Dissertation
Zelluläre und biochemische Charakterisierung der bifunktionalen Methyltransferase Dnmt2
Abstract
Seit der Entdeckung der Methyltransferase 2 als hoch konserviertes und weit verbreitetes Enzym sind zahlreiche Versuche zur vollständigen Charakterisierung erfolgt. Dabei ist die biologische Funktion des Proteins ein permanent umstrittener Punkt. In dieser Arbeit wird dnmA als sensitiver Oszillator bezüglich des Zellzyklus und weiterer Einflüsse gezeigt. Insgesamt liegt der Hauptfokus auf der Untersuchung der in vivo Charakterisierung des Gens, der endogenen subzellulären Verteilung, sowie der physiologischen Aufgaben des Proteins in vivo in D. discoideum. Um Hinweise auf Signalwege in vivo zu erhalten, in denen DnmA beteiligt ist, war es zunächst notwendig, eine detaillierte Analyse des Gens anzufertigen. Mit molekularbiologisch äußerst sensitiven Methoden, wie beispielsweise Chromatin‐IP oder qRT‐PCR, konnte ein vollständiges Expressionsprofil über den Zell‐ und Lebenszyklus von D. discoideum angelegt werden. Besonders interessant sind dabei die Ergebnisse eines ursprünglichen Wildtypstammes (NC4), dessen dnmA‐Expressionsprofil quantitativ von anderen Wildtypstämmen abweicht. Auch auf Proteinebene konnten Zellzyklus‐abhängige Effekte von DnmA bestimmt werden. Durch mikroskopische Untersuchungen von verschiedenen DnmA‐GFP‐Stämmen wurden Lokalisationsänderungen während der Mitose gezeigt. Weiterhin wurde ein DnmA‐GFP‐Konstrukt unter der Kontrolle des endogenen Promotors generiert, wodurch das Protein in der Entwicklung eindeutig als Zelltypus spezifisches Protein, nämlich als Präsporen‐ bzw. Sporenspezifisches Protein, identifiziert werden konnte. Für die in vivo Analyse der katalytischen Aktivität des Enzyms konnten nun die Erkenntnisse aus der Charakterisierung des Gens bzw. Proteins berücksichtigt werden, um in vivo Substratkandidaten zu testen. Es zeigte sich, dass von allen bisherigen Substrat Kandidaten lediglich die tRNA^Asp als in vivo Substrat bestätigt werden konnte. Als besondere Erkenntnis konnte hierbei ein quantitativer Unterschied des Methylierungslevels zwischen verschiedenen Wildtypstämmen detektiert werden. Weiterhin wurde die Methylierung sowie Bindung an einen DNA‐Substratkandidaten ermittelt. Es konnte gezeigt werden, dass DnmA äußerst sequenzspezifisch mit Abschnitten des Retrotransposons DIRS‐1 in vivo eine Bindung eingeht. Auch für den Substrakandidaten snRNA‐U2 konnte eine stabile in vitro Komplexbildung zwischen U2 und hDnmt2 gezeigt werden. Insgesamt erfolgte auf Basis der ermittelten Expressionsdaten eine erneute Charakterisierung der Aktivität des Enzyms und der Substrate in vivo und in vitro.
Since the discovery of Methyltransferase 2 as
a highly conserved and widely
distributed enzyme, much effort on the
complete characterization
of the enzyme has been
done. The functionality of the protein is a
highly discussed point.
In
this
thesis,
dnmA
is
shown
as
a
sensitive
oscillator
regarding
the
cell
cycle
and
other
environmental
conditions.
The
aim
of
this
research
is
the
in
vivo
characterization
of
the
gene
as
well
as
the
endogenous
subcellular
distribution
and
the
physiological
in
vivo
function
of
the
protein
in
D.
discoideum.
In
order
to
demonstrate
involvement
of
dnmA
in
biological
pathways,
a
detailed
analysis
of
the
gene
was
necessary.
With
help
of
highly
sensitive
molecular
methods
like
Chromatin
IP
or
qRT‐PCR a complete expression profile
of
D.
discoideums
development‐ and cell
cycle
has
been
done.
Particullarly
interesting
in
this
regard
are
the
the
results
of
the
wildtype
(NC4),
where
the
expression
profile
differs
quantitatively
from
other
wildtype
strains.
Cell‐cyle
dependent
effects
of
DnmA
were
also
found
at
the
protein
level.
Microscopic
analysis
of
different
DnmA‐GFP
strains
detected
changes
in
localization
during
mitosis.
In
this
work,
a
construct
was
generated
which
expresses
dnmA
under
the
control
of
the
endogenous
promoter.
Thus,
the
protein
has
been
shown
as
a
cell‐type
specific
protein
during
development;
i.e.
it
was
identified
as
a
Prespore
and
subsequently
as
Spore
specific
protein.
