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2020-05Metadata
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Dissertation
Nachweis und Analyse BamA-assoziierter Faltungsintermediate des OmpA durch ortsgerichtete Fluoreszenzspektroskopie
Abstract
Die Faltung und Insertion von Außenmembranproteinen (OMPs) in die Außenmembran von Gram negativen Bakterien ist für das Leben der Zellen essentiell und erfordert den konservierten β-barrel assembly machinery (BAM) Komplex. Zahlreiche Studien befassen sich mit der Aufklärung des dahinterstehenden Faltungsmechanismus von OMPs, doch bislang ist nur sehr wenig darüber bekannt. Daher steht der Faltungsmechanismus der spontanen Faltung und Insertion von OMPs wie OmpA und der Einfluss der BAM Hauptkomponente BamA darauf, im Fokus der vorliegenden Arbeit. Ziel war die weitere Aufklärung des Faltungsmechanismus von OmpA in Gegenwart von BamA, anhand von dynamischen Wechselwirkungsstudien mittels ortsgerichteter Fluoreszenzspektroskopie. Für diese Studien wurde eine BamA-Mutante entwickelt und ausgenutzt, in der die 13 nativen Tryptophan- und zwei Cysteinreste im bamA-Gen durch strukturell ähnliche Aminosäuren (Phenylalanin, Alanin) substituiert wurden.
Zunächst erfolgte eine Charakterisierung der WaF, CaA-BamA Mutante im Hinblick auf Struktur und Funktion, die darlegte, dass das Substituieren der 15 Aminosäurereste konservativ möglich ist. CD-Messungen ergaben vergleichbare Sekundärstrukturanteile bei Faltung von WaF, CaA-BamA in Detergensmizellen (LDAO) und Lipiddoppelschichten (LD) sowie eine leicht erhöhte Temperaturstabilität gegenüber wt-BamA. In Faltungskinetik-Studien beschleunigte WaF, CaA-BamA die OmpA Faltung in gleicher Weise wie wt-BamA.
Im zweiten Teil der Arbeit wurden zwei Modellmembransysteme entwickelt, die es ermöglichen Faltungsintermediate von OmpA sowohl in reine LD aus Dilauroylphospholipiden als auch in LD mit inseriertem BamA zu stabilisieren. Diese Membranen weisen, im Gegensatz zu bisher eingesetzten Membranen, eine ähnliche hydrophobe Fettsäureregion wie die hydrophobe Transmembranregion vieler OMPs auf. BamA beschleunigt die OmpA Faltung und den Einbau in solch dünne LD drastisch. Eine Wechselwirkung der beiden Proteine findet jedoch nur temporär zu Beginn der OmpA-Faltung statt, weswegen eine Interaktion der beiden Proteine nur unter stark verringerter Faltungsgeschwindigkeit analysiert werden kann. OmpA- Faltungskinetiken in LD aus DLPC, DLPE und DLPG (5:3:2) bei pH 7 und 2 °C zeigten eine solch drastisch verlangsamte Faltungsreaktion auch in Gegenwart von BamA. Im gleichen System durchgeführte fluoreszenzspektroskopische Messungen zeigten eine temporäre hydrophobere Umgebung der Tryptophanumgebungen des wt-OmpA herbeigeführt durch die Gegenwart von BamA. Damit konnte die Funktionalität des Systems bestätigt werden, sowie
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zum ersten Mal ein Einfluss von BamA auf Faltungsintermediate von OmpA in einem dynamischen System gezeigt werden.
Weiterführende fluoreszenzspektroskopische Studien mit ETM von OmpA zeigten deutliche Umgebungsänderungen der Trps in den Faltungsintermediaten des OmpA in Gegenwart von BamA. Bei Trps lokalisiert in den β-Strängen zeigten sich Änderungen in den Intensitäten durch mehr oder weniger Wasser-Exposition. Diese legen eine Reorientierung des membranadsorbierten OmpA in Gegenwart von BamA nahe. Bei den Trps lokalisiert in den extrazellulären Schleifen zeigte sich in Gegenwart von BamA eine deutlich hydrophilere Umgebung mit erhöhter Wasserexposition. Das deutet auf eine stark geminderte Wechselwirkung der extrazellulären Schleifen mit der LD hin. Dies könnte zum einen auf eine Translokalisation der extrazellulären Schleifen über die geminderte LD-Schichtdicke hervorgerufen durch BamA hindeuten. Ebenso wäre eine Translokalisation der extrazellulären Schleifen von OmpA durch das BamA β-Fass Lumen denkbar. Insgesamt wird eine erleichterte Schleifen-Translokalisation über die Membran durch BamA deutlich.
