Dissertationen
https://kobra.uni-kassel.de:443/handle/123456789/200603067182
2024-03-28T19:18:16ZFunctional Analysis of Src42A in embryonic epithelial morphogenesis of Drosophila melanogaster
https://kobra.uni-kassel.de:443/handle/123456789/15459
Src42A is one of the Src family kinases (SFKs) present in Drosophila melanogaster. In mammals there are 8 SFKs and so far, a loss of function analysis of SFKs were difficult to conduct due to their functional redundancy. In Drosophila, there are only two SFKs namely Src42A and Src64B, the former is essential for embryonic development and the latter is a non-essential gene. Since Src42A is supplied as a maternal component, the zygotic mutant were showing defects in later developmental stages, because the contribution of maternal Src42A is stronger in early stages of development. Depleting maternal Src42A was challenging because of its genomic locus. To understand the function of Src42A during early developmental stages, loss of function analyses were performed using RNAi and CRISPR/Cas9 methods. Upon depletion of maternal Src42A, the early developmental stages including cellularization and germband elongation processes were affected. I explored the function of Src42A in adherens junction remodelling during Drosophila germband elongation. Src42A localizes at the hotspots of mechanical tension and is required for tyrosine phosphorylation at bicellular (bAJ) and tricellular junctions (tAJ) in germband cells. I found that during cell intercalations, Src42A is required for the contraction of AP cell junctions and the AP cell junction of intercalating cells displayed less tension. In addition, the planar cell polarity of E-cadherin and β-catenin is compromised, and E-cadherin accumulates at tricellular junctions after Src42A knock down. Furthermore, Src42A acts upstream of Abl and together they control the speed of germband elongation. Our data suggest that Src42A is involved in two related processes; in addition to establishing tension generated by the planar polarity of MyoII, it may also act as a signalling factor at tAJs in controlling E-cadherin residence time. In this thesis I have also reported preliminary findings on the impact of Src42A in cellular arrangement during cellularization. The experimental results include the impact of Src42A kinase in regulating AJ formation, by clustering Bazooka protein which is core of adherens junction.; Src42A gehört zur Familie der Src-Proteinkinasen (SFKs) in Drosophila melanogaster. Bei Säugetieren gibt es 8 SFKs, wodurch die Analyse der SFKs aufgrund ihrer funktionalen Redundanz schwierig durchzuführen ist. In Drosophila gibt es nur zwei SFKs, nämlich Src42A und Src64B, wobei ersteres für die embryonale Entwicklung unerlässlich ist. Da Src42A als maternale Komponente bereitgestellt wird, weisen zygotische Mutanten nur Defekte in späteren Entwicklungsstadien auf. Die Entfernung der maternalen Src42A Genprodukte ist aufgrund des genomischen Locus nah am Zentromer schwierig. Um die Funktion von Src42A in der Frühentwicklung von Drosophila zu verstehen, wurden Funktionsverlustanalysen unter Verwendung von RNAi- und CRISPR/Cas9-Methoden durchgeführt. Nach Depletion von maternalem Src42A waren die frühen Entwicklungsstadien, einschließlich der Zellularisierung und der Keimbandverlängerungsprozesse, betroffen. Ich habe die Funktion von Src42A bei der Remodellierung der Adhäsionsverbindungen während der Keimbandverlängerung untersucht. Src42A lokalisiert an den Hotspots mechanischer Spannung, und ist für die Tyrosinphosphorylierung an bizellulären (bAJ) und trizellulären Zellkontaken (tAJ) erforderlich. Ich konnte zeigen, dass Src42A für die Kontraktion der AP-Zellverbindungen während der Zellinterkalationen erforderlich ist und die Spannung der interkalierenden Zellen an den AP-Zellverbindungen reguliert. Die planar-polare Verteilung von E-Cadherin und β- Catenin sind beeinträchtigt, und E-Cadherin sammelt sich an trizellulären Verbindungen an. Src42A reguliert die Tyrosinkinase Abl, und zusammen kontrollieren sie die Geschwindigkeit der Keimbandverlängerung. Dies führt zum Schluss, dass Src42A an zwei Prozessen beteiligt ist: Neben der Generierung von mechanischen Kräften, die durch die planare MyoII Polarität erzeugt wird, kann es als Signal an tAJs wirken, um die Verweilzeit von E-Cadherin zu steuern. In dieser Arbeit habe ich auch vorläufige Ergebnisse zur Auswirkung von Src42A auf die Zellularisierung berichtet. Die experimentellen Ergebnisse umfassen die Auswirkungen des Src42A-Kinase auf die Regulation der AJ-Bildung, indem sie auf die Verteilung von Bazooka, ein Organisator der AJ, Einfluss nimmt.
