Date
2022-03Author
Khonsari, BaharSubject
570 Life sciences; biology Transfer-RNSMessenger-RNSHefestammPseudouridinSynthasenZelleProteineMetadata
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Dissertation
The Importance of tRNA Modification and SSD1 Status for Protein Homeostasis and Cell Viability
Abstract
Chemical modifications of anticodon loop are required to support tRNA function in mRNA decoding and to prevent protein aggregation in the eukaryotic model system Saccharomyces cerevisiae. This work investigates the effects of mutation in the gene encoding the Deg1 pseudouridine synthase. It is known that the mutation of the human DEG1 orthologue PUS3 causes severe neurological and developmental defects, emphasizing the general importance of the modification. However, the exact cellular consequences of deg1/pus3mutation remain to be resolved. This thesis shows that in yeast, the absence of a functional Deg1 synthase induces slow growth, heat and drug sensitivities and protein homeostasis defects. In addition, depending on the specific selection of the yeast strain background, a shortened chronological lifespan could also be observed, and strong negative genetic interactions of DEG1with other genes involved in anticodon loop modification were detected. Strain background influence on phenotypic variation is partly due to allelic variation of the gene encoding the RNA binding protein Ssd1. A common laboratory yeast strain used in this work contains the ssd1-d allele encoding a truncated non- functional Ssd1 variant. This allele is linked to phenotypes that partially overlap with those of deg1. Thus, enhancing deg1 phenotypes by ssd1-dmay result from the additivity of negative phenotypes and may not necessarily involve shared molecular mechanisms. Since protein homeostasis defects could be functionally involved in aging phenotypes, life spans and protein aggregation in deg1 mutants and strains lacking a ribosome-associated chaperone involved in co-translational protein folding is compared. While both strains accumulated protein aggregates, only the deg1 mutant exhibited a reduced life span. Hence, other cellular consequences than protein aggregation may cause the deg1 aging phenotype. Since yeast’s lifespan is also known to be affected by the TOR (target of rapamycin) kinase activity, the rapamycin sensitivities and autophagy (a process under the direct control of TOR) were analyzed. The absence of DEG1 is found to induce rapamycin sensitivity and increased autophagy. Both effects are enhanced in the absence of functional Ssd1, pointing to a variation of TOR activity in the different yeast strain backgrounds. Direct translational effects of the deg1mutation were studied using a glutamine-rich Rnq1 protein. The results suggest that the combined absence of functional SSD1 and DEG1 aggravates the expression defect of the protein, suggesting that translation is negatively affected by mutation in both genes.
Chemische Modifikationen der Anticodon-Schleife sind erforderlich, um die tRNA-Funktion bei der mRNA-Decodierung zu unterstützen und die Proteinaggregation im eukaryotischen Modellsystem Saccharomyces cerevisiae zu verhindern. Diese Arbeit untersucht die Auswirkungen von Mutationen im DEG1 Gen, das eine Pseudouridin-Synthase kodiert. Es ist bekannt, dass die Mutation des humanen DEG1-Orthologs PUS3 schwere neurologische und Entwicklungsstörungen verursacht, was die allgemeine Bedeutung der Modifikation unterstreicht. Die genauen zellulären Folgen müssen jedoch noch geklärt werden. Diese Arbeit zeigt, dass in der Hefe das Fehlen einer funktionellen Deg1-Synthase zu langsamem Wachstum und Emflindlichkeit gegenüber Hitze und verschiedenen chemischen Agenzien führt sowie Defekte in der Proteinhomöostase auslöst. Darüber hinaus konnte je nach spezifischer Selektion des Hefestammhintergrunds auch eine verkürzte chronologische Lebensdauer beobachtet werden, und es wurden starke negative genetische Wechselwirkungen von DEG1 mit anderen an der Anticodon Loop-Modifikation beteiligten Genen nachgewiesen. Der Einfluss des Stammhintergrunds auf die phänotypische Variation ist teilweise auf allelische Variation des Gens zurückzuführen, das das RNA-bindende Protein