| dc.date.accessioned | 2020-09-30T08:47:42Z | |
| dc.date.issued | 2020-06-08 | |
| dc.identifier | doi:10.17170/kobra-202009231841 | |
| dc.identifier.uri | http://hdl.handle.net/123456789/11839 | |
| dc.language.iso | eng | eng |
| dc.rights | Urheberrechtlich geschützt | |
| dc.rights.uri | https://rightsstatements.org/page/InC/1.0/ | |
| dc.subject | Saccharomyces cerevisiae | eng |
| dc.subject | Kti12 | eng |
| dc.subject | Elongator complex | eng |
| dc.subject | tRNA modification | eng |
| dc.subject.ddc | 500 | |
| dc.title | The tRNA binding protein Kti12 and its role in the regulation of Elongator complex | eng |
| dc.type | Dissertation | |
| dcterms.abstract | [Summary] Kti12 is a conserved eukaryotic protein showing sequence homology to O-phosphoseryltRNA kinase (Pstk), which is required for the synthesis of selenocysteine tRNA. Saccharomyces cerevisiae Kti12 was originally discovered in a genetic screening for resistance against zymocin, a protein toxin produced by Kluyveromyces lactis. The cytotoxicity of zymocin lies in its anticodon nuclease activity, causing tRNA depletion and cell death in sensitive yeast cells. It recognizes and cleaves a particular wobble uridine (U34) modification in tRNAGlu. The biosynthesis of nearly all U34 modifications requires a pivotal substitution at the U34, which is achieved by the Elongator complex and its co-factors, including Kti12, Hrr25 and Sit4. Unlike the other co-factors, Kti12 shows a unique behavior as it affects Elongator activity when deleted or overexpressed, causing zymocin resistance. It was shown, that a variation of Kti12 levels affects the balanced phosphorylation state of the largest Elongator subunit Elp1 by influencing the function of both Hrr25 kinase and Sit4 phosphatase complex. Cells lacking functional KTI12 display a hypophosphorylated Elp1 isoform, as Hrr25 is unable to interact and phosphorylate Elp1. An opposing effect is observable when Kti12 is overexpressed. In this case, Elp1 shows a hyperphosphorylated form resembling a situation, in which Sit4 is unable to mediate Elp1 dephosphorylation, because it is either deleted or inhibited by overexpression of its regulatory subunit Sap155. However, it is not fully understood how elevated expression of Kti12 affects Elongator activity. In this work, the overexpression effect of Kti12 and Sap155 on Elongators tRNA modification function was compared, using zymocin sensitivity assays to monitor the activity state of the complex. It was investigated, which genetic requirements are necessary for these effects. Overexpressed Sap155 exhibited a toxin resistance effect similar to Δkti12 mutants. On the opposite, high-copy expression of Kti12 provided an intermediate protection against zymocin, which was absent in hypersensitive Δsap155 cells. Furthermore, protein interaction studies showed that overexpression of Kti12 results in an enhanced co-precipitation with Sit4, independent of Sap155. The high dosage of Kti12 simultaneously increased Hrr25 and decreased Sit4 interaction with Elp1. Interestingly, the Kti12 presence on Elp1 remained unaffected. These results suggest that the overexpression effect of Kti12 on Elongator activity is likely due to a direct misregulation of Hrr25 accompanied by a reduction in Elongator specific Sit4 function. Additionally, as Kti12 shares a high sequence similarity with Pstk, it could further be shown that Kti12 binds any tRNA predominantly through its C-terminal domain in a Pstklike fashion. Furthermore, a tRNA bound Kti12 form shows a reduced binding ability with Elp1, which is in line with the observation that only the Elongator-free Kti12 pool is UV crosslinkable to nucleic acids. | eng |
