zwischen zwei Matrizen zu überprüfen. Im vorliegenden Fall wurde ein solcher Test durchgeführt, um die Korrelation zwischen genetischer und geographischer Distanz zwischen unterschiedlichen Populationen zu ermitteln. Eine signifikant positive Korrelation zwischen beiden Distanzen lässt die Annahme zu, dass der Genfluss zwischen den untersuchten Populationen mit zunehmender Entfernung abnimmt – es liegt somit ein ’isolation-by-distance’-Effekt vor. Der MANTEL-Test wurde basierend auf den paarweisen Fst-Werten mit ARLEQUIN durchgeführt. 2.3.6 Distanzverfahren 2.3.6.1 Neighbour-Joining-Analyse und NeighbourNet Die Neighbour-Joining-Methode (NJ) nach SAITOU & NEI (1987) ist die wohl am häufigsten genutzte, distanzbasierte Methode für phylogenetische Fragestellungen (BRYANT & MOULTON 2004). Der NJ- Algorithmus verwendet eine zuvor erstellte Distanzmatrix und produziert additive Bäume, denen keine festgelegte evolutive Geschwindigkeit zugrunde liegt (WEISING et al. 2005). Eine Abwandlung bzw. Variante der NJ-Methode wird durch den NeighbourNet-Algorithmus repräsentiert. Dabei werden Netzwerke erzeugt. Sie generalisieren phylogenetische Bäume, weil sie das Vorhandensein von widersprüchlichen Signalen im resultierenden Datensatz durch Parallelogramme wiedergeben. In der vorliegenden Arbeit wurde das Programm SPLITSTREE4 (HUSON & BRYANT 2006) zur NeighbourNet-Analyse genutzt. Die Distanzmatrix, welche dem Netzwerk zugrunde liegt, wurde zuvor mithilfe des Programms SPAGEDI Version 1.4 (HARDY & VEKEMANS 2002) generiert, hierbei handelte es sich um die auf Allelfrequenzen basierende genetische Distanz zwischen Individuen nach ROUSSET (2000). Hingegen wurde PAUP* Version 4.0 Beta 10 (SWOFFORD 2003) zur Durchführung der NJ-Analyse verwendet 2.3.6.2 Hauptkoordinaten-Analyse (’principal coordinates analysis’, PCo-Analyse) Bei der Hauptkoordinaten-Analyse nach GOWER (1966) handelt es sich um ein statistisches Verfahren, in dem multivariate Datensätze mit einem minimalen Verlust an Information kondensiert und graphisch dargestellt werden. Der zugrunde liegende mathematische Algorithmus ist sehr komplex (ORLÓCI 1978). Vereinfacht ausgedrückt ist die PCo-Analyse ein 54 Material und Methoden Prozess, bei dem die vorhandene genetische Variabilität durch Achsen repräsentiert ist, welche innerhalb eines multidimensionalen Datensatzes lokalisiert sind. Jede nachfolgende Achse spiegelt einen proportional geringeren Anteil der Gesamtvariation wider, sodass beispielsweise bei distinkten Gruppen die ersten beiden Achsen typischerweise den Hauptanteil genetischer Auftrennung zwischen diesen aufdecken. Häufig repräsentieren bereits die ersten beiden Achsen mehr als 50% der gesamten im Datensatz erhaltenen Variabilität und lassen die relativen ’genetischen Ähnlichkeiten’ verschiedener Populationen erkennen. PCoA-Diagramme gelten als Methode der Wahl zur Untersuchung geographisch benachbarter Populationen, bei denen von beträchtlichem Genfluss untereinander ausgegangen werden muss. Zur Durchführung der PCo-Analyse wurde das Softwarepaket NTSYSpc genutzt (ROHLF 1998, 2000). Die als Inputmatrix erforderlichen genetischen Distanzen zwischen den Individuen basierend auf dem Unähnlichkeits-Koeffizienten nach BRAY & CURTIS (1957) wurden ebenfalls mittels NTSYSpc kalkuliert. 2.3.6.3 BAYES`sches Verfahren Zur Ermittlung der genetischen Struktur der untersuchten Populationen wurden zusätzlich BAYES`sche Cluster-Analysen angewendet, deren zugrunde liegender Algorithmus sowohl in BAPS Version 6.0 (CORANDER et al. 2003, 2008) als auch in STRUCTURE Version 2.3.4 (PRITCHARD et al. 2000) umgesetzt ist. In beiden Programmen wird die genetische Information genutzt, um die Populationszugehörigkeit von Individuen zu ermitteln, ohne dabei auf zuvor definierte Angaben Bezug zu nehmen (RODRÍGUEZ-RAMILo et al. 2009). Basierend auf einem Datensatz, der z.B. aus den Allelfrequenzen an mehreren Mikrosatellitenloci besteht, ist es somit möglich, die in die Untersuchung einbezogenen Individuen einer bestimmten Anzahl an Clustern (K) zuzuordnen. Die Kalkulation der wahrscheinlichsten Anzahl an Clustern bzw. Populationen geschieht innerhalb von BAPS basierend auf dem Logarithmus der marginalen Likelihood (vgl. hierzu CORANDER et al. 2004). Innerhalb von STRUCTURE wird der optimale Wert für K durch den höchsten zugrunde liegenden Delta K-Wert definiert (EVANNO et al. 2005). Der Wert Delta K wurde im vorliegenden Fall mit der webbasierten Applikation STRUCTURE-HARVESTER ermittelt und visualisiert (EARL & VON HOLDT 2012). Für alle vorgenommenen STRUCTURE-Analysen wurden folgende Einstellungen gewählt: Wiederholungen der ’burn-in’ Periode 500.000 MCMC-Schritte im Anschluss an die ’burn-in’ Periode 500.000 Wiederholungen für jedes K (1 ≤ K ≤ definierte Populationsgröße X, K ∈X) 10 55 Material und Methoden 2.4 Datenauswertung plastidärer Mikrosatellitenmarker 2.4.1 Genetische Diversität und Differenzierung Zur Auswertung der chloroplastidären Mikrosatellitendaten innerhalb der Fosterella rusbyi- Populationen wurde das Programm HAPLOTYPEANALYSIS Version 1.05 (ELIADES & ELIADES 2009) verwendet. Ein chloroplastidärer Haplotyp wurde in der vorliegenden Arbeit als die Kombination der Allele an sämtlichen verwendeten Mikrosatellitenloci pro Individuum definiert. Mittels der implementierten Funktion ’descriptive statistics’ wurden die im Datensatz erhaltenen Haplotypen und deren Frequenzen ermittelt, sowie die Anzahl und Frequenz von privaten Haplotypen, welche definitionsgemäß nur in einer der untersuchten Populationen vorkommen. Die Analyse von privaten Haplotypen bietet neben der Kalkulation von genetischen Distanzen eine gute Möglichkeit, um die Abgrenzbarkeit bzw. Differenzierung von Populationen darzustellen. Erweiterte Analysen wurden mit der Funktion ’inter-population analysis’ vorgenommen. So wurde die Anzahl der Haplotypen (A), die Anzahl privater Haplotypen (P) und die effektive Anzahl an Haplotypen (Ne) je Population ermittelt. Für Ne gilt: wobei Nh die Anzahl beobachteter Haplotypen pro Locus darstellt und P(i,j) die relative Frequenz des i-ten Haplotyps im j-ten Datensatz. Die effektive Anzahl an Haplotypen ist die Wahrscheinlichkeit dafür, dass zwei zufällig gewählte Haplotypen nicht identisch sind. Ne kann Werte von null bis n annehmen, wobei n die ermittelte Anzahl an Haplotypen in jeder untersuchten Population repräsentiert. Zudem erfolgte die Kalkulation der genetischen Diversität (He) nach NEI (1973), für einen Datensatz j galt: wobei P(i,j) erneut die relative Frequenz des i-ten Haplotyps darstellt und Nh die Anzahl beobachteter Haplotypen je Locus. N(j) steht für den Probenumfang innerhalb einer Population. He kann Werte zwischen null und eins annehmen und repräsentiert den Anteil an Diversität innerhalb einer Population. Um die genetische Differenzierung zwischen den Populationen abzuschätzen wurde NEI`s genetische Distanz (NEI 1972) in Form einer paarweisen Matrix kalkuliert, wobei Werte zwischen 56 Material und Methoden null (genetische Übereinstimmung zwischen zwei Populationen) und eins (völlige Unähnlichkeit) auftreten können. Diese Messgröße wurde ebenfalls für die nukleären Mikrosatellitendaten ermittelt, um im Rahmen eines MANTEL-Tests (vgl. Abschnitt 2.3.4) beide Datensätze auf eine mögliche Korrelation hin zu untersuchen. Die paarweisen genetischen Distanzen (NEI 1972) wurden jeweils mit der Software POPGENE Version 1.32 (YEH et al. 1997) kalkuliert. Zur Abschätzung der Allelfixierung wurden zudem die paarweisen Fst-Werte ermittelt, dazu wurde ebenfalls das Programm HAPLOTYPEANALYSIS verwendet. 2.4.2 Haplotypen-Netzwerke Auf Populationsebene bieten Netzwerke die Möglichkeit, die Verteilung von Haplotypen und deren Beziehungen zueinander graphisch zu visualisieren. Im Gegensatz zu phylogenetischen Stammbäumen stehen in einem solchen Netzwerk die Taxa nicht ausschließlich an den Astenden, sondern können auch interne Positionen, sogenannte ’Knoten’ besetzen. Die Verbindungslinie zwischen zwei Knoten und somit entsprechend zwischen zwei Haplotypen entspricht genau einem Mutationsschritt. Unterscheiden sich zwei Haplotypen durch mehr als einen Schritt und kommt in dem zugrunde liegenden Datensatz die verbindende Variante nicht vor, dann resultiert dies in einer unbesetzten Position. Graphisch werden solche im Datensatz vorhandenen Haplotypen durch einen Punkt, vorhandene hingegen durch unterschiedlich große Kreise symbolisiert. Je häufiger ein Haplotyp im Datensatz repräsentiert ist, desto größer wird der Kreis dargestellt. Alternative Verbindungen zwischen einzelnen Haplotypen, die eine maschenartige Vernetzung zur Folge haben, sind ein Hinweis auf Widersprüche bzw. Homoplasie im Datensatz. Nach dem Parsimonie-Prinzip, also dem Sparsamkeits-Prinzip, wird genau das Netzwerk angestrebt, welches alle ermittelten Haplotypen abbildet und mit der geringst möglichen Anzahl an Mutationsschritten verbindet. Zur Kalkulation eines solchen Netzwerkes wurde das Programm TCS Version 1.21 (CLEMENT et al. 2000) verwendet, welchem die statistische Parsimonie- Methode zugrunde liegt (TEMPLETON et al. 1992). Das Ausgangsformat zur Kalkulation eines Netzwerkes besteht im Fall von TCS aus Sequenzen. Somit war es nötig, die pro Marker und Akzession bestimmten Fragmentlängen in eine Sequenz umzuschreiben bzw. zu kodieren. Die Anzahl an Positionen wurde über die Anzahl der Basenpaare vom kleinsten bis zum größten detektierten Fragment pro Locus festgelegt. Zur Veranschaulichung folgendes Beispiel: an einem Locus X werden drei Allele mit den Längen 139 bp, 140 bp und 144 bp detektiert. Folglich hätte die Kodierung für diesen Locus sechs Positionen. Die drei fehlenden Allele 141 bp, 142 bp und 143 bp würden in der Kodierung jeweils 57 Material und Methoden als ’gap’ gewertet (’5th state’) und mit einem ’-’ gekennzeichnet. Ist eine der sechs Positionen durch ein Fragment vertreten, so würde sie mit einer der vier Basen, z.B. stets Adenin, kodiert. So ergibt sich für das o.g. Beispiel am Locus X: 139 bp = A-----, 140 bp = AA----, 144 bp = AAAAAA. Entsprechend dieser Methode wurden sämtliche Haplotypen inklusive der ’gaps’ lückenlos in eine Sequenz umgeschrieben, deren Gesamtlänge additiv auf der Anzahl an Positionen pro Locus basiert. 2.4.3 Berechnung der Koeffizienten Gst und Nst Dem auf NEI (1977) zurückgehenden Differenzierungskoeffizienten Gst (vgl. Kapitel 2.3.2) liegt die Annahme einer Population im HARDY-WEINBERG Gleichgewicht zugrunde. Da diese Annahme für natürliche Populationen in der Regel nicht zutrifft, wurde Gst von PONS & PETIT (1995) entsprechend abgeändert: mit und Hierbei ist pki die Frequenz des i-ten Haplotyps in der k-ten Population und pi die Frequenz des i- ten Haplotypen in der Gesamtpopulation, folglich ist Vi die Differenz aller quadrierten pki von allen quadrierten pi. Weiterhin definiert hT die Gesamtdiversität aller untersuchten Populationen. Eine Folge dieser Abänderung ist zum einen, dass Gst auch auf Ebene von Haplotypen oder auf der Basis eines einzelnen Locus anwendbar ist. Zum anderen ergibt sich, dass dieser Wert berechnet werden kann ohne den mengenmäßigen Umfang einer Population mit einzubeziehen, da er auf den Frequenzen und Variationen von Haplotypen innerhalb der Gesamtpopulation beruht anstatt auf dem Mittelwert der Subpopulationen. Zur Kalkulation von Gst diente die Software PERMUTCPSSR Version 2.0 (PONS & PETIT 1996). Zur Überprüfung der Signifikanzen wurden 1.000 Permutationen durchgeführt. Ein weiteres Maß zur Beschreibung der genetischen Differenzierung von haploiden Populationen bietet der Nst-Koeffizient nach PONS & PETIT (1996), der im selben Rechenschritt wie Gst automatisch von der PERMUTCPSSR-Software ermittelt wird. Obwohl in der Aussage sehr ähnlich zu Gst, basiert die Kalkulation dieses Koeffizienten nicht auf zufälligen, sondern auf geordnet betrachteten Haplotypdaten. Im Prinzip kann Gst als ein spezieller Fall von Nst bezeichnet werden, wobei innerhalb von Nst neben den Haplotypfrequenzen auch die genetischen Distanzen zwischen den Haplotypen berücksichtigt werden. Die Formel zur Berechnung von Nst lautet: 58 V i=pki 2− p i 2 hT=1−∑ i p i 2G st= ∑i V i hT N ST= (∑ij π ijc ij) vT Material und Methoden Der Wichtungsfaktor πij fungiert hier als Distanzmaß zwischen den Haplotypen i und j, sodass der Anteil an Verschiedenartigkeit der Allele der untersuchten Haplotypen ausgedrückt wird. Die Kovarianz zwischen pki und pkj (Frequenz des i-ten bzw. j-ten Haplotyps der k-ten Population) wird durch cij ausgedrückt. Auch in dieser Formel ist vT ein Maß für die Gesamtdiversität aller untersuchten Populationen. Der direkte Vergleich von Gst und Nst erlaubt eine Aussage über das Vorhandensein und die Art der genetischen Struktur von Populationen. Ist der Nst-Wert signifikant größer als der Gst-Wert so liegt eine deutliche Strukturierung vor und die jeweils nah verwandten Haplotypen sind in derselben Population lokalisiert. Es herrscht ein Zusammenhang zwischen Haplotypen-Ähnlichkeit und deren geographischer Verbreitung. Sind hingegen beide Werte identisch, so sind die untersuchten Haplotypen unabhängig von ihrer geographischen Verbreitung und Populationszugehörigkeit miteinander verwandt. Kommen aber die am nächsten miteinander verwandten Haplotypen aus unterschiedlichen, geographisch getrennten Populationen vor, so ist Nst signifikant kleiner als Gst (PONS & PETIT 1996). 2.4.4 Genetische Strukturierung Um einen Eindruck von der Strukturierung der F. rusbyi-Individuen zu erhalten, wurde auch mit den plastidären Mikrosatellitendaten eine BAYES`sche Analyse mittels BAPS durchgeführt. Unter Berücksichtigung der konnektiven Natur der plastidären Mikrosatelliten wurde die hier bereitgestellte Option ’clustering of linked loci’ gewählt. Der ermittelte und somit wahrscheinlichste Wert für K diente anschließend als Grundlage für eine AMOVA (vgl. Kapitel 2.3.3), um auch im Rahmen des Datensatzes der plastidären Mikrosatelliten die Verteilung der Variation auf verschiedenen Hierarchie-Ebenen zu bewerten. 59 Ergebnisse 3. Ergebnisse 3.1 DNA-Isolation Die DNA-Isolation aus getrocknetem und frischem Blattmaterial unterschiedlicher Bromelienarten sowohl mittels der Standard-CTAB als auch der abgewandelten CTAB-Methode nach TEL-ZUR et al. (1999) verlief generell problemlos und resultierte jeweils in einer deutlichen Bande im hochmolekularen Bereich. Der Anteil an niedermolekularer DNA war meist verhältnismäßig gering. Die DNA-Gehalte des Probenmaterials wurden über eine Agarose- Gelelektrophorese und einen optischen Intensitätsvergleich mit unterschiedlich konzentrierter DNA des Phagen Lambda nach Ethidiumbromidfärbung abgeschätzt (beispielhaft in Abbildung 3.1). Die DNA-Ausbeuten reichten von weniger als 5 ng/µl bis zu mehr als 100 ng/µl. Umgerechnet auf das Volumen eines Isolationsansatzes entspricht dies einer Gesamtausbeute von 0,5 µg bis 100 µg DNA pro 50 mg getrocknetem bzw. 500 mg frischem Ausgangsmaterial. Abbildung 3.1: Genomische DNA nach gelelektrophoretischer Auftrennung auf einem 0,8%-igen Agarosegel. Beispielhaft abgebildet ist das Ergebnis der DNA-Isolation für die zur 454-Sequenzierung verwendeten Akzessionen von Fosterella rusbyi, Deuterocohnia longipetala und Dyckia marnier-lapostollei var. estevesii. Die Auftragsmenge jeder der drei DNA-Stammlösungen sowie der zur Quantifizierung parallel aufgetragenen Lambda-DNA in fünf definierten Konzentrationen betrug 3 µl. 3.2 In silico-Suche nach Mikrosatellitensequenzen und digitales Primerdesign Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden zahlreiche Mikrosatellitenmarker unterschiedlichen Ursprungs zur Analyse der Populationsgenetik von verschiedenen Bromelienarten aus Gattungen der Unterfamilie Pitcairnioideae entwickelt. Ausgangspunkt für die Etablierung geeigneter Marker war zum einen die Suche innerhalb einer ’expressed sequence tag’ (EST)-Datenbank, zum anderen die Generierung von Sequenzen je einer Art aus drei verschiedenen Gattungen (alle UF Pitcairnioideae) mittels der 454-Pyrosequenzierungstechnik. Nach einer Quantifizierung und 60 Ergebnisse Editierung der EST- bzw. 454-Rohsequenzen erfolgte die Suche und Charakterisierung sämtlicher im jeweiligen Datensatz enthaltener Mikrosatelliten nach einheitlichen Kriterien. Die dabei erhaltenen Daten wurden hinsichtlich der Abundanz und Kopienzahl der einzelnen Mikrosatellitenmotive statistisch ausgewertet. Für alle potenziellen Markerkandidaten mit ausreichender Sequenzinformation wurden in silico flankierende Primerpaare konstruiert. Ausgewählte Primerpaare wurden synthetisiert und im Hinblick auf ihre Funktionalität und Übertragbarkeit in speziell zusammengesetzten Probensets getestet. Im Anschluss an diese Voruntersuchungen erfolgte die Anwendung der am geeignetsten erscheinenden Mikrosatellitenmarker für die eigentlichen populationsgenetischen Untersuchungen. Die einzelnen Schritte bei der Bearbeitung der EST- und 454-Datensätze bis hin zum jeweiligen digitalen Primerdesign stimmten im Wesentlichen überein. Aus diesem Grund und um einen direkten Vergleich zu ermöglichen, werden die mit den vier unterschiedlichen Datensätzen erhaltenen Ergebnisse in den folgenden Kapiteln gemeinsam vorgestellt. 3.2.1 EST-Sequenzen Zum Zeitpunkt der Suche nach verwendbaren EST-Einträgen in öffentlichen Datenbanken (Dezember 2010) bildete die von MOYLE et al. (2005) entwickelte PineappleDB (Ananas comosus) die einzige öffentlich zugängliche Quelle für ESTs innerhalb der Familie der Bromeliaceae. Die in der Datenbank enthaltenen insgesamt 5.659 Sequenzen mit einer durchschnittlichen Länge von ca. 730 bp wurden von GenBank heruntergeladen und dienten als Basis zur Entwicklung von EST- Mikrosatellitenmarkern (vgl. Kapitel 2.2.2.1). Die Assemblierung des EST-Datensatzes lieferte 3.389 Unigenes, welche aus 824 Contigs und 2.565 nicht assemblierten Singletons zusammengesetzt waren (digitaler Anhang DA-1). Insgesamt variierten die Sequenzlängen der Unigenes zwischen 129 bp und 3.162 bp. Die Sequenzen beliefen sich auf einen Gesamtumfang von 2.840 kb, der GC-Gehalt betrug 43,6%. 3.2.2 454-Sequenzen Jeweils eine Akzession der drei Arten Fosterella rusbyi, Dyckia marnier-lapostollei und Deuterocohnia longipetala (UF Pitcairnioideae) wurden in Kooperation mit Dr. F. KRAPP (Universität Kassel) und Dr. B. HUETTEL (MAX-PLANCK-Institut für Züchtungsforschung Köln) basierend auf der 454-Technik sequenziert (vgl. Kapitel 2.2.2.2). Eine detaillierte und vergleichende Übersicht der dabei erhaltenen Daten ist in Tabelle 3.1 aufgelistet. Im Einzelnen lieferte die 454-Pyrosequenzierung 61 Ergebnisse nach dem Entfernen der spezifischen MID-Adapter insgesamt 73.027 Einzelsequenzen für F. rusbyi, 59.624 für Dy. marnier-lapostollei und 25.827 für D. longipetala mit einer durchschnittlichen Länge von 314 bp, 330 bp sowie 337 bp. Das Spektrum an Sequenzlängen erwies sich bei allen drei Arten als ähnlich; die Mehrzahl der Sequenzen war zwischen 300 und 500 Basen lang. Der gemittelte GC- Gehalt lag bei 38,2% (F. rusbyi), 40,7% (D. longipetala) und 43,3% (Dy. marnier-lapostollei). Tabelle 3.1: Ergebnisse und Statistik der 454-Sequenzierung von F. rusbyi, Dy. marnier-lapostollei und D. longipetala. Für jede Art ist die Verteilung der Sequenzen einer bestimmten Länge, der resultierende prozentuale Anteil bezogen auf die Gesamtzahl der Sequenzen, sowie deren gemittelte Länge und GC-Gehalt angegeben. Der untere Abschnitt repräsentiert die Ergebnisse der Assemblierung. Die assemblierten Contigs bilden zusammen mit den Singletons die Unigenes. In Klammern ist zusätzlich die genaue Zahl der zu Contigs assemblierten Sequenzen angegeben. Länge der Sequenzen Anzahl der Sequenzen und ihr prozentualer Anteil am Gesamtdatensatz Fosterella Dyckia Deuterocohnia 1 – 100 bp 6.484 9% 5.876 10% 1.876 7% 101 – 200 bp 7.575 11% 6.642 11% 2.862 11% 201 – 300 bp 9.272 13% 6.968 12% 3.767 15% 301 – 400 bp 17.993 25% 13.361 22% 7.345 28% 401 – 500 bp 26.084 36% 21.181 36% 8.507 33% 501 – 600 bp 5.600 8% 5.588 9% 1.468 6% 601 – 700 bp 16 0% 7 0% 2 0% 701 – 800 bp 0 0% 0 0% 0 0% > 800 0 0% 0 0% 0 0% Gesamtzahl der Sequenzen 73.027 59.624 25.827 Gemittelte Länge 314 bp 330 bp 337 bp Gesamtzahl der sequenzierten Basen 24.988.232 20.395.498 8.703.874 Durchschnittlicher GC-Gehalt 38,2% 43,3% 40,7% Contigs (assemblierte Sequenzen) 11.682 (65.566) 6.948 (54.026) 3.575 (21.643) Singletons 7.461 5.598 4.184 Unigenes 19.143 12.546 7.759 Durch Assemblierung der Rohdaten wurden für F. rusbyi insgesamt 19.143 Unigenes generiert, die aus 11.682 Contigs und 7.461 Singletons zusammengesetzt waren (digitaler Anhang DA-2). Entsprechend bestanden die 12.546 assemblierten Unigenes von Dy. marnier-lapostollei aus 6.948 Contigs und 5.598 Singletons (digitaler Anhang DA-3), und die 7.759 Unigenes von D. longipetala aus 3.575 Contigs und 4.184 Singletons (digitaler Anhang DA-4; Tabelle 3.1). 3.2.3 Identifizierung, Häufigkeit und Charakterisierung der Mikrosatelliten Ein Mikrosatellit wurde als eine DNA-Sequenz mit einer bestimmten Anzahl an Wiederholungseinheiten (Mono- bis Hexanukleotid-Wiederholungen) definiert (vgl. Tabelle 2.1). Tabelle 3.2 stellt die Verteilung und Häufigkeit der einzelnen, in den EST- und 454-Datensätzen gefundenen Mikrosatellitentypen zusammen, aufgegliedert nach der Länge der jeweiligen Wiederholungseinheit. Insgesamt wurden in Fosterella, Dyckia, Deuterocohnia und Ananas 2.796, 1.587, 584 sowie 696 perfekte Mikrosatelliten gefunden, was einer Häufigkeit von jeweils einem perfekten Mikrosatelliten pro 4,1 kb (Ananas), pro 5,6 kb (Fosterella und Dyckia) und pro 7,1 kb 62 Ergebnisse (Deuterocohnia) entspricht. In allen Datensätzen waren die Dinukleotid-Wiederholungen am häufigsten vertreten, mit einem prozentualen Anteil zwischen 38,4% (Ananas) und 55,6% (Dyckia). Am zweithäufigsten kamen Trinukleotid-Wiederholungen vor (zwischen 19,5% und 38,1%), gefolgt von den Mononukleotid-Wiederholungen (12,6% bis 17,1%). Trinukleotid-Wiederholungen waren erwartungsgemäß in den aus genischen Regionen stammenden EST-Datensätzen der Ananas deutlich stärker vertreten als in den 454-Datensätzen (vgl. Abschnitt 1.2.1). Alle übrigen Motive (Tetra- bis Hexanukleotid-Wiederholungen) repräsentierten zusammengenommen nur durchschnittlich 12,4% aller gefundenen Mikrosatelliten. Tabelle 3.2: Vergleichende Übersicht zur Verteilung und Häufigkeit der Mikrosatelliten-Wiederholungseinheiten innerhalb der drei assemblierten 454-Datensätze (Fosterella rusbyi, Dyckia marnier-lapostollei und Deuterocohnia longipetala) sowie des assemblierten EST-Datensatzes (Ananas comosus; MOYLE et al. 2005). In den drei Spalten unterhalb der jeweiligen Gattungsnamen findet sich jeweils die Gesamtanzahl detektierter Mikrosatelliten (SSRs), der prozentuale Anteil des jeweiligen Mikrosatellitentyps (Art der Wiederholungseinheit) bezogen auf die Gesamtanzahl (%), sowie die errechnete Häufigkeit des jeweiligen Mikrosatellitentyps pro Kilobase (SSR/kb). An dieser Stelle sei auf die abweichenden Suchkriterien für EST- und 454-Mikrosatelliten hingewiesen (siehe Tabelle 2.2). Art der Wiederholungs- einheit Fosterella Dyckia Deuterocohnia Ananas SSRs % SSR/kb SSRs % SSR/kb SSRs % SSR/kb SSRs % SSR/kb Mononukleotide 351 12,6 44,3 229 14,4 39,0 100 17,1 41,3 115 16,5 24,7 Dinukleotide 1.536 54,9 10,1 883 55,6 10,1 278 47,6 14,9 267 38,4 10,6 Trinukleotide 581 20,8 26,8 309 19,5 28,9 130 22,3 31,8 265 38,1 10,7 Tetranukleotide 128 4,6 121,6 75 4,7 119,1 30 5,1 137,8 22 3,2 128,7 Pentanukleotide 92 3,3 166,2 46 2,9 194,1 21 3,6 196,8 12 1,7 235,9 Hexanukleotide 108 3,9 144,1 45 2,8 198,5 25 4,3 165,3 15 2,2 188,7 Gesamt 2.796 100 5,6 1.587 100 5,6 584 100 7,1 696 100 4,1 Von den 501 Kombinationsmöglichkeiten redundanzfreier Mono- bis Hexanukleotid- Mikrosatellitenmotive (JURKA & PETHIYAGODA 1995) wurden insgesamt 107 im Datensatz von Fosterella, 76 in Dyckia, 55 in Deuterocohnia und 38 in Ananas gefunden. Alle Einzelmotive und ihre jeweiligen Frequenzen sind in den Tabellen T3 bis T6 (Anhang) im Detail aufgelistet. Es zeigte sich ein deutliches Ungleichgewicht zwischen den einzelnen Motiven. So war (AG)n mit mehreren hundert Loci in jedem Datensatz das am stärksten vertretene Einzelmotiv, wohingegen (CG)n lediglich zweimal (Ananas und Deuterocohnia), dreimal (Dyckia), bzw. sechsmal (Fosterella) detektiert wurde. Das (AT)n-Motiv war in den 454-Datensätzen nahezu ebenso häufig wie (AG)n, nicht jedoch im EST-Datensatz der Ananas, wo es vergleichsweise selten auftauchte. Auch bei den Trinukleotid-Wiederholungen ergaben sich Unterschiede zwischen den EST- und 454-Daten, mit (AAT)n bzw. (ACG)n als jeweils häufigstem Motiv, gefolgt von (AAG)n in den 454- und (AGG)n sowie (AAG)n im EST-Datensatz. Von den beiden möglichen (standardisierten) Mononukleotid- Wiederholungseinheiten war das (A)n-Motiv mit großem Abstand häufiger als das (C)n-Motiv, das in den drei 454-Datensätzen lediglich mit einem durchschnittlichen Anteil von 5,8% vertreten war und im EST-Datensatz völlig fehlte. Insgesamt lässt sich festhalten, dass AT-reiche Motive in allen Datensätzen überwiegen, und dass sich bezüglich der Verteilung der einzelnen Motive 63 Ergebnisse deutliche Unterschiede zwischen den Mikrosatelliten aus ESTs auf der einen und aus 454- Sequenzen auf der anderen Seite zeigen (Tabellen T2 bis T5, Anhang). 3.2.4 Digitales Primerdesign Aufgrund der häufig schwierigen Auswertbarkeit (GUICHOUX et al. 2011) der von Mononukleotid- Wiederholungen abhängigen Mikrosatellitenmarker wurden nur Di- bis Hexanukleotid- Wiederholungen als potenzielle Kandidaten zur Markerentwicklung herangezogen. Flankierende Sequenzen von ausreichender Länge und adäquater Qualität zur Primersynthese waren in jedem der vier Datensätze in durchschnittlich 82% der Fälle vorhanden. Insgesamt konnten flankierende Primerpaare für 2.178 Mikrosatellitenloci aus Fosterella, 1.165 aus Dyckia, 400 aus Deuterocohnia und 537 aus Ananas digital generiert werden. Die Effizienz der Primerentwicklung für Mikrosatellitenloci der einzelnen Motivtypen wird in Tabelle 3.3 zusammengestellt, alle Primerpaare sind im digitalen Anhang DA-5 aufgelistet. Ausgewählte Primerpaare aus dem Deuterocohnia-Datensatz wurden im Rahmen einer von mir betreuten Bachelorarbeit (ZENK 2012) bereits synthetisiert, getestet und zur Beantwortung einer biologischen Fragestellung eingesetzt. Dieser Aspekt ist nicht Gegenstand der vorliegenden Arbeit. Die in den Kapiteln 3.2.2 bis 3.2.4 dargestellten Ergebnisse des Deuterocohnia-Datensatzes dienen ausschließlich einer vergleichenden Analyse der zugrunde liegenden Sequenzen. Tabelle 3.3: Effizienz der Entwicklung von Mikrosatelliten-flankierenden Primerpaaren innerhalb der drei assemblierten 454-Datensätze (Fosterella rusbyi, Dyckia marnier-lapostollei und Deuterocohnia longipetala) sowie des assemblierten EST-Datensatzes (Ananas comosus; MOYLE et al. 2005) mit der jeweiligen Anzahl an zugrunde liegenden Unigenes (in Klammern). Das Primerdesign erfolgte für alle vier Datensätze mittels der Software BATCHPRIMER3 (YOU et al. 2008) unter gleichen Bedingungen. Sequenzen mit Mononukleotid-Wiederholungen wurden nicht für das Primerdesign verwendet. Assemblierte Datensätze Fosterella Dyckia Deuterocohnia Ananas (19.143) (12.546) (7.759) (3.389) Gesamtzahl gefundener SSRs 2.796 1.587 584 696 SSR-enthaltende Sequenzen 2.083 1.177 435 421 Generierte Primerpaare 2.178 1.165 400 537 Dinukleotide 1.348 746 219 240 Trinukleotide 537 271 117 251 Tetranukleotide 116 67 25 21 Pentanukleotide 85 41 17 14 Hexanukleotide 92 40 22 11 Sequenzen ohne Primerpaare 17.060 11.369 7.324 2.968 64 Ergebnisse 3.3 Nukleäre Mikrosatellitenmarker 3.3.1 Acom-Loci (Ananas comosus, EST-Datenbank) 3.3.1.1 Pilotstudien Aus den insgesamt 537 zur Verfügung stehenden Mikrosatellitenloci (Kapitel 3.2.4, Tabelle 3.3) innerhalb des EST-Datensatzes wurden 48 Primerpaare entsprechend der in Kapitel 2.2.3.3 aufgeführten Kriterien selektiert und synthetisiert. Neben einem Tetranukleotid- Mikrosatellitenmotiv wurden ausschließlich Di- und Trinukleotid-Wiederholungen ausgewählt (digitaler Anhang DA-5). Die Primerpaare wurden mit dem Akronym ’Acom’ (für Ananas comosus) und einer Identifizierungsnummer versehen und zunächst genutzt, um ein kleines Probenset bestehend aus vier Ananas comosus-Akzessionen, einer Akzession von A. bracteatus sowie einer Akzession einer unbestimmten Ananas-Art zu amplifizieren (Set 1, Tabelle T2 im Anhang). Sämtliche Reaktionen wurden mit demselben PCR-Programm (’TD 64-54’) durchgeführt und die Produkte anschließend auf 1,5%-igen Agarosegelen elektrophoretisch aufgetrennt. Alle dabei erhaltenen Gelbilder sind der Abbildung A1 (Anhang) zu entnehmen. Von den 48 getesteten Primerpaaren generierten 38 (79%) ein deutliches PCR-Produkt in jeder der sechs Akzessionen des Sets 1, wobei in drei Fällen (Acom_9.9, Acom_85.3, Acom_86.4) Mehrfachbanden für die beiden Proben BT_17 und BT_19 beobachtet wurden. Vierzig Primerpaare (83%) lieferten ein PCR-Produkt für alle vier A. comosus-Akzessionen. An sechs Loci (Acom_50.7, Acom_62.20, Acom_70.2, Acom_89.3, Acom_90.1, Acom_114.12) wurde für keine der untersuchten Ananas-Akzessionen ein sichtbares PCR-Produkt erzeugt. An zwei Loci (Acom_5.5, Acom_49.6) fiel jeweils die Probe BT_16 aus, an den Loci Acom_49.6 und Acom_111.8 auch die Probe BT_18. Basierend auf den Ergebnissen dieser ersten Testreihe wurden 18 Primerpaare für weiterführende Analysen selektiert (vgl. Tabelle 3.4), fluoreszenzmarkiert und für die Genotypisierung eines zweiten Probensets, bestehend aus 27 Ananas-Akzessionen und einer Akzession von Pseudananas sagenarius angewendet (Set 2, Tabelle T2 im Anhang). Die für die ausgewählten 18 Mikrosatellitenloci auf hochauflösenden PAA-Gelen erzeugten Bandenmuster waren durchgehend von hoher Qualität und komplikationslos auszuwerten, was durch Abbildung 3.2 beispielhaft an zwei Loci veranschaulicht ist. Eine Darstellung der spezifischen Bandenmuster an allen 18 Loci innerhalb eines repräsentativen Sets ist der Abbildung A4 (Anhang) zu entnehmen. 65 Ergebnisse Tabelle 3.4: Eigenschaften von 18 ausgewählten EST-Mikrosatellitenmarker aus einer EST-Datenbank von Ananas comosus (MOYLE et al. 2005). Angegeben sind die jeweiligen Motivtypen, die Primer-Sequenzen, die erwarteten Fragmentgrößen in Basenpaaren, die gemittelte Anlagerungs- Temperatur (Ta) sowie die GenBank-Akzessionsnummer der Original-EST-Sequenz. Marker Motiv Primer-Sequenz (5'-3') Größe (in bp) Ta (°C) GenBank-Akzessionsnummer Acom_9.9 (TTC)8 TTTAATCGGGTGGAGTAAGGA 149 59,2 DT337383GCCAATATGAACAGGGGAAA Acom_12.12 (TTC)7 TAGAGGTCGGGAGAACGAAA 204 59,9 DT335877GCGGAGGCTACTGATGCTAC Acom_22.22 (AAG)6 CCACAACAACGAGAGAACCA 196 60,1 DT336678AAAAGACACCTTGCGAGCAC Acom_39.5 (TGG)6 CCGTTGAGATCGGAGAAATG 199 60,4 CO731649ACCACACATGAGCAAAACGA Acom_64.22 (TCC)5 CTCCTCATCTACCGCACCTC 199 59,9 DT338176CCCTAGACGACGACGAAGAG Acom_65.1 (AGT)5 GGCACAATTTTTGTGGCTGT 194 60,4 CO731264GAGGATGGAGAAACCCATGA Acom_67.2 (AT)10 CATCCATCCATCCATCCAAT 191 60,0 DT336954GTCGTTGATCATTCGCAAAA Acom_68.3 (AT)8 AAGCGCAGGTTCGTAATTTG 205 60,2 DT336292TCGAAATCCACAGAACACCA Acom_71.3 (ATG)7 TGCTCTGTTGCTGATGAGGT 200 60,0 DT338035CCAGCCTCTCCTTCTCCTTC Acom_78.4 (GT)14 GCAAATGAGGCCACAAACTT 197 59,6 DT336561GGGTGGTGTGGACTTTCTCT Acom_82.8 (GT)10 CCCTGAAGGTGGAGATTGTG 166 59,9 DT337038AAAAACCAAAACCCTGGACA Acom_86.4 (GTT)11 GCATGCCAAAGGAAAGAGTT 178 59,8 DT336932CCCTGAACAAATCACCCAAC Acom_91.2 (GGC)9 AGAAGCGGAAGCGTGTTG 197 59,9 CO731629GCGGAGATCGAAGCACTC Acom_93.4 (CCG)6 CCAAATTCACCACCGAAGAC 189 60,2 DT337663GCAATCTCAAAGCCATCCAT Acom_101.1 (CGT)12 CGAGAGAGATTGTGCGTTTG 191 59,6 DT337868GGGGGAACACACTGCTAAAG Acom_109.6 (CT)25 CTTTTGCTCAGAAAGCAGGTT 198 59,7 DT336852TGCGTGCTTGACCTCTGTTA Acom_117.15 (CT)20 GCAACCCCAATACCCTAACC 208 60,9 DT335782GTACTCCGCCATTGTTGGTG Acom_119.1 (CTTT)7 TTCTGATCAATGAGTGGACACC 213 60,1 DT338083TCCTGAATCCAAAGGCAAAG Abbildung 3.2: Spezifisches Bandenmuster an zwei ausgewählten EST-Mikrosatellitenloci nach Auftrennung auf hochauflösenden 6%-igen PAA- Gelen (Set 2). Die linke Seite zeigt das Bandenmuster am Locus Acom_9.9, die rechte Seite das Bandenmuster am Locus Acom_12.12. Auftragsreihenfolge (v.l.n.r.): 1-10 = A. comosus, 11 = A. comosus var. erectifolius, 12 = A. comosus var. porteanus, 13-17 = A. bracteatus, 18-22 = A. nanus, 23+24 = A. ananassoides, 25 = A. fritzmuelleri, 26 = A. lucidus, 27 = A. spec., 28 = Pseudananas sagenarius. In den durch ’S’ gekennzeichneten Bahnen wurde jeweils ein Längenstandard zur Abschätzung der Fragmentlängen (in bp) aufgetragen. Darstellung leicht verändert nac h WÖHRMANN & WEISING (2011). 66 Ergebnisse 3.3.1.2 Assoziation der EST-Mikrosatelliten mit Genfunktionen Um eine Assoziation der EST-Mikrosatelliten mit möglichen Genfunktionen zu ermitteln, wurde für diejenigen EST-Sequenzen, die den 18 ausgewählten Markern zugrunde liegen, eine BLAST- Analyse durchgeführt. Dazu wurde jede Sequenz individuell mit einer als Referenz fungierenden Datenbank von Oryza sativa in NCBI (GenBank) verglichen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3.5 zusammengefasst. Insgesamt 15 der untersuchten ESTs zeigten signifikante Ähnlichkeiten zu Einträgen in dieser Protein-Datenbank, dabei handelte es sich in sechs Fällen um hypothetische oder unbekannte Proteine. Im Fall der übrigen neun Sequenzen war eine exaktere Zuordnung möglich. So kodiert beispielsweise die Sequenz am Locus Acom_68.3 mit hoher Wahrscheinlichkeit für eine Serin / Threonin-Proteinkinase. Für drei der ESTs (Acom_9.9, Acom_82.8 und Acom_117.15) blieb die Suche nach signifikanten Homologien zur O. sativa- Datenbank ohne Ergebnis. Tabelle 3.5: Ergebnisse einer BLAST-Analyse von 18 ausgewählten EST-Mikrosatellitenmarkern in einer als Referenz fungierenden Datenbank von Oryza sativa in NCBI (GenBank). Marker BLAST Homologien gegen Oryza sativa E-Wert Acom_9.9 Keine signifikante Homologie − Acom_12.12 Serin-O-Acetyltranferase 2 4e-98 Acom_22.22 Unbekanntes Protein 1e-65 Acom_39.5 Auxin-unterdrückendes Protein ARP1 (Protein-ähnlich) 2e-30 Acom_64.22 Exprimiertes Protein unbekannter Funktion 3e-47 Acom_65.1 Spermin-Synthase (mutmaßlich) 1e-137 Acom_67.2 Hypothetisches Protein 1e-23 Acom_68.3 Serin/Threonin-Proteinkinase 6e-04 Acom_71.3 Hypothetisches Protein 1e-16 Acom_78.4 Unbekanntes Protein 6e-16 Acom_82.8 Keine signifikante Homologie − Acom_86.4 Raffinose-Synthase oder Samen-Imbibitionsprotein 1e-36 Acom_91.2 Calcineurin B-ähnliches Protein 1e-80 Acom_93.4 Methylthioadenosin / S-Adenosyl- Homocysteinnukleosidase 1e-94 Acom_101.1 Unbekanntes Protein 3e-27 Acom_109.6 REG-Rezeptor (mutmaßlich) 4e-77 Acom_117.15 Keine signifikante Homologie − Acom_119.1 Hypothetisches Protein 7e-10 3.3.1.3 Anwendbarkeit der EST-Marker in den Gattungen Ananas und Pseudananas: Verwandtschaftsanalysen Alle 18 ausgewählten EST-Mikrosatellitenloci waren auf intraspezifischer Ebene in 12 Akzessionen von A. comosus polymorph. Über alle Loci hinweg wurden zwischen zwei und sechs Allelen detektiert, was einem gemittelten Wert von 4,3 entspricht (Tabelle 3.6). Die durchschnittliche erwartete Heterozygotie (He) lag bei 0,58 und die durchschnittliche beobachtete Heterozygotie (Ho) bei 0,49 (Tabelle 3.6). An zwei Loci (Acom_22.22 und Acom_91.2) 67 Ergebnisse wurden Fragmentlängen ermittelt, die den Erwartungswert deutlich überstiegen. Dies ist möglicherweise auf die Anwesenheit eines Introns zwischen den beiden Primerbindestellen zurückzuführen. Sechzehn der 18 Primerpaare amplifizierten das gewünschte PCR-Produkt auch in allen Akzessionen der übrigen Ananas- und Pseudananas-Arten (Set 2, Tabelle T2 im Anhang). Nicht amplifiziert wurden hingegen die DNAs sämtlicher A. nanus-Akzessionen an den beiden Loci Acom_39.5 und Acom_67.2 sowie einer Akzession von A. ananassoides am Locus Acom_39.5. Übereinstimmend mit dem homozygoten oder heterozygoten Status am entsprechenden Locus wurden typischerweise entweder eine oder zwei Banden je Ananas-Akzession detektiert. In Pseudananas sagenarius wurden an insgesamt sechs Loci (Acom_9.9, Acom_12.12, Acom_78.4, Acom_86.4, Acom_101.1, Acom_109.6) drei bis vier Banden generiert (vgl. Abbildung 3.2, Spur 28 auf der rechten Seite), was mit dem tetraploiden Status dieser Art erklärt werden kann (COLLINS 1960; DUVAL et al. 2001). Tabelle 3.6: Funktionalität und Übertragbarkeit von 18 ausgewählten EST-Mikrosatellitenmarkern. Na Allelzahl, Ho/He beobachtete und erwartete Heterozygotie in 12 Akzessionen von Ananas comosus, neun Akzessionen von Deuterocohnia brevifolia sowie 24 Akzessionen von Fosterella rusbyi. Signifikante Abweichungen vom HARDY-WEINBERG Gleichgeweicht (p-Wert < 0,05) sind durch einen entsprechenden „fett“ gedruckten Ho-Wert hervorgehoben (diese Analyse wurde nur für A. comosus durchgeführt). Marker A. comosus (N = 12) D. brevifolia (N = 9) F. rusbyi (N = 24) Na Ho He Na Ho He Na Ho He Acom_9.9 6 0,92 0,75 3 0,78 0,65 0 − − Acom_12.12 4 1,00 0,69 3 0,56 0,62 1 − − Acom_22.22 2 0,08 0,08 0 − − 0 − − Acom_39.5 4 0,42 0,66 0 − − 0 − − Acom_64.22 3 0,33 0,30 0 − − 2 0,00 0,16 Acom_65.1 2 0,17 0,29 0 − − 0 − − Acom_67.2 4 0,42 0,72 5 0,78 0,69 0 − − Acom_68.3 4 0,42 0,63 0 − − 1 − − Acom_71.3 6 0,00 0,78 4 0,56 0,66 5 0,13 0,65 Acom_78.4 5 0,58 0,61 0 − − 1 − − Acom_82.8 5 0,58 0,57 0 − − 1 − − Acom_86.4 6 0,58 0,77 3 0,71 0,65 0 − − Acom_91.2 5 0,92 0,77 0 − − 0 − − Acom_93.4 2 0,17 0,16 1 − − 0 − − Acom_101.1 5 0,92 0,63 5 0,57 0,77 2 1,00 0,51 Acom_109.6 5 0,33 0,74 1 − − 1 − − Acom_117.15 5 0,58 0,64 4 0,14 0,74 9 0,00 0,84 Acom_119.1 4 0,33 0,60 3 0,11 0,31 0 − − 4,3 0,49 0,58 3,2 0,53 0,63 4,5 0,13 0,24 Um die genetische Divergenz bzw. die Verwandtschaftsverhältnisse zwischen den in Set 2 vereinigten 28 Akzessionen der Gattungen Ananas und Pseudananas zu illustrieren wurde der Datensatz einer Hauptkoordinaten-Analyse (’principal coordinates analysis’, PCoA) in einem zweidimensionalen Raum unterzogen (Abbildung 3.3). Hierbei reflektieren die ersten beiden Achsen (Dim-1 und Dim-2) zusammen ca. 50% der Gesamtvariation. Über alle 18 Loci hinweg 68 Ergebnisse erwiesen sich jeweils vier Paare bzw. Dreiergruppen als genetisch identisch und wiesen die gleichen Mikrosatelliten-Genotypen auf: (1) BT_77 und BT_81 (beide A. comosus), (2) BT_79 und BT_85 (beide A. comosus), (3) BT_73, BT_80 (beide A. bracteatus) und BT_75 (A. comosus) sowie (4) BT_84, BT_86 und BT_90 (alle A. nanus). Alle übrigen Akzessionen besaßen einen einzigartigen Genotyp. Die Punktewolken der PCo-Analyse bildeten vier lockere Gruppen (in der Abbildung 3.3 farbig eingekreist), wobei die erste Gruppe neun der insgesamt zehn A. comosus-Akzessionen sowie eine A. comosus var. porteanus-Akzession umfasste. Die zweite Gruppe enthielt alle A. nanus- Akzessionen, die dritte Gruppe alle bis auf eine A. bracteatus-Akzession zusammen mit einem offenbar aberranten A. comosus-Individuum und die vierte beide A. ananassoides-Akzessionen. Die übrigen Individuen bildeten keine deutliche Gruppierung. Abbildung 3.3: Zweidimensionale PCo-Analyse basierend auf den Mikrosatellitendaten und dem Unähnlichkeits-Koeffizienten nach BRAY & CURTIS (1957) an 18 EST-Mikrosatellitenloci und 10 Ananas comosus-Akzessionen, je einer Akzession von A. comosus var. erectifolius, A. comosus var. porteanus, A. lucidus, A. fritzmuelleri und einer unbestimmten Ananas-Art, je fünf Akzessionen von A. bracteatus und A. nanus, zwei Akzessionen von A. ananassoides sowie einer Akzession von P. sagenarius. Jede Art ist durch eine individuelle Farbkodierung gekennzeichnet. Die im Text näher bezeichneten Gruppen sind durch farbige Kreise hervorgehoben. Die ersten beiden Dimensionen reflektieren zusammen 49% der Gesamtvariation des Datensatzes (Dim-1 = 28,4%, Dim-2 = 20,6%). 69 Ergebnisse 3.3.1.4 Übertragbarkeit der EST-Mikrosatellitenmarker aus Ananas comosus auf andere Gattungen der Bromeliaceae Neben dem Nachweis der Funktionalität der entwickelten EST-Mikrosatellitenmarker innerhalb der Gattungen Ananas und Pseudananas war die Abschätzung der Übertragbarkeit der Marker innerhalb der Familie der Bromeliaceae ein wichtiger Aspekt der vorliegenden Arbeit. Für diese Untersuchungen wurde zunächst ein Probenset zusammengestellt, das 74 Arten aus 30 Gattungen und sechs der acht Unterfamilien repräsentierte (Set 3; Tabelle T2 im Anhang und Tabelle 3.7). Das Pflanzenmaterial stammte überwiegend aus Botanischen Gärten (vgl. Tabelle 3.7 und Tabelle T1 im Anhang). Die mit den 18 Mikrosatellitenmarkern erhaltenen PCR-Produkte wurden auf hochauflösenden PAA-Gelen aufgetrennt und die Fragmentlängen manuell bestimmt (vgl. Kapitel 2.2.7). Die Ergebnisse sind in Tabelle 3.7 detailliert aufgelistet. Die Übertragbarkeit eines Markers wurde nur dann als erfolgreich eingestuft, wenn entweder eine oder zwei distinkte Banden an entsprechender Stelle im Sequenziergel zu beobachten waren. Nach Maßgabe dieses Kriteriums variierte die Übertragbarkeit zwischen einem Minimum von 6,8% für den Locus Acom_65.1 und einem Maximum von 97,3% für den Locus Acom_12.12, bei einem gemittelten Wert von 53,8% (Tabelle 3.7, vorletzte Spalte). Elf der 18 Loci erwiesen sich als besonders gut konserviert und erzeugten in mehr als 55% der untersuchten Akzessionen ein entsprechendes PCR-Produkt. Lediglich ein Primerpaar (Acom_39.5) lieferte außerhalb der Gattungen Ananas und Pseudananas kein einziges Amplifikat. Bezogen auf die sechs Unterfamilien lässt sich folgender Trend beobachten: die höchste Erfolgsquote (68%) der Marker- Übertragbarkeit wurde innerhalb der Bromelioideae ermittelt (die gleiche Unterfamilie, zu der auch die Gattungen Ananas und Pseudananas gezählt werden), gefolgt von den Puyoideae (60%), Pitcairnioideae (51,1%), Hechtioideae (42,6%), Tillandsioideae (27,3%) und Brocchinioideae (19,5%). Vergleicht man diese Werte mit der aktuellen molekularen Phylogenie der Bromeliaceen (GIVNISH et al. 2011), so ergibt sich ein deutlicher inverser Zusammenhang zwischen dem Verwandtschaftsgrad und der Effizienz der Marker-Übertragbarkeit. Ein Mikrosatellitenmarker kann nur dann als ’übertragbar’ im eigentlichen Sinne gelten, wenn er in der Zielart nicht nur amplifiziert wird, sondern dort auch innerartliche Variation aufweist und daher für populationsgenetische Studien eingesetzt werden kann. Die Arbeitsgruppe Systematik und Morphologie der Pflanzen an der Universität Kassel beschäftigt sich insbesondere mit Arten der Bromelien-Unterfamilie Pitcairnioideae. 70 Ergebnisse Tabelle 3.7: Ergebnisse der Übertragbarkeitsstudien von 18 EST-Mikrosatellitenmarkern aus Ananas comosus (EST-Datenbank generiert durch MOYLE et al. 2005) in Pflanzenset 3, bestehend aus 74 Arten aus sechs Unterfamilien der Bromeliaceae (30 Gattungen). Symbolerläuterung: + ein oder zwei distinkte PCR-Produkte im Sequenziergel; (+) drei oder mehr Banden im PAA-Gel; - kein sichtbares PCR-Produkt. Die sowohl für die einzelnen Marker als auch für die einzelnen Arten errechneten prozentualen Angaben basieren ausschließlich auf den durch ’+’ gekennzeichneten Zellen. ID-Nr. Art Acom9.9 Acom 12.12 Acom 22.22 Acom 39.5 Acom 64.22 Acom 65.1 Acom 67.2 Acom 68.3 Acom 71.3 Acom 78.4 Acom 82.8 Acom 86.4 Acom 91.2 Acom 93.4 Acom 101.1 Acom 109.6 Acom 117.15 Acom 119.1 Total (in %) Ø BT_21 Acanthostachys pitcairnioidea + + + - + - + - + + + + + - + + + - 72,2 BT_24 Aechmea chantinii + + + - + - - + + + + + + + + + + + 83,3 BT_22 Ae. allenii + + + - + - - + + + + + + - + - + + 72,2 BT_23 Ae. biflora + + + - - - + + + + + + + (+) + + - - 66,7 F 9a Ae. kertesziae - + + - + - + + + + + + + + + + + + 83,3 BT_26 Ae. orlandiana + + + - + - + + + + + + + (+) + + + + 83,3 BT_30 Billbergia pyramidalis - + + - + - - + + + + + + (+) + + + - 66,7 BT_92 Bromelia balansae (+) + - - (+) + - + (+) + - - - - + - + - 33,3 BT_32 B. laciniosa + + + - + - - - (+) + + + - - + + + - 55,6 BT_6 B. karatas - + - - + + - - + + + + - - + - + - 50 BT_93 B. plumieri - + - - + + - - + + - + - - + - - - 38,9 F 12a B. serra + + - - + + - + + + + + - - + + + + 72,2 BT_37 Cryptanthus acaulis - + + - + - + + + + - + + + + + + + 77,8 BT_38 C. fosterianus - + + - + - + - + + + + + + + - + + 72,2 68 % BT_39 C. microglazioui - + + - + - + - + + - + + + + - - + 61,1 BT_40 Deinacanthon urbanianum - + - - + - - + (+) + - + + - + - + + 50 BT_41 Disteganthus basilateralis + + + - + - + + - + + + - + + + + + 77,8 BT_42 Edmundoa lindenii - + + - + - + - + + + + + + + + + + 77,8 BT_44 Greigia sphacelata + + + - + - + + + + - + - - + + + + 72,2 BT_51 Hohenbergia leopoldo-horstii - + + - + - - + + + + + + + + + + + 77,8 BT_52 Hohenbergiopsis guatemalensis - + - - + - + + + + + + + (+) + + + + 72,2 BT_53 Lymania alvimii + + + - + - - + + + + + + + + + + + 83,3 BT_54 L. smithii + + + - + - - + + + + + + (+) + + + + 77,8 F 28a Neoregelia binotii - + - - + - + - + + + + + - + + + + 66,7 F 29a N. laevis - + + - + - + + + + + + - (+) + + + + 72,2 BT_57 Ochagavia carnea + + + - (+) + + + + + + + - + + + + + 83,3 BT_59 Portea kermesiana - + + - + - + + + - (+) + + + + + + + 72,2 BT_60 Po. leptantha - + + - + - + + + - + + + + + + + + 77,8 BT_72 Ursulaea tuitensis + + - - + - - - - - - + - - - - - - 22,2 Bromelioideae (in %): 44,8 100 72,4 0 89,7 17,2 55,2 69 82,8 89,7 72,4 96,6 65,5 41,4 96,6 72,4 86,2 72,4 — N 106 Deuterocohnia brevifolia + + + - + - + + + - - + + - + + + + 72,2 F 43a D. glandulaosa + + - - + - + - + + - + + - + + + + 66,7 N 289 D. meziana + + - - + - + - + + - - - - + + + + 55,6 F 45a D. scapigera (+) + - - + - + - + + - - - - + (+) + + 44,4 FK0021 Dyckia chorislaminea + + - - + - - - + - + + - - + + + + 55,6 FK0001 Dy. estevesii + + - - + - - - - - + + - - + + + + 50 FK0020 Dy. ferox + + - - + - + - - - + + - - + + + + 55,6 BT_121 Dy. marnier-lapostollei + + - - + - - - - - + + - - + + + + 50 FK0009 Dy. microcalyx + + - - + - + - + - + + - - + + + + 61,1 FK0068 Dy. remotiflora + + - - + - + - + + - + - - + + + + 61,1 F 46a Encholirium horidum - + - - + - + - + - + + - - + + + + 55,6 51 ,6 % JP 06.0078 Fosterella rusbyi - + - - + - - + + + + - - - + + + - 50 F 25b F. villosula + + - - + - - - - + - + - - + + + + 50 P6 Pitcairnia abundans + + - - + - + + - - + (+) - - - + + - 44,4 P21 P. breedlovei + + - - - - + + - + + + - - + + + + 61,1 P10 P. burle-marxii + + - - - - - - - + - - - - - + - - 22,2 P23 P. grafii + + - - + - - + + + + + - - - + + + 61,1 BT_11 P. loki-schmidtiae + + - - + - + - + + + + - + + + + + 72,2 P13 P. macrochlamys + + - - - - - - - + + + - - - + + - 38,9 P7 P. piepenbringii - + - - + - + - - + + + - - + + + + 55,6 P8 P. riparia + + - - + - + + - + + - - - - + + + 55,6 P15 P. utcubambensis + + - - - - - - - + + + - - - + + + 44,4 P9 P. villetaensis - + - - - - - - - - - + - - - - - - 11,1 P12 P. yaupi-bajaensis + + - - + - - - - + + + - - - + - + 44,4 Pitcairnioideae (in %): 79,2 100 4,2 0 79,2 0 54,2 25 45,8 62,5 66,7 75 8,3 4,2 66,7 91,7 87,5 79,2 — BT_35 Catopsis morreniana - + - - + - - + + + - - - - + - + + 44,4 BT_34 C. floribunda - + - - - - - - - + - - - - - - - - 11,1 BT_36 C. nitida - + - - - - - - - + - - - - + - - - 16,7 BT_45 Guzmania glaucophylla - - - - + - - - - - - - - - - - - - 5,6 2 7, 3% F 33a G. musaica - + - - + - - - + - - - - - + - + + 33,3 BT_47 G. wittmackii - + - - - - - - + (+) - - - - - - - - 11,1 BT_55 Mezobromelia capituligera + + - - - - - - + - - - - - - - - - 16,7 BT_68 Racinaea pugiformis - + - - + - - - - + - - - - - - - - 16,7 BT_67 R. fraseri - + + - + - + + + + + + + - + + + + 77,8 BT_69 Tillandsia somnians + + - - + - - - - + - - - - + - + - 33,3 BT_70 T. usneoides + + - - - - - - - + + - - - - - + + 33,3 Tillandsioideae (in %): 27,3 90,9 9,1 0 54,5 0 9,1 18,2 45,5 63,6 18,2 9,1 9,1 0 45,4 9,1 45,4 36,4 — BT_61 Puya coerulea + + - - + - - - + + + + - - + + + + 61,1 BT_63 Pu. herzogii + + - - + - - - + + + + - - + + + + 61,1 6 0, % BT_64 Pu. mirabilis - + - - + - - - - + + + - - + + + + 50 BT_65 Pu. spathacea + + + - + - - - + + + + - + + + + + 72,2 BT_66 Pu. venusta + + - - + - - - + + + - - + + - + + 55,6 Puyoideae (in %): 80 100 20 0 100 0 0 0 80 100 100 80 0 40 100 80 100 100 — BT_48 Hechtia caerulea + + - - + - + - - + - + - - - + - - 38,9 4 2, 6%BT_50 H. glomerata + + - - + - + - - + - + - - - + + - 44,4 F 21a H. stenopetale - + - - + - + - - + - - + - - + + + 44,4 Hechtioideae (in %): 66,7 100 0 0 100 0 100 0 0 100 0 66,7 33,3 0 0 100 66,7 33,3 — BT_1 Brocchinia acuminata - - - - + - - - - + - - - - - - - + 16,7 19 ,5 % BT_31 Br. micrantha + + - - + - - - - + - - - - - - - - 22,2 Brocchinioideae (in %): 50 50 0 0 100 0 0 0 0 100 0 0 0 0 0 0 0 50 — Alle 6 Unterfamilien (in %): 56,8 97,3 32,4 0 82,4 6,8 44,6 37,8 59,4 78,4 59,4 71,6 31,1 20,3 73 69 78,4 68,9 Ø 53,8% 71 Ergebnisse Um die Übertragbarkeit der EST-Mikrosatellitenmarker aus Ananas comosus auf Arten der Pitcairnioideae exemplarisch zu überprüfen, wurde zum einen ein Probenset verwendet, das neun Pflanzen der Art Deuterocohnia brevifolia enthält (Set 4, Tabelle T2 im Anhang). Auch diese Proben stammten im wesentlichen aus Botanischen Gärten. Zum anderen wurden 24 Pflanzen der Art Fosterella rusbyi untersucht. Diese stammten aus Freilandaufsammlungen von acht geographisch getrennten Populationen in Bolivien (Set 5, Tabelle T2 im Anhang). Die mit D. brevifolia und F. rusbyi erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 3.6 zusammengefasst und werden dort den entsprechenden Diversitätsparametern in Ananas comosus gegenübergestellt. In Deuterocohnia brevifolia erzeugten zehn der 18 zur Verfügung stehenden Primerpaare ein PCR- Produkt in allen Akzessionen, lediglich an drei Loci (Acom_86.4, Acom_101.1 und Acom_117.15) war die Amplifikation in jeweils zwei Akzessionen nicht erfolgreich, die nicht vorhandenen Informationen wurden als ’missing data’ gewertet (Tabelle 3.6). Acht der zehn Loci generierten mit drei bis fünf Allelen ein polymorphes Bandenmuster, während die beiden übrigen Loci (Acom_93.4 und Acom_109.6) eine einzige, in jeder Akzession identische Bande erzeugten und sich damit als monomorph erwiesen. Die durchschnittlichen Werte für die beobachtete und erwartete Heterozygotie lagen bei 0,53 (Ho) und 0,63 (He) und sind für jeden individuellen Marker der Tabelle 3.6 zu entnehmen. In Abbildung 3.4 sind die in D. brevifolia erzeugten Bandenmuster an vier der Loci beispielhaft illustriert. Abbildung 3.4: Spezifische Bandenmuster an vier ausgewählten EST-Mikrosatellitenloci in neun Akzessionen von Deuterocohnia brevifolia (Set 4) nach Auftrennung auf hochauflösenden PAA-Gelen (6%). Loci der Einzelbilder v.l.n.r: Acom_12.12, Acom_67.2, Acom_71.3 und Acom_109.6. In den 24 Fosterella rusbyi-Akzessionen erzeugten neun der 18 EST-Mikrosatellitenmarker ein Amplifikat auf 6%-igen PAA-Gelen, allerdings war das Bandenmuster an fünf dieser neun Loci monomorph (Acom_12.12, Acom_68.3, Acom_78.4, Acom_82.8, Acom_109.6). An zwei Loci (Acom_64.22 und Acom_101.1) wurden zwei, an einem weiteren Locus fünf (Acom_71.3) und an einem Locus neun Allele generiert (Acom_117.15). Die gemittelten Werte zur beobachteten und erwarteten Heterozygotie dieser vier Loci lagen bei 0,28 bzw. 0,54 und sind in Tabelle 3.6 aufgelistet. Die an den Loci Acom_71.3 und Acom_117.15 erzeugten Bandenmuster sind in Abbildung 3.5 dargestellt, die Bandenmuster an den übrigen Loci in Abbildung A5 im Anhang. 72 Ergebnisse Mit Acom_71.3 und Acom_117.15 konnten damit zwei EST-Mikrosatellitenmarker identifiziert werden, die mit fünf bzw. neun Allelen ein geeignetes Maß an Variabilität in acht geographisch separierten Populationen detektieren konnten (Abbildung 3.5). Abbildung 3.5: Spezifische Bandenmuster an zwei ausgewählten EST-Mikrosatellitenloci in 24 Akzessionen (Set 5) aus acht geographisch getrennten Populationen (in vier bolivianischen Provinzen) von Fosterella rusbyi nach Auftrennung auf hochauflösenden PAA-Gelen (6%). Linke Seite: Acom_71.3, rechte Seite: Acom_117.15. Auftragsreihenfolge: 1-4 Population NW09.010 (Nor Yungas), 5-7 Population NW09.015 (Caranavi), 8- 10 Population NW09.018 (Sud Yungas), 11-13 Population NW09.027 (Caranavi), 14-16 Population NW09.031 (Larecaja), 17-19 Population NW09.032 (Larecaja), 20-22 Population NW09.038 (Larecaja), 23+24 Population NW09.039 (Larecaja), 25 Positivkontrolle A. comosus (BT_20). Probe Nr. 15 wurde zweimal aufgetragen. Für die in Folge vorgesehene populationsgenetische Analyse der Art F. rusbyi im größeren geographischen Rahmen (vgl. Kapitel 3.7) reichte dies jedoch nicht aus. Aufgrund des vergleichsweise hohen Zeit- und Ressourcenaufwands (DNA-Verbrauch und Laborkosten) zur Etablierung zusätzlicher polymorpher EST-basierter Mikrosatellitenmarker für F. rusbyi wurde daher die 454-Technologie als weitere Strategie zur Markerentwicklung angewendet (vgl. Folgekapitel 3.3.2). Alle 18 EST-Mikrosatellitenmarker wurden bereits publiziert (WÖHRMANN & WEISING 2011). 3.3.2 ngFos-Loci (Fosterella rusbyi, 454-Pyrosequenzierung) 3.3.2.1 Pilotstudien Aus den insgesamt 2.178 in silico generierten, Mikrosatelliten-flankierenden Primerpaaren (1.741 Einzelsequenzen) des 454-Datensatzes einer Akzession (JP 06.0078) von F. rusbyi (Kapitel 3.2.4, Tabelle 3.3) wurden 30 Loci ausgewählt, die spezifisch für Tri-, Tetra- oder Hexanukleotid- Wiederholungen waren. Diese Primerpaare wurden synthetisiert und mit dem Akronym ’ngFos’ (für ’next-generation Fosterella’) und einer Identifikationsnummer versehen. Ihre Funktionalität wurde zunächst in einem kleinen Probenset getestet, bestehend aus zwei F. rusbyi-Akzessionen (inklusive der Positivkontrolle JP 06.0078), sowie je einer Akzession der Arten F. floridensis, F. robertreadii und F. weberbaueri (Set 6, Tabelle T2 im Anhang). Die PCRs wurden ausnahmslos mit 73 Ergebnisse dem Programm ’TD 64-50’ durchgeführt und die PCR-Produkte anschließend auf 1,5%-igen Agarosegelen elektrophoretisch aufgetrennt. Insgesamt 23 der 30 Primerpaare erzeugten ein deutlich sichtbares PCR-Produkt in beiden F. rusbyi-Individuen. Von diesen 23 wiederum funktionierten 16 Primerpaare auch in allen drei verbleibenden Arten, wobei ngFos_3, ngFos_17 und ngFos_20 statt eines distinkten ein multiples Bandenmuster generierten. Die übrigen sieben der 23 Primerpaare amplifizierten neben F. rusbyi in mindestens einer weiteren Fosterella-Art. An zwei Loci (ngFos_19 und ngFos_28) wurde nur für die Positivkontrolle F. rusbyi eine distinkte Bande detektiert. An fünf Loci blieb die Amplifikation ergebnislos (ngFos_5, ngFos_7, ngFos_23, ngFos_25 und ngFos_27). Sämtliche Gelbilder sind in Abbildung A2 (im Anhang) zusammengestellt. Nach Maßgabe der Ergebnisse dieser ersten Testreihe wurden 16 Primerpaare für die weiterführenden Analysen ausgewählt. Dabei wurde vor allem auf das Vorhandensein eines distinkten PCR-Produktes in beiden F. rusbyi-Akzessionen Wert gelegt. In der zweiten Versuchsreihe wurden diese 16 Primerpaare zur Amplifikation des gleichen o.g. Probensets (Set 6) eingesetzt, diesmal jedoch unter Verwendung fluoreszenzmarkierter Primer und mittels ’touch-down’ PCR. Die erzeugten Bandenmuster nach Auftrennung der PCR-Produkte auf 6%-igen PAA-Gelen an 15 dieser Loci sind in Abbildung 3.6 dargestellt. Abbildung 3.6: Spezifische Bandenmuster an 15 Mikrosatellitenloci auf 6%-igen PAA-Gelen (Set 6). Die jeweils erste Spur repräsentiert die Positivkontrolle F. rusbyi (JP 06.0078), auf deren Basis die 454-Sequenzen generiert wurden. In den Spuren zwei bis fünf sind die PCR-Produkte der Individuen F. rusbyi (NW09.008-6), F. floridensis (NW09.003-1), F. robertreadii (BT_138) und F. weberbaueri (NW09.025-1) aufgetragen. In vier Fällen (ngFos_9, ngFos_13, ngFos_21, ngFos_30) ist zusätzlich eine Spur mit der Negativkontrolle (N) abgebildet, wohingegen auf eine Abbildung des Standards (S) verzichtet wurde. Die PCR-Produkte am Locus ngFos_22 sind vergleichsweise schwach erkennbar, aber für jede Akzession vorhanden. 