Ssd1 codiert. Ein üblicher Laborhefestamm, der in dieser Arbeit verwendet wird, enthält das ssd1-d-Allel, das für eine verkürzte, nicht funktionale Ssd1-Variante kodiert. Dieses Allel ist mit Phänotypen verbunden, die teilweise mit denen von deg1 überlappen. Daher kann die Verstärkung von deg1-Phänotypen durch ssd1-d aus der Additivität negativer Phänotypen resultieren und muss nicht notwendigerweise gemeinsame molekulare Mechanismen beinhalten. Da Defekte der Proteinhomöostase funktionell an alternden Phänotypen beteiligt sein könnten, werden Lebensdauern und Proteinaggregation in deg1-Mutanten und Stämmen, denen ein Ribosomen-assoziiertes Chaperon fehlt, das an der co-translationalen Proteinfaltung beteiligt ist, verglichen. Während beide Stämme Proteinaggregate akkumulierten, wies nur die deg1-Mutante eine reduzierte Lebensdauer auf. Daher können andere zelluläre Folgen als die Proteinaggregation den deg1-Alterungsphänotyp verursachen. Da bekannt ist, dass die Lebensdauer von Hefen auch von der TOR-Kinaseaktivität (Target of Rapamycin) beeinflusst wird, wurden die Rapamycin-Empfindlichkeit und die Autophagie (ein Prozess unter direkter Kontrolle von TOR) analysiert. Es wurde festgestellt, dass das Fehlen von DEG1 eine Rapamycin-Empfindlichkeit und eine erhöhte Autophagie induziert. Beide Effekte werden in Abwesenheit von funktionellem Ssd1 verstärkt, was auf eine Variation der TOR-Aktivität in den unterschiedlichen Hefestämmen hindeutet. Direkte Translationseffekte der deg1- Mutation wurden unter Verwendung eines glutaminreichen Rnq1-Proteins untersucht. Die Ergebnisse legen nahe, dass das kombinierte Fehlen von funktionellem SSD1 und DEG1 den Expressionsdefekt des Proteins verschlimmert, was darauf hindeutet, dass die Translation durch Mutationen in beiden Genen negativ beeinflusst wird.
Citation
@phdthesis{doi:10.17170/kobra-202207276528,
author={Khonsari, Bahar},
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2022-07-28T10:50:27Z 2022-07-28T10:50:27Z 2022-03 doi:10.17170/kobra-202207276528 http://hdl.handle.net/123456789/14023 eng Urheberrechtlich geschützt https://rightsstatements.org/page/InC/1.0/ 570 The Importance of tRNA Modification and SSD1 Status for Protein Homeostasis and Cell Viability Dissertation Chemical modifications of anticodon loop are required to support tRNA function in mRNA decoding and to prevent protein aggregation in the eukaryotic model system Saccharomyces cerevisiae. This work investigates the effects of mutation in the gene encoding the Deg1 pseudouridine synthase. It is known that the mutation of the human DEG1 orthologue PUS3 causes severe neurological and developmental defects, emphasizing the general importance of the modification. However, the exact cellular consequences of deg1/pus3mutation remain to be resolved. This thesis shows that in yeast, the absence of a functional Deg1 synthase induces slow growth, heat and drug sensitivities and protein homeostasis defects. In addition, depending on the specific selection of the yeast strain background, a shortened chronological lifespan could also be observed, and strong negative genetic interactions of DEG1with other genes involved in anticodon loop modification were detected. Strain background influence on phenotypic variation is partly due to allelic variation of the gene encoding the RNA binding protein Ssd1. A common laboratory yeast strain used in this work contains the ssd1-d allele encoding a truncated non- functional Ssd1 variant. This allele is linked to phenotypes that partially overlap with those of deg1. Thus, enhancing deg1 phenotypes by ssd1-dmay result from the additivity of negative phenotypes and may not necessarily involve shared molecular mechanisms. Since protein homeostasis defects could be functionally involved in aging phenotypes, life spans and protein aggregation in deg1 mutants and strains lacking a ribosome-associated chaperone involved in co-translational protein folding is compared. While both strains accumulated protein aggregates, only the deg1 mutant exhibited a reduced life span. Hence, other cellular consequences than protein aggregation may cause the deg1 aging phenotype. Since yeast’s lifespan is also known to be affected by