| dc.date.accessioned | 2024-03-25T14:52:15Z | |
| dc.date.available | 2024-03-25T14:52:15Z | |
| dc.date.issued | 2024 | |
| dc.identifier | doi:10.17170/kobra-202403249856 | |
| dc.identifier.uri | http://hdl.handle.net/123456789/15600 | |
| dc.language.iso | eng | |
| dc.rights | Urheberrechtlich geschützt | |
| dc.rights.uri | https://rightsstatements.org/page/InC/1.0/ | |
| dc.subject.ddc | 570 | |
| dc.title | Functional analyses of Dph1•Dph2 in synthesis of diphthamide, a clinically relevant modification on eEF2 | eng |
| dc.type | Dissertation | |
| dcterms.abstract | Diphthamide is a unique post-translational modification of a conserved histidine on the eukaryotic translation elongation factor 2 (eEF2). During translation elongation, eEF2 induces translocation of codon-anticodon duplexes across the ribosomal decoding center. Diphthamide is involved in fine-tuning of this process by stabilizing the codon-anticodon duplex and maintaining reading frame accuracy. Initially, diphthamide was identified as the target for diphtheria toxin, enabling ADP-ribosylation of eEF2 and resulting in cell death. Hypomodification of eEF2 is associated with a range of cellular defects and reflected by relevance in human disease. Mutations in genes coding for diphthamide synthesis protein Dph1 are associated with various cancer diseases. Dph1 and Dph2 mutations are also associated with an autosomal recessive neurodevelopmental disorder named diphthamide deficiency syndrome (DDS). Affected individuals display mutual traits including intellectual disability, craniofacial malformations and short stature. In S. cerevisiae, diphthamide is synthesized in four catalytic steps requiring eight proteins (Dph1-Dph8). The first step revolves around a radical reaction catalysed by the heterodimer Dph1•Dph2, processing S-adenosylmethionine (SAM) into the diphthamide precursor ACP (3-amino-3-carboxypropyl). This biological redox reaction requires [Fe4-S4]-clusters as inorganic cofactors. The subunits of Dph1•Dph2 are proposedly asymmetric in function, with Dph1 being the catalyst Dph2 a regulator. Their [Fe4-S4] binding motifs include four cysteines, respectively and two of these form tandem-cysteines motifs (TCMs) with an ill-defined role. Based on mutagenesis in yeast cells, chromosomally coded substitution mutants of Dph1 and Dph2 were phenotypically and biochemically analysed. Results show that tandem-cysteines in Dph2 (but not in Dph1) are cooperatively important in function, suggesting four cysteines in Dph2 qualify as [Fe4-S4]-cluster ligands. All essential cysteines in Dph1•Dph2 were revealed as critical integrity factors for both subunits unanimously. Unlike Dph2, Dph1 (the catalytic subunit) contains an amino acid sequence qualifying for SAM binding motif (SAM pocket). Dph1 residues which were structurally predicted to surround the SAM methionine moiety are critical for functionality, suggesting an involvement in SAM orientation for efficient ACP-formation. Based on obtained insights into critical Dph1•Dph2 regions, rare human DPH1 and DPH2 variants (occurring heterozygous) were analysed in human cells and their yeast counterparts as well. Ten DPH1 and two DPH2 variants have been identified as prone to trigger DDS. Some functionally compromised variants affected DPH1 residues close to the active center, which may indicate a role in DPH1•DPH2 activation by DPH3. Lastly, in a collaborative effort, a novel DPH5-related diphthamide deficiency syndrome was identified including studies on Dph5 counterparts in yeast cells. Taken together, this thesis is supposed to provide insights in understanding Dph1•Dph2 and facilitate DDS diagnosis. | eng |
