| dc.date.accessioned | 2019-10-02T07:09:57Z | |
| dc.date.issued | 2019-06 | |
| dc.identifier | doi:10.17170/kobra-20190925703 | |
| dc.identifier.uri | http://hdl.handle.net/123456789/11320 | |
| dc.language.iso | eng | |
| dc.rights | Urheberrechtlich geschützt | |
| dc.rights.uri | https://rightsstatements.org/page/InC/1.0/ | |
| dc.subject | LRRK2 | eng |
| dc.subject | kinase | eng |
| dc.subject | nanobody | eng |
| dc.subject | R-spine | eng |
| dc.subject.ddc | 570 | |
| dc.title | Mechanistic Insights into the intrinsic Kinase Regulation of LRRK2 | eng |
| dc.type | Dissertation | |
| dcterms.abstract | Obwohl Morbus Parkinson (PD) die zweithäufigste neurodegenerative Erkrankung darstellt, ist der Pathomechanismus kaum verstanden. Es ist jedoch erwiesen, dass PD assoziierte Mutationen die Aktivität der Leucine rich repeat kinase 2 (LRRK2) beeinflussen, sodass diese ein potentielles Drug Target darstellt. Für ein besseres Verständnis wurden daher der intrinsische regulatorische Mechanismus und der Einfluss von Mutationen auf LRRK2 untersucht. Zusätzlich wurde der Einfluss von Nanobodies gegen die ROC Domäne von LRRK2 auf die Kinase Aktivität überprüft. Die Nanobodies konnten in hoch- und niedrigaffine ROCDomänen- Binder unterteilt werden, dabei erkannten die hochaffinen ein anderes Epitop (Bins) als die niedrigaffinen. Die Zugabe von hochaffinen Nanobodies erhöhte die Kinaseaktivität von LRRK2, jedoch nicht die eines N-terminal verkürzten ROC-COR-Kinase-WD40- Konstruktes (RCKW). Zusammen mit Ergebnissen anderer Forschergruppen kann daher von einer autoinhibitorischen Domäne um die Aminosäure S1292 ausgegangen werden. Überdieswurde in der vorliegenden Arbeit gezeigt, dass nukleotidfreies LRRK2 eine höhere Kinaseaktivität besitzt als die GDP- oder GTP-gebundene Form. Dies deutet auf eine Regulation der Kinasedomäne durch Modulation des Monomer-Dimer-Zyklus aufgrund des G-Nukleotid-Status der ROC Domäne hin. Die R-Spine Mutation Y2018F, welche das für Kinasen essenzielle DFG (LRRK2: DYG) Motiv wiederherstellt, erhöht wie G2019S die Kinaseaktivität um den Faktor drei bis vier. Außerdem bildet LRRK2 Y2018F, ebenso wie die PD assoziierte Mutation I2020T, mit erhöhter Wahrscheinlichkeit Filamente um Mikrotubuli. Sowohl die erhöhte Kinaseaktivität als auch die Filamentbildung stehen im engen Zusammenhang mit der Entstehung von PD. Y2018F vereint beide pathogenen Effekte vermutlich durch die Stabilisierung einer spezifischen aktiven LRRK2-Konformation, welche sich zur der von G2019S unterscheidet.