the TOR (target of rapamycin) kinase activity, the rapamycin sensitivities and autophagy (a process under the direct control of TOR) were analyzed. The absence of DEG1 is found to induce rapamycin sensitivity and increased autophagy. Both effects are enhanced in the absence of functional Ssd1, pointing to a variation of TOR activity in the different yeast strain backgrounds. Direct translational effects of the deg1mutation were studied using a glutamine-rich Rnq1 protein. The results suggest that the combined absence of functional SSD1 and DEG1 aggravates the expression defect of the protein, suggesting that translation is negatively affected by mutation in both genes. Chemische Modifikationen der Anticodon-Schleife sind erforderlich, um die tRNA-Funktion bei der mRNA-Decodierung zu unterstützen und die Proteinaggregation im eukaryotischen Modellsystem Saccharomyces cerevisiae zu verhindern. Diese Arbeit untersucht die Auswirkungen von Mutationen im DEG1 Gen, das eine Pseudouridin-Synthase kodiert. Es ist bekannt, dass die Mutation des humanen DEG1-Orthologs PUS3 schwere neurologische und Entwicklungsstörungen verursacht, was die allgemeine Bedeutung der Modifikation unterstreicht. Die genauen zellulären Folgen müssen jedoch noch geklärt werden. Diese Arbeit zeigt, dass in der Hefe das Fehlen einer funktionellen Deg1-Synthase zu langsamem Wachstum und Emflindlichkeit gegenüber Hitze und verschiedenen chemischen Agenzien führt sowie Defekte in der Proteinhomöostase auslöst. Darüber hinaus konnte je nach spezifischer Selektion des Hefestammhintergrunds auch eine verkürzte chronologische Lebensdauer beobachtet werden, und es wurden starke negative genetische Wechselwirkungen von DEG1 mit anderen an der Anticodon Loop-Modifikation beteiligten Genen nachgewiesen. Der Einfluss des Stammhintergrunds auf die phänotypische Variation ist teilweise auf allelische Variation des Gens zurückzuführen, das das RNA-bindende Protein Ssd1 codiert. Ein üblicher Laborhefestamm, der in dieser Arbeit verwendet wird, enthält das ssd1-d-Allel, das für eine verkürzte, nicht funktionale Ssd1-Variante kodiert. Dieses Allel ist mit Phänotypen verbunden, die teilweise mit denen von deg1 überlappen. Daher kann die Verstärkung von deg1-Phänotypen durch ssd1-d aus der Additivität negativer Phänotypen resultieren und muss nicht notwendigerweise gemeinsame molekulare Mechanismen beinhalten. Da Defekte der Proteinhomöostase funktionell an alternden Phänotypen beteiligt sein könnten, werden Lebensdauern und Proteinaggregation in deg1-Mutanten und Stämmen, denen ein Ribosomen-assoziiertes Chaperon fehlt, das an der co-translationalen Proteinfaltung beteiligt ist, verglichen. Während beide Stämme Proteinaggregate akkumulierten, wies nur die deg1-Mutante eine reduzierte Lebensdauer auf. Daher können andere zelluläre Folgen als die Proteinaggregation den deg1-Alterungsphänotyp verursachen. Da bekannt ist, dass die Lebensdauer von Hefen auch von der TOR-Kinaseaktivität (Target of Rapamycin) beeinflusst wird, wurden die Rapamycin-Empfindlichkeit und die Autophagie (ein Prozess unter direkter Kontrolle von TOR) analysiert. Es wurde festgestellt, dass das Fehlen von DEG1 eine Rapamycin-Empfindlichkeit und eine erhöhte Autophagie induziert. Beide Effekte werden in Abwesenheit von funktionellem Ssd1 verstärkt, was auf eine Variation der TOR-Aktivität in den unterschiedlichen Hefestämmen hindeutet. Direkte Translationseffekte der deg1- Mutation wurden unter Verwendung eines glutaminreichen Rnq1-Proteins untersucht. Die Ergebnisse legen nahe, dass das kombinierte Fehlen von funktionellem SSD1 und DEG1 den Expressionsdefekt des Proteins verschlimmert, was darauf hindeutet, dass die Translation durch Mutationen in beiden Genen negativ beeinflusst wird. open access Khonsari, Bahar 2022-07-12 xii, 13-132 Seiten Kassel, Universität Kassel, Fachbereich Mathematik und Naturwissenschaften, Institut für Biologie Schaffrath, Raffael (Prof. Dr.) Herberg, Friedrich W. (Prof. Dr.) Stengl, Monika (Prof. Dr.) Gutekunst, Kirstin (Prof. Dr.) Klassen, Roland (Dr.) Transfer-RNS Messenger-RNS Hefestamm Pseudouridin Synthasen Zelle Proteine publishedVersion false true
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