For
the
analysis
of
the
in
vivo
function
of
the
protein,
this
work
considered
the
results
from
gene
and/or
protein
characterization
in
order
to
test
in
vivo
substrate
candidates
and
further
to
identify
the
mechanism
that
causes
differences
in
enzyme
activity.
It
became
evident
that
of
all
the
substrate
candidates,
only
tRNA^Asp
could
be
confirmed
as
an
in
vivo
substrate.
Surprisingly,
a
quantitative
difference
is
detected
in
the
methylation
level
between
different
wildtype
strains.
Thus,
this
result
is
the
first
analysis
regarding
the
differences
in
methylation
activity
of
wildtype
strains.
It
was
shown
in
vivo
that
DnmA
has
a
highlysequence‐specific interaction
with parts of the retrotransposon
DIRS‐1.
Thus,
this
region
could
not
be
characterized
as
a
methylation
substrate
but
as
a
partner
for
DnmA
binding.
Also
for
the
non
tRNA
substrate
candidate
snRNA
U2
a
stably
bound
in
vitro
complex
between
U2
and
hDnmt2
is
shown.
In
conclusion,
based
on
the
identified
expression
data
a
new
characterization
of
the
substrates
of
the
Dnmt2
homolog,
DnmA,
has
been
done
in
vivo
and
in
vitro.
a highly conserved and widely
distributed enzyme, much effort on the
complete characterization
of the enzyme has been
done. The functionality of the protein is a
highly discussed point.
In
this
thesis,
dnmA
is
shown
as
a
sensitive
oscillator
regarding
the
cell
cycle
and
other
environmental
conditions.
The
aim
of
this
research
is
the
in
vivo
characterization
of
the
gene
as
well
as
the
endogenous
subcellular
distribution
and
the
physiological
in
vivo
function
of
the
protein
in
D.
discoideum.
In
order
to
demonstrate
involvement
of
dnmA
in
biological
pathways,
a
detailed
analysis
of
the
gene
was
necessary.
With
help
of
highly
sensitive
molecular
methods
like
Chromatin
IP
or
qRT‐PCR a complete expression profile
of
D.
discoideums
development‐ and cell
cycle
has
been
done.
Particullarly
interesting
in
this
regard
are
the
the
results
of
the
wildtype
(NC4),
where
the
expression
profile
differs
quantitatively
from
other
wildtype
strains.
Cell‐cyle
dependent
effects
of
DnmA
were
also
found
at
the
protein
level.
Microscopic
analysis
of
different
DnmA‐GFP
strains
detected
changes
in
localization
during
mitosis.
In
this
work,
a
construct
was
generated
which
expresses
dnmA
under
the
control
of
the
endogenous
promoter.
Thus,
the
protein
has
been
shown
as
a
cell‐type
specific
protein
during
development;
i.e.
it
was
identified
as
a
Prespore
and
subsequently
as
Spore
specific
protein.
For
the
analysis
of
the
in
vivo
function
of
the
protein,
this
work
considered
the
results
from
gene
and/or
protein
characterization
in
order
to
test
in
vivo
substrate
candidates
and
further
to
identify
the
mechanism
that
causes
differences
in
enzyme
activity.
It
became
evident
that
of
all
the
substrate
candidates,
only
tRNA^Asp
could
be
confirmed
as
an
in
vivo
substrate.
Surprisingly,
a
quantitative
difference
is
detected
in
the
methylation
level
between
different
wildtype
strains.
Thus,
this
result
is
the
first
analysis
regarding
the
differences
in
methylation
activity
of
wildtype
strains.
It
was
shown
in
vivo
that
DnmA
has
a
highlysequence‐specific interaction
with parts of the retrotransposon
DIRS‐1.
Thus,
this
region
could
not
be
characterized
as
a
methylation
substrate
but
as
a
partner
for
DnmA
binding.
Also
for
the
non
tRNA
substrate
candidate
snRNA
U2
a
stably
bound
in
vitro
complex
between
U2
and
hDnmt2
is
shown.
In
conclusion,
based
on
the
identified
expression
data
a
new
characterization
of
the
substrates
of
the
Dnmt2
homolog,
DnmA,
has
been
done
in
vivo
and
in
vitro.