LRRK2 bildet ebenfalls nach Inhibition durch MLi-2 Filamente aus. Daher ist die Bildung von Filamenten wahrscheinlich auf die aktive Konformation und nicht die Kinaseaktivität zurückzuführen. Zusätzlich ist eine schützende Funktion des N-Terminus wahrscheinlich, da das RCKW Konstrukt unabhängig von Mutationen oder MLi-2-Behandlung Filamente bildet. Nur die RCKW-Kinase-Tot-Mutante D2017A konnte die Filamentbildung reduzieren. Dies bestätigt zusätzlich, dass eine aktive Kinase-Konformation für das Bilden von LRRK2-Filamenten benötigt wird, während dieser Prozess zusätzlich durch den N-Terminus reguliert wird. Zusammenfassend nehmen die ROC-Domäne sowie der N-Terminus wichtige regulative Rollen bei der Kontrolle von Kinaseaktivität und Filamentbildung bei LRRK2 ein. Abschließend wurde das Spine-Modell für Kinasen auf LRRK2 angewendet sowie Spine-Mutationen, welche potenziell die Stabilität der Kinase erhöhen, eingebracht und charakterisiert. Die Flexibilität dieses hydrophoben Netzwerks basiert auf einem fein abgestimmten Gleichgewicht zwischen dem aktiven und inaktiven Status der Kinase. Dieses Gleichgewicht kann relativ einfach durch pathogene Mutationen wie G2019S oder I2020T, die den aktiven Status präferieren, beeinträchtigt werden. Interessanterweise wurde die R-Spine-Mutation Y2018F als eine neue hyperaktive Kinase-Mutation in LRRK2 identifiziert. | ger |
| dcterms.abstract | Parkinson’s disease (PD) is the second most neurodegenerative disorder, however, underlying pathomechanisms are only poorly understood. The leucine rich repeat kinase 2 (LRRK2) was found to play a major role in the development of PD and may provide a novel drug target as PD associated mutations in LRRK2 were generally found to alter kinase activity. Therefore, the intrinsic regulatory mechanisms of LRRK2 and how mutations impair these mechanisms was investigated to obtain a better understanding. Furthermore, Nanobodies against the ROC domain were tested on their impact on kinase activity. Two Nanobody bins were identified, one with a high and one with a low affinity towards the ROC domain. Interestingly, in a kinase assay the addition of the ROC domain binders, belonging to the high affinity bin, increased the kinase activity of LRRK2 for LRRKtide phosphorylation. The effect was lost for an N-terminal truncated ROC-Cor-Kinase-WD40 construct (RCKW). Together with crosslinking results performed by others this suggests an autoinhibitory domain comprising S1292. Additionally, it was shown that nucleotide-free LRRK2 shows a higher kinase activity than the GDP or GTP bound form. This indicates a regulation of kinase activation by modulating monomer-dimercycling depending on the G-nucleotide state of the ROC domain. Strikingly, the R-spine mutation Y2018F, restoring the for kinases critically important DFG (DYG in LRRK2) motif, increases the kinase activity 3-4 times comparable to the PD associated mutation G2019S. Interestingly, LRRK2 Y2018F exhibits the same increased likelihood to form filaments around microtubules as described for the PD associated mutation I2020T. Both, increased activity, as well as filament formation, are therefore linked to the development of PD. Y2018F combines both effects by presumably stabilizing a specific active conformation of LRRK2 which is different to the stabilized conformation of G2019S. that an active kinase conformation and not kinase activity is causative for filament formation is supported by the finding that MLi-2 inhibition does also induce filament formation. As the RCKW construct forms filaments independent of mutations and MLi-2 treatment, the N-terminus may shield the putative site for MT interaction. Only RCKW D2017A, a kinase dead mutant, showed a reduced l filament formation. This further supports the hypothesis of an active kinase conformation that is needed for filament formation, while this process is additionally inhibited by the N-terminus. Taken together the kinase activity and filament formation of LRRK2 is controlled by several intrinsic regulation mechanisms, in which the ROC and the N-terminus maintain important regulative roles. Finally, the spine model for kinases was introduced to LRRK2, and spine mutations which potentially stabilize the active kinase conformation were introduced and characterized. The flexibility of this hydrophobic network is based on a finetuned balance between the active and inactive state that can easily be impaired by pathogenic mutations like G2019S and I2020T, which favor the active state. Strikingly, the R-spine mutation Y2018F, restoring the classical DFG motif, was identified as a new hyperactive kinase mutation in LRRK2. | eng |
| dcterms.accessRights | open access | |
| dcterms.creator | Schmidt, Sven | |
| dcterms.dateAccepted | 2019-07-29 | |
| dcterms.extent | 173 Seiten | |
| dc.contributor.corporatename | Kassel, Universität Kassel, Fachbereich Mathematik und Naturwissenschaften, Institut für Biologie | |
| dc.contributor.referee | Herberg, Friedrich W. (Prof. Dr.) | |
| dc.subject.swd | Parkinson-Krankheit | ger |
| dc.subject.swd | Leucin | ger |
| dc.subject.swd | Kinasen | ger |
| dc.type.version | publishedVersion | |
| ubks.embargo.terms | 2020-10-02 | |
| ubks.embargo.end | 2020-10-02 | |