2023-01-01T00:00:00ZChandran, LeninSrc42A is one of the Src family kinases (SFKs) present in Drosophila melanogaster. In mammals there are 8 SFKs and so far, a loss of function analysis of SFKs were difficult to conduct due to their functional redundancy. In Drosophila, there are only two SFKs namely Src42A and Src64B, the former is essential for embryonic development and the latter is a non-essential gene. Since Src42A is supplied as a maternal component, the zygotic mutant were showing defects in later developmental stages, because the contribution of maternal Src42A is stronger in early stages of development. Depleting maternal Src42A was challenging because of its genomic locus. To understand the function of Src42A during early developmental stages, loss of function analyses were performed using RNAi and CRISPR/Cas9 methods. Upon depletion of maternal Src42A, the early developmental stages including cellularization and germband elongation processes were affected. I explored the function of Src42A in adherens junction remodelling during Drosophila germband elongation. Src42A localizes at the hotspots of mechanical tension and is required for tyrosine phosphorylation at bicellular (bAJ) and tricellular junctions (tAJ) in germband cells. I found that during cell intercalations, Src42A is required for the contraction of AP cell junctions and the AP cell junction of intercalating cells displayed less tension. In addition, the planar cell polarity of E-cadherin and β-catenin is compromised, and E-cadherin accumulates at tricellular junctions after Src42A knock down. Furthermore, Src42A acts upstream of Abl and together they control the speed of germband elongation. Our data suggest that Src42A is involved in two related processes; in addition to establishing tension generated by the planar polarity of MyoII, it may also act as a signalling factor at tAJs in controlling E-cadherin residence time. In this thesis I have also reported preliminary findings on the impact of Src42A in cellular arrangement during cellularization. The experimental results include the impact of Src42A kinase in regulating AJ formation, by clustering Bazooka protein which is core of adherens junction.
Src42A gehört zur Familie der Src-Proteinkinasen (SFKs) in Drosophila melanogaster. Bei Säugetieren gibt es 8 SFKs, wodurch die Analyse der SFKs aufgrund ihrer funktionalen Redundanz schwierig durchzuführen ist. In Drosophila gibt es nur zwei SFKs, nämlich Src42A und Src64B, wobei ersteres für die embryonale Entwicklung unerlässlich ist. Da Src42A als maternale Komponente bereitgestellt wird, weisen zygotische Mutanten nur Defekte in späteren Entwicklungsstadien auf. Die Entfernung der maternalen Src42A Genprodukte ist aufgrund des genomischen Locus nah am Zentromer schwierig. Um die Funktion von Src42A in der Frühentwicklung von Drosophila zu verstehen, wurden Funktionsverlustanalysen unter Verwendung von RNAi- und CRISPR/Cas9-Methoden durchgeführt. Nach Depletion von maternalem Src42A waren die frühen Entwicklungsstadien, einschließlich der Zellularisierung und der Keimbandverlängerungsprozesse, betroffen. Ich habe die Funktion von Src42A bei der Remodellierung der Adhäsionsverbindungen während der Keimbandverlängerung untersucht. Src42A lokalisiert an den Hotspots mechanischer Spannung, und ist für die Tyrosinphosphorylierung an bizellulären (bAJ) und trizellulären Zellkontaken (tAJ) erforderlich. Ich konnte zeigen, dass Src42A für die Kontraktion der AP-Zellverbindungen während der Zellinterkalationen erforderlich ist und die Spannung der interkalierenden Zellen an den AP-Zellverbindungen reguliert. Die planar-polare Verteilung von E-Cadherin und β- Catenin sind beeinträchtigt, und E-Cadherin sammelt sich an trizellulären Verbindungen an. Src42A reguliert die Tyrosinkinase Abl, und zusammen kontrollieren sie die Geschwindigkeit der Keimbandverlängerung. Dies führt zum Schluss, dass Src42A an zwei Prozessen beteiligt ist: Neben der Generierung von mechanischen Kräften, die durch die planare MyoII Polarität erzeugt wird, kann es als Signal an tAJs wirken, um die Verweilzeit von E-Cadherin zu steuern. In dieser Arbeit habe ich auch vorläufige Ergebnisse zur Auswirkung von Src42A auf die Zellularisierung berichtet. Die experimentellen Ergebnisse umfassen die Auswirkungen des Src42A-Kinase auf die Regulation der AJ-Bildung, indem sie auf die Verteilung von Bazooka, ein Organisator der AJ, Einfluss nimmt.Development of digital fluorescence light sheet microscopy for high-resolution optical imaging
https://kobra.uni-kassel.de:443/handle/123456789/14131
In modern biology investigating the morphological development of an organism is an inevitable task. Optical microscopy has been extensively used to monitor the live tissue changes in a model organism and it is typically used in conjunction with white light or fluorescence microscopy. The fluorescence microscopy occupies a significant place in biological research due to its ability to address various biological question at subcellular level of a biological sample. One of the more recent developments in fluorescence imaging is selective plane illumination microscopy (SPIM), it is a wide-field fluorescence microscope that images the sample based on the optical sectioning by a light sheet. The main optical properties of SPIM depend on the thickness and the distribution of the light sheet. Controlling the characteristics of the light sheet is possible by using engineered beams such as the Bessel, Airy, tiling beams, etc. Ideally, a SPIM should be able to apply different engineered light sheets to provide the user with the direct chance to evaluate different light sheets on the same sample for optimum image quality. The first section of this thesis provides insights into SSPIM, which is developed to achieve better imaging system. SSPIM is a hologram producer for beam engineering that converts a Gaussian beam to all possible light sheet variants. We demonstrate that the SSPIM is readily integrated into the SPIM setup and can enhance the imaging capabilities of a large biological sample.