| dcterms.abstract | Diphthamid ist eine post-translationale Modifikation eines konservierten Histidins und kommt ausschließlich am eukaryotischen Translationselongationsfaktor 2 (eEF2) vor. Während der Translationselongation induziert eEF2 die Translokation der Codon-Anticodon Duplexe entlang des ribosomalen Decodierungszentrums. Diphthamid ist durch Stabilisierung des Codon-Anticodon Duplexes und dem Aufrechterhalt der Leserastergenauigkeit speziell am Feinschliff dieses Prozesses beteiligt. Ursprünglich wurde Diphthamid als das Angriffsziel des Diphtherietoxins identifiziert, das durch ADP-Ribosylierung von eEF2 den Zelltod hervorruft. Die Hypomodifikation von eEF2 ist mit einer Reihe von zellulären Defekten assoziiert, was sich in ihrer Relevanz für humane Erkrankungen widerspiegelt. Mutationen in Genen, welche für Diphthamid-Syntheseproteine wie Dph1 codieren, sind mit verschiedenen Krebserkrankungen assoziiert. Dph1 und Dph2 Mutationen werden auch mit einer autosomal rezessiven neuronalen Entwicklungsstörung (Diphthamid-Mangelsyndrom (DDS)) assoziiert, welche mit Symptomen wie einem beschränkten Intellekt, Fehlbildungen von Kopf- und Gesichtsregion, sowie Kleinwuchs einher gehen. In S. cerevisiae wird Diphthamid in vier katalytischen Schritten unter Beteiligung von acht Proteinen (Dph1-Dph8) synthetisiert. Der erste Schritt umfasst eine von Dph1•Dph2 katalysierte Radikalreaktion, in welcher S-Adenosyl-Methionin (SAM) zum Diphthamid-Vorläufermolekül ACP (3-amino-3-carboxypropyl) prozessiert wird. Diese biologische Redoxreaktion benötigt [Fe4-S4]-cluster als anorganische Cofaktoren. Die Untereinheiten von Dph1•Dph2 wurden als funktional asymmetrisch postuliert, mit Dph1 als Katalysator und Dph2 als Regulator. Ihre [Fe4-S4] Bindemotive umfassen jeweils vier Cysteine, wovon zwei ein Tandem-Cystein-Motiv (TCM) mit bisher ungeklärter Rolle bilden. Basierend auf Mutagenesen in Hefezellen wurden chromosomal codierende Dph1 und Dph2 Punktmutanten phänotypisch und biochemisch analysiert. Ergebnisse zeigen, dass Tandem-Cysteine in Dph2 (jedoch nicht in Dph1) kooperativ von funktioneller Bedeutung sind und sich vier Dph2 Cysteine als [Fe4-S4]-cluster Liganden qualifizieren. Alle essenziellen Cysteine in Dph1•Dph2 entpuppten sich als wichtige Integritätsfaktoren für beide Untereinheiten zugleich. Im Gegensatz zu Dph2 weist Dph1 (die katalytische Untereinheit) ein potenzielles SAM-Bindemotiv (SAM-Tasche) auf. Insbesondere erwiesen sich Dph1 Aminosäuren als wichtig, welche laut struktureller Vorhersage die SAM Methioningruppe umgeben. Dies deutet wiederum auf eine Funktion dieser Reste in der Orientierung von SAM zwecks effizienter ACP-Bildung. Basierend auf gewonnen Erkenntnissen wichtiger Dph1•Dph2 Regionen wurden seltene humane heterozygot auftretende DPH1 und DPH2 Varianten in humanen Zellen und Hefezellen untersucht. Zehn DPH1 und zwei DPH2 Varianten wurden als mögliche Ursachen für DDS-Erkrankungen identifiziert. Einige funktional beeinträchtigte Varianten umfassten DPH1 Reste, welche dem aktiven Zentrum nah sind und möglicherweise der Aktivierung durch DPH3 dienen. Zuletzt wurde in einer kollaborativen Studie eine neue mit DPH5 zusammenhängende DDS-Erkrankung identifiziert, in welcher unter anderem entsprechende Dph5-Varianten in Hefezellen untersucht wurden. Zusammengefasst soll diese Arbeit Einblicke in die Funktion von Dph1•Dph2 gewährleisten und die Diagnose von DDS erleichtern | ger |
| dcterms.accessRights | open access | |
| dcterms.creator | Ütkür, Koray | |
| dcterms.dateAccepted | 2024-03-06 | |
| dcterms.extent | XIV, 129 Seiten | |
| dc.contributor.corporatename | Kassel, Universität Kassel, Fachbereich Mathematik und Naturwissenschaften, Institut für Biologie | |
| dc.contributor.referee | Schaffrath, Raffael (Prof. Dr.) | |
| dc.contributor.referee | Maniak, Markus (Prof. Dr.) | |
| dc.subject.swd | Histidin | ger |
| dc.subject.swd | Proteine | ger |
| dc.subject.swd | Radikalreaktion | ger |
| dc.subject.swd | Cystein | ger |
| dc.subject.swd | Elongationsfaktor | ger |
| dc.type.version | publishedVersion | |
| kup.iskup | false | |
| ubks.epflicht | true | |