74 Ergebnisse Für ngFos_24 wurde an keiner Stelle ein PCR-Produkt detektiert, sodass dieser Locus nicht in der Abbildung 3.6 vertreten ist und von weitergehenden Analysen ausgeschlossen wurde. Alle Primerpaare amplifizierten erfolgreich in beiden F. rusbyi-Akzessionen, zudem zeigten alle mit Ausnahme von ngFos_13 in diesen beiden Individuen ein polymorphes Bandenmuster. Weiterhin amplifizierte jedes Primerpaar PCR-Produkte im erwarteten Größenbereich in allen übrigen Fosterella-Individuen, lediglich am Locus ngFos_29 wurde für F. floridensis keine Bande generiert. Heterozygote Individuen wurden nur in fünf Akzessionen und an drei Loci gefunden (vgl. Abbildung 3.6: JP 06.0078, BT_125 und NW09.025-1 am Locus ngFos_1; JP 06.0078 am Locus ngFos_4; JP 06.0078 am Locus ngFos_22). Dies entspricht einem Anteil von 3,7%. Alle anderen Individuen zeigten über die 15 Loci hinweg ein homozygotes Bandenmuster (Abbildung 3.6). Die Bandenmuster waren stets von guter Qualität, was eine problemlose Bestimmung der Fragmentlängen ermöglichte. Sämtliche Eigenschaften der 15 für weitergehende Studien eingesetzten ngFos-Mikrosatellitenmarker sind in Tabelle 3.8 zusammengefasst und wurden bereits publiziert (WÖHRMANN et al. 2012). Tabelle 3.8: Eigenschaften der 15 ausgewählten Mikrosatellitenmarker aus dem 454-Datensatz von Fosterella rusbyi (JP 06.0078). Angegeben sind die jeweiligen Motivtypen, die Primer-Sequenzen, die erwarteten Fragmentgrößen in Basenpaaren, die gemittelte Anlagerungs-Temperatur (Ta) des entsprechenden Primerpaares sowie die GenBank-Akzessionsnummer der jeweiligen 454-Sequenz. Marker Motiv Primer-Sequenz (5'-3') Länge (in bp) Ta (°C) GenBank-Akzessionsnummer ngFos_1 (TGT)8 GCTTGACTCTCATTCAATCC 168 54,9 JN642690AGTGACCGACCACTGTAAAC ngFos_4 (ACA)12 TTCTCAGATCGTGGTCTTTAC 156 54,4 JN642691TCGACTCTACTATCCATGACC ngFos_6 (TCT)19 GATGCTCTCATGTGTGTCTCT 140 55,2 JN642692TATCCGAAGAAACCCTAATTC ngFos_8 (TAA)11 TCACGATAGGAGTACAAAAGG 139 55,2 JN642693CGCAAATAATGAAAATTAGACC ngFos_9 (TAT)14 GTTCTGCGAATATTTGTTGTC 161 55,0 JN642694AATTAAAGTGGAGACACAGCA ngFos_11 (GTC)7 AACTAGGGTTAGGGTTTCTGA 162 55,1 JN642695ACTTGTTAGAATCGTCGGAGT ngFos_12 (AGC)8 CCTGCACGATGCGTTGTC 178 58,8 JN642696GTAAAATCCATATCCGAATCC ngFos_13 (TCG)8 AGAGAATCGACAAATGGAAAG 161 54,9 JN642697TAACCCTAGAAACGATGAGAG ngFos_14 (CGA)9 AGTAGCCGGAGATCTTGAA 158 55,2 JN642698CCTTCGAACTCAATAATACCC ngFos_16 (GAC)9 ATATTTGCGAAGAAGTCGAG 148 55,2 JN642699ATTATCGTCGCCATGTTCT ngFos_18 (CAG)11 TTTCATCGTCGTCGTCAT 152 55,4 JN642700GATGAAGAATATCATGGTGGA ngFos_21 (GGA)9 CCATTGTCGTTGGTGGAG 199 56,8 JN642701AAAATTCCAAGCACTCTTACC ngFos_22 (ATG)10 GGATGTTAGTCATGAGCAGAG 150 54,9 JN642702TCTACAGCTGATTCCTCTTTG ngFos_29 (ACCCGA)9 GGATTCGGATATGGGTATAGA 150 54,7 JN642703AATTTGTTCGGATTCGTATT ngFos_30 (TCGTCT)12 AGAGCATCTTCTTCTTCTTCG 151 55,4 JN642704GAGTGTGAGGGCTTAGAGAAT Mit den 15 den Markern zugrunde liegenden Sequenzen (vgl. digitaler Anhang DA-2) wurde eine 75 Ergebnisse BLASTx-Analyse durchgeführt, um Homologien der entsprechenden Mikrosatellitenabschnitte mit Einträgen aus Referenz-Datenbanken (Protein-Datenbanken) zu detektieren. Sowohl der Vergleich gegen die Oryza sativa-Datenbank (324.318 Einträge zum Zeitpunkt der Suche) als auch gegen diejenige von Typha latifolia (296 Einträge) ergab keinen positiven Treffer, die gefundenen Mikrosatelliten sind demgemäß nicht mit bekannten Genen assoziiert. 3.3.2.2 Anwendbarkeit der ngFos-Marker für genetische Studien in Populationen von F. rusbyi Die 15 auf Basis der 454-Sequenzdaten von F. rusbyi entwickelten und in Tabelle 3.8 zusammengestellten Mikrosatellitenmarker sollten für eine populationsgenetische Studie in eben dieser Bromelienart eingesetzt werden (vgl. Kapitel 3.7). Im Vorfeld dieser Studie wurde die Funktionalität der 15 Primerpaare in einem kleinen Probenset aus 29 F. rusbyi-Individuen zwei separater geographischer Regionen des bolivianischen Regierungsbezirks (Departamento) La Paz getestet (Set 7, Tabelle T2 im Anhang). Zwölf dieser Pflanzen stammten von zwei Fundorten innerhalb der Provinz Sud Yungas (JP 06.0070, JP 06.0078) und 17 Pflanzen von vier getrennten Lokalitäten innerhalb der Provinz Larecaja (NW09.029, NW09.031, NW09.032, NW09.038). Der Amplifizierung mit bereits fluoreszenzmarkierten Primern folgte die Elektrophorese auf hochauflösenden PAA-Gelen. Abbildung 3.7 zeigt exemplarisch das erhaltene Gelbild am Locus ngFos_6, welches die Markenfunktionalität besonders gut reflektiert. Abbildung 3.7: Spezifisches Bandenmuster von 29 F. rusbyi-Akzessionen (Set 7) am Locus ngFos_6. Auftragsreihenfolge: 1-11 und 16 = F. rusbyi- Pflanzen von zwei Lokalitäten der Provinz Sud Yungas, 12-15 und 17-29 = F. rusbyi-Pflanzen von vier Lokalitäten in der Provinz Larecaja, Bolivien. Schwächere Banden unterhalb der Hauptbanden sind Stotterbanden, die durch ein Verrutschen der DNA-Polymerase entstehen. Zwölf der Pflanzen sind für den betreffenden Locus heterozygot, 17 homozygot. Alle 15 Loci erwiesen sich als polymorph, mit zwei (ngFos_13) bis neun (ngFos_6) detektierten Allelen (durchschnittlich 5,0 Allele / Locus; Tabelle 3.9). An sieben Loci (ngFos_11 bis ngFos_21) 76 Ergebnisse wurde für die aus der Provinz Sud Yungas stammenden Pflanzen jeweils nur ein Allel und somit ein monomorphes Bandenmuster ermittelt. Insgesamt war der durchschnittliche Wert von 2,1 Allelen pro Locus in den Pflanzen der Sud Yungas deutlich geringer innerhalb der Provinz Larecaja, wo durchschnittlich 3,9 Allele pro Locus detektiert wurden. Über alle Loci und Individuen hinweg lag die gemittelte beobachteten Heterozygotie bei 0,14 und die gemittelte erwartete Heterozygotie bei 0,61. Beide Werte fielen für die Proben aus der Provinz Sud Yungas deutlich niedriger aus (Ho = 0,08 und He = 0,24) als für die Proben der Provinz Larecaja (Ho = 0,18 und He = 0,55). Die offensichtliche Differenz zwischen den jeweils kalkulierten Ho- und He-Werten weist auf ein ausgeprägtes Heterozygoten-Defizit an allen Loci hin. Daher ergeben sich für die meisten Loci sowohl bei getrennter Betrachtung der beiden Provinzen als auch über alle Individuen hinweg hohe Werte für den Inzuchtskoeffizienten Fis (durchschnittlich 0,79 über alle Loci und Individuen) und eine signifikante Abweichung vom HARDY-WEINBERG Gleichgewicht. Alle genannten Parameter sind im Detail in Tabelle 3.9 aufgelistet. Tabelle 3.9: Ergebnisse der Funktionalitätstests von 15 Mikrosatellitenmarkern in 29 Individuen von Fosterella rusbyi (Set 7). Für jeden Locus und für jede geographischer Region (Provinzen Sud Yungas und Larecaja) sind die Allelzahlen (Na), die Werte der beobachteten und erwarteten Heterozygotie (Ho / He), der Inzuchtskoeffizient (Fis) sowie der jeweilige Proben-Umfang (N) angegeben. Signifikanz: p-Wert bezogen auf Fis: ***: < 0,001; **: < 0,01; *: < 0,05; n.s.: nicht signifikant. Locus Provinz Sud Yungas (N = 12) Provinz Larecaja (N = 17) Beide Provinzen (N = 29) Na Ho He Fis Na Ho He Fis Na Ho He Fis ngFos_1 3 0,17 0,49 0,67* 3 0,12 0,57 0,80*** 5 0,14 0,73 0,81*** ngFos_4 3 0,25 0,47 0,48* 4 0,24 0,60 0,62*** 4 0,24 0,68 0,65*** ngFos_6 5 0,17 0,73 0,78*** 7 0,41 0,81 0,50*** 9 0,31 0,84 0,64*** ngFos_8 2 0,08 0,23 0,65** 3 0,12 0,39 0,71** 5 0,10 0,66 0,85*** ngFos_9 3 0,08 0,45 0,54** 2 0,12 0,11 -0,03 n.s. 5 0,10 0,61 0,83*** ngFos_11 1 - - - 3 0,41 0,52 0,21 n.s. 3 0,24 0,35 0,31 n.s ngFos_12 1 - - - 3 0,00 0,68 1,00*** 3 0,00 0,55 1,00*** ngFos_13 1 - - - 2 0,00 0,11 1,00* 2 0,00 0,07 1,00* ngFos_14 1 - - - 7 0,41 0,83 0,51*** 7 0,24 0,63 0,62*** ngFos_16 1 - - - 4 0,12 0,69 0,83*** 4 0,07 0,61 0,89*** ngFos_18 1 - - - 2 0,00 0,21 1,00** 3 0,00 0,57 1,00*** ngFos_21 1 - - - 3 0,12 0,56 0,80*** 3 0,07 0,48 0,86*** ngFos_22 2 0,17 0,16 -0,05 n.s. 5 0,06 0,68 0,92*** 7 0,10 0,75 0,86*** ngFos_29 3 0,25 0,60 0,60* 7 0,18 0,78 0,78*** 8 0,21 0,84 0,76*** ngFos_30 3 0,00 0,42 1,00*** 4 0,41 0,68 0,40 n.s. 7 0,24 0,79 0,70*** Ø 2,1 0,15 0,44 0,58 3,9 0,18 0,55 0,70 5,0 0,14 0,61 0,79 Um die genetischen Distanzen zwischen den Individuen beider Provinzen zu visualisieren und somit das Potenzial der Marker zur populationsgenetischen Anwendung einzuschätzen, wurde ein phylogenetisches Netzwerk (NeighbourNet) konstruiert (Abbildung 3.8). Das Netzwerk zeigt eine klare Trennung zwischen den Individuen aus den beiden Provinzen Larecaja (blau hinterlegt) und Sud Yungas (grün hinterlegt). Innerhalb der Provinzen gruppieren die Individuen entsprechend ihrer Fundorte bzw. Populationszugehörigkeit. 77 Ergebnisse Abbildung 3.8: Phylogenetisches Netzwerk von 29 Fosterella rusbyi-Individuen (Set 7) basierend auf 15 Mikrosatellitenmarkern und den daraus berechneten ROUSSET-Distanzen zwischen Individuen (ROUSSET 2000, vgl. 2.3.6.1). Die ID-Nummern der Pflanzen der einzelnen Fundorte sind schattiert hinterlegt. Grüne Farbtöne: 17 Proben aus der Provinz Sud Yungas (zwei Fundorte), blaue Farbtöne: 13 Proben der Provinz Larecaja (vier Fundorte). Die gestrichelte Linie verdeutlicht die Aufteilung der Pflanzenproben entsprechend den beiden Provinzen. 3.3.2.3 Übertragbarkeit der nukleären 454-Marker aus F. rusbyi auf andere Gattungen der Bromeliaceae Um die Übertragbarkeit der ngFos-Marker innerhalb der Gattung Fosterella sowie auf einige Vertreter der übrigen Gattungen der UF Pitcairnioideae in einem größeren Rahmen abzuschätzen wurde ein Probenset aus 44 Akzessionen zusammengestellt (Set 8, Tabellen T2 im Anhang und Tabelle 3.10). Enthalten waren zehn Fosterella-Arten, die zusammen fünf der sechs derzeit anerkannten Gruppen innerhalb der Gattung repräsentieren (REX et al. 2009; WAGNER & SILVESTRO et al. 2013), sowie je eine Akzession aus zehn verschiedenen Arten der Gattungen Deuterocohnia, Dyckia, Encholirium, Pitcairnia (Pitcairnioideae) und ein Individuum von Ananas comosus (Bromelioideae). Der Großteil der in diesem Set eingeschlossenen Fosterella-Individuen wurde in natürlichen Habitaten gesammelt, sodass eine erste Einsicht in die Variabilität der Loci innerhalb von natürlichen Populationen möglich war. Die drei F. micrantha-Individuen stammen aus unterschiedlichen Lokalitäten in Mexiko, die sechs F. villosula-Akzessionen sind Vertreter zweier bolivianischer Populationen. Die Ergebnisse der Übertragbarkeitsstudie werden in Tabelle 3.10 78 Ergebnisse zusammengefasst. Innerhalb der Gattung Fosterella variierte die Erfolgsquote der Übertragbarkeit zwischen 3% für ngFos_14 und 100% für ngFos_6. Fünf Loci erwiesen sich als besonders gut konserviert und zeigten eine konsistente Amplifikation in mehr als 60% aller im Probenset enthaltenen Fosterella- Arten. Die höchsten Werte bezogen auf die Primer-Übertragbarkeit wurden in der Art F. petiolata (durchschnittlich 82,2%) erzielt. Ein ebenfalls gutes Ergebnis mit Werten über 70% wurde in den Arten F. albicans, F. robertreadii und F. floridensis erzielt. Für die drei Arten der micrantha-Gruppe (F. christophii, F. micrantha, F. villosula) lag der gemittelte Wert bei 35,1%, wobei in F. micrantha 40% der Loci funktionierten, in F. villosula hingegen nur 30%. Auf innerartlicher Ebene wird deutlich, dass ein Großteil der Marker nicht nur übertragbar, sondern in der Zielart auch polymorph ist. Außerdem treten in den Zielarten zum Teil zwei Banden auf, was auf einen heterozygoten Zustand hinweist. So wurde z.B. vor allem in F. petiolata an insgesamt zehn Loci ein sowohl variables als auch heterozygotes Bandenmuster detektiert („fett“ gedruckte Zahlen in Tabelle 3.10). Auch die drei Akzessionen von F. micrantha zeigen an drei von sechs erfolgreich amplifizierten Loci mehr als ein Allel, allerdings waren alle Allele homozygot. In F. robertreadii waren vier (ngFos_6, ngFos_16, ngFos_22 und ngFos_30) und in F. albicans jeweils zwei Loci (ngFos_21 und ngFos_22) variabel, auch hier mit z.T. heterozygotem Zustand. Die Akzessionen von F. weberbaueri zeigten am Locus ngFos_16 ein variables, jedoch homozygotes Bandenmuster. Der Locus ngFos_4 erwies sich innerhalb von F. villosula als variabel, jedoch als monomorph in F. christophii, F. floridensis, F. gracilis und F. penduliflora. Einzig in der letztgenannten Art traten an einem Locus (ngFos_12) drei Banden auf. Dies ist als Hinweis für einen polyploiden Status der Art zu deuten, der auch durch cytogenetische Daten belegt wird (J. PAULE, persönliche Mitteilung). Weiterhin war in F. penduliflora im Vergleich zu den übrigen Fosterella-Arten (außer F. petiolata) der heterozygote Zustand recht häufig und an den entsprechenden Loci (ngFos_4, ngFos_6, ngFos_11, ngFos_18, ngFos_21, ngFos_22) gleichmäßig ausgeprägt. Der Versuch, die 454-Mikrosatellitenmarker auf Arten außerhalb der Gattung Fosterella zu übertragen, erwies sich als wenig erfolgreich. Lediglich am Locus ngFos_22 wurden in zehn von elf Akzessionen PCR-Produkte erzeugt, deren Bandenmuster allerdings unspezifisch waren. An vier der 15 Loci (ngFos_1, ngFos_4, ngFos_12, ngFos_16) wurden in der einen oder anderen Probe eine bis maximal zwei Banden ermittelt, ein systematisches Muster war dabei nicht erkennbar. Für die übrigen zehn der 15 Primerpaare blieb die Amplifikation außerhalb von Fosterella durchweg ohne Ergebnis (vgl. Tabelle 3.10). 79 Ergebnisse Tabelle 3.10: Ergebnisse der Fragmentlängenanalyse an 15 Mikrosatellitenloci in Pflanzensets 8, bestehend aus 33 Akzessionen aus zehn Arten der Gattung Fosterella und elf Arten der Gattungen Deuterocohnia, Dyckia, Encholirium, Pitcairnia und Ananas. Die angegebenen Zahlen entsprechen den Allelen (Fragmentlängen) an einem Locus. Eine einzelne Zahl steht für ein homozygotes Bandenmuster, zwei bzw. drei Zahlen kennzeichnen ein heterozygotes, bzw. multiples Bandenmuster, beginnend mit dem kürzesten Fragment. ’-’ kein sichtbares PCR-Produkt. Sind die Fragmentlängen bzw. Zahlen „fett“ gedruckt, so wurde innerhalb einer Art ein variables Bandenmuster detektiert, alle nicht hervorgehobenen Zahlen deuten hingegen auf ein innerartlich monomorphes Bandenmuster. Die Nummerierung entspricht der Auftragsreihenfolge auf den PAA-Gelen. 80 Ergebnisse Insgesamt lässt sich festhalten, dass sich ein Großteil der 454-Mikrosatellitenmarker von F. rusbyi auf mehrere Fosterella-Arten übertragen lässt und in den jeweiligen Zielarten polymorphe Banden erzeugt (z.B. ngFos_4, ngFos_6, ngFos_11, ngFos_16, ngFos_22). In den untersuchten Akzessionen und Populationen von F. rusbyi waren alle 15 Mikrosatellitenmarker informativ, sodass jeder einzelne dieser Marker im Rahmen der populationsgenetischen Studie in F. rusbyi eingesetzt wurde (vgl. Kapitel 3.7). 3.3.3 ngDy-Loci (Dyckia marnier-lapostollei var. estevesii, 454-Pyrosequenzierung) 3.3.3.1 Pilotstudien Aus den insgesamt 1.165 in silico generierten, Mikrosatelliten-flankierenden Primerpaaren des 454-Datensatzes einer Akzession (BT_121) von Dy. marnier-lapostollei var. estevesii (vgl. Tabelle 3.3) wurden 50 ausgewählt, die spezifisch für Di-, Tri-, Tetra-, Penta- und Hexanukleotid- Wiederholungen waren. Die Primerpaare wurden in einem zeitlichen Abstand von zwei Monaten synthetisiert (zunächst 30, später nochmals 20) und jeweils mit dem Akronym ’ngDy’ (für ’next- generation Dyckia’) und einer Identifikationsnummer versehen. Die Funktionalität der ersten 30 Primerpaare (ngDy_1 bis ngDy_30) wurde in einem kleinen Probenset (Set 10a, Tabelle T2 im Anhang), bestehend aus fünf verschiedenen Dyckia-Arten und der Positivkontrolle (Dyckia marnier-lapostollei var. estevesii; BT_121) getestet. Die PCR wurde mit dem Programm ’TD 64-50’ durchgeführt und die PCR-Produkte wurden auf 1,5%-igen Agarosegelen elektrophoretisch aufgetrennt. Für die Funktionalitätstests der übrigen 20 Primerpaare (ngDy_31 bis ngDy_50) wurde ein leicht abgewandeltes Probenset (Set 10b, Tabelle T2 im Anhang) zusammengestellt. Sämtliche Gelbilder sind im Anhang in den Abbildungen A3a und A3b illustriert. Von den insgesamt 50 getesteten Primerpaaren erzeugten 28 sowohl in der Positivkontrolle als auch in mindestens einer weiteren Dyckia-Akzession ein klares PCR-Produkt, weitere neun Primerpaare erzeugten ausschließlich in der Positivkontrolle ein Amplifikat. Im Detail generierten acht der ersten 30 Primerpaare in allen fünf Akzessionen des Probensets 10a und fünf der zusätzlichen 20 Primerpaare in allen sieben getesteten Individuen des Probensets 10b ein PCR-Produkt. Die erzeugten Bandenmuster waren an 37 der 50 getesteten ngDy-Loci distinkt, lediglich am Locus ngDy_33 wurde ein multiples Bandenmuster sichtbar, weshalb dieser Locus von weiteren Analysen ausgeschlossen wurde. An 13 Loci blieb die Amplifikation durchweg ergebnislos. Fünfzehn der 37 funktionierenden Primerpaare wurden für die nachfolgenden Analysen zur Übertragbarkeit auf andere Arten (siehe Kapitel 3.3.3.2) und zur Artabgrenzung innerhalb der Gattung Dyckia (vgl. Kapitel 3.5) ausgewählt. Die Eigenschaften dieser 15 ngDy-Loci 81 Ergebnisse und die zugehörigen Primersequenzen sind in Tabelle 3.11 aufgeführt und wurden bereits publiziert (WÖHRMANN et. al. 2013). Tabelle 3.11: Eigenschaften der 15 ausgewählten ngDy-Mikrosatellitenmarker aus dem 454-Datensatz von Dyckia marnier-lapostollei var. estevesii (BT_121). Angegeben sind die jeweiligen Motivtypen, die Primersequenzen, die erwarteten Fragmentgrößen in Basenpaaren, die gemittelte Anlagerungs-Temperatur (Ta) des entsprechenden Primerpaares sowie die GenBank-Akzessionsnummer der jeweiligen 454-Sequenz. Marker Motiv Primer-Sequenz (5'-3') Länge (in bp) Ta (°C) GenBank-Akzessionsnummer ngDy_1 (AAC)8 AAAGAGGTGTCAATTGCTAAA 146 54,7 JX051855GCTAACTCTCTCCTCTCTTGG ngDy_3 (GAA)7 GTCATCCGAAAACCCTACTAC 146 55,6 JX051856AGACCATCATCATCGGATATT ngDy_8 (TCT)9 AGGTTCCAAGTCTCAATTTTT 148 55,0 JX051857TGACAAAGTTAAAGGAGCGTA ngDy_10 (TTA)7 TGTCCATCCCTGAATTAAGTA 170 54,8 JX051858CATCCAACCACTCTTTTATTG ngDy_16 (AAT)9 GTTAAGATTGAAGGGCAAAAA 154 55,4 JX051859ATCAGAAGATATTGGACGACA ngDy_17 (AAT)10 GCGAGGCTTTTGTTTTATATT 142 54,9 JX051860AGCTCTAAGTCTGTTTGGTCA ngDy_22 (GTC)9 TCGTCGATACGGTTTTTC 129 54,8 JX051861CCTAGAGCAAAGAGAAACGA ngDy_24 (TAC)10 AATGGTTAGTAGTGCCGTTTA 166 54,6 JX051862CGCAGATCGAAATAAAGAATA ngDy_25 (CCT)6 CTCTCCTCTCATTTGAAACCT 188 55,8 JX051863GACGGATCCTGACGAAAC ngDy_27 (GCG)6 ATCAAATCGACCGAGAAAC 147 54,7 JX051864TACAAGTACATGGAGGAGGAG ngDy_30 (AAGTTC)6 CATAGATCGAAAAACCTACCC 164 55,1 JX051865CATTAAGCGTTCTTCATCCTA ngDy_31 (CA)11 TTACATACTCGCCTCTTGAAA 151 54,6 JX051866GCTAATATTTCATCGTTTTCTCT ngDy_32 (CA)19 AGATGATTCTCACCTGAGTTCT 126 53,4 JX051867GGATAGGCTAGGTACATTTTT ngDy_45 (ATTT)8 CCATTTCTGCTGAGTTTATTT 161 54,4 JX051868GTGGGGAACATGATCTTAAA ngDy_49 (GCGAGG)5 ATATTCCGCTATGTTCCAGAG 199 55,6 JX051869TCTAAATCGAGCCATCAGATA Eine Homologie-Suche, nach der selben Vorgehensweise wie sie bereits für die 454-Sequenzen von Fosterella rusbyi beschrieben und durchgeführt wurde (BLAST; vgl. Kapitel 3.3.2.1), ergab auch für die 15 den ngDy-Markern zugrunde liegenden Sequenzen keine positiven Treffer gegen die Datenbanken von Oryza sativa und Typha latifolia. Folglich ist keiner der gefundenen Mikrosatelliten mit bekannten Genen assoziiert. 3.3.3.2 Übertragbarkeit der nukleären 454-Marker aus Dy. marnier-lapostollei auf andere Gattungen der Bromeliaceae Die für Dy. marnier-lapostollei var. estevesii entwickelten Mikrosatelliten-Primerpaare sollten insbesondere für populationsgenetische Studien in den vier heterologen Arten Dy. dissitiflora, Dy. pernambucana, Dy. limae und Dy. macedoi eingesetzt werden. Um einen ersten Eindruck von der 82 Ergebnisse Übertragbarkeit der Marker und ihrer Variabilität in den Zielarten zu erhalten, wurden die Primerpaare in einem neuen Probenset getestet (Set 11, Tabelle T2 im Anhang und Tabelle 3.12). Dieses enthielt je zwei Akzessionen der vier genannten Arten sowie jeweils eine Akzession von Dy. hebdingii, Dy. maritima und Dy. velascana, acht Akzessionen von vier Encholirium-Arten und je eine Art aus den Gattungen Deuterocohnia, Fosterella und Pitcairnia. Der Erfolg der Amplifikation wurde zunächst durch Auftrennung der PCR-Produkte auf 1,5%-igen Agarosegelen überprüft. Die Ergebnisse sind exemplarisch für zwei der 15 Loci (ngDy_3 und ngDy_17) und einen Teil der Proben in Abbildung 3.9a und b dargestellt. Abbildung 3.9: Spezifisches Bandenmuster von 9 Dyckia-Proben aus dem Pflanzenset 11 nach Auftrennung der PCR-Produkte auf 1,5%-igen Agarosegelen (a und b) sowie auf hochauflösenden 6%-igen PAA-Gelen (c und d) an den Loci ngDy_3 (a und c) und ngDy_16 (b und d). Auftragsreihenfolge: 1-2 = Dy. dissitiflora, 3-4 = Dy. pernambucana, 5-6 = Dy. macedoi, 7-8 = Dy. limae, 9 = Dy. marnier-lapostollei var. estevesii (Positivkontrolle); N = Negativkontrolle. Jedes der 15 Primerpaare erzeugte ein Amplifikat in nahezu allen untersuchten Dyckia- Akzessionen, lediglich an den Loci ngDy_17 und ngDy_31 wurde für Dy. hebdingii bzw. Dy. velascana kein PCR-Produkt generiert. Alle Loci wurden daher unter Verwendung fluoreszenzmarkierter Primer amplifiziert und die PCR-Produkte auf 6%-igen PAA-Gelen aufgetrennt. In Abbildung 3.9c und 3.9d sind die spezifischen Bandenmuster an den beiden Loci ngDy_3 und ngDy_16 exemplarisch dargestellt, wiederum für einen Teil des Pflanzensets 11. Die Ergebnisse der Übertragbarkeitstests sind in Tabelle 3.12 zusammengefasst. Bis auf die beiden o.g. Ausfälle generierten alle 15 Primerpaare entweder eine oder zwei distinkte Banden in jeder untersuchten Dyckia-Akzession, entsprechend lag die Erfolgsquote für die Übertragbarkeit der ngDy-Marker innerhalb der Gattung Dyckia zwischen 93,3 und 100% (vgl. Tabelle 3.12). Das Verhältnis zwischen homozygoten und heterozygoten Genotypen, in Tabelle 3.12 durch ’+’ bzw. ’++’ symbolisiert, war vergleichsweise ausgeglichen. Die durch jeweils zwei Individuen vertretenen Arten Dy. dissitiflora, Dy. pernambucana, Dy. limae und Dy. macedoi zeigten an zahlreichen Loci innerartliche Variation. 83 Ergebnisse In der Gattung Encholirium, die Dyckia verwandtschaftlich am nächsten steht (KRAPP et al. 2014), amplifizierten vier Primerpaare (ngDy_8, ngDy_10, ngDy_16 und ngDy_25) in jeder der acht Akzessionen. Für die übrigen Loci lag die Erfolgsquote zwischen 25,0% und 87,5%, lediglich vier Primerpaare (ngDy_17, ngDy_22, ngDy_24 und ngDy_45) erzeugten in keiner der untersuchten Pflanzenproben ein sichtbares PCR-Produkt. Sechs der 15 Mikrosatellitenmarker erwiesen sich innerhalb der Art Encholirium spectabile als variabel, während an drei Loci (ngDy_8, ngDy_10 und ngDy_16) ein monomorphes Bandenmuster detektiert wurde. Tabelle 3.12: Ergebnisse der Übertragbarkeitsstudie von 15 Mikrosatellitenmarkern aus Dyckia marnier-lapostollei var. estevesii im Pflanzenset 11, bestehend aus 23 Akzessionen aus 16 Arten der UF Pitcairnioideae. Die vier Akzessionen von Encholirium spectabile sind Vertreter einer natürlichen Population aus dem Bundesstaat Sergipé. Symbolerläuterung: + homozygotes und ++ heterozygotes Bandenmuster auf 6%-igen PAA-Gelen; - kein sichtbares PCR-Produkt. Die prozentualen Angaben wurden sowohl pro Locus als auch pro Art und Gattung kalkuliert. Die ermittelten Fragmentlängen sind dem digitalen Anhang DA-6 zu entnehmen. Nr. Art ID-Nr. ngDy_1 ngDy _3 ngDy _8 ngDy _10 ngDy _16 ngDy _17 ngDy _22 ngDy _24 ngDy _25 ngDy _27 ngDy _30 ngDy _31 ngDy _32 ngDy _45 ngDy _49 Total (%) 1 Dyckia dissitiflora ’Ferro Doido’ D26 + ++ + ++ + + + ++ ++ + + + + + + 100 2 Dy. dissitiflora D28 + ++ + ++ ++ + + ++ ++ + ++ ++ ++ ++ + 3 Dy. pernambucana ’Pesgueira’ D90 + ++ + + + + + + + + + + + + ++ 100 4 Dy. pernambucana D91 ++ ++ + + ++ + + ++ + + + + + + ++ 5 Dy. macedoi ’Serra do Cipo’ D121 + ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ + + ++ + ++ ++ ++ 100 6 Dy. macedoi D123 + ++ ++ + ++ + + ++ ++ ++ ++ + + ++ ++ 7 Dy. limae ’Buique’ D182 + + + + + + ++ ++ + ++ + ++ ++ + + 100 8 Dy. limae D183 + + + + + ++ ++ ++ + + + + + + + 9 Dy. marnier-lapostollei POS BT_121 + ++ + ++ ++ + + + + + ++ ++ + ++ ++ 100 10 Dy. hebdingii FK0112 + ++ ++ + ++ - + + ++ ++ + + ++ ++ + 93,3 11 Dy. maritima FK0113 ++ ++ ++ ++ + + + + ++ + ++ + ++ + + 100 12 Dy. velascana FK0006 + ++ ++ ++ + + ++ ++ + ++ + - ++ + + 93,3 Prozentualer Anteil Dyckia: 100 100 100 100 100 66,7 100 100 100 100 100 66,7 100 100 100 13 Encholirium brachypodum EB1-RJ ++ ++ + ++ + - - - ++ + + - - - - 53,3 14 E. erectiflorum ER-AFR1 + + ++ + + - - - + ++ + ++ - - + 66,7 15 E. horridum EH2-RJ - + + + + - - - + + + + - - - 53,3 16 E. magalhaesii EM3-RJ - + + ++ + - - - + + - ++ + - + 60,0 17 E. spectabile ES-csf2 - + + + + - - - + - - ++ ++ - ++ 50,0 18 E. spectabile ES-csf5 - ++ + + + - - - + - - + - - ++ 19 E. spectabile ES-csf13 - ++ + + + - - - + - + + + - + 20 E. spectabile ES-csf14 - - + + + - - - ++ - + - - - + Prozentualer Anteil Encholirium: 25,0 87,5 100 100 100 0 0 0 100 50,0 62,5 75,0 37,5 0 75,0 21 Deuterocohnia longipetala BT_123 - - - + - - - - + + - - - - - 20,0 22 Fosterella rusbyi JP 06.0078 - - - - + - - - - + - - + - - 20,0 23 Pitcairnia loki-schmidtiae BT_11 - - - - - - - - - - - - + - - 6,7 Prozentualer Anteil übriger Gattungen: 0 0 0 33,3 33,3 0 0 0 33,3 66,7 0 0 66,7 0 0 Total (in %) 35,7 71,4 78,6 85,7 85,7 14,3 21,4 21,4 85,7 64,3 57,1 57,1 57,1 21,4 63,3 Vergleichsweise gering war die Übertragbarkeit auf weiter entfernte Gattungen der Pitcairnioideae, die in Set 11 durch je ein Individuum von Deuterocohnia longipetala, Fosterella rusbyi und Pitcairnia loki-schmidtiae repräsentiert sind. An fünf der 15 Loci (ngDy_10, ngDy_16, ngDy_25, ngDy_27, ngDy_32) wurden in der einen oder anderen Probe eine bis maximal zwei Banden ermittelt, ein systematisches Muster war nicht erkennbar. Für die übrigen zehn Primerpaare blieb die Amplifikation außerhalb von Dyckia und Encholirium ohne Ergebnis (vgl. Tabelle 3.12). Sämtliche Fragmentlängen sind im digitalen Anhang (DA-6) aufgeführt. 84 Ergebnisse 3.4 Plastidäre Mikrosatellitenmarker 3.4.1 In silico-Extraktion des plastidären DNA-Anteils aus den verfügbaren 454-Sequenzen Neben der Suche nach nukleären Mikrosatellitenmarkern dienten die im Rahmen des Kooperationsprojektes mit Dr. B. HUETTEL generierten 454-Sequenzen von Fosterella rusbyi, Deuterocohnia longipetala und Dyckia marnier-lapostollei var. estevesii auch dazu, plastidäre DNA- Sequenzen zu identifizieren und plastidäre Mikrosatellitenmarker zu entwickeln. Als Grundlage dafür diente ein Vergleich mit dem vollständig sequenzierten Plastom von Typha latifolia (insgesamt 161.572 bp) aus der nahe verwandten Familie der Typhaceae. Eine BLAST-Analyse der 454-Sequenzen von F. rusbyi (73.027), Dy. marnier-lapostollei var. estevesii (59.624) und D. longipetala (25.827) lieferte 2.794, 3.826 und 3.722 zum Plastom signifikant ähnliche Sequenzen, was einem Anteil von 3,8%, 6,4% und 14,4% der verfügbaren 454-Sequenzen entspricht (Tabelle 3.13). Tabelle 3.13: Gegenüberstellung des in den drei 454-Datensätzen von F. rusyi, Dy. marnier-lapostollei var. estevesii und D. longipetala enthaltenen Anteils an plastidären Sequenzen, ermittelt durch den Vergleich mit dem Plastom von Typha latifolia. Fosterella Dyckia (KRAPP 2012) Deuterocohnia Gesamtzahl der Sequenzen 73.027 59.624 25.827 Zum Plastom (T. latifolia) signifikant ähnlich 2.794 3.826 3.722 Prozentualer Anteil 3,8% 6,4% 14,4% Distinkte Sequenzen nach Assemblierung 58 (32 – 18.318 bp) 89 (89 – 14.880 bp) 73 (61 – 14.931 bp) Contigs 52 77 66 Nicht assembliert 6 12 7 Gesamtlänge distinkter Sequenzen 126.994 bp 139.839 bp 125.535 bp Abdeckung gegenüber dem T. latifolia-Plastom 78,5% 86,5% 77,7% Die Assemblierung dieser Sequenzen resultierte im Fall von Fosterella in 52 Contigs zwischen 32 und 18.318 bp Länge (durchschnittlich 2.190 bp). Sechs Sequenzen blieben unassembliert, sodass insgesamt 58 distinkte Sequenzen mit einer Gesamtlänge von 126.994 bp generiert wurden (Tabelle 3.13). In Dyckia ergaben sich nach der Assemblierung 89 distinkte Einzelsequenzen mit Längen zwischen 89 und 14.880 bp (KRAPP et al. 2012; KRAPP 2012). Für Deuterocohnia wurden 3.722 zum Typha-Plastom signifikant ähnliche Sequenzen ermittelt, die wiederum zu 73 distinkten Einzelsequenzen mit einer Gesamtlänge von 125.635 bp assembliert wurden (Tabelle 3.13). Für die einzelnen Gattungen betrachtet entsprechen die Ergebnisse einer Abdeckung des Plastoms von T. latifolia von 78,5% (Fosterella), 86,5% (Dyckia) sowie 77,7% (Deuterocohnia), wenn die Sequenzen der ’inverted repeats’ (IR) doppelt gezählt werden (Tabelle 3.13). 218 der 220 distinkten Sequenzen der drei Datensätze wurden anschließend kombiniert und erneut gegen das Typha-Plastom assembliert, was in einem Alignment und einer resultierenden Consensus-Sequenz mit einer Gesamtlänge von 166.875 bp resultierte (Abbildung 3.10). Die distinkten Sequenzen der 85 Ergebnisse drei Bromelienarten deckten damit in Summe zu 95,2% (153.884 bp) das Typha-Plastom ab. Lediglich an 35 Positionen, welche regelmäßig über das Plastom verteilt waren, blieben Sequenzabschnitte mit Längen zwischen zehn und 1.466 bp unassembliert (durchschnittlich 219 bp; in Abbildung 3.10 orange hervorgehoben). Um die exakte Lage dieser insgesamt 7.688 bp zu ermitteln wurden die entsprechenden Sequenzen auf die Genkarte des Typha latifolia-Plastoms kartiert und mit orangefarbenen Pfeilen gekennzeichnet (Abbildung 3.11 verändert nach GUISINGER et al. 2010). Abbildung 3.10: Assemblierung von 218 distinkten Einzelsequenzen (hellgraue Balken) aus Dy. marnier-lapostollei, D. longipetala und F. rusbyi gegen das Plastom von Typha latifolia. Die resultierende Consensus-Sequenz (oberster dunkelgrauer Balken) umfasste 166.875 bp. Insgesamt wurden 95,2% des Typha-Plastoms abgedeckt, unassemblierte Abschnitte sind durch orangefarbene Blöcke markiert. 3.4.2 cpFos-Loci (Fosterella rusbyi, 454-Pyrosequenzierung) Die zum Plastom von Typha latifolia signifikant ähnlichen Sequenzen aus den 454-Datensätzen von Fosterella rusbyi und Dyckia marnier-lapostollei var. estevesii bildeten die Grundlage zur Etablierung von polymorphen und übertragbaren plastidären Mikrosatellitenmarkern (chloroplast simple sequence repeats; cpSSRs). Die für Dy. marnier-lapostollei erzeugten Marker sind in Kooperation mit Dr. F. KRAPP entstanden und bereits publiziert worden (KRAPP et al. 2012; KRAPP 2012). Eine Markerentwicklung für Deuterocohnia war nicht Gegenstand der vorliegenden Arbeit, sodass im nachfolgenden Abschnitt nur die Ergebnisse für F. rusbyi präsentiert werden. Die Ermittlung der Anzahl an Mononukleotid-Wiederholungen mit einer Mindestlänge von 10 bp ergab insgesamt 38 Mikrosatelliten plastidären Ursprungs. Davon wiesen 28 cpSSRs jeweils zehn Wiederholungen von A oder T auf, fünf cpSSRs bestanden aus elf, zwei cpSSRs aus 12, einer aus 13 und zwei cpSSRs aus 15 Wiederholungen. Eine ausreichend lange flankierende Sequenz und ausreichende Sequenzqualität war für 24 der 38 plastidären Mikrosatellitenmarker gegeben, für diese wurden in silico flankierende Primerpaare entworfen (Tabelle 3.14). Die Positionen dieser Markerloci auf dem Plastom von T. latifolia sind in Abbildung 3.11 durch die violetten Pfeile hervorgehoben und in Tabelle 3.14 beschrieben. Zwanzig Loci sind im Bereich von Genen lokalisiert, und vier Loci im intergenischen Bereich. Zweiundzwanzig der 24 Marker basieren auf Mikrosatelliten vom (A/T)n-Typ, zwei sind vom (C/G)n-Typ. 86 Ergebnisse Abbildung 3.11: Genkarte des Plastoms von Typha latifolia (verändert nach GUISINGER et al. 2010). Die Positionen der plastidären Mikrosatelliten (cpSSRs) sind durch die violetten Pfeile im äußeren Kreis markiert. Die Sequenzbereiche des Typha-Plastoms, welche nach der Assemblierung gegen die drei Bromelien-Datensätze unbesetzt blieben sind durch orangefarbene Pfeile hervorgehoben. Basierend auf dem Kriterium einer möglichst geringen Wahrscheinlichkeit zur Selbstanlagerung der Primersequenzen wurden Primerpaare für zehn plastidäre Mikrosatellitenmarker tatsächlich synthetisiert (in Tabelle 3.14 durch * gekennzeichnet). Diese zehn Marker wurden in Pilotstudien zunächst auf ihre Funktionalität in F. rusbyi und auf die Übertragbarkeit auf unterschiedliche Gattungen und Unterfamilien der Bromeliaceae getestet. Alle Marker, die sich als geeignet erwiesen, wurden anschließend zusammen mit nukleären Mikrosatellitenmarkern für eine populationsgenetische Analyse von F. rusbyi eingesetzt. 87 Typha latifolia Plastom 161572 bp LSC: 89140 bp SSC: 19652 bp IRa und IRb: je 26390 bp Typha latifolia Plastom 161.572 bp LSC: 8 .140 bp SSC: 19.652 bp IR: jeweils 26.390 bp Ergebnisse Tabelle 3.14: Charakteristik von 24 plastidären Mikrosatellitenmarkern, die aus 454-Sequenzen von Fosterella rusbyi entwickelt wurden. Die ermittelten Genorte und Positionen der 24 Loci beziehen sich auf das Typha latifolia-Plastom (GUISINGER et al. 2010) und wurden durch eine BLAST- Analyse (ALTSCHUL et al. 1997) identifiziert. Insgesamt zehn Loci wurden für die Hauptuntersuchung ausgewählt (*). Locus SSR-Motiv Primer-Sequenz (5`-3`) Optimale Anlagerungs- Temperatur Genort (T. latifolia) Position (T. latifolia) Erwartete Fragmentlänge in bp (F. rusbyi) cpFos_1* (T)10 GGAGTTCCGCTTCCATTCCC TGGTGTTCAATTATCAGAAACGG 59.1°C ycf1 132.900- 133.100 201 cpFos_2* (A)10 GGCAACCCATCATTTGAGTGA TGCCAATCCAACACAAGTCT 58.2°C trnKUUU-rps16 intergenisch 4.349- 4.521 176 cpFos_3* (A)10 TTCGTCAATCCCAACCCAAA TTCTTCGGTTCGGACTCTCC 58.4°C trnQ UUG 7.238- 7.437 214 cpFos_4* (A)10 TCCGCTGTTATCCGCTACAT AAAGGGGTATTGGGGATGAAAA 58.3°C rpl14 86.224- 86.383 164 cpFos_5* (A)10 CGGGTCTATCGGAAACTCC ATCCGTCTTTCAACCGTCTT 57.1°C petA-psbJ intergenisch 67.861- 68.028 193 cpFos_6* (A)10 GCTTGAGACTAAATCATCGTGGT TGTTGATCGTTACAGGCCTCT 59.0°C petB 80.368- 80.486 187 cpFos_7* (G)12 TTTGGATCGGATTTGGCGG GCAGGGCAAGAATTTCTCGA 58.5°C trnC GCA 29.229- 29.375 162 cpFos_8 (A)10 TCTCAACTCACCAACTTGAATCC TTGTGAGGGTCGTTCTAGCT 58.5°C atpI 16.718- 16.961 247 cpFos_9 (T)10 TTTACCACCCTTCCCTTCGT GTGTCGGGAGTACATTTCAGC 58.8°C clpP 75.454- 75.697 246 cpFos_10 (A)10 TTTCAGGTTCTCTCCCCACC ATCAAGCAGAAGAGGTGGCT 59.0°C ycf1 133.393- 133.632 246 cpFos_11 (A)10 TCAACAGATCCTTTTACCTTCCT ATGCGGGAAAGAGTGGGTT 58.1°C trnK UUU 3.413- 3.650 250 cpFos_12 (T)10 GCTACACCGCTGCTCAATAC GCAAGGAAAGAGACTTCACGA 58.7°C ycf3 45.649- 45.883 241 cpFos_13 (A)15 GTATCACCCAACCGAATCCG AGAACAAAGGCCAATAAGATCGA 58.3°C rbcL 58.075- 58.313 232 cpFos_14* (A)11 CTTAGGAACCGTACGTGCAC GAGGGAAGGGAGCCAAAACT 59.1°C clpP 76.206- 76.371 173 cpFos_15* (A)10 GTTTTGGCTCCCTTCCCTCT GCAGATCTTTTCCCGGGGTA 59.5°C clpP 76.353- 76.521 169 cpFos_16* (C)15 CGACTAGGGTTGCTGTTTCC TGGCCCAGATCTAGAACTATCC 58.5°C psbN 79.518- 79.692 188 cpFos_17 (T)10 TGGATCCAACAACCAAACCC CAGGCCATTCTACAGGGTGA 58.7°C psaA-ycf3 intergenisch 45.098- 45.265 207 cpFos_18 (T)10 GGCATGCTACGTTTGCTTTG CAGTCAAGATTTCTCGGATACCC 58.6°C psbB 78.901- 79.137 243 cpFos_19 (T)10 ACTCCTTACTCAAGTTCCCAGT CCATCGAGGTGAGTAGAGACC 58.7°C rpoC1 23.989- 24.220 228 cpFos_20 (T)10 GGTACCATATAGAAGCGGCCA AAAAGGAGCGTTGGAATGGT 58.7°C ndhK 53.302- 53.505 201 cpFos_21 (T)10 CACAAGGAAACGATACAATTGGT CCAACCATGAGTCGAGTGAA 57.6°C cemA 65.859- 66.104 250 cpFos_22 (T)10 TCCTGCAAGATATCCCGAGG AGATATCCAGGCACAGCGG 59.0°C rpoC2 19.636- 19.764 212 cpFos_23 (A)10 CCCGCAAAGTGGTGATTCAA ATTGAATGGTGATGTGGGCG 59.0°C psaA 43.880- 44.113 238 cpFos_24 (A)10 GGACAATTCAGGATTCAAATGGT CAACCATTTCCGAACACCTCA 58.1°C trnTGGU-psbD intergenisch 35.270- 35.497 231 3.4.2.1 Pilotstudien Um die Übertragbarkeit und Funktionalität der zehn cpSSR-Primerpaare zu untersuchen, wurde ein Testset aus 13 Pflanzen aus acht Bromelienarten zusammengestellt (Set 13, Tabelle T2 im Anhang). Der Schwerpunkt lag dabei auf der Gattung Fosterella, welche durch vier Arten mit neun Akzessionen repräsentiert war. Die PCR wurde mit fluoreszenzmarkierten M13-Primern nach SCHUELKE (2000) ohne weitere Modifizierungen durchgeführt (siehe Tabelle 3.14). In Abbildung 3.12 sind die PAA-Gelbilder der PCR-Produkte aller 13 Pflanzenproben an allen zehn Loci dargestellt. 88 Ergebnisse Abbildung 3.12: Spezifisches Bandenmuster an zehn chloroplastidären Mikrosatellitenloci, die spezifisch für das Plastom von Fosterella rusbyi entwickelt wurden. Amplifiziert wurden die Loci in acht verschiedenen Bromelienarten (Pflanzenset 13). Auftragsreihenfolge: 1-3: F. rusbyi, 4-5: F. christophii, 6-7: F. micrantha, 8-9: F. villosula, 10: Dyckia marnier-lapostollei var. estevesii, 11: Deuterocohnia longipetala, 12: Encholirium spec., 13: Ananas comosus, N: Negativkontrolle. Neun der zehn Marker funktionierten in allen untersuchten Arten der Gattungen Fosterella, Dyckia, Deuterocohnia und Encholirium sowie der weit entfernt verwandten Gattung Ananas (UF Bromelioideae). Bis auf eine Ausnahme (D. longipetala BT_123 am Locus cpFos_5) wurde stets entsprechend dem haploiden Status des Plastoms ein einzelnes Fragment generiert. Stotterbanden, welche aufgrund einer unvollständigen Adenylierung durch die Taq DNA- Polymerase während der PCR hervorgerufen werden, waren an jedem Locus in unterschiedlicher Intensität zu beobachten, interferierten jedoch nicht mit der Auswertbarkeit. Über alle Arten hinweg erwiesen sich acht der Loci mit drei bis sieben Allelen (durchschnittlich 5,1) als polymorph, nur die Loci cpFos_1 und cpFos_16 zeigten ein monomorphes Bandenmuster. Mit drei Markern (cpFos_3, cpFos_4 und cpFos_14) konnte innerartliche Variation in F. rusbyi nachgewiesen werden (zwei bis drei Allele in drei Individuen aus zwei bolivianischen Populationen). In F. christophii erwiesen sich sechs Loci als variabel (cpFos_2, cpFos_3, cpFos_6, cpFos_7, cpFos_14 und cpFos_15), innerhalb von F. micrantha hingegen nur einer (cpFos_2). Für die beiden Akzessionen von F. villosula war das Bandenmuster durchweg monomorph. Sämtliche Fragmentlängen sind im digitalen Anhang (DA-6) zusammengefasst. Die Anwendung der zehn plastidären Mikrosatellitenmarker in einem erweiterten Testset (Set 14, Tabelle T2 im Anhang) bestehend aus 39 Akzessionen verschiedener Vertreter der Tillandsioideae, Puyoideae, Brocchinioideae, Hechtioideae, Pitcairnioideae und Bromelioideae zeigte ein ähnliches Bild. Die Abbildung 3.13 zeigt exemplarisch die für die beiden variabelsten Loci cpFos_4 und cpFos_14 erhaltenen Ergebnisse. Alle Fragmentgrößen wurden im digitalen 89 Ergebnisse Anhang (DA-6) zusammengefasst. Sieben der zehn Marker generierten zwischen drei und 12 distinkte Einzelbanden in allen untersuchten Akzessionen und waren somit auch zwischen Unterfamilien zu 100% übertragbar. Variation auf innerartlichem Niveau wurde in Catopsis morreniana an drei (cpFos_4, cpFos_14, cpFos_15), in Puya mirabilis an einem (cpFos_4), in Hechtia glomerata und A. nanus an zwei (cpFos_2 bis cpFos_15, bzw. cpFos_4, cpFos_14) und in Ananas bracteatus sowie A. comosus an vier Loci (cpFos_4, cpFos_6, cpFos_14, cpFos_15) detektiert. Je fünf Loci erzeugten ein polymorphes Bandenmuster in den untersuchten Pflanzenproben der Gattungen Brocchinia und Pitcairnia (je eine Akzession pro Art). Als durchweg monomorph erwiesen sich die Loci cpFos_1 und cpFos_16. Am Locus cpFos_5 wurden für Pitcairnia pungens sowie beide Vertreter der Gattung Brocchinia Ausfälle verzeichnet. Abbildung 3.13: Ergebnisse der Übertragbarkeitstests zweier repräsentativer plastidärer Mikrosatellitenloci (A: cpFos_4, B: cpFos_14) in 39 Akzessionen (Set 14) verschiedener Unterfamilien der Bromeliaceae. Auftragsreihenfolge: 1-6: Catopsis morreniana, 7-10: Puya mirabilis, 11: Brocchinia acuminata, 12: Brocchinia spec., 13+14: Hechtia glomerata, 15: Pitcairnia heterophylla, 16: Pitcairnia atrorubens, 17: Pitcairnia pungens, 18: Ananas ananassoides, 19-23: Ananas bracteatus, 24-33: Ananas comosus, 34-37: Ananas nanus, 38: Ananas spec., 39: Fosterella rusbyi (Positivkontrolle). Für die populationsgenetische Studie in Fosterella rusbyi (Kapitel 3.7) wurden mit Ausnahme von cpFos_1 und cpFos_16 zunächst alle Marker verwendet. Der Locus ngFos_7 stellte sich allerdings als monomorph heraus, sodass er nicht in die Analysen miteinbezogen wurde. 90 Ergebnisse 3.5 Artabgrenzung von Dyckia dissitiflora, Dy. pernambucana, Dy. macedoi und Dy. limae Die in Kapitel 3.3.3.2 vorgestellten Primerpaare wurden verwendet, um 89 individuelle Pflanzen von neun Populationen der vier nordostbrasilianischen Arten Dy. dissitiflora, Dy. pernambucana, Dy. macedoi und Dy. limae zu genotypisieren. Mit diesen Experimenten sollte das Potenzial der Mikrosatellitenmarker zur Abgrenzung dieser nahe verwandten Arten bzw. ihrer Populationen geprüft werden. Die 89 Pflanzenproben des Pflanzensets 12 waren in drei brasilianischen Bundesstaaten (Pernambuco, Bahia und Minas Gerais) von unserem Kooperationspartner D. PINANGÉ (Universität Pernambuco, Recife) gesammelt worden. In Abbildung 3.14 sind die neun Sammelorte durch farbige Kreise dargestellt. Abbildung 3.14: Fundorte des Pflanzenmaterials der vier untersuchten Dyckia-Arten. Die 89 Individuen stammten von neun Lokalitäten in den brasilianischen Bundesstaaten Pernambuco, Bahia und Minas Gerais (Set 12, Tabelle T2 im Anhang). Die Fundorte sind durch farbige Kreise gekennzeichnet und in der Legende entsprechend definiert. Die Amplifikation der 15 Mikrosatellitenloci war in allen Individuen zu 100% erfolgreich. Die Alleldaten wurden zur Berechnung einer Reihe von populationsgenetischen Parametern herangezogen, die in Tabelle 3.15 zusammenfassend dargestellt sind. Über alle Loci hinweg wurden durchschnittlich 12,3 Allele ermittelt. Mit insgesamt 38 verschiedenen Allelen in vier Arten stellte sich der Locus ngDy_24 als der variabelste Locus heraus, ngDy_25 dagegen erwies sich mit nur drei Allelen als am wenigsten variabel. In Dy. dissitiflora und Dy. macedoi waren alle 15 91 Ergebnisse Loci mit zwei bis 24 bzw. mit zwei bis elf Allelen innerartlich polymorph (= Ø 7,5 bzw. 5,5). Dagegen wurden in Dy. pernambucana und in Dy. limae nur durchschnittlich 4,1 bzw. 3,5 Allele über alle Loci detektiert, wobei sich fünf der Loci (ngDy_8, ngDy_10, ngDy_25, ngDy_30, ngDy_32) in einigen Arten als monomorph erwiesen (vgl. Tabelle 3.15). Von den drei untersuchten Populationen von Dy. dissitiflora wurden in ’Lajes’ mit einem Durchschnittswert von 4,9 die meisten Allele detektiert, hingegen erwies sich die Population ’Pico do Papagaio’ (Dy. pernambucana) mit durchschnittlich 1,6 Allelen als am wenigsten variabel. Ebenfalls wenig variabel waren die Populationen ’Brejo Madre Deus’ und ’Lajedo Santa Rita’, beide mit durchschnittlich 1,7 Allelen. Die Werte der beobachteten Heterozygotie pro Art reichten von Ho = 0,22 in Dy. pernambucana bis Ho = 0,47 in Dy. macedoi, die der erwarteten Heterozygotie von He = 0,24 in Dy. pernambucana bis He = 0,63 in Dy. macedoi. Über alle Akzessionen und Loci hinweg lagen die gemittelten Werte bei 0,34 für Ho und 0,39 für He. Bezüglich des Inzuchtskoeffizienten Fis ergab sich kein einheitliches Bild. Der Fis-Wert betrug über alle Akzessionen und Loci hinweg 0,45, erwies sich jedoch als sehr variabel und von Locus zu Locus und von Population zu Population unterschiedlich (vgl. Tabelle 3.15). In Dy. limae (zehn Akzessionen von einer Lokalität) wurde mit 0,01 der niedrigste gemittelte Fis- Wert festgestellt, hier wich nur ein Locus (ngDy_16) signifikant vom HARDY-WEINBERG Gleichgewicht ab. Dabei muss allerdings berücksichtigt werden, dass an vier der 15 Loci (ngDy_8, ngDy_10, ngDy_25, ngDy_30) aufgrund eines monomorphen Bandenmusters oder eines zu niedrigen Anteils an heterozygoten Individuen eine Kalkulation des Fis-Wertes nicht möglich war. Ebenfalls niedrige Fis-Werte wurden in den drei untersuchten Populationen von Dy. dissitiflora detektiert, ausgedrückt durch einen durchschnittlichen Wert von 0,14. Signifikante Abweichungen vom HARDY-WEINBERG Gleichgewicht ergaben sich an drei Loci (ngDy_1, ngDy_16 und ngDy_22). Am Locus ngDy_8 war keine Berechnung des Fis-Wertes möglich, da nur ein Individuum aus der Population ’Ferro Doido’ heterozygot war. Mit durchschnittlich 0,24 zeigten die 12 Pflanzenproben der einzigen Population von Dy. macedoi einen etwas höheren Fis-Wert, signifikante Abweichungen vom HARDY-WEINBERG Gleichgewicht wurden an drei der 15 Mikrosatellitenloci nachgewiesen (ngDy_22, ngDy_31 und ngDy_32). Der höchste Fis-Wert (0,42) über die gesamte Art hinweg wurde für Dy. pernambucana errechnet, allerdings auf Basis der verhältnismäßig niedrigen durchschnittlichen Allelzahl von 4,1 über 30 Akzessionen hinweg. Innerhalb der vier Einzelpopulationen war aufgrund des häufig monomorphen Bandenmusters an einigen der Loci keine Kalkulation des Inzuchtskoeffizienten möglich, zudem wichen acht Loci signifikant vom HARDY-WEINBERG Gleichgewicht ab. 92 Ergebnisse Tabelle 3.15: Populationsgenetische Parameter auf Basis der Alleldaten an 15 Mikrosatellitenloci in 89 Individuen (Set 12) von neun verschiedenen Populationen aus vier Dyckia-Arten (farbig markiert). Je Locus und Art sind die Allelzahlen (Na), die Werte der beobachteten und erwarteten Heterozygotie (Ho und He) sowie der jeweilige Proben-Umfang (N) pro Population angegeben. Ebenfalls ermittelt wurden die Allelzahlen pro Art (Nad = Allelzahlen für Dy. dissitiflora; Nap = Allelzahlen für Dy. pernambucana), die Allelzahlen über alle Akzessionen (Natotal) hinweg, die Fis-Werte pro Population und Art (Fisd = Fis-Werte für Dy. dissitiflora; Fisp = Fis-Werte für Dy. pernambucana) und für alle Individuen (Fistotal) sowie die Abweichungen vom HARDY-WEINBERG Gleichgewicht (p-Wert ***: < 0,001; **: < 0,01; *: < 0,05; n.s.: nicht signifikant), sofern eine Kalkulation möglich war. Dyckia dissitiflora ’Ferro Doido’ (N = 19) ’Lajes’ (N = 10) ’Morrão’ (N = 8) (N = 37) Locus Na Ho He Fis Na Ho He Fis Na Ho He Fis Nad Fisd ngDy_1 4 0,21 0,53 0,61*** 3 0,00 0,36 1,00** 5 0,50 0,61 0,19n.s. 6 0,68*** ngDy_3 5 0,53 0,51 -0,03n.s. 3 0,60 0,62 0,03n.s. 3 0,63 0,68 0,08n.s. 5 0,04n.s. ngDy_8 2 0,05 0,05 – 1 0 0 – 1 0 0 – 2 – ngDy_10 3 0,68 0,61 -0,13n.s. 3 0,90 0,67 -0,37n.s. 3 0,63 0,58 -0,09n.s. 3 -0,18n.s. ngDy_16 6 0,68 0,70 0,02n.s. 7 0,60 0,83 0,29n.s. 4 0,50 0,53 0,05n.s. 9 0,13* ngDy_17 1 0 0 – 3 0,20 0,19 -0,03n.s. 2 0,13 0,13 3 -0,02n.s. ngDy_22 4 0,32 0,65 0,52** 5 0,40 0,69 0,44n.s. 5 0,38 0,67 0,45n.s. 7 0,52*** ngDy_24 10 0,89 0,88 -0,01n.s. 14 1,00 0,97 -0,04n.s. 8 0,63 0,92 0,33n.s. 24 0,09n.s. ngDy_25 2 0,53 0,40 -0,33n.s. 2 0,30 0,27 -0,13n.s. 2 0,25 0,50 0,52n.s. 2 -0,05n.s. ngDy_27 1 0 0 – 2 0,10 0,10 – 3 0,50 0,43 -0,19n.s. 4 -0,04n.s. ngDy_30 5 0,47 0,50 0,06n.s. 4 0,50 0,54 0,07n.s. 3 0,13 0,34 0,65n.s. 8 0,16n.s. ngDy_31 7 0,47 0,85 0,45** 5 0,50 0,73 0,32n.s. 6 0,88 0,81 -0,09n.s. 10 0,32n.s. ngDy_32 8 0,68 0,84 0,19n.s. 9 0,30 0,89 0,67*** 8 0,50 0,92 0,47** 15 0,41n.s. ngDy_45 7 0,68 0,70 0,03n.s. 9 0,90 0,86 -0,05n.s. 5 0,88 0,78 -0,14n.s. 11 -0,02n.s. ngDy_49 1 0 0 – 3 0,30 0,28 -0,08n.s. 3 0,38 0,34 -0,11n.s. 3 -0,05n.s. Ø 4,4 0,41 0,48 0,13 4,9 0,44 0,53 0,16 4,1 0,46 0,55 0,16 7,5 0,14 Dyckia pernambucana ’Brejo Madre Deus’ (N = 10) ’Pesgueira’ (N = 10) ’Pico do Papagaio’ (N = 5) ’Lajedo Santa Rita’ (N = 5) (N = 30) Locus Na Ho He Fis Na Ho He Fis Na Ho He Fis Na Ho He Fis Nap Fisp ngDy_1 2 0,30 0,39 0,25n.s. 2 0,30 0,27 -0,13n.s. 2 0,60 0,56 -0,09n.s. 3 0,80 0,60 -0,39n.s. 4 0,07n.s. ngDy_3 3 0,50 0,62 0,20n.s. 4 0,60 0,62 0,03n.s. 2 0,20 0,20 – 1 0 0 – 4 0,20n.s. ngDy_8 1 0 0 – 1 0 0 – 1 0 0 – 1 0 0 – 1 – ngDy_10 2 0,10 0,10 – 2 0,10 0,10 – 1 0 0 – 1 0 0 – 3 -0,01n.s. ngDy_16 1 0 0 – 2 0,30 0,27 -0,13n.s. 1 0 0 – 2 0,80 0,53 -0,60n.s. 3 0,50** ngDy_17 1 0 0 – 1 0 0 – 2 0,40 0,53 0,27n.s. 1 0 0 – 2 0,87*** ngDy_22 2 0,10 0,52 0,82* 1 0 0 – 3 0,60 0,69 0,14n.s. 3 0,20 0,51 0,64n.s. 5 0,74*** ngDy_24 4 0,50 0,72 0,32n.s. 7 0,70 0,85 0,19* 3 0,80 0,60 -0,39n.s. 4 0,60 0,73 0,20n.s. 13 0,29*** ngDy_25 2 0,10 0,10 – 1 0 0 – 1 0 0 – 1 0 0 – 2 0,93*** ngDy_27 1 0 0 – 3 0,20 0,19 -0,03n.s. 1 0 0 – 1 0 0 – 3 -0,01n.s. ngDy_30 1 0 0 – 2 0,20 0,19 -0,06n.s. 1 0 0 – 1 0 0 – 2 0,85*** ngDy_31 1 0 0 – 1 0 0 – 1 0 0 – 1 0 0 – 1 – ngDy_32 2 0,20 0,19 -0,06n.s. 4 0,20 0,50 0,61** 2 0,80 0,53 -0,60n.s. 4 0,40 0,73 0,48n.s. 9 0,60*** ngDy_45 1 0 0 – 3 0,30 0,62 0,53* 2 0,80 0,53 -0,60n.s. 1 0 0 – 4 0,45*** ngDy_49 2 0,50 0,48 -0,05n.s. 4 0,90 0,68 -0,35n.s. 1 0 0 – 1 0 0 – 5 0,01n.s. Ø 1,7 0,15 0,21 0,25 2,5 0,25 0,29 0,07 1,6 0,28 0,24 -0,21 1,7 0,19 0,21 0,07 4,1 0,42 Dy. limae Dy. macedoi Alle Arten ’Buique’ (N = 10) ’Serra do Cipo’ (N = 12) (N = 89) Locus Na Ho He Fis Na Ho He Fis Locus Natotal Fistotal ngDy_1 2 0,20 0,19 -0,06n.s. 7 0,50 0,80 0,39n.s. ngDy_1 10 0,57 ngDy_3 2 0,20 0,19 -0,06n.s. 7 0,75 0,79 0,06n.s. ngDy_3 12 0,38 ngDy_8 2 0,10 0,10 – 4 0,33 0,43 0,24n.s. ngDy_8 6 0,74 ngDy_10 1 0 0 – 2 0,58 0,43 -0,38n.s. ngDy_10 6 0,18 ngDy_16 3 0,20 0,57 0,66* 4 0,33 0,37 0,10n.s. ngDy_16 12 0,42 ngDy_17 3 0,60 0,54 -0,11n.s. 5 0,33 0,43 0,24n.s. ngDy_17 9 0,77 ngDy_22 5 0,80 0,69 -0,16n.s. 6 0,42 0,82 0,50** ngDy_22 10 0,55 ngDy_24 12 1,00 0,94 -0,07n.s. 7 0,58 0,76 0,24n.s. ngDy_24 38 0,21 ngDy_25 1 0 0 – 2 0,33 0,39 0,15n.s. ngDy_25 3 0,45 ngDy_27 5 0,50 0,66 0,26n.s. 5 0,33 0,63 0,48* ngDy_27 9 0,50 ngDy_30 1 0 0 – 5 0,75 0,79 0,05n.s. ngDy_30 11 0,61 ngDy_31 2 0,30 0,27 -0,13n.s. 8 0,33 0,82 0,60*** ngDy_31 18 0,59 ngDy_32 6 0,90 0,76 -0,19n.s. 11 0,75 0,91 0,19*** ngDy_32 20 0,41 ngDy_45 4 0,60 0,66 0,09n.s. 5 0,42 0,67 0,39n.s. ngDy_45 13 0,22 ngDy_49 3 0,30 0,28 -0,08n.s. 4 0,25 0,42 0,42n.s. ngDy_49 8 0,10 Ø 3,5 0,38 0,39 0,01 5,5 0,47 0,63 0,24 Ø 12,3 4,45 93 Ergebnisse 3.5.1 BAYES`sche Analyse zur Bestimmung der wahrscheinlichsten Anzahl an Gruppen Um das Potenzial der 15 Mikrosatellitenmarker in Bezug auf die Abgrenzung der vier Dyckia- Arten zu validieren, wurde eine BAYES`sche Analyse mit dem Programm STRUCTURE durchgeführt. Als wahrscheinlichsten Delta K-Wert im Dyckia-Datensatz ergab die STRUCTURE- Analyse (1 ≤ K ≤ 9) eindeutig K = 3. Das resultierende Diagramm zur Bestimmung des optimalen K- Wertes ist auf der linken Seite von Abbildung 3.15 dargestellt, auf der rechten Seite ist das dazugehörige Balkendiagramm illustriert, in welchem die Individuen entsprechend ihrer Artzugehörigkeit farblich hinterlegt sind. Abbildung 3.15: Ergebnis der STRUCTURE-Analyse zur Ermittlung des wahrscheinlichsten K-Wertes in 89 Individuen der vier Arten Dy. dissitiflora, Dy. limae, Dy. pernambucana und Dy. macedoi auf Basis der Alleldaten an 15 Mikrosatellitenloci (1 ≤ K ≤ 9). Im Balkendiagramm auf der rechten Seite sind die einzelnen Individuen nach Artzugehörigkeit farblich markiert. Die Zugehörigkeit zu einer der drei Gruppen gemäß dem STRUCTURE- Ergebnis K = 3 wird durch unterschiedliche Grautöne symbolisiert. Die drei von STRUCTURE ermittelten genetischen Cluster sind in unterschiedlichen Grautönen hinterlegt. Das erste Cluster (mittelgrau) enthält alle Individuen der drei Populationen von Dy. dissitiflora (orange). Das zweite Cluster (hellgrau) umfasst Individuen und Populationen von Dy. limae (blau) und Dy. pernambucana (grün). Das dritte Cluster (dunkelgrau) beherbergt alle Akzessionen von Dy. macedoi (violett). Anzeichen für eine genetische Vermischung sind nur in wenigen Proben zu beobachten. Dyckia macedoi, Dy. dissitiflora und der Komplex ’Dy. limae / pernambucana’ können demnach auf Grundlage der Mikrosatellitenmarker sehr gut als eigenständige Arten abgegrenzt werden, zwischen Dy. limae und Dy. pernambucana ist eine solche Abgrenzung hingegen mit STRUCTURE nicht möglich. 3.5.2 Hauptkoordinaten-Analyse (’principal coordinates analysis’, PCoA) Die ersten drei Achsen (Dim-1 bis Dim-3) des in Abbildung 3.16 dargestellten Diagramms aus der 94 Ergebnisse PCo-Analyse spiegeln insgesamt 55% der Gesamtvariation des Datensatzes wieder. Die Verteilung der Individuen auf drei Punktewolken entspricht dem Ergebnis der STRUCTURE-Analyse (K = 3). Die Individuen von Dy. pernambucana und Dy. limae gruppieren auch hier zusammen und bilden einen Artenkomplex, der von den ihrerseits klar getrennten Arten Dy. macedoi und Dy. dissitiflora deutlich differenziert ist. Während die Individuen der drei einzelnen Dy. dissitiflora-Populationen relativ stark durchmischt sind, ist für Dy. pernambucana eine gewisse Gruppierung nach Populationszugehörigkeit festzustellen. Abbildung 3.16: PCo-Analyse von 89 Akzessionen (Set 12) neun verschiedener Populationen von Dy. dissitiflora, Dy. limae, Dy. macedoi und Dy. pernambucana basierend auf den Mikrosatellitendaten an 15 Loci und dem Unähnlichkeits-Koeffizienten nach BRAY & CURTIS (1957). Die drei abgebildeten Achsen (Dim-1 bis Dim-3) spiegeln insgesamt 55% der Gesamtvariation des Datensatzes wieder. Die Punkte sind entsprechend der Art-, bzw. Populationszugehörigkeit farblich markiert. Die Aufteilung in drei große Gruppen entspricht dem Ergebnis der STRUCTURE-Analyse (Abbildung 3.15). 3.5.3 NeighbourNet und genetische Differenzierung Wie für Fosterella rusbyi (Kapitel 3.3.2.2) wurde auch für den Dyckia-Datensatz ein phylogenetisches Netzwerk basierend auf ROUSSET`s genetischer Distanz zwischen Individuen erstellt, welches in Abbildung 3.17 wiedergegeben ist. Für die Differenzierung der neun Populationen wurden die gleichen Farben verwendet wie in Abbildung 3.14 und Tabelle 3.15. Das Netzwerk zeigt eine klare Trennung zwischen den Arten Dy. dissitiflora und Dy. macedoi. Der Komplex ’Dy. limae / pernambucana’ ist deutlich von Dy. macedoi und Dy. dissitiflora getrennt. Die 95 Ergebnisse Vertreter von Dy. limae nehmen dabei eine intermediäre Position zwischen den Populationen ’Brejo Madre Deus’ und ’Lajedo Santa Rita’ von Dy. pernambucana ein. Über alle Arten hinweg gruppieren nahezu alle Individuen entsprechend ihrer Populationszugehörigkeit, lediglich die Individuen der Populationen ’Morrão’ und ’Lajes’ (Dy. dissitiflora) sind heterogen im rechten Teil des Netzwerks verteilt und flankieren die Individuen der Population ’Ferro Doido’. Abbildung 3.17: Phylogenetisches Netzwerk von 89 Dyckia-Individuen aus vier Arten (Set 12) basierend auf 15 Mikrosatellitenmarkern und den daraus berechneten ROUSSET-Distanzen zwischen Individuen. Es wurden neun Populationen analysiert, die entsprechenden Äste im Netzwerk sind farblich markiert. Rote Farbtöne: 37 Proben von Dy. dissitiflora (drei Populationen), grüne Farbtöne: 30 Proben von Dy. pernambucana (vier Populationen), violett: 12 Proben von Dy. macedoi (eine Population), blau: zehn Proben von Dy. limae (eine Population). Wie aus Tabelle 3.16 hervorgeht, liegen die Fundorte von Dy. dissitiflora geographisch sehr nah beieinander, hierbei ist die Distanz zwischen den beiden Populationen ’Lajes’ und ’Morrão’ mit knapp 5 km am kleinsten, der Höhenunterschied zwischen beiden Fundorten beträgt ca. 125 m. Der Fst-Wert, der als Maß der genetischen Differenzierung betrachtet werden kann, gibt Auskunft 96 Ergebnisse darüber, in welchem Stadium der Allelfixierung sich eine bestimmte Population befindet. Dieser Fixierungs-Index wurde für alle möglichen paarweisen Kombinationen der neun Dyckia- Populationen kalkuliert und betrug gemittelt über alle vier Arten 0,367. Für die drei Populationen von Dy. dissitiflora wurde ein durchschnittlicher paarweiser Fst-Wert von 0,069 ermittelt, für die vier Populationen von Dy. pernambucana lag dieser Wert mit bei 0,46 deutlich höher. Die jeweils nur durch eine Population vertretenen Arten Dy. macedoi und Dy. limae erlaubten keine Ermittlung des durchschnittlichen Fst-Wertes. Insgesamt waren 97,2% der in Tabelle 3.16 aufgeführten Fst-Werte signifikant, lediglich der Vergleich zwischen den geographisch sehr nahen Populationen ’Lajes’ und ’Morrão’ (Dy. dissitiflora) hatte keine statistische Aussagekraft (Fst = 0,022). Insgesamt unterstützen die paarweisen Fst-Werte die Topologie des in Abbildung 3.17 gezeigten Netzwerks. Tabelle 3.16: Paarweise genetische und geographische Distanzen zwischen den neun untersuchten Populationen aus vier Dyckia-Arten (Set 12). Unterhalb der Diagonalen sind die paarweisen Fst-Werte als Maß der genetischen Differenzierung gezeigt (nicht signifikante Werte sind „fett“ gedruckt), oberhalb der Diagonalen die paarweisen Entfernungen in Kilometern. Dy. dissitiflora Dy. pernambucana Dy. macedoi Dy. limae Population ’FD’ ’LA’ ’MO’ ’BMD’ ’PE’ ’PP’ ’LSR’ ’SC’ ’BU’ ’Ferro Doido’ 18,1 22,9 633,1 592,3 532,1 608,5 903,8 533,1 ’Lajes’ 0,087 4,8 645,7 604,7 540,9 622,1 901,4 545,2 ’Morrão’ 0,097 0,022 648,8 607,7 542,9 625,5 901,2 548,2 ’Brejo Madre Deus’ 0,477 0,493 0,473 42,7 187,5 53,9 1.465,8 102,8 ’Pesgueira’ 0,422 0,412 0,396 0,514 153,6 61,0 1.432,3 60,3 ’Pico do Papagaio’ 0,426 0,398 0,414 0,551 0,469 212,6 1.415,9 123,5 ’Lajedo Santa Rita’ 0,424 0,412 0,417 0,550 0,419 0,258 1.415,9 101,0 ’Serra do Cipo’ 0,349 0,307 0,293 0,474 0,417 0,341 0,354 1.381,0 ’Buique’ 0,394 0,364 0,355 0,396 0,301 0,245 0,226 0,343 Auf innerartlichem Niveau deutet die Topologie des Netzwerks in Verbindung mit den genetischen Distanzen darauf hin, dass zwischen den Individuen von Dy. dissitiflora und hier besonders zwischen den Populationen ’Lajes’ und ’Morrão’ ein reger Genfluss besteht. In Dy. pernambucana hingegen weisen die durchweg hohen Fst-Werte sowie die klare Gruppierung im Netzwerk auf eine signifikante Differenzierung der vier Populationen voneinander hin, was auf die mögliche Existenz von Ausbreitungsbarrieren hindeutet. Die einzige untersuchte Population von Dy. limae weist eine intermediäre Position zwischen den vier Populationen von Dy. pernambucana auf, was wie bereits die STRUCTURE- und die PCo-Analyse für eine sehr enge verwandtschaftliche Beziehung zwischen diesen beiden Arten spricht. Die Individuen von Dy. macedoi hingegen nehmen sowohl im Netzwerk als auch hinsichtlich der geographischen Distanz von mindestens 901,2 km zum nächsten Fundort eine isolierte Position gegenüber allen übrigen Arten ein. Dies wird durch die durchweg hohen Fst-Werte von 29,3% bis 47,4% gestützt. 