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dc.format.extent2873767 bytes
dc.rightsUrheberrechtlich geschützt
dc.subjectJAK/STAT pathwayeng
dc.titleThe role of Ken&Barbie in JAK/STAT signalling during development of Drosophila melanogastereng
dcterms.abstractCell-cell interactions during embryonic development are crucial in the co-ordination of growth, differentiation and maintenance of many different cell types. To achieve this co-ordination each cell must properly translate signals received from neighbouring cells, into spatially and temporally appropriate developmental responses. A surprisingly limited number of signal pathways are responsible for the differentiation of enormous variety of cell types. As a result, pathways are frequently 'reused' during development. Thus, in mammals the JAK/STAT pathway is required during early embryogenesis, mammary gland formation, hematopoiesis and, finally, plays a pivotal role in immune response. In the canonical way, the JAK/STAT pathway is represented by a transmembrane receptor associated with a Janus kinase (JAK), which upon stimulation by an extra-cellular ligand, phosphorylates itself, the receptor and, finally, the signal transducer and activator of transcription (STAT) molecules. Phosphorylated STATs dimerise and translocate to the nucleus where they activate transcription of target genes. The JAK/STAT pathway has been conserved throughout evolution, and all known components are present in the genome of Drosophila melanogaster. Besides hematopoietic and immunity functions, the pathway is also required during development for processes including embryonic segmentation, tracheal morphogenesis, posterior spiracle formation etc. This study describes Drosophila Ken&Barbie (Ken) as a selective regulator of JAK/STAT signalling. ken mutations identified in a screen for modulators of an eye overgrowth phenotype, caused by over-expression of the pathway ligand unpaired, also interact genetically with the pathway receptor domeless (dome) and the transcription factor stat92E. Over-expression of Ken can phenocopy developmental defects known to be caused by the loss of JAK/STAT signalling. These genetic interactions suggest that Ken may function as a negative regulator of the pathway. Ken has C-terminal Zn-finger domain, presumably for DNA binding, and N-terminal BTB/POZ domain, often found in transcriptional repressors. Using EGFP-fused construct expressed in vivo revealed nuclear accumulation of Ken. Therefore, it is proposed that Ken may act as a suppresser of STAT92E target genes. An in vitro assay, termed SELEX, determined that Ken specifically binds to a DNA sequence, with the essential for DNA recognition core overlapping that of STAT92E. This interesting observation suggests that not all STAT92E sites may also allow Ken binding. Strikingly, when effects of ectopic Ken on the expression of putative JAK/STAT pathway target genes were examined, only a subset of the genes tested, namely vvl, trh and kni, were down-regulated by Ken, whereas some others, such as eve and fj, appeared to be unresponsive. Further analysis of vvl, one of the genes susceptible to ectopic Ken, was undertaken. In the developing hindgut, expression of vvl is JAK/STAT pathway dependent, but remains repressed in the posterior spiracles, despite the stimulation of STAT92E by Upd in their primordia. Importantly, ken is also expressed in the developing posterior spiracles. Strikingly, up-regulation of vvl is observed in these tissues in ken mutant embryos. These imply that while ectopic Ken is sufficient to repress the expression of vvl in the hindgut, endogenous Ken is also necessary to prevent its activation in the posterior spiracles. It is therefore conceivable that ectopic vvl expression in the posterior spiracles of the ken mutants may be the result of de-repression of endogenous STAT92E activity. Another consequence of these observations is a