📆 Embargo bis 2023-11-14
Dissertation
Pathogenic Mutations in Catalytic Subunit Isoforms of the cAMP-Dependent Protein Kinase
(Pathogene Mutationen in Isoformen der katalytischen Untereinheit der cAMP-abhängigen Proteinkinase)
Zusammenfassung
Protein kinase A (PKA) is an integral part in a myriad of cellular pathways and a main effector of the second messenger cAMP. Since its discovery in the late 1960s, PKA has become one of the best-studied eukaryotic protein kinases in terms of enzymatic and structural features. Pathological implications of PKA have just started to emerge. There are three main isoforms (α, β, γ) of the catalytic subunit of PKA (PKA-C) which constitute a holoenzyme (R2C2) by association with a regulatory subunit (PKA-R) dimer. While most of the research in recent decades has been focused on PKA-Cα, little research has been done on PKA-Cβ. Lately, disease-associated mutations highlight the non-redundant features of the PKA-Cα/Cβ isoforms, in particular the exceptional role of PKA-Cβ. This dissertation focussed on the detailed biochemical and in cell characterization of pathological mutations of PKA-Cα/Cβ to understand the molecular mechanisms of these mutations, and to illustrate the non-redundancy of PKA-Cα/Cβ. With a direct link to Hedgehog (Hh) signalling, the mutations in PKA-Cα (G136R) and in PKA-Cβ1 (H87N, H87R, G234R) are related to cardioacrofacial dysplasia 1 and 2, respectively. PKA-Cα G136R and PKA-Cβ1 G234R contribute to inhibitor and substrate binding, while PKA-Cβ1 H87N and H87R alter an important interaction with the phosphorylation site pT197 in the activation loop. The PKA-Cβ1 mutations displayed decreased catalytic activity, reduced PKIα inhibitor affinity and altered enzymatic parameters of (co-)substrates (ATP, Kemptide). Biochemical and biophysical data point to H87R being the most severe mutation followed by H87N and G234R. In contrast, PKA-Cα G136R displayed mainly an increased (!) affinity towards the inhibitor PKIα. PKA-Cβ1 G234R is depending on the presence of the PDK1 in E. coli expression for proper autophosphorylation of the two residues T197 and S338. Real-time BRET assays were employed to study PKA holoenzyme dynamics and regulation in HEK293 cells. All mutations except for PKA-Cα G136R showed a drastic increase in cAMP-dependent holoenzyme dissociation of PKA-RI and PKA-RII isoforms. When using the physiological β-adrenergic agonist isoproterenol, the hypothesis of labile PKA-C mutant holoenzymes was reassured. The mutations had similar effects in the splice variant PKA-Cβ2, which shows unique tissue expression. So far unpublished PKA-Cα disease-associated mutants (A20P, ΔN289-I291) also showed more labile PKA holoenzymes. In this dissertation, intramolecular effects of the PKA-C mutations on regulation and enzymatic parameters were characterized. These disease-associated mutations are located at key positions, thereby altering kinase function and regulation. It can be shown that aberrant Hh signalling is mainly due to increased cAMP-sensitivity of the resulting PKA-C mutant holoenzymes.