97 Ergebnisse 3.6 Artabgrenzung innerhalb der micrantha-Gruppe Nach Maßgabe der Chloroplastenphylogenien von REX et al. (2009) und WAGNER (2012) bilden die drei Arten Fosterella christophii, F. micrantha und F. villosula eine monophyletische Gruppe. Interessant an dieser sog. micrantha-Gruppe ist der Aspekt, dass F. micrantha als einzige Vertreterin der Gattung Fosterella ausschließlich in Zentralamerika anzutreffen ist, wohingegen die beiden anderen Arten unterschiedliche Habitate in Bolivien besiedeln. Nach den Chloroplastendaten von REX et al. (2009) und WAGNER & SILVESTRO et al. (2013) ist F. christophii von den beiden übrigen Arten deutlich getrennt, wohingegen eine populationsgenetische AFLP- Analyse mit sechs Primerkombinationen eher auf eine separate Stellung von F. micrantha gegenüber F. christophii und F. villosula hindeutet (WAGNER 2012). Eine Auswahl der in den Kapiteln 3.3.1 und 3.3.2 vorgestellten Mikrosatellitenmarker wurde verwendet, um die von WAGNER (2012) bereits untersuchten Individuen der micrantha-Gruppe zu genotypisieren und in Bezug auf die Abgrenzung der drei Arten zu untersuchen. WAGNER (2012) hatte in ihren AFLP-Studien insgesamt 109 Pflanzenproben aus 21 Populationen verwendet, darunter 9 Populationen von F. villosula (54 Individuen), 6 Populationen von F. christophii (28 Individuen) und 6 Populationen von F. micrantha (27 Individuen). Für die hier durchgeführte Mikrosatellitenanalyse wurde dieser Datensatz auf 190 Pflanzenproben aus 28 Populationen erweitert (Set 9, Tabelle T2 im Anhang), davon 11 Populationen von F. villosula (83 Individuen), 9 Populationen von F. christophii (50 Individuen) und 8 Populationen von F. micrantha (57 Individuen). Die Pflanzenproben stammten aus Freilandaufsammlungen von N. WAGNER (NW), I. MICHALAK (IM) und N. SCHÜTZ. Basierend auf den Ergebnissen der Übertragbarkeitstests in Kapitel 3.3.2.3 wurden vier 454-Mikrosatellitenmarker aus F. rusbyi zur Genotypisierung verwendet (ngFos_4, ngFos_6, ngFos_11 und ngFos_12). Zusätzlich wurden vier EST-Mikrosatellitenmarker eingesetzt, deren erfolgreiche Übertragbarkeit innerhalb der Gattung Fosterella bereits nachgewiesen wurde (Acom_12.12, Acom_101.1, Acom_109.6 und Acom_117.15). Die Abbildung 3.18 zeigt exemplarisch die spezifischen Bandenmuster für einen Teil der Proben an drei der acht Mikrosatellitenloci. Die Amplifikation an allen acht Loci war bis auf vier Individuen aus Population NW09.019 (F. villosula) am Locus Acom_109.6 durchweg erfolgreich und lieferte entsprechend dem diploiden Status der Arten entweder eine oder zwei Banden pro Locus. Die Fragmentlängen für alle Individuen an allen Loci sind im digitalen Anhang (DA-6) zusammengestellt. 98 Ergebnisse Abbildung 3.18: Genotypisierung von Vertretern der Fosterella micrantha-Gruppe (Auszug des Pflanzensets 9) an einem 454- und zwei EST- Mikrosatellitenloci. A und B: Genotypen von 40 Individuen von F. christophii aus fünf Populationen an den Loci ngFos_11 (A) und Acom_101.1 (B); C und D: Genotypen von 80 Individuen von F. villosula aus zehn Populationen am Locus Acom_12.12; E und F: Genotypen von 80 Individuen von F. micrantha aus zehn Populationen am Locus Acom_101.1. Als Positivkontrollen wurde stets entweder eine F. rusbyi- oder Ananas comosus-Akzession in der vorletzten Bahn aufgetragen; N: Negativkontrolle (ohne Templat-DNA). Einzelne, ausgefallene PCR-Produkte wurden in einer neuen Reaktion wiederholt und erneut aufgetragen (nicht dargestellt). 99 Ergebnisse Die auf Basis der Alleldaten berechneten populationsgenetischen Parameter für jede der drei Arten sind in Tabelle 3.17 aufgeführt. Über alle 190 Individuen hinweg wurden an den einzelnen Loci zwischen vier (ngFos_6) und 24 (Acom_117.15) Allele detektiert (durchschnittlich 10,1). Nahezu alle Loci erwiesen sich als innerartlich polymorph, nur innerhalb von F. micrantha zeigten zwei Loci (ngFos_4 und Acom_12.12) ein monomorphes Bandenmuster. Die durchschnittlichen Werte der beobachteten Heterozygotie über alle Loci hinweg reichten von 0,03 in F. villosula bis 0,14 in F. christophii und waren generell deutlich niedriger als die Durchschnittswerte für die erwartete Heterozygotie (0,47 für F. christophii, 0,59 in F. micrantha, 0,63 für F. villosula). Ähnlich wie in F. rusbyi (vgl. Kapitel 3.3.2.2) liegt demnach auch in den Arten der micrantha-Gruppe ein deutliches Heterozygoten-Defizit vor. Aufgrund der großen Differenz zwischen Ho und He ergeben sich für die meisten Loci in jeder der drei Arten hohe Werte für den Inzuchtskoeffizienten Fis (durchschnittlich 0,82 über alle Loci und Pflanzenproben) und eine signifikante Abweichung vom HARDY-WEINBERG Gleichgewicht. Über alle acht Loci hinweg erwiesen sich mehrere Individuen durch das Vorhandensein der gleichen Mikrosatelliten-Genotypen als genetisch identisch. Tabelle 3.17: Populationsgenetische Parameter von F. christophii, F. micrantha und F. villosula (Set 9; micrantha-Gruppe), basierend auf der Genotypisierung an acht Mikrosatellitenloci (vier EST- und vier 454-Mikrosatellitenmarker) . Für jeden Locus und für jede Art sind die Allelzahlen (Na), die Werte der beobachteten und erwarteten Heterozygotie (Ho/He), der Inzuchtskoeffizient (Fis) sowie der Probenumfang des gesamten Datensatzes (Natotal) angegeben. Signifikanz: p-Wert bezogen auf Fis: ***: < 0,001; **: < 0,01; *: < 0,05; n.s.: nicht signifikant. Locus F. christophii (N = 50) F. micrantha (N = 57) F. villosula (N = 83) N = 190 Na Ho He Fis Na Ho He Fis Na Ho He Fis Natotal ngFos_4 3 0,04 0,26 0,85*** 1 - - - 5 0,02 0,70 0,97*** 5 ngFos_6 2 0,12 0,15 0,19n.s. 2 0,04 0,34 0,90*** 3 0,00 0,50 1,00*** 4 ngFos_11 4 0,26 0,72 0,64*** 4 0,05 0,64 0,92*** 4 0,02 0,59 0,96*** 8 ngFos_12 6 0,18 0,48 0,63*** 2 0,02 0,05 0,66* 4 0,00 0,50 1,00*** 7 Acom_12.12 4 0,14 0,65 0,79*** 1 - - - 6 0,04 0,69 0,95*** 7 Acom_101.1 7 0,22 0,41 0,47*** 8 0,11 0,81 0,87*** 7 0,10 0,70 0,86*** 11 Acom_109.6 8 0,10 0,56 0,82*** 11 0,11 0,84 0,88*** 6 0,01 0,67 0,98*** 15 Acom_117.15 7 0,04 0,54 0,93*** 14 0,18 0,84 0,79*** 9 0,08 0,73 0,99*** 24 ∅ 5,1 0,14 0,47 0,67 6,8 0,08 0,59 0,84 5,5 0,03 0,63 0,96 10,12 3.6.1 BAYES`sche Analyse Innerhalb des micrantha-Datensatzes ergab die BAYES`sche Analyse mit dem Programm STRUCTURE mit 1 ≤ K ≤ 30 eindeutig K = 2 als wahrscheinlichste Anzahl an Gruppen, wobei der höchste Delta K-Wert als Maß der Konfidenz des optimalsten K-Wertes nach EVANNO et al. (2005) berücksichtigt wurde. Das entsprechende Diagramm ist in der linken Hälfte der Abbildung 3.19 dargestellt, die rechte Seite zeigt das dazugehörige Balkendiagramm, in welchem die Individuen entsprechend ihrer Artzugehörigkeit farblich hinterlegt sind. Die Balken selbst sind hinsichtlich der Einteilung in die beiden Gruppen in Grautönen markiert. 100 Ergebnisse Abbildung 3.19: Ergebnis der STRUCTURE-Analyse zur Ermittlung des wahrscheinlichsten K-Wertes (K = 2) in 190 Individuen der drei Arten Fosterella christophii, F. micrantha und F. villosula (micrantha-Gruppe) auf Basis der Alleldaten an jeweils vier EST- und 454-Mikrosatellitenloci. Im Balkendiagramm auf der rechten Seite sind die einzelnen Individuen entsprechend ihrer Artzugehörigkeit farblich markiert. Die Zugehörigkeit zu einer der beiden Gruppen wird durch Grautöne symbolisiert. Gruppe 1 (dunkelgrau) umfasst sowohl alle Individuen der Populationen IM0033, IM0043, IM0046, IM0050, IM0052, NW09.005 und NW09.006 von F. christophii als auch sämtliche Akzessionen der Populationen IM0012, IM0019, IM0022 und IM0029 von F. villosula. Gruppe 2 (hellgrau) enthält alle Individuen von F. micrantha sowie alle verbleibenden Akzessionen von F. villosula. Die Individuen zweier Populationen von F. christophii (NW09.030 und NW09.034) wiesen (mit einem erhöhten Anteil von Gruppe 2 gegenüber dem von Gruppe 1) eine genetische Vermischung auf. Die STRUCTURE-Analyse ergibt demnach keine klare Auftrennung der Individuen bzw. Populationen nach ihrer Artzugehörigkeit. 3.6.2 Hauptkoordinaten-Analyse (PCoA) Um die genetischen Distanzen zwischen den 190 Pflanzenproben der micrantha-Gruppe graphisch abzubilden wurde eine Hauptkoordinaten-Analyse (PCoA) auf Basis des Unähnlichkeits- Koeffizienten nach BRAY & CURTIS (1957) durchgeführt und die Ergebnisse als dreidimensionales Koordinatensystem wiedergegeben, in dem jede Probe mit ihrer ID-Nummer versehen wurde (Abbildung 3.20). Dabei spiegeln die ersten drei Achsen (Dim-1 bis Dim-3) der PCo-Analyse 75,8% der Gesamtvariation des Datensatzes wieder. Es lassen sich zwei klar voneinander getrennte Gruppen erkennen (in Abbildung 3.20 durch eine s-förmige Linie separiert). Die beiden Gruppen entsprechen exakt der Unterteilung, die auch mit der STRUCTURE-Analyse mit K = 2 erhalten wurde (vgl. Abbildung 3.19). Wiederum ist eine klare Differenzierung zwischen den drei Fosterella- Arten nicht möglich. 101 Ergebnisse Abbildung 3.20: Dreidimensionale PCo-Analyse der micrantha-Gruppe (190 Proben, Set 9) basierend auf den Mikrosatellitendaten an vier EST- und vier 454-Loci. Die drei abgebildeten Achsen (Dim-1 bis Dim-3) spiegeln 75,8% der Gesamtvariation des Datensatzes wieder. Die Punkte sind entsprechend der Artzugehörigkeit farblich markiert (rot: Fosterella micrantha, blau: F. christophii, grün: F. villosula). Die zwei Gruppen, die bereits durch die STRUCTURE-Analyse (K = 2) angenommen wurden, sind optisch durch eine gestrichelte Linie voneinander separiert. Stehen die ID- Nummern direkt untereinander, waren diese Proben genetisch identisch und wiesen über alle Loci den gleichen Mikrosatelliten-Genotypen auf. Während die Individuen von F. micrantha tendenziell zusammen gruppieren und nur in Gruppe 2 vertreten sind, vermischen sich die Akzessionen der beiden übrigen Arten F. christophii und F. villosula und sind in beiden Gruppen vertreten. Die Individuen der Populationen NW09.030 und NW09.034 (vgl. vorheriges Kapitel) sind die einzigen Vertreter von F. christophii in Gruppe 2 und nehmen eine zentrale Stellung zwischen den übrigen Akzessionen von Gruppe 2 und allen Mitgliedern der Gruppe 1 ein. In Abbildung 3.20 wird außerdem deutlich, dass der Anteil genetisch identischer Individuen vergleichsweise groß ist. Den geringsten Anteil gleicher Mikrosatelliten-Genotypen wiesen die Individuen der Populationen NW09.030 und NW09.034 auf (vgl. Abbildung 3.20). Mit Ausnahme eines besonders häufigen Genotypen, den insgesamt 19 Individuen aus drei Populationen von Gruppe 1 aufwiesen (vgl. Abbildung 3.21), wurden identische Genotypen jedoch überwiegend innerhalb des gleichen Fundortes festgestellt. Möglicherweise ist dies ein Hinweis auf ein ausgeprägtes klonales Wachstum in den drei Arten der micrantha-Gruppe. 102 Ergebnisse 3.6.3 Geographische Korrelation Ein Vergleich der Fundorte der analysierten Pflanzenproben bzw. Populationen basierend auf dem Ergebnis der STRUCTURE-Analyse (K = 2) ergibt ein klares geographisches Muster in Form einer Nord-Süd-Verteilung (Abbildung 3.21), welches offenbar weitgehend unabhängig von der Artzugehörigkeit zu sein scheint. Gruppe 1 (dunkelgrau) umfasst alle Populationen von F. christophii und F. villosula aus der Region südöstlich des Andenknicks im Departamento Santa Cruz, die Gruppe 2 hingegen enthält alle übrigen bolivianischen Populationen von F. christophii und F. villosula aus den Departamentos Cochabamba und La Paz, sowie alle Proben von F. micrantha aus dem ca. 4.000 km entfernten Mexiko. Die Populationen NW09.030 und NW09.034, für die die STRUCTURE-Analyse eine genetische Vermischung nahelegt, sind die beiden einzigen Populationen von F. christophii innerhalb der Gruppe 2 und stammen aus dem Zentrum des Departamentos La Paz (vgl. Abbildung 3.21). Abbildung 3.21: Sammelorte der Populationsproben der Vertreter der micrantha-Gruppe in Bolivien und Süd-Mexiko. Die beiden genetisch determinierten Gruppen, basierend auf dem wahrscheinlichsten Wert der STRUCTURE-Analyse (K = 2) sind dunkelgrau (Gruppe 1) bzw. hellgrau (Gruppe 2) hinterlegt. Die Anzahl analysierter Individuen pro Population ist jeweils in Klammern angegeben. 103 Ergebnisse 3.7 Populationsgenetik von Fosterella rusbyi Eine Kombination aus 15 nukleären (ngFos-Loci) und sieben plastidären (cpFos-Loci) Mikrosatellitenmarkern (vgl. Kapitel 3.3.2 und 3.4.2) wurde für eine populationsgenetische Analyse von 253 F. rusbyi-Individuen (Set 15, Tabelle T2 im Anhang) aus 30 Populationen angewendet. Die Pflanzen waren von N. WAGNER (NW), I. MICHALAK (IM) und J. PETERS (JP) auf mehreren Expeditionen nach Bolivien gesammelt worden. Das Untersuchungsgebiet im Zentrum des Departamentos La Paz ist in Abbildung 3.22 dargestellt. Basierend auf der Verteilung der 30 Sammelorte wurden die Individuen vorab in neun geographische Gruppen eingeteilt, die in der Abbildung durch farbige Polygone hervorgehoben sind. Die Distanz zwischen den beiden am weitesten voneinander entfernten Populationen betrug etwa 150 km. Abbildung 3.22: Geographische Lokalitäten der Fundorte von 253 untersuchten F. rusbyi-Individuen im Zentrum des bolivianischen Departamentos La Paz. Hinter dem Namen der jeweiligen Population ist die Anzahl untersuchter Individuen in Klammern angegeben. Basierend auf ihrer lokalen Verteilung wurden die Individuen, bzw. Populationen in neun geographische Gruppen eingeteilt, welche durch farbige Polygone hervorgehoben sind. Die Besammlung erfolgte durch N. WAGNER (NW), I. MICHALAK (IM) UND J. PETERS (JP). 3.7.1 Nukleäre Mikrosatellitenmarker 104 Ergebnisse 3.7.1.1 Genetische Diversität Die 15 nukleären ngFos-Mikrosatellitenmarker erwiesen sich als durchweg variabel und generierten insgesamt 104 Allele (∅ 6,9 Allele pro Locus). Als repräsentatives Beispiel sind in Abbildung 3.23 die Bandenmuster an sechs Loci in 87 der 253 Individuen illustriert (für sämtliche Fragmentlängen siehe digitaler Anhang (DA-6). Eine Zusammenstellung der Allelzahlen ist Tabelle 3.18 zu entnehmen. Die unterschiedlichen Fragmentlängen je Locus konnten zu 81,7% durch Variation in den Kopienzahlen der jeweiligen Wiederholungsmotive erklärt werden (bei Trinukleotiden drei, bei Hexanukleotiden sechs Basen). Neunzehn der 104 Allele wiesen Größenunterschiede von einer (z.B. ngFos_29) bzw. zwei Basen (z.B. ngFos_14) zum nächsten Allel auf, was auf Insertionen oder Deletionen (Indels) in der den jeweiligen Mikrosatelliten flankierenden Sequenz hindeutet. Tabelle 3.18: Zusammenstellung der Allelzahlen an den 15 untersuchten Loci bezogen auf die 30 besammelten Populationen von F. rusbyi (Set 15) sowie auf die Gesamtpopulation (N = 253), durch Farbkodierung sind die Populationen den neun geographischen Gruppen aus Abbildung 3.22 zugeordnet. Angegeben sind die Allelzahlen pro Population und Locus, sowie über alle Populationen und Loci hinweg. Die letzten drei Spalten enthalten die Werte der beobachteten und erwarteten Heterozygotie sowie des Inzuchtskoeffizienten (Ho/He/Fis) innerhalb der jeweiligen Population, die unteren drei Zeilen enthalten die entsprechenden Werte (Ho /He /Fis) für den betreffenden Locus, wobei ein * jeweils die Signifikanz mit p < 0,05 hervorhebt; n.a.: Berechnung nicht möglich. Population (N) ng Fo s_ 1 ng Fo s_ 4 ng Fo s_ 6 ng Fo s_ 8 ng Fo s_ 9 ng Fo s_ 11 ng Fo s_ 12 ng Fo s_ 13 ng Fo s_ 14 ng Fo s_ 16 ng Fo s_ 18 ng Fo s_ 21 ng Fo s_ 22 ng Fo s_ 29 ng Fo s_ 30 To ta l Ho He Fis NW09.039 (2) 1 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 16 0 0,07 1,0* IM0133-IM0135 (10) 1 2 3 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 3 1 20 0,03 0,06 0,5* IM0130-IM0132 (8) 1 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 16 0,01 0,01 n.a. NW09.038 (9) 1 1 2 1 1 1 1 2 1 1 1 1 2 1 1 18 0,05 0,06 0,1* IM0128-IM0129 (5) 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 15 0 0 n.a. IM0118-IM0120 (7) 1 1 1 1 1 2 1 1 1 2 1 1 1 2 1 18 0 0,06 1,0* IM0071-IM0073 (8) 1 1 2 1 1 1 1 1 2 1 1 1 3 2 1 20 0,03 0,1 0,7* NW09.033 (9) 2 2 3 3 1 3 1 1 2 3 1 1 3 2 2 30 0,18 0,3 0,4* NW09.032 (9) 1 2 4 2 1 2 1 1 2 3 1 2 2 4 2 30 0,12 0,33 0,6* NW09.031 (10) 2 2 3 2 1 2 1 2 4 2 2 2 1 1 2 29 0,21 0,33 0,4* IM0111-IM0113 (10) 2 3 3 1 2 2 2 1 2 1 2 2 2 1 4 30 0,25 0,32 0,2* IM0108-IM0110 (2) 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 15 0 0 n.a. NW09.029 (9) 1 3 2 1 2 3 1 1 1 2 1 2 2 2 2 26 0,22 0,27 n.a. IM0105-IM0107 (11) 1 2 2 1 2 3 1 1 1 3 1 2 3 2 2 27 0,12 0,18 0,3* IM0102-IM0104 (3) 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 15 0 0 n.a. NW09.028 (10) 2 2 4 1 2 2 2 1 1 3 1 2 3 1 1 28 0,22 0,29 0,2* IM0098-IM0101 (14) 2 2 6 1 2 2 2 1 1 3 1 2 4 1 2 32 0,2 0,32 0,4* NW09.027 (7) 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 2 1 2 19 0,04 0,1 0,5* IM0095-IM0097 (9) 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 2 1 2 18 0,04 0,08 0,4* NW09.015 (7) 1 1 1 1 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 16 0,02 0,02 n.a. NW09.016 (9) 1 1 2 2 1 1 2 1 2 1 1 2 2 2 2 23 0,14 0,17 0,2* IM0077-IM0080 (10) 2 2 1 2 1 3 2 2 1 1 1 2 2 3 1 26 0,15 0,27 0,5* IM0081-IM0083 (11) 1 2 1 2 1 2 1 2 1 1 1 2 1 1 1 20 0,05 0,15 0,7* IM0084-IM0090 (14) 1 3 5 1 2 3 3 2 5 2 1 2 4 1 1 36 0,18 0,25 0,3* NW09.008 (9) 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 1 2 1 17 0,05 0,07 0,3* NW09.009 (8) 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 15 0 0 n.a. NW09.010 (10) 1 2 1 2 1 1 1 1 2 1 2 1 2 1 1 20 0 0,07 1,0* NW09.018 (9) 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 15 0 0 n.a. JP 06.0070 (13) 2 2 3 2 3 1 1 1 1 1 1 1 2 2 3 26 0,08 0,2 0,6* JP 06.0078 (1) 2 1 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 17 n.a. n.a. n.a. Total (N = 253): 5 6 13 6 8 4 3 3 9 5 5 5 12 11 9 - 0,1 0,14 0,4 Ho: 0,11 0,16 0,17 0,02 0,06 0,15 0,11 0,01 0,10 0,10 0,01 0,13 0,15 0,09 0,12 0,1 He: 0,63 0,59 0,82 0,59 0,35 0,62 0,53 0,27 0,79 0,68 0,20 0,67 0,84 0,76 0,69 0,6 Fis: 0,27* 0,33* 0,45* 0,83* 0,54* 0,25* 0,12* 0,83* 0,25* 0,26* 0,79* 0,39* 0,44* 0,48* 0,26* 0,4 105 Ergebnisse Locusspezifische Stotterbanden, welche als Artefakte durch Verrutschen der Taq DNA- Polymerase während der PCR entstehen und um mindestens ein Wiederholungsmotiv kürzer sind als das eigentliche Fragment, traten an jedem der 15 Loci in unterschiedlicher Intensität auf (Abbildung 3.23). Die genetische Diversität innerhalb der einzelnen Populationen war generell unerwartet niedrig. Abbildung 3.23: Spezifische Bandenmuster an sechs der 15 Mikrosatellitenloci in 87 repräsentativen F. rusbyi-Akzessionen (Teil von Set 15) aus elf Populationen nach Auftrennung der PCR-Produkte auf 6%-igen PAA-Gelen. Auftragsreihenfolge der Populationen: 1-8: IM0071-IM0073 (8 Individuen), 9-18: IM0077-IM0080 (10), 19-28: IM0081-IM0083 (10), 29-42 : IM0084-IM0090 (14), 43 und 45-52 : IM0095-IM0097 (9), 44 und 88: Positivkontrolle JP 06.0078, 53-65: IM0098-IM0101 (13), 66-68: IM0102-IM0104 (3), 69-79: IM0105-IM0107 (11), 80-82: IM0108-IM0110 (3), 83-87: IM0111-IM0113 (5). Unterhalb der sechs Einzelbilder sind die jeweiligen Mikrosatellitenmotive in Klammern hinter dem Markernamen angegeben. An jedem der Loci ist ein deutliches Heterozygoten-Defizit zu beobachten. Über alle Populationen hinweg reichte die erwartete Heterozygotie von 0,20 (ngFos_18) bis 0,84 (ngFos_22) mit 0,6 als Durchschnittswert und die beobachtete Heterozygotie von 0,01 (ngFos_18) bis 0,17 (ngFos_6), mit einem durchschnittlichen Wert von 0,1. Entsprechend reichte die erwartete Heterozygotie über alle Loci hinweg von null (ngFos_18) bis 0,33 (NW06.031 und 106 Ergebnisse NW06.032) mit 0,14 als Durchschnittswert und die beobachtete Heterozygotie von null bis 0,25 (IM0111-IM0113, mit einem durchschnittlichen Wert von 0,1. Das Heterozygoten-Defizit war beträchtlich. Es resultierte für jeden Locus und jede Population, für die eine Berechnung möglich war, in hohen Inzuchtskoeffizienten (Fis) und durchweg signifikanten Abweichungen vom HARDY-WEINBERG Gleichgewicht (Tabelle 3.18, letzte Spalte). Alle berechneten Allelfrequenzen sind in Tabelle DA-7 des digitalen Anhangs wiedergegeben. In Bezug auf die Gesamtpopulation (N = 253) variierten die Allelfrequenzen von 0,002 bis 0,893, an jedem Locus trat jedoch mindestens ein dominantes Allel mit hoher Frequenz auf. Allele, die ausschließlich in einer einzigen Population vorkommen und entsprechend als ’privat’ bezeichnet werden können, wurden in 15 der 30 untersuchten Populationen und an 14 der 15 Loci beobachtet (Ausnahme ngFos_12). Private Allele traten vor allem in den Populationen JP 06.0070 (Gruppe IX) und IM0084-IM0090 (Gruppe VII) im zentralen Bereich des Untersuchungsgebietes auf, wohingegen keine der fünf Populationen der geographischen Gruppe I (vgl. Abbildung 3.22) private Allele aufwies. Eine Übersicht über die Verteilung der insgesamt 27 privaten Allele gibt Tabelle T7 im Anhang. 3.7.1.2 Genetische Differenzierung Um einen ersten tieferen Einblick in die genetische Differenzierung der F. rusbyi-Populationen zu gewinnen, wurden sowohl die auf dem ’infinite alleles model’ (IAM) beruhenden Parameter Fst und Gst als auch der auf dem ’stepwise mutation model’ (SMM) basierende Rst-Wert ermittelt und miteinander verglichen (Abbildung 3.24). Die über alle Loci gemittelten Fst- und Gst-Werte lagen bei 0,794 bzw. 0,766, was auf eine klare Differenzierung zwischen den Populationen hindeutet. Die jeweils niedrigsten Fst-Werte wurden für den Locus ngFos_4 berechnet, die jeweils höchsten Werte für den Locus ngFos_14. Der Verlauf der locusabhängigen Kurve in Abbildung 3.24 ist für beide Werte sehr ähnlich. Auch der Rst-Wert weist mit durchschnittlich 0,783 auf eine erhebliche Differen- zierung zwischen den Populationen hin, der locusabhängige Kurven- verlauf differiert bezüglich der Minimum- und 107 Abbildung 3.24: Genetische Differenzierung über 15 Mikrosatellitenloci und alle 30 Populationen von F. rusbyi (253 Individuen) pro Locus. Angegeben sind: Fst, Gst und Rst, jeder Wert ist mit p < 0,005 signifikant. Ergebnisse Maximum-Werte nur unerheblich von der Fst- und Gst-Kurve (Abbildung 3.24). Der direkte Vergleich der Fst und Rst-Werte im Rahmen eines MANTEL-Tests ergab eine hohe Korrelation von 75% (p ≤ 0,005; Daten nicht dargestellt). 3.7.1.3 Hauptkoordinaten-Analyse (PCoA) Um die genetische Struktur der F. rusbyi-Populationen im Untersuchungsgebiet näher zu beleuchten wurde eine individuenbasierte PCo-Analyse auf Basis des Unähnlichkeits- Koeffizienten nach BRAY & CURTIS (1957) durchgeführt. Ein zweidimensionales Diagramm, in welchem die ersten beiden Dimensionen 49,4% der Gesamtvariation des Datensatzes widerspiegeln, ist in Abbildung 3.25 dargestellt. Individuen, die aus der gleichen geographischen Region stammen, wurden entsprechend der Abbildung 3.22 farbkodiert. Dadurch lässt sich zeigen, dass die Anordnung der Individuen im PCoA-Diagramm weitgehend geographischen Kriterien folgt. So bilden die Individuen aus sieben der neun Regionen jeweils separate, regionsspezifische Punktewolken, eine Überschneidung ist nur für die geographischen Gruppen III (grün) und IV (rot) gegeben (vgl. Abbildung 3.22). Abbildung 3.25: Zweidimensionale PCo-Analyse von 253 F. rusbyi-Akzessionen basierend auf dem Unähnlichkeits-Koeffizienten nach BRAY & CURTIS (1957) an 15 Mikrosatellitenloci. Die ersten beiden dargestellten Dimensionen spiegeln 49,4% der Gesamtvariation des Datensatzes wieder. Jedes Individuum wurde entsprechend seiner Herkunft aus einer der neun vorab definierten geographischen Gruppen farbkodiert (vgl. Abbildung 3.22). 108 Ergebnisse 3.7.1.4 BAYES`sche Analyse Die genetische Strukturierung innerhalb der 253 F. rusbyi-Individuen wurde auch mit den Computerprogrammen STRUCTURE und BAPS analysiert, die beide zu den BAYES`schen Analysemethoden zählen (2.3.6.3). Abbildung 3.26 zeigt die von STRUCTURE nach der Delta K- Methode von EVANNO et al. (2005) generierten Diagramme zur Abschätzung des besten K-Wertes. Aus der Abbildung ist zu erkennen, dass STRUCTURE-HARVESTER mit moderater statistischer Sicherheit K = 2 als den wahrscheinlichsten Wert vorschlägt, dicht gefolgt von K = 5 und K = 9. Folglich wurden alle drei K-Werte zur Beurteilung der Struktur und der Anzahl vorhandener Populationen berücksichtigt und miteinander verglichen. Eine mit dem Programm BAPS durchgeführte Cluster-Analyse auf Individuen-Basis ergab hingegen ein K von 21. Die Ergebnisse der BAYES`schen Analyse sind in Abbildung 3.27 in Form von Balkendiagrammen illustriert. Abbildung 3.26: Ermittlung des wahrscheinlichsten Wertes für K in F. rusbyi basierend auf 15 nukleären Mikrosatellitenmarkern (Diagramme mit STRUCTURE-HARVESTER erstellt). STRUCTURE-Einstellungen: 500.000 Wiederholungen sowohl während als auch nach der ’burn-in’ Periode, die Berechnung für jedes K (1 ≤ K ≤ 30) wurde 10-fach wiederholt. Für K = 2 ergibt sich mit STRUCTURE eine deutliche Trennung der drei geographischen Gruppen I, V und IX, welche jeweils im peripheren Bereich des Untersuchungsgebiets zu finden sind, von den sechs übrigen, zentral lokalisierten Gruppen (Abbildung 3.27, oberste Reihe). Für K = 5 erfolgt eine Differenzierung der am weitesten östlich gelegenen Gruppe V von der südlichsten Gruppe XI, die aber weiterhin denselben Genotyp wie Gruppe I aufweist. Ein weiterer Cluster wird von den geographischen Gruppen II und III sowie allen Individuen der Population IM0111-IM0113 aus der Gruppe IV gebildet. Für die übrigen Gruppen ist keine klare Strukturierung erkennbar (Abbildung 3.27, zweitoberste Reihe). Für K = 9 erfolgt eine Trennung der geographischen Gruppen I und IX voneinander, außerdem erfolgt eine noch weitergehende Differenzierung im zentralen Bereich, wobei die geographischen Gruppen III, IV und VIII in jeweils zwei bis mehrere 109 Ergebnisse Cluster zerlegt werden (Abbildung 3.27, drittoberste Reihe). In den Populationen NW09.031, NW09.032 und IM0077-IM0080 ist bei allen drei K-Werten eine gewisse genetische Durchmischung zu beobachten. Das auf der Basis von K = 21 von BAPS ermittelte Diagramm zeigt, dass die Individuen aus den peripher gelegenen geographischen Regionen I, II, V und IX jeweils einem eigenen Cluster zugeordnet sind. Alle übrigen, im zentralen Bereich des Sammelgebiets gelegenen geographischen Gruppen teilen sich hingegen in zwei oder mehrere Cluster auf, die häufig einzelnen 30 Populationen oder Gruppen von Populationen entsprechen (Abbildung 3.27, unterste Reihe). Abbildung 3.27: Ergebnisse der BAYES`schen Analysen der Alleldaten an 15 nukleären Mikrosatellitenloci für 253 F. rusbyi-Individuen von 30 verschiedenen Sammelorten in Form von Balkendiagrammen. Die Bezeichnungen der Populationen sind jeweils im unteren Teil der Abbildung angegeben. Die obersten drei Diagramme geben die Ergebnisse der STRUCTURE-Analyse mit K = 2, K = 5 und K = 9 wieder, das unterste Diagramm zeigt das Ergebnis der BAPS-Analyse mit dem von BAPS ermittelten Wert von K = 21. Ganz unten ist die Aufteilung der Individuen und Populationen in neun geographische Gruppen (I-IX) angegeben. Die Farben entsprechen denen der Polygone in Abbildung 3.22. Die farbigen Dreiecke stehen für die Einteilung in 19 genetische Gruppen (Populationen) als Grundlage für die AMOVA (vgl. Kapitel 3.7.1.5). 110 Ergebnisse Die Ergebnisse der BAPS-Analyse wurden als Grundlage für eine Einteilung der Individuen in genetische Gruppen für eine Analyse der molekularen Varianz (AMOVA) genommen (3.7.1.6). Dazu wurde die von BAPS vorgeschlagene Zahl von 21 Gruppen aus folgenden Gründen auf 19 reduziert: (1) in der Population NW09.032 schlägt BAPS die Existenz zweier unterschiedlicher Genotypen vor, dem wurde für die AMOVA nicht Folge geleistet. (2) ’Population’ JP 06.0078 ist nur durch ein einzelnes Individuum repräsentiert und wurde daher zur Berechnung der AMOVA mit den Vertretern der nächstgelegenen Population JP 06.0070 zusammengeschlossen. Die 19 genetischen Gruppen für die AMOVA sind in Abbildung 3.27 unten als farbige Dreiecke dargestellt. 3.7.1.5 Distanzverfahren Als weitere Methode zur Analyse der genetischen Differenzierung zwischen den 253 Individuen im F. rusbyi-Datensatz wurden paarweise genetische Distanzen nach ROUSSET (2000) berechnet und in Form phylogenetischer Netzwerke (NeighbourNet; HUSON & BRYANT 2006) bzw. Phänogramme (Neighbour-Joining; SAITOU & NEI 1987) graphisch dargestellt. NeighbourNet-Analyse Das mit dem Programm SPLITSTREE (HUSON & BRYANT 2006) erzeugte Netzwerk ist in Abbildung 3.28 dargestellt. Die auf der Basis der BAPS-Analyse vorgenommene Aufteilung der 30 Populationen in 19 genetische Gruppen wird von der Baumtopologie grundsätzlich widergespiegelt. Bis auf zwei Ausnahmen (III-5 und VIII-16) erwiesen sich alle diese genetischen Gruppen (I-1 bis IX-19) als monophyletisch. Die hellgrau markierte Gruppe VIII-16 teilt sich im Netzwerk entsprechend der beiden zugrunde liegenden Populationen NW09.008 und NW09.009 auf. Im Fall von III-5 (Population NW09.032) wurde im Rahmen der BAPS-Analyse (K = 21) eine Zweiteilung dieser Gruppe vorgeschlagen (s.o.), die durch das Netzwerk bestätigt wird. Die in den peripheren Bereichen des Untersuchungsgebietes lokalisierten geographischen Gruppen I-1, II-2, V-18 und IX-19 sowie die zentral gelegene Gruppe VII-14 und -15 nehmen separate Positionen im Netzwerk ein und sind jeweils monophyletisch. Die vier übrigen zentralen geographischen Gruppen III, IV, VI und VIII sind hingegen paraphyletisch. 111 Ergebnisse Abbildung 3.28: Phylogenetisches Netzwerk (NeighbourNet) von 253 F. rusbyi-Individuen basierend auf ROUSSET`s paarweisen genetischen Distanzen zwischen Individuen an 15 Mikrosatellitenloci (ROUSSET 2000). Die Äste wurden entsprechend der Einteilung in neun geographische Gruppen (I-IX) aus Abbildung 3.22, bzw. 19 genetische Gruppen (1-19) aus Abbildung 3.27 betitelt und farbig hervorgehoben. Neighbour-Joining-Analyse Der Neighbour-Joining-Baum in Abbildung 3.29 zeigt ebenfalls eine klare Gruppierung der Individuen entsprechend ihrer Populationszugehörigkeit und somit eine deutlich genetische Differenzierung. Die einzige Ausnahme bilden die Individuen aus Population NW09.032 (III-5) sowie die Vertreter der Gruppe VIII-16, welche jeweils paraphyletisch sind, was dem Ergebnis der STRUCTURE- bzw. NeighbourNet-Analyse entspricht. Im Gegensatz zum NeighbourNet-Netzwerk sind die beiden Populationen aus der Region VII deutlich voneinander getrennt. Hingegen bilden die fünf westlichsten Populationen wie in allen anderen bisherigen Analysen eine distinkte und monophyletische Gruppe (I-1), ebenso die Populationen JP 06.0070 und JP 06.0078 (IX-19) im Süden, die Population IM0118-IM0120 (II-2) im Nordwesten und die Population NW09.018 (V-18) im Osten des Untersuchungsgebiets. 112 Ergebnisse Abbildung 3.29: Neighbour-Joining-Analyse der 253 F. rusbyi-Individuen auf Basis der Mikrosatellitendaten an 15 nukleären Loci. Die genetische Distanz nach ROUSSET (2000) bildet die Grundlage der Berechnung. Die Äste wurden entsprechend der Einteilung in neun geographische Gruppen (I- IX) aus Abbildung 3.22, bzw. 19 genetische Gruppen (1-19) aus Abbildung 3.27 betitelt und farbig hervorgehoben. Nahezu alle Individuen gruppieren entsprechend ihrer Zugehörigkeit zu den 19 genetischen Gruppen. 3.7.1.6 AMOVA Auf Basis der Mikrosatellitendaten wurde eine AMOVA mit insgesamt fünf verschiedenen Partitionen und mehreren Hierarchie-Ebenen durchgeführt. Drei Partitionen folgten den Vorschlägen von STRUCTURE zur Einteilung in K = 2, K = 5 und K = 9 Gruppen, und eine Partition erfolgte nach dem modifizierten Vorschlag von BAPS (K = 21, reduziert auf 19 Gruppen; vgl. Kapitel 3.7.1.4). Bei diesen vier Analysen wurden jeweils drei Hierarchie-Ebenen angenommen (innerhalb von Populationen; zwischen Populationen der gleichen Gruppe; zwischen Gruppen). Bei der fünften Partition wurde der Originaldatensatz mit 30 Populationen auf zwei Hierarchie- 113 Ergebnisse Ebenen analysiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3.19 zusammengefasst. Die Variation innerhalb der Populationen lag zwischen 21,6% (K = 2) und 25,8% (K = 30) und blieb somit vergleichsweise konstant. Mit zunehmender Anzahl von definierten Gruppen verlagerte sich der Hauptanteil der Variation, der zunächst zwischen den Populationen innerhalb von Gruppen bestimmt wurde (53,0% für K = 2), auf den Bereich zwischen den einzelnen Gruppen (maximal 74,2% für K = 30). Die ermittelten Fst-Werte zwischen den Gruppen variierten zwischen 0,742 und 0,784 und waren in jeder der fünf Analysen hochsignifikant. Tabelle 3.19: Ergebnis der AMOVA für fünf Partitionen von 253 F. rusbyi-Individuen aus 30 Populationen (Details siehe Text). Die Analyse wurde auf zwei bzw. drei Hierarchie-Ebenen durchgeführt, angegeben sind die Freiheitsgrade (d.f.), die Varianz-Komponenten, der prozentuale Anteil der Variation bezogen auf die jeweilige Bezugsquelle sowie die F-Statistik und deren Signifikanz. Quelle der Variation d.f. Varianz-Komponenten Anteil der Variation (%) Statistik Signifikanz Zwischen den Gruppen (K = 2) 1 1,41 25,4 Fst = 0,784 < 0,001 Zwischen den Populationen innerhalb der Gruppen 28 2,94 53,0 Fsc = 0,711 < 0,001 Innerhalb der Populationen 476 1,20 21,6 Fct = 0,254 < 0,001 Total 505 5,55 Zwischen den geographischen Gruppen (K = 5) 4 1,68 33,5 Fst = 0,761 < 0,001 Zwischen den Populationen innerhalb der Gruppen 25 2,13 42,6 Fsc = 0,640 < 0,001 Innerhalb der Populationen 476 1,20 23,9 Fct = 0,335 < 0,001 Total 505 5,01 Zwischen den geographischen Gruppen (K = 9) 8 2,11 43,3 Fst = 0,755 < 0,001 Zwischen den Populationen innerhalb der Gruppen 21 1,57 32,2 Fsc = 0,568 < 0,001 Innerhalb der Populationen 476 1,20 24,5 Fct = 0,432 < 0,001 Total 505 4,88 Zwischen den Gruppen (K = 19) 18 3,00 63,2 Fst = 0,747 < 0,001 Zwischen den Populationen innerhalb der Gruppen 11 0,54 11,5 Fsc = 0,312 < 0,001 Innerhalb der Populationen 476 1,20 25,3 Fct = 0,632 < 0,001 Total 505 4,74 Zwischen Populationen (K = 30) 29 3,45 74,2 Fst = 0,742 < 0,001 Innerhalb der Populationen 476 1,20 25,8 Total 505 4,65 3.7.1.7 MANTEL-Test Eine mögliche Korrelation zwischen der geographischen und der genetischen Distanz wurde mittels eines MANTEL-Tests mit der Software ARLEQUIN Version 3.5.1.2 analysiert. Grundlage hierzu waren die durchweg hohen paarweisen Fst-Werte (durchschnittlich 0,74) zwischen ursprünglich 30 Populationen, die als Maß der genetischen Distanz dienten, sowie die Entfernungen zwischen sämtlichen Fundorten in Kilometern (vgl. Tabelle 3.20). Die Ergebnisse 114 Ergebnisse sind in Abbildung 3.30 dargestellt. Die Korrelation zwischen beiden Distanzen betrug weniger als 40% (r = 0,38), war allerdings hochsignifikant (p < 0,0006), was das Vorhandensein einer positiven ’isolation-by-distance’ bestätigt. Tabelle 3.20: Geographische Distanzen in Kilometern (unterhalb der Diagonalen) und genetische Distanzen in Form paarweiser Fst-Werte (oberhalb der Diagonalen) ermittelt für 30 F. rusbyi-Populationen (253 Individuen) als Grundlage für einen MANTEL-Test. Die durchschnittliche Entfernung zwischen den einzelnen Populationen betrug 45,9 km, der durchschnittliche Fst-Wert lag bei 0,74 und war hochsignifikant, was auf eine ausgeprägte Differenzierung und geringen Genfluss zwischen den einzelnen Populationen hindeutet. Die Einteilung der 30 Populationen in neun geographische Gruppen ist farblich hervorgehoben. Alle zehn Fst-Werte unter 0,4 sind „fett“ und kursiv gedruckt. Abbildung 3.30: ’Isolation-by-distance’. Korrelation der paarweisen Fst-Werte und der geographischen Distanzen in Kilometern zwischen 30 Populationen von F. rusbyi (MANTEL-Test: p < 0,005, Korrelationskoeffizient r = 0,38). Die Trendlinie mit positiver Steigung ist zusätzlich abgebildet. 115 Ergebnisse Die Verteilung der Punktewolken verdeutlicht aber zudem, dass auch geographisch nah benachbarte Populationen ausgeprägte genetische Distanzen voneinander aufweisen können. So liegen z.B. die Populationen IM0105-IM0107 und IM0102-IM0104 mit einer Distanz von knapp 2 km vergleichsweise sehr nah beieinander, mit einem Fst-Wert von 0,77 ist die genetische Distanz zwischen beiden Standorten dagegen sehr hoch. Insgesamt konnte mit allen Analysen ein hohes Maß an genetischer Differenzierung zwischen den einzelnen Populationen von F. rusbyi nachgewiesen werden, was auf einen nur geringen Genfluss zwischen den Populationen schließen lässt. 3.7.2 Plastidäre Mikrosatellitenmarker 3.7.2.1 Genetische Diversität und Haplotypen-Netzwerk Alle sieben untersuchten cpSSR-Loci waren variabel und generierten in den 253 F. rusbyi- Individuen insgesamt 23 Allele. Gemäß der Natur der cpSSRs als Mononukleotid-Wiederholungen variierte die Länge der Fragmente um ein Basenpaar. Die Allelvarianten wurden zu 19 Haplotypen kombiniert, die ebenso wie die einzelnen Allele in Tabelle 3.21 zusammengestellt sind. Tabelle 3.21: Mikrosatellitenallele an sieben plastidären Loci in 253 F. rusbyi-Individuen (Pflanzenset 15). Es wurden insgesamt 23 Allele gefunden, die zu 19 Haplotypen kombiniert wurden. Locus Haplotyp cpFos_2 cpFos_3 cpFos_4 cpFos_5 cpFos_6 cpFos_14 cpFos_15 Total (N = 253) #1 193 233 181 214 203 190 189 21 #2 193 233 182 214 203 193 189 10 #3 193 233 183 214 203 194 189 16 #4 194 233 181 213 203 191 189 1 #5 194 233 181 214 203 189 189 7 #6 194 233 181 214 203 190 189 4 #7 194 233 181 214 203 191 189 24 #8 194 233 182 214 203 189 189 2 #9 194 233 182 214 203 190 189 36 #10 194 233 183 214 203 193 189 26 #11 194 233 183 214 203 194 189 25 #12 194 233 183 214 203 195 190 20 #13 194 234 182 214 203 191 189 1 #14 194 234 182 214 203 192 189 5 #15 195 233 182 214 205 195 189 27 #16 195 233 183 214 203 192 189 4 #17 195 233 183 214 205 195 189 10 #18 195 234 182 214 203 192 189 5 #19 197 233 182 214 204 194 189 9 Total 4 2 3 2 3 7 2 23 Bei neun ermittelten Haplotypen handelte es sich um private Haplotypen, die jeweils nur innerhalb einer einzigen Population bzw. Sammelstelle gefunden wurden. Der Haplotyp #9 wurde in 36 Individuen aus sieben Populationen und infolgedessen am häufigsten nachgewiesen, 116 Ergebnisse wohingegen die Haplotypen #4 und #13 jeweils nur in einem einzigen Individuum vorkamen. Die Haplotypen-Verteilung auf die einzelnen Individuen findet sich im Anhang (Tabelle T8). Alle Fragmentgrößen inklusive der Allelfrequenzen sind im digitalen Anhang DA-6 und DA-7 zusammengestellt. Über alle Populationen und Loci hinweg betrug die effektive Anzahl an Haplotypen 1,228 (Ne) und die genetische Diversität (He, NEI 1973) 0,134. Als Maß für die genetische Differenzierung zwischen den Populationen diente der Fst-Wert, welcher über alle Loci hinweg sehr hoch war (durchschnittlich 0,83). Die Verteilung der Haplotypenfrequenzen auf die einzelnen Populationen ist in Abbildung 3.31 dargestellt. Neunzehn Populationen waren jeweils für einen bestimmten Haplotypen fixiert, in neun Populationen konnten zwei und in zwei Populationen (IM0105-IM0107, JP 09.0070) jeweils drei Haplotypen detektiert werden. Population JP 06.0070 wies mit zwei privaten Allelen und einem dritten Allel, welches ebenfalls in Population NW09.010 gefunden wurde, die höchste Haplotypendiversität auf (He = 0,72). Die Verbreitung und Abundanz der Haplotypen an den jeweiligen Sammelorten bzw. Populationen wird in Abbildung 3.32 durch farbige Tortendiagramme illustriert. Abbildung 3.31: Balkendiagramm der Haplotypenfrequenzen der sieben plastidären Mikrosatellitenmarker pro Population (vgl. digitaler Anhang DA-7). Die Farben der 19 Haplotypen entsprechen der Farbkodierung in Abbildung 3.32. Mittels der Software TCS Version 1.21 (CLEMENT et al. 2000) wurde ein Haplotypen-Netzwerk (Abbildung 3.32, rechte Seite) berechnet, welches durch 29 Mutationsschritte (MS) erklärt wird. Das Netzwerk enthält 19 besetzte sowie 10 unbesetzte Positionen. Die Haplotypen #6, #7, #9 sind zusammen mit einem fehlenden Haplotypen durch eine unaufgelöste Schleife (’loop’) verbunden. Im großen und ganzen ergibt sich bezüglich der Anordnung der Haplotypen ein geographisches 117 Ergebnisse Muster, das jedoch weniger deutlich ausgeprägt ist als in den Analysen, die auf den nukleären Mikrosatellitenmarkern beruhen. Wieder nehmen die peripheren Populationen der geographischen Gruppen I, II, V und IX eine genetisch distinkte Stellung ein: die fünf Populationen der Gruppe I sind durch das Vorhandensein der drei Haplotypen #1, #4 und #7 charakterisiert, die alle im gleichen Teil des Netzwerks gruppieren und genetisch relativ nahe miteinander verwandt sind. In Gruppe II findet sich der einzigartige Haplotyp #5, der ebenfalls nahe mit #1, #4 und #7 verwandt ist. Für Gruppe IX wurden die Haplotypen #13, #14 und #18 nachgewiesen - welche im Netzwerk jeweils durch einen MS voneinander getrennt sind – sowie der zentrale Haplotyp #6 (von #13 durch drei MS getrennt). Alle Individuen der geographischen Gruppe V sind für den Haplotyp #19 fixiert, der im Netzwerk eine terminale Position einnimmt und durch drei unbesetzte Positionen vom nächsten Haplotypen #15 getrennt ist. Abbildung 3.32: Verteilung der 19 plastidären Haplotypen im Untersuchungsgebiet (links) und Darstellung des Haplotypen-Netzwerks (rechts) auf Basis von sieben plastidären Mikrosatellitenloci für 253 Akzessionen von F. rusbyi. Sofern mehrere Haplotypen innerhalb einer Population vorkommen, ist ihr prozentualer Anteil durch die relative Größe der Fläche verdeutlicht. Die neun geographischen Gruppen sind an den römischen Zahlen erkennbar (I-IX). Das Netzwerk wurde mit dem Programm TCS Version 1.21 (CLEMENT et al. 2000) generiert und basiert auf der statistischen Parsimonie. Der Durchmesser der Kreise im Netzwerk entspricht dem zahlenmäßigen Vorkommen der einzelnen Haplotypen, so ist #9 am häufigsten (36 Individuen) und #4 bzw. #13 (je ein Individuum) am seltensten vertreten. 118 Ergebnisse Die Haplotypen im zentralen Bereich des Untersuchungsgebiets sind nur zum Teil entsprechend der geographischen Gruppen organisiert, so kommen #3 und #11 (im Netzwerk direkt benachbart) nur in den Populationen der Gruppe VI vor, #10 dagegen nur innerhalb der Gruppe VIII. Die Gruppen III und IV sind bezogen auf die Haplotypen vergleichsweise heterogen zusammengesetzt. 3.7.2.2 BAYES`sche Analyse und genetische Differenzierung Die Analyse mit BAPS schlägt K = 12 als die wahrscheinlichste Anzahl an Gruppen innerhalb des cpSSR-Datensatzes der F. rusbyi-Proben vor. Im Hinblick auf die ringförmige Struktur der Chloroplasten-DNA und der damit einhergehenden Kopplung der einzelnen Mikrosatelliten wurde speziell für diese Analyse die Option der verlinkten Loci im BAPS-Programm gewählt. Das resultierende Balkendiagramm ist in Abbildung 3.33 (unteres Diagramm) abgebildet. Zum Vergleich wird in der oberen Hälfte der Abbildung 3.33 das Ergebnis der BAPS-Analyse auf Basis der nukleären Marker für K = 21 abgebildet (aus Abbildung 3.27). Abbildung 3.33: Gegenüberstellung der Ergebnisse der BAYES`schen Analyse mit dem Programm BAPS für 15 nukleäre Mikrosatellitenloci (K = 21, ’clustering of individuals’, oberer Teil des Diagramms) und sieben plastidäre Mikrosatellitenloci (K = 12, ’clustering of linked loci’, unterer Teil des Diagramms) für 253 F. rusbyi-Individuen. Im mittleren Teil des Diagramms sind neben der Populationsbezeichnung die Einteilung in neun geographische Gruppen (I-IX) sowie die Zuordnung der 30 Populationen zu 19 genetischen Gruppen dargestellt (vgl. Abbildung 3.27) . 119 Ergebnisse Die Gegenüberstellung verdeutlicht die mit beiden Markertypen nachweisbare genetisch distinkte Stellung der meisten Populationen und von vier der neun geographischen Gruppen und unterstreicht somit die ausgeprägte genetische Strukturierung in einem vergleichsweise kleinen Untersuchungsgebiet mit einem Radius von ca. 80 km. Die Korrelation zwischen der paarweisen genetischen Distanz zwischen den Haplotypen und ihrer geographischen Verteilung erfolgte mittels eines Vergleichs zweier Parameter der genetischen Differenzierung, Nst und Gst. Während die Berechnung von Gst nur auf der Frequenz der Haplotypen beruht, wird der Nst-Wert außer durch die Haplotypenfrequenz auch von der genetischen Distanz zwischen den Haplotypen beeinflusst. Entsprechend PONS & PETIT (1996) liegt eine phylogeographische Struktur dann vor, wenn Nst > Gst ist. Die hier gefundenen Werte für Gst = 0,86 und Nst = 0,87 sind nicht signifikant voneinander verschieden, was darauf hindeutet, dass die Haplotypen phylogenetisch gleichwertig sind und infolgedessen nur eine geographische Struktur vorhanden ist (VETTORI et al. 2004). Dieses Ergebnis ist gut auf das Verteilungsmuster der Haplotypen übertragbar: innerhalb der geographischen Gruppen I, IV, VI, VIII und IX sind die jeweiligen Haplotypen bezogen auf das Netzwerk maximal fünf Mutationsschritte (MS) voneinander entfernt (dies ist der Fall für #6 und #18 in Population JP 06.0070). Die Gruppen III (maximal acht MS zwischen #15 und #16), IV (maximal 12 MS zwischen #8 und #12) und VII (maximal 15 MS zwischen #9 und #15) dagegen vereinigen jeweils verwandtschaftlich weit voneinander entfernte Haplotypen. Tabelle 3.22: Ergebnis der AMOVA für drei definierte Gruppen von F. rusbyi basierend auf dem Datensatz von sieben plastidären Mikrosatellitenloci. Die Analyse wurde auf zwei, bzw. drei Hierarchie-Ebenen durchgeführt, angegeben sind die Freiheitsgrade (d.f.), die Varianz- Komponenten, der prozentuale Anteil der Variation bezogen auf die jeweilige Bezugsquelle sowie die F-Statistik und deren Signifikanz. Quelle der Variation d.f. Varianz-Komponenten Anteil der Variation (%) Statistik Signifikanz Zwischen den geographischen Gruppen (K = 9) 8 1,12 44,4 Fst = 0,843 < 0,001 Zwischen den Populationen innerhalb der Gruppen 21 1,01 40,0 Fsc = 0,718 < 0,001 Innerhalb der Populationen 223 0,40 15,7 Fct = 0,444 < 0,001 Total 252 2,53 Zwischen Populationen (K = 12) 11 2,50 95,8 Fst = 0,958 < 0,001 Innerhalb der Populationen 241 0,11 4,2 Total 252 2,61 Zwischen Populationen (K = 30) 29 2,01 83,5 Fst = 0,835 < 0,001 Innerhalb der Populationen 223 0,40 16,5 Total 252 2,41 120 Ergebnisse Der hohe Gst-Wert weist darauf hin, dass analog zu den mit nukleären Markern erzielten Ergebnissen der Hauptanteil der genetischen Differenzierung und Variation zwischen den Populationen angesiedelt ist. Diese Beobachtung wird auch durch das Ergebnis der AMOVA gestützt, die mit drei verschiedenen Partitionierungen durchgeführt wurden und deren Ergebnisse in Tabelle 3.22 zusammengefasst sind. Die AMOVA besagt, dass unter der Annahme von K = 12 insgesamt 95,8% der Gesamtvariation zwischen den Populationen vorhanden ist. Der mit 0,96 extrem hohe Fst-Wert unterstreicht ebenfalls, dass der plastidäre Genfluss zwischen den einzelnen Populationen und Regionen minimal ist. In Tabelle T9 im Anhang sind die paarweisen genetischen Distanzen (NEI 1972) auf der Basis der 15 nukleären und der sieben plastidären Mikrosatellitenmarker zusammengestellt. Ein MANTEL-Test ergab eine moderate, aber signifikante Korrelation von 31% zwischen den beiden (p < 0,003; Daten nicht dargestellt). Die Korrelation zwischen den paarweisen genetischen Distanzen auf Basis der sieben plastidären Mikrosatellitenmarker und den geographischen Distanzen war hingegen mit p = 0,02 nicht signifikant (r = 0,22; Daten nicht dargestellt). Im Gegensatz zu den nukleären Markern ist daher auf Ebene der Chloroplasten nicht von einer ’isolation-by-distance’ im Untersuchungsgebiet auszugehen. 121 Diskussion 4. Diskussion 4.1 Methodische Aspekte Die Verfahren zur Entwicklung von Mikrosatellitenmarkern sind sehr vielfältig und reichen von der traditionellen Klonierung mithilfe von Vektoren (WEISING et al. 2005) bis hin zur Anwendung fortschrittlichster ’next-generation sequencing’ (NGS)-Technologien (ZALAPA et al. 2012). Alle Verfahren verbindet allerdings eine gemeinsame Grundvoraussetzung: die Information über die den Mikrosatelliten flankierende Sequenz. Diese Kenntnis ist essentiell wichtig, da andernfalls eine Ableitung der spezifischen Primerpaare zur Amplifizierung eines Mikrosatellitenlocus via PCR nicht erfolgen kann. Sofern bereits Sequenzdaten für das bearbeitete Taxon oder nahe verwandte Arten verfügbar sind, bietet die Suche in öffentlich zugänglichen Datenbanken wie GenBank eine gute Möglichkeit, um schnell und kostensparend Mikrosatelliten und flankierende Primersequenzen zu identifizieren. Liegen die Primerbindestellen in kodierenden und daher konservierteren Region eines Genoms, so erhöht dies die Chance, dass ein spezifisches Primerpaar auch über Artgrenzen hinweg in weiter entfernte Taxa anwendbar ist. Die Suche nach Mikrosatelliten in öffentlichen ’expressed sequence tag’ (EST)-Datenbanken ist eine der beiden Vorgehensweisen, die in der vorliegenden Arbeit zur Entwicklung von Markern für die Familie der Bromeliaceen eingesetzt wurde. Die dabei erhaltenen Ergebnisse liegen inklusive verschiedener Anwendungsbeispiele bereits in publizierter Form vor (WÖHRMANN & WEISING 2011) und werden nachfolgend unter 4.1.1 diskutiert. Als zweite Methode wurden Mikrosatelliten aus 454-Sequenzen von drei Arten der Unterfamilie Pitcairnioideae extrahiert (siehe 4.1.2). Auch hierzu wurde ein Teil der Daten bereits publiziert (WÖHRMANN et al. 2012, 2013). 4.1.1 Ananas-ESTs als ergiebige Quelle für Mikrosatelliten Noch in den 1990er Jahren waren Mikrosatelliten vornehmlich in der nicht-kodierenden Fraktion des Genoms vermutet worden, doch dies erwies sich als Fehleinschätzung. So stellten z.B. bereits MORGANTE et al. (2002) fest, dass Mikrosatelliten vornehmlich mit den niedrig-repetitiven und exprimierten Regionen des Genoms assoziiert sind. Entsprechend häufig treten Mikrosatelliten in EST-Datenbanken auf, die ja von kurzen mRNA-Abschnitten abgeleitet werden (WEISING et al. 2005). In Pflanzen sind ESTs daher in den vergangenen Jahren zu einem begehrten und nützlichen Ausgangsmaterial für die Entwicklung von Mikrosatellitenmarkern geworden, so zum Beispiel in kultivierten Obstsorten wie der Weintraube (SCOTT et al. 2000), Aprikose (DEQROOCQ et al. 2003), Kiwi (FRASER et al. 2004) und Zitrone (CHEN et al. 2006) oder in Getreidesorten wie Weizen 122 Diskussion (GUPTA et al. 2003) und Gerste (THIEL et al. 2003). Es liegt daher nahe, ESTs auch als Quelle für Mikrosatellitenmarker in der artenreichen Familie der Ananasgewächse zu nutzen. Zum aktuellen Zeitpunkt (Stand Januar 2014) stehen 5.941 EST-Einträge in GenBank zur Verfügung. Bis auf eine cDNA-Sequenz aus dem Blattgewebe von Guzmania lingulata (Tillandsioideae) stammen alle übrigen Einträge aus Ananas comosus (Bromelioideae), wobei 282 dieser ESTs zum Zeitpunkt meiner Suche in GenBank (Anfang 2010) noch nicht veröffentlicht waren (ONG et al. 2012). Die in 2010 vorhandenen 5.659 Ananas-ESTs mit einer durchschnittlichen Länge von 730 bp (MOYLE et al. 2005) dienten in der vorliegenden Arbeit als Ausgangsmaterial für die Suche nach Mikrosatelliten. Eine oft verfolgte Strategie zur möglichst konkreten Einschätzung der Häufigkeit und Verteilung von Mikrosatelliten besteht in einer – der Suche vorgeschalteten – Assemblierung der ESTs in mutmaßliche Contigs, wodurch die Redundanz im Datensatz erheblich herabgesetzt wird. Zahlreiche Studien belegen die Zweckmäßigkeit dieses Schritts. Beispielsweise wurden im Flachs (Linum usitatissimum) auf diese Weise 146.611 ESTs in 23.062 nicht-redundante Unigenes (11.166 Contigs und 11.896 Singletons) konvertiert, was einer Verringerung der Anzahl der Sequenzen (ohne Singletons) um 92% entspricht (CLOUTIER et al. 2009). Ähnliche Werte wurden auch in anderen Studien erzielt, die Übersicht in Tabelle 4.1 zeigt diesbezüglich eine Spannweite von 60- 92%. Die hier erzielte Assemblierung der Ananas-ESTs in 824 Contigs und 2.565 Singletons liegt ebenfalls in diesem Bereich (73%; vgl. Tabelle 4.1). Tabelle 4.1: Vergleichende Gegenüberstellung einiger publizierter Studien basierend auf EST-Mikrosatelliten (EST-SSRs). Angegeben sind jeweils die Gesamtzahl der ESTs, die Ergebnisse der Assemblierung in Contigs und Singletons (zusammen Unigenes), der prozentuale Wert der Datensatz- Verringerung nach Assemblierung (%), sowie die nach individuellen Suchkriterien (Mindestzahl an Wiederholungseinheiten) gefundenen Mikrosatelliten (1-6 bedeutet Mono- bis Hexanukleotid-Wiederholungen). Zitation Objekt ESTs Contigs Singletons % SSRs SSR-Suchkriterien1 2 3 4 5 6 CLOUTIER et al. 2009 Linum usitatissimum 146.611 11.166 11.896 92% 803 - 9 6 5 5 5 DURAND et al. 2010 Quercus robur 103.000 13.477 14.547 85% 5.218 - 5 4 3 3 3 HEESACKER et al. 2008 Drei Helianthus-Arten 89.225 6.098 11.806 86% 16.643 - 4 4 4 - - SIMKO 2009 Lactuca sativa 68.197 8.179 11.344 86% 882 20 10 6 5 4 3 CHAPMAN et al. 2009 Catharmus tinctorius 40.874 7.154 12.241 75% 6.180 - 5 4 4 - - SCAGLIONE et al. 2009 Cynara cardunculus 36.321 6.621 12.434 72% 4.219 - 5 4 4 4 3 ASP et al. 2007 Lolium perenne 25.744 3.195 6.170 84% 955 - 6 4 4 4 4 PONCET et al. 2006 Coffea canephora 9.820 1.787 3.747 71% 431 15 9 6 5 4 3 TANG et al. 2003 Iris brevicaulis / I. fulva 6.530 1.066 3.851 60% 1.447 5 5 5 5 5 5 ZHANG et al. 2010 Juglans regia 5.025 816 1.598 76% 398 - 5 5 5 5 5 WÖHRMANN & WEISING 2011 Ananas comosus 5.659 824 2.565 73% 696 15 7 5 5 5 5 ONG et al. 2012 Ananas comosus 5.931 n.a. n.a. n.a. 411 - 8 6 5 - - FENG et al. 2013 Ananas comosus 5.659 n.a. n.a. n.a. 588 10 6 6 5 5 5 Mit den 3.389 Ananas-Unigenes als Suchgrundlage wurden 696 perfekte, einzigartige Mikrosatelliten identifiziert, was einer Häufigkeit von einem Mikrosatelliten pro 4,1 kb entspricht. Dieser Wert liegt im oberen Bereich des für andere Pflanzenarten vorgegebenen Rahmens von üblicherweise 2-10 kb (MORGANTE et al. 2002; KANTETY et al. 2002; KUMPATLA & 123 Diskussion MUKHOPADHYAY 2005; VARSHNEY et al. 2005; CHEN et al. 2006; PONCET et al. 2006; SCAGLIONE et al. 2009; VECCHIETTI et al. 2009). Diese Zahlen sind allerdings mit Vorsicht zu interpretieren, da von den unterschiedlichen Autoren unterschiedliche Suchkriterien eingesetzt wurden. So schließen beispielsweise einige Autoren die Mono- oder auch die Penta- und Hexanukleotide von der Suche aus, und auch die Mindestzahlen an Wiederholungseinheiten für die Definition eines Mikrosatelliten eines bestimmten Typs wurden nicht einheitlich gewählt (vgl. Tabelle 4.1). Ebenfalls variieren die zur Suche eingesetzten Software-Programme. Obwohl es dadurch schwierig ist, die relativen Häufigkeiten und Abundanzen von EST-stämmigen Mikrosatelliten in unterschiedlichen Organismen zu vergleichen, belegen die hier erzielten Resultate eindeutig, dass Ananas-ESTs eine ergiebige Quelle für Mikrosatelliten darstellen. Zu diesem Ergebnis kamen auch andere Arbeitsgruppen, die zu einem späteren Zeitpunkt und nach Publikation unseres Manuskripts (WÖHRMANN & WEISING 2011) von ähnlichen Vorgehensweisen berichteten. So konstruierten ONG et al. (2012) eine cDNA-Bibliothek basierend auf der RNA kultivierter Ananas- Früchte, die nach bidirektionaler Sequenzierung insgesamt 282 ESTs lieferte (230 5`-ESTs und 52 3`-ESTs). Zwar erfolgte eine Assemblierung dieser ESTs in 34 Contigs und 134 Singletons, allerdings wurde anschließend der unassemblierte Datensatz mit dem ebenfalls unassemblierten EST-Datensatz von MOYLE et al. (2005) kombiniert. Folglich bildeten 5.931 ESTs die Grundlage der Suche nach Mikrosatelliten, wobei nur Di- (≥ 8 Einheiten), Tri- (≥ 6 Einheiten) und Tetranukleotide (≥ 5 Einheiten) berücksichtigt wurden. Insgesamt lieferte die Suche 441 Mikrosatelliten, was einer Häufigkeit von einem Mikrosatelliten pro 13 kb innerhalb des kombinierten Datensatzes entspricht und von den Autoren als überraschend hohes Ergebnis gewertet wurde. Für 133 Mikrosatelliten konnten ONG et al. (2012) Primerpaare ableiten, die Publikation der Primersequenzen ist bis jetzt jedoch noch nicht erfolgt, womit die von dieser Gruppe entwickelten Mikrosatellitenmarker auch nicht öffentlich zur Verfügung stehen. Auch FENG et al. (2013) verfolgten sowohl dieselbe Strategie wie im Rahmen der vorliegenden Arbeit, als auch denselben EST-Datensatz (MOYLE et al. 2005), um mit leicht abgewandelten Kriterien (vgl. Tabelle 4.1) nach EST-Mikrosatelliten zu suchen und Marker zu entwickeln. Schließlich verwendeten auch CARLIER et al. (2012) die EST-Datenbank von MOYLE et al. (2005) um nach Mikrosatelliten zu suchen, allerdings lag der Schwerpunkt hier auf der genetischen Kartierung. Die Autoren entwickelten Primerpaare zur Amplifizierung von 45 EST-Mikrosatellitenloci, von welchen am Ende 13 erfolgreich in eine genetische Karte von Ananas comosus integriert wurden, zusammen mit diversen RAPD-, ISSR-, AFLP-, SCAR-, genomischen SSR- und CAPS-Markern. 