The second part of this thesis focuses on the development of a novel SPIM setup, which addresses some of the existing limitations of SPIM in resolution caused by the non- transparency of a large biological sample. The core of this SPIM relies upon the Multiview SPIM (M-SPIM) setup, which enables the observer to image the sample from different views simultaneously. To accomplish this, M-SPIM is build up as a four lenses SPIM set up to illuminate the sample simultaneously on two sides and detect the emission signals in orthogonal directions. In order to engineer the light sheet within this setup, the M-SPIM was combined with a spatial light modulator (SLM). We take advantage of the SSPIM software to produce several holograms as virtual lenses for applying to tile thin light sheets over a large field of view. We demonstrate that the combination of the tiling technique and M-SPIM, called MT-SPIM, has several advantages compared to previous methods including sample rotation. The first advantage is that a fairly large sample can be imagedin sub-cellular resolution without any mechanical rotation, preventing the sample from unwanted drift over the imaging. The other advantage is that the spatial and temporal resolution is homogenous in different planes, resulting in a successful 3D image registration and fusion. The results show that the MT-SPIM improves the axial-resolution relative to the conventional M-SPIM by a factor of two which improves imaging quality of nuclei and MyosinII from cellular to subcellular level during early embryogenesis of Drosophila melanogaster.; In der modernen Biologie ist die Untersuchung der morphogenetischen Entwicklung eines Organismus eine wichtige und herausfordernde Aufgabe. Die Lichtmikroskopie, in der Regel in Verbindung mit Weißlicht- oder Fluoreszenzmikroskopie, wird in großem Umfang eingesetzt, um die Formveränderungen von lebendem Gewebe in Modellorganismen zu beobachten. Die Fluoreszenzmikroskopie nimmt dabei einen bedeutenden Platz in der biologischen Forschung ein, da sie die Möglichkeit bietet, verschiedene biologische Fragen auf subzellulärer Ebene einer biologischen Probe zu untersuchen. Eine der neueren Entwicklungen auf dem Gebiet der Fluoreszenzbildgebung ist die Selective Plane Illumination Microscopy (SPIM), ein Weitfeld-Fluoreszenzmikroskop, das die Probe auf der Grundlage optischer Schnitte durch ein Lichtblatt abbildet. Die wichtigsten optischen Eigenschaften der SPIM hängen von der Dicke und der Verteilung des Lichtblatts ab. Die Eigenschaften des Lichtblatt- bildenden Lichtbogens lassen sich durch die Verwendung von Strahlenbündeln wie Bessel- , Airy- und gekachelte Strahlen steuern. Idealerweise sollte ein SPIM in der Lage sein, verschiedene Lichtblätter zu verwenden, um dem Benutzer die Möglichkeit zu geben, verschiedene Lichtblätter auf derselben Probe für eine optimale Bildqualität zu bewerten. Der erste Abschnitt dieser Arbeit befasst sich mit der Entwicklung von SSPIM, das entwickelt wurde, um ein besseres räumliches Strahlenformungssystem zu erreichen. SSPIM ist ein Hologrammerzeuger für das ‚Beam-Engineering‘, der einen Gaußschen Strahl in alle möglichen Lichtblattvarianten umwandelt. Wir zeigen, dass sich das SSPIM leicht in den SPIM-Aufbau integrieren lässt, und die Abbildungsmöglichkeiten einer großen biologischen Probe verbessern kann.
Der zweite Teil dieser Arbeit konzentriert sich auf die Entwicklung eines neuartigen SPIM-Aufbaus, der einige der bestehenden Einschränkungen von SPIM, die durch die Intransparenz einer großen biologischen Probe verursacht werden, behebt. Das Herzstück dieses SPIM-Systems ist das Multiview-SPIM (M-SPIM), welches es dem Beobachter ermöglicht, die Probe aus verschiedenen Blickwinkeln gleichzeitig zu betrachten. Um dies zu erreichen, ist M-SPIM als SPIM mit vier Objektiven aufgebaut, um die Probe gleichzeitig von zwei Seiten zu beleuchten und die Emissionssignale in orthogonalen Richtungen zu erfassen. Um das Lichtblatt in diesem Aufbau zu erzeugen, wurde das M-SPIM mit einem räumlichen Lichtmodulator (SLM) kombiniert. Wir nutzen die Vorteile der SSPIM-Software, um mehrere Hologramme als virtuelle Linsen zu erzeugen, die wir zum Kacheln dünner Lichtblätter über ein großes Sichtfeld verwenden. Wir zeigen, dass die Kombination aus der Kacheltechnik und M-SPIM, MT-SPIM genannt, mehrere Vorteile gegenüber früheren Methoden mit Probenrotation hat. Der erste Vorteil besteht darin, dass eine relativ große Probe in subzellulärer Auflösung ohne mechanische Drehung abgebildet werden kann, wodurch eine unerwünschte Drift der Probe während der Abbildung verhindert wird. Der andere Vorteil ist, dass die räumliche und zeitliche Auflösung in verschiedenen Ebenen homogen ist, was zu einer erfolgreichen 3D-Bildregistrierung und -fusion führt. Die Ergebnisse zeigen, dass die axiale Auflösung von MT-SPIM im Vergleich zur konventionellen M-SPIM um den Faktor zwei verbessert wird, was die Bildqualität von Zellkernen und Myosin II von der zellulären bis zur subzellulären Ebene während der frühen Embryogenese von Drosophila melanogaster verbessert.