fine balance that must exist between STAT92E and Ken activities. Apparently, endogenous level of Ken is sufficient to repress vvl, but not other, as yet unidentified, JAK/STAT pathway targets, whose presumable activation by STAT92E is required for posterior spiracle development as the embryos mutant for dome, the receptor of the pathway, show severe spiracle defects. These defects are also observed in the embryos mis-expressing Ken. Though it is possible that the posterior spiracle phenotype caused by higher levels of Ken results from a JAK/STAT pathway independent activity, it seems to be more likely that Ken acts in a dosage dependent manner, and extra Ken is able to further antagonise JAK/STAT pathway target genes. While STAT92E binding sites required for target gene expression have been poorly characterised, the existence of genome data allows the prediction of candidate STAT92E sites present in target genes promoters to be attempted. When a 6kb region containing the putative regulatory domains flanking the vvl locus are examined, only a single potential STAT92E binding site located 825bp upstream of the translational start can be detected. Strikingly, this site also includes a perfect Ken binding sequence. Such an in silico observation, though consistent with both Ken DNA binding assay in vitro and regulation of STAT92E target genes in vivo, however, requires further analysis. The JAK/STAT pathway is implicated in a variety of processes during embryonic and larval development as well as in imago. In each case, stimulation of the same transcription factor results in different developmental outcomes. While many potential mechanisms have been proposed and demonstrated to explain such pleiotropy, the present study indicates that Ken may represent another mechanism, with which signal transduction pathways are controlled. Ken selectively down-regulates a subset of potential target genes and so modifies the transcriptional profile generated by activated STAT92E - a mechanism, which may be partially responsible for differences in the morphogenetic processes elicited by JAK/STAT signalling during development.eng
dcterms.abstractWechselwirkungen zwischen Zellen während der embryonalen Entwicklung sind von großer Bedeutung für die Koordination von Wachstum, Differenzierung und Erhaltung vieler verschiedener Zelltypen. Für diese Koordination muss jede Zelle sowohl die Signale von benachbarten als auch von weit entfernten Zellen in räumlich und zeitlich adäquate Entwicklungsvorgänge übersetzen. Einer enormen Zahl von Differenzierungsvorgängen unterschiedlicher Zelltypen steht dabei eine vergleichbar geringe Anzahl verschiedener Signaltransduktionswege gegenüber. Deshalb werden solche Signalwege mehrfach für unterschiedliche Entwicklungsprozesse gebraucht. Bei Säugetieren z.B. spielt der JAK/STAT-Signalweg für die Prä-Gastrulations-Stadien der Embryogenese, für die Differenzierung des Brustdrüsen-Epithels, für die Hämatopoese und auch für das Immunsystem eine bedeutende Rolle. Im kanonischen Modell der JAK/STAT-Signalübertragung ist ein Transmembran-Rezeptor mit der Janus Kinase (JAK) assoziiert, die nach Stimulation durch einen extrazellulären Liganden zuerst sich selbst und dann auch den Rezeptor und STAT-Moleküle (Signal Transducer and Activator of Transcription) phosphoryliert. Phosphorylierte STAT-Molekule dimerisieren, werden in den Kern transportiert und aktivieren dort die Transkription von Ziel-Genen. Der JAK/STAT-Signalweg ist evolutionär konserviert. Auch das Genom der Fruchtfliege Drosophila melanogaster enthält alle bekannten Komponenten des Signalwegs, deren Aktivität während der Hämotopoese und bei der Immunantwort eine Rolle spielt und für verschiedene Entwicklungsprozesse. In dieser Arbeit wird Ken&Barbie (Ken) als negativer Regulator der JAK/STAT-Signalübertragung bei Drosophila melanogaster beschreiben. Mutationen im ken Lokus wurden in einer systematischen