124 Diskussion 4.1.1.1 Verteilung der Mikrosatellitenmotive in ESTs Unsere Ergebnisse zeigen, dass Di- und Trinukleotide mit einem Gesamtanteil von 76,5% die vorherrschenden Wiederholungseinheiten in der EST-Datenbank von MOYLE et al. (2005) darstellen (vgl. Tabellen 3.2 und 3.3). Dies spiegelt die beobachtete Situation in diversen anderen pflanzlichen ESTs wider, in denen entweder Dinukleotid- (PINTO et al. 2004; KUMPATLA & MUKHOPADHYAY 2005; FENG et al. 2013) oder Trinukleotid-Wiederholungen (SCOTT et al. 2000; KANTETY et al. 2002; CHEN et al. 2006; ASP et al. 2007; ZHANG et al. 2010) die häufigsten Klassen von Wiederholungseinheiten repräsentieren. In Exon-Bereichen überwiegen generell Trinukleotid- Mikrosatelliten, da Längenvariationen hier keine allzu negativen Auswirkungen auf den Leserahmen haben. Nicht-trimäre Motive werden hingegen meist durch Rasterschubmutationen ausselektiert (METZGAR et al. 2000). Innerhalb der 5`- und 3`-UTRs findet man häufiger Dinukleotid- Wiederholungen. Mit einem Anteil von 33,2% bezogen auf alle übrigen Mikrosatelliten und mit 86,5% aller Dinukleotide war das (AG)n-Motiv in den Ananas-EST-Mikrosatelliten das bei weitem häufigste der 42 individuellen Motive. Ein ähnlich hoher Anteil des (AG)n-Motivs wurde auch in anderen EST-Datenbanken beobachtet, so zum Beispiel im Gartensalat (53,6% aller Dinukleotid- Wiederholungen, SIMKO 2009), im Deutschen Weidelgras (41%, ASP et al. 2007), in der Erdnuss (75,7%, LIANG et al. 2009), im Kaffee (62,2%, PONCET et al. 2006), der Gerste (51%, THIEL et al. 2003), der Iris (90,3%, TANG et al. 2003), der Eiche (70%, DURAND et al. 2010) und in nahezu allen ESTs von 55 verschiedenen dikotylen Pflanzenarten die von KUMPATLA & MUKHOPADHYAY (2005) untersucht wurden. Die Dominanz des (AG)n-Motivs unter den Dinukleotid-Wiederholungen scheint eine generelle Eigenschaft von pflanzlichen Genomen zu sein, während in den meisten Wirbeltieren und Arthropoden das (AC)n-Motiv überwiegt (TÓTH et al. 2000). Zur funktionellen Bedeutung von Mikrosatelliten in Genen oder ihrer unmittelbaren Umgebung gibt es viele Hypothesen, von denen hier nur einige kurz genannt werden sollten. So wird zum Beispiel angenommen, dass Homopurin-Homopyrimidin-Einheiten wie (AG)n im 5`-UTR-Bereich an der Genregulation beteiligt sind (VARSHNEY et al. 2005). AYERS et al. (1997) fanden heraus, dass die Längenvariation eines (CT)n-Mikrosatelliten in der 5`-UTR des Waxy-Gens im Reis mit dem Amylose-Gehalt korreliert. Analog zu diesen Erkenntnissen zeigte sich, dass die (AG)n- Wiederholungen in der 5`-UTR von Artischocken-ESTs mit Genen assoziiert sind, die an der Transkription, dem Nukleinsäure-Stoffwechsel und der Regulation der Gen-Expression beteiligt sind (SCAGLIONE et al. 2009). Schon seit den 1990er Jahren werden längenvariable Mikrosatelliten in kodierenden oder regulatorischen Regionen von Genen mit neurodegenerativen Krankheiten des Menschen (wie z.B. Morbus HUNTINGTON) in Verbindung gebracht (GATCHEL & ZOGHBI 2005). 125 Diskussion 4.1.1.2 Etablierung von EST-Mikrosatellitenmarkern und Primervalidierung Um für das Primerdesign geeignet zu sein, müssen die einen Mikrosatelliten flankierenden Sequenzen eine ausreichende Länge und einen genügend hohen GC-Gehalt aufweisen (PARDI et al. 2005). In der vorliegenden Arbeit waren Sequenzen, die diesen Ansprüchen genügten, in der Umgebung von 537 der 696 gefundenen Mikrosatelliten vorhanden (77,2%). Bei der Auswahl möglicher Mikrosatellitenmarker sind mehrere Aspekte zu berücksichtigen. So hat die Anzahl an Wiederholungseinheiten einen entscheidenden Einfluss auf das Mutationsverhalten eines Mikrosatelliten, denn Loci mit einer hohen Anzahl an Wiederholungen (> 16) weisen meist eine höhere Mutationsrate und infolgedessen eine größere Zahl von Allelen auf als kürzere Mikrosatelliten (ELLEGREN 2000; PETIT et al. 2005; KELKAR et al. 2008; GUICHOUX et al. 2011). Daher wurden in der vorliegenden Arbeit vorwiegend Mikrosatellitenloci mit möglichst vielen Wiederholungseinheiten ausgewählt. Ein zweites Kriterium für die Auswahl betrifft die Berücksichtigung der sechs möglichen Motivklassen. Dinukleotid-Wiederholungen sind häufig der variabelste Typ von Mikrosatelliten, allerdings treten hier auch besonders oft Stotterbanden auf, die ein korrektes Bewerten der Bandenprofile nach gelelektrophoretischer Auftrennung erschweren können. Trinukleotid- Wiederholungen wiederum sind aufgrund ihrer häufigen Lokalisation im kodierenden Bereich nicht ganz so variabel, jedoch ist der Stottereffekt bei ihnen (und allen Mikrosatellitenklassen mit längeren Wiederholungseinheiten) vergleichsweise schwach ausgeprägt. Den Tetra- und Pentanukleotiden wird wiederum ein höheres Maß an Variabilität nachgesagt, allerdings sind diese Klassen innerhalb von ESTs nur selten anzutreffen (GARDNER et al. 2011). In der vorliegenden Arbeit wurden hauptsächlich EST-Mikrosatelliten vom Di- oder Trinukleotid- Wiederholungstyp ausgewählt. Die Sequenzdaten von 36 Singletons und 12 Contigs bildeten die Grundlage zur Synthese von 48 Primerpaaren, die 15 Di- und 32 Tri- und einer Tetranukleotid- Wiederholungseinheit flankierten. Ein drittes Kriterium besteht in der Perfektion eines Mikrosatelliten. Perfekte Wiederholungseinheiten sind meist variabler als imperfekte oder zusammengesetzte Mikrosatelliten und folgen eher dem ’stepwise mutation model’ (SMM; vgl. Kapitel 1.2.3.2). Durch die in silico vorgenommenen Einstellungen am PC wurde dieses Kriterium bereits zum frühen Zeitpunkt der Datenbank-Suche erfüllt. Entgegen den traditionellen Klonierungsverfahren, bei denen möglichst alle Mikrosatelliten aus den Sequenzen der positiven Klone verwendet werden mussten, ist innerhalb der EST-Sequenzen eine individuelle ’top-down’-Auswahl der besten Mikrosatelliten möglich. 126 Diskussion Um die Amplifizierung unspezifischer DNA-Sequenzen zu vermeiden ist es möglich, die PCR entsprechend abzuwandeln. Die ’touch-down’-PCR nach DON et al. (1991) ist so konzipiert, dass in den ersten Zyklen der Synthese die Anlagerungs-Temperatur so hoch gewählt wird, dass die Primer hochspezifisch binden und ein ebensolches Amplifikat erzielt wird. Die sukzessive Herabsetzung der Temperatur während der folgenden Schritte erlaubt im weiteren Verlauf der PCR zwar eine unspezifische Primerbindung, die bereits vorhandenen Kopien aus den primären Zyklen unterbinden allerdings eine Anreicherung solcher Produkte. Als Nebeneffekt dieser Methode ergibt sich eine deutliche Steigerung in der Menge der erhaltenen PCR-Produkte. Unter Verwendung eines ’touch-down’-Protokolls mit geeigneten Ober- und Untergrenzen in Bezug auf die Anlagerungs-Temperatur war es möglich, den Großteil der 48 ausgewählten EST- Mikrosatellitenloci zu amplifizieren, ohne zusätzliche Zeit in die Optimierung von Standard-PCR- Protokollen zu investieren. Insgesamt ergaben 81,3% aller Trinukleotid- und 86,7% der aller Dinukleotid-Mikrosatelliten sowie das einzige Tetranukleotid-Motiv ein PCR-Produkt in allen vier Ananas comosus-Akzessionen des ersten Testdurchlaufs. Zweiundvierzig der Marker (87,5%) amplifizierten das erwünschte PCR-Produkt in mindestens einer der getesteten Akzessionen, lediglich für sechs der Marker blieb die PCR erfolglos. Vergleichbar hohe Erfolgsquoten wurden auch in anderen Studien erzielt, so amplifizierten 283 von 568 EST-stämmigen Primerpaaren (75,8%) das erwartete PCR-Produkt in Quercus robur (DURAND et al. 2010), ebenso generierten 145 von 157 Mikrosatelliten-flankierenden Primerpaaren (92%) aus einer EST-Datenbank von Festuca arundinacea ein klares PCR-Produkt in mindestens einer von elf untersuchten Grasarten (SAHA et al. 2004). 4.1.1.3 Funktionalität der EST-Mikrosatellitenmarker und Verwandtschaftsstudien innerhalb der Gattung Ananas Aufgrund ihrer Assoziation mit kodierenden und infolgedessen konservierten Bereichen des Genoms wird für EST-stämmige Mikrosatelliten oftmals vermutet, dass sie gegenüber ihren anonymen, genomischen Pendants ein vermindertes Maß an Variabilität aufweisen (VARSHNEY et al. 2005; ELLIS & BURKE 2007). Vergleichende Studien auf der Basis beider Markertypen haben gezeigt, dass diese Annahme nicht zwangsläufig zutreffen muss. So wurde in der Kiwi-Frucht (FRASER et al. 2004) und der Sonnenblume (PASHLEY et al. 2006) ein relativ ausgewogenes Maß an Polymorphismus mit den beiden Markertypen beobachtet. In der vorliegenden Arbeit war jeder der 18 für die detaillierten Untersuchungen in der Ananas ausgewählten EST- Mikrosatellitenmarker variabel (vgl. Tabellen 3.4 und 3.5). Im Detail wurden zwei bis sechs Allele und eine durchschnittliche erwartete Heterozygotie (He) von 0,58 zwischen 12 A. comosus- 127 Diskussion Individuen ermittelt. Diese Werte stehen in Einklang mit den zwei bis vier Allelen und einem He- Wert von 0,51, die von KINSUAT & KUMAR (2007) auf der Basis von 19 anonymen Mikrosatellitenmarkern in einem Probenset aus 180 A. comosus-Individuen sechs verschiedener Populationen im Osten von Malaysia ermittelt hatten. Die Variabilität von EST- und genomischen Mikrosatelliten scheint mithin in der Ananas nicht stark unterschiedlich zu sein. Es ist daher zu erwarten, dass die hier entwickelten EST-Mikrosatellitenmarker in unterschiedlichen Bereichen der Ananasforschung eingesetzt werden können, zum Beispiel im Rahmen der genetischen Kartierung (CARLIER et al. 2004, 2011; DE SOUZA et al. 2013). Die mittels der EST-Mikrosatellitenmarker erzeugten Bandenmuster waren durchweg sehr gut reproduzierbar und von hoher Qualität, was einer generellen Eigenschaft dieses Markertyps entspricht (VARSHNEY et al. 2005; PASHLEY et al. 2006). Jeder Locus zeichnete sich zudem durch seine individuelle ’Signatur’ aus, die durch ein spezifisches Arrangement von Stotterbanden hervorgerufen und geprägt wurde. Diese waren stets um mindestens eine Wiederholungseinheit kürzer als das eigentliche Allel, was sie in Verbindung mit einer deutlich schwächeren Banden- Intensität zu willkommenen Hilfsmitteln machte, um zwischen Artefakten und echten Allelen zu differenzieren (SCHWENGEL et al. 1994). Die Anwesenheit von Stotterbanden ermöglicht zudem eine Aussage darüber, ob ein PCR-Produkt tatsächlich einen Mikrosatelliten enthält. So besteht bei der Abwesenheit von Stotterbanden im PCR-Produkt einer heterogenen Art der Verdacht, dass zwar die Mikrosatelliten-flankierenden Sequenzen und Primerbindestellen vorhanden sind, der Mikrosatellit selbst jedoch deletiert wurde. Wenn andererseits ein ansonsten variabler Marker in einer heterologen Art ein monomorphes Bandenmuster mit typischem Stotter produziert, könnte das monomorphe Verhalten des Markers auf Klonalität und vegetative Vermehrung hindeuten. Entsprechend dem diploiden Status aller Arten der Gattung Ananas (2n = 50; COTIAS DE OLIVEIRA et al. 2004; GITAÍ et al. 2005) wurden in sämtlichen zur Verfügung stehenden Ananas-Arten stets einzelne bzw. doppelte Mikrosatellitenbanden nachgewiesen. Nur in Pseudananas sagenarius wurden gelegentlich drei oder vier Banden beobachtet, was mit dem tetraploiden Status dieser Art übereinstimmt (2n = 100; COLLINS 1960; BOTELLA & SMITH 2008; DE SOUZA et al. 2013). Über alle Mikrosatellitenmarker hinweg wiesen drei Akzessionen von A. nanus, je zwei Akzessionen von A. comosus und zwei Akzessionen von A. bracteatus den jeweils identischen Genotyp auf, was vermutlich auf vegetative Vermehrung und/oder einen Austausch zwischen den Botanischen Gärten zurückzuführen ist, von denen das Material stammte. Bezüglich der A. comosus-Akzession BT_75 lag offenbar eine Fehlbestimmung vor, da sie denselben Genotyp wie zwei Individuen von A. bracteatus (BT_73 und BT_80) aufwies und zusammen mit diesen und den meisten übrigen A. bracteatus-Akzessionen eine Gruppe innerhalb der PCo-Analyse bildete (vgl. 128 Diskussion Abbildung 3.3). Ein Ausschluss dieses abweichenden Individuums aus dem Probenset bewirkte eine leichte Verringerung der ermittelten Heterozygotie-Werte über alle Loci (He = 0,56 und Ho = 0,47). Locker definierte Gruppen wurden sowohl von allen A. nanus- als auch den meisten A. comosus-Akzessionen gebildet, allerdings waren diese Gruppen in der PCo-Analyse nicht eindeutig und es zeichnete sich ebenfalls keine klare Beziehung zwischen den einzelnen Arten ab. Die Taxonomie von Ananas und Pseudananas wurde lange Zeit kontrovers diskutiert. In ihrer umfangreichen Monographie über die Familie Bromeliaceae haben SMITH & DOWNS (1979) sieben Arten innerhalb der Gattung Ananas anerkannt: A. ananassoides, A. bracteatus, A. comosus, A. fritzmuelleri, A. lucidus, A. nanus und A. parguazensis. Die tetraploide Pseudananas sagenarius wurde als nächste Verwandte aufgefasst. Die sieben Ananas-Arten sind allerdings frei miteinander kreuzbar (COLLINS 1960), was auf die Abwesenheit von reproduktiven Barrieren hinweist. Auch die vermutlich umweltbedingte morphologische Variation bzw. Plastizität der einzelnen Arten macht eine klare Trennung der Taxa problematisch (COPPENS D`EECKENBRUGGE & LEAL 2003). Molekulare Studien auf der Basis von Isozymen (ARADHYA et al. 1994), RAPD- (RUAS et al. 2001), AFLP- (KATO et al. 2004), sowie nukleären (DUVAL et al. 2001) und plastidären (DUVAL et al. 2003) RFLP-Markern bestätigen, dass auch auf molekularer Ebene nur ein geringes Maß an genetischer Differenzierung zwischen den sieben Arten vorhanden ist (CARLIER et al. 2012). COPPENS D`EECKENBRUGGE & LEAL (2003) revidierten und vereinfachten die Taxonomie der Gattung Ananas dahingehend, dass sie die bis dato sieben Arten auf zwei Arten reduzierten. Danach sind alle diploiden Arten unter A. comosus vereinigt, die in fünf botanische Varietäten untergliedert wird: ananassoides, bracteatus, comosus, erectifolius und parguazensis. Die tetraploide Pseudananas sagenarius hingegen wird in Ananas macrodontes MORREN umbenannt (COPPENS D`EECKENBRUGGE & LEAL 2003). Aufgrund des zu geringen Probenumfangs der in der vorliegenden Arbeit untersuchten Ananas- Akzessionen kann über die Artabgrenzung keine belastbare Aussage getroffen werden, jedoch wird aus der PCo-Analyse ersichtlich, dass auch nukleäre Mikrosatellitenmarker keine klare Trennung zwischen den Ananas-Arten erlauben. Um dies zu bestätigen, sollten die hier entwickelten EST-Mikrosatellitenmarker zur Genotypisierung eines deutlich umfangreicheren Probensets eingesetzt werden, bestehend aus mehreren natürlichen Populationen von geeigneter Stichprobengröße. 129 Diskussion 4.1.1.4 Übertragbarkeit der EST-Mikrosatellitenmarker aus Ananas innerhalb der Bromeliaceae Die Entwicklung nukleärer Mikrosatellitenmarker via Anreicherung und Klonierung im Rahmen der traditionellen Verfahren ist eine oftmals zeit- und kostenintensive Angelegenheit (ZANE et al. 2002; GUICHOUX et al. 2011). Die computerbasierte Suche ist daher eine äußerst praktikable und günstige Alternative. Da allerdings ein großer Teil der ESTs in öffentlichen Datenbanken (z.B. GenBank) aus wirtschaftlich relevanten Arten und/oder Modell-Organismen generiert wurde, mangelt es oftmals an der Verfügbarkeit ausreichend umfangreicher EST-Einträge für die im eigenen Fokus stehende Pflanzenart. Somit kommt der Übertragbarkeit der Mikrosatellitenmarker auf näher oder auch entfernter verwandte Taxa eine große Bedeutung zu (PEAKALL et al. 1998; BARBARÁ et al. 2007a). Eine wesentliche Zielsetzung der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung von Mikrosatellitenmarkern, die sich für eine Vielfalt von Anwendungen in einem möglichst weiteren Spektrum der Arten der Bromeliaceae eignen. In Anbetracht ihrer Assoziation mit Genen wird den EST-Mikrosatellitenmarkern gegenüber anonymen Mikrosatelliten ein generell höheres Maß an Übertragbarkeit beigemessen. Übereinstimmend mit dieser Annahme erwies sich die Transferierbarkeit genomischer, anonymer Mikrosatellitenmarker auch oftmals als beschränkt auf nah verwandte Arten, während die EST-Mikrosatellitenmarker häufig zwischen Gattungen (Übersicht bei ELLIS & BURKE 2007), gelegentlich zwischen Unterfamilien (DECROOCQ et al. 2003; ZHANG et al. 2005; HEESACKER et al. 2008) und selten sogar zwischen Familien übertragbar sind (GUPTA & PRASAD 2009). Dies wird durch die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit bestätigt. Nahezu alle hier entwickelten EST-Mikrosatellitenmarker waren innerhalb der Gattung Ananas übertragbar und ein erheblicher Anteil der Primerpaare amplifizierte ein PCR-Produkt erwarteter Länge in unterschiedlich weit entfernten Arten diverser Gattungen und Unterfamilien der Bromeliaceae (vgl. Tabelle 3.7). Gemäß der taxonomischen Erwartungen (GIVNISH et al. 2007, 2011) amplifizierten die meisten Primerpaare innerhalb der UF Bromelioideae (74,8%), zu der auch Ananas comosus gehört. Mit zunehmender taxonomischer Entfernung verringerte sich der prozentuale Anteil transferierbarer Primerpaare auf 60% (Puyoideae), 51,6% (Pitcairnioideae), 42,6% (Hechtioideae), 27,3% (Tillandsioideae) und 19,5% in der – bezogen auf die Ursprungsart der ESTs (A. comosus) – am weitesten entfernten UF Brocchinioideae. 130 Diskussion 4.1.1.5 Anwendbarkeit der EST-Mikrosatellitenmarker aus Ananas in der Unterfamilie Pitcairnioideae Wird ein Mikrosatellitenmarker als ’zwischen Arten transferierbar’ bezeichnet so müssen zwei Voraussetzungen erfüllt sein, nämlich dessen (1) Präsenz und (2) Variabilität in der heterologen Zielart (DECROOCQ et al. 2003). In nah verwandten Arten treffen auf EST-Mikrosatellitenmarker in der Regel beide Voraussetzungen zu (ELLIS & BURKE 2007), so auch in der vorliegenden Arbeit innerhalb der Gattung Ananas beobachtet. Bezüglich der Übertragbarkeit in die taxonomisch vergleichsweise weit entfernte Unterfamilie Pitcairnioideae bestand indes eine wesentlich schwieriger zu erfüllende Anforderung an die entwickelten EST-Mikrosatellitenmarker. Die Funktionalität der Marker wurde vornehmlich in den Pitcairnioideen-Gattungen Deuterocohnia und Fosterella eruiert. In neun Individuen von Deuterocohnia brevifolia amplifizierten zehn der 18 EST- Mikrosatellitenmarker ein PCR-Produkt, acht dieser Marker erwiesen sich mit drei bis fünf Allelen als polymorph, wobei die durchschnittlichen Werte der beobachteten und erwarteten Heterozygotie bei 0,53 bzw. 0,63 lagen (Tabelle 3.6). Obwohl diese Ergebnisse erfolgversprechend sind, sollte die Markerfunktionalität vor einem Einsatz in groß angelegten Populationsstudien innerhalb der Gattung erneut getestet werden, da es sich bei dem untersuchten Material um Akzessionen aus Botanischen Gärten und nicht um Vertreter natürlicher Populationen handelte. Die Analyse von 24 Vertretern aus acht natürlichen Populationen von Fosterella rusbyi ergab an neun der 18 Loci eine erfolgreiche Amplifikation, wobei das Bandenmuster lediglich an vier Loci mit zwei bis neun detektierten Allelen variabel war. Die Heterozygotie-Werte lagen entsprechend bei He = 0,24 und Ho = 0,13 (Tabelle 3.6). Die Existenz von Mikrosatelliten in den heterologen PCR- Produkten wird durch die deutlichen Stotterbanden unterhalb der eigentlichen Allele bestätigt, die gemäß der jeweiligen Wiederholungseinheiten an den Loci Acom_71.3 und Acom_117.15 einen Abstand von jeweils zwei oder drei Basen zueinander aufwiesen (vgl. Abbildung 3.5). Besonders am Locus Acom_71.3 (linke Seite der Abbildung 3.5) wird für die bolivianischen Provinzen Sud Yungas, Nor Yungas und Caranavi eine populationsspezifische Verteilung der Allele augenscheinlich. Vier der hier entwickelten EST-Mikrosatellitenmarker aus Ananas comosus, die über sehr weite taxonomische Grenzen hinweg übertragbar waren (Acom_12.12, Acom_101.1, Acom_109.6, Acom_117.15), wurden zur genetischen Abgrenzung der drei Arten Fosterella christophii, F. micrantha und F. villosula aus der micrantha-Gruppe eingesetzt (vgl. dazu Kapitel 4.2.1.2). In 190 untersuchten Populationsproben erwiesen sich die vier Acom-Loci mit durchschnittlich 14,3 131 Diskussion detektierten Allelen als durchaus variabel. Über alle drei Fosterella-Arten wurden Heterozygotie- Werte von Ho = 0,10 und He = 0,68 nachgewiesen, was mit dem Ergebnis der ebenfalls im selben Datensatz angewendeten vier nukleären 454-Mikrosatellitenloci aus Fosterella rusbyi entspricht (vgl. Tabelle 3.17). 4.1.1.6 EST-Mikrosatellitenmarker: ein Résumé Die in der vorliegenden Arbeit entwickelten EST-Mikrosatellitenmarker bilden eine wertvolle Ergänzung der derzeit verfügbaren Marker für zahlreiche Anwendungsgebiete innerhalb der großen Familie der Bromeliaceen. Ein hoher Prozentsatz der 18 etablierten Marker erwies sich als über weite taxonomische Grenzen hinweg übertragbar, diese Marker stellen besonders innerhalb der Unterfamilie Bromelioideae geeignete Kandidaten zur populationsgenetischen Analyse dar. So erwiesen sich nahezu alle der etablierten Marker in mindestens einer von vier brasilianischen Arten der Bromelioideen-Gattung Cryptanthus (C. sergipensis, C. schwackeanus, C. spec. 1 und C. spec. 2) als polymorph (CRUZ & WÖHRMANN et al., in Vorbereitung zur Publikation). Fünf dieser Marker zeigten bereits in einem kleinen Probenset aus 20 Akzessionen das Potenzial zur Differenzierung zwischen allen vier Arten, die übrigen Marker eignen sich zur populationsgenetischen Analyse in jeweils mindestens einer der Cryptanthus-Arten. Einen Eindruck von der Funktionalität und Variabilität vier dieser Marker liefert Abbildung 4.1. Acom_86.4 Acom_93.4 Acom_101.1 Acom_109.6 Abbildung 4.1: Spezifische Bandenmuster an vier EST-Mikrosatellitenloci über 20 Akzessionen von vier Cryptanthus-Arten aus natürlichen Populationen im Osten Brasiliens (G.A. CRUZ, persönliche Mitteilung). Auftragsreihenfolge der Spuren: 1-3 = C. sergipensis, 4-6 = C. spec. 1, 7-13 = C. spec. 2, 14-20 = C. schwackeanus. Neben dem Einsatz für die Populationsgenetik und der Ermittlung von Genfluss und Artgrenzen stellen die EST-Mikrosatellitenmarker auch ein potenziell gut geeignetes Werkzeug dar, um die Herkunft vermeintlicher Hybride (GEALY et al. 2002) oder den Ursprung polyploider Arten abzuleiten (LELLEY et al. 2000). Derartige Analysen würden sich beispielsweise im Fall der tetraploiden Pseudananas sagenarius (Bromelioideae) oder der gleichfalls tetra- oder gar 132 Diskussion hexaploiden Fosterella penduliflora (Pitcairnioideae) anbieten. Eine erste Studie in dieser Richtung wurde im Rahmen einer von mir betreuten Bachelorarbeit von ÖDER (2012) durchgeführt. In dieser Arbeit wurden Kreuzungsexperimente zwischen den Arten der micrantha-Gruppe und Fosterella rusbyi durchgeführt und die Nachkommen mit Hilfe einiger hier etablierter EST- Mikrosatellitenmarker validiert. Dabei konnte neben der Fähigkeit aller untersuchten Arten zur Selbstbestäubung auch die Hybridbildung zwischen mehreren Arten nachgewiesen werden (ÖDER 2012). Die Übertragbarkeit von EST-Mikrosatellitenmarkern hat allerdings auch ihre Grenzen. So war die Anzahl polymorpher EST-Mikrosatellitenmarker in einer der Zielarten der vorliegenden Arbeit, Fosterella rusbyi, relativ gering, ebenso wie der Anteil heterozygoter Individuen in natürlichen Populationen von F. rusbyi. Dies könnte möglicherweise durch die konservierte Natur der EST-Mikrosatelliten oder das Auftreten von Nullallelen in dieser weit entfernten Art bedingt sein. Um für eine populationsgenetische Untersuchung innerhalb von F. rusbyi eine ausreichende Zahl von Markern für belastbare Ergebnisse zu bekommen, wurde ein zusätzliches Verfahren zur Etablierung von Mikrosatellitenmarkern in Form der 454-Sequenzierung herangezogen. 4.1.2 Mikrosatelliten aus der 454-Sequenzierung: Effizienz der Methode Der inhaltliche Aspekt der vorliegenden Dissertation beschäftigt sich mit Fragen der Populationsgenetik und Artabgrenzung innerhalb der Gattungen Dyckia und Fosterella, die beide zur Unterfamilie der Pitcairnioideae zählen. Einige der unter 4.1.1 diskutierten EST- Mikrosatellitenmarker aus Ananas waren zwar auf diese Gattungen übertragbar, für die vorgesehenen Studien war dies aber nicht ausreichend. Durch die Sequenzierung der DNA dreier ausgewählter Arten der Gattungen Deuterocohnia, Dyckia und Fosterella mittels der 454-Technologie sollten weitere Mikrosatellitenmarker entwickelt werden, die aufgrund der geringen taxonomischen Distanzen in den zu untersuchenden Arten funktionieren sollten. Die 454-Pyrosequenzierung mit dem GS-FLX Titanium-System liefert durchschnittlich 400 bp lange Sequenzen (GLENN 2011) und wurde bereits in zahlreichen Studien zur Entwicklung von Mikrosatellitenmarkern appliziert (Übersicht bei ZALAPA et al. 2012). In den meisten Arbeiten wurde eine ’shotgun’-Sequenzierung genomischer DNA vorgenommen und die Mikrosatelliten direkt aus den dabei erhaltenen ’reads’ isoliert, nur in manchen Fällen wurde der Pyrosequenzierung ein Anreicherungsschritt vorgeschaltet, so zum Beispiel in Rhododendron ferrugineum (DELMAS et al. 2011) und Alnus glutinosa (LEPAIS & BACLES 2011). Eine weitere Alternative 133 Diskussion besteht in der 454-Sequenzierung des Transkriptoms oder der cDNA. Diese Methode wurde beispielsweise in Cicer arietinum (HIREMATH et al. 2011), Glycine max (LI et al. 2010), Cucurbita pepo (BLANCA et al. 2011) und Epimedium sagittatum (ZENG et al. 2010) angewendet und bietet den Vorteil, eine mögliche Assoziation der gefundenen Mikrosatelliten mit funktionellen Genen (z.B. zur genetischen Kartierung) vergleichsweise effizient nachzuweisen. Die 454-Pyrosequenzierung genomischer DNA und die daran anschließende Entwicklung nukleärer und plastidärer Mikrosatellitenmarker wurde in der vorliegenden Arbeit erstmals für Bromelien angewendet. Ein Vergleich ist somit nur zwischen den drei hier erzeugten Datensätzen und mit den in anderen Pflanzenfamilien erzielten Ergebnissen möglich, allerdings müssen bei einem solchen Vergleich wie im Fall der EST-Mikrosatelliten die uneinheitlichen Suchkriterien für Mikrosatelliten berücksichtigt werden (Tabelle 4.2; weitere Übersicht in JENNINGS et al. 2011). Mit einer Sequenzausbeute von zusammengenommen etwa 8,7 Mb (Deuterocohnia longipetala), 20,4 Mb (Dyckia marnier-lapostollei var. estevesii) sowie 25,0 Mb (Fosterella rusbyi) liegt die mit dem GS-FLX Titanium-System (454 Life Sciences, ROCHE) produzierte Datenmenge im unteren Bereich des in anderen Studien angegebenen Rahmens, eine kleine Übersicht liefert Tabelle 4.2. Die durchschnittliche Länge der Bromelien-Sequenzen lag mit 327 bp im üblichen Bereich. Tabelle 4.2: Vergleichende Gegenüberstellung einiger publizierter Studien basierend auf 454-Mikrosatelliten (454-SSR). Angegeben sind jeweils die Gesamtzahl der 454-Sequenzen, deren durchschnittliche Länge (in bp) und Basenumfang (in Mb) sowie die nach individuellen Suchkriterien (Mindestzahl an Wiederholungseinheiten) gefundenen Mikrosatelliten; 1-6 bedeutet Mono- bis Hexanukleotid-Wiederholungen; .n.a.: Daten nicht verfügbar. Zitation Objekt Sequenzen Mb ∅ SSRs SSR-Suchkriterien1 2 3 4 5 6 BURRELL et al. 2011 Caulanthus amplexicaulis 19.974 6,4 318 bp 307 18 9 6 - - - Vorliegende Arbeit Deuterocohnia longipetala 25.827 8,7 337 bp 584 15 7 6 5 4 4 BUEHLER et al. 2011 Arabis alpina 40.361 14,3 354 bp 341 - 6 4 4 - - WÖHRMANN et al. 2013 Dyckia marnier-lapostollei 59.624 20,4 330 bp 1.587 15 7 6 5 4 4 SOMME et al. 2012 Comarum palustre 63.860 24,3 191 bp 2.553 - 6 4 - - - WÖHRMANN et al. 2012 Fosterella rusbyi 73.027 25,0 314 bp 2.796 15 7 6 5 4 4 CSENCSICS et al. 2010 Typha minima 76.692 26,2 341 bp 307 - 8 10 6 - - KARAN et al. 2012 Khaya senegalensis 93.943 22,0 234 bp 1.030 - 6 4 4 4 4 SEXTON et al. 2010 Khaya senegalensis 97.351 33,7 347 bp 12.014 - 4 4 4 - - BAI et al. 2013 Pinus massoniana 106.428 60,2 565 bp 1.699 - 9 6 5 5 4 SZCZECIŃSKA et al. 2012 Galium trifidum 144.275 61,5 426 bp 153 10 6 4 4 4 4 LEE et al. 2009 Amaranthus tuberculatus 158.015 43,0 271 bp 382 n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. TANGPHATSORNRUANG et al. 2009 Vigna radiata 470.024 100,5 216 bp 1.493 - 7 5 4 3 3 Die parallele Sequenzierung mehrerer, mittels spezifischer MID-Adaptoren markierter Proben (’pooling’) innerhalb eines 454-Gerätedurchlaufs gewährleistet weiterhin die Generierung ausreichender Sequenzmengen mehrerer Arten zur Entwicklung von Mikrosatellitenmarkern. Gleichzeitig werden auf diese Weise die anfallenden Kosten pro Spezies gesenkt. Dass durch Anwendung dieser ’pooling’-Methode keine signifikanten Nachteile entstehen, bewiesen SCHOEBEL 134 Diskussion et al. (2013) im Rahmen einer vergleichenden Analyse der 454-Datensätze von 17 Arten aus unterschiedlichen taxonomischen Gruppen (Pilze, Pflanzen, Moostierchen, Insekten, Vögeln und Säugetieren). Weitere Anwendungsbeispiele finden sich in MALAUSA et al. (2011), JENNINGS et al. (2011) sowie TAKAYAMA et al. (2011). Auch in der vorliegenden Arbeit wurden die DNAs der drei Bromelien parallel sequenziert und anschließend durch die artspezifischen MID-Adaptoren identifiziert und einer Art zugeordnet. Die Unterschiede in der Anzahl generierter Sequenzen pro Art sind hierbei allerdings weder dem ’pooling’ noch variierender DNA-Qualität zuzuschreiben, sondern beruhen überwiegend auf der Stochastik. Gegenwärtig ist es aufgrund des Einflusses diverser Parameter noch nicht möglich, den Sequenzdurchsatz einer Bibliothek innerhalb eines 454-Gerätedurchlaufs exakt vorherzusagen (HUETTEL, persönliche Mitteilung). 4.1.2.1 Assemblierung Ein Vergleich der Publikationen zeigt, dass die (sofern vorhandenen) Strategien zum Erhalt eines möglichst redundanzfreien Datensatzes recht unterschiedlich ausfallen, infolgedessen auch die verwendeten Software-Programme. Eine häufig angewandte Methode besteht in der Assemblierung der Rohsequenzen mittels des ’greedy’-Algorithmus in Contigs oder Assemblies sowie nicht assemblierte Singletons (ZHANG et al. 2000). Im Rahmen der EST-, nicht aber der 454- Assemblierung hat sich für die Kombination dieser beiden Datensätze der Begriff der Unigenes durchgesetzt und wurde zur einfacheren Zuordnung auch im Rahmen der assemblierten 454- Datensätze verwendet. Der ’greedy’-Algorithmus, der auch in der Software GENEIOUS implementiert ist, kalkuliert paarweise Alignments aller vorhandenen Fragmente. Die jeweils am besten zusammenpassenden Fragmente werden iterativ zu Contigs zusammengefasst, welche anschließend wiederum mit geeigneten Fragmenten verschmolzen werden. Der Nachteil dieser Methode besteht darin, dass Fragmente mit dem gleichen Mikrosatellitenmotiv am Anfang bzw. Ende ihrer Sequenz fälschlicherweise zuerst assembliert werden, da sie an dieser Stelle die höchste Überlappung aufweisen, so z.B. das erste und das vierte Fragment aus Abbildung 4.2. Im Fall der ESTs aus Ananas waren solche Sequenzen eher selten, weshalb die Problematik der Assemblierung erst an dieser Stelle der Diskussion behandelt wird. 135 Diskussion Abbildung 4.2: Korrekte Assemblierung a) von vier Mikrosatelliten-enthaltenden Fragmenten. Nach dem ’greedy’-Algorithmus b) würden das erste und das vierte Fragment wegen ihrer Ähnlichkeit im Bereich des repetitiven Abschnitts assembliert werden (verändert nach POP 2009). Eine Lösung des oben genannten Problems bietet die digitale Maskierung repetitiver Elemente über ein externes Programm (z.B. REPEATMASKER, SMIT et al. 1996-2010), allerdings kann nach einer Assemblierung unter Verwendung von GENEIOUS diese Maskierung nicht mehr rückgängig gemacht werden, sodass die Detektion sämtlicher Mikrosatelliten unmöglich wird. In der vorliegenden Arbeit wurden daher alle generierten Contigs, die einen zur Amplifizierung ausgewählten Mikrosatellitenlocus enthielten, separat innerhalb der GENEIOUS-Oberfläche kontrolliert und verworfen, falls ein gefundener Mikrosatellit das alleinige Konnektiv zweier Sequenzen darstellte. Auf diese Weise sollte eine Bildung von chimären Contigs verhindert und eine erfolgreiche PCR mittels spezifischer Primer sichergestellt werden. Weiterhin wurden die flankierenden Sequenzen der ausgewählten Loci miteinander verglichen, um Duplikate auszuschließen. Diese Methode wurde zum Beispiel auch von ABBOTT et al. (2010) in Didemnum vexillum angewendet. Die Autoren berichten, dass ein Alignieren der flankierenden Sequenzen von 775 gefundenen Mikrosatelliten dabei half, insgesamt 17 Duplikate im Datensatz zu identifizieren. Andere Autoren verzichten ganz auf eine Assemblierung der Rohsequenzen in Contigs und Singletons und greifen stattdessen auf einen ’all against all’ BLAST (AKKAK et al. 2009; MALAUSA et al. 2011; TAKAYAMA et al. 2011) oder lediglich auf ein Alignment der Mikrosatelliten-enthaltenden Fragmente zurück, um Sequenz-Ähnlichkeiten aufzudecken (CSENCSICS et al. 2010). In manchen Arbeiten erfolgt die Entwicklung von Mikrosatellitenmarkern ausschließlich auf Basis der Rohsequenzen ohne jegliche Berücksichtigung der Redundanz im 454-Datensatz (ABDELKRIM et al. 2009; ALLENTOFT et al. 2009; CASTOE et al. 2010; SAARINEN & AUSTIN 2010; PERRY & ROWE 2011). Nach NIU et al. (2010) enthalten 454-generierte Sequenzen elf bis 35% exakt identische sowie nahezu identische Duplikate, was die Wichtigkeit einer Assemblierung unterstreicht. Auch ein mengenmäßiger Vergleich der in der Literatur und der vorliegenden Arbeit zu Contigs assemblierten Rohdaten (Abbildung 4.3) belegt die Signifikanz dieses Ansatzes. Von den ursprünglichen 454-Rohsequenzen der zehn in Abbildung 4.3 dargestellten Spezies, bzw. Studien wurden durchschnittlich 67,1% aufgrund der vorhandenen Redundanz mittels unterschiedlichen 136 Diskussion Software-Programmen zu Contigs assembliert. Hierbei scheint es offensichtlich keinen Zusammenhang zwischen der Menge analysierter Rohdaten und der Anzahl der assemblierten Sequenzen zu geben. So wurden beispielsweise von den 626.586 Mytilus coruscus-Sequenzen nur 23,6% zu Contigs assembliert (KANG et al. 2013), während dies für 91,3% der 182.179 Tetrao tetrix- Sequenzen der Fall war (WANG et al. 2012). Die Assemblierung der Rohsequenzen der drei Bromelien-Datensätze aus der vorliegenden Arbeit in Contigs liegt dabei mit rund 88,1% im oberen Bereich des Spektrums. Abbildung 4.3: Gegenüberstellung der Assemblierung sieben verschiedener Spezies aus der Literatur und der Bromelien aus vorliegender Arbeit. Der jeweils erste Balken (dunkelgrau) entspricht den 454-Rohsequenzen und der zweite (hellgrüne) Balken denjenigen Sequenzen, die zu Contigs assembliert wurden. Der jeweils hellgraue, untere Teil des 3. Balkens entspricht den nicht-assemblierten Singletons und repräsentiert zusammen mit den Contigs (dunkelgrüner, oberer Teil des dritten Balkens) alle nicht-redundanten Sequenzen (Unigenes). Die Assemblierung erfolgte mittels vier verschiedener Software-Programme: NEWBLER (M. coruscus, KANG et al. 2013; P. dolichorhiza, MAGAIN et al. 2010; P. massoniana, BAI et al. 2013; T. tetrix, WANG et al. 2012; A. tuberculatus, LEE et al. 2009), CAP3 (K. senegalensis, KARAN et al. 2012), CLCBIO (C. amplexicaulis, BURRELL et al. 2011) und GENEIOUS (F. rusbyi, Dy. marnier-lapostollei und D. longipetala). Abschließend sei angemerkt, dass je mehr Sequenzen zu einem Contig zusammengefügt werden, desto größer wird die Chance zur Identifizierung von Sequenzierfehlern, was wiederum die Zuverlässigkeit der Sequenzabfolge erhöht (ZALAPA et al. 2012). Werden zudem die Datensätze unterschiedlicher Individuen einer Art oder auch unterschiedlicher Arten assembliert, ergibt sich die Gelegenheit, ’single nucleotide polymorphisms’ (SNPs) ausfindig zu machen und als genetische Marker zu verwenden (BARBAZUK et al. 2007; vgl. Kapitel 4.1.2.4). 137 Diskussion 4.1.2.2 Abundanz der Mikrosatelliten und Primerdesign für ausgewählte Loci Das Vorkommen der unterschiedlichen Klassen von Mikrosatelliten in den drei 454-Datensätzen der untersuchten Bromelienarten ist in Abbildung 4.4 zusammengestellt. Die vorherrschende Wiederholungseinheit waren die Dinukleotide mit insgesamt 52,7%, gefolgt von Tri- (20,9%), Mono- und Tetranukleotiden (zusammen 9,8%). Während in F. rusbyi und D. longipetala die Mikrosatelliten vom Hexanukleotid-Wiederholungstyp etwas häufiger waren als die vom Pentanukleotid-Typ, war die Situation in Dy. marnier-lapostollei umgekehrt (Abbildung 4.4). Dies entspricht auch der Verteilung der Mikrosatelliten in den 454-Datensätzen anderer Pflanzenarten (SCHOEBEL et al. 2013). Auch innerhalb der Vertreter der Pitcairnioideae war das Motiv (AG)n mit durchschnittlich 26,5% (25,8% bis 27,1%) bezogen auf alle gefundenen Motive am häufigsten vertreten, dicht gefolgt von (AT)n, wohingegen das (CG)n-Motiv, das auch in anderen Studien seltenste Dinukleotid (SONG et al. 2010), insgesamt lediglich elfmal (0,2%) detektiert wurde. Von den Trinukleotid-Wiederholungen war das (AAT)n-Motiv das Häufigste, gefolgt von (AAG)n und (CCG)n, was insgesamt den Befunden in den Genomen anderer Pflanzenarten entspricht (FERGUSON et al. 2004; WEISING et al. 2005; ZHENG et al. 2013). Lediglich die Dominanz des (AAT)n-Motivs scheint eine Besonderheit darzustellen, zumal speziell für monokotyle Pflanzen oftmals CG-reiche Mikrosatellitenmotive in überwiegender Zahl nachgewiesen wurden (SONAH et al. 2011). Abbildung 4.4: Abundanz der sechs Klassen von Mikrosatelliten innerhalb der drei 454-Datensätze sowie der jeweilige Anteil generierter Primerpaare für Di- bis Hexanukleotide (Mononukleotide wurden vom Primerdesign ausgeschlossen). Die jeweiligen Suchkriterien sind angegeben. Trotz der unterschiedlichen Sequenzmengen in den drei Datensätzen war mit einem Mikrosatelliten pro 5,6 kb (F. rusbyi und Dy. marnier-lapostollei) und 7,1 kb (D. longipetala) die 138 Diskussion Abundanz der Mikrosatelliten in den Genomen der drei Bromelienarten recht ähnlich und wie im Fall der EST-Mikrosatelliten im oberen Bereich des in der Literatur vorgegebenen Rahmens (vgl. TAKAYAMA et al. 2011). Aufgrund der uneinheitlichen Suchkriterien sollten diese Angaben allerdings eher als Richtwerte betrachtet werden. Unter Ausschluss der Mononukleotide war das Primerdesign für 85,8% der gefundenen Di- bis Hexanukleotide möglich (Abbildung 4.4), was gegenüber anderen Arbeiten einer hohen Erfolgsquote entspricht (∅ 65,1%, TAKAYAMA et al. 2011). 4.1.2.3 Funktionalität der nukleären 454-Mikrosatellitenmarker Von den 2.178 (F. rusbyi) und 1.165 (Dy. marnier-lapostollei) potenziellen Primerpaaren zur Amplifizierung gefundener Mikrosatellitenloci wurden 30 (1,4%), bzw. 50 Kandidaten (4,3%) ausgewählt. Innerhalb der jeweiligen Herkunftsart amplifizierten 23 (76,7%) der nukleären Fosterella- und 37 (74%) der Dyckia-Mikrosatellitenmarker ein distinktes PCR-Produkt auf Agarosegel, was mit dem Ergebnis von ZENK (2012) gleichzusetzen ist, die eine erfolgreiche Amplifizierung für 75% der für Deuterocohnia longipetala entwickelten Marker nachweisen konnte. Da die Primerpaare anhand der 454-Sequenzen der jeweiligen Herkunftsart sowie nach Qualitätskontrolle der Contigs abgeleitet wurden und auch Veränderungen der PCR-Bedingungen keinen positiven Effekt hatten, scheinen die ausgefallenen PCR-Produkte der restlichen Marker auf technische Fehler im Rahmen des Sequenziervorgangs hinzudeuten. So ergab eine Studie von GILLES et al. (2011) eine kalkulierte Fehlerrate von 1,07% für das GS-FLX Titanium-System, wobei die häufigsten Fehler und Diskrepanzen von den Autoren auf Insertionen und Deletionen zurückgeführt wurden. Übertragen auf die vorliegende Arbeit wären im Fall der Rohsequenzen von F. rusbyi 267.374 Basen und entsprechend für Dy. marnier-lapostollei 218.231 Basen fehlerhaft. Ist die einem Primer zugrunde liegende und damit spezifische Sequenz vom Auftreten eines Indels betroffen, könnte eine erfolglose Amplifizierung die Folge sein. Eine weitere Quelle potenzieller Sequenzierfehler bilden Homopolymere (GILLES et al. 2011), da allerdings in der vorliegenden Arbeit bei der Auswahl geeigneter Primerpaare darauf geachtet wurde, dass keine Mononukleotid-Wiederholungen in den Sequenzen vorhanden waren, ist dies als Ursache einer erfolglosen PCR auszuschließen. Jeweils 15 Marker (Tabellen 3.9 und 3.10) erwiesen sich sowohl in den Übertragbarkeitsstudien als auch bezogen auf ihre Variabilität in der Herkunftsart bzw. in heterologen Arten als funktional. In einem ersten Testset, bestehend aus zwei F. rusbyi-Individuen und je einem Individuum von F. floridensis, F. robertreadii und F. weberbaueri, wurde an jedem der 15 ngFos-Mikrosatellitenloci ein distinktes PCR-Produkt erzeugt. Die Analyse eines umfangreicheren Probensets aus drei bis sechs 139 Diskussion Akzessionen zehn heterologer Fosterella-Arten sowie je einer Akzession zehn verschiedener Arten der vier übrigen Gattungen der UF Pitcairnioideae sowie eines Ananas-Individuums (UF Bromelioideae) zeigte, dass die Mikrosatellitenmarker innerhalb der Gattung Fosterella recht gut übertragbar waren. So amplifizierten die meisten (82,2%) Primerpaare in F. petiolata, in dieser Art wurden zudem die meisten heterozygoten Bandenmuster detektiert (Tabelle 3.9). Ebenfalls sehr erfolgreich waren die Tests in F. floridensis (78,0%), F. robertreadii (73,3%) und F. albicans (71,3%), der prozentual geringste Wert wurde in den drei Arten der micrantha-Gruppe (35,2%) sowie F. weberbaueri (31,3%) nachgewiesen. In F. penduliflora wurden zudem Mehrfachbanden ermittelt, was (wie in Pseudananas sagenarius) auf einen polyploiden Status der Art hinweist (WAGNER 2012; J. PAULE, persönliche Mitteilung). Insgesamt lag die Übertragbarkeit innerhalb der Gattung Fosterella bei 51,9%. Für keinen der anonymen Mikrosatellitenmarker konnte mittels BLAST-Analyse eine Homologie zu einer in GenBank katalogisierten Sequenz aufgedeckt werden. Dennoch amplifizierte der Marker ngFos_6 ein distinktes PCR-Produkt in allen untersuchten Akzessionen, und für fünf weitere Marker lag die Erfolgsquote bei mehr als 75%, was auf eine hohe Konservierung der Primerbindestellen in Fosterella spricht. Lediglich drei der 15 Marker amplifizierten nur in einem, bzw. in vier Individuen. Oberhalb der Gattungsebene war die Übertragbarkeit der Marker deutlich herabgesetzt, nur an einem Locus (ngFos_22) wurden 81,9% der getesteten Arten amplifiziert, die Banden zeigten allerdings ein unspezifisches Muster. Für alle anderen Marker lag der Erfolg bei maximal 18,2%, wobei an zehn Loci in keinem der Individuen ein Amplifikat generiert wurde. Ein ähnliches Ergebnis lieferten die Dyckia-Mikrosatellitenmarker, deren Übertragbarkeit innerhalb von Dyckia-Arten sehr erfolgreich war. Auch innerhalb der nächstverwandten Gattung Encholirium gelang die Amplifizierung noch in moderatem Umfang, wodurch die geringe evolutive Distanz zwischen diesen beiden Gattungen zum Ausdruck kommt (KRAPP et al. 2014). Für die Vertreter der übrigen drei Gattungen der Unterfamilie Pitcairnioideae ergab sich nur eine sehr geringe Übertragbarkeit. Ein Vergleich mit anderen Studien aus der Literatur zeigt, dass Mikrosatellitenmarker innerhalb der Bromeliaceae durchaus auch oberhalb der Gattungsebene übertragbar und in den Zielarten variabel sein können. Unter anderem generierten zwei der nukleären Fosterella- Mikrosatellitenmarker (ngFos_6 und ngFos_22) zwei, bzw. sechs Allele in 20 Individuen von Vriesea minarum aus der UF Tillandsioideae (LAVOR et al. 2013). In der selben Studie wurden auch Mikrosatellitenmarker aus Tillandsia fasciculata und Guzmania monostachya (BONEH et al. 2003) sowie aus V. gigantea (PALMA-SILVA et al. 2007) angewendet und generierten zwischen zwei und 13 Allelen in V. minarum. Allerdings wurden die meisten Allele durch Mikrosatellitenmarker erzielt, die aus 140 Diskussion Vriesea selbst stammten. PALMA-SILVA et al. (2007), PAGGI et al. (2008) sowie GOETZE et al. (2013) berichteten sogar die Übertragbarkeit von Markern zwischen Unterfamilien, wobei sich die Angaben jedoch auf ein oder selten zwei untersuchte Individuen pro Art beziehen und die Auftrennung der PCR-Produkte zum Teil ausschließlich auf Agarosegelen erfolgte. Da in keiner der zitierten Arbeiten eine Homologie-Suche der Mikrosatellitenloci durchgeführt wurde, ist die hohe Übertragbarkeit möglicherweise darauf zurückzuführen, dass die Primerpaare im kodierenden Bereich der DNA binden und daher, wie im Fall der EST-Mikrosatelliten aus Ananas, über weitere taxonomische Grenzen konserviert sind. Insgesamt stimmen die Resultate, die mit den ngFos- und ngDy-Mikrosatellitenloci erzielt wurden, mit denen anderer Studien überein und belegen die deutlich geringere Übertragbarkeit anonymer Mikrosatellitenmarker im Vergleich zu EST-Mikrosatellitenmarkern (PEAKALL et al. 1998; CHAGNE et al. 2004; GUTIERREZ et al. 2005; PASHLEY et al. 2006). Die Variabilität der Loci und somit ihr Potenzial zur Anwendung in populationsgenetischen Studien wurde jeweils im Rahmen von Übertragbarkeitsstudien in Individuen mehrerer natürlicher Populationen validiert. Nukleäre 454-Mikrosatellitenmarker aus Fosterella rusbyi In einem kleinen Testset (29 Proben) der Herkunftsart (F. rusbyi) waren alle 15 Mikrosatellitenloci polymorph und erzeugten eins bis fünf Allele pro Locus innerhalb der 12 Individuen aus der Provinz Sud Yungas und zwei bis sieben Allele in den 17 Pflanzen aus der Provinz Larecaja (∅ 5,0 Allele). Die durchschnittlichen erwarteten und beobachteten Heterozygotien lagen insgesamt bei He = 0,61 und Ho = 0,14 (vgl. Tabelle 3.9). Ein Vergleich beider Werte zeigt, dass an nahezu allen Loci und in beiden Regionen ein deutliches Heterozygoten-Defizit vorherrscht, was zu signifikanten Abweichungen vom HARDY-WEINBERG Gleichgewicht und hohen Inzuchts- koeffizienten führte. Das Potenzial der Mikrosatellitenmarker, zwischen den bolivianischen Lokalitäten von F. rusbyi in einem kleinen Probenset zu differenzieren, wird durch das phylogenetische Netzwerk (Abbildung 3.8) deutlich, in welchem sowohl die Individuen entsprechend ihrer Populationszugehörigkeit als auch die Populationen entsprechend den beiden besammelten Provinzen (Sud Yungas und Larecaja) zusammen gruppieren. Nukleäre 454-Mikrosatellitenmarker aus Dyckia marnier-lapostollei var. estevesii Aufgrund ihrer zentralen Stellung sowohl innerhalb der Dyckia-Phylogenie als auch des Haplotypen-Netzwerks von KRAPP et al. (2014) und der dadurch erhofften guten Übertragbarkeit 141 Diskussion von Mikrosatellitenmarkern in heterologe Arten innerhalb der zentral-brasilianischen Klade wurde Dy. marnier-lapostollei var. estevesii für die 454-Pyrosequenzierung ausgewählt. Das entsprechende Individuum (BGHD 130151), aus dessen Blattmaterial die DNA isoliert wurde, repräsentiert eine kultivierte Nachzucht des Typusexemplars und verfügt über eine besonders gute Dokumentation (KRAPP 2012). Aufgrund nicht verfügbarer Populationsproben dieser speziellen Dyckia-Art wurde die Variabilität der 15 ngDy-Loci in 59 Vertretern natürlicher Populationen von Dy. dissitiflora, Dy. pernambucana (jeweils zwei Populationen) und Dy. limae (eine Population) validiert und bereits publiziert (WÖHRMANN et al. 2013). Mit durchschnittlich 6,6 Allelen über alle Loci wurden in Dy. dissitiflora die meisten Allele nachgewiesen, während die etwas niedrigeren Werte für Dy. limae (3,5) und Dy. pernambucana (3,1) vergleichsweise nah beieinander lagen. Signifikante Abweichungen vom HARDY-WEINBERG Gleichgewicht wurden nur an wenigen Stellen nachgewiesen und entsprechend ähnlich waren die Werte der erwarteten bzw. beobachteten Heterozygotie, womit kein deutliches Heterozygoten-Defizit vorlag. Über alle Populationen und Loci hinweg wurden durchschnittlich 9,3 Allele nachgewiesen, was den Ergebnissen anderer Studien innerhalb der Bromeliaceae entspricht, wobei dieser Wert eher im oberen Bereich des vorgegebenen Rahmens liegt (vgl. Kapitel 4.2.3). 4.1.2.4 Anteil der plastidären Sequenzen im 454-Gesamtdatensatz Ein zusätzlicher Vorteil bei Verwendung der 454-Technologie als Grundlage zur Identifizierung und Isolation von Mikrosatelliten liegt neben der großen Menge zufälliger nukleärer Sequenzen in der zusätzlichen Verfügbarkeit der DNA sämtlicher Zellorganellen (Plastom und Chondriom), sozusagen als Nebenprodukt. So wurde zum Beispiel nach der 454-Sequenzierung genomischer DNA von Amaranthus tuberculatus, die 158.015 Rohsequenzen (42,8 Mb) lieferte, neben 382 nukleären Mikrosatelliten, vielen transposablen Elementen sowie mitochondrialen DNA- Abschnitten und zahlreichen nukleären Genen noch nahezu das komplette Plastom (150.382 von 150.725 bp) dieser Pflanzenart extrahiert (LEE et al. 2009). Entsprechend gelang es TAKAYAMA et al. (2011) aus den durchschnittlich 15.964 Rohsequenzen sechs verschiedener Angiospermen neben zahlreichen nukleären Mikrosatelliten (∅ 674) auch plastidäre Mikrosatelliten (∅ 30 Mononukleotide) zu isolieren. In der vorliegenden Arbeit wurde ausschließlich grünes Blattgewebe zur DNA-Isolation verwendet. Weiterhin wurde vor der Sequenzierung keine Anreicherung für bestimmte Mikrosatellitenmotive vorgenommen (vgl. MOORE et al. 2006; SANTANA et al. 2009; GUISINGER et al. 142 Diskussion 2010), sodass sämtliche Motive, speziell auch die für Chloroplasten typischen Mononukleotid- Wiederholungen, im Datensatz erhalten blieben. Andernfalls wären diese Motive während der Waschschritte im Rahmen eines Anreicherungsprozesses entfernt worden (TAKAYAMA et al. 2011). Nach separater Assemblierung gegen das Plastom von Typha latifolia (GUISINGER et al. 2010) wurden für die drei Bromelien-Datensätze jeweils plastidäre Anteile von 78,5% (F. rusbyi), 77,7% (D. longipetala) und 86,5% (Dy. marnier-lapostollei var. estevesii, KRAPP 2012) identifiziert, was bezogen auf die Anzahl und Gesamtmenge der jeweiligen 454-Rohsequenzen dem erwarteten Anteil plastidärer DNA entspricht (LEE et al. 2009). Durch die Kombination der Sequenzen aus allen drei Bromelienarten und erneuter Assemblierung war es möglich, insgesamt 95,2% des Typha- Plastoms abzudecken und eine Consensus-Sequenz zu generieren. Eine Rekonstruktion des Bromelien-Plastoms war nicht das primäre Ziel des Chloroplasten-Ansatzes, sondern diente ausschließlich der Abschätzung des plastidären Anteils innerhalb der 454-Sequenzen und der Erzeugung von plastidären Mikrosatellitenmarkern, weshalb der vorgestellte Datensatz nicht weiter bearbeitet und editiert wurde. Ohne Zweifel bietet dieses Datenmaterial ein breites Spektrum an Anwendungsmöglichkeiten, so zum Beispiel die Ableitung konservierter Primerpaare zur Amplifizierung phylogenetisch informativer Loci innerhalb der Pitcairnioideae, oder die Suche nach Punktmutationen zur Etablierung polymorpher SNP-Marker (GUICHOUX et al. 2011). In diesem Zusammenhang deutet eine erste grobe Suche auf die Existenz zahlreicher SNPs innerhalb der gegen das Typha-Plastom assemblierten Bromelien-Sequenzen hin, ein Ausschnitt dieser Suche ist in Abbildung 4.5 dargestellt. Nach einer gründlichen Sichtung und Bewertung der jeweiligen Positionen wären vor allem solche Punktmutationen wie diejenige an Position 30.166 (Abbildung 4.5) geeignet, um als genetische Marker innerhalb der Unterfamilie eingesetzt zu werden. Abbildung 4.5: Ausschnitt der GENEIOUS-Oberfläche einer exemplarischen Suche nach SNPs (’single nucleotide polymorphism’) innerhalb der Plastom-ähnlichen 454-Sequenzen von D. longipetala, Dy. marnier-lapostollei var. estevesii und F. rusbyi. Gelb hinterlegt ist ein kleiner Ausschnitt des T. latifolia-Plastoms (GUISINGER et al. 2010) inklusive mehrerer orange hervorgehobener Punktmutationen (SNPs). Darunter ist das Ergebnis der Assemblierung von fünf Bromelien-Sequenzen ersichtlich (farblich hinterlegte Nukleotide deuten auf Unterschiede gegenüber der Typha-Sequenz hin), während die resultierende Consensus-Sequenz im obersten Teil der Abbildung erkennbar ist. 143 Diskussion 4.1.2.5 Funktionalität der entwickelten plastidären 454-Mikrosatellitenmarker aus F. rusbyi Innerhalb der assemblierten, plastidären 454-Sequenzen von F. rusbyi wurden 38 Mikrosatelliten vom Mononukleotid-Typ mit einer Mindestlänge von zehn Wiederholungen detektiert, sodass sich bei Hochrechnung für das komplette Plastom eine Gesamtzahl von etwa 48 Mikrosatelliten ergibt. Diese Zahl deckt sich mit den in der Literatur angegebenen Werten von 40 plastidären Mikrosatelliten in Drimys confertifolia und 61 in Myrceugenia fernandeziana (TAKAYAMA et al. 2011). Für 14 Arten aus fünf monokotylen Pflanzenfamilien wurden zudem zwischen sechs und 51 plastidäre Mikrosatelliten nachgewiesen (EBERT & PEAKALL 2009). In Fosterella war das Primerdesign für 24 plastidäre Loci erfolgreich. Auch der Datensatz von Dy. marnier-lapostollei var. estevesii lieferte vergleichbare Werte, so wurden innerhalb der assemblierten Sequenzen (86,5% des Typha-Plastoms) insgesamt 36 Mononukleotid-Abfolgen mit mehr als zehn Wiederholungen nachgewiesen, wobei ein Primerdesign in 25 Fällen erfolgreich war (KRAPP et al. 2012). Aufgrund der nahezu einheitlichen (optimalen) Anlagerungs-Temperaturen der cpFos- Primerpaare war es möglich, dasselbe PCR-Programm mit fixierter Anlagerungs-Temperatur für die ausgewählten Kandidaten zu verwenden, was sich positiv auf den zeitlichen Aufwand auswirkte. Die generierten PCR-Fragmente waren durchweg von hoher Qualität, infolgedessen erwies sich die Auswertung der Banden als sehr komfortabel. Sowohl innerhalb der Unterfamilie Pitcairnioideae als auch in fünf weiteren Unterfamilien der Bromeliaceen erwiesen sich die plastidären Mikrosatellitenmarker in neun von zehn Fällen zu 100% als übertragbar. Diese deutlich besseren Werte als für die nukleären Mikrosatelliten sind sicherlich der höheren Konservierung des Plastidengenoms im Vergleich zum Kerngenom geschuldet. Das Bandenmuster war zudem sowohl zwischen den Vertretern verschiedener Gattungen und Unterfamilien als auch an mehreren Loci auf innerartlichem Niveau variabel, so zum Beispiel in Ananas comosus und Catopsis morreniana. Auch die von KRAPP et al. (2012) etablierten plastidären Mikrosatellitenmarker erwiesen sich sowohl innerhalb der Gattung Dyckia als auch in anderen Gattungen und Unterfamilien als übertragbar und variabel (vgl. auch KRAPP et al. 2013). Diese Marker wurden entwickelt, um die Auflösung und Unterstützung der Dyckia-Phylogenien aus vergleichsweise invariablen plastidären Sequenzen mithilfe der sehr viel variableren Mikrosatellitendaten zu verbessern (KRAPP 2012). Allerdings stellte sich heraus, dass die Mutationsrate längerer plastidärer Mikrosatelliten und das damit einhergehende Auftreten von Homoplasie für zuverlässige Verwandtschaftsanalysen, also der korrekten Einschätzung der Phylogenien, zu hoch ist. Aus diesem Grund verzichtete KRAPP (2012) auf den weiteren Einsatz dieser Marker und regte dazu an, derart variable Werkzeuge auf 144 Diskussion sehr niedrigem taxonomischen Niveau einzusetzen. Analog finden sich in der Literatur zahlreiche Beispiele für eine erfolgreiche Anwendung von plastidären Mikrosatelliten auf Ebene von Populationen innerhalb einer Art oder zwischen Vertretern nah verwandter Arten in den unterschiedlichsten Pflanzenfamilien (COLLEVATTI et al. 2003; VETTORI et al. 2004; QUINTELA-SABARÍS et al. 2010; PALMA-SILVA et al. 2011; GUICKING et al. 2013; RODRÍGUEZ et al. 2013b). Im vergangenen Jahr konnte erstmals innerhalb einiger Vertreter der Gattung Fosterella und auf Basis der hier entwickelten plastidären Mikrosatellitenmarker die bislang nur vermutete maternale Vererbung der Plastiden über den Samen nachgewiesen werden (BURMEISTER 2013). In strukturierten Populationen ermöglicht die Kombination nukleärer und plastidärer Mikrosatelliten wertvolle Einblicke in die relative Bedeutung des Genflusses sowohl über Samen als auch über den Pollen (MCCAULEY 1995). Weiterhin liegt in der haploiden Natur des Chloroplastengenoms der Grund dafür, dass die effektive Populationsgröße halb so groß ist wie die des Kerngenoms. Dies wiederum führt dazu, dass Faktoren wie genetische Drift stärker auf das plastidäre als auf das nukleäre Genom einwirken und dass plastidäre Haplotypen die vorhandene Populationsstruktur vermutlich besser wiedergeben als nukleäre Gene (MCCAULEY 1995). Um herauszufinden, welchen Einfluss die Fragmentierung der besiedelten Habitate auf die Populationsstruktur und den Genfluss zwischen Populationen von F. rusbyi ausübt, wurden beide Markertypen in dieser Bromelienart angewendet. 