2021-12-15T00:00:00ZAakhte, MostafaIn modern biology investigating the morphological development of an organism is an inevitable task. Optical microscopy has been extensively used to monitor the live tissue changes in a model organism and it is typically used in conjunction with white light or fluorescence microscopy. The fluorescence microscopy occupies a significant place in biological research due to its ability to address various biological question at subcellular level of a biological sample. One of the more recent developments in fluorescence imaging is selective plane illumination microscopy (SPIM), it is a wide-field fluorescence microscope that images the sample based on the optical sectioning by a light sheet. The main optical properties of SPIM depend on the thickness and the distribution of the light sheet. Controlling the characteristics of the light sheet is possible by using engineered beams such as the Bessel, Airy, tiling beams, etc. Ideally, a SPIM should be able to apply different engineered light sheets to provide the user with the direct chance to evaluate different light sheets on the same sample for optimum image quality. The first section of this thesis provides insights into SSPIM, which is developed to achieve better imaging system. SSPIM is a hologram producer for beam engineering that converts a Gaussian beam to all possible light sheet variants. We demonstrate that the SSPIM is readily integrated into the SPIM setup and can enhance the imaging capabilities of a large biological sample.
The second part of this thesis focuses on the development of a novel SPIM setup, which addresses some of the existing limitations of SPIM in resolution caused by the non- transparency of a large biological sample. The core of this SPIM relies upon the Multiview SPIM (M-SPIM) setup, which enables the observer to image the sample from different views simultaneously. To accomplish this, M-SPIM is build up as a four lenses SPIM set up to illuminate the sample simultaneously on two sides and detect the emission signals in orthogonal directions. In order to engineer the light sheet within this setup, the M-SPIM was combined with a spatial light modulator (SLM). We take advantage of the SSPIM software to produce several holograms as virtual lenses for applying to tile thin light sheets over a large field of view. We demonstrate that the combination of the tiling technique and M-SPIM, called MT-SPIM, has several advantages compared to previous methods including sample rotation. The first advantage is that a fairly large sample can be imagedin sub-cellular resolution without any mechanical rotation, preventing the sample from unwanted drift over the imaging. The other advantage is that the spatial and temporal resolution is homogenous in different planes, resulting in a successful 3D image registration and fusion. The results show that the MT-SPIM improves the axial-resolution relative to the conventional M-SPIM by a factor of two which improves imaging quality of nuclei and MyosinII from cellular to subcellular level during early embryogenesis of Drosophila melanogaster.
In der modernen Biologie ist die Untersuchung der morphogenetischen Entwicklung eines Organismus eine wichtige und herausfordernde Aufgabe. Die Lichtmikroskopie, in der Regel in Verbindung mit Weißlicht- oder Fluoreszenzmikroskopie, wird in großem Umfang eingesetzt, um die Formveränderungen von lebendem Gewebe in Modellorganismen zu beobachten. Die Fluoreszenzmikroskopie nimmt dabei einen bedeutenden Platz in der biologischen Forschung ein, da sie die Möglichkeit bietet, verschiedene biologische Fragen auf subzellulärer Ebene einer biologischen Probe zu untersuchen. Eine der neueren Entwicklungen auf dem Gebiet der Fluoreszenzbildgebung ist die Selective Plane Illumination Microscopy (SPIM), ein Weitfeld-Fluoreszenzmikroskop, das die Probe auf der Grundlage optischer Schnitte durch ein Lichtblatt abbildet. Die wichtigsten optischen Eigenschaften der SPIM hängen von der Dicke und der Verteilung des Lichtblatts ab. Die Eigenschaften des Lichtblatt- bildenden Lichtbogens lassen sich durch die Verwendung von Strahlenbündeln wie Bessel- , Airy- und gekachelte Strahlen steuern. Idealerweise sollte ein SPIM in der Lage sein, verschiedene Lichtblätter zu verwenden, um dem Benutzer die Möglichkeit zu geben, verschiedene Lichtblätter auf derselben Probe für eine optimale Bildqualität zu bewerten. Der erste Abschnitt dieser Arbeit befasst sich mit der Entwicklung von SSPIM, das entwickelt wurde, um ein besseres räumliches Strahlenformungssystem zu erreichen. SSPIM ist ein Hologrammerzeuger für das ‚Beam-Engineering‘, der einen Gaußschen Strahl in alle möglichen Lichtblattvarianten umwandelt. Wir zeigen, dass sich das SSPIM leicht in den SPIM-Aufbau integrieren lässt, und die Abbildungsmöglichkeiten einer großen biologischen Probe verbessern kann.