Suche nach Modulatoren identifiziert. ken interagiert genetisch mit dem Signalwegs-Liganden unpaired, dem Rezeptor domeless (dome) und dem Transkriptionfaktor stat92E. Über-Expression von Ken resultiert in Entwicklungsstörungen, die auch durch den Verlust von JAK/STAT-Signal-Aktivität verursacht werden. Die genetischen Interaktionen deuten auf eine negativ-regulatorische Funktion von Ken im JAK/STAT-Signalweg hin. Ken enthält eine C-terminale Zn-Finger-Domäne, die vermutlich der DNA-Bindung dient, und eine N-terminale BTB/POZ Domäne, die häufig in transkriptionellen Repressoren auftritt, und ein Ken-EGFP-Reporter-Protein im Nukleus akkumuliert, Darum Ken kann als Suppressor von STAT92E Ziel-Genen funktionieren. Ken bindet spezifisch an DNA, und die Zielsequenz überlappt mit der von STAT92E. Diese Beobachtung lässt vermuten, dass nicht alle STAT92E Zielsequenzen die Bindung von Ken erlauben. Es ist daher wahrscheinlich, dass unter den DNA-Sequenzen, an die STAT92E binden kann, nur wenige auch die Bindung von Ken ermöglichen. Diese Hypothese wird durch Experimente untermauert, in denen der Effekt von ektopisch exprimiertem Ken auf die Expression von Ziel-Genen des JAK/STAT-Signalwegs untersucht wurde. Nur einige dieser Gene, nämlich vvl, trh and kni, wurden von Ken supprimiert. Die Expression anderer JAK/STAT Ziel-Gene wie eve and fj waren von ektopischer Ken-Aktivität nicht betroffen. Unter Berücksichtigung der oben vorgeschlagenen Hypothese hängt die spezifische Suppression durch Ken von der Sequenz der STAT92E-Bindestellen in den untersuchten Zielgen-Promotoren ab. Zur genaueren Klärung wurden weitergehende Studien mit dem gemeinsamen Ziel-Gen vvl durchgeführt. Im sich entwickelnden Hinterdarm hängt die Expression von vvl von JAK/STAT-Aktivität ab. Trotz Stimulation von STAT92E durch Upd wird vvl-Expression in den Bereichen, aus denen sich das posteriore Atemloch bildet und wo auch ken exprimiert wird, nicht aktiviert. Interessanterweise, wird vvl vermehrt in den genannten Geweben exprimiert, wenn Ken-Aktivität durch eine Mutation gestört wird. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass ektopisch exprimiertes Ken ausreicht, die Expression von vvl im Hinterdarm zu reprimieren, und endogenes Ken notwendig ist, um vvl-Aktivierung im posterioren Atemloch zu verhindern. Es scheint daher, dass ektopische Expression von vvl im Gewebe, aus dem das posteriore Atemloch hervorgeht, das Ergebnis von De-Reprimierung endogener STAT92E-Aktivität ist. STAT92E-Bindestellen, die für die Expression von Ziel-Genen notwendig sind, wurden bisher kaum charakterisiert. Die verfügbaren Daten des Genom-Projekts ermöglichen allerdings die Vorhersage von möglichen STAT92E-Bindestellen in Promotoren von potenziellen Ziel-Genen. So befindet sich in einer durch Sequenz-Analyse vorhergesagten 6kb großen regulatorischen Region, die den vvl locus flankiert, eine einzige mögliche STAT92E Bindestelle (825bp vor dem Translationstart). Diese Bindestelle überlappt mit eine in-vitro-Ken-Bindesequenz. In der vorliegenden Arbeit wird Ken als Teil eines neuartigen Mechanismus vorgestellt, mit dem Signaltransduktionswege kontrolliert werden können. Ken suprimiert eine Teilmenge möglicher Ziel-Gene, die der JAK/STAT-Signalweg aktiviert, und verändert dadurch das STAT92E-abhängige Expressionsprofil. Dieser Mechanismus könnte für die unterschiedlichen Auswirkungen des JAK/STAT-Signalwegs in den morphogenetischen Prozessen während der Entwicklung verantwortlich sein.ger
dcterms.accessRightsopen access
dcterms.creatorArbouzova, Natalia
dc.contributor.corporatenameKassel, Universität, FB 18, Naturwissenschaften, Institut für Biologie
dc.contributor.refereeSchäfer, Mireille A. (Prof. Dr.)
dc.contributor.refereeJäckle, Herbert (Prof. Dr.)
dc.description.everythingDiese Arbeit entstand am Max-Planck-Institut für Biophysikalische Chemie, Göttingen.ger

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