4.1.2.6 Mikrosatelliten aus 454-Daten: ein Résumé Die 454-Pyrosequenzierung erwies sich als höchst ergiebige und effiziente Quelle zur Isolation zahlreicher Mikrosatelliten in drei monokotylen Pflanzenarten, für die bislang nur wenige Sequenz-Informationen existierten (für D. longipetala siehe ZENK 2012). Schätzungen auf Basis eines Vergleichs der Ergebnisse 13 verschiedener Arten ergaben, dass in Pflanzen insgesamt 24.709 Rohsequenzen benötigt werden, um 40 einzigartige und funktionale nukleäre Mikrosatellitenmarker zu etablieren (GARDNER et al. 2011). Aus den 59.624 Rohsequenzen von Dy. marnier-lapostollei var. estevesii und den 73.027 Rohsequenzen von F. rusbyi war im Anschluss an die Assemblierung das Ableiten spezifischer Primerpaare für 1.165 bzw. 2.178 Di- bis Hexanukleotid- Wiederholungen möglich. Im Hinblick auf das Verhältnis zwischen den in dieser Arbeit getesteten und letztendlich etablierten Markern (2:1 in Fosterella und 3,3:1 in Dyckia) stehen theoretisch noch mindestens 334 Loci aus Dy. marnier-lapostollei und 1.074 Loci aus F. rusbyi als potenzielle Kandidaten zur Verfügung. Nach der BLAST-Analyse aller zugrunde liegenden Sequenzen wäre sicherlich auch die Detektion genassoziierter Wiederholungen zur Erstellung 145 Diskussion genetischer Karten möglich. In diesem Zusammenhang könnten die 454-Sequenzen genutzt werden, um zusätzliche nukleäre Marker für phylogenetische Studien innerhalb der Bromelien zu finden und zu etablieren. Ein solcher Ansatz entfällt allerdings, wenn der eigentlichen Sequenzierung eine Mikrosatelliten-Anreicherung vorgeschaltet ist, wodurch alle übrigen nukleären und plastidären Sequenzen vorzeitig aus dem Datensatz entfernt werden würden. Die Ergebnisse zeigen, dass die partielle Sequenzierung (z.B. 1/16 einer Picotiterplatte) ausreicht, um sowohl große Mengen an nukleären Mikrosatelliten zu identifizieren, als auch um nahezu das gesamte Plastom zu isolieren und auf dessen Basis ebenfalls spezifische Mikrosatellitenmarker zu entwickeln. Neben der populationsgenetischen Anwendung, die in den folgenden Kapiteln diskutiert wird, wurden insbesondere die nukleären und plastidären Marker aus F. rusbyi bereits in unabhängigen Studien erfolgreich genutzt. Angewendet in der F1-Generation von Kreuzungsexperimenten mit Vertretern der Gattung Fosterella dienten sie der eindeutigen Identifizierung der Eltern und lieferten einen Einblick in die reproduktive Kompatibilität der beteiligten Arten (ÖDER 2012). Zudem gelang es BURMEISTER (2013) mittels einiger plastidärer Mikrosatellitenmarker aus F. rusbyi die maternale Vererbung von Plastiden auf Basis der Kreuzungen von ÖDER (2012) nachzuweisen. Einige der ’ngDy’-Mikrosatellitenmarker bilden in Kombination mit weiteren, jüngst publizierten nukleären Mikrosatellitenmarkern aus Dy. distachya (ZANELLA et al. 2012a) und E. horridum (HMELJEVSKI et al. 2013) die genetische Grundlage für populationsgenetische Untersuchungen in E. spectabile (OLIVEIRA, Dissertation). What comes next-next? Zu Beginn der Arbeiten an der vorliegenden Dissertation stellte die 454-Pyrosequenzierung noch die am häufigsten verwendete NGS-Technologie zur Identifizierung von Mikrosatelliten dar (vgl. hierzu die Übersicht in ZALAPA et al. 2012). Seit dieser Zeit hat jedoch die Zahl der publizierten Arbeiten, die eine erfolgreiche Anwendung der wesentlich ökonomischeren Illumina-Technologie beschreiben, stetig zugenommen (NYBOM et al. 2014). Der Grund dafür liegt in der zunehmenden technischen Verbesserung der Illumina-Systeme und einer damit einhergehenden Verlängerung der Leseweiten von ursprünglich maximal 75-100 Nukleotiden auf über 150 Nukleotide. Die korrekte Assemblierung solcher ’short reads’ mit weniger als 100 Nukleotiden zu längeren Sequenzabschnitten ist bioinformatisch aufwendig und setzt eine computerbasierte Expertise voraus, besonders wenn es sich um ’non-model species’ handelt, für die keine Vergleichssequenzen verfügbar sind. Hingegen ist das Auffinden von Mikrosatelliten und das 146 Diskussion Primerdesign innerhalb deutlich längerer (flankierender) Sequenzen, wie sie mit der 454- Technologie (∅ 400 bp mit dem GS-FLX Titanium-System) erzielt werden, auch ohne jegliche Aufbereitung bzw. mit einer weniger problematischen Assemblierung möglich. Die Illumina- Technologie vervielfältigt die zu sequenzierenden DNA-Moleküle nicht innerhalb einer Wasser- in-Öl-Emulsion an speziellen Kügelchen (’Emulsions-PCR’), sondern auf einem festen Träger über die sogenannte ’Brücken-PCR’. Die Illumina-Methode ist so effizient, dass mit den ersten Systemen bereits bis zu 120 Millionen Sequenzierungen in einem einzigen Gerätedurchlauf möglich waren, was einer Datenmenge von bis zu 20 Gb entspricht. Mit den verbesserten Systemen steigt analog zur oben angesprochenen Zunahme der Leseweite auch die produzierte Datenmenge auf bis zu 600 Gb (gegenüber 700 Mb via 454), was letztlich zu einer erheblichen Kostenreduktion führt. Infolgedessen ist davon auszugehen, dass die 454-Pyrosequenzierung zukünftig immer seltener zur Identifizierung von Mikrosatelliten genutzt wird. Für die ersten NGS-Verfahren wie 454, Illumina, SOLiD (’sequencing by oligo ligation and detection’, LIFE TECHNOLOGIES) und Polonator (SHENDURE et al. 2005) stellt die klonale Amplifikation der DNA via PCR eine Grundvoraussetzung dar, um eine adäquate Menge an Sequenzmatrizen zu generieren. Hingegen verzichten die neuesten Technologien (’next-next-generation sequencing’) auf diesen fehleranfälligen Schritt und sequenzieren stattdessen direkt das Einzelmolekül (eine Übersicht liefern u.a. ZHOU et al. 2010). Neben einer weiteren Zeit- und Kostenreduktion und einer deutlich längeren Leseweite zielen diese Verfahren darauf ab, den Umfang der bislang komplexen Signaldetektion auf ein Minimum zu beschränken. Dies wird dadurch erreicht, dass die tatsächlich stattfindende Reaktion an einem einzelnen Molekül beispielsweise über freigesetzte Fluorophore in Echtzeit gemessen wird. Die von PACIFIC BIOSCIENCES entwickelte ’single-molecule real time’ (SMRT)-Sequenzierung läuft parallel in jeweils einer von 150.000 winzigen Halbleiterkammern (’zero-mode wave guide’) auf einer sogenannten SMRT-Zelle ab. Dabei werden beachtlich lange Sequenzen von bis zu 1.500 bp gelesen. Derart lange Sequenzen erleichtern die bioinformatische Editierung in Bezug auf die o.g. Assemblierung erheblich und wurden vor kurzem erstmals erfolgreich zur Isolation von Mikrosatelliten eingesetzt (WAINWRIGHT et al. 2013; GROHME et al. 2013). 4.1.3 Bromelien und Mikrosatelliten Lässt man die Publikationen der letzten vier Jahre Revue passieren, so offenbart sich ein kontinuierlich steigender Trend bezüglich der Entwicklung hoch-variabler Mikrosatelliten- marker in den Bromeliaceen. Während noch zu Beginn der Untersuchungen zur vorliegenden 147 Diskussion Arbeit insgesamt nur 55 Primerpaare aus sieben Arten und drei Unterfamilien (Bromelioideae, Pitcairnioideae und Tillandsioideae) zur Verfügung standen, sind es zum derzeitigen Kenntnisstand (Januar 2014) in Summe 210 bereits getestete Primerpaare aus 14 Arten elf verschiedener Gattungen (vgl. Tabelle 4.3). Rechnet man die noch nicht getesteten Kandidaten aus dem NGS-Ansatz mit hinzu, steigt dieser Wert um weitere 4.826 potenzielle Marker. Tabelle 4.3: Zusammenstellung der zum derzeitigen Kenntnisstand (Januar 2014) veröffentlichten nukleären und plastidären Mikrosatellitenmarker für die Bromeliaceae. Angegeben sind neben der jeweiligen Publikation und Herkunftsart noch die Anzahl der publizierten Primerpaare; nicht getestete, aber bereits in silico abgeleitete Primerpaare stehen in Klammern. Weiterhin angegeben ist der entsprechende Markertyp (nukleäre, EST-, plastidäre Mikrosatelliten) sowie das jeweilige Verfahren zur Identifizierung der Mikrosatelliten. Grau hinterlegt sind die in unserer Arbeitsgruppe bzw. in der vorliegenden Arbeit entwickelten Primerpaare. Zitation Herkunftsarten Unterfamilie Entwickelte Primerpaare Markertyp Verfahren BONEH et al. 2003 Tillandsia fasciculataGuzmania monostachya Tillandsioideae 5 nSSRs Klassisch, Anreicherung SARTHOU et al. 2003 Pitcairnia geyskesii Pitcairnioideae 7 nSSRs Klassisch, Anreicherung KINSUAT & KUMAR 2007 Ananas comosus Bromelioideae 20 nSSRs Klassisch, Anreicherung PALMA-SILVA et al. 2007 Vriesea giganteaAlcantarea imperialis Tillandsioideae 15 nSSRs Klassisch, Anreicherung PAGGI et al. 2008 Pitcairnia albiflos Pitcairnioideae 8 nSSRs Klassisch, Anreicherung WÖHRMANN & WEISING 2011 Ananas comosus Bromelioideae 18 (+519) EST-SSRs GenBank-Suche (EST, MOYLE et al. 2005) CARLIER et al. 2012 Ananas bracteatusAnanas comosus Bromelioideae 16 12 nSSRs EST-SSRs GenBank-Suche (Nukleotide) GenBank-Suche (EST, MOYLE et al. 2005) KRAPP et al. 2012 Dyckia marnier-lapostollei Pitcairnioideae 12 (+22) cpSSRs 454-Pyrosequenzierung SHODA et al. 2012 Ananas comosus Bromelioideae 18 nSSRs Klassisch, Anreicherung WÖHRMANN et al. 2012 Fosterella rusbyi Pitcairnioideae 15 (+2.163) nSSRs 454-Pyrosequenzierung ZANELLA et al. 2012a Dyckia distachya Pitcairnioideae 9 nSSRs Klassisch, Anreicherung ZENK 2012 Deuterocohnia longipetala Pitcairnioideae 10 (+388) nSSRs 454-Pyrosequenzierung WÖHRMANN et al. 2013 Dyckia marnier-lapostollei Pitcairnioideae 15 (+1.150) nSSRs 454-Pyrosequenzierung Vorliegende Arbeit Fosterella rusbyi Pitcairnioideae 10 (+14) cpSSR 454-Pyrosequenzierung FENG et al. 2013 Ananas comosus Bromelioideae 18 (+570) nSSRs GenBank-Suche (EST, MOYLE et al. 2005) GOETZE et al. 2013 Aechmea caudata Bromelioideae 10 nSSRs Klassisch, Anreicherung HMELJEVSKI et al. 2013 Encholirium horridum Pitcairnioideae 10 nSSRs Klassisch, Anreicherung RODRÍGUEZ et al. 2013a Ananas comosus Bromelioideae 10 nSSRs Klassisch, Anreicherung Total: 14 Arten 3 Unterfamilien 210 (+4.826) 3 verschiedene Verfahren Der Anteil der Primerpaare, die in unserer Arbeitsgruppe entwickelt wurden, ist in Tabelle 4.3 grau hinterlegt und verdeutlicht, dass exklusive dieser Arbeiten bislang hauptsächlich die traditionellen Klonierungs- und Anreicherungsverfahren zur Identifizierung und Isolation von Mikrosatelliten genutzt wurden. Zudem lag der Schwerpunkt in anderen Arbeiten ausschließlich auf der Etablierung von nukleären Markern, sodass die für Dyckia und Fosterella entwickelten plastidären Mikrosatellitenmarker bislang die einzigen Kandidaten aus Bromelien und für Bromelien darstellen. Bedenkt man das Artenreichtum und die Bedeutsamkeit dieser neotropischen Pflanzenfamilie, so erscheint der Einsatz von Mikrosatellitenmarkern innerhalb der Bromeliaceen noch relativ begrenzt. Von den derzeit anerkannten 3.352 Arten aus 58 Gattungen (LUTHER 2012) wurden laut einer Übersicht von ZANELLA et al. (2012b) bis Juni 2011 lediglich neun Arten (Alcantarea geniculata, Al. glaziouana, Al. imperialis, Al. regina, Bromelia antiacantha, Pitcairnia albiflos, P. geyskesii, P. staminea, 148 Diskussion Vriesea gigantea) mit molekularen Markern im Hinblick auf ihre genetische Diversität und Struktur hin analysiert. Die Autoren dieser Übersichtsarbeit betonen auch, dass viele Bromelienarten durch Habitatzerstörung stark gefährdet sind, insbesondere die zahlreichen endemischen Bromelienarten in den atlantischen Regenwäldern (Mata Atlântica). Kenntnisse über klonale und/oder sexuelle Reproduktion, Demographie, genetische Diversität und Strukturierung sowie über den Genfluss innerhalb und zwischen Populationen sind von primärer Bedeutung, um erfolgreiche Strategien in Bezug auf den Naturschutz und die Arterhaltung zu entwickeln. Mikrosatelliten liefern als Marker der Wahl in diesem Zusammenhang wertvolle genetische Informationen. Je mehr dieser Marker der wissenschaftlichen Öffentlichkeit zur Verfügung stehen, desto mehr Arten können unter den verschiedensten Aspekten untersucht werden. 4.2 Populationsgenetische Untersuchungen in Dyckia- und Fosterella-Arten 4.2.1 Potenzial der Mikrosatellitenmarker zur Abgrenzung von Arten Die Frage nach der gegenseitigen Abgrenzbarkeit von Arten ist von grundlegender Bedeutung, da die Art an sich als einzige taxonomische Stufe eine biologische Relevanz hat und die Grundeinheit der biologischen Systematik darstellt. Traditionelle Verfahren zur Differenzierung von Arten basieren weitgehend auf morphologischen Merkmalen und werden in jüngster Zeit durch die Einbeziehung von molekulargenetischen Daten zunehmend positiv ergänzt (HAUSDORF & HENNING 2010). In den beiden Pitcairnioideen-Gattungen Dyckia und Fosterella ist zum Teil eine ausgeprägte morphologische Plastizität innerhalb der Arten zu beobachten, was eine Artabgrenzung oft schwierig macht. In der vorliegenden Arbeit wurden Mikrosatellitenmarker angewendet, um ihr Potenzial zur Artabgrenzung in ausgewählten Artengruppen innerhalb der beiden Gattungen zu überprüfen. In beiden Ansätzen standen AFLP-Daten als Referenz zur Verfügung. 4.2.1.1 Artabgrenzung in der Artengruppe Dyckia dissitiflora-Dy. pernambucana-Dy. limae Nukleäre wie auch plastidäre Phylogenien der Gattung Dyckia haben gezeigt, dass sich die Plastizität morphologischer Merkmale auch in der genetischen Situation widerspiegelt und viele Akzessionen nicht gemäß ihrer Artzugehörigkeit gruppieren (KRAPP 2012; KRAPP et al. 2014). Man nimmt an, dass gelegentlicher Genfluss zwischen einzelnen Arten infolge von Hybridisierungs- Ereignissen, gefolgt von Introgression durch Rückkreuzungen im Wesentlichen für diese Situation verantwortlich ist. KRAPP (2012) postuliert, dass der sporadische Austausch genetischen 149 Diskussion Materials via Pollen u.a. durch die räumliche Nähe vieler Dyckia-Arten zueinander und einer eher unspezifischen Bestäubung begünstigt wird. Unter Gewächshaus-Bedingungen scheinen viele Dyckia-Arten zur Erzeugung fertiler Hybride in der Lage zu sein. Insofern ist anzunehmen, dass die genetische Durchmischung auch an natürlichen Standorten durch sekundäre Kontakte gefördert wird und dass eine wenig ausgeprägte reproduktive Isolation zwischen den Arten vorliegt (KRAPP et al. 2014). Die erstaunliche Fähigkeit, trotz eines mehr oder weniger regen Austauschs genetischen Materials die spezifische, phänotypische Identität einer Art beizubehalten, scheint sowohl innerhalb der Gattung Dyckia als auch Pitcairnia verbreitet zu sein (PALMA-SILVA et al. 2011) und wird mit dem Konzept des porösen Genoms erklärt (’porous genome concept; WU 2001). Demzufolge können große Teile des Genoms weitgehend frei zwischen Arten ausgetauscht werden, ohne dass dabei die morphologische Identität einer Art nachhaltig beeinflusst wird. Reicht die Auflösung von Phylogenien in derart komplexen Situationen zur Erfassung der Artgrenzen nicht aus, so sind alternative und zudem empfindlichere Markersysteme wie Mikrosatelliten hilfreich (SOLIVA & WIDMER 2003; FRIAR et al. 2007; CADDAH et al. 2013). In Bromelien wurden Mikrosatelliten bereits in einigen Artengruppen erfolgreich zur Artabgrenzung eingesetzt, zum Beispiel zwischen den nah verwandten Arten Alcantarea imperialis und Al. geniculata (BARBARÁ et al. 2007b) oder innerhalb der Gattung Pitcairnia (PALMA-SILVA et al. 2011). Für die Gattung Dyckia wurden nukleäre Mikrosatellitenmarker zum derzeitigen Kenntnisstand (Januar 2014) ausschließlich zur Abschätzung der genetischen Diversität zweier Populationen (N = 43) von Dy. distachya im Rahmen einer kurzen Primer-Veröffentlichung eingesetzt (ZANELLA et al. 2012a). Die bisher einzige umfangreichere populationsgenetische Studie in Dyckia bezog sich auf Subpopulationen der seltenen und bedrohten Art Dy. ibiramensis und beruht auf Allozymmarkern (HMELJEVSKI et al. 2011). In der vorliegenden Arbeit wurden Mikrosatellitenprofile dafür eingesetzt, um natürliche Populationen der drei Arten Dy. dissitiflora, Dy. limae und Dy. pernambucana zu differenzieren; als Vergleichsart wurde die weiter entfernte Dy. macedoi herangezogen. Bereits im Vorfeld wurden im Rahmen einer Dissertation unseres Kooperationspartners D. PINANGÉ an der Universität Pernambuco (PINANGÉ 2013) AFLP-Daten eines leicht abgewandelten Probensets erhoben. PINANGÉ (2013) konzentrierte sich bei seinen populationsgenetischen Analysen mit AFLPs ausschließlich auf die drei Arten Dy. dissitiflora, Dy. limae und Dy. pernambucana, weshalb ein Vergleich der Ergebnisse für Dy. macedoi nicht möglich ist. Sowohl die AFLP- wie auch die Mikrosatellitendaten konnten eindeutig zwischen Dy. limae / Dy. pernambucana auf der einen Seite und Dy. dissitiflora auf der anderen Seite unterscheiden, was die prinzipielle Eignung von 150 Diskussion Mikrosatellitenmarkern für die Abgrenzung nahe verwandter Arten unterstreicht. Mit keinem der beiden Markersysteme war es hingegen möglich, Dy. limae und Dy. pernambucana eindeutig voneinander zu trennen. Trotz einer relativ hohen genetischen Distanz zwischen den einzelnen Populationen von Fst = 0,29 (Mikrosatellitendaten der vorliegenden Arbeit) und einer durchschnittlichen Entfernung von 97 km zwischen den besammelten Lokalitäten gruppierten die Individuen innerhalb der angewendeten Cluster-Analysen stets zusammen. Die übereinstimmenden Ergebnisse der AFLP- und Mikrosatellitendaten illustrieren, dass sich die morphologische Plastizität der beiden seltenen und endemischen Arten Dy. limae und Dy. pernambucana auch in der genetischen Situation widerspiegelt. Betrachtet man den Komplex ’Dy. limae / pernambucana’ insgesamt, so ergibt sich sowohl für die PCo-, als auch die NeighbourNet- Analyse eine Gruppierung der Individuen entsprechend ihrer Populationszugehörigkeit (was auf das Vorhandensein einer genetischen Strukturierung hinweist), nicht jedoch bezüglich ihrer Artzugehörigkeit. Die Dy. dissitiflora-Individuen hingegen sind vergleichsweise stark durchmischt und die Populationen weisen kaum genetische Distanz zueinander auf (Fst = 0,07), sodass hier von einem ausgeprägten Genfluss zwischen Populationen auszugehen ist. Insgesamt ist Dy. dissitiflora allerdings sowohl vom Artenkomplex (’Dy. limae / pernambucana’) als auch von der geographisch weit entfernten Art Dy. macedoi klar getrennt. Eine wesentliche Rolle für die Artabgrenzung scheinen die geographischen Distanzen zwischen den untersuchten Arten, bzw. Populationen zu spielen, entsprechend wies PINANGÉ (2013) auf der Basis von AFLP-Daten eine signifikante Korrelation zwischen genetischer und geographischer Distanz zwischen dem ’Dy. limae / pernambucana’-Komplex und Dy. dissitiflora nach. Die hier vorgenommene Studie illustriert, dass variable Mikrosatellitenmarker bereits in einem vergleichsweise kleinen Probenset (N = 89) dazu geeignet sind, mögliche Artgrenzen (oder deren Abwesenheit) innerhalb der jungen Gattung Dyckia aufzuzeigen und dadurch Informationen zu liefern, die mit Hilfe von plastidären und nukleären Sequenzdaten nicht erhalten worden waren (KRAPP et al. 2014). So sind die hier erhobenen Daten in Verbindung mit den Erkenntnissen aus der AFLP-Analyse von PINANGÉ (2013) als klares Indiz dafür zu werten, dass es sich bei dem Komplex ’Dy. limae / pernambucana’ nicht um zwei getrennte Arten handelt. In künftigen Studien können die nun verfügbaren nukleären Mikrosatellitenmarker auch dazu verwendet werden, die möglichen Abgrenzungen zwischen den zahlreichen endemischen Arten in den Diversitätszentren der Gattung im Bundesstaat Minas Gerais auszuloten. 151 Diskussion 4.2.1.2 Artabgrenzung in der Artengruppe Fosterella christophii-F. micrantha-F. villosula Die Zusammenfassung der drei in Abbildung 4.6 vorgestellten Arten Fosterella christophii, F. micrantha und F. villosula zur so genannten micrantha-Gruppe basierte ursprünglich auf der vergleichenden Sequenzierung von sechs plastidären Loci und den daraus resultierenden phylogenetischen Bäumen (REX et al. 2009; WAGNER et al. 2013). Neben der micrantha-Gruppe konnten auf diese Weise fünf weitere, gut gestützte Gruppen innerhalb der Gattung definiert werden (albicans-, rusbyi-, penduliflora-, weddelliana- und weberbaueri-Gruppe). Die Auflösung innerhalb dieser Gruppen erwies sich hingegen in der Plastidenphylogenie als relativ gering. Mit dem Ziel, eine bessere Abgrenzung der einzelnen Arten innerhalb der penduliflora-Gruppe (F. penduliflora und F. gracilis) und der micrantha-Gruppe zu erreichen, führte WAGNER (2012) eine populationsgenetische Studie basierend auf AFLP-Markern durch. Während die dabei erhaltenen Ergebnisse eine klare Trennung der beiden Arten der penduliflora-Gruppe zeigten, war es auf Basis von sechs AFLP-Primerkombinationen nicht möglich, die drei morphologisch sehr ähnlichen Arten der micrantha-Gruppe eindeutig voneinander zu differenzieren. Um ergänzende Informationen zur Artabgrenzung innerhalb dieser Gruppe zu erhalten, wurde nun im Rahmen der vorliegenden Dissertation nahezu das gleiche Probenset mit den neu entwickelten nukleären Mikrosatellitenmarkern genotypisiert. Abbildung 4.6: Morphologischer Vergleich der Arten der micrantha-Gruppe, zum Teil im natürlichen Habitat. Typisch dreizählige Blüten sowie grundständige Blattrosetten von F. christophii (A-B), F. micrantha (C-D) und F. villosula (E-F). Bilder mit freundlicher Genehmigung von N. WAGNER. Keine der in der vorliegenden Arbeit auf Basis der Mikrosatellitenallele vorgenommenen Cluster- 152 Diskussion Analysen lässt eine zweifelsfreie Trennung zwischen den drei Arten der micrantha-Gruppe erkennen. Anstelle der zu erwartenden Aufteilung auf drei Arten deuten die Ergebnisse auf eine geographisch determinierte Aufteilung der untersuchten Individuen hin, wobei der Siedlungsbereich der größeren der beiden Gruppen neben einem Areal in Bolivien auch das gesamte Verbreitungsgebiet von F. micrantha in Zentralamerika umfasst (Abbildungen 3.10 ff.). Innerhalb von Bolivien liegt dieser Verteilung möglicherweise eine genetische Barriere im Bereich des Andenknicks zugrunde, infolge welcher alle Populationen südlich und nördlich dieser Region weitgehend unabhängig von ihrer Artzugehörigkeit gruppieren. Innerhalb der größeren Gruppe bilden alle F. micrantha-Individuen aus dem über 4.000 km entfernten Mexiko in der PCo- Analyse ihrerseits eine undeutlich definierte Untergruppe, was auf eine gewisse Differenzierung gegenüber den Individuen der kleineren Gruppe in den bolivianischen Arten hindeutet. Die auf der Basis von acht Mikrosatellitenmarkern ermittelte genetische Distanz reicht jedoch nicht aus, um F. micrantha eindeutig als Art abzugrenzen, das gleiche gilt für F. christophii und F. villosula. Auffällig ist, dass vergleichsweise viele Individuen der drei Arten entsprechend ihrer Populationszugehörigkeit gruppieren, was auf eine genetische Strukturierung auf Populations- ebene hindeutet, nicht aber auf Artebene. Die hier erzielten Mikrosatellitendaten stützen somit die Schlussfolgerungen von WAGNER (2012), dass sich 1) die F. micrantha-Individuen gegenüber den verbleibenden Proben erheblich weniger gut getrennt sind als es die große geographische Distanz erwarten lässt, dass 2) keine Abgrenzung zwischen F. christophii und F. villosula möglich ist und dass 3) die genetischen Gruppierungen der Individuen in erster Linie geographisch bedingt sind. Eine Gegenüberstellung der PCoA- Diagramme beider Markersysteme (AFLP und Mikrosatelliten) zeigt die Ähnlichkeit in der Verteilung der Punktewolken (Abbildung 4.7). Eine Abweichung besteht lediglich darin, dass die Individuen von F. christophii und F. villosula nach Maßgabe der Mikrosatellitendaten weitgehend entsprechend ihrer Populationszugehörigkeit gruppieren, nach Maßgabe der AFLP-Daten ist dies nicht der Fall. Demzufolge scheinen die Mikrosatellitenmarker über ein höheres Differenzierungspotenzial auf Ebene der Populationen zu verfügen. Insgesamt lässt sich festhalten, dass die drei Arten der micrantha-Gruppe durch molekulare Daten nicht eindeutig zu trennen sind und dass F. christophii und F. villosula in ihren jeweiligen Verbreitungsgebieten offenbar durch Genfluss miteinander in Verbindung stehen. Auch die morphologische Abgrenzung der drei Arten ist nicht eindeutig möglich (WAGNER 2012), und die Experimente von ÖDER (2012) bestätigen, dass alle drei Arten miteinander kreuzbar sind. Zudem war unter Gewächshaus-Bedingungen eine Keimung der bei den Kreuzungen erhaltenen Samen in mehr als 90% der Fälle erfolgreich und die Keimlinge lebensfähig. All diese Daten deuten darauf 153 Diskussion hin, dass der Artbildungsprozess innerhalb der micrantha-Gruppe längst nicht abgeschlossen ist, sodass der Vorschlag von WAGNER (2012) angebracht erscheint, eine erneute Überprüfung der von PETERS (2009) vorgenommenen Einteilung der micrantha-Gruppe vorzunehmen. Abbildung 4.7: Gegenüberstellung der dreidimensionalen PCo-Analysen der micrantha-Gruppe (F. christophii, F. micrantha, F. villosula) basierend auf den Alleldaten an acht nukleären Mikrosatellitenmarkern (oben, N = 190, vorliegende Arbeit) und den AFLP-Daten aus WAGNER (2012) basierend auf sechs Primerkombinationen (unten, 109 Individuen aus 21 Populationen). Das obere Diagramm repräsentiert 75,8%, das untere 26,5% ( N. WAGNER, persönliche Mitteilung) der Gesamtvarianz. 4.2.2 Populationsgenetik von Fosterella rusbyi Die im Abschnitt 4.2.1 diskutierten Studien an Dyckia und der Fosterella micrantha-Gruppe waren vorwiegend oberhalb des Artniveaus angesiedelt und behandelten insbesondere Fragen der Abgrenzung zwischen nahe verwandten Arten. Hingegen beschränkte sich die Untersuchung an Fosterella rusbyi auf innerartliche Fragestellungen, insbesondere in Hinblick auf mögliche Artbildungsmechanismen. Dazu wurden mit einer Kombination aus 15 nukleären und sieben plastidären Mikrosatellitenmarkern 253 F. rusbyi-Individuen aus 30 Populationen untersucht 154 Diskussion (Kapitel 3.7). Nahezu die gleichen Individuen wurden in einer parallelen Arbeit am SENCKENBERG- Institut Frankfurt mit Hilfe von AFLP-Markern untersucht (Michalak 2013), so dass die mit drei Markertypen erhalten Ergebnisse verglichen werden konnten. Die Pflanzen stammten aus verschiedenen Regionen Boliviens und wurden anhand ihrer Sammelorte vorab in neun geographische Gruppen eingeteilt (vgl. Abbildung 3.22). Im folgenden sollen zunächst kurz die Mutationsmodelle für Mikrosatelliten diskutiert werden, die einer populationsgenetischen Studien zugrunde gelegt werden können. Im Anschluss erfolgt eine Diskussion der erhaltenen populationsgenetischen Parameter, die in diversen Schlussfolgerungen mündet. 4.2.2.1 Mutationsmodelle Die Frage nach dem am besten geeigneten Mutationsmodell zur Kalkulation genetischer Distanzen und der Differenzierung von Populationen auf Basis von Mikrosatellitenmarkern ist umstritten. Das IAM (’infinite alleles model’) besagt, dass jede Mutation ein neues, unabhängiges Allel hervorbringt, während das SMM (’stepwise mutation model’) eine enge Verwandtschaft zwischen Allelen ähnlicher Länge annimmt (vgl. Kapitel 1.2.3). In Anbetracht dessen, dass vor allem ’slipped strand mispairing’ für die Variation an Mikrosatellitenloci verantwortlich gemacht wird, erscheint das SMM und somit Rst als Maß der genetischen Distanz, zur Interpretation von Mikrosatellitendaten die angemessenere Variante zu sein. Andererseits folgen Mikrosatelliten in der Praxis kaum jemals einem strikten SMM (MEIRMANS & HEDRICK 2011), weshalb vor allem bei der Analyse von genetisch und geographisch näher zusammen liegenden Populationen auch oder ausschließlich der auf dem IAM basierende Fst-Wert berechnet wird und beide Modelle vergleichend angewendet werden (WEISING et al. 2005). In der vorliegenden Arbeit an den F. rusbyi- Populationen zeigte der MANTEL -Test eine ausgeprägte und hochsignifikante Korrelation zwischen Fst und Rst, was für die Unabhängigkeit der genetischen Situation vom jeweils angenommenen Mutationsmodell und der Robustheit der im folgenden diskutierten Ergebnisse spricht. 4.2.2.2 Genetische Diversität basierend auf nukleären Mikrosatellitenmarkern In der Populationsgenetik ist die Abschätzung der genetischen Diversität als eine der wichtigsten Eigenschaften natürlicher Populationen von zentraler Bedeutung. Je höher die genetische Diversität einer Population ist, desto besser stehen ihre Chancen auf Weiterentwicklung und Adaption an veränderte Lebensbedingungen. Von der Fragmentierung natürlicher Habitate wird angenommen, dass sie einen negativen Einfluss auf die genetische Diversität ausübt (YOUNG et al. 155 Diskussion 1996). Weitere Gründe können im verstärkten Einfluss genetischer Drift und/oder Inzucht liegen. An den 15 untersuchten nukleären Mikrosatellitenloci wurden über alle Populationen hinweg zwischen drei und 13 Allelen nachgewiesen, was einem Durchschnittswert von 6,9 Allelen pro Locus in 253 Individuen und einer Gesamtzahl von 104 Allelen entspricht. In diesem Bereich lagen auch die Werte, die innerhalb der micrantha-Gruppe und in anderen Bromelien gefunden wurden (vgl. Tabelle 4.4). Im Gegensatz zu den Vergleichsstudien an anderen Bromelien war jedoch sowohl innerhalb der micrantha-Gruppe als auch in den Populationen von F. rusbyi die beobachtete Heterozygotie als direktes Maß für genetische Diversität sehr niedrig (Tabelle 4.4). In der Literatur finden sich unterschiedliche Ansätze zur Erklärung dieses so genannten Heterozygoten-Defizits, wie zum Beispiel die Nicht-Amplifikation von Nullallelen (FREELAND et al. 2000), Selektion oder nicht- zufällige Partnerwahl, z.B. infolge von Inzucht. Nullallele scheinen in der vorliegenden Studie eher nicht verantwortlich zu sein, da an jedem der 15 Mikrosatellitenloci (Tabelle 3.17) und in nahezu jeder der 30 untersuchten Populationen ein Homozygoten-Überschuss beobachtet wurde (vgl. Tabelle 3.18). Der Einfluss der Selektion, basierend auf einer nicht neutralen Natur der untersuchten Loci, scheint ebenfalls vergleichsweise gering, zumal auf Basis einer BLAST-Analyse für keinen der 15 ngFos-Loci Homologien zu den in GenBank verfügbaren Einträgen detektiert wurden. Eine weitere Erklärungsmöglichkeit besteht in einer durch ungleiches Sammeln hervorgerufenen Unterbewertung der tatsächlichen Diversität (ZHOU et al. 2003). Vergleicht man jedoch die ermittelte genetische Diversität mit der Anzahl untersuchter Individuen pro Population (Tabelle 3.18), so wird deutlich, dass keine unmittelbare Korrelation zwischen beiden Parametern besteht. Aufgrund der starken Fragmentierung der für F. rusbyi geeigneten Habitate (vgl. Kapitel 1.4.2.2) wären als Ursache für die geringe Variation innerhalb von Populationen und den hohen Anteil von Homozygoten auch Gründer- oder Flaschenhalseffekte denkbar. Selbst wenn sich der Bestand an Individuen nach einem solchen Ereignis in kürzester Zeit wieder erholten kann, würde die genetische Variation erst wesentlich später ihr ursprüngliches Niveau erreichen, wenn sie durch Mutationen oder Genfluss wieder hergestellt ist (LOWE et al. 2004). Die wahrscheinlichste Erklärung für das Heterozygoten-Defizit in F. rusbyi liegt jedoch in der nichtzufälligen Paarung. Wenn sich die Mitglieder einer Population häufiger mit ihren nächsten Nachbarn als mit weiter entfernten Vertretern kreuzen, führt dies über kurz oder lang zu Inzucht. Innerhalb einer Population bewirken sowohl die Inzucht als auch die autogame Vermehrung durch Selbstbestäubung – eine extreme Form der nichtzufälligen Paarung – einen 156 Diskussion Anstieg des Homozygoten-Anteils auf Kosten der Heterozygoten, was letztendlich zu massiven Abweichungen vom HARDY-WEINBERG Gleichgewicht führt (ARNOLD 1982). So wurden beispielsweise in 42 Vertretern natürlicher Populationen der selbstkompatiblen Brassicaceenart Arabidopsis thaliana insgesamt 216 ausschließlich homozygote Allele an jedem der 20 verwendeten Mikrosatellitenloci detektiert, was von den Autoren auf Inzucht zurückgeführt wurde (INNAN et al. 1997). Analog dazu wurde auch in einer Allozymstudie an Tillandsia achyrostachys die Differenz zwischen Ho und He durch genetische Drift und Inzucht erklärt (GONZÁLEZ-ASTORGA et al. 2004). In den beiden wilden Reisarten Oryza rufipogon und O. officinalis wurde das ausgeprägte Heterozygoten-Defizit auf ein erhöhtes Maß an Selbstbestäubung zurückgeführt (ZHOU et al. 2003; GAO 2005). In 2012 wurde in Kreuzungsexperimenten unter Gewächshaus-Bedingungen mithilfe der hier vorgestellten Mikrosatellitenmarker nachgewiesen, dass sowohl die Arten der micrantha-Gruppe als auch F. rusbyi zur Selbstbestäubung in der Lage sind und somit selbstkompatibel sind (ÖDER 2012). Bislang wurden noch keine Freiland-Experimente durchgeführt, um die autogame Vermehrung auch unter natürlichen Bedingungen zu bestätigen. Aufgrund der nachgewiesen erfolgreichen, geschlossenen Pollination und der hohen Anzahl der dabei produzierten Samen (46,6 Samen pro Blüte) und deren uneingeschränkter Keimfähigkeit ist allerdings davon auszugehen, dass auch in natürlichen Populationen die Selbstbestäubung einen möglichen Reproduktionsmechanismus von F. rusbyi darstellt (ÖDER 2012). Schließlich kommt als Möglichkeit zur Erklärung der geringen genetischen Variation innerhalb der Populationen auch vegetative Vermehrung in Betracht. Fosterella rusbyi bildet wie die meisten Bromelien Erneuerungsknospen, die als Kindel bezeichnet werden. Nach Freiland-Beobachtungen von N. WAGNER (persönliche Mitteilung) bestehen die Populationen von F. rusbyi neben einem gewissen Teil vermutlich sexuell erzeugter Jungpflanzen hauptsächlich aus ausgewachsenen Mutterpflanzen, die üblicherweise ein Kindel in ihrer unmittelbaren Umgebung aufweisen. Somit kann angenommen werden, dass klonale Einheiten einen erheblichen Teil der F. rusbyi- Populationen ausmachen. In drei der untersuchten Populationen mit fünf und mehr genotypisierten Individuen (IM0128-IM0129, NW09.009 und NW09.018) wurde trotz einem möglichst großen Abstand zwischen den besammelten Individuen ein durchweg monomorphes und zugleich homozygotes Bandenmuster detektiert (vgl. Abbildung 4.7), sodass es sich bei diesen Proben wahrscheinlich um Klongeschwister handelt (REUSCH et al. 2000). Ein homozygotes Muster ist in vorwiegend klonal reproduzierenden Pflanzen allerdings eher unüblich, so wurden beispielsweise in klonalen Populationen von Prunus avium (STOECKEL et al. 157 Diskussion 2006), Sorbus torminalis (RASMUSSEN & KOLLMANN 2008) oder auch dem Kleinen Immergrün, Vinca minor (S. MÖLLER, persönliche Mitteilung) negative Fis-Werte und folglich ein signifikanter Heterozygoten-Überschuss ermittelt, der auf die asexuelle Reproduktion einiger weniger heterozygoter Individuen zurückzuführen ist (ZHOU et al. 2003). Auf der anderen Seite haben Mikrosatelliten-basierte Untersuchungen an einer Seegrasart (Posidonia oceanica) im Golf von Triest gezeigt, dass homozygote Klone durchaus beträchtliche Ausmaße annehmen können (PROCACCINI et al. 2001; RUGGIERO & PROCACCINI 2002). Die Autoren nehmen an, dass ein Gründereffekt, gefolgt von genetischer Isolation, klonaler Vermehrung und einem hohen Maß an Inzucht zur raschen Fixierung eines einzelnen Allels pro Locus geführt hat. Ein derartiges Ereignis ist auch innerhalb der Populationen von F. rusbyi denkbar. Tabelle 4.4: Gegenüberstellung der in der vorliegenden Arbeit und in anderen populationsgenetischen Studien an Bromelienarten auf Basis nukleärer Mikrosatellitenloci ermittelten Allelzahlen und Heterozygotie-Werte. Neben der Anzahl untersuchter Individuen ( N) sind die Menge eingesetzter polymorpher Loci, die durchschnittlich detektierten Allelzahlen sowie die Werte der beobachteten ( Ho) und erwarteten Heterozygotie (He) angegeben. Zitation Herkunftsarten N Polymorphe Loci Detektierte Allele pro Locus (∅) Ho He Vorliegende Arbeit Fosterella rusbyi 253 15 6,9 0,01 0,60 Vorliegende Arbeit Fosterella christophii F. micrantha F. villosula 50 57 83 8 5,1 6,8 5,5 0,14 0,08 0,03 0,47 0,59 0,63 BARBARÁ et al. 2007b & 2009 Alcantarea regina Al. geniculata Al. glaziouana Al. imperialis 55 168 170 248 8 4,4 4,9 6,3 6,5 0,48 0,36 0,30 0,36 0,52 0,43 0,47 0,62 BOISSELIER-DUBAYLE et al. 2010 Pitcairnia geyskesii 420 7 3,6 0,29 0,33 PAGGI et al. 2008 P. albiflos 22 8 5,9 0,41 0,66 GOETZE et al. 2013 Aechmea caudata 37 10 8,5 0,47 0,71 ZANELLA et al. 2011 Bromelia antiacantha 165 5 4,0 0,37 0,75 LAVOR et al. 2013 Vriesea minarum 20 5 8,6 0,43 0,58 RODRÍGUEZ et al. 2013a Ananas comosus 6 10 2,6 0,47 0,56 Bisher wurden nur wenige populationsgenetische Studien an Bromelienarten durchgeführt. Einige der dabei erhaltenen Schlüsselparameter sind in Tabelle 4.4. zusammengestellt. Wie die Auflistung zeigt, wurde auch in anderen Bromelien ein Heterozygoten-Defizit beobachtet, wenn auch nicht so extrem wie in F. rusbyi. Deutliche Abweichungen zwischen erwarteter und tatsächlicher Heterozygotie scheinen somit in Bromeliaceen keine Seltenheit darzustellen. Inwieweit dies generell eher auf Klonalität oder auf Selbstkompatibilität beruht, müssen weitere Untersuchungen an zusätzlichen Arten zeigen. Auch innerhalb von acht Puya raimondii- Populationen (N = 160) wurde basierend auf drei unterschiedlichen Markertypen (allerdings keine nukleären Mikrosatelliten) eine bemerkenswerte genetische Einheitlichkeit (nur 4% der genetischen Variation innerhalb von Populationen) festgestellt (SGORBATI et al. 2004). Die Autoren schließen daraus, dass dies vor allem auf autogame Vermehrung in Verbindung mit der Produktion einer großen Menge sehr keimfähiger Samen zurückzuführen ist. 158 Diskussion Insgesamt scheinen die Faktoren Inzucht, Selbstbestäubung sowie die Tendenz zu klonaler Vermehrung die Hauptursachen für die geringe detektierte genetische Diversität und den Homozygoten-Überschuss innerhalb der untersuchten F. rusbyi-Populationen darzustellen. Die nukleären Mikrosatellitendaten deuten darauf hin, dass die Populationen der fünf eher zentral gelegenen geographischen Gruppen III, IV, VI, VII und IX tendenziell eine höhere genetische Diversität aufweisen als die Populationen der eher peripher gelegenen Gruppen I, II und V. Eine Ausnahme bildet hierbei die geographische Gruppe VIII. Obwohl diese auch zentral liegt und in dieser Region die meisten Fundorte für F. rusbyi bekannt sind, erweisen sich die drei Populationen der Gruppe VIII als wenig divers. Population NW09.009 zeigt zudem die oben beschriebenen Indizien für klonales Wachstum, möglicherweise ist in diesem Fall die untersuchte Stichprobengröße nicht repräsentativ, sodass die tatsächliche genetische Diversität dieser individuenreichen Region nicht erfasst werden konnte. 4.2.2.3Genetische Diversität basierend auf den plastidären Mikrosatellitenmarkern An den sieben plastidären Mikrosatellitenloci wurden zwei bis sieben Allele (∅ 3,3 Allelen/Locus) mit einer Gesamtzahl von 23 Allelen detektiert. Da das Chloroplastengenom in der Regel keiner Rekombination unterliegt, wurde jede einzigartige Kombination verschiedener Längenvarianten (Allele) über alle sieben Loci als Haplotyp definiert. Eine Kombination der 23 Allele resultierte in 19 distinkten Haplotypen. Eine ähnlich hohe Plastidendiversität mit durchschnittlich 3,3 Allelen über vier plastidäre Mikrosatellitenloci ergab sich in 13 Populationen (N = 190) der Tillandsioideenart Vriesea gigantea (PALMA-SILVA et al. 2009). Hier konnten insgesamt 13 Haplotypen festgestellt werden. Auch außerhalb der Bromeliaceen liegen die Werte oft in einem ähnlichen Bereich, so wurden beispielsweise in 25 Populationen von Castanea mollissima durchschnittlich 3,5 Allele an sieben cpSSR-Loci (N = 659) und insgesamt 39 einzigartige Haplotypen nachgewiesen (LIU et al. 2013). In 64 Individuen zweier Prunus-Arten (P. mahaleb und P. avium) dagegen detektierten ABEDIAN et al. (2012) 2,3 Allele gemittelt über elf cpSSR-Loci und eine Gesamtzahl von 43 Haplotypen. Die Diversität der Plastidenhaplotypen in F. rusbyi erwies sich als ähnlich verteilt wie die genetische Diversität des Kerngenoms (Abbildung 3.31). Auch hier zeigten sich die zentral gelegenen Populationen gegenüber den Vertretern der peripheren Lokalitäten als diverser, wobei die meisten Haplotypen in den Gruppen III, IV und IX ermittelt wurden. Das Vorhandensein von jeweils nur einem einzigen Haplotypen in den Populationen IM0128-IM0129, NW09.018 und NW09.009 unterstützt zudem die Annahme, dass es sich bei den Individuen der drei Populationen, 159 Diskussion die auch an den nukleären Loci ein durchweg monomorphes und homozygotes Bandenmuster zeigten, jeweils um Klongeschwister handelt. 4.2.2.4 Genetische Differenzierung und Populationsstruktur in Fosterella rusbyi Eine Untersuchung der Verteilung der Variation zwischen und innerhalb der Populationen und Regionen erlaubt es, Faktoren zu identifizieren, die möglicherweise an der Strukturierung von Populationen mitgewirkt haben. Hierzu zählen u.a. Genfluss über Pollen und Samen, genetische Drift oder die natürliche Selektion. Genfluss ist dabei zweifelsohne einer der wichtigsten Prozesse. Genetische Drift und natürliche Selektion können die Differenzierung zwischen Populationen verstärken, wenn entweder die Populationsgrößen sehr gering sind oder unterschiedliche Arten bzw. Intensitäten von Selektionsdruck in den verschiedenen Populationen wirken. Ein Indiz für eine vorhandene genetische Differenzierung von Populationen liefern erhöhte Fixationsindizes. Nehmen diese mit steigender geographischer Distanz zu, kann von einer ’isolation-by-distance’ ausgegangen werden. Eine ausgeprägte genetische Differenz zwischen zwei oder mehr Pflanzenpopulationen weist auf eingeschränkten Pollen- bzw. Samenaustausch hin, der durch Barrieren unterschiedlicher Art verursacht werden kann, die Migrationsrate ist dann merklich herabgesetzt. Sowohl auf Basis der nukleären Mikrosatelliten (∅ Fst = 0,79, Gst = 0,77, Rst = 0,78) als auch ausgehend von den plastidären Loci (∅ Fst = 0,84) wurde ein hohes Maß an genetischer Differenzierung zwischen den 30 untersuchten Populationen von F. rusbyi ermittelt, sodass selbst nah benachbarte Populationen in beiden Genomen erhebliche genetische Unterschiede zueinander aufwiesen. Auch die Ergebnisse der AMOVA sowohl für nukleäre als auch plastidäre Loci (Tabellen 3.19 und 3.22) verdeutlichen, dass unabhängig von der vorgenommenen Gruppierung der geringste Anteil der Variation stets innerhalb der Populationen auftrat. Die beobachtete genetische Fixierung bezogen auf die Kerndaten liegt im oberen Bereich der in anderen Studien ermittelten Werte (Fst = 0,21 in Vriesea gigantea, PALMA-SILVA et al. 2009; Fst = 0,39 in Tillandsia achyrostachys, GONZÁLEZ-ASTORGA et al. 2004; Fst = 0,002 bis 0,81 in Pitcairnia geyskesii, BOISSELIER-DUBAYLE et al. 2010). Bezogen auf die plastidären Daten deutet der höhere Fst-Wert darauf hin, dass das maternal vererbte Chloroplastengenom eine größere genetische Differenzierung aufweist als das biparental abgeleitete Kerngenom (ENNOS 1994). Eine erste Vorab-Aufteilung des Datensatzes in neun geographische Gruppen erfolgte rein subjektiv aufgrund der geographischen Lage der 30 F. rusbyi-Populationen innerhalb des Untersuchungsgebietes. Dass hierdurch auch die molekulare Situation relativ gut widergespiegelt 160 Diskussion wird, zeigt die Konstellation der Punktewolken innerhalb der PCo-Analyse (Abbildung 3.25). Hingegen ergab die BAYES`sche Analyse mit den Computerprogrammen STRUCTURE und BAPS kein so eindeutiges Ergebnis für die wahrscheinlichste Anzahl der Gruppen im nukleären Datensatz. Bei Annahme des kleinsten Wertes, K = 2, ergibt sich bei der STRUCTURE-Analyse eine deutliche Trennung der peripheren und gleichzeitig am weitesten voneinander entfernten Populationen der Region I, V und IX von allen zentral gelegenen Populationen (Abbildung 3.27). Wird der nächsthöhere Wert von K = 5 angenommen, so erhält jede der drei peripheren Gruppen einen distinkten Status, der auch bei noch höheren K-Werten erhalten bleibt. Ein genetischer Austausch mit den zentral gelegenen Populationen scheint somit eingeschränkt zu sein, was für die ermittelte Korrelation zwischen geographischer und genetischer Distanz spricht (Abbildung 3.30). Innerhalb des zentralen Bereichs ergibt sich weiterhin eine Abgrenzung der nördlichsten (Gruppe II, III sowie die nördlichste Population von IV) von den verbleibenden, eher durchmischten Gruppen. Im Fall des größten, von BAPS angenommenen Wertes von K = 21 zeigt sich jedoch, dass nahezu jede Population ihre individuelle genetische Identität aufweist. Einzige Ausnahme bildet Population NW09.032, deren Struktur offenbar zweigeteilt ist, was auch durch die plastidären Daten sowie die AFLP-Analysen von MICHALAK (2013, siehe folgendes Kapitel) bestätigt wird. Die in aller Regel vorhandene Korrelation zwischen genetischer Struktur und geographischer Lage der Populationen innerhalb des Untersuchungsgebiets zeigt sich sowohl im NeighbourNet als auch in der Neighbour-Joining-Analyse. Beide Verfahren illustrieren, dass die Individuen der gleichen Population bis auf besagte Ausnahme (NW09.032) sehr häufig beisammen stehen und dass die genetisch determinierten Cluster größtenteils mit den neun geographischen Gruppen übereinstimmen. Dies gilt insbesondere für die peripheren Regionen. Für den plastidären Datensatz wurde K = 12 als wahrscheinlichste Anzahl vorhandener Gruppen angenommen, wodurch ebenfalls eine ausgeprägte Strukturierung zum Ausdruck kommt. Dieses Ergebnis wird zudem durch die Existenz von acht privaten Haplotypen gestützt, die vergleichsweise regelmäßig über die verschiedenen Populationen verteilt sind. Das untere Balkendiagramm in Abbildung 3.33 illustriert, dass fünf der neun geographischen Gruppen (I, II, VI, VIII und V) eine distinkte Stellung einnehmen. Innerhalb der verbleibenden Gruppen ist ein gewisses Maß an genetischer Durchmischung zu beobachten, so scheinen die Populationen IM0111-IM0113 und IM0108-IM0110 (IV) eher mit Gruppe I, Population NW09.033 (III) eher mit Gruppe VI und die Populationen IM0077-IM0080 und IM0084-IM0090 (beide VII) sowohl mit Gruppe IV als auch Gruppe III assoziiert zu sein. Zusätzlich ist eine häufigere genetische 161 Diskussion Durchmischung auf Ebene einzelner Individuen erkennbar, so zeigen beispielsweise vier Individuen aus Population JP 06.0070 (IX) und je ein Individuum aus Population NW09.029 und IM0105-IM0107 (IV) erhebliche Ähnlichkeiten zu den Individuen aus Gruppe II. Diese Beobachtung in Verbindung mit einer nicht signifikanten phylogeographischen Struktur lässt eine gelegentlich stattfindende, zufällige Samenausbreitung teils über längere, teils über kürzere geographische Distanzen vermuten. Die in der vorliegenden Arbeit generierten nukleären Mikrosatellitendaten eines leicht reduzierten Probensets (N = 231) bilden in Kombination mit 447 AFLP-Markern aus sechs Primer- Kombinationen die molekulare Grundlage der Dissertation unseres Kooperationspartners I. MICHALAK vom Forschungsinstitut SENCKENBERG (MICHALAK 2013). Das Differenzierungspotenzial dieser AFLP-Marker ist merklich herabgesetzt. Während die BAYES`sche Analyse für beide AFLP- Datensätze nur kleine Werte (K = 2, K = 3 mit STRUCTURE; K = 6, K = 7 mit BAPS) suggerierte, zeigten die Mikrosatellitendaten (K = 21, K = 22) dagegen ein erhöhtes Differenzierungspotenzial bezogen auf die genetische Strukturierung. 4.2.2.5 Schlussfolgerungen Die Populationen einer Art sind für gewöhnlich durch Genfluss miteinander verbunden, was den Zusammenhalt einer Art aufrecht erhält. Der Umfang des genetischen Austauschs zwischen Populationen bestimmt dabei, ob eine Art in eine einheitliche Richtung evolviert oder ob die Populationen in separate Richtungen divergieren. Eine mögliche Konsequenz eines unterbrochenen oder eingeschränkten Genflusses besteht in der Isolation von Populationen und mittelfristig in der möglichen Bildung neuer Arten (HUGHES et al. 2007). Entsprechend ist der Genfluss über die Verbreitung von Samen und Pollen ein entscheidender und bestimmender Faktor bezüglich der gegenwärtigen und zukünftigen genetischen Divergenz zwischen Populationen (KRAMER et al. 2011). Bestäubung Die meisten Fosterella-Arten blühen in ihrer Heimat in den Monaten September und Oktober und werden von Insekten bestäubt (PETERS 2009). Es wird vermutet, dass Insekten auf ihrer Suche nach Nektar nur relativ kleine Gebiete abdecken. So postulieren GRAVES & SCHRADER (2008), dass sich die Honigbiene gewöhnlich in einem Radius von etwa einem Kilometer um den Bienenstock bewegt und sich nur selten weiter als sechs Kilometer von diesem entfernt. Auch für manch andere 162 Diskussion Insekten nehmen die Autoren einen Wirkungskreis von etwa drei Kilometern an. Zahlreiche Studien belegen, dass Insekten deutlich weniger effektiv in Bezug auf den Austausch genetischen Materials über weite geographische Distanzen sind als beispielsweise Vögel (HUGHES et al. 2007; GRAVES & SCHRADER 2008; KRAMER et al. 2011). Somit könnte eine mögliche Ursache für den geringen Genfluss und die ausgeprägte genetische Differenzierung zwischen den voneinander isolierten Populationen von F. rusbyi in einer kurzen Reichweite der Bestäuber liegen. Die Interaktion zwischen Insekten und Blüten im Rahmen der Bestäubung wäre infolgedessen auf ein entsprechend kleines Areal beschränkt. Samenausbreitung Die winzigen, geflügelten Samen von F. rusbyi (PETERS 2009) sind auf eine anemochore Samenausbreitung ausgerichtet; es ist jedoch nicht bekannt, welche Strecken hierbei überwunden werden können. Fosterella rusbyi besiedelt bevorzugt steile Hänge und felsige Böschungen, weshalb diese Bromelie häufig entlang von Straßen zu finden ist (vgl. Abbildung 4.8). Die in der vorliegenden Arbeit untersuchten Populationsproben wurden durchweg an solch anthropogen beeinflussten Standorten entlang von Straßen in den nordöstlichen Anden-Tälern gesammelt, exemplarisch sind in Abbildung 4.8 die Fundorte von vier der 30 in der vorliegenden Arbeit untersuchten Populationen dargestellt. Den vier Klimadiagrammen in Abbildung 4.9 ist zu entnehmen, dass während der Blütezeit von F. rusbyi (September bis Oktober) die Hauptregenzeit in Bolivien einsetzt. Infolgedessen ist zum Zeitpunkt der Samenreife mit deutlich zunehmenden Niederschlagsmengen und als Konsequenz auch mit einem Anstieg der Wassermengen in den Flüssen am Talboden zu rechnen. Möglicherweise lassen sich die ausgeprägte Populationsstruktur und die isolierten Standorte von F. rusbyi mit dem Einfluss des Wassers innerhalb des menschlich veränderten Landschaftsbildes oder auch dem Einfluss des Menschen selbst erklären. 163 Diskussion Abbildung 4.8: Natürliche Standorte von F. rusbyi entlang von verschiedenen Straßenabschnitten im Departamento La Paz, Bolivien. A: Population NW09.033 (Provinz Larecaja), B: Population NW09.029 (Provinz Larecaja), C: Population NW09.008 (Provinz Nor Yungas), D: Population NW09.028 (Provinz Caranavi). Bilder mit freundlicher Genehmigung von N. WAGNER. 164 Diskussion Abbildung 4.9: Klimadiagramme von vier Regionen innerhalb des Verbreitungsgebietes von Fosterella rusbyi im Departamento La Paz. Bezugsquelle der Diagramme: Wikipedia, erstellt von K. EHLERS mit der Software Geoklima 2.1. Denkbar wäre, dass die aus den Kapseln entlassenen Samen von dem die Hänge herablaufenden Wasser erfasst und auf die Straße gespült werden. Abbildung 4.8 (A und B) illustriert, welchen Einfluss herablaufendes Wasser auf die einzelnen Pflanzen besitzt. Möglicherweise würde man auch Stellen (zum Beispiel flache Bodensenken) finden, in denen sich das Wasser vor dem Austrocknen sammelt und den akkumulierten Samen eine Keimung erlaubt. Eine ähnliche Beobachtung wurde auch im Habitat von Encholirium pedicellatum (CAVALLARI et al. 2006) gemacht. Von der Straße aus könnten die Samen aber auch weiter in Richtung Talboden transportiert werden, wo eine erfolgreiche Keimung aufgrund des dichten Bewuchses erschwert ist. Falls die Samen den Fluss am Talboden jedoch erreichen, wäre ein Weitertransport mit der Strömung denkbar, dadurch können Samen auch weit weg vom ursprünglichen Standort gelangen. Es wäre allerdings ebenso denkbar, dass sich die kleinen, auf der Straße befindlichen Samen im Reifenprofil der häufig vorbeifahrenden Kraftwagen festsetzen und so talauf- oder talabwärts zu neuen potenziellen Standorten transportiert werden. Bezüglich der Verfügbarkeit neuer Standorte könnten neben dem Menschen, der durch den Bau von Straßen geeignete Habitate für F. rusbyi schafft, auch lokale, niederschlagsbedingte Erdrutsche für Lücken im bestehenden Pflanzenbestand der Hänge sorgen, was eine Besiedlung durch F. rusbyi begünstigen würde. 165 Diskussion 4.2.2.6 Fosterella rusbyi: eine Bromelie mit Pionier-Charakter? Pionierpflanzen zeichnen sich durch ein lokales Auftreten in Verbindung mit einer hohen Abundanz bezogen auf die Individuendichte aus, was neben ihrem erhöhten Lichtbedarf auch auf ihrer Strategie der Neubesiedlung noch vegetationsfreier Habitate beruht. Pionierarten bilden oft kleine, an die anemochore Ausbreitung angepasste Samen und sind häufig selbstkompatibel, was prinzipiell einem einzigen Samen erlaubt, eine neue Population zu gründen (STEBBINS 1970). Aufgrund ihrer geringen Größe dringen die Diasporen leichter ins Erdreich ein und können dort vergleichsweise lang überdauern, während die Keimung für gewöhnlich durch Licht induziert wird (SILVEIRA et al. 2010). Viele der genannten Eigenschaften treffen auch auf F. rusbyi zu, der auch schon aufgrund des ephemeren Charakters ihrer bevorzugten Habitate der Charakter einer Pionierpflanze zukommt. Infolge von Gründereffekten im Rahmen der Neubesiedlung (DAVIES et al. 2010) sowie nachfolgende Inzucht und vegetative Vermehrung ist innerhalb einer Population eine deutlich geringere Variabilität zu erwarten als bei einem Vergleich der Pflanzen von verschiedenen Lokalitäten. Die genetische Struktur der Vorkommen von F. rusbyi deutet in der Tat darauf hin, dass die einzelnen Populationen jeweils aus Nachkommen eines einzigen oder nur sehr weniger Individuen bestehen. 4.2.2.7 Ausblick Die in den vorhergehenden Abschnitten diskutierten möglichen Ursachen für das in Fosterella rusbyi beobachtete Heterozygoten-Defizit, die geringe genetische Diversität innerhalb von Populationen und die ausgeprägte genetische Differenzierung zwischen den untersuchten Populationen sind bislang rein spekulativ. Um wirklich mehr Licht ins Dunkel zu bringen müssten kontrollierte Freiland- sowie Laborexperimente während und nach der Blütezeit von F. rusbyi an ausgewählten Fundorten durchgeführt werden. Dies würde unter anderem wertvolle Einblicke in den Bestäubungsvorgang, die involvierten Insekten, deren Effizienz als Bestäuber und den Einfluss der Witterungsbedingungen und insbesondere erhöhter Niederschläge ermöglichen. Weiterhin wäre es sinnvoll, sämtliche F. rusbyi-Individuen ausgewählter Fundorte bzw. Populationen mit den in der vorliegenden Arbeit entwickelten Mikrosatellitenmarkern flächendeckend zu genotypisieren. Auf Basis der dabei erhaltenen genetischen Informationen wären zum einen fundiertere Aussagen über den Umfang des klonalen Wachstums möglich, zum anderen über die Herkunft der Eltern von Jungpflanzen. Die Hypothese, dass es sich bei F. rusbyi um eine Pflanze mit Pionier-Eigenschaften handelt, könnte durch die präzise Dokumentation des Verlaufs der primären Sukzession an einem neu geschaffenen, noch unbesiedelten Standort (z.B. 166 Diskussion einer Böschung) wichtige Informationen liefern. Durch ein ergänzendes, möglichst vollständiges Besammeln aller bekannten Populationen innerhalb des Verbreitungsgebiet von F. rusbyi wären auch molekulare Daten zu den nördlichsten und südlichsten Gebieten verfügbar, die hier nur durch die Populationen JP 06.0070 und JP 06.0078 vertreten sind. Dies würde einen direkten Vergleich der meist anthropogen beeinflussten Standorte entlang von Straßen mit natürlichen offenen Standorten ermöglichen. 167 Zusammenfassung 5. Zusammenfassung Die etwa 13,4 Millionen Jahre alte Unterfamilie der Pitcairnioideae (Bromeliaceae) besteht aus den fünf Gattungen Dyckia, Deuterocohnia, Encholirium, Fosterella und Pitcairnia, deren insgesamt etwa 630 Arten in Süd- und Zentralamerika verbreitet sind. Die Monophylie der Unterfamilie sowie der Gattungen Dyckia und Fosterella wird von molekularen Daten gut gestützt, für die übrigen drei Gattungen liegen noch keine eindeutigen Ergebnisse vor. Auch zu den Verwandtschaftsverhältnissen innerhalb der Gattungen gibt es noch viele Fragezeichen. So wurde zum Beispiel für 25 der 31 Arten der Gattung Fosterella mit Hilfe von Chloroplasten-DNA- Sequenzen die Aufspaltung in sechs evolutionäre Linien nachgewiesen (REX et al. 2009; WAGNER et al. 2013), zur Klärung der Verwandtschaft und Abgrenzung der Arten innerhalb dieser Linien reichten aber die verwendeten Sequenzdaten nicht aus. Innerhalb der mit mehr als 150 Arten relativ großen Gattung Dyckia war es mit Plastidensequenzen noch nicht einmal möglich, Artengruppen zu definieren, geschweige denn Artgrenzen zu erfassen (KRAPP et al. 2014). Erschwerend kommt hinzu, dass viele Arten der Pitcairnioideae eine beträchtliche morphologische Plastizität aufweisen und nahezu fließende Übergänge zwischen den Arten die sichere Bestimmung zu einem schwierigen Problem machen können. Da die Evolution von Lebewesen auf der Ebene von Populationen beginnt, kann die Populationsgenetik wertvolle und ergänzende Erkenntnisse bezüglich der genetischen Differenzierung bis hin zur Artbildung und Artabgrenzung liefern. Um das Ausmaß der genetischen Variation und ihrer Verteilung innerhalb und zwischen benachbarten Populationen zu bestimmen, sind hoch-variable molekulare Marker unentbehrlich. Aufgrund ihrer hohen Mutationsrate, dem daraus resultierenden Längenpolymorphismus, der kodominanten Vererbung und der guten Reproduzierbarkeit haben sich locusspezifische Mikrosatelliten für populationsgenetische Untersuchungen als Marker der Wahl bewährt. Diese Marker können durch flankierende Primerpaare im Rahmen einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR) leicht amplifiziert werden; die unterschiedlichen Allele werden nach elektrophoretischer Auftrennung ausgewertet. Nachteilig ist nur, dass für die Etablierung von Mikrosatellitenmarkern Sequenzinformation erforderlich ist, und die Übertragbarkeit von Markern über Arten und Gattungen hinweg oft nur begrenzt ist. Bisher wurden nur vergleichsweise wenige Mikrosatellitenmarker für Bromeliaceen entwickelt. So standen innerhalb der Pitcairnioideae zu Beginn meines Promotionsprojektes nur einige wenige Marker für Arten der Gattung Pitcairnia zur Verfügung, nicht jedoch für die anderen vier Gattungen. 