Der zweite Teil dieser Arbeit konzentriert sich auf die Entwicklung eines neuartigen SPIM-Aufbaus, der einige der bestehenden Einschränkungen von SPIM, die durch die Intransparenz einer großen biologischen Probe verursacht werden, behebt. Das Herzstück dieses SPIM-Systems ist das Multiview-SPIM (M-SPIM), welches es dem Beobachter ermöglicht, die Probe aus verschiedenen Blickwinkeln gleichzeitig zu betrachten. Um dies zu erreichen, ist M-SPIM als SPIM mit vier Objektiven aufgebaut, um die Probe gleichzeitig von zwei Seiten zu beleuchten und die Emissionssignale in orthogonalen Richtungen zu erfassen. Um das Lichtblatt in diesem Aufbau zu erzeugen, wurde das M-SPIM mit einem räumlichen Lichtmodulator (SLM) kombiniert. Wir nutzen die Vorteile der SSPIM-Software, um mehrere Hologramme als virtuelle Linsen zu erzeugen, die wir zum Kacheln dünner Lichtblätter über ein großes Sichtfeld verwenden. Wir zeigen, dass die Kombination aus der Kacheltechnik und M-SPIM, MT-SPIM genannt, mehrere Vorteile gegenüber früheren Methoden mit Probenrotation hat. Der erste Vorteil besteht darin, dass eine relativ große Probe in subzellulärer Auflösung ohne mechanische Drehung abgebildet werden kann, wodurch eine unerwünschte Drift der Probe während der Abbildung verhindert wird. Der andere Vorteil ist, dass die räumliche und zeitliche Auflösung in verschiedenen Ebenen homogen ist, was zu einer erfolgreichen 3D-Bildregistrierung und -fusion führt. Die Ergebnisse zeigen, dass die axiale Auflösung von MT-SPIM im Vergleich zur konventionellen M-SPIM um den Faktor zwei verbessert wird, was die Bildqualität von Zellkernen und Myosin II von der zellulären bis zur subzellulären Ebene während der frühen Embryogenese von Drosophila melanogaster verbessert.Mechanismen kleiner regulatorischer RNAs in Dictyostelium discoideum: Charakterisierung und Anwendung
https://kobra.uni-kassel.de:443/handle/123456789/2016053150341
Die RNA-Interferenz (RNAi) ist ein in Eukaryoten weit verbreiteter Mechanismus, der die transkriptionelle oder posttranskriptionelle Stilllegung von Genen beschreibt. Die Spezifität wird dabei durch die Sequenz einer kleinen, nicht-kodierenden RNA gewährleistet. Diese RNA leitet einen Effektorkomplex, dessen Zentrum immer von einem Argonautenprotein gebildet wird, üblicherweise zu einer komplementären mRNA. In der Folge kommt es zum Abbau des Transkripts oder zur Inhibierung der Translation. Aktuelle Veröffentlichungen konnten zudem das Aktivitätsprofil der Argonautenproteine beträchtlich erweitern: Im Zellkern vorkommende Argonautenproteine wurden beispielsweise mit Spleißvorgängen, der Promotorkontrolle von Genen und der DNA-Reparatur in Verbindung gebracht. In den letzten Jahren konnten weitreichende Kenntnisse bezüglich der Kontrolle einiger transposabler Elemente durch RNAi sowie der Biogenese kleiner regulatorischer RNAs in Dictyostelium discoideum und anderen Organismen gewonnen werden.
Ein Fokus dieser Arbeit lag zunächst auf der Charakterisierung des Argonautenproteins AgnB und der Identifikation von Interaktionspartnern. Es konnte gezeigt werden, dass AgnB zumindest partiell im Zellkern der Amöbe lokalisiert und dort vermutlich regulatorische Aufgaben wahrnimmt. Gestützt wurde diese Annahme durch die massenspektrometrische und Western Blot basierte Detektion nukleärer Bindungspartner. Weiterführende Analysen konnten AgnB zudem als positiven Regulator für drei entwicklungsregulierte Gene beschreiben und so die Verbindung zum Prozess der RNA activation in der Amöbe herstellen. Identifizierte posttranslationale Modifikationen könnten diesbezüglich die Aktivität des Argonauten steuern.
Mit Hilfe von Crosslink-RNA-Immunopräzipitation und anschließender Hochdurchsatz-sequenzierung oder der Northern Blot basierten Auswertung konnte eine Assoziation von AgnB und der Class I RNAs gezeigt werden. Diese Klasse umfasst nicht-kodierende RNAs mit einer Länge von etwa 42 bis 65 Nukleotiden und wurde bisher nicht als Substrat für die RNAi-Maschinerie in D. discoideum angesehen.
Ein weiterer Teil dieser Arbeit beschäftigte sich mit dem Einfluss von AgnA und AgnB auf die Promotorbereiche des D. discoideum Retrotransposons DIRS-1. Im Verlauf der Untersuchungen konnte beobachtet werden, dass die Anordnung entgegengesetzt operierender DIRS-1 Promotor-sequenzen für die Stilllegung eines Reportergens ausreichend war. Darauf aufbauend konnte ein DIRS-1 basiertes knockdown System etabliert werden. Mit Hilfe dieses Systems konnten die Proteinmengen ausgewählter Zielgene so effektiv reduziert werden, dass die entsprechenden Stämme den Phänotyp des korrespondierenden knockout Stammes zeigten. Darüber hinaus war es möglich die Proteinreduktion zu modulieren, um so beispielsweise dosisabhängige Effekte zu registrieren.
Vorangegangene Arbeiten zur Biogenese von micro (mi)RNAs konnten das RNA-bindende Protein RbdB als eine Hauptkomponente für die Prozessierung maturer miRNAs identifizieren. Der miRNA defiziente RbdB- Stamm wurde in dieser Arbeit zur Identifikation putativer miRNA Ziele genutzt. Dazu wurde sowohl das Transkriptom des D. discoideum Wildtyps als auch des rbdB knockout Stammes in hohem Durchsatz sequenziert, um so differentiell exprimierte Gene zu detektieren. Vielversprechende Kandidaten wurden mittels qRT-PCR verifiziert. Dabei wurde unter anderem ein putativer Transkriptionsfaktor als miRNA target identifiziert, der eine Vielzahl weiterer Gene regulieren könnte.
Abschließend konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass RbdB ebenfalls für die Generierung von small interfering (si)RNAs aus strukturierten Loci von Bedeutung ist. Dies weist auf mindestens zwei unterschiedliche Mechanismen zur siRNA Prozessierung in D. discoideum hin.