Die Proteinkinase A (PKA) ist ein essenzielles Schlüsselenzym innerhalb vieler Signalwege der Zelle und wird durch den second messenger cAMP aktiviert. Seit ihrer Entdeckung Ende der 1960er Jahre und der jahrzehntelangen Erforschung gilt PKA als eine der am besten untersuchten Kinasen. Der Fokus lag neben regulatorischen und funktionellen Eigenschaften besonders auf der Aufklärung struktureller Merkmale. Pathologische Ursachen und Wirkungen (z.B. durch Mutationen) von PKA sind erst zum Teil untersucht. Strukturell besteht das Holoenzym aus zwei katalytischen (PKA-C) und zwei regulatorischen Untereinheiten. Es gibt drei PKA-C Isoformen (α, β, γ), welche eine hohe Homologie zeigen. Der Großteil der Forschung befasste sich lediglich mit der Isoform PKA-Cα. PKA-Cβ wird bedingt durch neue pathologische Mutationen intensiver erforscht, um die Alleinstellungsmerkmale der Isoform zu untersuchen. Diese Arbeit konzentrierte sich daher auf pathogene PKA-Cα/Cβ Mutationen und deren Einflüsse. Die Mutationen in PKA-Cα (G136R) und PKA-Cβ1 (H87N, H87R, G234R) wurden als cardioacrofacial dysplasia 1 und 2 beschrieben und mit dem Hedgehog-Signalweg in Verbindung gebracht. PKA-Cα G136R und PKA-Cβ1 G234R beeinflussen Substrat- und Inhibitor-Wechselwirkungen, während PKA-Cβ1 H87N/R eine wichtige Interaktion zur Phosphorylierungsstelle T197 im activation loop verändert. Die PKA-Cβ1 Mutationen zeigten in Aktivitäts- und Bindungsstudien eine geringere Aktivität und PKIα Affinität sowie veränderte enzymatischer Parameter. Die Mutation H87R zeigte in vitro, vor H87N und G234R den größten Einfluss. PKA-Cα G136R zeigte im Besonderen eine erhöhte Affinität zu PKIα (!). PKA-Cβ1 G234R benötigte die upstream Kinase PDK1 zur rekombinanten Expression und Autophosphorylierung in E. coli. BRET Messungen wurden zur Untersuchung von PKA Holoenzymen in HEK293 Zellen genutzt, wodurch gezeigt wurde, dass alle PKA-C Mutationen, außer PKA-Cα G136R, die cAMP-abhängige Dissoziation der Typ I und II Holoenzyme erhöhte. Der β-adrenerge Agonist Isoproterenol konnte die Hypothese der erhöhten Labilität von PKA Holoenzymen aufgrund der Mutationen bestätigen. Ähnliche Effekte konnte auch für die Mutationen in der Spleißvariante PKA-Cβ2 gezeigt werden. Bisher unveröffentlichte PKA-Cα Mutationen (A20P, ΔN289-I291) zeigten hingegen nur schwache Einflüsse auf PKA Holoenzyme und deren Dissoziation. In dieser Arbeit wurden die molekularen Einflüsse der PKA-C Mutationen in Bezug auf Regulation und Funktion hin untersucht. Die krankheitsassoziierten Mutationen befinden sich an wichtigen Stellen innerhalb der Kinase, die zu pathologischen Veränderungen innerhalb des Hedgehog-Signalweges aufgrund einer erhöhte cAMP-Sensitivität der Holoenzyme.
Zitieren
@phdthesis{doi:10.17170/kobra-202303097607,
author={Machal, Erik Marco Florian},
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While most of the research in recent decades has been focused on PKA-Cα, little research has been done on PKA-Cβ. Lately, disease-associated mutations highlight the non-redundant features of the PKA-Cα/Cβ isoforms, in particular the exceptional role of PKA-Cβ. This dissertation focussed on the detailed biochemical and in cell characterization of pathological mutations of PKA-Cα/Cβ to understand the molecular mechanisms of these mutations, and to illustrate the non-redundancy of PKA-Cα/Cβ. With a direct link to Hedgehog (Hh) signalling, the mutations in PKA-Cα (G136R) and in PKA-Cβ1 (H87N, H87R, G234R) are related to cardioacrofacial dysplasia 1 and 2, respectively. PKA-Cα G136R and PKA-Cβ1 G234R contribute to inhibitor and substrate binding, while PKA-Cβ1 H87N and H87R alter an important interaction with the phosphorylation site pT197 in the activation loop. The PKA-Cβ1 mutations displayed decreased catalytic activity, reduced PKIα inhibitor affinity and altered enzymatic parameters of (co-)substrates (ATP, Kemptide). Biochemical and biophysical data point to H87R being the most severe mutation followed by H87N and G234R. In contrast, PKA-Cα G136R displayed mainly an increased (!) affinity towards the inhibitor PKIα. PKA-Cβ1 G234R is depending on the presence of the PDK1 in E. coli expression for proper autophosphorylation of the two residues