168 Zusammenfassung Ein wesentliches Ziel im ersten Teil der vorliegenden Arbeit bestand daher in der Etablierung einer möglichst hohen Anzahl nukleärer und plastidärer Mikrosatellitenmarker für populationsgenetische Studien und andere Untersuchungen innerhalb der Unterfamilie Pitcairnioideae. Im zweiten Teil der Arbeit wurden die neu entwickelten Marker für Fragen der Artabgrenzung innerhalb von eng verwandten Artengruppen der Gattungen Dyckia und Fosterella sowie für die Untersuchung der Populationsstruktur der in den Anden endemischen Art Fosterella rusbyi eingesetzt. Etablierung von Mikrosatellitenmarkern Zur Etablierung von Mikrosatellitenmarkern wurden zwei unterschiedliche technische Ansätze verfolgt. Zum einen diente eine öffentlich zugängliche ’expressed sequence tag’ (EST)-Datenbank, bestehend aus 5.659 Sequenzeinträgen für Ananas comosus (Unterfamilie Bromelioideae) als Grundlage zur in silico-Suche nach Mikrosatelliten. Zum anderen wurde die 454-Technologie des ’next-generation sequencing’ angewendet, um DNA-Sequenzdaten direkt aus drei ausgewählten Arten der Pitcairnioideae zu generieren und anschließend Mikrosatellitenmarker daraus zu isolieren. Im Laufe der Untersuchung wurden für Fosterella rusbyi 73.027, für Dyckia marnier- lapostollei var. estevesii 59.624 und für Deuterocohnia longipetala 25.827 454-Sequenzen (’reads’) produziert. Im Fall von F. rusbyi dienten die Sequenzdaten auch als Grundlage für die Suche nach plastidären Mikrosatelliten. Insgesamt wurden in der EST-Datenbank der Ananas 696 perfekte nukleäre Mikrosatelliten vom Mono- bis Hexanukleotid-Wiederholungstyp gefunden, was einer Häufigkeit von einem perfekten Mikrosatelliten pro 4,1 kb entspricht. In den 454-Sequenzdaten konnten für Fosterella, Dyckia und Deuterocohnia 2.796, 1.587 und 584 perfekte Mikrosatelliten identifiziert werden, entsprechend einem Mikrosatelliten pro 5,6 kb (Fosterella und Dyckia) und pro 7,1 kb (Deuterocohnia). Im Datensatz von Fosterella rusbyi wurden weiterhin 38 plastidäre Mikrosatelliten vom Mononukleotid-Wiederholungstyp detektiert. In Abhängigkeit von der Qualität und der Länge der Mikrosatelliten-flankierenden Sequenzen konnten Primerpaare 537 nukleäre Mikrosatellitenloci aus Ananas, 2.178 aus Fosterella, 1.165 aus Dyckia und 400 aus Deuterocohnia generiert werden, außerdem für 24 plastidäre Mikrosatellitenloci aus Fosterella. Für eine Auswahl dieser Loci wurden Primerpaare synthetisiert und in Pilotstudien getestet. Nach Maßgabe der dabei erhaltenen Ergebnisse wurden 18 nukleäre EST-Mikrosatellitenmarker aus Ananas, jeweils 15 nukleäre Mikrosatellitenmarker aus den 454-Datensätzen von F. rusbyi und Dy. marnier-lapostollei var. estevesii sowie sieben plastidäre Mikrosatellitenmarker aus F. rusbyi ausgewählt und auf ihre Funktionalität und Übertragbarkeit innerhalb der Bromeliaceen und 169 Zusammenfassung insbesondere der Pitcairnioideae hin validiert. Erwartungsgemäß zeigten sich die aus transkribierten Regionen stammenden EST-Mikrosatellitenmarker sowie die Plastidenmarker als besonders gut konserviert und über weite taxonomische Distanzen hinweg übertragbar. Wie die Analysen innerhalb der micrantha-Gruppe zeigen, sind einige der hier entwickelten EST-Marker auch zur Artabgrenzung innerhalb der Gattung Fosterella geeignet (siehe folgende Seite). Nach Abschluss der Testphase wurden die besten Mikrosatellitenmarker im Rahmen von drei populationsgenetischen Studien in ausgewählten Arten bzw. Artengruppen der Gattungen Dyckia und Fosterella mit unterschiedlichen thematischen Schwerpunkten angewendet. So wurde das Potenzial der nukleären Mikrosatellitenmarker zur Abgrenzung nah verwandter und morphologisch sehr ähnlicher Arten zum einen in der im Nordosten Brasiliens verbreiteten Artengruppe Dyckia dissitiflora-Dy. pernambucana-Dy. limae und zum anderen in der in Bolivien bzw. Zentralamerika heimischen Artengruppe Fosterella christophii-F. micrantha-F. villosula überprüft (micrantha-Gruppe nach REX et al. 2009). Das Pflanzenmaterial für die beiden Studien stammte von Freilandaufsammlungen und repräsentiert natürliche Populationen der entsprechenden Art. Weiterhin wurden sowohl plastidäre als auch nukleäre Mikrosatellitenmarker in natürlichen Populationen von Fosterella rusbyi angewendet, um die Verteilung der genetischen Diversität, die Differenzierung und den Genfluss zwischen den einzelnen Populationen dieser in den bolivianischen Anden inselartig verbreiteten Art zu untersuchen. Artabgrenzung in der Artengruppe Dyckia dissitiflora - Dy. pernambucana - Dy. limae Bei Dyckia pernambucana und Dy. limae handelt es sich um Lokalendemiten mit einem sehr ähnlichen Verbreitungsgebiet. Beide Arten sind morphologisch nicht eindeutig voneinander zu unterscheiden und es wird vermutet, dass sie nah miteinander verwandt sind. Dyckia dissitiflora ist ebenfalls eine nahe Verwandte mit einem vergleichsweise großen Verbreitungsgebiet. Die weiter entfernt stehende Art Dy. macedoi diente zur Validierung der Markenfunktionalität. Das Pflanzenmaterial für diese Analyse bestand aus drei Populationen von Dy. dissitiflora (N = 37), vier von Dy. pernambucana (N = 30), sowie je einer Population von Dy. limae (N = 10) und Dy. macedoi (N = 12). Basierend auf den Alleldaten an 15 nukleären Mikrosatellitenloci aus Dy. marnier- lapostollei var. estevesii konnte eindeutig zwischen Dy. limae / Dy. pernambucana auf der einen Seite und Dy. dissitiflora bzw. Dy. macedoi auf der anderen Seite unterschieden werden, was die Eignung von nukleären Mikrosatellitenmarkern für die Abgrenzung nahe verwandter Arten unterstreicht. Eine Abtrennung der Arten Dy. limae und Dy. pernambucana war hingegen mit keiner der verwendeten Auswertemethoden möglich, was darauf hindeutet, dass es sich hierbei nicht um zwei getrennte Arten handelt. Das Ergebnis der Mikrosatellitenstudie wurde durch eine unabhängige Studie mit dominanten AFLP-Markern unterstützt (PINANGÉ 2013). 170 Zusammenfassung Artabgrenzung in der Artengruppe Fosterella christophii-F. micrantha-F. villosula Während F. micrantha als einzige Fosterella-Art in Zentralamerika beheimatet ist, überschneiden sich die Verbreitungsgebiete der beiden bolivianischen Arten F. christophii und F. villosula, allerdings stellen beide unterschiedliche Ansprüche an ihre Habitate. Diese ökologischen Faktoren wurden als Merkmale für die Differenzierung und Diagnose der Arten dieser Gruppe hinzugezogen (PETERS 2009), da eine eindeutige Unterscheidung aufgrund der Morphologie kaum möglich war. Für die Mikrosatellitenanalyse wurden elf Populationen von F. villosula (N = 83), neun Populationen von F. christophii (N = 50) und acht Populationen von F. micrantha (N = 57) mit Hilfe von je vier nukleären EST- und 454- Mikrosatellitenmarkern genotypisiert. Die Ergebnisse lassen keine eindeutige Trennung der drei Arten zu. Es konnten zwei klar voneinander getrennte genetische Gruppen definiert werden, die jedoch eher geographisch determiniert waren. Dabei umfasste die größere der beiden Gruppen alle drei Arten, deren Siedlungsbereich neben einem Areal in den bolivianischen Departamentos Beni, La Paz und Cochabamba auch das gesamte Verbreitungsgebiet von F. micrantha in Zentralamerika umfasste. Die zweite, kleinere Gruppe enthielt nur Populationen von F. christophii und F. villosula und war auf eine Region innerhalb des bolivianischen Departamentos Santa Cruz beschränkt. Innerhalb von Bolivien liegt dieser Verteilung möglicherweise eine genetische Barriere im Bereich des Andenknicks zugrunde, infolge welcher alle Populationen südlich und nördlich dieser Region weitgehend unabhängig von ihrer Artzugehörigkeit gruppieren. Die geringen genetischen Unterschiede zwischen F. micrantha auf der einen und F. villosula-F. christophii auf der anderen Seite legen nahe, dass die Besiedlung Zentralamerikas durch F. micrantha erst vor kurzer Zeit erfolgt ist. Auch auf Basis von AFLP-Daten (WAGNER 2012) war eine Trennung der drei Arten ebenfalls nicht möglich, sodass davon ausgegangen werden kann, dass der Artbildungsprozess innerhalb der micrantha-Gruppe noch keineswegs abgeschlossen ist. Populationsgenetik von Fosterella rusbyi Für die populationsgenetische Analyse von F. rusbyi wurde ein umfangreiches Probenset genotypisiert, bestehend aus 253 Individuen aus 30 Populationen dieser in den bolivianischen Anden endemischen Art. Dazu wurde eine Kombination aus 15 nukleären und sieben plastidären Mikrosatellitenmarkern verwendet. Die einzelnen Populationen erwiesen sich als genetisch deutlich voneinander differenziert, was u.a. durch sehr hohe paarweise Fst-Werte zum Ausdruck kommt, sowohl basierend auf den nukleären (Fst = 0,79), als auch den plastidären (Fst = 0,96) Mikrosatellitendaten. Die Ergebnisse der BAYES`schen Analysen mit den Programmen STRUCTURE und BAPS weisen darauf hin, dass der Populationsstruktur von F. rusbyi ein geographisches Muster zugrunde liegt, in dem die eher peripher lokalisierten Populationen eine 171 Zusammenfassung distinktere Stellung einnehmen als die zentral im Untersuchungsgebiet gelegenen Populationen. Auch im NeighbourNet und der Neighbour-Joining-Analyse gruppieren die einzelnen Individuen fast ausnahmslos entsprechend ihrer Populations- bzw. Gruppenzugehörigkeit. Auf Ebene der Populationen wurde ein deutliches Heterozygoten-Defizit über alle Loci ermittelt, was am ehesten durch Faktoren wie Inzucht und Selbstbestäubung in Kombination mit einer Tendenz zu klonalem Wachstum erklärt werden kann. Mögliche Gründe für den eingeschränkten Genfluss zwischen den Populationen werden diskutiert. Neben der geringen Reichweite potenzieller Bestäuber dürften vor allem die nicht-effiziente Ausbreitung der Samen und die inselartige Verbreitung geeigneter offener Habitate (wie z.B. Straßenböschungen) dafür verantwortlich sein. Möglicherweise wirken sich auch die Witterungsverhältnisse während der Zeit der Samenreife, speziell der Einfluss des Niederschlags an den steilen, von F. rusbyi besiedelten Hängen negativ auf die Samenausbreitung aus. 172 Literaturverzeichnis 6. Literaturverzeichnis ABBOTT CL, EBERT D, TABATA A, AND THERRIAULT TW (2010) Twelve microsatellite markers in the invasive tunicate, Didemnum vexillum, isolated from low coverage 454 pyrosequencing reads. Conservation Genetics and Resources 3: 79-81 ABEDIAN M, TALEBI M, TABATABAEI BES, AND GHOBADI C (2012) Chloroplast microsatellite diversity among and within Prunus mahaleb L. and P. avium L. species. Journal of Agricultural Sciences 4: 191-202 ABDELKRIM J, ROBERTSON BC, STANTON J-AL, AND GEMMELL NJ (2009) Fast, cost-effective development of species-specific microsatellite markers by genomic sequencing. BioTechniques 46: 185-192 AGARWAL M, SHRIVASTAVA N, AND PADH H (2008) Advances in molecular marker techniques and their applications in plant sciences. Plant Cell Reporter 27: 617-631 AITMAN TJ, HEARNE CM, MCALEER MA, AND TODD JA (1991) Mononucleotide repeats are an abundant source of length variants in mouse genomic DNA. Mammalian Genome 1: 206-210 AKKAK A, SCARIOT V, MARINONI DT, BOCCACCI P, BELTRAMO C, AND BOTTA R (2009) Development and evaluation of microsatellite markers in Phoenix dactylifera L. and their transferability to other Phoenix species. Biologia Plantarum 53: 164-166 AKKAYA MS, BHAGWAT AA, AND CREGAN PB (1992) Length polymorphisms of simple sequence repeat DNA in soybean. Genetics 132: 1131–1139 ALFADALA S, DAWSON DA, HORSBURGH GJ, BEHNKE JM, BAJER A, MOHALLAL EME, ZALAT S, AND SLATE J (2013) Large-scale isolation of eastern spiny mouse Acomys dimidiatus microsatellite loci through GS-FLX 454 titanium sequencing. Conservation Genetics Resources 5: 519-524 ALLENTOFT ME, SCHUSTER S, HOLDAWAY R, HALE M, MCLAY E, OSKAM CL, GILBERT MTP, SPENCER P, WILLERSLEV E, AND BUNCE M (2009) Identification of microsatellites from an extinct moa species using high-throughput (454) sequence data. BioTechniques 46: 195-200 ALTSCHUL SF, MADDEN TL, SCHÄFFER AA, ZHANG J, ZHANG Z, MILLER W, AND LIPMAN DJ (1997) Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Research 25: 3389-3402 ANDERSON JR, AND LÜBBERSTEDT T (2003) Functional markers in plants. Trends in Plant Science 8: 554-560 ANDERSON TJC, HAUBOLD B, WILLIAMS JT, ESTRADA-FRANCO JG, RICHARDSON L, MOLLINEDO R, BOCKARIE M, MOKILI J, MHARAKURWA S, FRENCH N, WHITWORTH J, VELEZ ID, BROCKMAN AH, NOSTEN F, FERREIRA MU, AND DAY KP (2000) Microsatellite markers reveal a spectrum of population structures in the malaria parasite Plasmodium falciparum. Molecular Biology and Evolution 17: 1467-1482 ARADHYA M, ZEE F, AND MANSHART RM (1994) Isozyme variation in cultivated and wild pineapple. Euphytica 79: 87–99 ARNOLD RM (1982) Floral biology of Chaenorrhinum minus (Scrophulariaceae), a self-compatible annual. American Midland Naturalist 108: 317-324 ARROYO JM, MUNGUIA-VEGA A, RODRÍGUEZ-ESTRELLA R, AND BASCOMPTE J (2013) Isolation of 18 microsatellite loci in the desert mistletoe Phoradendron californicum (Santalaceae) via 454 pyrosequencing. Applications in Plant Sciences 1: 1300048 ASP T, FREI UK, DIDION T, NIELSEN KK, AND LÜBBERSTEDT T (2007) Frequency, type, and distribution of EST-SSRs from three genotypes of Lolium perenne, and their conservation across orthologous sequences of Festuca arundinacea, Brachypodium distachyon, and Oryza sativa. BMC Plant Biology 7: 36 AYERS NM, MCCLUNG AM, LARKIN PD, BLIGH HFJ, JONES CA, AND PARK WD (1997) Microsatellites and a single nucleotide polymorphism differentiate apparent amylose classes in an extended pedigree of US rice germplasm. Theoretical and Applied Genetics 94: 773–781 BAI T-D, XU L-A, XU M, AND WANG Z-R (2013) Characterization of masson pine (Pinus massoniana LAMB.) microsatellite DNA by 454 genome shotgun sequencing. Tree Genetics and Genomics, online first BÄNFER G, MOOG U, FIALA B, MOHAMED M, WEISING K, AND BLATTNER FR (2006) A chloroplast genealogy of myrmecophytic Macaranga species (Euphorbiaceae) in Southeast Asia reveals hybridization, vicariance and long-distance dispersals. Molecular Ecology 15: 4409-4424 BARBARÁ T, PALMA-SILVA C, PAGGI GM, BERED F, FAY MF, AND LEXER C (2007a) Cross-species transfer of nuclear microsatellite markers: Potenzial and limitations. Molecular Ecology 16: 3759–3767 173 Literaturverzeichnis BARBARÁ T, MARTINELLI G, FAY MF, MAYO SJ, LEXER C (2007b) Population differentiation and species cohesion in two closely related plants adapted to neotropical high-altitude ‘‘inselbergs’’: Alcantarea imperialis and Alcantarea geniculata (Bromeliaceae). Molecular Ecology 16: 1981–1992 BARBARÁ T, MARTINELLI G, PALMA-SILVA C, FAY MF, MAYO SJ, AND LEXER C (2009) Genetic relationships and variation in reproductive strategies in four closely related bromeliads adapted to neotropical ‘inselbergs’: Alcantarea glaziouana, A. regina, A. geniculata and A. imperialis (Bromeliaceae). Annals of Botany 103: 65-77 BARBAZUK WB, EMRICH SJ, CHEN HD, LI L, AND SCHNABLE PS (2007) SNP discovery via 454 transcriptome sequencing. The Plant Journal 51: 910-918 BATRA R, CHARIZANIS K, AND SWANSON MS (2010) Partners in crime: bidirectional transcription in unstable microsatellite desease. Human Molecular Genetics 19: R77-R82 BECKMANN JS, AND WEBER JL (1992) Survey of human and rat microsatellites. Genomics 12: 627-631 BENZING DH, AND BURT KM (1970) Foliar permeability among twenty species of the Bromeliaceae. Bulletin of the Torrey Botanical Club 97: 269-279 BENZING DH (2000) Bromeliaceae. Profile of an adaptive radiation. Cambridge: Cambridge University Press BEYERMANN B, NÜRNBERG P, WEIHE A, MEIXNER M, EPPLEN JT, AND BÖRNER T (1992) Fingerprinting plant genomes with oligonucleotide probes specific for simple repetitive DNA sequences. Theoretical and Applied Genetics 83: 691-694 BLANCA J, CANIZARES J, ROIG C, ZIARSOLO P, NUZE F, AND PICO B (2011) Transcriptome characterization and high throughput SSRs and SNPs discovery in Cucurbita pepo (Cucurbitaceae). BMC Genomics 12: e104–118 BOISSELIER-DUBAYLE MC, LEBLOIS R, SAMADI S, LAMBOURDIÈRE J, AND SARTHOU C (2010) Genetic structure of the xerophilous bromeliad Pitcairnia geyskesii on inselbergs in French Guiana - a test of the forest refuge hypothesis. Ecography 33: 175- 184 BOLAND CR, AND GOEL A (2010) Microsatellite instability in colorectal cancer. Gastroenterology 138: 2073-2087 BONEH L, KUPERUS P, AND VAN TIENDEREN PH (2003) Microsatellites in the bromeliads Tillandsia fasciculata and Guzmania monostachya. Molecular Ecology Notes 3: 302–303 BOTELLA JR, SMITH M (2008) Genomics of pineapple, crowning the king of tropical fruits. In: MOORE PH, MING R (eds) Plant genetics and genomics vol. 1: genomics of tropical crop plants. Springer, New York, p 441–450 BOWEN BW, BASS AL, SOARES L, AND TOONEN RJ (2005) Conservation implications of complex population structure: lessons from the loggerhead turtle (Caretta caretta). Molecular Ecology 14: 2389-2402 BOWLES V, MAYERHOFER R, DAVIS C, GOOD A, AND HALL J (2010) A phylogenetic investigation of Carthamus combining sequence and microsatellite data. Plant Systematics and Evolution 287: 85–97 BRAY RJ, AND CURTIS JI (1957) An ordination of the upland forest communities of southern Wisconsin. Ecological Monographs 27: 325–349 BRUFORD MW, AND WAYNE RK (1993) Microsatellites and their application to population genetic studies. Current Opinion in Genetics and Development 3: 939-943 BRYANT D, AND MOULTON V (2004) Neighbor-Net: an agglomerative method for the construction of phylogenetic networks. Molecular Biology and Evolution 21: 255-265 BUEHLER D, GRAF R, HOLDEREGGER R, AND GUGERLI F (2011) Using the 454 pyrosequencing-based technique in the development of nuclear microsatellite loci in the alpine plant Arabis alpina (Brassicaceae). American Journal of Botany 98: e1–e3 BURMEISTER A (2013) Molekulare Untersuchungen zur Plastidenvererbung bei Fosterella (Pitcairnioideae – Bromeliaceae). Bachelorarbeit im Fachgebiet Systematik und Morphologie der Pflanzen, Universität Kassel BURRELL AM, NO E-G, AND PEPPER AE (2011) Discovery of nuclear and plastid microsatellites, and other key genomic information, in the rare endemic plant (Caulanthus amplexicaulis var. barbarae) using minimal 454 pyrosequencing. Conservation Genetics Resources 3: 753-755 CADDAH MK, CAMPOS T, ZUCCHI MI, PEREIRA DE SOUZA A, BITTRICH V, AND DO AMARAL MCE (2013) Species boundaries inferred from microsatellite markers in the Kielmeyera coriacea complex (Calophyllaceae) and evidence of asymmetric hybridization. Plant Systematics and Evolution 299: 731–741 CARDLE L, RAMSAY L, MILBOURNE D, MACAULAY M, MARSHALL D, AND WAUGH R (2000) Computational and experimental characterization of physically clustered simple sequence repeats in plants. Genetics 156: 847-854 174 Literaturverzeichnis CARLIER JD, REIS A, DUVAL MF, COPPENS D‘EECKENBRUGGE G, AND LEITÃO JM (2004) Genetic maps of RAPD, AFLP and ISSR markers in Ananas bracteatus and A. comosus using the pseudo-testcross strategy. Plant Breeding 123:186–192 CARLIER JD, HORTA SOUSA N, ESPÍRITO SANTO T, COPPENS D‘EECKENBRUGGE G, AND LEITÃO JM (2012) A genetic map of pineapple (Ananas comosus (L.) MERR.) including SCAR, CAPS, SSR and EST-SSR markers. Molecular Breeding 29: 245-260 CASCANTE-MARÍN A, DE JONG M, BORG ED, OOSTERMEIJER JGB, WOLF JHD, AND DEN NIJS JCM (2006) Reproductive strategies and colonizing ability of two sympatric epiphytic bromeliads in a tropical premontane area. International Journal of Plant Science 167: 1187-1195 CASTOE TA, POOLE AW, GU W, DE KONING APJ, DAZA JM, SMITH EN, AND POLLOCK DD (2010) Rapid identification of thousands of copperhead snake (Agkistrodon contortrix) microsatellite loci from modest amounts of 454 shotgun genome sequence. Molecular Ecology Resources 10: 341-347 CAVALLARI MM, FORZZA RC, VEASEY EA, ZUCCHI MI, AND OLIVEIRA GCX (2006) Genetic variation in three endangered species of Encholirium (Bromeliaceae) from Cadeia do Espinhaço, Brazil, detected using RAPD markers. Biodiversity and Conservation 15: 4357-4373 CHAGNE D, CHAUMEIL P, RAMBOER A, COLLADA C, GUEVARA A, CERVERA MT, VENDRAMIN GG, GARCIA V, FRIGERIO J-M, ECHT C, RICHARDSON T, AND PLOMION C (2004) Cross-species transferability and mapping of genomic and cDNA SSRs in pines. Theoretical and Applied Genetics 109: 1204–1214 CHAPMAN MA, HVALA J, STREVER J, MATVIENKO M, KOZIK A, MICHELMORE RW, TANG S, KNAPP SJ, AND BURKE JM (2009) Development, polymorphism, and cross-taxon utility of EST–SSR markers from safflower (Carthamus tinctorius L.). Theoretical and Applied Genetics 120: 85–91 CHAPUIS M-P, AND ESTOUP A (2006) Microsatellite null alleles and estimation of population differentiation. Molecular Biology and Evolution 24: 621-631 CHASE MR, KESSELI R, AND BAWA K (1996) Microsatellite markers for population and conservation genetics of tropical trees. American Journal of Botany 83: 51–57 CHEN C, ZHOU P, CHOI YA, HUANG S, AND GMITTER FG JR (2006). Mining and characterizing microsatellites from citrus ESTs. Theoretical and Applied Genetics 112: 1248-1257 CHEUNG F, HAAS BJ, GOLDBERG SMD, MAY GD, XIAO Y, AND TOWN CD (2006) Sequencing Medicago trunculata expressed sequence tags using 454 Life Science technology. BMC Genomics 7: 272 CLEMENT M, POSADA D, AND CRANDALL, KA (2000) TCS: a computer program to estimate gene genealogies. Molecular Ecology 9: 1657-1659 CLOUTIER S, NIU Z, DATLA R, AND DUGUID S (2009) Development and analysis of EST-SSRs for flax (Linum usitatissimum L.). Theoretical and Applied Genetics 119: 53–63 COLLEVATTI RG, GRATTAPAGLIA D, AND HAY JD (2001) Population genetic structure of the endangered tropical tree species Caryocar brasiliense, based on variability at microsatellite loci. Molecular Ecology 10: 349–356 COLLINS JL (1960) The pineapple. Interscience Publishers, New York CONCEIÇÃO AA, AND PIRANI JR (2007) Diversidade em quatro áreas de campos rupestres na Chapada Diamantina, Bahia, Brasil: espécies distintas, mas riquezas similares. Rodriguésia 58: 193–206 COPPENS D`EECKENBRUGGE G, AND LEAL F (2003) Morphology, anatomy and taxonomy. In: BARTHOLOMEW DP, PAULL RE, ROHRBACH KG (eds) The pineapple: botany, production and uses. CAB International, Wallingford, pp 13–32 CORANDER J, WALDMAN, P, SILLANPAA MJ (2003) Bayesian analysis of genetic differentiation between populations. Genetics 163: 367-374. CORANDER J, WALDMANN P, MARTTINEN P, AND SILLENPÄÄ (2004) BAPS 2: enhanced possibilities for the analysis of genetic population structure. Bioinformatics 15: 2363-2369 CORANDER J, MARTTINEN P, SIRÉN J, AND TANG J (2008) Enhanced Bayesian modelling in BAPS software for learning genetic structures of populations. BMC Bioinformatics 9: 539 CORDEIRO GM, CASU R, MCINTYRE CL, MANNERS JM, AND HENRY RJ (2001) Microsatellite markers from sugarcane (Saccharum spp.) ESTs cross transferable to erianthus and sorghum. Plant Science 160: 1115–1123 COTIAS DE OLIVEIRA ALP, ASSIS JGA, CEITA GO, PALMEIRA ACL, AND GUEDES MLS (2004) Chromosome number for Bromeliaceae species occuring in Brazil. Cytologia 69: 161–166 175 Literaturverzeichnis CRAYN DM, WINTER K, AND SMITH JAC (2004) Multiple origins of crassulacean acid metabolism and the epiphytic habit in the Neotropical family Bromeliaceae. Proceedings of the National Academy of Science of the USA 101: 3703–3708 CSENCSICS D, BRODBECK S, AND HOLDEREGGER R (2010) Cost-effective, species-specific microsatellite development for the endangered dwarf bulrush (Typha minima) using next-generation sequencing technology. Journal of Heredity 101: 789– 793 DAVIES SJ, CAVERS S, FINEGAN B, NAVARRO C, AND LOWE AJ (2010) Genetic consequences of multigenerational and landscape colonisation bottlenecks for a neotropical forest pioneer tree, Vochysia ferruginea. Tropical Plant Biology 3: 14–27 DECROOCQ V, FAVÉ MG, HAGEN L, BORDENAVE L, AND DECROOCQ S (2003) Development and transferability of apricot and grape EST microsatellite markers across taxa. Theoretical and Applied Genetics 106: 912–922 DE LA ROSA R, BELAJ A, MUÑOZ-MÉRIDA A, TRELLES O, ORTÍZ-MARTÍN I, GONZÁLEZ-PLAZA JJ, VALPUESTA V, AND BEUZÓN CR (2013) Development of EST-derived SSR markers with long-core repeat in olive and their use for paternity testing. Journal of the American Society for Horticulural Science 138: 290-296 DELMAS CEL, LHUILLIER E, PORNON A, AND ESCARAVAGE N (2011) Isolation and characterization of microsatellite loci in Rhododendron ferrugineum (Ericaceae) using pyrosequencing technology. American Journal of Botany 98: e120–e122 DE SOUZA N, CARLIER JD, SANTO T, AND LEITÃO J (2013) An intergrated genetic map of pineapple (Ananas comosus (L.) MERR.). Scientia Horticulturae 157: 113-118 DIB C, FAURE S, FIZAMES C, SAMSON D, DROUOT N, VIGNAL A, MILLASSEAU P, MARC S, HAZAN J, SEBOUN E, LATHROP M, GYAPAY G, MORISSETTE J, AND WEISSENBACH J (1996) A comprehensive genetic map of the human genome based on 5264 microsatellites. Nature 380: 152–154 DON RH, COX PT, WAINWRIGHT BJ, BAKER K, AND MATTICK JS (1991) ‘Touchdown‘ PCR to circumvent spurious priming during gene amplification. Nucleic Acids Research 19: 4008 DRUMMOND AJ, ASHTON B, CHEUNG M, HELED J, KEARSE M, MOIR R, STONES-HAVAS S, STURROCK S, THIERER T, AND WILSON A (2010) Geneious v5.0, available from www.geneious.com [accessed 3 December 2010] DURAND J, BODÉNÈS C, CHANCEREL E, FRIGERIO J-M, VENDRAMIN G, SEBASTIANI F, BUONAMICI A, GAILING O, KOELEWIJN H-P, VILLANI F, MATTIONI C, CHERUBINI M, GOICOECHEA PG, HERRÁN A, IKARAN Z, CABANÉ C, UENO S, ALBERTO F, DUMOULIN P-Y, GUICHOUX E, DE DARUVAR A, KREMER A, AND PLOMION C (2010) A fast and cost-effective approach to develop and map EST-SSR markers: oak as a case study. BMC Genomics 11: 570 DUTTA S, KUMAWAT G, SINGH BP, GUPTA DK, SINGH S, DOGRA V, GAIKWAD K, SHARMA TR, RAJE RS, BANDHOPADHYA TK, DATTA S, SINGH MN, BASHASAB F, KULWAL P, WANJARI KB, VARSHNEY RK, COOK DR, AND SINGH NK (2011) Development of genic-SSR markers by deep transcriptome sequencing in pigeonpea [Cajanus cajan (L.) MILLSPAUGH]. BMC Plant Biology 11: 17 DUVAL M-F, NOYER JL, PERRIER X, COPPENS D`ECKENBRUGGE G, AND HAMON P (2001) Molecular diversity in pineapple assessed by RFLP markers. Theoretical and Applied Genetics 102: 83–90 DUVAL MF, BUSO GSC, FERREIRA FR, NOYER JL, COPPENS D’EECKENBRUGGE G, HAMON P, AND FERREIRA ME (2003) Relationships in Ananas and other related genera using chloroplast DNA restriction site variation. Genome 46: 990–1004 EARL DA, AND VONHOLDT BM (2012) STRUCTURE HARVESTER: a website and program for visualizing STRUCTURE output and implementing the Evanno method. Conservation Genetics Resources 4: 359-361 EBERT D, AND PEAKALL R (2009) Chloroplast simple sequence repeats (cpSSRs): technical resources and recommendations for expanding cpSSR discovery and applications to a wide array of plant species. Molecular Ecology Resources 9: 673-690 EDWARDS A, CIVITELLO A, HAMMOND HA, AND CASKEY CT (1991) DNA typing and genetic mapping with trimeric and tetrameric tandem repeats. American Journal of Human Genetics 49: 746-756 ELIADES NG, AND ELIADES DG (2009) Haplotype Analysis: software for analysis of haplotype data. Forest Genetics and Forest Tree Breeding, GEORG-AUGUST University, Goettingen, Germany. Online available at http://www.uni- goettingen.de/en/134935.html ELLEGREN H, JOHANSSON M, SANDBERG K, AND ANDERSSON L (1992) Cloning of highly polymorphic microsatellites in the horse. Animal Genetics 23: 133-142 ELLEGREN H (2000) Microsatellite mutations in the germline: implications for evolutionary inference. Trends in Genetics 16: 551–558 ELLEGREN H (2004) Microsatellites: simple sequences with complex evolution. Nature Reviews Genetics 5: 435-445 ELLIS JR, AND BURKE JM (2007) EST-SSRs as a resource for population genetic analyses. Heredity 99: 125–132 176 Literaturverzeichnis ENNOS RA (1994) Estimating the relative rates of pollen and seed migration among plant populations. Heredity 72: 250- 259 ESTOUP A, JARNE P. AND CORNUET J-M (2002) Homoplasy and mutation model at microsatellite loci and their consequences for population genetics analysis. Molecular Ecology 11: 1591-1604 EVANNO G, REGNAUT S, AND GOUDET J (2005) Detecting the number of clusters of individuals using the software STRUCTURE: a simulation study. Molecular Ecology 14: 2611-2620 EXCOFFIER L (2001) Analysis of population subdivision. Editors: BALDING, BISHOP & CANNINGS. In: Handbook of statistical genetics (JOHN WILEY & Sons, Chichester, UK): 271-307 EXCOFFIER L, AND LISCHER HEL (2010) Arlequin suite version 3.5: A new series of programs to perform population genetics analyses under Linux and Windows. Molecular Ecology Resources 10: 564-567 FARRELL LL, BURKE T, SLATE J, AND LANK DB (2013) A first-generation microsatellite linkage map of the ruff. Ecology and Evolution 3: 4631-4640 FENG S, TONG H, CHEN Y, WANG J, CHEN Y, SUN G, HE J, AND WU Y (2013) Development of pineapple microsatellite markers and germplasm genetic diversity analysis. BioMed Research International 2013: 1-11 FERGUSON ME, BUROW MD, SCHULZE SR, BRAMEL PJ, PATERSON AH, KRESOVICH S, AND MITCHELL S (2004). Microsatellite identification and characterization in peanut (A. hypogaea L.). Theoretical and Applied Genetics 108: 1064-1070 FIELD D, AND WILLS C (1996) Long, polymorphic microsatellites in simple organisms. Proceedings of the Royal Society of London 263: 209–251 FISCHER D, AND BACHMANN K (1998) Microsatellite enrichment in organisms with large genomes (Allium cepa L.). BioTechniques 24: 796–802 FORZZA RC (2005) Revisão Taxonómica de Encholirium MART. EX SCHULT. & SCHULT. f. (Pitcairnioideae - Bromeliaceae). Boletim de Botânica da Universidade de São Paulo 23: 1–49 FRASER LG, HARVEY CF, CROWHURST RN, AND DE SILVA HN (2004) EST-derived microsatellites from Actinidia species and their Potenzial for mapping. Theoretical and Applied Genetics 108: 1010-1016 FREELAND JR, NOBLE LR, AND OKAMURA B (2000) Genetic consequences of the metapopulation biology of a facultatively sexual freshwater invertebrate. Journal of Evolutionary Biology 13: 383-395 FRESCO JR, AND ALBERTS BM (1960) The accommodation of noncomplementary bases in helical polyribonucleotides and deoxyribonucleic acids. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 46: 311-321 FRIAR EA, CRUSE-SANDERS JM, AND MCGLAUGHLIN (2007) Gene flow in Dubautia arborea and D. ciliolata: the roles of ecology and isolation by distance in maintaining species boundaries despite ongoing hybridization. Molecular Ecology 16: 4028– 4038 GARDNER MG, FITCH AJ, BERTOZZI T, AND LOWE AJ (2011) Rise of the machines – recommendations for ecologists when using next generation sequencing for microsatellite development. Molecular Ecology Resources 11: 1093–1101 GAO L-Z (2005) Microsatellite variation within and among populations of Oryza officinalis (Poaceae), an endangered wild rice from China. Molecular Ecology 14: 4287-4297 GATCHEL JR, AND ZOGHBI HY (2005) Diseases of unstable repeat expansion: mechanisms and common principles. Nature Reviews Genetics 6: 743-755 GAUT BS, MUSE SV, CLARK WD, AND CLEGG MT (1992) Relative rates of nucleotide substitution at the rbcL locus of monocotyledonous plants. Journal of Molecular Evolution 35: 292–303 GEALY DR, TAI TH, AND SNELLER CH (2002) Identification of red rice, rice and hybrid populations using microsatellite markers. Weed Science 50: 333-339 GILLES A, MEGLÉCZ E, PECH N, FERREIRA S, MALAUSE T, AND MARTIN J-F (2011) Accuracy and quality assessment of 454 GS-FLX Titanium pyrosequencing. BMC Genomics 12: 245 GITAÌ J, HORRES R, AND BENKO-ISEPPON AM (2005) Chromosomal features and evolution of Bromeliaceae. Plant Systematics and Evolution 253: 65–80 GIVNISH TJ, MILLAM KC, BERRY PE, AND SYTSMA KJ (2007) Phylogeny, adaptive radiation, and historical biogeography of Bromeliaceae inferred from ndhF sequence data. Aliso 23: 3–26 177 Literaturverzeichnis GIVNISH TJ, AMES M, MCNEAL JR, MCKAIN MR, STEELE PR, DEPAMPHILIS CW, GRAHAM SW, PIRES JC, STEVENSON DW, ZOMLEFER WB, BRIGGS BG, DUVALL MR, MOORE MJ, HEANEY JM, SOLTIS DE, SOLTIS PS, THIELE K, AND LEEBENS-MACK JH (2010) Assembling the tree of the Monocotyledons: Plastome sequence phylogeny and evolution of Poales. Annals of the Missouri Botanical Garden 97: 584-616 GIVNISH TJ, BARFUSS MHJ, VAN EE B, RIINA R, SCHULTE K, HORRES R, GONSISKA PA, JABAILY RS, CRAYN DM, SMITH JAC, WINTER K, BROWN GK, EVANS TM, HOLST BK, LUTHER H, TILL W, ZIZKA G, BERRY PE, AND SYTSMA KJ (2011) Phylogeny, adaptive radiation, and historical biogeography in Bromeliaceae: insights from an eight-locus plastid phylogeny. American Journal of Botany 98: 872–895 GIVNISH TJ, BARFUSS MHJ, VAN EE B, RIINA R, SCHULTE K, HORRES R, GONSISKA PA, JABAILY RS, CRAYN DM, SMITH JAC, WINTER K, BROWN GK, EVANS TM, HOLST BK, LUTHER H, TILL W, ZIZKA G, BERRY PE, AND SYTSMA KJ (2014) Adaptive radiation, correlated and contingent evolution, and net species diversification in Bromeliaceae. Molecular Phylogeny and Evolution 71: 55-78 GLENN TC (2011) Field guide to next-generation DNA sequencers. Molecular Ecology Resources 11: 759–769 GOETZE M, LOUZADA RB, WANDERLEY MGL, SOUZA LM, BERED F, AND PALMA-SILVA C (2013) Development of microsatellite markers for genetic diversity analysis of Aechmea caudata (Bromeliaceae) and cross-species amplification in other bromeliads. Biochemical Systematics and Ecology 48: 194-198 GONZÁLEZ-ASTORGA J, CRUZ-ANGÓN A, FLORES-PALACIOS A, AND VOVIDES AP (2004) Diversity and genetic structure of the mexican endemic epiphyte Tillandsia achyrostachys E. MORR. EX BAKER var. achyrostachys (Bromeliaceae). Annals of Botany 94: 545-551 GOUDET J (2002) Fstat, Version 2.9.3.2: a computer package for PCs which estimates and tests gene diversities and differentiation statistics from codominant genetic markers. Current version online available at: http://www2.unil.ch/popgen/softwares/fstat.htm GOWER JC (1966) Some distance properties of latent root and vector methods used in multivariate analysis. Biometrika 53: 325-338 GRAVES WR, AND SCHRADER JA (2008) At the interface of phylogenetics and population genetics, the phylogeography of Dirca occidentalis (Thymelaeaceae). American Journal of Botany 95: 1454-1465 GRIFFITHS H, AND SMITH JAC (1983) Photosynthetic pathways in the Bromeliaceae of Trinidad: relations between life- forms, habitat preference and the occurrence of CAM. Oecologia 60: 176-184 GROHME MA, SOLER RF, WINK M, AND FROHME M (2013) Microsatellite marker discovery using single molecule real-time circular consensus sequencing on the Pacific Biosciences RS. BioTechniques 55: 253-256 GUICHOUX E, LAGACHE L, WAGNER S, CHAUMEIL P, LÉGER P, LEPAIS O, LEPOITTEVIN C, MALAUSA T, REVARDEL E, SALIN F, AND PETIT RJ (2011) Current trends in microsatellite genotyping. Molecular Ecology Resources 11: 591–611 GUICKING D, RANA TS, BLATTNER FR, AND WEISING K (2006) Microsatellite markers for the paleotropical pioneer tree genus Macaranga (Euphorbiaceae) and their cross-species transferability. Molecular Ecology Notes 6: 245–248 GUICKING D, KRÖGER-KILIAN T, WEISING K, AND BLATTNER FR (2008) Single nucleotide sequence analysis: a cost- and time- effective protocol for the analysis of microsatellite- and indel-rich chloroplast DNA regions. Molecular Ecology Resources 8: 62-65 GUICKING D, FIALA B, KRÖGER-KILIAN T, MOHAMED M, AND WEISING K (2013) High gene flow in two thrips-pollinated South- East Asian pioneer trees: genetic diversity and population structure of Macaranga hypoleuca and M. beccariana  (Euphorbiaceae). Botanical Journal of the Linnean Society 173: 606-621 GUILFORD P, PRAKASH S, ZHU JM, RIKKERINK E, GARDINER S, BASSETT H, AND FORSTER R (1997) Microsatellites in Malus x domestica (apple): abundance, polymorphism, and cultivar identification. Theoretical and Applied Genetics 94: 249-254 GUISINGER MM, CHUMLEY TW, KUEHL JV, BOORE JL, AND JANSEN RK (2010) Implications of the plastid genome sequence of Typha (Typhaceae, Poales) for understanding genome evolution in Poaceae. Journal of Molecular Evolution 70: 149-166 GUPTA M, CHYI YS, ROMERO-SEVERSON J, AND OWEN JL (1994) Amplification of DNA markers from evolutionary diverse genomes using single primers of simple-sequence repeats. Theoretical and Applied Genetics 89: 998–1006 GUPTA PK, RUSTGI S, SHARMA S, SINGH R, KUMAR N, AND BALYAN HS (2003) Transferable EST-SSR markers for the study of polymorphism and genetic diversity in bread wheat. Molecular Genetics and Genomics 270: 315-323 GUPTA S, AND PRASAD M (2009) Development and characterization of genic SSR markers in Medicago truncatula and their transferability in leguminous and non-leguminous species. Genome 52: 761–771 178 Literaturverzeichnis GUTIERREZ MV, PATTO MCV, HUGUET T, CUBERO JI, MORENO MT, AND TORRES AM (2005) Cross-species amplification of Medicago truncatula microsatellites across three major pulse crops. Theoretical and Applied Genetics 110: 1210–1217 HAMADA H, PETRINO MG, AND KAKUNAGA T (1982) A novel repeated element with Z-DNA-forming Potenzial is widely found in evolutionarily diverse eukaryotic genomes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 79: 6465-6469 HAMRICK JL, AND GODT MJW (1990) Allozyme diversity in plant species. Editors: BROWN, CLEGG, KAHLER & WEIR. In: Plant population genetics, breeding and genetic resources (Sinauer, Sunderland, MA): 43-63 HANCOCK JM (1996) Simple sequences and the expanding genome. BioEssays 18: 421–425 HARDY OJ, AND VEKEMANS X (2002) SPAGeDi: a versatile computer program to analyse spatial genetic structure at the individual or population levels. Molecular Ecology Notes 2: 618-620 HAUSDORF B, AND HENNING C (2010) Species delimitation using dominant and codominant multilocus markers. Systematic Biology 59: 491-503 HEDRICK PW (2001) Conservation genetics: where are we now? Trends in Ecology and Evolution 16: 629–636 HEESACKER A, KISHORE VK, GAO W, TANG S, KOLKMAN JM, GINGLE A, MATVIENKO M, KOZIK A, MICHELMORE RM, LAI Z, RIESEBERG LH, AND KNAPP SJ (2008) SSRs and INDELs mined from the sunflower EST database: abundance, polymorphisms, and cross- taxa utility. Theoretical and Applied Genetics 117: 1021-1029 HIREMATH PJ, FARMER A, CANNON SB, WOODWARD J, KUPADA H, TUTEJA R, KUMAR A, BHANUPRAKASH A, MULAOSMANOVIC B, GUJARIA N, KRISHNAMURTHY L, GAUR PM, KAVIKISHOR PB, SHAH T, SRINIVASAN R, LOHSE M, XIAO Y, TOWN CD, COOK DR, MAY GD, AND VARSHNEY RK (2011) Large-scale transcriptome analysis in chickpea (Cicer arietinum L.), an orphan legume crop of the semi-arid tropics of Asia and Africa. Plant Biotechnology Journal 10: 922–931 HMELJEVSKI KV, RESI A, MONTAGNA T, AND REIS MS (2011) Genetic diversity, genetic drift and mixed mating system in small subpopulations of Dyckia ibiramensis, a rare endemic bromeliad from Southern Brazil. Conservation Genetics 12: 761–769 HMELJEVSKI KV, CIAMPI MB, BALDAUF C, REIS MS, AND FORZZA RC (2013) Development of SSR markers for Encholirium horridum (Bromeliaceae) and transferability to other Pitcairnioideae. Applications in Plant Sciences 1: 1200445 HUGHES M, MÖLLER M, EDWARDS TJ, BELLSTEDT DU, AND VILLIERS M (2007) The impact of pollination syndrome and habitat on gene flow: a comparative study on two Streptocarpus (Gesneriaceae) species. American Journal of Botany 94: 1688- 1695 HUSON DH, AND BRYANT D (2006) Application of phylogenetic networks in evolutionary studies. Molecular Biology and Evolution 23: 254-267 INNAN H, TERAUCHI R, AND MIYASHITA NT (1997) Microsatellite polymorphism in natural populations of the wild plant Arabidopsis thaliana. Genetics 146: 1441–1452 JACOB H, LINDPAINTNER K, LINCOLN SE, KUSUMI K, BUNKER RK, MAO Y-P, GANTEN D, DZAU VJ, AND LANDER ES (1991) Genetic mapping of a gene causing hypertensive rat. Cell 67: 213-224 JARNE P, AND LAGODA PJL (1996) Microsatellites, from molecules to populations and back. Trends in Ecology and Evolution 11: 424–429 JENNINGS TN, KNAUS BJ, MULLINS TD, HAIG SM, AND CRONN RC (2011) Multiplexed microsatellite recovery using massively parallel sequencing. Molecular Ecology Resources 11: 1060-1067 JONES KC, LEVINE KF, AND BANKS JD (2002) Characterization of 11 polymorphic tetranucleotide microsatellites for forensic applications in California elk (Cervus elaphus canadensis). Molecular Ecology Notes 2: 425–427 JURKA J, AND PETHIYAGODA C (1995) Simple repetitive DNA sequences from primates: Compilation and analysis. Journal of Molecular Evolution 40: 120–126 KANG JH, KIM YK, PARK JY, NOH ES, JEONG JE, LEE YS, AND CHOI TJ (2013) Development of microsatellite markers for a hard- shelled mussel, Mytilus coruscus, and cross-species transfer. Genetics and Molecular Research 12: 4009-4017 KANTETY RV, LA ROTA M, MATTHEWS DE, AND SORRELLS ME (2002) Data mining for simple sequence repeats in expressed sequence tags from barley, maize, rize, sorghum and wheat. Plant Molecular Biology 48: 501–510 KARAN M, EVANS DS, REILLY D, SCHULTE K, WRIGHT C, INNES D, HOLTON TA, NIKLES DG, AND DICKINSON GR (2012) Rapid microsatellite marker development for African mahogany (Khaya senegalensis, Meliaceae) using next-generation sequencing and assessment of its intra-specific genetic diversity. Molecular Ecology Resources 12: 344-353 179 Literaturverzeichnis KARLIN EF, BOLES SB, AND SHAW AJ (2008) Resolving boundaries between species in Sphagnum section Subsecunda using microsatellite markers. Taxon 57: 1189–1200 KATO CY, NAGAI C, MOORE PH, FRANCIS Z, KIM MS, STEIGER DL, AND MING R (2004) Intra-specific DNA polymorphism in pineapple (Ananas comosus (L.) MERR.) assessed by AFLP markers. Genetic Resources and Crop Evolution 51: 815–825 KELKAR YD, TYEKUCHEVA S, CHIAROMONTE F, AND MAKOVA KD (2008) The genome-wide determinants of human and chimpanzee microsatellite evolution. Genome Research 18: 30–38 KIM C, JUNG J, AND CHOU HK (2012) Molecular identification of Schoenoplectiella species (Cyperaceae) by use of microsatellite markers. Plant Systematics and Evolution 298: 811-817 KIMURA M, AND CROW JF (1964) The number of alleles that can be maintained in a finite population. Genetics 49: 725–738 KIMURA M, AND OHTA T (1978) Stepwise mutation model and distribution of allelic frequencies in a finite population. Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 2868–2872 KINSUAT MJ, AND KUMAR SV (2007) Polymorphic microsatellite and cryptic simple repeat sequence markers in pineapples (Ananas comosus var. comosus). Molecular Ecology Notes 7: 1032–1035 KNAPIK EW, GOODMAN A, EKKER M, CHEVRETTE M, DELGADO J, NEUHAUSS S, SHIMODA N, DRIEVER W, FISHMAN MC, AND JACOB HJ (1998) A microsatellite genetic linkage map for zebrafish (Danio rerio). Nature Genetics 18: 338-343 KNIGHT ME, TURNER GF, RICO C, VAN OPPEN MJH, AND HEWITT GM (1998). Microsatellite analysis on captive Lake Malawi cichlids supports reproductive isolation by direct mate choice. Molecular Ecology 7: 1605-1610 KOFLER R, SCHLÖTTERER C, AND LELLEY T (2007) SciRoKo: a new tool for whole genome microsatellite search and investigation. Bioinformatics 23: 1683-1685 KRAMER AT, FANT JB, AND ASHLEY MV (2011) Influences of landscape and pollinators on population genetic structure: examples from three Penstemon (Plantaginaceae) species in the Great Basin. American Journal of Botany 95: 109-121 KRAPP F (2012) Phylogenie und Evolution der Gattung Dyckia (Bromeliaceae). Dissertation im Fachgebiet Systematik und Morphologie der Pflanzen, Universität Kassel KRAPP F, WÖHRMANN T, PINANGÉ DSB, BENKO-ISEPPON AM, HUETTEL B, AND WEISING K (2012) A set of plastid microsatellite loci for the genus Dyckia (Bromeliaceae) derived from 454-pyrosequencing. American Journal of Botany 99: e470-e473 KRAPP F, CRUZ GAS, WÖHRMANN T, BENKO-ISEPPON AM, AND WEISING K (2013) A set of variable plastid SSR loci for the genus Cryptanthus (Bromeliaceae). Research in Plant Biology 3: 18-21 KRAPP F, PINANGÉ DSB, BENKO-ISEPPON AM, LEME EMC, AND WEISING K (2014) Phylogeny and evolution of Dyckia (Bromeliaceae) inferred from chloroplast and nuclear sequences. Plant Systematics and Evolution, online first KUMPATLA SP, AND MUKHOPADHYAY S (2005) Mining and survey of simple sequence repeats in expressed sequence tags of dicotyledonous species. Genome 48: 985–998 LAGERCRANTZ U, ELLEGREN H, AND ANDERSSON L (1993) The abundance of various polymorphic microsatellite motifs differs between plants and vertebrates. Nucleic Acids Research 21: 1111-1115 LAROTA M, KANTETY RV, YU J-K, AND SORRELLS ME (2005) Nonrandom distribution and frequencies of genomic and EST- derived microsatellite markers in rice, wheat, and barley. BMC Genomics 6: 23 LATORRE C, GONZÁLEZ AL, QUADE J, FARIÑA JM, PINTO R, AND MARQUET PA (2011) Establishment and formation of fog- dependent Tillandsia landbeckii dunes in the Atacama Desert: evidence from radiocarbon and stable isotopes. Journal of Geophysical Research, Biogeosciences 116: G03033 LAVOR P, VAN DEN BERG C, AND VERSIEUX LM (2013) Transferability of 10 nuclear microsatellite primers to Vriesea minarum (Bromeliaceae), a narrowly endemic and threatened species from Brazil. Brazilian Journal of Botany 36: 165-168 LEE RM, THIMMAPURAM J, THINGLUM KA, GONG G, HERNANDEZ AG, WRIGHT CL, KIM RW, MIKEL MA, AND TRANEL PJ (2009) Sampling the waterhemp (Amaranthus tuberculatus) genome using pyrosequencing technology. Weed Science 57: 463- 469 LELLEY T, STACHEL M, GRAUSGRUBER H, AND VOLLMANN J (2000) Analysis of relationships between Aegilops tauschii and the D genome of wheat utilizing microsatellites. Genome 43: 661-668 LEMES MR, GRIBEL R, PROCTOR J, AND GRATTAPAGLIA D (2003) Population genetic structure of mahogany (Swietenia macrophylla KING, Meliaceae) across the Brazilian Amazon, based on variation at microsatellite loci: implications for conservation. Molecular Ecology 12: 2875-2883 180 Literaturverzeichnis LEPAIS O, AND BACLES CFE (2011) De novo discovery and multiplexed amplification of microsatellite markers for black alder (Alnus glutinosa) and related species using SSR-enriched shotgun pyrosequencing. Journal of Heredity 102: 627-632 LEVINSON G, AND GUTMAN GA (1987) Slipped-strand mispairing: a major mechanism for DNA sequence evolution. Molecular Biology and Evolution 4: 203-221 LIANG X, CHEN X, HONG Y, LIU H, ZHOU G, LI S, AND GUO B (2009) Utility of EST-derived SSR in cultivated peanut (Arachis hypogaea L.) and Arachis wild species. BMC Plant Biology 9: 35 LI YC, KOROL AB, FAHIMA T, BEILES A, AND NEVO E (2002) Microsatellites: genomic distribution, putative functions and mutational mechanisms: a review. Molecular Ecology 11: 2453-2465 LI YC, KOROL AB, FAHIMA T, NEVO E (2004). Microsatellites within genes: structure, function, and evolution. Society for Molecular Biology and Evolution 21: 991–1007 LI AQ, ZHAO CZ, WANG XJ, LIU ZJ, ZHANG LF, SONG GQ, YIN J, LI CS, XIA H, AND BI YP (2010) Identification of SSR markers using soybean (Glycine max) ESTs from globular stage embryos. Electronic Journal of Biotechnology 13 LITT M, AND LUTY JA (1989) A hypervariable microsatellite revealed by in vitro amplification of a dinucleotide repeat within the cardiac muscle actin gene. American Journal of Human Genetics 44: 397-401 LIU W, KANG M, TIAN H, AND HUANG H (2013) A range wide pattern of genetic diversity and population structure of Castanea mollissima populations inferred from nuclear and chloroplast microsatellites. Tree Genetics and Genomes 9: 975- 987 LOPEZ LCS, SILVA, BELTRÃO MG, LEANDRO RS, BARBOSA JEL, AND BESERRA EB (2011) Effect of tank bromeliad micro- environment on Aedes aegypti larval mortality. Hydrobiologia 665: 257-261 LOPEZ CASTEL A, CLEARY JD, AND PEARSON CE (2010) Repeat instability as the basis for human diseases and as a Potenzial target for therapy. Nature Reviews Molecular Cell Biology 11: 165–170 LOWE A, HARRIS S, AND ASHTON P (2004) Ecological genetics: design, analysis and application. Blackwell Science Ltd, Blackwell Publishing, MALDEN MA, USA; Oxford, UK; Carlton, Australia LUO H, LI Y, SUN C, WU Q, SONG J, SUN Y, STEINMETZ A, AND CHEN S (2010) Comparison of 454-ESTs from Huperzia serrata and Phlegmariurus carinatus reveals putative genes involved in lycopodium alkaloid biosynthesis and developmental regulation. BMC Plant Biology 10: 209 LUTHER HE (2012) An alphabetical list of bromeliad binominals, ed. 13. Marie Selby Botanical Gardens and Bromeliad Society International LUTY JA, GUO Z, WILLORD HF, LEDBETTER DH, LEDBETTER S, AND LITT M (1990) Five polymorphic microsatellite VNTRs on the human X chromosome. American Journal of Human Genetics 46: 776-783 MACDONALD ME, AMBROSE CM, DUYAO MP, MYERS RH, LIN C, SRINIDHI L, BARNES G, TAYLOR SA, JAMES M, GROOT N, MACFARLANE H, JENKINS B, ANDERSON MA, WEXLER NS, GUSELLA JF, BATES GP, BAXENDALE S, HUMMERICH H, KIRBY S, NORTH M, YOUNGMAN S, MOTT R, ZEHETNER G, SEDLACEK Z, POUSTKA A, FRISCHAUF A-M, LEHRACH H, BUCKLER AJ, CHURCH D, DOUCETTE-STAMM L, O'DONOVAN MC, RIBA-RAMIREZ L, SHAH M, STANTON VP, STROBEL SA, DRATHS KM, WALES JL, DERVAN P, HOUSMAN DE, ALTHERR M, SHIANG R, THOMPSON L, FIELDER T, WASMUTH JJ, TAGLE D, VALDES J, ELMER L, ALLARD M, CASTILLA L, SWAROOP M, BLANCHARD K, COLLINS FS, SNELL R, HOLLOWAY T, GILLESPIE K, DATSON N, SHAW D, AND HARPER PS (1993) A novel gene containing a trinucleotide repeat that is expanded and unstable on Huntington's disease chromosomes. Cell 72: 971-983 MADDEN TL (2002) The BLAST sequence analysis tool, chapter 16. In: The NCBI handbook (Internet), Editoren: MCENTYRE J. & OSTELL J., Bathesda (MD): National Center for Biotechnology Information (US) MAGAIN N, FORREST LL, SÉRUSIAUX E, AND GOFFINET B (2010) Microsatellite primers in the Peltigera dolichorhiza complex (lichenized ascomycete, Peltigerales). American Journal of Botany 97: e102-e104 MAIA VH, MATA CSD, FRANCO LO, CARDOSO MA, CARDOSO SRS, HEMERLY AS, AND FERREIRA PCG (2012) DNA barcoding Bromeliaceae: achievements and pitfalls. Public Library of Science One 7: e29877 MALAUSA T, GILLES A, MEGLÉCZ E, BLANQUART H, DUTHOY S, COSTEDOAT C, DUBUT V, PECH N, CASTAGNONE-SERENO P, DÉLYE C, FEAU N, FREY P, GAUTHIER P, GUILLEMAUD T, HAZARD L, LE CORRE V, LUNG-ESCARMANT B, MALÉ P-JG, FERREIRA S, AND MARTIN J-F (2011) High-throughput microsatellite isolation through 454 GS-FLX Titanium pyrosequencing of enriched DNA libraries. Molecular Ecology Resources 11: 638-644 MANTEL N (1967) The detection of disease clustering and a generalized regression approach. Cancer Research 27: 209- 220 MANTEL N, AND VALAND RS (1970) A technique of nonparametric multivariate analysis. Biometrics 26: 547-558 181 Literaturverzeichnis MARCOTTE EM, PELLEGRINI M, YEATES TO, AND EISENBERG D (1999) A census of protein repeats. Journal of Molecular Biology 293: 151–160 MARGULIES M, EGHOLM M, ALTMAN WE, ATTIYA S, BADER JS, BEMBEN LA, BERKA J, BRAVERMAN MS, CHEN Y-J, CHEN Z, DEWELL SB, DU L, FIERRO JM, GOMES XV, GODWIN BC, HE W, HELGESEN S, HO CH, IRZYK GP, JANDO SC, ALENQUER MLI, JARVIE TP, JIRAGE KB, KIM J-B, KNIGHT JR, LANZA JR, LEAMON JH, LEFKOWITZ SM, LEI M, LI J, LOHMAN KL, LU H, MAKHIJANI VB, MCDADE KE, MCKENNA MP, MYERS EW, NICKERSON E, NOBILE JR, PLANT R, PUC BP, RONAN MT, ROTH GT, SARKIS GJ, SIMONS JF, SIMPSON JW, SRINIVASAN M, TARTARO KR, TOMASZ A, VOGT KA, VOLKMER GA, WANG SH, WANG Y, WEINER MP, YU P, BEGLEY RF, AND ROTHBERG JM (2005) Genome sequencing in microfabricated high-density picolitre reactors. Nature 437: 376-380 MAUDET C, MILLER C, BASSANO B, BREITENMOSER-WÜRSTEN C, GAUTHIER D, OBEXER-RUFF G, MICHALLET J, TABERLET P, AND LUIKART G (2002) Microsatellite DNA and recent statistical methods in wildlife conservation management: applications in Alpine ibex [Capra ibex (ibex)]. Molecular Ecology 11: 421–436 MCCAULEY DE (1995) The use of chloroplast DNA polymorphism in studies of gene flow in plants. Trends in Ecology and Evolution 10: 198-202 MEIRMANS PG, AND HEDRICK PW (2011) Assessing population structure: Fst and related measures. Molecular Ecology Resources 11: 5-18 MERCIER H, AND KERBAUY GB (1993) Micropropagation of Dyckia macedoi - an endangered endemic Brazilian bromeliad. Botanic Gardens Micropropagation News 1: 70-72 MESSIER W, LI SH, AND STEWARD CB (1996) The birth of microsatellites. Nature 381: 483 METZGAR D, BYTOF J, AND WILLS C (2000) Selection against frameshift mutations limits microsatellite expansion in coding DNA. Genome Research 10: 72–80 MICHALAK I (2013) Evolution of Bromeliaceae – observations on three levels of diversity. Dissertation im Fachbereich 15 (Biowissenschaften) der JOHANN WOLFGANG GOETHE-Universität, Frankfurt am Main MILLER JC, AND TANKSLEY SD (1990) RFLP analysis of phylogenetic relationships and genetic variation in the genus Lycopersicon. Theoretical and Applied Genetics 80: 437-448 MOORE MJ, DHINGRA A, SOLTIS PE, SHAW R, FARMERIE WG, FOLTA KM, AND SOLTIS DE (2006) Rapid and accurate pyrosequencing of angiosperm plastid genomes. BMC Plant Biology 6: 17 MORGANTE M, AND OLIVIERI AM (1993) PCR-amplified microsatellites as markers in plant genetics. The Plant Journal 3: 175-182 MORGANTE M, HANAFEY M, AND POWELL W (2002) Microsatellites are preferentially associated with nonrepetitive DNA in plant genomes. Nature Genetics 30: 194-200 MOROZOVA O, AND MARRA MA (2008) Applications of next-generation sequencing technologies in functional genomics. Genomics 92: 255–264 MOYLE RL, CROWE ML, RIPI-KOIA J, FAIRBAIRN DJ, AND BOTELLA JR (2005) PineappleDB: an online pineapple bioinformatics resource. BMC Plant Biology 5: 21 MULLIS K, FALOONA F, SCHARF S, SAIKI R, HORN G, AND ERLICH H (1986) Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology 51: 263-273 NAGARAJ SH, GASSER RB, AND RANGANATHAN S (2006) A hitchhiker's guide to expressed sequence tag (EST) analysis. Briefings in Bioinformatics 8: 6-21 NEI M (1972) Genetic distance between populations. American Naturalist 106: 283-292 NEI M (1973) Analysis of gene diversity in subdivided populations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 70: 3321-3323 NEI M (1977) F-statistics and analysis of gene diversity in subdivided populations. Annals of Human Genetics 47: 253-259 NEI M (1987) Molecular evolutionary genetics. Columbia University Press, New York NIU B, FU L, SUN S, AND WEIZHONG L (2010) Artifical and natural duplicates in pyrosequencing reads of metagenomics data. BMC Bioinformatics 11: 187 NOVICK RR, DICK CW, LEMES MR, NAVARRO C, CACCONE A, AND BERMINGHAM E (2003) Genetic structure of Mesoamerican populations of big-leaf mahogany (Swietenia macrophylla) inferred from microsatellite analysis. Molecular Ecology 12: 2885-2893 NYBOM H, WEISING K, AND ROTTER B (2014) DNA fingerprinting in botany: past, present, future. Investigative Genetics 5: 1 182 Literaturverzeichnis ÖDER V (2012) Untersuchungen zur Kreuzbarkeit der Arten der Fosterella micrantha-Gruppe (Pitcairnioideae - Bromeliaceae). Bachelorarbeit im Fachgebiet Systematik und Morphologie der Pflanzen, Universität Kassel OLIVEIRA EJ, PÁDUA JG, ZUCCHI MI, VENCOVSKY R, AND VIEIRA MLC (2006) Origin, evolution and genome distribution of microsatellites. Genetics and Molecular Biology 29: 294-307 ONG WD, VOO CLY, AND KUMAR SV (2012) Development of ESTs and data mining of pineapple EST-SSRs. Molecular Biology Reports 39: 5889-5896 ORLÓCI L (1978) Multivariate analysis in vegetation research. 2nd ed. Junk, The Hague OSTRANDER EA, JONG PM, RINE J, AND DUYK G (1992) Construction of small-insert genomic DNA libraries highly enriched for microsatellite repeat sequences. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 89: 3419-3423 PAETKAU D (1999) Microsatellites obtained using strand extension: an enrichment protocol. Biotechniques 26: 690-697 PAGGI GM, PALMA-SILVA T, BERED F, CIDADE FW, SOUSA ACB, SOUZA AP, WENDT T, AND LEXER C (2008) Isolation and characterization of microsatellite loci in Pitcairnia albiflos (Bromeliaceae), an endemic bromeliad from the Atlantic Rainforest, and crossamplification in other species. Molecular Ecology Resources 8: 980–982 PALMA-SILVA C, CAVALLARI MM, BARBARÁ T, LEXER C, GIMENES MA, BERED F, AND BODANESE-ZANETTINI MH (2007) A set of polymorphic microsatellite loci for Vriesea gigantea and Alcantarea imperialis (Bromeliaceae) and cross-amplification in other bromeliad species. Molecular Ecology Notes 7: 654–657 PALMA-SILVA C, LEXER C, PAGGI GM, BARBARÁ T, BERED F, AND BODANESE-ZANETTINI MH (2009) Range-wide patterns of nuclear and chloroplast DNA diversity in Vriesea gigantea (Bromeliaceae), a neotropical forest species. Heredity 103: 503–512 PALMA-SILVA C, WENDT T, PINHEIRO F, BARBARÁ T, FAY MF, COZZOLINO S, AND LEXER C (2011) Sympatric bromeliad species (Pitcairnia spp.) facilitate tests of mechanisms involved in species cohesion and reproductive isolation in Neotropical inselbergs. Molecular Ecology 20: 3185-3201 PARDI F, SIBLY RM, WILKINSON MJ, AND WHITTAKER JC (2005) On the structural differences between markers and genomic AC microsatellites. Journal of Molecular Evolution 60: 688–693 PASHLEY CH, ELLIS JR, MCCAULEY DE, AND BURKE JM (2006) EST databases as a source for molecular markers: lessons from Helianthus. Journal of Heredity 97: 381–388 PEAKALL R, GILMORE S, KEYS W, MORGANTE M, AND RAFALSKI A (1998) Cross-species amplification of soybean (Glycine max) simple sequence repeats (SSRs) within the genus and other legume genera: implications for the transferability of SSRs in plants. Molecular Biology and Evolution 15: 1275–1287 PERRY JC, AND ROWE L (2011) Rapid microsatellite development for water striders by next-generation sequencing. Journal of Heredity 102: 125-129 PETERS J (2009) Revision of the genus Fosterella L.B.Sm. (Bromeliaceae). Dissertation im Fachgebiet Systematik und Morphologie der Pflanzen, Universität Kassel PETIT RJ, DEGUILLOUX M-F, CHAT J, GRIVET D, GARNIER-GÉRÉ P, AND VENDRAMIN G (2005) Standardizing for microsatellite length in comparisons of genetic diversity. Molecular Ecology 14: 885–890 PETREN K, GRANT BR, AND GRANT PR (1999) A phylogeny of Darwin`s finches based on microsatellite DNA length variation. Proceedings of the Royal Society of London 266: 321-329 PINANGÉ DSB (2013) Filogenia molecular e estudos populacionais no gênero Dyckia SCHULT. & SCHULT.f. (Bromeliaceae). Tese de Doutorado. Departamento de Genética, Laboratório de Genética e Biotecnologia Vegetal, Universidade Federal de Pernambuco, Pernambuco, Brasil PINTO LR, OLIVEIRA KM, ULIAN EC, GARCIA AAF, AND DE SOUZA AP (2004) Survey in the sugarcane expressed sequence tag database (SUCEST) for simple sequence repeats. Genome 47: 795–804 PONCET V, RONDEAU M, TRANCHANT C, CAYREL A, HAMON S, DE KOCHKO A, AND HAMON P (2006) SSR mining in coffee tree EST databases: Potenzial use of EST–SSRs as markers for the Coffea genus. Molecular Genetics and Genomics 276: 436–449 PONS O, AND PETIT RJ (1995) Estimation, variance and optimal sampling of gene diversity. I. Haploid locus. Theoretical and Applied Genetics 90: 462-470 PONS O, AND PETIT RJ (1996) Measuring and testing genetic differentiation with ordered versus unordered alleles. Genetics 144: 1237-1245 183 Literaturverzeichnis POOTAKHAM W, CHANPRASERT J, JOMCHAI N, SANGSRAKRU D, YOOCHA T, TRAGOONRUNG S, TANGPHATSORNRUANG S (2012) Development of genomic-derived simple sequence repeat markers in Hevea brasiliensis from 454 genome shotgun sequences. Plant Breeding 131: 555-562 POP M (2009) Genome assembly reborn: recent computational challenges. Brief Bioinformation 10: 354-366 POREMBSKI S, AND BARTHLOTT W (1999) Pitcairnia feliciana: the only indigenous African Bromeliaceae. Harvard Papers in Botany 4: 175–184 POWELL W, MORGANTE M, ANDRE C, MCNICOL JW, MACHRAY GC, DOYLE JJ, TINGEY SV, AND RAFALSKI JA (1995a) Hypervariable microsatellites provide a general source of polymorphic DNA markers for the chloroplast genome. Current Biology 5: 1023-1029 POWELL W, MORGANTE M, MCDEVITT R, VENDRAMIN GG, AND RAFALSKI JA (1995b) Polymorphic simple sequence repreat regions in chloroplast genomes: applications to the population genetics of pines. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 92: 7759-7763 PRITCHARD JK, STEPHENS M, AND DONNELLY PJ (2000) Inference of population structure using multilocus genotype data. Genetics 155: 945-959 PROCACCINI G, ORSINI L, RUGGIERO MV, AND SCARDI M (2001) Spatial patterns of genetic diversity in Posidonia oceanica, an endemic Mediterranean seagrass. Molecular Ecology 10: 1413–1421 PROVAN J, SORENZO N, WILSON NJ, GOLDSTEIN DB, POWELL W (1999) A low mutation rate for chloroplast microsatellites. Genetics 153: 943-947 QUELLER DC, STRASSMANN JE, HUGHES CR (1993) Microsatellites and kinship. Trends in Ecology and Evolution 8: 285–288 QUESEDA IM, AND GIANOLI E (2011) Crassulacean acid metabolism photosynthesis in Bromeliaceae: an evolutionary key innovation. Botanical Journal of the Linnean Society 104: 480–486 QUINTELA-SABARÍS C, VENDRAMIN GG, CASTRO-FERNÁNDEZ D, AND FRAGA MI (2010) Chloroplast microsatellites reveal that metallicolous populations of the mediterranean shrub Cistus ladanifer L. have multiple origins. Plant Soil 334: 161-174 RAJORA OP, AND RAHMAN MH (2003) Microsatellite DNA and RAPD fingerprinting, identification and genetic relationships of hybrid poplar (Populus x canadensis) cultivars. Theoretical and Applied Genetics 106: 470-477 RAMIREZ MORILLO IM, CHI MAY F, FERNANDEZ-CONCHA GC, MAY PAT F (2008) Reproductive biology of Hechtia schottii, a dioecious Bromeliaceae, in Mexico. Revista de Biología Tropical 56: 279-289 RASMUSSEN KK, AND KOLLMANN J (2008) Low genetic diversity in small peripheral populations of a rare European tree (Sorbus torminalis) dominated by clonal reproduction. Conservation Genetics 9: 1533-1539 RASSMANN K, SCHLÖTTERER C, AND TAUTZ D (1991) Isolation of simple sequence loci for use in polymerase chain reaction- based DNA fingerprinting. Electrophoresis 12: 113-118 RAYMOND M, AND ROUSSET F (1995) GENEPOP (version 1.2): population genetics software for exact tests and ecumenicism. Journal of Heredity 86: 248-249 REDD AJ, AGELLON AB, KEARNEY VA, CONTRERAS VA, KARAFET T, PARK H, DE KNIJFF P, BUTLER JM, AND HAMMER MF (2002) Forensic value of 14 novel STRs on the human Y chromosome. Forensic Science International 130: 97-111 REUSCH TBH, STAM WT, AND OLSEN JL (2000) A microsatellite-based estimation of clonal diversity and population subdivision in Zostera marina, a marine flowering plant. Molecular Ecology 9: 127–140 REX M (2007) Molekulare Untersuchungen zur Phylogenie der Gattung Fosterella (Bromeliaceae). Dissertation im Fachgebiet Systematik und Morphologie der Pflanzen, Universität Kassel REX M, PATZHOLT K, SCHULTE K, ZIZKA G, VÁSQUEZ R, IBISCH PL, AND WEISING K (2007) AFLP analysis of genetic relationships in the genus Fosterella L.B. SMITH (Pitcairnioideae, Bromeliaceae). Genome 50: 90-105 REX M, SCHULTE K, ZIZKA G, PETERS J, VÁSQUEZ R, IBISCH PL, AND WEISING K (2009) Phylogenetic analysis of Fosterella L.B. SM. (Pitcairnioideae, Bromeliaceae) based on four chloroplast DNA regions. Molecular Phylogenetics and Evolution 51: 472- 485 RÖDER MS, KORZUN V, WENDEHAKE K, PLASCHKE J, TIXIER M-H, LEROY P, AND GANAL MW (1998) A microsatellite map of wheat. Genetics 149: 2007–2023 RODRÍGUEZ D, GRAJAL-MARIN MJ, ISIDRÓN M, PETIT S, AND HORMAZA JI (2013a) Polymorphic microsatellite markers in pineapple (Ananas comosus (L.) MERRILL). Scientia Horticulturae 156: 127-130 184 Literaturverzeichnis RODRÍGUEZ M, RAU D, ANGIOI SA, BELLUCCI E, BITOCCHI E, NANNI L, KNÜPFFER H, NEGRI V, PAPA R, AND ATTENE G (2013b) European Phaseolus coccineus L. landraces: population structure and adaption, as revealed by cpSSR and phenotypic analysis. Public Library of Science One 8: e57337 RODRÍGUEZ-RAMILO ST, TORO MA, AND FERNANDEZ J (2009) Assessing population genetic structure via the maximisation of genetic distance. Genetic Selection Evolution 41: 49 ROHLF FJ (1998) NTSYSpc. Version 2.10p. Applied biostatistics. Setauket, NY, USA. Online available at http://www.exetersoftware.com/cat/ntsyspc/ntsyspc.html [accessed November 2003] ROHLF FJ (2000) NTSYSpc: numerical taxonomy and multivariate analysis system, version 2.1. Applied Biostatistic Inc, Port Jefferson, New York ROUSSET F (2000) Genetic differentiation between individuals. Journal of Evolutionary Biology 13: 58-62 ROZEN S, AND SKALETSKY HJ (2000) Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers. In: KRAWETZ S, and MISENER S (eds) Bioinformatics methods and protocols: Methods in molecular biology. Humana Press, Totowa, p. 365–386 RUAS CD, RUAS PM, AND CABRAL JRS (2001) Assessment of genetic relatedness of the genera Ananas and Pseudananas confirmed by RAPD markers. Euphytica 119: 245–252 RUGGIERO MV, TURK R, AND PROCACCINI G (2002) Genetic identity and homozygosity in North-Adriatic populations of Posidonia oceanica: an ancient, post-glacial clone? Conservation Genetics 3: 69-72 SAARINEN EV, AND AUSTIN JD (2010) When technology meets conservation: increased microsatellite marker production using 454 genome sequencing on the endangered Okaloosa darter (Etheostoma okaloosae). Journal of Heredity 101: 784– 788 SAHA MC, MIAN MAR, EUJAYL I, ZWONITZER JC,WANG LJ, AND MAY GD (2004). Tall fescue EST-SSR markers with transferability across several grass species. Theoretical and Applied Genetics 109: 783–791 SAITOU N, AND NEI M (1987) The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees. Molecular Biology and Evolution 4: 406-425 SANGER F, NICKLEN S, AND COULSON AR (1977) DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States 74: 5463-5467 SANTANA QC, COETZEE MPA, STEENKAMP ET, MLONYENI OX, HAMMOND GNA, WINGFIELD MJ, AND WINGFIELD BD (2009) Microsatellite discovery by deep sequencing of enriched genomic libraries. BioTechniques 46: 217-223 SARGENT DJ, PASSEY T, SURBANOVSKI N, LOPEZ GIRONA E, KUCHTA P, DAVIK J, HARRISON R, PASSEY A, WHITEHOUSE AB, AND SIMPSON DW (2012) A microsatellite linkage map for the cultivated strawberry (Fragaria × ananassa) suggests extensive regions of homozygosity in the genome that may have resulted from breeding and selection. Theoretical and Applied Genetics 124: 1229-1240 SARTHOU C, BOISSELIER-DUBAYLE MC, LAMBOURDIÉRE J, AND SAMADI S (2003) Polymorphic microsatellites for the study of fragmented populations of Pitcairnia geyskesii L.B. SMITH (Bromeliaceae), a specific saxicolous species of inselbergs in French Guiana. Molecular Ecology Notes 3: 221–223 SCAGLIONE D, ACQUADRO A, PORTIS E, TAYLOR CA, LANTERI S, AND KNAPP SJ (2009) Ontology and diversity of transcript- associated microsatellites mined from a globe artichoke EST database. BMC Genomics 10: 454 SCARANO FR (2002) Structure, function and floristic relationships of plant communities in stressful habitats marginal to the Brazilian Atlantic Rainforest. Annals of Botany 90: 517-524 SCHLÖTTERER C (2000) Evolutionary dynamics of microsatellite DNA. Chromosoma 109: 365-371 SCHOEBEL CN, BRODBECK S, BUEHLER D, CORNEJO C, GAJUREL J, HARTIKAINEN H, KELLER D, LEYS M, RÍCANOVÁ S, SEGELBACHER G, WERTH S, AND CSENCSICS D (2013) Lessons learned from microsatellite development for nonmodel organisms using 454 pyrosequencing. Journal of Evolutionary Biology 26: 600-611 SCHUELKE M (2000) An economic method for the fluorescent labeling of PCR fragments. Nature Biotechnology 18: 233- 234 SCHULTE K, BARFUSS MHJ, AND ZIZKA G (2009) Phylogeny of Bromelioideae (Bromeliaceae) inferred from nuclear and plastid DNA loci reveals the evolution of the tank habit within the subfamily. Molecular Phylogenetics and Evolution 51: 327–339 SCHÜTZ N (2012) Systematics and evolution of the genus Deuterocohnia MEZ (Bromeliaceae). Dissertation im Fachgebiet Systematik und Morphologie der Pflanzen, Universität Kassel 185 Literaturverzeichnis SCHWENGEL DA, JEDLICKA AE, NANTHAKUMAR EJ, WEBER JL, AND LEVITT RC (1994) Comparison of fluorescence-based semi- automated genotyping of multiple microsatellite loci with autoradiographic techniques. Genomics 22: 46–54 SCOTT KD, EGGLER P, SEATON G, ROSSETTO M, ABLETT EM, LEE LS, AND HENRY RJ (2000) Analysis of SSRs derived from grape ESTs. Theoretical and Applied Genetics 100: 723-726 SEXTON GJ, FRERE CH, DIETERS MJ, GODWIN ID, AND PRENTIS PJ (2010) Development and characterization of microsatellite loci for Khaya senegalensis (Meliaceae). American Journal of Botany 97: e111-e113 SGORBATI S, LABRA M, GRUGNI E, BARCACCIA G, GALASSO G, BONI U, MUCCIARELLI M, CITTERIO S, BENAVIDES IRAMÁTEGUI A, VENERO GONZALES L, AND SCANNERINI S (2004) A survey of genetic diversity and reproductive biology of Puya raimondii (Bromeliaceae), the endangered queen of the Andes. Plant Biology 6: 222-230 SHAW J, LICKEY EB, SCHILLING EE, SMALL RL (2007) Comparison of whole chloroplast genome sequences to choose noncoding regions for phylogenetic studies in angiosperms: the tortoise and the hare III. American Journal of Botany 94: 275-288 SHENDURE J, PORRECAL GJ, REPPAS NB, LIN X, MCCUTCHEON, ROSENBAUM AM, WANG MD, ZHANG K, MITRA RD, AND CHURCH GM (2005) Accurate multiplex polony sequencing of an evolved bacterial genome. Science 309: 1728-1732 SHENDURE J, AND LI H (2008) Next-generation DNA sequencing. Nature Biotechnology 26: 1135-1145 SHODA M, URASAKI N, SAKIYAMA S, TERAKAMI S, HOSAKA F, SHIGETA N, NISHITANI C, AND YAMAMOTO T (2012) DNA profiling of pineapple cultivars in Japan discriminated by SSR markers. Breeding Science 62: 352–359 SHOKEEN B, CHOUDHARY S, SETHY NK, AND BHATIA S (2011) Development of SSR and gene-targeted markers for construction of a framework linkage map of Catharanthus roseus. Annals of Botany 108: 321-36 SILVEIRA FAO, SANTOS JC, AND FERNANDES GW (2010) Seed germination ecophysiology of the wild pineapple, Ananas ananassoides (BAKER) L.B.SM. (Bromeliaceae). Acta Botanica Brasilica 24: 1100-1103 SILVESTRO D, ZIZKA G, AND SCHULTE K (2014) Disentangling the effects of key innovations on the diversification of Bromelioideae (Bromeliaceae). Evolution 68: 163-75 SIMKO I (2009) Development of EST-SSR markers for the study of population structure in lettuce (Lactuca sativa L.). Journal of Heredity 100: 256-262 SIQUEIRA-FILHO JA, SANTOS AMM, LEME MC, AND CABRAL JS (2006) Atlantic forest fragments and bromeliads in Pernambuco and Alagoas: distribution, composition, richness and conservation. In: SIQUEIRA-FILHO JA, AND LEME EM (eds) Fragmentos de Mata Atlantica do Nordeste, Biodiversidade, Conservação e suas Bromélias. ANDREA JAKOBSSON ESTÚDIO, SKINNER DM, BEATTIE WG, BLATTNER FR, STARK BP, AND DAHLBERG JE (1974) The repeat sequence of a hermit crab satellite deoxyribonucleic acid is (TAGG)n x (ATCC)n. Biochemistry 13: 3930–3937 SLATKIN M (1985) Rare alleles as indications of gene flow. Evolution 38: 53-65 SLATKIN M (1995) A measure of population subdivision based on microsatellite allele frequencies. Genetics 139: 457-462 SMIT AFA, HUBLEY R, AND GREEN P (1996-2010) RepeatMasker Open-3.0. Verfügbar unter http://www.repeatmasker.org SMITH LB (1934) Geographical evidence on the lines of evolution in the Bromeliaceae. Botanischer Jahresbericht 66: 446– 468 SMITH LB, AND DOWNS RJ (1974) Pitcairnioideae (Bromeliaceae). Flora Neotropica Monographs 14: 1–662 SMITH LB, AND DOWNS RJ (1979) Bromelioideae (Bromeliaceae). Flora Neotropica Monographs 14: 1493-2142 SOLIVA M, AND WIDMER A (2003) Gene flow across species boundaries in sympatric, sexually deceptive Ophrys (Orchidaceae) species. Evolution 57: 2252–2261 SOMME L, RAABOVA J, JACQUEMART AL, AND RASPÉ O (2012) Development and multiplexing of microsatellite markers using pyrosequencing in the clonal plant Comarum palustre (Rosaceae). Molecular Ecology Resources 12: 91-97 SONAH H, DESHMUKH RK, SHARMA A, SINGH VP, GUPTA DK, GACCHE RN, RANA JC, SINGH NK, AND SHARMA TR (2011) Genome-wide distribution and organization of microsatellites in plants: an insight into marker development in Brachypodium. Public Library of Science One 6: e21298 SONG Q, JIA G, ZHU Y, GRANT D, NELSON RT, HWANG E-Y, HYTEN DL, AND CREGAN PB (2010) Abundance of SSR motifs and development of candidate polymorphic SSR markers (BARCSOYSSR_1.0) in soybean. Crop Science 50: 1950-1960 SORANZO N, PROVAN J, AND POWELL W (1999) An example of microsatellite length variation in the mitochondrial genome of conifers. Genome 42: 158-161 186 Literaturverzeichnis STEBBINS GL (1970) Adaptive radiation of reproductive characteristics in angiosperms, I: pollination mechanisms. Annual Review of Ecology and Systematics 1: 307-326 STOECKEL S, GRANGE J, FERNANDEZ-MANJARRES JF, BILGER I, FRASCARIA-LACOSTE N, AND MARIETTE S (2006) Heterozygote excess in a self-incompatible and partially clonal forest tree species – Prunus avium L. Molecular Ecology 15: 2109-2118 SWOFFORT DL (2003) PAUP*. Phylogenetic analysis using parsimony (*and other methods). Version 4.0 Beta 10. Sinauer Associations, Sunderland, Massachusetts SZCZECIŃSKA M, KWAŚNIEWSKI M, SAWICKI J, CHWIAŁKOWSKA K, SZANDAR K, AND PISAREK W (2012) Development of microsatellite markers using pyrosequencing in Galium trifidum (Rubiaceae), a rare species in Central Europe. International Journal of Molecular Science 13: 9893-9899 TAKAYAMA K, LÓPEZ PS, KÖNIG C, KOHL G, NOVAK J, AND STUESSY TF (2011) A simple and cost-effective approach for microsatellite isolation in non-model plant species using small-scale 454 pyrosequencing. Taxon 60: 1442-1449 TANG S, OKASHAH RA, CORDONNIER-PRATT M-M, PRATT LH, JOHNSON VE, TAYLOR CA, ARNOLD ML, AND KNAPP SJ (2003) EST and EST-SSR marker resources for Iris. BMC Plant Biology 9: 72 TANGPHATSORNRUANG S, SOMTA P, UTHAIPAISANWONG P, CHANPRASERT J, SANGSRAKRU D, SEEHALAK W, SOMMANAS W, TRAGOONRUNG S, AND SRINIVES P (2009) Characterization of microsatellites and gene contents from genome shotgun sequences of mungbean (Vigna radiata (L.)WILCZEK). BMC Plant Biology 9: 137 TAKEZAKI N, AND NEI M (1996) Genetic distance and reconstruction of phylogenetic trees from microsatellite DNA. Genetics 144: 389-399 TAUTZ D (1989) Hypervariability of simple sequences as a general source for polymorphic DNA markers. Nucleic Acids Research 17: 6463–6471 TAUTZ D, AND RENZ M (1984) Simple sequences are ubiquitous repetitive components of eukaryotic genomes. Nucleic Acids Research 12: 4127–4138 TAUTZ D, AND SCHLÖTTERER C (1994) Simple sequences. Current Opinion in Genetics and Development 4: 832–837 TAYLOR JS, DURKIN JMH, AND BREDEN F (1999) The death of a microsatellite: a phylogenetic perspective on microsatellite interruptions. Molecular Biology and Evolution 16: 567-572 TEL-ZUR N, ABBO S, MYSLABODSKI D, AND MIZRAHI Y (1999) Modified CTAB procedure for DNA isolation from epiphytic cacti of the genera Hylocereus and Selenicereus (Cactaceae). Plant Molecular Biology Reporter 17: 249-254 TEMPLETON AR, CRANDALL KA, AND SING CF (1992) A cladistic analysis of phenotypic associations with haplotypes inferred from restriction endonuclease mapping and DNA sequence data. III. Cladogram estimation. Genetics 132: 619-633 TERRY RG, BROWN GK, AND OLMSTEAD RG (1997) Examination of subfamilial phylogeny in Bromeliaceae using comparative sequencing of the plastid locus ndhF. American Journal of Botany 84: 664–670 THIEL T, MICHALEK W, VARSHNEY R, AND GRANER A (2003) Exploiting EST databases for the development and characterization of gene-derived SSR-markers in barley (Hordeum vulgare L.). Theoretical and Applied Genetics 106: 411- 422 TÓTH G, GASPARI Z, AND JURKA J (2000) Microsatellites in different eukaryotic genomes: survey and analysis. Genome Research 10: 967-981 VAN BELKUM A, SCHERER S, VAN ALPHEN L, AND VERBRUGH (1998) Short-sequence DNA repeats in prokaryotic genomes. Microbiology and Molecular Biology Reviews 62: 275–293 VANHAECKE D, GARCIA DE LEANIZ C, GAJARDO G, YOUNG K, SANZANA J, ORELLANA G, FOWLER D, HOWES P, MONZON-ARGUELLO C, AND CONSUEGRA S (2012) DNA barcoding and microsatellites help species delimitation and hybrid identification in endangered galaxiid fishes. Public Library of Science One 7: e32939 VARSHNEY RK, GRANER A, AND SORRELLS ME (2005) Genic microsatellite markers in plants: features and applications. Trends in Biotechnology 23: 48–55 VECCHIETTI A, LAZZARI B, ORTUGNO C, BIANCHI F, MALINVERNI R, CAPRERA A, MIGNANI I, AND POZZI C (2009) Comparative analysis of expressed sequence tags from tissues in ripening stages of peach (Prunus persica L. BATSCH). Tree Genetics and Genomics 5: 377-391 VERSIEUX LM, AND WENDT T (2007) Bromeliaceae diversity and conservation in Minas Gerais state, Brazil. Biodiversity and Conservation 16: 2989–3009 187 Literaturverzeichnis VERSIEUX LM, BARBARÁ T, WANDERLEY MGL, CALVENTE A, FAY MF, AND LEXER C (2012) Molecular phylogenetics of the Brazilian giant bromeliads (Alcantarea, Bromeliaceae): implications for morphological evolution and biogeography. Molecular Phylogenetics and Evolution 64: 177–189 VETTORI C, VENDRAMIN GG, ANZIDEI M, PASTORELLI R, PAFFETTI D, AND GIANNINI R (2004) Geographic distribution of chloroplast variation in Italian populations of beech (Fagus sylvatica L.). Theoretical and Applied Genetics 109: 1-9 VOS P, HOGERS R, BLEEKER M, REIJANS, VAN DE LEE T, HORNES M, FRITERS A, POT J, PALEMAN J, KUIPER M, AND ZABEAU M (1995) AFLP: a new technique for DNA fingerprinting. Nucleic Acids Research 23: 4407–4414 WAGNER N (2012) Phylogeographie und Populationsgenetik der Arten der Gattung Fosterella (Bromeliaceae) in den südamerikanischen Anden. Dissertation im Fachgebiet Systematik und Morphologie der Pflanzen, Universität Kassel WAGNER N, SILVESTRO D, BRIE D, IBISCH PL, ZIZKA G, WEISING K, AND SCHULTE K (2013) Spatio-temporal evolution of Fosterella (Bromeliaceae) in the Central Andean biodiversity hotspot. Journal of Biogeography 40: 869-880 WAINWRIGHT BJ, ARLYZA IS, AND KARL SA (2013) Isolation and characterization of twenty-one polymorphic microsatellite loci for Polycarpa aurata using third generation sequencing. Conservation Genetics and Resources 5: 671–673 WANG Z, WEBER JL, ZHONG G, AND TANKSLEY SD (1994) Survey of plant short tandem DNA repeats. Theoretical and Applied Genetics 88: 1-6 WANG B, EKBLOM R, CASTOE TA, JONES EP, KOZMA R, BONGCAM-RUDLOFF E, POLLOCK DD, AND HÖGLUND J (2012) Transcriptome sequencing of black grouse (Tetrao tetrix) for immune gene discovery and microsatellite development. Open Biology 2: 120054 WATSON L, AND DALLWITZ MJ (1992 onwards) The families of flowering plants: descriptions, illustrations, identification, and information retrieval. Version: 19th October 2013. http://delta-intkey.com WEBER JL (1990) Informativeness of human (dC-dA)n (dG-dT)n polymorphisms. Genomics 7: 524–530 WEISING K, WEIGAND F, DRIESEL AJ, KAHL G, ZISCHLER H, EPPLEN JT (1989) Polymorphic simple GATA/GACA repeats in plant genomes. Nucleic Acids Research 17: 10128 WEISING K, KAEMMER D, WEIGAND F, EPPLEN JT, AND KAHL G (1992) Oligonucleotide fingerprinting reveals various probe- dependent levels of informativeness in chickpea (Cicer arietinum). Genome 35: 436-442 WEISING K, AND GARDNER RC (1999) A set of conserved PCR primers for the analysis of simple sequence repeat polymorphisms in chloroplast genomes of dicotyledonous angiosperms. Genome 42: 9–19 WEISING K, NYBOM H, WOLFF K, AND KAHL G (2005) DNA fingerprinting in plants: principles, methods and applications, 2nd edition. TAYLOR & FRANCIS, Boca Raton, Florida WILLIAMS JGK, KUBELIK AR, LIVAK KJ, RAFALSKI JA, AND TINGEY SV (1990) DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic Acids Research 18: 6231–6235 WÖHRMANN T (2008) Populationsgenetik von Prunus cerasifera in Nord-Iran. Diplomarbeit im Fachgebiet Systematik und Morphologie der Pflanzen, Universität Kassel WÖHRMANN T, GUICKING D, KHOSHBAKHT K, AND WEISING K (2011) Genetic variability in wild populations of Prunus divaricata LEDEB. in northern Iran evaluated by EST-SSR and genomic SSR marker analysis. Genetic Resources and Crop Evolution 58: 1157–1167 WÖHRMANN T, AND WEISING K (2011) In silico mining for simple sequence repeat loci in a pineapple expressed sequence tag database and cross-species amplification of EST-SSR markers across Bromeliaceae. Theoretical and Applied Genetics 123: 635-647 WÖHRMANN T, WAGNER N, KRAPP F, HUETTEL B, AND WEISING K (2012) Development of microsatellite markers in Fosterella rusbyi (Bromeliaceae) using 454-pyrosequencing. American Journal of Botany 99: e160-e163 WÖHRMANN T, PINANGÉ DSB, KRAPP F, BENKO-ISEPPON AM, HUETTEL B, AND WEISING K (2013) Development of 15 nuclear microsatellite markers in the genus Dyckia (Pitcairnioideae; Bromeliaceae) using 454 pyrosequencing. Conservation Genetics Resources 5: 81-84 WRIGHT S (1931) Evolution in mendelian populations. Genetics 16: 97-159 WRIGHT S (1946) Isolation by distance under diverse systems of mating. Genetics 28: 139-156 WRIGHT S (1951) The genetical structure of populations. Annals of Eugenics 15: 323-354 WRIGHT S (1965) The interpretation of population structure by F-statistics with special regard to systems of mating. Evolution 19: 395-420 188 Literaturverzeichnis WRIGHT S (1969) Evolution and the genetics of populations. Volume 2. The theory of gene frequencies, University of Chicago Press WU CI (2001) The genic view of the process of speciation. Journal of Evolutionary Biology 14: 851-865 XU Y, MA R-C, XIE H, LIU J-T, CAO M-Q (2004) Development of SSR markers for the phylogenetic analysis of almond trees from China and the Mediterraneaen region. Genome 47: 1091-1104 YEH FC, YANG R-C, BOYLE TBJ, YE Z-H, AND MAO JX (1997) POPGENE, the user-friendly shareware for population genetic analysis. Molecular Biology and Biotechnology Centre, University of Alberta, Canada YOU FM, HUO N, GU YQ, LUO M-C, MA Y, HANE D, LAZO GR, DVORAK J, AND ANDERSON OD (2008) BatchPrimer3: a high throughput web application for PCR and sequencing primer design. BMC Bioinformatics 9: 253 YOUNG A, BOYLE T, AND BROWN T (1996) The population genetic consequences of habitat fragmentation for plants. Trends in Ecology and Evolution 11: 413-418 ZALAPA JE, CUEVAS H, ZHU H, STEFFAN S, SENALIK D, ZELDIN E, MCCROWN B, HARBUT R, AND SIMON P (2012) Using next- generation sequencing approaches to isolate simple sequence repeat (SSR) loci in the plant sciences. American Journal of Botany 99: 1-16 ZANE L, BARGELLONI L, AND PATARNELLO T (2002) Strategies for microsatellite isolation: a review. Molecular Ecology 11: 1–16 ZANELLA CM, BRUXEL M, PAGGI GM, GOETZE M, BUTTOW MV, CIDADE FW, AND BERED F (2011) Genetic structure and phenotypic variation in wild populations of the medicinal tetraploid species Bromelia antiacantha (Bromeliaceae). American Journal of Botany 98: 1511–1519 ZANELLA CM, JANKE A, PAGGI GM, GOETZE M, REIS MS, AND BERED F (2012a) Microsatellites in the endangered species Dyckia distachya (Bromeliaceae) and cross-amplification in other bromeliads. International Journal of Molecular Science 13: 15859-15866 ZANELLA CM, JANKE A, PALMA-SILVA C, KALTCHUK-SANTOS E, PINHEIRO FG, PAGGI GM, SOARES LES, GOETZE M, BÜTTOW MV, AND BERED F (2012b) Genetics, evolution and conservation of Bromeliaceae. Genetics and Molecular Biology 35: 1020-1026 ZENG S, XIAO G, GUO J, FEI Z, XU Y, ROE BA, AND WANG Y (2010) Development of a EST dataset and characterization of EST- SSRs in a traditional Chinese medicinal plant, Epimedium sagittatum (SIEB. ET ZUCC.) MAXIM. BMC Genomics 11: 94 ZENK FL (2012) Entwicklung von Mikrosatellitenmarkern in Deuterocohnia longipetala MEZ (Bromeliaceae) auf der Basis von DNA-Sequenzdaten aus der 454-Pyrosequenzierung. Bachelor-Arbeit im Fachgebiet Systematik und Morphologie der Pflanzen, Universität Kassel ZHANG LY, BERNARD M, LEROY P, FEUILLET C, AND SOURDILLE P (2005) High transferability of bread wheat EST-derived SSRs to other cereals. Theoretical and Applied Genetics 111: 677–687 ZHANG R, ZHU A, WANG X, YU J, ZHANG H, GAO J, CHENG Y, AND DENG X (2010) Development of Juglans regia SSR markers by data mining of the EST database. Plant Molecular Biology Reporter 28: 646–653 ZHANG Z, SCHWARTZ S, WAGNER L, AND MILLER W (2000) A greedy algorithm for aligning DNA sequences. Journal of Computational Biology 7: 203-214 ZHENG X, PAN C, DIAO Y, YOU Y, YANG C, AND HU Z (2013) Development of microsatellite markers by transcriptome sequencing in two species of Amorphophallus (Araceae). BMC Genomics 14: 490 ZHOU H-F, XIE Z-W, AND GE S (2003) Microsatellite analysis of genetic diversity and population genetic structure of a wild rice (Oryza rufipogon GRIFF.) in China. Theoretical and Applied Genetics 107: 332-339 ZHOU XG, REN LF, LI YT, ZHANG M, YU YD, AND YU J (2010) The next-generation sequencing technology: a technology review and future perspective. Science China Life Sciences 53: 44-57 ZIETKIEWICZ E, RAFALSKI A, AND LABUDA D (1994) Genome fingerprinting by simple sequence repeat (SSR)-anchored polymerase chain reaction amplification. Genomics 20: 176–183 ZIZKA G, SCHMIDT M, SCHULTE K, NOVOA P, PINTO R, AND KÖNIG K (2009) Chilean Bromeliaceae: diversity, distribution and evaluation of conservation status. Biodiversity and Conservation 18: 2449–2471 ZOTZ G, AND THOMAS V (1999) How much water is in the tank? Model calculations of two epiphytic bromeliads. Annals of Botany 83: 183-192 189 Anhang 7. Anhang Tabelle T1: Verwendetes Pflanzenmaterial, alphabetisch aufgelistet. Abkürzungen der Länder: AR: Argentinien, BO: Bolivien, BR: Brasilien, CL: Chile, CO, Kolumbien, DO: Dominikanische Republik, EC: Ecuador, GF: Französisch-Guayana, GT: Guatemala, HN: Honduras, MX: Mexiko, PA: Panama, PE: Peru, PY: Paraguay, UY: Uruguay, VE: Venezuela. Abkürzungen der Unterfamilien: BROM: Bromelioideae, PUYO: Puyoideae, PITC: Pitcairnioideae, NAVI: Navioideae, HECH: Hechtioideae, TILL: Tillandsioideae, LIND: Lindmanioideae, BROC: Brocchinioideae. Abkürzungen der Botanischen Gärten: ABG: Alter Botanischer Garten der Georg-Friedrich-Universität Göttingen, BGB: Botanischen Garten Berlin-Dahlem, BGHD: Botanischer Garten Heidelberg, BGK: Botanischer Garten der Christian-Albrechts-Universität zu Kiel, BGKS: Botanischer Garten der Universität Kassel, BGOS: Botanischer Garten der Universität Osnabrück, BGRU: Botanischer Garten der Ruhr-Universität Bochum, BGTD: Botanischer Garten der Universität Darmstadt, BGU: Botanischer Garten der Universität Ulm, FAN: Fundación Amigos de la Naturaleza (Santa Cruz, BO), FRP: Palmengarten der Stadt Frankfurt am Main, Leme: Privatsammlung von Dr. Elton Leme (Teresópolis, BR), HERRH: Herrenhäuser Gärten Hannover, WI: Gewächshaus für tropische Nutzpflanzen der Universität Kassel (in Witzenhausen), WU: Botanischer Garten der Universität Wien. Abkürzungen der Herbarien: ASE: Herbarium der Universität Sergipé, FAN: Fundación Amigos de la Naturaleza (Santa Cruz, BO), FR: Herbarium Senckenbergianum in Frankfurt, HD: Herbarium des Botanischen Gartens Heidelberg, LPB: Herbario Nacional de Bolivia (Universidad Mayor de San Andrés, La Paz), SEL: Marie Selby Botanical Gardens (U.S.A. Florida, Sarasota), UFP: Herbarium der Universität Pernambuco, USZ: Museo de Historia Natural Noel Kempff Mercado (Universidad Autónoma Gabriel René Moreno, BO, Santa Cruz) . Natürliche Populationen und deren im Ergebnisteil verwendete Namen sind in der 2. Spalte jeweils durch Anführungszeichen markiert, der Probenumfang ist zusätzlich in Klammern angegeben. Sonstige Zeichen und Abkürzungen: ~ : Daten nicht vorhanden, s.n. : ohne Nummer. Artname Autor ID-Nummer Unterfamilie Sammler, bzw. Sammlernummer Garten-ID / Herbarbeleg Herkunft Breitengrad / Längengrad Acanthostachys pitcairnioides (Mez) Rauh & Barthlott BT_21 BROM Leme (483) BGHD 102584 / HD 607678 BR exakte Koordinaten fehlen Aechmea allenii Smith BT_22 BROM Rauh (R:58706) BGHD 130247 / ~ PA, Coclé, El Valle exakte Koordinaten fehlen Aechmea biflora (Smith) Smith & Spencer BT_23 BROM Prinsler BGHD 104024 / HD 130215 EC exakte Koordinaten fehlen Aechmea chantinii (Carriére) Baker BT_24 BROM von Bismarck BGHD 130293 / ~ PE, Taraporto exakte Koordinaten fehlen Aechmea kertesziae Reitz F 9a BROM (s.n.) FRP 98-16935-3 / FR Zizka 1177 ~ exakte Koordinaten fehlen Aechmea orlandiana var. orlandiana Smith BT_26 BROM (s.n.) BGHD 104241 / ~ ~ exakte Koordinaten fehlen Ananas ananassoides (Baker) Smith BT_27 BROM Maas BGHD 107787 / ~ BR, Amazonas, Itacoatiara exakte Koordinaten fehlen " BT_87 BROM (s.n.) FRP R 111 / ~ ~ exakte Koordinaten fehlen Ananas bracteatus (Lindley) Schultes f. BT_15 BROM (s.n.) WI 90-G-810 / ~ ~ exakte Koordinaten fehlen " BT_74 BROM (s.n.) HERRH 0000-G-32 / ~ ~ exakte Koordinaten fehlen " BT_28 BROM (s.n.) BGHD 107470 / ~ ~ exakte Koordinaten fehlen " BT_80 BROM (s.n.) ABG-0080 / ~ ~ exakte Koordinaten fehlen " BT_73 BROM (s.n.) HERRH 0000-G-438 / ~ ~ exakte Koordinaten fehlen Ananas comosus (Linnaeus) Merrill BT_19 BROM (s.n.) WI 90-G-813 / ~ ~ exakte Koordinaten fehlen " BT_18 BROM (s.n.) WI 90-G-814 / ~ ~ exakte Koordinaten fehlen " BT_77 BROM (s.n.) HERRH 0000-G-33 / ~ ~ exakte Koordinaten fehlen " BT_81 BROM (s.n.) ABG-0081 / ~ ~ exakte Koordinaten fehlen " BT_82 BROM (s.n.) ABG-0082 / ~ ~ exakte Koordinaten fehlen " BT_85 BROM (s.n.) BGKS 0085 / ~ ~ exakte Koordinaten fehlen Ananas comosus `cayenne` (Linnaeus) Merrill BT_20 BROM (s.n.) WI 90-G-815 / ~ ~ exakte Koordinaten fehlen Ananas comosus `queen` (Linnaeus) Merrill BT_17 BROM (s.n.) WI 90-G-812 / ~ ~ exakte Koordinaten fehlen Ananas comosus `smooth cayenne` (Linnaeus) Merrill BT_79 BROM (s.n.) HERRH 0000-G-439 / ~ ~ exakte Koordinaten fehlen 190 Anhang Artname Autor ID-Nummer Unterfamilie Sammler, bzw. Sammlernummer Garten-ID / Herbarbeleg Herkunft Breitengrad / Längengrad Ananas comosus `variegata` (Linnaeus) Merrill BT_75 BROM (s.n.) HERRH 0000-G-440 / ~ ~ exakte Koordinaten fehlen Ananas comosus var. erectifolius (Smith) Coppens & Leal BT_89 BROM Benko-Iseppon BGKS 0089 / ~ BR exakte Koordinaten fehlen Ananas comosus var. porteanus Koch BT_76 BROM (s.n.) HERRH 0000-G-34 / ~ ~ exakte Koordinaten fehlen Ananas fritzmuelleri Camargo BT_88 BROM (s.n.) FRP R 104 / ~ ~ exakte Koordinaten fehlen Ananas lucidus Miller BT_83 BROM (s.n.) ABG-0083 / ~ ~ exakte Koordinaten fehlen Ananas spec. Miller BT_16 BROM (s.n.) WI 90-G-811 / ~ ~ exakte Koordinaten fehlen Ananas nanus (Smith) Smith BT_78 BROM (s.n.) HERRH 0000-G-35 / ~ ~ exakte Koordinaten fehlen " BT_29 BROM Prinsler BGHD 107158 / HD 600089 ~ exakte Koordinaten fehlen " BT_84 BROM (s.n.) ABG-0084 / ~ ~ exakte Koordinaten fehlen " BT_90 BROM Benko-Issepon BGKS 0090 / ~ BR exakte Koordinaten fehlen " BT_86 BROM (s.n.) FRP R 107 / ~ ~ exakte Koordinaten fehlen Billbergia pyramidalis var. concolor Smith BT_30 BROM (s.n.) BGHD 130413 / ~ ~ exakte Koordinaten fehlen Brocchinia acuminata Smith BT_1 BROC (s.n.) FRP 95-12994-4-60 / ~ ~ exakte Koordinaten fehlen Brocchinia micrantha (Baker) Mez BT_31 BROC Rauh (R:69323) BGHD 130575 / HD 602933 VE, Bolivar, La Escalera exakte Koordinaten fehlen Brocchinia spec. (Baker) Mez BT_94 BROC (s.n.) BGRU / (s.n.) ~ exakte Koordinaten fehlen Bromelia balansae Mez BT_92 BROM (s.n.) WU AB 482-1 / ~ ~ exakte Koordinaten fehlen Bromelia laciniosa Martius ex Schultes f. BT_32 BROM Marnier-Lapostolle BGHD 130062 / HD 602942 ~ exakte Koordinaten fehlen Bromelia karatas Linnaeus BT_6 BROM Stolten BGHD 104015 / ~ MX, Yucatan exakte Koordinaten fehlen Bromelia plumieri (Morren) Smith BT_93 BROM (s.n.) WU 584 / ~ ~ exakte Koordinaten fehlen Bromelia serra Grisebach F 12a BROM (s.n.) FRP 98-17751-0 / FR Horres 029 ~ exakte Koordinaten fehlen Catopsis floribunda Smith BT_34 TILL Rauh (R:58579) BGHD 104590 / HD 600127 DO, Rancho arriba exakte Koordinaten fehlen Catopsis morreniana Mez BT_35 TILL Rauh (R:36485) BGHD 131731 / HD 600133 MX, Veracruz exakte Koordinaten fehlen " BT_95 TILL (s.n.) BGTD D-4985 / (s.n.) ~ exakte Koordinaten fehlen " BT_96 TILL (s.n.) BGOS 85-11-0407-30 / (s.n.) ~ exakte Koordinaten fehlen " BT_97 TILL (s.n.) HERRH 2010-G-78 / (s.n.) ~ exakte Koordinaten fehlen " BT_98 TILL (s.n.) BGK 1985-1873 ~ exakte Koordinaten fehlen " BT_99 TILL (s.n.) BGRU / (s.n.) ~ exakte Koordinaten fehlen " BT_116 TILL (s.n.) BGU 1989-6-839 ~ exakte Koordinaten fehlen Catopsis nitida (Hooker) Grisebach BT_36 TILL Rauh (R:70955) BGHD 131346 / HD 601930 HN, Marcapa exakte Koordinaten fehlen Cryptanthus acaulis var. ruber hortus ex Beer BT_37 BROM (s.n.) BGHD 103279 / ~ ~ exakte Koordinaten fehlen Cryptanthus fosterianus Smith BT_38 BROM (s.n.) BGHD 103286 / ~ ~ exakte Koordinaten fehlen Cryptanthus microglazioui Ramírez BT_39 BROM Prinsler BGHD 107157 / ~ ~ exakte Koordinaten fehlen Deinacanthon urbanianum (Mez) Mez BT_40 BROM (s.n.) BGHD 105010 / HD 600122 ~ exakte Koordinaten fehlen Deuterocohnia brevifolia (Grisebach) Spencer & Smith N 106 PITC (s.n.) BGKS 0106 / FR (s.n.) ~ exakte Koordinaten fehlen 191 Anhang Artname Autor ID-Nummer Unterfamilie Sammler, bzw. Sammlernummer Garten-ID / Herbarbeleg Herkunft Breitengrad / Längengrad Deuterocohnia brevifolia (Grisebach) Spencer & Smith N 122 PITC (s.n.) BGB 118-01-74-83 / ~ ~ exakte Koordinaten fehlen " N 125 PITC (s.n.) BGB 264-16-99-33 / ~ AR exakte Koordinaten fehlen " N 138 PITC Balfanz (075) BGHD 107170 / HD 602395 BO, Tarija -21.55500 / -64.61667 " N 139 PITC Hromadnik (HR:5124) BGHD 107456 BO, Tarija -21.53333 / -64.58333 " N 173 PITC (s.n.) BGKS Schütz 06-061 / ~ BO, Tarija -21.96020 / -64.68140 " N 221 PITC (s.n.) BGB 906-21-96-90-84 / ~ ~ exakte Koordinaten fehlen " N 222 PITC (s.n.) BGKS 0222 / ~ ~ exakte Koordinaten fehlen " N 256 PITC (s.n.) WU Till, H. 88-135 / ~ AR -27.50000 / -66.41667 Deuterocohnia glandulosa Gross F 43a PITC Hromadnik (HR:5167) BGHD 103854 / HD 602085 BO, Tarija exakte Koordinaten fehlen Deuterocohnia longipetala Mez BT_123 PITC (s.n.) BGKS Schütz 06.068 BO, Tarija -22.57043 / -64.41242 Deuterocohnia meziana Kuntze ex Mez N 289 PITC (s.n.) BGKS Schütz 09/001 / ~ BO exakte Koordinaten fehlen Deuterocohnia scapigera (Rauh & L Hromadnik) Spencer & Smith F 45a PITC Hromadnik (HR:5275) BGHD 130020 / HD 603109 BO, Potosi exakte Koordinaten fehlen Disteganthus basilateralis Lemaire BT_41 BROM Feuillet (09947) BGHD 100429 / ~ GF, Mt. Tortue exakte Koordinaten fehlen Dyckia choristaminea Mez FK0021 PITC (s.n.) BGHD 130018 / HD 600162 ~ exakte Koordinaten fehlen Dyckia dissitiflora Schultes f. D19-D40 “Ferro Doido” (19) PITC Benko-Iseppon, Pinangé, Cruz (1605) Feldsammlung / UFP 1605 BR, Bahia, Cachoeira, Ferro Doido -11.62790 / -41.00050 " D102-D111 “Jajes” (10) PITC Benko-Iseppon, Pinangé, Cruz (1598) Feldsammlung / UFP 1598 BR, Bahia, Lajes -11.60100 / -41.16450 " D112-D119 “Morrão” (8) PITC Benko-Iseppon, Pinangé, Cruz (1562) Feldsammlung / UFP 1562 BR, Bahia, Morrão -11.59014 / -41.20722 Dyckia estevesii Rauh FK0001 PITC Braun BGHD 105188 / HD 602151 BR exakte Koordinaten fehlen Dyckia ferox Mez FK0020 PITC Rauh (R:64237) BGHD 130031 / HD 600166 AR, Cerro Colorado -30.10000 / -63.93333 Dyckia hebdingii Smith FK0013 PITC Marnier BGHD 103913 / HD 600171 BR, Rio Grande do Sul exakte Koordinaten fehlen Dyckia maritima Baker FK0113 PITC (s.n.) WU Genf / ~ BR exakte Koordinaten fehlen Dyckia marnier-lapostollei var. estevesii Rauh BT_121 PITC Horst (5) BGHD 130151 / HD 600183 BR, Goias -16.66667 / -49.26667 Dyckia marnier-lapostollei Rauh BT_122 PITC Marnier-Lapostolle BGHD 130189 BR exakte Koordinaten fehlen Dyckia microcalyx var. indet. Baker FK0009 PITC Till W, Till S (6020) BGHD 102970 / ~ PY, Acahay -25.91667 / -57.15000 Dyckia pernambucana Smith 1A-10A “Brejo Madre Deus” (10) PITC Pinangé, Louzada, Cruz Feldsammlung / UFP DCKA-09.2009 BR, Pernambuco, Brejo Madre Deus -8.18940 / -36.39310 " D90-D99 “Pesqueira” (10) PITC Pinangé, Louzada, Cruz Feldsammlung / UFP DCKA-09.2009 BR, Pernambuco, Pesgueira -8.32540 / -36.75620 " D161-D165 „Pico do Papagaio“ (5) PITC Wanderley Feldsammlung / ~ BR, Pernambuco, Pico do Papagaio -7.82280 / -38.05536 " D171-D175 „Lajedo Santa Rita“ (5) PITC Wanderley Feldsammlung / UFP DCKA-09.2009 BR, Pernambuco, Lajedo Santa Rita -8.66895 / -36.32335 Dyckia limae Smith D181-D190 „Buíque“ (10) PITC Wanderley Feldsammlung / UFP DCKA-09.2009 BR, Pernambuco, Serra de Jerusalém -8.58372 / -37.23836 Dyckia macedoi Smith D120-D125 „Serra do Cipo“ (6) PITC Louzada, Pinangé, Medeiros 151 Feldsammlung / RB Louzada 151 BR, Minas Gerais, Serra do Cipo -19.35386 / -43.62372 " D126-D131 „Serra do Cipo“ (6) PITC Louzada, Pinangé, Medeiros 153 Feldsammlung / SP 423596 BR, Minas Gerais, Serra do Cipo -19.35603 / -43.60806 Dyckia remotiflora Otto & Dietrich FK0068 PITC (s.n.) BGKS 0068 / ~ UY exakte Koordinaten fehlen Dyckia velascana Mez FK0006 PITC Till W, Till S (5012) BGHD 103740 / ~ AR, Cordoba, Ascochinga -30.95000 / -64.26670 Edmundoa lindenii var. rosea (Morren) Leme BT_42 BROM Marnier BGHD 105009 / HD 602373 ~ exakte Koordinaten fehlen 192 Anhang Artname Autor ID-Nummer Unterfamilie Sammler, bzw. Sammlernummer Garten-ID / Herbarbeleg Herkunft Breitengrad / Längengrad Encholirium brachypodum Smith & Read EB1-RJ PITC Leme Leme EB1-RJ / ~ BR exakte Koordinaten fehlen Encholirium erectiflorum Smith ER-AFR1 PITC Oliveira ER-AFR1 / UFP 63.708 BR, Pernambuco, Afránio -8.44364 / -40.90433 Encholirium horridum Smith F 46a PITC Schindhelm BGHD 108213 / HD 600209 BR, Minas Gerais exakte Koordinaten fehlen Encholirium horridum Smith EH2-RJ PITC Oliveira Feldsammlung EH2-RJ / ~ BR exakte Koordinaten fehlen Encholirium magalhaesii Smith EM3-RJ PITC Oliveira Feldsammlung EM3-RJ / ~ BR, Minas Gerais, Diamantina -18.23333 / -43.61667 Encholirium spectabile Martius ex. Schultes ES-csf „Sergipe“ (4) PITC Oliveira ES-csf / ASE 15917 BR, Sergipe -9.70000 / -37.96667 Encholirium spec. Martius ex. Schultes FK0078 PITC Schulz BGHD 125585 BR exakte Koordinaten fehlen Fosterella albicans (Griseb.) Smith „NW09.036“ (3) PITC Wagner, Schütz, Blacutt BGKS NW09.036-1 / LPB NW09.036 BO, La Paz, Larecaja -15.30908 / -68.46353 Fosterella christophii Ibisch, Vasquez & Peters „NW09.005“ (5) PITC Wagner, Schütz, Lara BGKS NW09.005-6 / LPB NW09.005 BO, Santa Cruz, Florida -18.09952 / -63.60210 " „NW09.006“ (1) PITC Wagner, Schütz, Lara BGKS NW09.006-1 / LPB NW09.006 BO, Santa Cruz, Florida -18.09952 / -63.60210 " „NW09.030“ (8) PITC Wagner, Schütz, Blacutt BGKS NW09.030-1 / LPB NW09.030 BO, La Paz, Larecaja -15.66240 / -67.71320 " „NW09.034“ (9) PITC Wagner, Schütz, Blacutt BGKS NW09.034-1 / LPB NW09.034 BO, La Paz, Larecaja -15.46787 / -67.97005 " „IM0033-IM0034“ (6) PITC Michalak, Blacutt, Landivar IM0033 / USZ IM0033 BO, Santa Cruz, Florida -18.10550 / -63.58833 " „IM0043-IM0045“ (7) PITC Michalak, Blacutt, Landivar IM0043 / USZ IM0043 BO, Santa Cruz, Florida -18.09133 / -63.59033 " „IM0046-IM0048“ (9) PITC Michalak, Blacutt, Landivar IM0046 / USZ IM0046 BO, Santa Cruz, Florida -18.10083 / -63.58983 " „IM0050“ (1) PITC Michalak, Blacutt, Landivar IM0050 / USZ IM0050 BO, Santa Cruz, Florida -18.10267 / -63.59300 " „IM0052-IM0054“ (4) PITC Michalak, Blacutt, Landivar IM0052 / USZ IM0052 BO, Santa Cruz, Florida -18.09952 / -63.60210 Fosterella floridensis Ibisch, Vasquez & Gross „NW09.003“ (3) PITC Wagner, Schütz, Lara BGKS NW09.003-1 / LPB NW09.003 BO, Santa Cruz, Florida -15.09952 / -63.60210 Fosterella gracilis (Rusby) Smith „NW09.021“ (3) PITC Wagner, Schütz, Blacutt BGKS NW09.021-1 / LPB NW09.021 BO, Beni, Jose Balivian -14.52003 / -67.49705 Fosterella micrantha (Lindley) Smith „Schütz 11-04“ (6) PITC Schütz, Duno, Pinzon BGKS NiSch11-04-08 / ~ MX, Veracruz 18.41262 / -95.09468 " „Schütz 11-05“ (10) PITC Schütz, Duno, Pinzon BGKS NiSch11-05-01 / MX, Oaxaca 17.85203 / -96.21658 " „Schütz 11-06“ (7) PITC Schütz, Duno, Pinzon BGKS NiSch11-06-02 / MX, Oaxaca 17.73767 / -96.32755 " „Schütz 11-12“ (6) PITC Schütz, Carn., Pinz., Cast., Leop., Jim. BGKS NiSch11-12-01 / ~ MX, Chiapas 15.31644 / -92.35678 " „Schütz 11-13“ (6) PITC Schütz, Carn., Pinz., Cast., Leop., Jim. BGKS NiSch11-13-01 / ~ MX, Chiapas 15.25389 / -92.40556 " „Schütz 11-15“ (5) PITC Schütz, Carn., Pinz., Cast., Leop., Jim. BGKS NiSch11-04-08 / ~ MX, Chiapas 15.38825 / -92.66067 " „Schütz 11-17“ (8) PITC Schütz, Carn., Pinz., Cast., Leop., Jim. BGKS NiSch11-04-08 / ~ MX, Oaxaca 16.79033 / -95.35933 " „Schütz 11-19“ (9) PITC Schütz, Carn., Pinz., Cast., Leop., Jim. BGKS NiSch11-04-08 / ~ MX, Oaxaca 15.86467 / -96.47219 Fosterella penduliflora (Wright) Smith „NW09.002“ (3) PITC Wagner, Schütz, Lara BGKS NW09.002-1 / LPB NW09.002 BO, Santa Cruz, Ibañez/ Florida -15.18558 / -63.55872 Fosterella petiolata (Mez) Smith „NW09.037“ (3) PITC Wagner, Schütz, Blacutt BGKS NW09.037-1 / LPB NW09.037 BO, La Paz, Larecaja -15.35998 / -68.50167 Fosterella robertreadii Ibisch, Vasquez & Peters „JP06.0124“ (3) PITC Peters BGKS JP06.0124 / USM, LPB JP06.0124 PE, Cusco, Quillabamba -12.76767 / -72.58567 Fosterella rusbyi (Mez) Smith BT_124 „JP06.0078“ (1) PITC Peters BGKS JP06.0078 / SEL JP06.0078 BO, La Paz, Sud Yungas -16.36167 / -67.46333 " „JP06.0070“ (13) PITC Peters BGKS JP06.0070 / LPB JP06.0070 BO, La Paz, Sud Yungas -16.40139 / -67.63944 " „NW09.008“ (9) PITC Wagner, Schütz BGKS NW09.008-1 / LPB NW09.008 BO, La Paz, Nor Yungas -16.16612 / -67.72157 " „NW09.009“ (8) PITC Wagner, Schütz BGKS NW09.009-1 / LPB NW09.009 BO, La Paz, Nor Yungas -16.22090 / -67.73728 193 Anhang Artname Autor ID-Nummer Unterfamilie Sammler, bzw. Sammlernummer Garten-ID / Herbarbeleg Herkunft Breitengrad / Längengrad Fosterella rusbyi (Mez) Smith „NW09.010“ (10) PITC Wagner, Schütz BGKS NW09.010-1 / LPB NW09.010 BO, La Paz, Nor Yungas -16.23807 / -67.73672 " „NW09.015“ (7) PITC Wagner, Schütz, Blacutt BGKS NW09.015-1 / LPB NW09.015 BO, La Paz, Caranavi -15.84397 / -67.52628 " „NW09.016“ (9) PITC Wagner, Schütz, Blacutt BGKS NW09.016-1 / LPB NW09.016 BO, La Paz, Caranavi -15.80497 / -67.50720 " „NW09.018“ (9) PITC Wagner, Schütz, Blacutt BGKS NW09.018-1 / LPB NW09.018 BO, La Paz, Sud Yungas -15.45160 / -67.17057 " „NW09.027“ (7) PITC Wagner, Schütz, Blacutt BGKS NW09.027-1 / LPB NW09.027 BO, La Paz, Caranavi -15.82108 / -67.60230 " „NW09.028“ (10) PITC Wagner, Schütz, Blacutt BGKS NW09.028-1 / LPB NW09.028 BO, La Paz, Caranavi -15.73889 / -67.67472 " „NW09.029“ (9) PITC Wagner, Schütz, Blacutt BGKS NW09.029-1 / LPB NW09.029 BO, La Paz, Larecaja -15.67343 / -67.70375 " „NW09.031“ (10) PITC Wagner, Schütz, Blacutt BGKS NW09.031-1 / LPB NW09.031 BO, La Paz, Larecaja -15.52883 / -67.83135 " „NW09.032“ (9) PITC Wagner, Schütz, Blacutt BGKS NW09.032-1 / LPB NW09.032 BO, La Paz, Larecaja -15.49660 / -67.85492 " „NW09.033“ (9) PITC Wagner, Schütz, Blacutt BGKS NW09.033-1 / LPB NW09.033 BO, La Paz, Larecaja -15.50915 / -67.86835 " „NW09.038“ (9) PITC Wagner, Schütz, Blacutt BGKS NW09.038-1 / LPB NW09.038 BO, La Paz, Larecaja -15.37582 / -68.50650 " „NW09.039“ (2) PITC Wagner, Schütz, Blacutt BGKS NW09.039-1 / LPB NW09.039 BO, La Paz, Larecaja -15.39515 / -68.53827 " „IM0071-IM0073“ (8) PITC Michalak, Blacutt, Landivar IM0071 / USZ IM0071 BO, La Paz, Larecaja -15.50056 / - 67.87778 " „IM0077-IM0080“ (10) PITC Michalak, Blacutt, Landivar IM0077 / USZ IM0077 BO, La Paz, Caranavi -15.94583 / -67.56889 " „IM0081-IM0083“ (11) PITC Michalak, Blacutt, Landivar IM0081 / USZ IM0081 BO, La Paz, Caranavi -15.95417 / -67.56972 " „IM0084-IM0090“ (14) PITC Michalak, Blacutt, Landivar IM0084 / USZ IM0084 BO, La Paz, Caranavi -15.96722 / -67.56417 " „IM0095-IM0097“ (9) PITC Michalak, Blacutt, Landivar IM0095 / USZ IM0095 BO, La Paz, Caranavi -15.82111 / -67.60222 " „IM0098-IM0101“ (14) PITC Michalak, Blacutt, Landivar IM0098 / USZ IM0098 BO, La Paz, Larecaja -15.73889 / -67.67472 " „IM0102-IM0104“ (3) PITC Michalak, Blacutt, Landivar IM0102 / USZ IM0102 BO, La Paz, Larecaja -15.69472 / -67.68889 " „IM0105-IM0107“ (11) PITC Michalak, Blacutt, Landivar IM0105 / USZ IM0105 BO, La Paz, Larecaja -15.67417 / -67.70389 " „IM0108-IM0110“ (2) PITC Michalak, Blacutt, Landivar IM0108 / USZ IM0108 BO, La Paz, Larecaja -15.64861 / -67.72639 " „IM0111-IM0113“ (10 PITC Michalak, Blacutt, Landivar IM0111 / USZ IM0111 BO, La Paz, Larecaja -15.62972 / -67.75583 " „IM0118-IM0120“ (7) PITC Michalak, Blacutt, Landivar IM0118 / USZ IM0118 BO, La Paz, Larecaja -15.54167 / -68.01000 " „IM0128-IM0129“ (5) PITC Michalak, Blacutt, Landivar IM0128 / USZ IM0128 BO, La Paz, Larecaja -15.37583 / -68.50750 " „IM0130-IM0132“ (8) PITC Michalak, Blacutt, Landivar IM0130.1 / USZ IM0130 BO, La Paz, Larecaja -15.39000 / -68.52417 " „IM0133-IM0135“ (10) PITC Michalak, Blacutt, Landivar IM0133 / USZ IM0133 BO, La Paz, Larecaja -15.39861 / -68.53972 Fosterella villosula (Harms) Smith F25b Ibisch FAN PI 98.0173 / USZ, FR, WU, SEL BO, Santa Cruz, Andrez Ibanez exakte Koordinaten fehlen " „NW09.012“ (5) PITC Wagner, Schütz BGKS NW09.012-1 / LPB NW09.012 BO, La Paz, Caranavi -16.03293 / -67.63168 " „NW09.019“ (4) PITC Wagner, Schütz BGKS NW09.019-1 / LPB NW09.019 BO, La Paz, Sud Yungas -15.45160 / -67.17057 " „NW09.024“ (7) PITC Wagner, Schütz, Blacutt BGKS NW09.024-1 / LPB NW09.024 BO, Beni, Jose Balivian -14.54075 / -67.49963 " „NW09.035“ (6) PITC Wagner, Schütz, Blacutt BGKS NW09.035-2 / LPB NW09.035 BO, La Paz, Larecaja -15.30580 / -67.36843 " „IM0012-IM0013“ (11) PITC Michalak, Blacutt, Landivar IM0012 / USZ IM0012 BO, Santa Cruz, Vallegrande -18.78550 / -63.84067 " „IM0019-IM0021“ (12) PITC Michalak, Blacutt, Landivar IM0019 / USZ IM0019 BO, Santa Cruz, Vallegrande -18.10467 / -63.59183 " „IM0022-IM0028“ (7) PITC Michalak, Blacutt, Landivar IM0022 / USZ IM0022 BO, Santa Cruz, Vallegrande -18.10600 / -63.58983 194 Anhang Artname Autor ID-Nummer Unterfamilie Sammler, bzw. Sammlernummer Garten-ID / Herbarbeleg Herkunft Breitengrad / Längengrad Fosterella villosula (Harms) Smith „IM0029-IM0030“ (2) PITC Michalak, Blacutt, Landivar IM0029 / USZ IM0029 BO, Santa Cruz, Vallegrande -18.10550 / -63.58867 " „IM0124-IM0125“ (9) PITC Michalak, Blacutt, Landivar IM0124 / USZ IM0124 BO, La Paz, Larecaja -15.37217 / -68.50450 " „IM0139-IM0142“ (12) PITC Michalak, Blacutt, Landivar IM0139 / USZ IM0139 BO, Cochabamba, Chapare -17.00200 / -65.63450 " „IM0143-IM0145“ (8) PITC Michalak, Blacutt, Landivar IM0143 / USZ IM0143 BO, Cochabamba, Chapare -17.00200 / -65.63450 Fosterella weberbaueri (Mez) Smith „NW09.025“ (3) PITC Wagner, Schütz, Blacutt BGKS NW09.025-1 / LPB NW09.025 BO, La Paz, Caranavi -15.67188 / -67.47218 Greigia sphacelata (Ruiz & Pavón) Regel BT_44 BROM (s.n.) BGHD 103526 / ~ CL, Conception, Biobio exakte Koordinaten fehlen Guzmania glaucophylla Rauh BT_45 TILL Rauh 66031 BGHD 102386 / HD 602219 PE, Pasco exakte Koordinaten fehlen Guzmania musaica (Linden & André) Mez F 33a TILL (s.n.) FRP 92-10645-0 / ~ ~ exakte Koordinaten fehlen Guzmania wittmackii (André) André ex Mez BT_47 TILL Rauh (R:37660) BGHD 102807 / HD 605008 EC, Ambato-Selva Negra exakte Koordinaten fehlen Hechtia caerulea (Matuda) Smith BT_48 HECH Flügel BGHD 104095 / HD 602999 MX, Morelos exakte Koordinaten fehlen Hechtia glomerata Zuccarini BT_50 HECH (s.n.) BGHD 105017 / HD 600411 ~ exakte Koordinaten fehlen Hechtia glomerata Zuccarini BT_100 HECH (s.n.) BGRU / (s.n.) ~ exakte Koordinaten fehlen Hechtia stenopetala Klotzsch F 21a HECH (s.n.) FRP 0-19154-2 ~ exakte Koordinaten fehlen Hohenbergia leopoldo-horstii Gross, Rauh & Leme BT_51 BROM Rauh (R:70116) BGHD 130307 / HD 600076 BR, Bahia, Chapata Diamantina exakte Koordinaten fehlen Hohenbergiopsis guatemalensis (Smith) Smith & Read BT_52 BROM Meyer BGHD 130417 / HD 130416 GT exakte Koordinaten fehlen Lymania alvimii (Smith & Read) Read BT_53 BROM (s.n.) BGHD 103784 / ~ BR, Bahia exakte Koordinaten fehlen Lymania smithii Read BT_54 BROM Bello BGHD 104865 / HD 600432 BR, Bahia exakte Koordinaten fehlen Mezobromelia capituligera (Grisebach) Grant BT_55 TILL Krömer BGHD 132601 / HD 601711 BO, Cochabamba, Capare exakte Koordinaten fehlen Neoregelia binotii (Antoine) Smith F 28a BROM (s.n.) FRP 98-16967-3 / Zizka 1418 ~ exakte Koordinaten fehlen Neoregelia laevis (Mez) Smith F 29a BROM (s.n.) FRP 98-16962-3 / Horr., Sch. 220601-3 ~ exakte Koordinaten fehlen Ochagavia carnea (Beer) Smith & Looser BT_57 BROM (s.n.) BGHD 130042 / HD 600462 ~ exakte Koordinaten fehlen Pitcairnia abundans Smith P6 PITC (s.n.) BGHD 130636 / 600479 ~ exakte Koordinaten fehlen Pitcairnia atrorubens Baker F 34a PITC (s.n.) FRP 89-16095-2 ~ exakte Koordinaten fehlen Pitcairnia breedlovei Smith P21 PITC Rauh (R:52598) BGHD 132652 / ~ MX, Oaxaca exakte Koordinaten fehlen Pitcairnia burle-marxii Braga & Sucre P10 PITC Marnier BGHD 130537 / HD 600487 ~ exakte Koordinaten fehlen Pitcairnia grafii Rauh P23 PITC Graf BGHD 102579 / HD 602097 VE, Tachira exakte Koordinaten fehlen Pitcairnia heterophylla Beer FK0083 PITC Senghas O-11230 BGHD 104945 / HD 104945 MX, Est. Guerrero exakte Koordinaten fehlen Pitcairnia loki-schmidtiae Rauh & Barthlott BT_11 PITC Schmidt BGHD 104044 / HD 602369 MX, Jalisco exakte Koordinaten fehlen Pitcairnia macrochlamys Mez P13 PITC Rauh (R:52623) BGHD 103587 / HD 600513 MX, Chiapas exakte Koordinaten fehlen Pitcairnia piepenbringii Rauh & Gross P7 PITC Rauh (R:67430) BGHD 103786 / HD 602406 BR, Bahia exakte Koordinaten fehlen Pitcairnia pungens Kunth FK0084 PITC Rauh (R:69140) BGHD 130648 / HD 130648 PE, Dept. Lambayeque, Olmos-Tal exakte Koordinaten fehlen Pitcairnia riparia Mez P8 PITC Miyagawa BGHD 103060 / HD 600531 BO, Alto Beni exakte Koordinaten fehlen Pitcairnia utcubambensis Rauh P15 PITC Rauh, von Bismarck (R:53566) BGHD 104868 / HD 602486 PE, Amazonas exakte Koordinaten fehlen Pitcairnia villetaensis Rauh P9 PITC Rauh (R:37089) BGHD 104225 / HD 602492 CO, nahe Bogota exakte Koordinaten fehlen 195 Anhang Artname Autor ID-Nummer Unterfamilie Sammler, bzw. Sammlernummer Garten-ID / Herbarbeleg Herkunft Breitengrad / Längengrad Pitcairnia yaupi-bajaensis Rauh P12 PITC Rauh (R:25718) BGHD 103785 / HD 602509 PE, Pasco exakte Koordinaten fehlen Portea kermesina Koch BT_59 BROM Seidel BGHD 104312 / ~ BR exakte Koordinaten fehlen Portea leptantha Harms BT_60 BROM Braun (1004) BGHD 103256 / HD BR, Pernambuco exakte Koordinaten fehlen Pseudananas sagenarius (Arruda da Camara) Camargo BT_91 BROM (s.n.) WU 68/91 / ~ ~ exakte Koordinaten fehlen Puya coerulea var. violacea (Brongniart) Smith & Looser BT_61 PUYO (s.n.) BGHD 103523 / HD 600587 ~ exakte Koordinaten fehlen Puya herzogii Wittmack BT_63 PUYO Krömer (TK:6581) BGHD 105240 / HD 602390 BO, Cochabamba, Carrasco exakte Koordinaten fehlen Puya mirabilis (Mez) Smith BT_64 PUYO Rauh (R:64208) BGHD 130040 / HD 600619 AR, Salta, Metan exakte Koordinaten fehlen " BT_101 PUYO (s.n.) BGK 1985-7230 / (s.n.) ~ exakte Koordinaten fehlen " BT_102 PUYO (s.n.) BGK 2000-8698 / (s.n.) ~ exakte Koordinaten fehlen " BT_103 PUYO (s.n.) BGRU / (s.n.) ~ exakte Koordinaten fehlen " BT_117 PUYO (s.n.) BGU 1991-6-212 / (s.n.) ~ exakte Koordinaten fehlen Puya spathacea (Grisebach) Mez BT_65 PUYO Leuenberger, Arr., Eggli (4490b) BGHD 103912 / HD 600638 AR, Cordoba, Colón exakte Koordinaten fehlen Puya venusta Philippi BT_66 PUYO (s.n.) BGHD 105609 / HD 600640 CL, Valoaraiso, Zapallar exakte Koordinaten fehlen Racinaea fraseri (Baker) Spencer & Smith BT_67 TILL Rauh (R:34010) BGHD 102394 / HD 600988 EC, Pichincha, Guayabamba exakte Koordinaten fehlen Racinaea pugiformis (LB Smith) Spencer & Smith BT_68 TILL Wülfinghoff BGHD 102997 / HD 601259 EC, Loja, Macara exakte Koordinaten fehlen Tillandsia somnians Smith BT_69 TILL Rauh (R:24330) BGHD 107462 / HD 103578 PE, Cajamarca, nahe Olmos exakte Koordinaten fehlen Tillandsia usneoides (Linnaeus) Linnaeus BT_70 TILL Rauh (R:67138) BGHD 130959 / HD 601440 AR, Yungas Cachi exakte Koordinaten fehlen Ursulaea tuitensis (Magaña & Lott) Read & Baensch BT_72 BROM Noller BGHD 130069 / ~ MX, Jalisco, El Tuito exakte Koordinaten fehlen 196 Anhang Tabelle T2: Einteilung und Übersicht von 15 Pflanzensets, die in der vorliegenden Arbeit zur Erhebung der aller Mikrosatellitendaten verwendet wurden. Natürliche Populationen (falls im jeweiligen Probenset vorhanden) sind im durch einen entsprechenden Namen (in Anführungszeichen) hinter der jeweils ersten Akzession sowie einer farblich abwechselnden Markierung gekennzeichnet. Zudem ist grob angegeben, in welchem Zusammenhang die einzelnen Sets verwendet wurden. Für detailliertere Informationen zu den einzelnen Proben (Herkunft, Sammler, Fundort etc.) siehe vorherige Tabelle T1. Set 1 (Kapitel 3.3.1.1) EST-Mikrosatellitenmarker, Primertests in Ananas Nr. Art ID-Nummer 1 Ananas comosus BT_17 2 A. comosus BT_18 3 A. comosus BT_19 4 A. comosus BT_20 5 A. bracteatus BT_15 6 A. spec. BT_16 Set 2 (Kapitel 3.3.1.1 und 3.3.1.3) EST-Mikrosatellitenmarker, Übertragbarkeit und Funktionalität in Ananas und Pseudananas Nr. Art ID-Nummer 1 Ananas comosus BT_17 2 A. comosus BT_18 3 A. comosus BT_19 4 A. comosus BT_20 5 A. comosus BT_75 6 A. comosus BT_77 7 A. comosus BT_79 8 A. comosus BT_81 9 A. comosus BT_82 10 A. comosus BT_85 11 A. comosus var. erectifolius BT_89 12 A. comosus var. porteanus BT_76 13 A. bracteatus BT_15 14 A. bracteatus BT_28 15 A. bracteatus BT_73 16 A. bracteatus BT_74 17 A. bracteatus BT_80 18 A. nanus BT_29 19 A. nanus BT_78 20 A. nanus BT_84 21 A. nanus BT_86 22 A. nanus BT_90 23 A. ananassoides BT_27 24 A. ananassoides BT_87 25 A. fritzmuelleri BT_88 26 A. lucidus BT_83 27 A. spec. BT_16 28 Pseudananas sagenarius BT_91 Set 3 (Kapitel 3.3.1.4) EST-Mikrosatellitenmarker, Übertragbarkeit in verschiedene Gattungen und Unterfamilien Nr. Art ID-Nummer 1 Acanthostachys pitcairnioidea BT_21 2 Aechmea chatini BT_12 3 Ae. allenii BT_22 4 Ae. biflora BT_23 5 Ae. kertesziae F 9a 6 Ae. orlandiana BT_26 7 Billbergia pyramidalis BT_30 8 Bromelia balansae BT_92 9 B. laciniosa BT_32 10 B. karatas BT_6 11 B. plumieri BT_93 12 B. serra F 12a 13 Cryptanthus acaulis BT_37 14 C. fosterianus BT_38 197 Anhang Fortsetzung Set 1 Nr. Art ID-Nummer 15 C. microglazioui BT_39 16 Deinacanthon urbanianum BT_40 17 Disteganthus basilateralis BT_41 18 Edmundoa lindenii BT_42 19 Greigia sphacelata BT_44 20 Hohenbergia leopoldo-horstii BT_51 21 Hohenbergiopsis guatemalensis BT_52 22 Lymania alvimii BT_53 23 L. smithii BT_54 24 Neoregelia binotii F 28a 25 N. laevis F 29a 26 Ochagavia carnea F 36a 27 Portea kermesiana BT_59 28 Po. leptantha BT_60 29 Ursulaea tuitensis BT_72 30 Deuterocohnia brevifolia N 106 31 D. glandulaosa F 43a 32 D. meziana N 289 33 D. scapigera F 45a 34 Dyckia chorislaminea FK0021 35 Dy. estevesii FK0001 36 Dy. ferox FK0020 37 Dy.marnier-lapostollei BT_121 38 Dy.microcalyx FK0009 39 Dy. remotiflora FK0068 40 Encholirium horidum F 46a 41 Fosterella rusbyi JP 06.0078 42 F. villosula F 25b 43 Pitcairnia abundans P6 44 P. breedlovei P21 45 P. burle-marxii P10 46 P. grafii P23 47 P. loki-schmidtiae BT_11 48 P. macrochlamys P13 49 P. piepenbringii P7 50 P. riparia P8 51 P. utcubambensis P15 52 P. villetaensis P9 53 P. yaupi-bajaensis P12 54 Catopsis morreniana BT_35 55 Ca. floribunda BT_34 56 Ca. nitida BT_36 57 Guzmania glaucophylla BT_45 58 G. musaica F 33a 59 G. wittmackii BT_47 60 Mezobromelia capituligera BT_55 61 Racinaea pugiformis BT_68 62 R. fraseri BT_67 63 Tillandsia somnians BT_69 64 T. usneoides BT_70 65 Puya coerulea BT_61 66 Pu. herzogii BT_63 67 Pu. mirabilis BT_64 68 Pu. spathacea BT_65 69 Pu. venusta BT_66 70 Hechtia caerulea BT_48 71 H. glomerata BT_50 72 H. stenopetale F 21a 73 Brocchinia acuminata BT_1 74 Br. micrantha BT_31 198 Anhang