2016-05-31T00:00:00ZFriedrich, MichaelDie RNA-Interferenz (RNAi) ist ein in Eukaryoten weit verbreiteter Mechanismus, der die transkriptionelle oder posttranskriptionelle Stilllegung von Genen beschreibt. Die Spezifität wird dabei durch die Sequenz einer kleinen, nicht-kodierenden RNA gewährleistet. Diese RNA leitet einen Effektorkomplex, dessen Zentrum immer von einem Argonautenprotein gebildet wird, üblicherweise zu einer komplementären mRNA. In der Folge kommt es zum Abbau des Transkripts oder zur Inhibierung der Translation. Aktuelle Veröffentlichungen konnten zudem das Aktivitätsprofil der Argonautenproteine beträchtlich erweitern: Im Zellkern vorkommende Argonautenproteine wurden beispielsweise mit Spleißvorgängen, der Promotorkontrolle von Genen und der DNA-Reparatur in Verbindung gebracht. In den letzten Jahren konnten weitreichende Kenntnisse bezüglich der Kontrolle einiger transposabler Elemente durch RNAi sowie der Biogenese kleiner regulatorischer RNAs in Dictyostelium discoideum und anderen Organismen gewonnen werden.
Ein Fokus dieser Arbeit lag zunächst auf der Charakterisierung des Argonautenproteins AgnB und der Identifikation von Interaktionspartnern. Es konnte gezeigt werden, dass AgnB zumindest partiell im Zellkern der Amöbe lokalisiert und dort vermutlich regulatorische Aufgaben wahrnimmt. Gestützt wurde diese Annahme durch die massenspektrometrische und Western Blot basierte Detektion nukleärer Bindungspartner. Weiterführende Analysen konnten AgnB zudem als positiven Regulator für drei entwicklungsregulierte Gene beschreiben und so die Verbindung zum Prozess der RNA activation in der Amöbe herstellen. Identifizierte posttranslationale Modifikationen könnten diesbezüglich die Aktivität des Argonauten steuern.
Mit Hilfe von Crosslink-RNA-Immunopräzipitation und anschließender Hochdurchsatz-sequenzierung oder der Northern Blot basierten Auswertung konnte eine Assoziation von AgnB und der Class I RNAs gezeigt werden. Diese Klasse umfasst nicht-kodierende RNAs mit einer Länge von etwa 42 bis 65 Nukleotiden und wurde bisher nicht als Substrat für die RNAi-Maschinerie in D. discoideum angesehen.
Ein weiterer Teil dieser Arbeit beschäftigte sich mit dem Einfluss von AgnA und AgnB auf die Promotorbereiche des D. discoideum Retrotransposons DIRS-1. Im Verlauf der Untersuchungen konnte beobachtet werden, dass die Anordnung entgegengesetzt operierender DIRS-1 Promotor-sequenzen für die Stilllegung eines Reportergens ausreichend war. Darauf aufbauend konnte ein DIRS-1 basiertes knockdown System etabliert werden. Mit Hilfe dieses Systems konnten die Proteinmengen ausgewählter Zielgene so effektiv reduziert werden, dass die entsprechenden Stämme den Phänotyp des korrespondierenden knockout Stammes zeigten. Darüber hinaus war es möglich die Proteinreduktion zu modulieren, um so beispielsweise dosisabhängige Effekte zu registrieren.
Vorangegangene Arbeiten zur Biogenese von micro (mi)RNAs konnten das RNA-bindende Protein RbdB als eine Hauptkomponente für die Prozessierung maturer miRNAs identifizieren. Der miRNA defiziente RbdB- Stamm wurde in dieser Arbeit zur Identifikation putativer miRNA Ziele genutzt. Dazu wurde sowohl das Transkriptom des D. discoideum Wildtyps als auch des rbdB knockout Stammes in hohem Durchsatz sequenziert, um so differentiell exprimierte Gene zu detektieren. Vielversprechende Kandidaten wurden mittels qRT-PCR verifiziert. Dabei wurde unter anderem ein putativer Transkriptionsfaktor als miRNA target identifiziert, der eine Vielzahl weiterer Gene regulieren könnte.
Abschließend konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass RbdB ebenfalls für die Generierung von small interfering (si)RNAs aus strukturierten Loci von Bedeutung ist. Dies weist auf mindestens zwei unterschiedliche Mechanismen zur siRNA Prozessierung in D. discoideum hin.Strukturelle und funktionelle Charakterisierung des Dnmt2-Homologs DnmA von Dictyostelium discoideum
https://kobra.uni-kassel.de:443/handle/123456789/2016040850101
In dieser Arbeit wurde die DNA Methyltransferase 2 aus Dictyostelium discoideum strukturell und funktionell untersucht. Sie vermittelt die Methylierung des Cytosin an Position 38 nahe des Anticodons der tRNAAsp (Goll et al., 2006; Müller et al., 2013). Jedoch ist die biologische Funktion dieser Methylierung bis heute nicht hinreichend geklärt.