| dcterms.abstract | [Zusammenfassung] Kti12 ist ein unter Eukaryonten konserviertes Protein, welches eine Sequenzhomologie zu der für die Synthese der Selenocystein tRNA erforderlichen O-phosphoseryl-tRNA-Kinase (Pstk) aufweist. Saccharomyces cerevisiae Kti12 wurde ursprünglich in einem genetischen Screening auf Resistenz gegen Zymocin, einem von Kluyveromyces lactis produzierten Proteintoxin, entdeckt. Die Zytotoxizität von Zymocin beruht auf seiner Anticodon-Nukleaseaktivität, die in empfindlichen Hefezellen zu tRNA Abbau und deren Zelltod führt. Dabei erkennt und spaltet Zymocin eine bestimmte Wobble-Uridin (U34) Modifikation in der tRNAGlu. Die Biosynthese fast aller U34Modifikationen erfordert eine zentrale Substitution am U34, die durch den Elongatorkomplex und seine Cofaktoren, einschließlich Kti12, Hrr25 und Sit4, vermittelt wird. Im Gegensatz zu den anderen Cofaktoren beeinflusst Kti12 einzigartiger Weise die Elongatoraktivität, unter Deletion oder Überexpression, wobei beide Fälle zu einer Zymocin-Resistenz führen. Es wurde gezeigt, dass eine Variation der Kti12 Menge den ausgeglichenen Phosphorylierungszustand der größten Elongator-Untereinheit Elp1 beeinflusst, da der Mengenunterschied sowohl auf die Funktion der Hrr25-Kinase als auch des Sit4-Phosphatasekomplexes wirkt. Zellen ohne funktionelles KTI12 zeigen eine hypo-phosphorylierte Elp1-Isoform, da Hrr25 nicht in der Lage ist mit Elp1 zu interagieren und es zu phosphorylieren. Ein entgegengesetzter Effekt ist unter Kti12 Überexpression zu beobachten. In diesem Fall zeigt Elp1 eine hyperphosphorylierte Form, die einer Situation ähnelt, in der Sit4 nicht in Richtung des Elongators funktionieren kann, verursacht durch entweder Sit4 Deletion oder der Inhibition durch die Überexpression seiner regulatorischen Untereinheit Sap155. Es ist jedoch nicht vollständig verstanden, wie eine erhöhte Expression von Kti12 die Elongatoraktivität beeinflusst. In dieser Arbeit wurde der Überexpressionseffekt von Kti12 und Sap155 auf die tRNAModifikationsfunktion des Elongators mittels des Zymocin-Empfindlichkeitstests verglichen, um den Aktivitätszustand des Komplexes zu überprüfen. Es wurde auch untersucht, welche genetischen Anforderungen für diese Effekte notwendig sind. Es konnte gezeigt werden, dass überexprimiertes Sap155 einen Toxin Resistenzeffekt aufzeigt, welcher Δkti12-Mutanten ähnelt. Im Gegensatz dazu zeigte die erhöhte Expression von Kti12 nur einen intermediären Schutz gegen Zymocin, allerdings nicht in überempfindlichen Δsap155-Zellen. Des Weiteren konnten Proteininteraktionsstudien zeigen, dass eine Überexpression von Kti12 unabhängig von Sap155 zu einer verstärkten Co-Präzipitation mit Sit4 führt. Die hohe Dosierung von Kti12 erhöht gleichzeitig die Hrr25 Interaktion mit Elp1 und verringert wiederum die Sit4-Elp1 Interaktion. Interessanterweise blieb die Präsenz von Kti12 auf Elp1 unbeeinflusst. Diese Ergebnisse legen nahe, dass der Überexpressionseffekt von Kti12 auf die Elongatoraktivität wahrscheinlich auf eine direkte Fehlregulation von Hrr25 zurückzuführen ist, das mit einer Verringerung der Elongator-spezifischen Sit4-Funktion einhergeht. Da Kti12 eine hohe Sequenzähnlichkeit mit Pstk aufweist, konnte außerdem gezeigt werden, dass Kti12 jede tRNA vorwiegend über seine C-terminale Domäne auf Pstk-ähnliche Weise bindet. Darüber hinaus zeigt eine tRNA-gebundene Kti12-Form eine verringerte Bindungsfähigkeit mit Elp1 auf, was mit der Beobachtung übereinstimmt, dass nur die Elongator-freie Kti12-Fraktion durch UV Licht kovalent mit Nukleinsäuren verbunden werden kann. | ger |
| dcterms.accessRights | open access | |
| dcterms.creator | Hammermeister, Alexander | |
| dcterms.dateAccepted | 2020-08-04 | |
| dcterms.extent | IX, 139 Seiten | |
| dc.contributor.corporatename | Kassel, Universität Kassel, Fachbereich Mathematik und Naturwissenschaften, Institut für Biologie, Mikrobiologie | ger |
| dc.contributor.referee | Schaffrath, Raffael (Prof. Dr.) | |
| dc.contributor.referee | Maniak, Markus (Prof. Dr.) | |
| dc.subject.swd | Saccharomyces cerevisiae | ger |
| dc.subject.swd | Proteine | ger |
| dc.subject.swd | Transfer-RNS | ger |
| ubks.embargo.terms | 2021-09-30 | |
| ubks.embargo.end | 2021-09-30 | |
| kup.iskup | false | |