Set 4 (Kapitel 3.3.1.4) EST-Mikrosatellitenmarker, Übertragbarkeit und Funktionalität in Deuterocohnia brevifolia Nr. Art ID-Nummer 1 Deuterocohnia brevifolia N 106 2 D. brevifolia N 122 3 D. brevifolia N 125 4 D. brevifolia N 138 5 D. brevifolia N 139 6 D. brevifolia N 173 7 D. brevifolia N 221 8 D. brevifolia N 222 9 D. brevifolia N 256 Set 5 (Kapitel 3.3.1.4) EST-Mikrosatellitenmarker, Übertragbarkeit und Funktionalität in Fosterella rusbyi Nr. Art ID-Nummer 1 Fosterella rusbyi ’NW09.010’ NW09.010-2 2 F. rusbyi NW09.010-3 3 F. rusbyi NW09.010-4 4 F. rusbyi NW09.010-5 5 F. rusbyi ’NW09.015’ NW09.015-1 6 F. rusbyi NW09.015-5 7 F. rusbyi NW09.015-10 8 F. rusbyi ’NW09.018’ NW09.018-1 9 F. rusbyi NW09.018-6 10 F. rusbyi NW09.018-12 11 F. rusbyi ’NW09.027’ NW09.027-1 12 F. rusbyi NW09.027-4 13 F. rusbyi NW09.027-8 14 F. rusbyi ’NW09.031’ NW09.031-1 15 F. rusbyi NW09.031-5 16 F. rusbyi NW09.031-10 17 F. rusbyi ’NW09.032’ NW09.032-1 18 F. rusbyi NW09.032-5 19 F. rusbyi NW09.032-10 20 F. rusbyi ’NW09.038’ NW09.038-1 21 F. rusbyi NW09.038-5 22 F. rusbyi NW09.038-10 23 F. rusbyi ’NW09.039’ NW09.039-1 24 F. rusbyi NW09.039-2 Set 6 (Kapitel 3.3.2.1) Nukleäre 454-Mikrosatellitenmarker (F. rusbyi), Primertests in Fosterella Nr. Art ID-Nummer 1 Fosterella rusbyi JP 06.0078 2 F. rusbyi NW09.008-6 3 F. floridensis NW09.003-1 4 F. robertreadii JP 06.0124_1 5 F. weberbaueri NW09.025-1 Set 7 (Kapitel 3.3.2.2) Nukleäre 454-Mikrosatellitenmarker (F. rusbyi), Funktionalität in F. rusbyi Nr. Art ID-Nummer 1 Fosterella rusbyi ’JP 06.0070’ JP 06.0070a 2 F. rusbyi JP 06.0070b 3 F. rusbyi JP 06.0070c 4 F. rusbyi JP 06.0070e 5 F. rusbyi JP 06.0070f 6 F. rusbyi JP 06.0070g 7 F. rusbyi JP 06.0070h 8 F. rusbyi JP 06.0070i 9 F. rusbyi JP 06.0070j 10 F. rusbyi JP 06.0070l 199 Anhang Fortsetzung Set 7 Nr. Art ID-Nummer 11 F. rusbyi JP 06.0070m 12 F. rusbyi ’NW09.029’ NW09.029-1 13 F. rusbyi NW09.029-3 14 F. rusbyi NW09.029-5 15 F. rusbyi NW09.029-8 16 F. rusbyi ’JP 06.0078’ JP 06.0078 17 F. rusbyi ’NW09.031’ NW09.031-1 18 F. rusbyi NW09.031-2 19 F. rusbyi NW09.031-3 20 F. rusbyi NW09.031-4 21 F. rusbyi NW09.031-5 22 F. rusbyi NW09.031-9 23 F. rusbyi NW09.031-10 24 F. rusbyi ’NW09.032’ NW09.032-1 25 F. rusbyi NW09.032-4 26 F. rusbyi NW09.032-7 27 F. rusbyi NW09.032-10 28 F. rusbyi ’NW09.038’ NW09.038-1 29 F. rusbyi NW09.038-5 Set 8 (Kapitel 3.3.2.3) Nukleäre 454-Mikrosatellitenmarker (F. rusbyi), Übertragbarkeit und Funktionalität Fosterella, Deuterocohnia, Dyckia, Encholirium, Pitcairnia und Ananas Nr. Art ID-Nummer 1 F. micrantha Schütz 11-05-01 2 F. micrantha Schütz 11-12-01 3 F. micrantha Schütz 11-13-01 4 F. robertreadii ’JP 06.0124’ JP 06.0124_1 5 F. robertreadii JP 06.0124_2 6 F. robertreadii JP 06.0124_4 7 F. penduliflora ’NW09.002’ NW09.002-1 8 F. penduliflora NW09.002-2 9 F. penduliflora NW09.002-3 10 F. floridensis ’NW09.003’ NW09.003-1 11 F. floridensis NW09.003-2 12 F. floridensis NW09.003-3 13 F. christophii ’NW09.005’ NW09.005-1 14 F. christophii NW09.005-2 15 F. christophii NW09.005-3 16 F. villosula ’NW09.012’ NW09.012-1 17 F. villosula NW09.012-2 18 F. villosula NW09.012-3 19 F. gracilis ’NW09.021’ NW09.021-1 20 F. gracilis NW09.021-2 21 F. gracilis NW09.021-3 22 F. villosula ’NW09.024’ NW09.024-1 23 F. villosula NW09.024-2 24 F. villosula NW09.024-3 25 F. weberbaueri ’NW09.025’ NW09.025-1 26 F. weberbaueri NW09.025-2 27 F. weberbaueri NW09.025-3 28 F. albicans ’NW09.036’ NW09.036-1 29 F. albicans NW09.036-2 30 F. albicans NW09.036-3 31 F. petiolata ’NW09.037’ NW09.037-1 32 F. petiolata NW09.037-2 33 F. petiolata NW09.037-3 34 Deuterocohnia longipetala BT_123 35 D. scapigera F 45a 36 D. glandulosa F 43a 37 Dyckia estevesii FK0001 38 Dy. marnier-lapostollei BT_121 39 Dy. remotiflora FK0068 40 Encholirium horridum F 46a 200 Anhang Fortsetzung Set 8 Nr. Art ID-Nummer 41 Pitcairnia loki-schmidtiae BT_11 42 P. abundans P6 43 P. burle-marxii P10 44 Ananas comosus BT_19 Set 9 (Kapitel 3.6) Nukleäre 454 (F. rusbyi)- und EST-Mikrosatellitenmarker, Artabgrenzung innerhalb der micrantha-Gruppe Nr. Art ID-Nummer 1 Fosterella christophii ’IM0033-IM0034’ IM0033 2 F. christophii IM0033.2 3 F. christophii IM0033.3 4 F. christophii IM0033.4 5 F. christophii IM0033.5 6 F. christophii IM0034 7 F. christophii ’IM0043-IM0045’ IM0043 8 F. christophii IM0043.1 9 F. christophii IM0043.2 10 F. christophii IM0043.3 11 F. christophii IM0043.4 12 F. christophii IM0044 13 F. christophii IM0045 14 F. christophii ’IM0046-IM0048’ IM0046 15 F. christophii IM0046.1 16 F. christophii IM0046.2 17 F. christophii IM0046.3 18 F. christophii IM0046.4 19 F. christophii IM0046.5 20 F. christophii IM0046.6 21 F. christophii IM0047 22 F. christophii IM0048 23 F. christophii ’IM0050’ IM0050 24 F. christophii ’IM0052-IM0054’ IM0052 25 F. christophii IM0053 26 F. christophii IM0054a 27 F. christophii IM0054b 28 F. christophii ’NW09.005’ NW09.005-6 29 F. christophii NW09.005-7 30 F. christophii NW09.005-8 31 F. christophii NW09.005-9 32 F. christophii NW09.005-10 33 F. christophii ’NW09.006’ NW09.006-1 34 F. christophii ’NW09.030’ NW09.030-1 35 F. christophii NW09.030-2 36 F. christophii NW09.030-3 37 F. christophii NW09.030-4 38 F. christophii NW09.030-6 39 F. christophii NW09.030-7 40 F. christophii NW09.030-8 41 F. christophii NW09.030-10 42 F. christophii ’NW09.034’ NW09.034-1 43 F. christophii NW09.034-2 44 F. christophii NW09.034-3 45 F. christophii NW09.034-4 46 F. christophii NW09.034-5 47 F. christophii NW09.034-6 48 F. christophii NW09.034-7 49 F. christophii NW09.034-8 50 F. christophii NW09.034-10 51 F. micrantha ’Schütz 11-04’ Schütz 11-04-02 52 F. micrantha Schütz 11-04-05 53 F. micrantha Schütz 11-04-06 54 F. micrantha Schütz 11-04-07 55 F. micrantha Schütz 11-04-08 201 Anhang Fortsetzung Set 9 Nr. Art ID-Nummer 56 F. micrantha Schütz 11-04-09 57 F. micrantha ’Schütz 11-05’ Schütz 11-05-01 58 F. micrantha Schütz 11-05-02 59 F. micrantha Schütz 11-05-03 60 F. micrantha Schütz 11-05-04 61 F. micrantha Schütz 11-05-05 62 F. micrantha Schütz 11-05-06 63 F. micrantha Schütz 11-05-07 64 F. micrantha Schütz 11-05-08 65 F. micrantha Schütz 11-05-09 66 F. micrantha Schütz 11-05-10 67 F. micrantha ’Schütz 11-06’ Schütz 11-06-02 68 F. micrantha Schütz 11-06-03 69 F. micrantha Schütz 11-06-04 70 F. micrantha Schütz 11-06-05 71 F. micrantha Schütz 11-06-06 72 F. micrantha Schütz 11-06-09 73 F. micrantha Schütz 11-06-10 74 F. micrantha ’Schütz 11-12’ Schütz 11-12-02 75 F. micrantha Schütz 11-12-04 76 F. micrantha Schütz 11-12-05 77 F. micrantha Schütz 11-12-06 78 F. micrantha Schütz 11-12-07 79 F. micrantha Schütz 11-12-10 80 F. micrantha ’Schütz 11-13’ Schütz 11-13-01 81 F. micrantha Schütz 11-13-02 82 F. micrantha Schütz 11-13-03 83 F. micrantha Schütz 11-13-06 84 F. micrantha Schütz 11-13-07 85 F. micrantha Schütz 11-13-10 86 F. micrantha ’Schütz 11-15’ Schütz 11-15-01 87 F. micrantha Schütz 11-15-02 88 F. micrantha Schütz 11-15-04 89 F. micrantha Schütz 11-15-05 90 F. micrantha Schütz 11-15-07 91 F. micrantha ’Schütz 11-17’ Schütz 11-17-01 92 F. micrantha Schütz 11-17-10 93 F. micrantha Schütz 11-17-03 94 F. micrantha Schütz 11-17-04 95 F. micrantha Schütz 11-17-05 96 F. micrantha Schütz 11-17-06 97 F. micrantha Schütz 11-17-07 98 F. micrantha Schütz 11-17-08 99 F. micrantha ’Schütz 11-19’ Schütz 11-19-01 100 F. micrantha Schütz 11-19-02 101 F. micrantha Schütz 11-19-03 102 F. micrantha Schütz 11-19-04 103 F. micrantha Schütz 11-19-05 104 F. micrantha Schütz 11-19-06 105 F. micrantha Schütz 11-19-07 106 F. micrantha Schütz 11-19-09 107 F. micrantha Schütz 11-19-10 108 F. villosula ’IM0012-IM0013’ IM0012 109 F. villosula IM0012.1 110 F. villosula IM0012.2 111 F. villosula IM0012.3 112 F. villosula IM0012.4 113 F. villosula IM0012.5a 114 F. villosula IM0012.5b 115 F. villosula IM0012.6 116 F. villosula IM0012.7 117 F. villosula IM0012.8 118 F. villosula IM0013 202 Anhang Fortsetzung Set 9 Nr. Art ID-Nummer 119 F. villosula ’IM0019-IM0021’ IM0019-a 120 F. villosula IM0019-b 121 F. villosula IM0019.1 122 F. villosula IM0019.2 123 F. villosula IM0019.3 124 F. villosula IM0019.4 125 F. villosula IM0019.5 126 F. villosula IM0019.7 127 F. villosula IM0019.8 128 F. villosula IM0020 129 F. villosula IM0021a 130 F. villosula IM0021b 131 F. villosula ’IM0022-IM0028’ IM0022 132 F. villosula IM0023 133 F. villosula IM0024 134 F. villosula IM0025 135 F. villosula IM0026 136 F. villosula IM0027 137 F. villosula IM0028 138 F. villosula ’IM0029-IM0030’ IM0029 139 F. villosula IM0030 140 F. villosula ’IM0124-IM0125’ IM0124 141 F. villosula IM0124.1 142 F. villosula IM0124.2 143 F. villosula IM0124.3 144 F. villosula IM0124.4 145 F. villosula IM0124.5a 146 F. villosula IM0124.5b 147 F. villosula IM0124.6 148 F. villosula IM0125 149 F. villosula ’IM0139-IM0142’ IM0139 150 F. villosula IM0139.1 151 F. villosula IM0139.2a 152 F. villosula IM0139.2b 153 F. villosula IM0139.3 154 F. villosula IM0139.4 155 F. villosula IM0139.5 156 F. villosula IM0139.6 157 F. villosula IM0139.7 158 F. villosula IM0140 159 F. villosula IM0141 160 F. villosula IM0142 161 F. villosula ’IM0143-IM0145’ IM0143a 162 F. villosula IM0143.2 163 F. villosula IM0143.3 164 F. villosula IM0143.4 165 F. villosula IM0143.5 166 F. villosula IM0143.6 167 F. villosula IM0144 168 F. villosula IM0145 169 F. villosula ’NW09.012’ NW09.012-6 170 F. villosula NW09.012-7 171 F. villosula NW09.012-8 172 F. villosula NW09.012-9 173 F. villosula NW09.012-10 174 F. villosula ’NW09.019’ NW09.019-1 175 F. villosula NW09.019-2 176 F. villosula NW09.019-3 177 F. villosula NW09.019-4 178 F. villosula ’NW09.024’ NW09.024-1 179 F. villosula NW09.024-2 180 F. villosula NW09.024-3 181 F. villosula NW09.024-4 203 Anhang Fortsetzung Set 9 Nr. Art ID-Nummer 182 F. villosula NW09.024-5 183 F. villosula NW09.024-6 184 F. villosula NW09.024-10 185 F. villosula ’NW09.035’ NW09.035-2 186 F. villosula NW09.035-3 187 F. villosula NW09.035-5 188 F. villosula NW09.035-6 189 F. villosula NW09.035-7 190 F. villosula NW09.035-9 Set 10a (Kapitel 3.3.3.1) Nukleäre 454-Mikrosatellitenmarker (Dy. marnier-lapostollei), Primertests in Dyckia Nr. Art ID-Nummer 1 Dyckia marnier-lapostollei BT_122 2 Dy. marnier-lapostollei var. estevesii BT_121 3 Dy. ferox FK0020 4 Dy. microcalyx FK0009 5 Dy. estevesii FK0001 Set 10b (Kapitel 3.3.3.1) Nukleäre 454-Mikrosatellitenmarker (Dy. marnier-lapostollei), Primertests in Dyckia Nr. Art ID-Nummer 1 Dy. marnier-lapostollei var. estevesii BT_121 2 Dy. dissitiflora D40 3 Dy. pernambucana D175 4 Dy. ferox FK0020 5 Dy. microcalyx FK0009 6 Dy. estevesii FK0001 7 Dy. marnier-lapostollei BT_122 Set 11 (Kapitel 3.3.3.2) Nukleäre 454-Mikrosatellitenmarker (Dy. marnier-lapostollei), Übertragbarkeit und Funktionalität in Dyckia und anderen Gattungen der Bromeliaceae Nr. Art ID-Nummer 1 Dyckia dissitiflora ’Ferro Doido’ D26 2 Dy. dissitiflora D28 3 Dy. pernambucana ’Pesgueira’ D90 4 Dy. pernambucana D91 5 Dy. macedoi ’Serra do Cipo’ D121 6 Dy. macedoi D123 7 Dy. limae ’Buique’ D182 8 Dy. limae D183 9 Dy. marnier-lapostollei var. estevesii BT_121 10 Dy. hebdingii FK0112 11 Dy. maritima FK0113 12 Dy. velascana FK0006 13 Encholirium erectiflorum ER-AFR1 14 E. magalhaesii EM3-RJ 15 E. horridum EH2-RJ 16 E. brachypodium EB1-RJ 17 E. spectabile ’Sergipe’ ES-csf2 18 E. spectabile ES-csf5 19 E. spectabile ES-csf13 20 E. spectabile ES-csf14 21 Deuterocohnia longipetala BT_123 22 Fosterella rusbyi ’JP 06.0078’ JP 06.0078 23 Pitcairnia loki-schmidtiae BT_11 204 Anhang Set 12 (Kapitel 3.5) Nukleäre 454-Mikrosatellitenmarker (Dy. marnier-lapostollei), Artabgrenzung von Dy. dissitiflora, Dy. limae, Dy. macedoi und Dy. pernambucana Nr. Art ID-Nummer 1 Dyckia dissitiflora ’Ferro Doido’ D19 2 Dy. dissitiflora D20 3 Dy. dissitiflora D21 4 Dy. dissitiflora D23 5 Dy. dissitiflora D25 6 Dy. dissitiflora D26 7 Dy. dissitiflora D27 8 Dy. dissitiflora D28 9 Dy. dissitiflora D29 10 Dy. dissitiflora D30 11 Dy. dissitiflora D31 12 Dy. dissitiflora D32 13 Dy. dissitiflora D33 14 Dy. dissitiflora D34 15 Dy. dissitiflora D35 16 Dy. dissitiflora D36 17 Dy. dissitiflora D38 18 Dy. dissitiflora D39 19 Dy. dissitiflora D40 20 Dy. dissitiflora ’Lajes’ D102 21 Dy. dissitiflora D103 22 Dy. dissitiflora D104 23 Dy. dissitiflora D105 24 Dy. dissitiflora D106 25 Dy. dissitiflora D107 26 Dy. dissitiflora D108 27 Dy. dissitiflora D109 28 Dy. dissitiflora D110 29 Dy. dissitiflora D111 30 Dy. dissitiflora ’Morrão’ D112 31 Dy. dissitiflora D113 32 Dy. dissitiflora D114 33 Dy. dissitiflora D115 34 Dy. dissitiflora D116 35 Dy. dissitiflora D117 36 Dy. dissitiflora D118 37 Dy. dissitiflora D119 38 Dy. pernambucana ’Brejo Madre Deus’ 1A 39 Dy. pernambucana 2A 40 Dy. pernambucana 3A 41 Dy. pernambucana 4A 42 Dy. pernambucana 5A 43 Dy. pernambucana 6A 44 Dy. pernambucana 7A 45 Dy. pernambucana 8A 46 Dy. pernambucana 9A 47 Dy. pernambucana 10A 48 Dy. pernambucana ’Pesgueira’ D90 49 Dy. pernambucana D91 50 Dy. pernambucana D92 51 Dy. pernambucana D93 52 Dy. pernambucana D94 53 Dy. pernambucana D95 54 Dy. pernambucana D96 55 Dy. pernambucana D97 56 Dy. pernambucana D98 57 Dy. pernambucana D99 58 Dy. pernambucana ’Pico do Papagaio’ D161 59 Dy. pernambucana D162 60 Dy. pernambucana D163 61 Dy. pernambucana D164 62 Dy. pernambucana D165 205 Anhang Fortsetzung Set 12 Nr. Art ID-Nummer 63 Dy. pernambucana ’Lajedo Santa Rita’ D171 64 Dy. pernambucana D172 65 Dy. pernambucana D173 66 Dy. pernambucana D174 67 Dy. pernambucana D175 68 Dy. macedoi ’Serra do Cipo’ D120 69 Dy. macedoi D121 70 Dy. macedoi D122 71 Dy. macedoi D123 72 Dy. macedoi D124 73 Dy. macedoi D125 74 Dy. macedoi D126 75 Dy. macedoi D127 76 Dy. macedoi D128 77 Dy. macedoi D129 78 Dy. macedoi D130 79 Dy. macedoi D131 80 Dy. limae ’Buique’ D181 81 Dy. limae D182 82 Dy. limae D183 83 Dy. limae D184 84 Dy. limae D185 85 Dy. limae D188 86 Dy. limae D186 87 Dy. limae D187 88 Dy. limae D189 89 Dy. limae D190 Set 13 (Kapitel 3.4.2.1) Plastidäre 454-Mikrosatellitenmarker (F. rusbyi), Primertests innerhalb der Pitcairnioideae Nr. Art ID-Nummer 1 Fosterella rusbyi ’JP 06.0078’ JP 06.0078 2 F. rusbyi ’JP 06.0070’ JP 06.0070a 3 F. rusbyi JP 06.0070m 4 F. christophii IM0033 5 F. christophii NW09.005-1 6 F. micrantha Schütz 11-04-08 7 F. micrantha Schütz 11-12-01 8 F. villosula ’NW09.012’ NW09.012-1 9 F. villosula NW09.012-2 10 Dyckia marnier-lapostollei var. estevesii BT_121 11 Deuterocohnia longipetala BT_123 12 Encholirium spec. FK0078 13 Ananas comosusglomerata BT_75 Set 14 (Kapitel 3.4.2.1) Plastidäre 454-Mikrosatellitenmarker (F. rusbyi), Übertragbarkeit in verschiedene Gattungen und Unterfamilien Nr. Art ID-Nummer 1 Catopsis morreniana BT_95 2 Ca. morreniana BT_96 3 Ca. morreniana BT_97 4 Ca. morreniana BT_98 5 Ca. morreniana BT_99 6 Ca. morreniana BT_116 7 Puya mirabilis BT_101 8 Pu. mirabilis BT_102 9 Pu. mirabilis BT_103 10 Pu. mirabilis BT_117 11 Brocchinia acuminata BT_1 12 Br. spec. BT_94 13 Hechtia glomerata BT_100 14 H. glomerata BT_50 15 Pitcairnia heterophylla FK0083 16 P. atrorubens F 34a 206 Anhang Fortsetzung Set 14 Nr. Art ID-Nummer 17 P. pungens FK0084 18 Ananas ananassoides BT_27 19 A. bracteatus BT_15 20 A. bracteatus BT_28 21 A. bracteatus BT_73 22 A. bracteatus BT_74 23 A. bracteatus BT_80 24 A. spec. BT_16 25 A. comosus BT_17 26 A. comosus BT_18 27 A. comosus BT_19 28 A. comosus BT_20 29 A. comosus BT_75 30 A. comosus BT_77 31 A. comosus BT_81 32 A. comosus BT_82 33 A. comosus BT_85 34 A. nanus BT_29 35 A. nanus BT_78 36 A. nanus BT_84 37 A. nanus BT_90 38 A. comosus BT_79 39 Fosterella rusbyi ’JP 06.0078’ JP 06.0078 Set 15 (Kapitel 3.7) Nukleäre und plastidäre 454-Mikrosatellitenmarker (F. rusbyi), Populationsgenetik von F. rusbyi Nr. Art ID-Nummer 1 Fosterella rusbyi ’NW09.039’ NW09.039-1 2 F. rusbyi NW09.039-2 3 F. rusbyi ’IM0133-IM0135’ IM0133 4 F. rusbyi IM0133.1 5 F. rusbyi IM0133.2 6 F. rusbyi IM0133.3 7 F. rusbyi IM0133.4-1 8 F. rusbyi IM0133.4-2 9 F. rusbyi IM0133.5 10 F. rusbyi IM0133.7 11 F. rusbyi IM0134 12 F. rusbyi IM0135 13 F. rusbyi ’IM0130-IM0132’ IM0130.1 14 F. rusbyi IM0130.2 15 F. rusbyi IM0130.3 16 F. rusbyi IM0130.4 17 F. rusbyi IM0130.5 18 F. rusbyi IM0130.6 19 F. rusbyi IM0131 20 F. rusbyi IM0132 21 F. rusbyi ’NW09.038’ NW09.038-1 22 F. rusbyi NW09.038-2 23 F. rusbyi NW09.038-4 24 F. rusbyi NW09.038-5 25 F. rusbyi NW09.038-6 26 F. rusbyi NW09.038-7 27 F. rusbyi NW09.038-8 28 F. rusbyi NW09.038-9 29 F. rusbyi NW09.038-10 30 F. rusbyi ’IM0128-IM0129’ IM0128 31 F. rusbyi IM0128.1-1 32 F. rusbyi IM0128.1-2 33 F. rusbyi IM0128.2 34 F. rusbyi IM0129 35 F. rusbyi ’IM0118-IM0120’ IM0118 36 F. rusbyi IM0118.1 207 Anhang Fortsetzung Set 15 Nr. Art ID-Nummer 37 F. rusbyi IM0118.2 38 F. rusbyi IM0118.3 39 F. rusbyi IM0118.4 40 F. rusbyi IM0119 41 F. rusbyi IM0120 42 F. rusbyi ’IM0071-IM0073’ IM0071 43 F. rusbyi IM0071.1 44 F. rusbyi IM0071.2 45 F. rusbyi IM0071.3 46 F. rusbyi IM0071.4 47 F. rusbyi IM0071.6 48 F. rusbyi IM0072 49 F. rusbyi IM0073 50 F. rusbyi ’NW09.033’ NW09.033-1 51 F. rusbyi NW09.033-2 52 F. rusbyi NW09.033-3 53 F. rusbyi NW09.033-4 54 F. rusbyi NW09.033-5 55 F. rusbyi NW09.033-6 56 F. rusbyi NW09.033-7 57 F. rusbyi NW09.033-8 58 F. rusbyi NW09.033-9 59 F. rusbyi ’NW09.032’ NW09.032-1 60 F. rusbyi NW09.032-2 61 F. rusbyi NW09.032-3 62 F. rusbyi NW09.032-4 63 F. rusbyi NW09.032-5 64 F. rusbyi NW09.032-6 65 F. rusbyi NW09.032-7 66 F. rusbyi NW09.032-8 67 F. rusbyi NW09.032-10 68 F. rusbyi ’NW09.031’ NW09.031-1 69 F. rusbyi NW09.031-2 70 F. rusbyi NW09.031-3 71 F. rusbyi NW09.031-4 72 F. rusbyi NW09.031-5 73 F. rusbyi NW09.031-6 74 F. rusbyi NW09.031-7 75 F. rusbyi NW09.031-8 76 F. rusbyi NW09.031-9 77 F. rusbyi NW09.031-10 78 F. rusbyi ’IM0111-IM0113’ IM0111 79 F. rusbyi IM0111.1 80 F. rusbyi IM0111.2 81 F. rusbyi IM0111.3 82 F. rusbyi IM0111.4 83 F. rusbyi IM0111.5 84 F. rusbyi IM0111.6 85 F. rusbyi IM0111.7 86 F. rusbyi IM0112 87 F. rusbyi IM0113 88 F. rusbyi ’IM0108-IM0110’ IM0108 89 F. rusbyi IM0110 90 F. rusbyi ’NW09.029’ NW09.029-1 91 F. rusbyi NW09.029-2 92 F. rusbyi NW09.029-3 93 F. rusbyi NW09.029-4 94 F. rusbyi NW09.029-5 95 F. rusbyi NW09.029-6 96 F. rusbyi NW09.029-7 97 F. rusbyi NW09.029-8 98 F. rusbyi NW09.029-9 99 F. rusbyi ’IM0105-IM0107’ IM0105 100 F. rusbyi IM0105.1 208 Anhang Fortsetzung Set 15 Nr. Art ID-Nummer 101 F. rusbyi IM0105.2 102 F. rusbyi IM0105.3 103 F. rusbyi IM0105.4 104 F. rusbyi IM0105.5 105 F. rusbyi IM0105.6 106 F. rusbyi IM0105.7-1 107 F. rusbyi IM0105.7-2 108 F. rusbyi IM0106 109 F. rusbyi IM0107 110 F. rusbyi ’IM0102-IM0104’ IM0102 111 F. rusbyi IM0103 112 F. rusbyi IM0104 113 F. rusbyi ’NW09.028’ NW09.028-1 114 F. rusbyi NW09.028-2 115 F. rusbyi NW09.028-3 116 F. rusbyi NW09.028-4 117 F. rusbyi NW09.028-5 118 F. rusbyi NW09.028-6 119 F. rusbyi NW09.028-7 120 F. rusbyi NW09.028-8 121 F. rusbyi NW09.028-9 122 F. rusbyi NW09.028-10 123 F. rusbyi ’IM0098-IM0101’ IM0098 124 F. rusbyi IM0098.1 125 F. rusbyi IM0098.2 126 F. rusbyi IM0098.3 127 F. rusbyi IM0098.4 128 F. rusbyi IM0098.5 129 F. rusbyi IM0098.6 130 F. rusbyi IM0098.7-1 131 F. rusbyi IM0098.7-2 132 F. rusbyi IM0098.8-1 133 F. rusbyi IM0098.8-2 134 F. rusbyi IM0099 135 F. rusbyi IM0100 136 F. rusbyi IM0101 137 F. rusbyi ’NW09.027’ NW09.027-1 138 F. rusbyi NW09.027-2 139 F. rusbyi NW09.027-3 140 F. rusbyi NW09.027-4 141 F. rusbyi NW09.027-5 142 F. rusbyi NW09.027-7 143 F. rusbyi NW09.027-8 144 F. rusbyi ’IM0095-IM0097’ IM0095 145 F. rusbyi IM0095.1 146 F. rusbyi IM0095.2 147 F. rusbyi IM0095.3 148 F. rusbyi IM0095.4 149 F. rusbyi IM0095.5 150 F. rusbyi IM0095.6 151 F. rusbyi IM0095.7 152 F. rusbyi IM0097 153 F. rusbyi ’NW09.015’ NW09.015-1 154 F. rusbyi NW09.015-2 155 F. rusbyi NW09.015-4 156 F. rusbyi NW09.015-5 157 F. rusbyi NW09.015-7 158 F. rusbyi NW09.015-8 159 F. rusbyi NW09.015-10 160 F. rusbyi ’NW09.016’ NW09.016-1 161 F. rusbyi NW09.016-2 162 F. rusbyi NW09.016-3 163 F. rusbyi NW09.016-4 164 F. rusbyi NW09.016-5 209 Anhang Fortsetzung Set 15 Nr. Art ID-Nummer 165 F. rusbyi NW09.016-7 166 F. rusbyi NW09.016-8 167 F. rusbyi NW09.016-9 168 F. rusbyi NW09.016-10 169 F. rusbyi ’IM0077-IM0080’ IM0077 170 F. rusbyi IM0077.1 171 F. rusbyi IM0077.3 172 F. rusbyi IM0077.4 173 F. rusbyi IM0077.5-1 174 F. rusbyi IM0077.5-2 175 F. rusbyi IM0077.6 176 F. rusbyi IM0078 177 F. rusbyi IM0079 178 F. rusbyi IM0080 179 F. rusbyi ’IM0081-IM0083’ IM0081 180 F. rusbyi IM0081.1 181 F. rusbyi IM0081.2 182 F. rusbyi IM0081.3 183 F. rusbyi IM0081.4 184 F. rusbyi IM0081.5 185 F. rusbyi IM0081.6 186 F. rusbyi IM0081.7-1 187 F. rusbyi IM0081.7-2 188 F. rusbyi IM0082 189 F. rusbyi IM0083 190 F. rusbyi ’IM0084-IM0090’ IM0084 191 F. rusbyi IM0084.2 192 F. rusbyi IM0084.3 193 F. rusbyi IM0084.4 194 F. rusbyi IM0084.5 195 F. rusbyi IM0084.6 196 F. rusbyi IM0084.7-1 197 F. rusbyi IM0084.7-2 198 F. rusbyi IM0085 199 F. rusbyi IM0086 200 F. rusbyi IM0087 201 F. rusbyi IM0088 202 F. rusbyi IM0089 203 F. rusbyi IM0090 204 F. rusbyi ’NW09.008’ NW09.008-1 205 F. rusbyi NW09.008-2 206 F. rusbyi NW09.008-3 207 F. rusbyi NW09.008-4 208 F. rusbyi NW09.008-5 209 F. rusbyi NW09.008-7 210 F. rusbyi NW09.008-8 211 F. rusbyi NW09.008-9 212 F. rusbyi NW09.008-10 213 F. rusbyi ’NW09.009’ NW09.009-1 214 F. rusbyi NW09.009-2 215 F. rusbyi NW09.009-3 216 F. rusbyi NW09.009-4 217 F. rusbyi NW09.009-5 218 F. rusbyi NW09.009-6 219 F. rusbyi NW09.009-7 220 F. rusbyi NW09.009-10 221 F. rusbyi ’NW09.010’ NW09.010-1 222 F. rusbyi NW09.010-2 223 F. rusbyi NW09.010-3 224 F. rusbyi NW09.010-4 225 F. rusbyi NW09.010-5 226 F. rusbyi NW09.010-6 227 F. rusbyi NW09.010-7 228 F. rusbyi NW09.010-8 210 Anhang Fortsetzung Set 15 Nr. Art ID-Nummer 229 F. rusbyi NW09.010-9 230 F. rusbyi NW09.010-10 231 F. rusbyi ’NW09.018’ NW09.018-1 232 F. rusbyi NW09.018-2 233 F. rusbyi NW09.018-5 234 F. rusbyi NW09.018-6 235 F. rusbyi NW09.018-8 236 F. rusbyi NW09.018-9 237 F. rusbyi NW09.018-10 238 F. rusbyi NW09.018-11 239 F. rusbyi NW09.018-12 240 F. rusbyi ’JP 06.0070’ JP 06.0070a 241 F. rusbyi JP 06.0070b 242 F. rusbyi JP 06.0070c 243 F. rusbyi JP 06.0070d 244 F. rusbyi JP 06.0070e 245 F. rusbyi JP 06.0070f 246 F. rusbyi JP 06.0070g 247 F. rusbyi JP 06.0070h 248 F. rusbyi JP 06.0070i 249 F. rusbyi JP 06.0070j 250 F. rusbyi JP 06.0070k 251 F. rusbyi JP 06.0070l 252 F. rusbyi JP 06.0070m 253 F. rusbyi ’JP 06.0078’ JP 06.0078 211 Anhang Tabelle T3: Frequenz und Anzahl der Wiederholungseinheiten von 107 verschiedenen Mikrosatellitenmotiven innerhalb des assemblierten 454- Datensatzes von Fosterella rusbyi (vgl. Kapitel 3.2.3); n.d.: nicht definiert. SSR-Motiv Anzahl der Wiederholungseinheiten Gesamt4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 >15 A n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. 111 216 327 C n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. 6 18 24 AG n.d. n.d. n.d. 201 152 109 73 54 32 34 22 18 47 742 AT n.d. n.d. n.d. 195 119 94 53 52 39 24 14 9 36 635 AC n.d. n.d. n.d. 38 33 25 16 6 5 4 8 5 13 153 CG n.d. n.d. n.d. 3 1 1 1 6 AAT n.d. n.d. 73 28 20 15 14 14 7 9 7 2 8 197 AAG n.d. n.d. 42 17 15 5 6 3 3 3 4 98 CCG n.d. n.d. 49 19 13 5 1 87 ACG n.d. n.d. 28 19 13 6 4 3 0 1 74 AGG n.d. n.d. 24 12 5 2 2 1 46 ACT n.d. n.d. 17 4 1 6 4 2 34 AAC n.d. n.d. 10 5 6 6 2 29 ACC n.d. n.d. 6 6 2 2 16 AAAT n.d. 47 11 4 2 1 1 66 ACAT n.d. 5 3 2 2 1 13 AATT n.d. 7 1 2 10 AAAG n.d. 4 2 1 1 1 9 ATCG n.d. 4 1 1 6 AAAC n.d. 5 5 AGAT n.d. 3 1 1 5 AGGG n.d. 1 1 2 4 ACAG n.d. 1 1 2 AGCG n.d. 1 1 2 AACC n.d. 1 1 AACG n.d. 1 1 ACGC n.d. 1 1 ACTC n.d. 1 1 ATAG n.d. 1 1 ATCC n.d. 1 1 AAAAT 20 6 2 1 29 AAAAG 5 1 1 7 AAAAC 4 1 1 6 AAATT 5 1 6 ACCCG 3 2 1 6 AATAT 3 1 1 5 AAATC 4 4 AGGGG 3 1 4 AGAGG 1 2 3 CCCGG 3 3 AACTC 1 1 2 ACCGG 2 2 AGATC 2 2 ATATA 1 1 2 ATCCC 2 2 AAACC 1 1 AAAGC 1 1 AACAT 1 1 AACGG 1 1 ACCCC 1 1 ACTAT 1 1 ACTCC 1 1 AGGAT 1 1 ATCCG 1 1 AAAAAT 4 2 3 9 AACCCT 7 2 9 AACCCG 5 1 1 1 8 AAAAAG 5 2 7 AAAATT 4 2 1 7 ACGGCG 5 5 AAATTT 4 4 AAATTC 2 1 3 AAGGAG 1 2 3 ACGAGG 1 2 3 AAAGAG 1 1 2 ACCCCG 2 2 ACCGCC 2 2 AGAGCG 2 2 CCCCCG 1 1 2 CCGGCG 2 2 ATATAC 2 2 AAAAAC 1 1 AAATAT 1 1 AACAAT 1 1 AACACC 1 1 AACCGG 1 1 AAGACG 1 1 AAGAGG 1 1 AAGATC 1 1 212 Anhang Fortsetzung Tabelle T3: SSR-Motiv Anzahl der Wiederholungseinheiten Gesamt4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 >15 AAGATG 1 1 AAGCAG 1 1 AAGGCG 1 1 AATATC 1 1 AATGAG 1 1 AATGAT 1 1 ACACAT 1 1 ACCACT 1 1 ACCCGG 1 1 ACGAGC 1 1 ACGATC 1 1 ACGCCG 1 1 ACGGAG 1 1 ACGGGG 1 1 AGATCG 1 1 AGCATG 1 1 AGCCCT 1 1 AGCGCG 1 1 AGCGGG 1 1 AGCTTT 1 1 AGGCGG 1 1 AGGGGG 1 1 ATAGGG 1 1 ATATGG 1 1 ATCAGC 1 1 ATCATG 1 1 ATCGGC 1 1 ATGCAC 1 1 Gesamt 135 127 280 568 386 281 175 134 87 72 54 154 343 2.796 213 Anhang Tabelle T4: Frequenz und Anzahl der Wiederholungseinheiten von 76 verschiedenen Mikrosatellitenmotiven innerhalb des assemblierten 454- Datensatzes von Dyckia marnier-lapostollei var. estevesii (vgl. Kapitel 3.2.3); n.d.: nicht definiert. SSR-Motiv Anzahl der Wiederholungseinheiten Gesamt4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 >15 A n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. 79 137 216 C n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. 2 11 13 AG n.d. n.d. n.d. 124 76 45 42 28 21 22 9 11 31 409 AT n.d. n.d. n.d. 104 72 65 29 31 15 11 10 10 24 371 AC n.d. n.d. n.d. 18 25 18 8 9 5 5 1 12 101 CG n.d. n.d. n.d. 1 1 2 AAT n.d. n.d. 31 18 11 10 5 4 5 6 2 2 5 99 AAG n.d. n.d. 22 12 11 5 5 2 1 58 CCG n.d. n.d. 28 11 8 1 48 AGG n.d. n.d. 16 9 4 2 31 ACG n.d. n.d. 13 6 6 3 1 29 ACT n.d. n.d. 11 6 1 2 1 21 AAC n.d. n.d. 4 3 4 3 3 1 1 19 ACC n.d. n.d. 2 2 4 AAAT n.d. 14 11 7 4 1 37 AAAG n.d. 7 2 1 2 3 1 16 AATT n.d. 5 1 1 1 8 ACAT n.d. 2 3 1 1 7 AGCT n.d. 3 3 AAAC n.d. 1 1 AACT n.d. 1 1 ACAG n.d. 1 1 ACTC n.d. 1 1 AAAAT 9 1 2 12 AAAAG 3 1 1 5 AAATT 3 1 4 AATAT 3 1 4 AAAAC 2 1 3 AAAGT 1 1 2 AACTT 2 2 AAGAT 1 1 2 AAAGG 1 1 AACAT 1 1 AACCT 1 1 AACGG 1 1 ACCCC 1 1 ACCCG 1 1 ACGGG 1 1 ACGTC 1 1 AGAGG 1 1 AGGGG 1 1 AGTCT 1 1 CCCCG 1 1 AAAAAT 4 1 5 AACCCT 2 1 3 AGGCGG 2 1 3 AAAAAC 1 1 2 AACCCG 2 2 AAGCGG 2 2 AAGCTG 1 1 2 ACCCCG 2 2 AAAAAG 1 1 AAAGGG 1 1 AAATAT 1 1 AAATTC 1 1 AAATTT 1 1 AACCCC 1 1 AACCTG 1 1 AACTAT 1 1 AAGAAT 1 1 AAGGAG 1 1 AAGTAG 1 1 AAGTTC 1 1 AATGGT 1 1 ACCACG 1 1 ACCGCC 1 1 ACGACC 1 1 ACGAGC 1 1 ACGTCT 1 1 AGAGAT 1 1 AGCGCG 1 1 AGCGGG 1 1 AGGCGC 1 1 AGGCTG 1 1 ATCTAT 1 1 Gesamt 62 52 151 326 216 165 99 75 46 41 26 106 222 1.587 214 Anhang Tabelle T5: Frequenz und Anzahl der Wiederholungseinheiten von 55 verschiedenen Mikrosatellitenmotiven innerhalb des assemblierten 454- Datensatzes von Deuterocohnia longipetala (vgl. Kapitel 3.2.2); n.d.: nicht definiert. SSR-Motiv Anzahl der Wiederholungseinheiten Gesamt4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 >15 A n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. 27 68 95 C n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. 3 2 5 AG n.d. n.d. n.d. 34 22 22 18 10 9 5 4 9 25 158 AT n.d. n.d. n.d. 12 14 16 9 6 4 3 4 1 4 73 AC n.d. n.d. n.d. 10 8 8 3 2 2 4 4 2 1 44 CG n.d. n.d. n.d. 3 3 AAT n.d. n.d. 7 8 5 3 4 3 1 1 1 2 35 AAG n.d. n.d. 7 10 5 3 5 1 1 32 CCG n.d. n.d. 13 7 2 1 23 AGG n.d. n.d. 5 3 5 2 1 1 17 ACG n.d. n.d. 2 2 3 1 8 ACT n.d. n.d. 4 2 1 7 AAC n.d. n.d. 3 1 2 6 ACC n.d. n.d. 1 1 2 AAAT n.d. 9 2 1 12 AAAG n.d. 4 1 1 6 ACAT n.d. 2 1 3 AGAT n.d. 2 2 AGCG n.d. 2 2 AAGT n.d. 1 1 AATC n.d. 1 1 AATT n.d. 1 1 ACGC n.d. 1 1 ACGG n.d. 1 1 AAAAT 6 6 AAAAG 3 3 AACCT 2 2 ACCCG 2 2 AAACG 1 1 AAACT 1 1 AAATT 1 1 AACCG 1 1 AAGAG 1 1 AGAGA 1 1 AGAGG 1 1 AGGGT 1 1 AAGAGG 2 1 3 AGGCGG 2 1 3 AAAATT 2 2 AACCCG 2 2 AAAAAT 1 1 AAAGTT 1 1 AAATTT 1 1 AACCAC 1 1 AACCCT 1 1 AACCTG 1 1 AAGCGT 1 1 AATAGT 1 1 ACATAT 1 1 ACGAGT 1 1 ACGCCG 1 1 AGAGCT 1 1 AGCGGG 1 1 AGTGGT 1 1 CCGCGG 1 1 Gesamt 40 23 50 93 67 58 42 22 18 13 13 43 102 584 215 Anhang Tabelle T6: Frequenz und Anzahl der Wiederholungseinheiten von 38 verschiedenen Mikrosatellitenmotiven innerhalb des assemblierten EST- Datensatzes von Ananas comosus (MOYLE et al. 2005; vgl. Kapitel 3.2.3); n.d.: nicht definiert. SSR-Motiv Anzahl der Wiederholungseinheiten Gesamt4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 >15 A n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. 21 94 115 AG n.d. n.d. n.d. 37 30 18 23 15 12 13 14 14 55 231 AT n.d. n.d. n.d. 5 8 4 3 1 21 AC n.d. n.d. n.d. 4 1 2 2 2 2 13 CG n.d. n.d. n.d. 2 2 ACG n.d. 28 17 17 6 8 5 9 1 1 92 AGG n.d. 31 14 6 1 52 AAG n.d. 19 12 8 6 2 1 1 1 50 AAT n.d. 9 3 4 2 2 20 ACT n.d. 7 4 4 1 1 2 19 AAC n.d. 2 2 2 2 2 1 11 CCG n.d. 4 3 1 2 1 11 ACC n.d. 5 1 2 1 1 10 AAAG n.d. 4 2 1 7 ACCT n.d. 4 4 AAAC n.d. 1 1 2 AAAT n.d. 1 1 2 AGCG n.d. 2 2 AACT n.d. 1 1 ACCG n.d. 1 1 ACTG n.d. 1 1 AGCT n.d. 1 1 ACGT n.d. 1 1 AAAAG n.d. 3 1 4 AAAAT n.d. 2 1 3 AACAC n.d. 1 1 AAGAG n.d. 1 1 AGCCG n.d. 1 1 AAGCT n.d. 1 1 ACCAT n.d. 1 1 AAAAAG n.d. 3 3 AACCCT n.d. 2 2 AAGAGG n.d. 3 1 4 AAGGCG n.d. 2 2 AACATC n.d. 1 1 ACGGCG n.d. 1 1 ACTGCG n.d. 1 1 ACGAGG n.d. 1 1 Gesamt - 137 65 92 60 37 40 30 16 15 17 36 151 696 216 Anhang Abbildung A1: PCR-Produkte an 48 Mikrosatellitenloci basierend auf den EST-Sequenzen von Ananas comosus, MOYLE et al. 2005) nach Auftrennung auf 1,5%igen Agarosegelen im Pflanzenset 1. Auftragsreihenfolge: Ananas bracteatus (1), Ananas spec. (2), A. comosus (3-6), N = Negativkontrolle; vgl. Kapitel 3.3.1.1. Die Einzelbilder wurden teilweise zerschnitten und anschließend zusammengefügt. Zur Abschätzung der Fragmentlängen wurde vor der ersten Probe und nach der Negativkontrolle ein 100bp-Längenstandard aufgetragen. 217 Anhang Fortsetzung Abbildung A1 218 Anhang Abbildung A2: PCR-Produkte an 30 Mikrosatellitenloci basierend auf den 454-Sequenzen von Fosterella rusbyi nach Auftrennung auf 1,5%igen Agarosegelen im Pflanzenset 6. Die jeweils erste Spur repräsentiert die Positivkontrolle F. rusbyi (JP 06.0078), auf deren Basis die 454-Sequenzen generiert wurden. In den Spuren zwei bis fünf sind die PCR-Produkte der Individuen F. rusbyi (NW09.008-6), F. floridensis (NW09.003-1), F. robertreadii (BT_138) und F. weberbaueri (NW09.025-1) aufgetragen. N = Negativkontrolle; vgl. Kapitel 3.3.2.1. Zur Abschätzung der Fragmentlängen wurde zusätzlich ein 100bp-Längenstandard vor der ersten Probe oder hinter der Negativkontrolle aufgetragen. 219 Anhang Abbildung A3a: PCR-Produkte an 30 Mikrosatellitenloci basierend auf den 454-Sequenzen von Dyckia marnier-lapostollei var. estevesii nach Auftrennung auf 1,5%igen Agarosegelen im Pflanzenset 10a. Die jeweils zweite Spur repräsentiert die Positivkontrolle Dy. marnier-lapostollei var. estevesii (BT_121), auf deren Basis die 454-Sequenzen generiert wurden. In der ersten Spur ist das PCR-Produkt von Dyckia marnier-lapostollei (BT_122) aufgetragen, in den Spuren drei bis 5 die PCR-Produkte von Dy. ferox (FK0020), Dy. microcalyx (FK0009) und Dy. estevesii (FK0001), N = Negativkontrolle; vgl. Kapitel 3.3.3.1. Zur Abschätzung der Fragmentlängen wurde zusätzlich ein 100bp-Längenstandard vor der ersten Probe oder hinter der Negativkontrolle aufgetragen. 220 Anhang Abbildung A3b: PCR-Produkte an 20 Mikrosatellitenloci basierend auf den 454-Sequenzen von Dyckia marnier-lapostollei var. estevesii nach Auftrennung auf 1,5%igen Agarosegelen im Pflanzenset 10b. Die jeweils erste Spur repräsentiert die Positivkontrolle Dy. marnier-lapostollei var. estevesii (BT_121), auf deren Basis die 454-Sequenzen generiert wurden. In den Spuren zwei bis sieben sind die PCR-Produkte von Dy. dissitiflora (D40), Dy. pernambucana (D175), Dy. ferox (FK0020), Dy. microcalyx var. indet. (FK0009), Dy. estevesii (FK0001) und Dy. marnier-lapostollei (BT_122) aufgetragen; vgl. Kapitel 3.3.3.1. N = Negativkontrolle. Zur Abschätzung der Fragmentlängen wurde zusätzlich ein 100bp-Längenstandard vor der ersten Probe oder hinter der Negativkontrolle aufgetragen. 221 Anhang 222 Ab bi ld un g A4 : S pe zi fis ch e B an de nm us te r a n 18 E ST -M ik ro sa te lli te nl oc i n ac h Au ftr en nu ng au f h oc ha uf lö se nd en 6% -ig en P AA -G el en . A uf tr ag sr ei he nf ol ge ei ne s T ei ls vo n Se t 2 : 1 -2 = An an as an an as so id es (B T_ 87 ,B T_ 27 ), 3- 5 = A. br ac tea tu s ( BT _7 3, BT _7 4, BT _8 0) , 6 -1 1+ 18 -1 9 = A. co m os us (B T_ 75 , B T_ 76 , B T_ 77 , B T_ 81 , B T_ 82 , B T_ 89 ,B T_ 79 , B T_ 85 ), 12 = A. fr itz m ue lle ri (B T_ 88 ), 13 = A. lu cid us (B T_ 83 ), 14 -1 7 = A . n an us (B T_ 78 , B T_ 84 , B T_ 86 , B T_ 90 ), 20 = Ps eu da na na s s ag en ar iu s ( BT _9 1) , 2 1- 22 = De ut er oc oh ni a l on gip eta la (N 11 6, N2 67 ), vg l. Ka pi te l 3 .3. 2.2 . Anhang Abbildung A5: Spezifische Bandenmuster an sechs EST-Mikrosatellitenloci in 24 Fosterella rusbyi-Akzessionen (Set 5). Die Pflanzenproben stammen aus acht bolivianischen Populationen. Weiterhin wurde eine Ananas comosus-Akzession als Positivkontrolle aufgetragen. Auftragsreihenfolge: 1-4 = Population NW09.010, 5-7 = Population NW09.015, 8-10 = Population NW09.018, 11-13 = Population NW09.27, 14-16 = Population NW09.031, 17-19 = Population NW09.032, 20-22 = Population NW09.038, 23 und 24 = Population NW09.039, 25 = A. comosus (BT_20); vgl. Kapitel 3.3.2.2. Teilweise liegen die Fragmente der Positivkontrolle aufgrund einer deutlichen Längendifferenz im Vergleich zu denen in F. rusbyi außerhalb des abgebildeten Bereichs. Die Original-Bilder wurden zerschnitten und wieder zusammengefügt, daher rührt die jeweilige Kante zwischen der vierten Spur und der Standardsequenz vor der fünften Spur. 223 Anhang Abbildung A6: Verbreitungskarte von Fosterella rusbyi in den Departamentos La Paz und Cochabamba (Bolivien). Rote Punkte entsprechen den in der vorliegenden Arbeit untersuchten Populationen, die blauen Punkte repräsentieren die aus der Literatur (PETERS 2009) bekannten Fundorte. Die farbigen Polygone ermöglichen die leichtere Zuordnung der Populationen zu den neun geographischen Gruppen aus Abbildung 3.22 (Bezug der Karte: GoogleEarth-Satellitenaufnahme). 224 Anhang Tabelle T7: Zusammenstellung der 27 gefundenen privaten Allele an fünfzehn 454-Mikrosatellitenloci in 30 Populationen von F. rusbyi-Individuen. (N): Anzahl der Individuen pro Population, die jeweiligen Fragmentlängen und die Frequenzen der privaten Allele sind dem digitalen Anhang DA-7 zu entnehmen (vgl. Kapitel 3.7.1). Population (N) ng Fo s_ 1 ng Fo s_ 4 ng Fo s_ 6 ng Fo s_ 8 ng Fo s_ 9 ng Fo s_ 11 ng Fo s_ 12 ng Fo s_ 13 ng Fo s_ 14 ng Fo s_ 16 ng Fo s_ 18 ng Fo s_ 21 ng Fo s_ 22 ng Fo s_ 29 ng Fo s_ 30 Total NW09.039 (2) IM0133-IM0135 (10) IM0130-IM0132 (8) NW09.038 (9) IM0128-IM0129 (5) IM0118-IM0120 (7) 1 1 1 3 IM0071-IM0073 (8) NW09.033 (9) NW09.032 (9) 1 1 NW09.031 (10) 1 1 2 IM0111-IM0113 (10) 1 1 2 IM0108-IM0110 (2) NW09.029 (9) 1 1 IM0105-IM0107 (11) IM0102-IM0104 (3) NW09.028 (10) IM0098-IM0101 (14) NW09.027 (7) 1 1 IM0095-IM0097 (9) 1 1 NW09.015 (7) NW09.016 (9) 1 1 IM0077-IM0080 (10) 1 1 IM0081-IM0083 (11) IM0084-IM0090 (14) 1 1 1 1 4 NW09.008 (9) 1 1 NW09.009 (8) NW09.010 (10) 1 1 NW09.018 (9) 1 1 JP 06.0070 (13) 1 2 1 1 5 JP 06.0078 (1) 1 1 2 Total 1 2 1 3 2 1 - 1 1 1 3 2 2 4 3 Tabelle T8: Verteilung der 19 ermittelten Haplotypen auf der Basis von sieben plastidären Mikrosatellitenloci in 253 F. rusbyi-Akzessionen aus 30 Populationen. Die grau hinterlegten Zahlen stehen für die acht privaten Haplotypen im Datensatz. N = Anzahl der untersuchten Individuen. Die jeweiligen Fragmentlängen und die Allelfrequenzen sind im digitalen Anhang DA-7 zusammengestellt (vgl. Kapitel 3.7.2.1). Haplotyp NW 09 .0 39 IM 01 33 -IM 01 35 IM 01 30 -IM 01 32 NW 09 .0 38 IM 01 28 -IM 01 29 IM 01 18 -IM 01 20 IM 00 71 -IM 00 73 NW 09 .0 33 NW 09 .0 32 NW 09 .0 31 IM 01 11 -IM 01 13 IM 01 08 -IM 01 10 NW 09 .0 29 IM 01 05 -IM 01 07 IM 01 02 -IM 01 04 NW 09 .0 28 IM 00 98 -IM 01 01 NW 09 .0 27 IM 00 95 -IM 00 97 NW 09 .0 15 NW 09 .0 16 IM 00 77 -IM 00 80 IM 00 81 -IM 00 83 IM 00 84 -IM 00 90 NW 09 .0 08 NW 09 .0 09 NW 09 .0 10 NW 09 .0 18 JP 0 6. 00 70 JP 0 6. 00 78 To ta l ( N = 2 53 ) #1 9 7 5 21 #2 10 10 #3 7 9 16 #4 1 1 #5 7 7 #6 4 4 #7 2 1 1 8 10 2 24 #8 1 1 2 #9 8 7 3 4 3 10 1 36 #10 9 8 9 26 #11 9 7 9 25 #12 3 6 11 20 #13 1 1 #14 1 4 5 #15 8 5 14 27 #16 4 4 #17 10 10 #18 5 5 #19 9 9 Total: 2 10 8 9 5 7 8 9 9 10 10 2 9 11 3 10 14 7 9 7 9 10 11 14 9 8 10 9 13 1 253 225 Anhang Tabelle T9: NEI`s paarweise genetische Distanzen der 15 nukleären Loci (unterhalb der Diagonalen) und der sieben plastidären Loci (oberhalb der Diagonalen) für 30 F. rusbyi-Populationen (253 Individuen) als Grundlage des MANTEL-Tests. Die Einteilung der 30 Populationen in neun geographische Gruppen ist farblich hervorgehoben (vgl. Kapitel 3.7). 226 Abbildungsverzeichnis 8. Abbildungsverzeichnis Nr. Titel Seite 1.1 Tuschezeichnungen von sechs Bromelienarten 13 1.2 Morphologie einiger xeromorpher Arten aus der ’Dyckia-clade’ 15 1.3 Morphologie einiger mesophytischer Arten der Gattungen Fosterella und Pitcairnia 16 1.4 Gegenüberstellung zweier Mutationsmodelle zur Evolution von Mikrosatelliten 22 1.5 Gegenüberstellung des Bandenmusters an einem homozygoten und einem heterozygoten Mikrosatellitenlocus 23 1.6 Morphologie von Fosterella rusbyi 33 3.1 Ergebnis einer DNA-Isolation 60 3.2 Spezifische Bandenmuster an zwei EST-Mikrosatellitenloci in Ananas und Pseudananas 66 3.3 PCo-Analyse der Alleldaten an 18 EST-Mikrosatellitenloci in Ananas und Pseudananas 69 3.4 Spezifische Bandenmuster an vier EST-Mikrosatellitenloci in Deuterocohnia brevifolia 72 3.5 Spezifische Bandenmuster an zwei EST-Mikrosatellitenloci in Fosterella rusbyi 73 3.6 Spezifische Bandenmuster an 15 ngFos-Mikrosatellitenloci in Fosterella 74 3.7 Spezifische Bandenmuster an einem ngFos-Mikrosatellitenlocus in Fosterella rusbyi 76 3.8 NeighbourNet basierend auf den Alleldaten an 15 ngFos-Mikrosatellitenmarkern in sechs Populationen von Fosterella rusbyi 78 3.9 Spezifische Bandenmuster an 15 ngDy-Mikrosatellitenloci in Dyckia 83 3.10 Assemblierung der plastidären 454-Sequenzen gegen das Plastom von Typha latifolia 86 3.11 Positionen der plastidären Mikrosatelliten auf der Genkarte des Plastoms von Typha latifolia 87 3.12 Spezifische Bandenmuster an zehn plastidären 454-Mikrosatellitenloci in Vertretern der Pitcairnioideae 89 3.13 Spezifische Bandenmuster an zwei plastidären 454-Mikrosatellitenloci in 14 Bromelienarten 90 3.14 Fundorte des Pflanzenmaterials vier untersuchter Dyckia-Arten 91 3.15 Ergebnis der STRUCTURE-Analyse in 89 Individuen von vier Dyckia-Arten 94 3.16 PCo-Analyse von 89 Individuen neun verschiedener Populationen von vier Dyckia-Arten 95 3.17 NeighbourNet basierend auf den Alleldaten an 15 ngDy-Mikrosatellitenmarkern in 89 Individuen von vier Dyckia-Arten 96 3.18 Genotypisierung von Vertretern der Fosterella micrantha-Gruppe an drei Mikrosatellitenloci 99 3.19 Ergebnis der STRUCTURE-Analyse in 190 Individuen der micrantha-Gruppe 101 3.20 PCo-Analyse von 190 Individuen verschiedener Populationen der micrantha-Gruppe 102 3.21 Sammelorte der Populationsproben der Vertreter der micrantha-Gruppe 103 3.22 Geographische Lokalitäten der Fundorte von 253 Fosterella rusbyi-Individuen 104 3.23 Spezifische Bandenmuster an sechs ngFos-Mikrosatellitenloci in Fosterella rusbyi 106 3.24 Genetische Differenzierung über 15 ngFos-Mikrosatellitenloci und 30 Populationen von Fosterella rusbyi 107 3.25 PCo-Analyse von 253 Individuen 30 verschiedener Populationen von Fosterella rusbyi 108 3.26 Ergebnis der STRUCTURE-Analyse in 253 Individuen von Fosterella rusbyi 109 3.27 Ergebnis der BAYES`schen Analysen an 15 ngFos-Mikrosatellitenloci für 253 Fosterella rusbyi-Individuen 110 3.28 NeighbourNet basierend auf den Alleldaten an 15 ngFos-Mikrosatellitenmarkern in 253 Individuen von Fosterella rusbyi 112 3.29 Neighbour-Joining Baum basierend auf den Alleldaten an 15 ngFos-Mikrosatellitenmarkern in 253 Individuen von Fosterella rusbyi 113 3.30 Korrelation geographischer und genetischer Distanzen zwischen 30 Populationen von Fosterella rusbyi 115 3.31 Balkendiagramm der Haplotypenfrequenzen an sieben plastidären Mikrosatellitenloci in 253 Individuen von Fosterella rusbyi 117 3.32 Verteilung der Haplotypen im Untersuchungsgebiet von Fosterella rusbyi 118 3.33 Gegenüberstellung der BAYES`schen Analysen für sieben plastidäre und 15 nukleäre Mikrosatellitenloci 119 4.1 Spezifische Bandenmuster an vier EST-Mikrosatellitenloci über 20 Akzessionen von vier Cryptanthus-Arten 132 4.2 Beispiel einer korrekten und einer falschen Assemblierung 136 4.3 Gegenüberstellung der Assemblierung verschiedener Arten 137 4.4 Abundanz der sechs Klassen von Mikrosatelliten innerhalb der drei 454-Datensätze 138 4.5 Ausschnitt der GENEIOUS-Oberfläche einer exemplarischen Suche nach SNPs 143 4.6 Morphologischer Vergleich der Arten der micrantha-Gruppe 152 4.7 Gegenüberstellung der dreidimensionalen PCo-Analysen der micrantha-Gruppe auf AFLP- und Mikrosatellitendaten 154 4.8 Natürliche Standorte von Fosterella rusbyi 164 4.9 Klimadiagramme von vier Regionen innerhalb des Verbreitungsgebietes von Fosterella rusbyi 165 227 Tabellenverzeichnis 9. Tabellenverzeichnis Nr. Titel Seite 2.1 Suchkriterien zur Definition von Mikrosatelliten 41 2.2 Zusammensetzung der PCR-Ansätze zur Amplifizierung von nukleären Mikrosatellitenloci 47 2.3 Protokoll des ’touch-down’ PCR-Programms ’TD 64-54’ zur Amplifizierung von EST-Mikrosatellitenloci 48 2.4 Protokoll des ’touch-down’ PCR-Programms ’TD 64-50’ zur Amplifizierung von nukleären 454-Mikrosatellitenloci 48 2.5a Zusammensetzung des PCR-Ansatzes zur Amplifikation von plastidären Mikrosatellitenloci (700er Kanal) 49 2.5b Zusammensetzung des PCR-Ansatzes zur Amplifikation von plastidären Mikrosatellitenloci (800er Kanal) 49 2.6 Protokoll des PCR-Programms ’cpSSR’ zur Amplifikation von plastidären Mikrosatellitenloci 49 3.1 Statistik der 454-Sequenzierung 62 3.2 Verteilung der Mikrosatelliten-Wiederholungseinheiten innerhalb der 454-Sequenzen 63 3.3 Effizienz der Primerentwicklung in assemblierten 454-Sequenzen 64 3.4 Eigenschaften von 18 EST-Mikrosatellitenmarkern aus Ananas comosus 66 3.5 Ergebnisse der BLAST-Analyse von 18 EST-Mikrosatellitenmarkern 67 3.6 Funktionalität und Übertragbarkeit von 18 EST-Mikrosatellitenmarkern in Ananas, Fosterella und Deuterocohnia 68 3.7 Übertragbarkeitsstudien von 18 EST-Mikrosatellitenmarkern in 74 Bromelienarten 71 3.8 Eigenschaften von 15 ngFos-Mikrosatellitenmarkern aus Fosterella rusbyi 75 3.9 Funktionalitätstests von 15 ngFos-Mikrosatellitenmarkern in sechs Populationen von Fosterella rusbyi 77 3.10 Ergebnisse der Fragmentlängenanalyse an 15 ngFos-Mikrosatellitenmarkern in Vertretern der Pitcairnioideae 80 3.11 Eigenschaften von 15 ngDy-Mikrosatellitenmarkern aus Dyckia marnier-lapostollei var. estevesii 82 3.12 Übertragbarkeitsstudien von 15 ngDy-Mikrosatellitenmarkern in Vertretern der Pitcairnioideae 84 3.13 Gegenüberstellung des Anteils an plastidären Sequenzen in den 454-Datensätzen 85 3.14 Eigenschaften von 24 plastidären 454-Mikrosatellitenmarkern aus Dyckia marnier-lapostollei var. estevesii 88 3.15 Populationsgenetische Parameter auf Basis der Alleldaten an 15 ngDy-Mikrosatellitenloci in vier Dyckia-Arten 93 3.16 Paarweise genetische und geographische Distanzen zwischen neun Populationen von vier Dyckia-Arten 97 3.17 Populationsgenetische Parameter auf Basis der Alleldaten an 15 ngFos-Mikrosatellitenloci in Vertretern der micrantha-Gruppe 100 3.18 Allelzahlen an 15 ngFos-Mikrosatellitenloci und in 30 Populationen von Fosterella rusbyi 105 3.19 AMOVA für fünf Partitionen von 253 Fosterella rusbyi-Individuen aus 30 Populationen 114 3.20 Geographische Distanzen zwischen 30 Populationen von Fosterella rusbyi 115 3.21 Mikrosatellitenallele an sieben plastidären Mikrosatellitenloci in 253 Fosterella rusbyi-Individuen 116 3.22 Allelzahlen an sieben plastidären Mikrosatellitenloci und in 30 Populationen von Fosterella rusbyi 120 4.1 Gegenüberstellung einiger publizierter Studien basierend auf EST-Mikrosatelliten 123 4.2 Gegenüberstellung einiger publizierter Studien basierend auf 454-Mikrosatelliten 134 4.3 Derzeit publizierte nukleäre und plastidäre Mikrosatellitenmarker für die Bromeliaceae 148 4.4 Gegenüberstellung von ermittelten Allelzahlen und Heterozygotie-Werten in populationsgenetischen Studien an Bromelienarten 158 228 Abkürzungsverzeichnis 10. Abkürzungsverzeichnis Abkürzung Bedeutung A je nach Kontext: Adenin, Anzahl der Haplotypen pro Population Acom Akronym für Ananas comosus AFLP amplified fragment length polymorphism AMOVA analysis of molecular variance APS Ammoniumpersulfat Aqua bidest zweifach destilliertes Wasser BGHD Botanischer Garten Heidelberg BLAST basal local alignment search tool BMD Brejo Madre Deus bp Basenpaar BROM Bromelioideae BSA bovine serum albumine BU Buique bzw. beziehungsweise C Cytosin CAM crassulacean acid metabolism CAPS cleaved amplified polymorphic sequences cDNA complementary DNA CDS coding sequence cpFos plastidäre Mikrosatellitenmarker aus Fosterella rusbyi cpSSR chloroplast simple sequence repeat CTAB Cetyltrimethylammoniumbromid ddNTP Didesoxyribonukleosidtriphosphat d.f. degree of freedom, Freiheitsgrad Dim Dimension innerhalb einer PCoA DNA deoxyribonucleic acid dNTP Desoxyribonukleosidtriphosphat D2sh durchschnittliche genetisch Diversität zwischen Individuen EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid EST expressed sequence tag EtBr Ethidiumbromid FD Ferro Doido ff. fortfolgend fwd. forward Fct, Fis, Fit, Fsc, Fst Fixationsindizes G Guanin Gb Gigabase GPS global positioning system Gst coefficient of genic differentiation HCl Chlorwasserstoff He erwartete Heterozygotie, genetische Diversität Ho beobachtete Heterozygotie HWG HARDY-WEINBERG-Gleichgewicht IAM infinite alleles model i.E. im Einzelnen Indel Insertion und Deletion IR inverted repeat IRDye infrared dye ISSR inter-simple sequence repeat kb Kilobasen km Kilometer 229 Abkürzungsverzeichnis Abkürzung Bedeutung LA Lajes LSC large single-copy LSR Lajedo Santa Rita MAS marker assisted selection Mb Megabasen MCMC Markov Chain Monte Carlo MgCl2 Magnesiumchlorid MID multiplex identifier min Minuten MO Morrão mRNA messenger RNA MS Mutationsschritt N je nach Kontext: Anzahl an Individuen, Negativkontrolle Na Anzahl an Allelen NCBI National Center for Biotechnology Information Ne effektive Anzahl an Haplotypen ngDy Akronym für ’next-generation’ Dyckia ngFos Akronym für ’next-generation’ Fosterella NGS next-generation sequencing NJ Neighbour-Joining n.s. nicht signifikant Nst Koeffizient zur Berechnung der Differenzierung haploider Populationen o.g. oben genannt p probability P je nach Kontext: Anzahl der privaten Haplotypen, Positivkontrolle PAA Polyacrylamid PCoA principal coordinates analysis, Hauptkoordinaten-Analyse PCR Polymerase chain reaction, Polymerase-Kettenreaktion PE Pesgueira PITC Pitcairnioideae PP Pico do Papagaio PVP Polyvinylpyrrolidon r Regressions-Koeffizient RAPD randomly amplified polymorphic DNA rev. reverse RNAse Ribonuklease rpm rounds per minute Rst Fst-Analog S Längenstandard zur Bestimmung der Fragmentgröße SC Serra do Cipo SCAR sequence characterized amplified region SMM stepwise mutation model SNP single nucleotide polymorphism SNSA single nucleotide sequence analysis s.o. siehe oben sog. sogenannt spec. species (aus dem Lateinischen: unbekannte Art) SSC small single-copy SSM slipped strand mispairing SSR simple sequence repeat s.u. siehe unten T Thymin Ta Anlagerungs-Temperatur Taq Thermus aquaticus TBE Tris-Borat-EDTA 230 Abkürzungsverzeichnis Abkürzung Bedeutung TD touch-down TE Tris-Chlorwasserstoff-EDTA TILL Tillandsioideae Tris Tris(hydroxymethyl)-aminomethan u.a. unter anderem UF Unterfamilie UTR untranslated region var. varietas (aus dem Lateinischen: Varietät) vgl. vergleiche v.l.n.r von links nach rechts v/v volume per volume, Volumen pro Gesamtvolumen w/v weight per volume, Gewicht pro Gesamtvolumen z.B. zum Beispiel 231 Verbrauchsmaterialien 11. Verbrauchsmaterialien 11.1 Geräte Bezeichnung Hersteller Automatischer Gel-Sequenzierer, IR2 DNA Sequencer Long Readir 4200 LI-COR BIOSCIENCES, Lincoln Automatischer Gel-Sequenzierer, 4300 DNA Analyzer LI-COR BIOSCIENCES, Lincoln Gel-Dokumentationssystem, BioDocAnalyze BIOMETRA, Göttingen Thermocycler, Bioer Life Touch BIOZYM, Oldendorf Thermocycler, iCycler BIO-RAD, München Thermocycler, T1 und TGradient BIOMETRA, Göttingen Tischzentrifugen, 5804 R, 5804, 5415 D EPPENDORF, Hamburg Tischzentrifuge, Galaxy Mini MERCK, Darmstadt Vakuum Konzentrations-Zentrifuge, Savant Speed Vac® SPD101B HERAEUS, Hanau Wasserbad GFL M.B.H. & CO., Burgwedel Zentrifuge, Variofuge 3.0 R HERAEUS, Hanau 11.2 Reagenzien, Enzyme und Kits Bezeichnung Hersteller Agarose, NEEO Roti® CARL ROTH, Karlsruhe Ammoniumpersulfat, 98+% SIGMA®, St. Louis Borsäure CARL ROTH, Karlsruhe Bovines Serum Albumin, 20 mg/ml FERMENTAS, Burlington Bromphenolblau CARL ROTH, Karlsruhe Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB) CARL ROTH, Karlsruhe Chloroform ACROS ORGANIGS, Geel Dimethylsulfoxid (DMSO), 100% SIGMA®, St.- Louis Sequenzierungskit, Thermo Sequenase GE HEALTHCARE, Little Chalfont DNA Standard, 100 bp ladder INVITROGEN, Carlsbad / Bioline, Taunton Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) CARL ROTH, Karlsruhe Ethidiumbromid CARL ROTH, Karlsruhe Formamid MERCK, Darmstadt Glycerol MERCK, Darmstadt Isoamylalkohol CARL ROTH, Karlsruhe Isopropanol CARL ROTH, Karlsruhe ß-Mercaptoethanol CARL ROTH, Karlsruhe Lambda-DNA FERMENTAS, Burlington Flüssiger Stickstoff LINDE, München Magnesiumchlorid, 50 mM INVITROGEN, Carlsbad / BIOLINE, Taunton Deoxyribonukleotide (dNTP), 100 mM CARL ROTH, Karlsruhe Oligonukleotide (PCR-Primer), 100 µM METABION, Planegg-Martinsried PCR-Puffer 5x BIOLINE, Taunton Polyvinylpyrrolidon (PVP-40) SIGMA®, St.- Louis RNase A, 5 mg / ml INVITROGEN, Carlsbad Steriler Seesand MERCK, Darmstadt Taq DNA-Polymerase, Mango-Taq, 5 U/µl BIOLINE, Taunton Tris-Chlorwasserstoff (Tris-HCl) CARL ROTH, Karlsruhe Gellösung, Ultra-Pure SequaGel® XR (inkl. Acrylamid) NATIONAL DIAGNOSTICS, Atlanta Gelpuffer, Ultra-Pure SequaGel® Complete Buffer Reagent NATIONAL DIAGNOSTICS, Atlanta Xylencyanol MERCK, Darmstadt Sorbitol MERCK, Darmstadt Sarkosyl MERCK, Darmstadt Natiumacetat MERCK, Darmstadt 232 Verbrauchsmaterialien 11.3 Lösungen Bezeichnung Zusammensetzung Agarose-Gellösung O,8% oder 1,5% Agarose in 0,5x TBE Puffer Ammoniumpersulfat-Lösung (APS) 100 mg/ml in Aqua bidest Hochsalz-CTAB-Puffer 3% CTAB (w/v), 3 M NaCl, 100 mM Tris-HCl, 20 mM EDTA Sorbitol-Waschpuffer 100 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA, 0,35 M Sorbitol, 1% ß-Mercaptoethanol, 1% PVP Extraktionspuffer Hochsalz-CTAB-Puffer plus 1% β-Mercaptoethanol und 1% PVP Chloroform-Isoamylalkohol Mischverhältnis 24:1 (v/v) DNA Ladepuffer zur DNA-Isolation 40% (v/v) Glycerol, 0,1% (w/v) Bromphenolblau, 0,1% (w/v) Xylencyanol DNA Ladepuffer zur Genotypisierung 98% (v/v) Formamid, 0,025% (v/v) basisches Fuchsin, 10 mM EDTA Ethidiumbromid-Färbelösung 1 µg/ml in 0,5x TBE Deoxyribonukleotid-Gemisch (dNTP) Je 2,5 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP in Aqua bidest Polyacrylamid-Gellösung SequaGel®-Lösung, SequaGel®-Puffer, 10% APS-Lösung, 100:25:1 TBE-Puffer, 1x 90 mM Tris-Borsäure, 2 mM EDTA, pH 8,3 TE-Puffer 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8 233 Referenzen 12. Referenzen 12.1 Qualifikationsarbeiten WÖHRMANN T (2008) Populationsgenetik von Prunus cerasifera in Nord-Iran. Diplomarbeit im Fachgebiet Systematik und Morphologie der Pflanzen, Universität Kassel 12.2 Publikationen in der Fachliteratur WÖHRMANN T, GUICKING D, KHOSHBAKHT K, AND WEISING K (2011) Genetic variability in wild populations of Prunus divaricata LEDEB. in northern Iran evaluated by EST-SSR and genomic SSR marker analysis. Genetic Resources and Crop Evolution 58: 1157–1167 WÖHRMANN T, AND WEISING K (2011) In silico mining for simple sequence repeat loci in a pineapple expressed sequence tag database and cross-species amplification of EST-SSR markers across Bromeliaceae. Theoretical and Applied Genetics 123: 635-647 WÖHRMANN T, WAGNER N, KRAPP F, HUETTEL B, AND WEISING K (2012) Development of microsatellite markers in Fosterella rusbyi (Bromeliaceae) using 454-pyrosequencing. American Journal of Botany 99: e160-e163 WÖHRMANN T, PINANGÉ DSB, KRAPP F, BENKO-ISEPPON AM, HUETTEL B, AND WEISING K (2013) Development of 15 nuclear microsatellite markers in the genus Dyckia (Pitcairnioideae; Bromeliaceae) using 454 pyrosequencing. Conservation Genetics Resources 5: 81-84 WÖHRMANN T, RÖÖSLI W, UND BAUERT M (2006) Madagassische Sukkulenten. Publisher: Zoo Zürich, online verfügbar unter: www.zoo.ch/Madagassische_Sukkulenten BAIER C, GUICKING D, PRINZ K, FEY-WAGNER C, WÖHRMANN T, WEISING K, DEBENER T, SCHIE S, AND BLATTNER FR (2009) Isolation and characterization of 11 new microsatellite markers for Macaranga (Euphorbiaceae). Molecular Ecology Resources 9: 1049-1052 WEISING K, GUICKING D, FEY-WAGNER C, KRÖGER-KILIAN T, WÖHRMANN T, DORSTEWITZ W, BÄNFER G, MOOG U, VOGEL M, BAIER C, BLATTNER FR, FELDHAAR H, AND FIALA B (2010) Mechanisms of speciation in Southeast Asian ant plants of the genus Macaranga (Euphorbiaceae). Editors: Glaubrecht & Schneider. In: Evolution in action – adaptive radiation and the origin of biodiversity (Springer, Berlin) KRAPP F, WÖHRMANN T, PINANGÉ DSB, BENKO-ISEPPON AM, HUETTEL B, AND WEISING K (2012) A set of plastid microsatellite loci for the genus Dyckia (Bromeliaceae) derived from 454 pyrosequencing. American Journal of Botany 99: e470-e473 KRAPP F, CRUZ GAS, WÖHRMANN T, BENKO-ISEPPON AM, AND WEISING K (2013) A set of variable plastid SSR loci for the genus Cryptanthus (Bromeliaceae). Research in Plant Biology 3: 18-21 234 Referenzen 12.3 Teilnahme an Fachtagungen durch Poster WÖHRMANN T, AND WEISING K (2010) In silico mining for simple sequence repeat (SSR) loci in a pineapple EST database and cross-species transferability of EST-SSR markers across Bromeliaceae. 19 th International Symposium ’Biodiversity and Evolutionary Biology’ of the German Botanical Society (DBG), 16.-19. September 2010 in Wien (Österreich) WÖHRMANN T, KRAPP F, HUETTEL B, AND WEISING K (2011) Development of large sets of simple sequence repeat (SSR) markers for three species of subfamily Pitcairnioideae (Bromeliaceae) using high-throughput 454 pyrosequencing. International Botanical Congress, 23.-30. Juli 2011 in Melbourne (Australien) WÖHRMANN T, KRAPP F, HUETTEL B, MÖLLER S, AND WEISING K (2011) Development of microsatellite markers for three species of subfamily Pitcairnioideae (Bromeliaceae) using high-throughput pyrosequencing. Botanikertagung, 18.-23. September 2011 in Berlin (Deutschland) MÖLLER S, WÖHRMANN T, AND WEISING K (2011) Population genetic structure of Vinca minor (Apocynaceae), an indicator plant for ancient urban settlements in Central Europe. Botanikertagung, 18.-23. September 2011 in Berlin (Deutschland) WÖHRMANN T, PINANGÉ DSB, KRAPP F, BENKO-ISEPPON AM, AND WEISING K (2012) A set of nuclear microsatellite markers for the genus Dyckia (Bromeliaceae) developed by 454 pyrosequencing. 21st International Symposium “Biodiversity and Evolutionary Biology” of the German Botanical Society (DBG), 16.-19. September 2012 in Mainz (Deutschland) MICHALAK I, WÖHRMANN T, WAGNER N, WEISING K, AND ZIZKA G (2012) Population genetic analysis of Fosterella rusbyi (Bromeliaceae) with AFLP and nuclear SSR markers. 21st International Symposium “Biodiversity and Evolutionary Biology” of the German Botanical Society (DBG), 16.-19. September 2012 in Mainz (Deutschland) ZENK F, WÖHRMANN T, AND WEISING K (2012) Development of SSR markers by means of 454 pyrosequencing in Deuterocohnia longipetala (Bromeliaceae) and their cross-species transferability within the genus. 21 st International Symposium ’Biodiversity and Evolutionary Biology’ of the German Botanical Society (DBG), 16.-19. September 2012 in Mainz (Deutschland) SCHUBERT K, WAGNER N, WÖHRMANN T, AND WEISING K (2013) A first three-locus plastid phylogeny of Pitcairnia (Bromeliaceae). MONOCOTS V: 5th International Conference on Comparative Biology of Monocotyledons, 7.-13. Juli 2013 in New York (USA) 12.4 Teilnahme an Fachtagungen durch Vorträge WÖHRMANN T, AND WEISING K (2011) In silico mining for simple sequence repeat (SSR) loci & cross-species transferability across Bromeliaceae. Biosystematics, 21.-27. Februar 2011 in Berlin (Deutschland) WÖHRMANN T, MICHALAK I, ZIZKA G, WAGNER N, SCHUBERT K, AND WEISING K (2013) Population genetics of Fosterella rusbyi (Pitcairnioideae; Bromeliaceae). MONOCOTS V: 5th International Conference on Comparative Biology of Monocotyledons, 7.-13. Juli 2013 in New York (USA) 235 Erklärung 13. Erklärung Hiermit versichere ich, dass ich die vorliegende Dissertation selbständig verfasst und keine anderen als die angegebenen Quellen und Hilfsmittel benutzt habe. Alle Stellen, die wörtlich oder sinngemäß aus veröffentlichten oder unveröffentlichten Werken entnommen sind, wurden als solche in der vorliegenden Dissertation kenntlich gemacht. Die Arbeit hat noch keiner anderen Stelle im Rahmen eines Promotions- oder Habilitationsverfahrens vorgelegen und wurde weder veröffentlicht noch zur Veröffentlichung eingereicht. Kassel, den 4. März 2014 Tina Wöhrmann 236