In der Vergangenheit konnten erhebliche Unterschiede in der in vivo- und in vitro-Methylierungsaktivität von DnmA, dem Dnmt2-Homolog aus D. discoideum, beobachtet werden. So wurde bis jetzt ausschließlich tRNAAsp als in vivo-Substrat des Proteins identifiziert. In vitro methyliert rekombinant gewonnenes DnmA aus E. coli allerdings auch Transkripte der tRNAGlu und tRNAGly (Müller et al., 2013). Aus diesem Grund sollten in dieser Arbeit posttranslationaler Proteinmodifikationen von DnmA identifiziert werden. Diese können an dem Protein aus D. discoideum, jedoch nicht oder verändert an dem Protein aus E. coli auftreten und deshalb zu einer abweichenden Methylierungsaktivität von DnmA führen.
Es konnte gezeigt werden, dass DnmA aus D. discoideum isoliert, zahlreiche Proteinmodifikationen aufweist, wobei elf Methylierungen, drei Phosphorylierungen und drei Acetylierungen identifiziert werden konnten. Die als methyliert identifizierten Aminosäuren K205, K236, K276 und R341 und die phosphorylierte Aminosäure T239 wurden detaillierter untersucht. Dazu wurden sie jeweils zu Alanin mutiert. Keine der Aminosäureaustausch-mutationen führte zu einem erheblichen Strukturverlust des Proteins und alle Proteine zeigten in vitro-Methylierungsaktivität mit tRNAAsp, tRNAGlu und tRNAGly. Die Mutations-proteine DnmAK276A und R341A wurden überdies in vivo untersucht und zeigten eine verringerte Methylierungsaktivität. Diese Ergebnisse liefern erste Hinweise darauf, dass posttranslationale Proteinmodifikationen die Aktivität von DnmA in vivo beeinflussen könnten.
Außerdem konnte gezeigt werden, dass auch DnmA, welches in D. discoideum überexprimiert und daraus gereinigt wurde, in vitro-Methylierungsaktivität mit tRNAGly besitzt. Da tRNAGly kein Substrat für DnmA in vivo darstellt (Müller et al., 2013), konnte dadurch nachgewiesen werden, dass das Protein, auch wenn es in D. discoideum exprimiert wird, in vivo und in vitro abweichende Substratspezifität aufweist.
Weiterhin wurde versucht, Protein-Interaktionspartner von DnmA zu identifizieren. Mittels Immunpräzipitation und anschließender massenspektrometrischer Analyse konnten eine Vielzahl von Kandidaten identifiziert werden. Erste Versuche, die Ergebnisse zu verifizieren, zeigten allerdings keine Bestätigung der direkten Interaktion der Proteine CulB, CulE und Nola1 mit DnmA. Wie in vorherigen Untersuchungen (Dissertation Vladimir Maksimov, 2010; Dissertation Sara Müller, 2011), konnten auch im Rahmen dieser Arbeit keine direkt mit DnmA assoziierten Proteine in D. discoideum identifiziert werden.
Im dritten Projekt der vorliegenden Arbeit wurde ein Zusammenhang zwischen der DnmA-vermittelten tRNA-Methylierung am C38 und einer weiteren tRNA-Modifikation, Queuosin an Position 34, gezeigt. Die Methylierung der tRNAAsp durch DnmA war signifikant erhöht, wenn das Nährmedium von D. discoideum mit Queuin supplementiert wurde. Allerdings ist Queuosin für die DnmA-vermittelte tRNA-Methylierung nicht unabdingbar. In vivo konnte nach Überexpression von DnmA ebenfalls eine Queuosin-unabhängige tRNAAsp-Methylierung detektiert werden. Weiterhin wurde gezeigt, dass Queuosin-enthaltende tRNAs kein generelles Substrat für DnmA darstellen. Nach Gabe von Queuin wiesen die anderen Queuosin-enthaltenden tRNAs tRNAAsn, tRNAHis und tRNATyr keine Methylierung putativer DnmA-targets auf. Auch an tRNAGlu und tRNAGly konnte unter diesen Bedingungen keine in vivo-Methylierung des C38 bzw. C37 gezeigt werden.
Weiterhin wurden erste Untersuchungen zur Bestimmung der Funktion der DnmA-vermittelten Methylierung in Zusammenhang mit der Queuosin-Modifikation durchgeführt. Bereits 1985 wurde beschrieben, dass Queuin im Nährmedium die tRNA-Menge von tRNAAsp und tRNATyr in Wildtyp Dictyostelium-Zellen um das Zweifache erhöht (Ott and Kersten, 1985). Hier konnten diese Ergebnisse bestätigt und außerdem gezeigt werden, dass dieser Effekt in einem dnmA- -Stamm nicht auftritt. Interessanterweise stellte tRNATyr jedoch kein Methylierungssubstrat für DnmA dar. Dennoch konnte in einem dnmA- -Stamm ebenfalls keine erhöhte Menge dieser tRNA beobachtet werden, obwohl die Zellen mit Queuin kultiviert wurden. In wieweit ein indirekter Effekt, welcher nicht die DnmA-vermittelte Methylierung darstellt, weitere tRNA-Modifikationen oder andere Proteine an diesem Regulationsmechanismus beteiligt sind, muss in zukünftigen Analysen geklärt werden.
2016-04-08T00:00:00ZSchuster, IsabelleIn dieser Arbeit wurde die DNA Methyltransferase 2 aus Dictyostelium discoideum strukturell und funktionell untersucht. Sie vermittelt die Methylierung des Cytosin an Position 38 nahe des Anticodons der tRNAAsp (Goll et al., 2006; Müller et al., 2013). Jedoch ist die biologische Funktion dieser Methylierung bis heute nicht hinreichend geklärt.