T197 and S338. Real-time BRET assays were employed to study PKA holoenzyme dynamics and regulation in HEK293 cells. All mutations except for PKA-Cα G136R showed a drastic increase in cAMP-dependent holoenzyme dissociation of PKA-RI and PKA-RII isoforms. When using the physiological β-adrenergic agonist isoproterenol, the hypothesis of labile PKA-C mutant holoenzymes was reassured. The mutations had similar effects in the splice variant PKA-Cβ2, which shows unique tissue expression. So far unpublished PKA-Cα disease-associated mutants (A20P, ΔN289-I291) also showed more labile PKA holoenzymes. In this dissertation, intramolecular effects of the PKA-C mutations on regulation and enzymatic parameters were characterized. These disease-associated mutations are located at key positions, thereby altering kinase function and regulation. It can be shown that aberrant Hh signalling is mainly due to increased cAMP-sensitivity of the resulting PKA-C mutant holoenzymes. Die Proteinkinase A (PKA) ist ein essenzielles Schlüsselenzym innerhalb vieler Signalwege der Zelle und wird durch den second messenger cAMP aktiviert. Seit ihrer Entdeckung Ende der 1960er Jahre und der jahrzehntelangen Erforschung gilt PKA als eine der am besten untersuchten Kinasen. Der Fokus lag neben regulatorischen und funktionellen Eigenschaften besonders auf der Aufklärung struktureller Merkmale. Pathologische Ursachen und Wirkungen (z.B. durch Mutationen) von PKA sind erst zum Teil untersucht. Strukturell besteht das Holoenzym aus zwei katalytischen (PKA-C) und zwei regulatorischen Untereinheiten. Es gibt drei PKA-C Isoformen (α, β, γ), welche eine hohe Homologie zeigen. Der Großteil der Forschung befasste sich lediglich mit der Isoform PKA-Cα. PKA-Cβ wird bedingt durch neue pathologische Mutationen intensiver erforscht, um die Alleinstellungsmerkmale der Isoform zu untersuchen. Diese Arbeit konzentrierte sich daher auf pathogene PKA-Cα/Cβ Mutationen und deren Einflüsse. Die Mutationen in PKA-Cα (G136R) und PKA-Cβ1 (H87N, H87R, G234R) wurden als cardioacrofacial dysplasia 1 und 2 beschrieben und mit dem Hedgehog-Signalweg in Verbindung gebracht. PKA-Cα G136R und PKA-Cβ1 G234R beeinflussen Substrat- und Inhibitor-Wechselwirkungen, während PKA-Cβ1 H87N/R eine wichtige Interaktion zur Phosphorylierungsstelle T197 im activation loop verändert. Die PKA-Cβ1 Mutationen zeigten in Aktivitäts- und Bindungsstudien eine geringere Aktivität und PKIα Affinität sowie veränderte enzymatischer Parameter. Die Mutation H87R zeigte in vitro, vor H87N und G234R den größten Einfluss. PKA-Cα G136R zeigte im Besonderen eine erhöhte Affinität zu PKIα (!). PKA-Cβ1 G234R benötigte die upstream Kinase PDK1 zur rekombinanten Expression und Autophosphorylierung in E. coli. BRET Messungen wurden zur Untersuchung von PKA Holoenzymen in HEK293 Zellen genutzt, wodurch gezeigt wurde, dass alle PKA-C Mutationen, außer PKA-Cα G136R, die cAMP-abhängige Dissoziation der Typ I und II Holoenzyme erhöhte. Der β-adrenerge Agonist Isoproterenol konnte die Hypothese der erhöhten Labilität von PKA Holoenzymen aufgrund der Mutationen bestätigen. Ähnliche Effekte konnte auch für die Mutationen in der Spleißvariante PKA-Cβ2 gezeigt werden. Bisher unveröffentlichte PKA-Cα Mutationen (A20P, ΔN289-I291) zeigten hingegen nur schwache Einflüsse auf PKA Holoenzyme und deren Dissoziation. In dieser Arbeit wurden die molekularen Einflüsse der PKA-C Mutationen in Bezug auf Regulation und Funktion hin untersucht. Die krankheitsassoziierten Mutationen befinden sich an wichtigen Stellen innerhalb der Kinase, die zu pathologischen Veränderungen innerhalb des Hedgehog-Signalweges aufgrund einer erhöhte cAMP-Sensitivität der Holoenzyme. restricted access Pathogene Mutationen in Isoformen der katalytischen Untereinheit der cAMP-abhängigen Proteinkinase Machal, Erik Marco Florian 2022-11-14 VI, 243 Seiten Kassel, Universität Kassel, Fachbereich Mathematik und Naturwissenschaften, Institut für Biologie Herberg, Friedrich W. (Prof. Dr.) Schaffrath, Raffael (Prof. Dr.) Skålhegg, Bjørn S. (Prof. Dr.) Müller, Arno (Prof. Dr.) Kinasen Mutation Phosphorylierung publishedVersion 2023-11-14 2023-11-14 false true </resource>
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