Erstmalig gelang es Faltungsintermediate von OmpA auch in einer dünnen LD mit einer hydrophoben Schichtdicke ähnlich der hydrophoben Transmembranregion vieler OMPs zu stabilisieren. Darüber hinaus gelang es freie und direkte Wechselwirkungen zwischen BamA und einem OMP (OmpA) in diesem neuen dünnen Modellmembransystem zu zeigen und damit einen Einblick in den BamA-abhängigen OmpA Faltungsmechanismus zu erlangen.
Zunächst erfolgte eine Charakterisierung der WaF, CaA-BamA Mutante im Hinblick auf Struktur und Funktion, die darlegte, dass das Substituieren der 15 Aminosäurereste konservativ möglich ist. CD-Messungen ergaben vergleichbare Sekundärstrukturanteile bei Faltung von WaF, CaA-BamA in Detergensmizellen (LDAO) und Lipiddoppelschichten (LD) sowie eine leicht erhöhte Temperaturstabilität gegenüber wt-BamA. In Faltungskinetik-Studien beschleunigte WaF, CaA-BamA die OmpA Faltung in gleicher Weise wie wt-BamA.
Im zweiten Teil der Arbeit wurden zwei Modellmembransysteme entwickelt, die es ermöglichen Faltungsintermediate von OmpA sowohl in reine LD aus Dilauroylphospholipiden als auch in LD mit inseriertem BamA zu stabilisieren. Diese Membranen weisen, im Gegensatz zu bisher eingesetzten Membranen, eine ähnliche hydrophobe Fettsäureregion wie die hydrophobe Transmembranregion vieler OMPs auf. BamA beschleunigt die OmpA Faltung und den Einbau in solch dünne LD drastisch. Eine Wechselwirkung der beiden Proteine findet jedoch nur temporär zu Beginn der OmpA-Faltung statt, weswegen eine Interaktion der beiden Proteine nur unter stark verringerter Faltungsgeschwindigkeit analysiert werden kann. OmpA- Faltungskinetiken in LD aus DLPC, DLPE und DLPG (5:3:2) bei pH 7 und 2 °C zeigten eine solch drastisch verlangsamte Faltungsreaktion auch in Gegenwart von BamA. Im gleichen System durchgeführte fluoreszenzspektroskopische Messungen zeigten eine temporäre hydrophobere Umgebung der Tryptophanumgebungen des wt-OmpA herbeigeführt durch die Gegenwart von BamA. Damit konnte die Funktionalität des Systems bestätigt werden, sowie
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zum ersten Mal ein Einfluss von BamA auf Faltungsintermediate von OmpA in einem dynamischen System gezeigt werden.
Weiterführende fluoreszenzspektroskopische Studien mit ETM von OmpA zeigten deutliche Umgebungsänderungen der Trps in den Faltungsintermediaten des OmpA in Gegenwart von BamA. Bei Trps lokalisiert in den β-Strängen zeigten sich Änderungen in den Intensitäten durch mehr oder weniger Wasser-Exposition. Diese legen eine Reorientierung des membranadsorbierten OmpA in Gegenwart von BamA nahe. Bei den Trps lokalisiert in den extrazellulären Schleifen zeigte sich in Gegenwart von BamA eine deutlich hydrophilere Umgebung mit erhöhter Wasserexposition. Das deutet auf eine stark geminderte Wechselwirkung der extrazellulären Schleifen mit der LD hin. Dies könnte zum einen auf eine Translokalisation der extrazellulären Schleifen über die geminderte LD-Schichtdicke hervorgerufen durch BamA hindeuten. Ebenso wäre eine Translokalisation der extrazellulären Schleifen von OmpA durch das BamA β-Fass Lumen denkbar. Insgesamt wird eine erleichterte Schleifen-Translokalisation über die Membran durch BamA deutlich.
Erstmalig gelang es Faltungsintermediate von OmpA auch in einer dünnen LD mit einer hydrophoben Schichtdicke ähnlich der hydrophoben Transmembranregion vieler OMPs zu stabilisieren. Darüber hinaus gelang es freie und direkte Wechselwirkungen zwischen BamA und einem OMP (OmpA) in diesem neuen dünnen Modellmembransystem zu zeigen und damit einen Einblick in den BamA-abhängigen OmpA Faltungsmechanismus zu erlangen.
Citation
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author={Schürmann, Nicole},
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school={Kassel, Universität Kassel, Fachbereich Mathematik und Naturwissenschaften, Institut für Biologie},
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