In der Vergangenheit konnten erhebliche Unterschiede in der in vivo- und in vitro-Methylierungsaktivität von DnmA, dem Dnmt2-Homolog aus D. discoideum, beobachtet werden. So wurde bis jetzt ausschließlich tRNAAsp als in vivo-Substrat des Proteins identifiziert. In vitro methyliert rekombinant gewonnenes DnmA aus E. coli allerdings auch Transkripte der tRNAGlu und tRNAGly (Müller et al., 2013). Aus diesem Grund sollten in dieser Arbeit posttranslationaler Proteinmodifikationen von DnmA identifiziert werden. Diese können an dem Protein aus D. discoideum, jedoch nicht oder verändert an dem Protein aus E. coli auftreten und deshalb zu einer abweichenden Methylierungsaktivität von DnmA führen.
Es konnte gezeigt werden, dass DnmA aus D. discoideum isoliert, zahlreiche Proteinmodifikationen aufweist, wobei elf Methylierungen, drei Phosphorylierungen und drei Acetylierungen identifiziert werden konnten. Die als methyliert identifizierten Aminosäuren K205, K236, K276 und R341 und die phosphorylierte Aminosäure T239 wurden detaillierter untersucht. Dazu wurden sie jeweils zu Alanin mutiert. Keine der Aminosäureaustausch-mutationen führte zu einem erheblichen Strukturverlust des Proteins und alle Proteine zeigten in vitro-Methylierungsaktivität mit tRNAAsp, tRNAGlu und tRNAGly. Die Mutations-proteine DnmAK276A und R341A wurden überdies in vivo untersucht und zeigten eine verringerte Methylierungsaktivität. Diese Ergebnisse liefern erste Hinweise darauf, dass posttranslationale Proteinmodifikationen die Aktivität von DnmA in vivo beeinflussen könnten.
Außerdem konnte gezeigt werden, dass auch DnmA, welches in D. discoideum überexprimiert und daraus gereinigt wurde, in vitro-Methylierungsaktivität mit tRNAGly besitzt. Da tRNAGly kein Substrat für DnmA in vivo darstellt (Müller et al., 2013), konnte dadurch nachgewiesen werden, dass das Protein, auch wenn es in D. discoideum exprimiert wird, in vivo und in vitro abweichende Substratspezifität aufweist.
Weiterhin wurde versucht, Protein-Interaktionspartner von DnmA zu identifizieren. Mittels Immunpräzipitation und anschließender massenspektrometrischer Analyse konnten eine Vielzahl von Kandidaten identifiziert werden. Erste Versuche, die Ergebnisse zu verifizieren, zeigten allerdings keine Bestätigung der direkten Interaktion der Proteine CulB, CulE und Nola1 mit DnmA. Wie in vorherigen Untersuchungen (Dissertation Vladimir Maksimov, 2010; Dissertation Sara Müller, 2011), konnten auch im Rahmen dieser Arbeit keine direkt mit DnmA assoziierten Proteine in D. discoideum identifiziert werden.
Im dritten Projekt der vorliegenden Arbeit wurde ein Zusammenhang zwischen der DnmA-vermittelten tRNA-Methylierung am C38 und einer weiteren tRNA-Modifikation, Queuosin an Position 34, gezeigt. Die Methylierung der tRNAAsp durch DnmA war signifikant erhöht, wenn das Nährmedium von D. discoideum mit Queuin supplementiert wurde. Allerdings ist Queuosin für die DnmA-vermittelte tRNA-Methylierung nicht unabdingbar. In vivo konnte nach Überexpression von DnmA ebenfalls eine Queuosin-unabhängige tRNAAsp-Methylierung detektiert werden. Weiterhin wurde gezeigt, dass Queuosin-enthaltende tRNAs kein generelles Substrat für DnmA darstellen. Nach Gabe von Queuin wiesen die anderen Queuosin-enthaltenden tRNAs tRNAAsn, tRNAHis und tRNATyr keine Methylierung putativer DnmA-targets auf. Auch an tRNAGlu und tRNAGly konnte unter diesen Bedingungen keine in vivo-Methylierung des C38 bzw. C37 gezeigt werden.
Weiterhin wurden erste Untersuchungen zur Bestimmung der Funktion der DnmA-vermittelten Methylierung in Zusammenhang mit der Queuosin-Modifikation durchgeführt. Bereits 1985 wurde beschrieben, dass Queuin im Nährmedium die tRNA-Menge von tRNAAsp und tRNATyr in Wildtyp Dictyostelium-Zellen um das Zweifache erhöht (Ott and Kersten, 1985). Hier konnten diese Ergebnisse bestätigt und außerdem gezeigt werden, dass dieser Effekt in einem dnmA- -Stamm nicht auftritt. Interessanterweise stellte tRNATyr jedoch kein Methylierungssubstrat für DnmA dar. Dennoch konnte in einem dnmA- -Stamm ebenfalls keine erhöhte Menge dieser tRNA beobachtet werden, obwohl die Zellen mit Queuin kultiviert wurden. In wieweit ein indirekter Effekt, welcher nicht die DnmA-vermittelte Methylierung darstellt, weitere tRNA-Modifikationen oder andere Proteine an diesem Regulationsmechanismus beteiligt sind, muss in zukünftigen Analysen geklärt werden.