Citation
@phdthesis{urn:nbn:de:hebis:34-2014091246008,
author={Windhof-Jaidhauser, Indra Maria},
title={Zelluläre und biochemische Charakterisierung der bifunktionalen Methyltransferase Dnmt2},
school={Kassel, Universität, FB 10, Mathematik und Naturwissenschaften, Institut für Biologie},
month={09},
year={2014}
}
0500 Oax
0501 Text $btxt$2rdacontent
0502 Computermedien $bc$2rdacarrier
1100 2014$n2014
1500 1/ger
2050 ##0##urn:nbn:de:hebis:34-2014091246008
3000 Windhof-Jaidhauser, Indra Maria
4000 Zelluläre und biochemische Charakterisierung der bifunktionalen Methyltransferase Dnmt2 / Windhof-Jaidhauser, Indra Maria
4030
4060 Online-Ressource
4085 ##0##=u http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:hebis:34-2014091246008=x R
4204 \$dDissertation
4170
5550 {{Dictyostelium discoideum}}
5550 {{Methylierung}}
5550 {{DNS-Methyltransferase}}
7136 ##0##urn:nbn:de:hebis:34-2014091246008
<resource xsi:schemaLocation="http://datacite.org/schema/kernel-2.2 http://schema.datacite.org/meta/kernel-2.2/metadata.xsd"> 2014-09-12T10:21:24Z 2014-09-12T10:21:24Z 2014-09-12 urn:nbn:de:hebis:34-2014091246008 http://hdl.handle.net/123456789/2014091246008 ger Urheberrechtlich geschützt https://rightsstatements.org/page/InC/1.0/ Methylierung Dnmt2 DnmA Dictyostelium discoideum 570 Zelluläre und biochemische Charakterisierung der bifunktionalen Methyltransferase Dnmt2 Dissertation Seit der Entdeckung der Methyltransferase 2 als hoch konserviertes und weit verbreitetes Enzym sind zahlreiche Versuche zur vollständigen Charakterisierung erfolgt. Dabei ist die biologische Funktion des Proteins ein permanent umstrittener Punkt. In dieser Arbeit wird dnmA als sensitiver Oszillator bezüglich des Zellzyklus und weiterer Einflüsse gezeigt. Insgesamt liegt der Hauptfokus auf der Untersuchung der in vivo Charakterisierung des Gens, der endogenen subzellulären Verteilung, sowie der physiologischen Aufgaben des Proteins in vivo in D. discoideum. Um Hinweise auf Signalwege in vivo zu erhalten, in denen DnmA beteiligt ist, war es zunächst notwendig, eine detaillierte Analyse des Gens anzufertigen. Mit molekularbiologisch äußerst sensitiven Methoden, wie beispielsweise Chromatin‐IP oder qRT‐PCR, konnte ein vollständiges Expressionsprofil über den Zell‐ und Lebenszyklus von D. discoideum angelegt werden. Besonders interessant sind dabei die Ergebnisse eines ursprünglichen Wildtypstammes (NC4), dessen dnmA‐Expressionsprofil quantitativ von anderen Wildtypstämmen abweicht. Auch auf Proteinebene konnten Zellzyklus‐abhängige Effekte von DnmA bestimmt werden. Durch mikroskopische Untersuchungen von verschiedenen DnmA‐GFP‐Stämmen wurden Lokalisationsänderungen während der Mitose gezeigt. Weiterhin wurde ein DnmA‐GFP‐Konstrukt unter der Kontrolle des endogenen Promotors generiert, wodurch das Protein in der Entwicklung eindeutig als Zelltypus spezifisches Protein, nämlich als Präsporen‐ bzw. Sporenspezifisches Protein, identifiziert werden konnte. Für die in vivo Analyse der katalytischen Aktivität des Enzyms konnten nun die Erkenntnisse aus der Charakterisierung des Gens bzw. Proteins berücksichtigt werden, um in vivo Substratkandidaten zu testen. Es zeigte sich, dass von allen bisherigen Substrat Kandidaten lediglich die tRNA^Asp als in vivo Substrat bestätigt werden konnte. Als besondere Erkenntnis konnte hierbei ein quantitativer Unterschied des Methylierungslevels zwischen verschiedenen Wildtypstämmen detektiert werden. Weiterhin wurde die Methylierung sowie Bindung an einen DNA‐Substratkandidaten ermittelt. Es konnte gezeigt werden, dass DnmA äußerst sequenzspezifisch mit Abschnitten des Retrotransposons DIRS‐1 in vivo eine Bindung eingeht. Auch für den Substrakandidaten snRNA‐U2 konnte eine stabile in vitro Komplexbildung zwischen U2 und hDnmt2 gezeigt werden. Insgesamt erfolgte auf Basis der ermittelten Expressionsdaten eine erneute Charakterisierung der Aktivität des Enzyms und der Substrate in vivo und in vitro. Since the discovery of Methyltransferase 2 as a highly conserved and widely distributed enzyme, much effort on the complete characterization of the enzyme has been done. The functionality of the protein is a highly discussed point. In this thesis, dnmA is shown as a sensitive oscillator regarding the cell cycle and other environmental conditions. The aim of this research is the in vivo characterization of the gene as well as the endogenous subcellular distribution and the physiological in vivo function of the protein in D. discoideum. In order to demonstrate involvement of dnmA in biological pathways, a detailed analysis of the gene was necessary. With help of highly sensitive molecular methods like Chromatin IP or qRT‐PCR a complete expression profile of D. discoideums development‐ and cell cycle has been done. Particullarly interesting in this regard are the the results of the wildtype (NC4), where the expression profile differs quantitatively from other wildtype strains. Cell‐cyle dependent effects of DnmA were also found at the protein level. Microscopic analysis of different DnmA‐GFP strains detected changes in localization during mitosis. In this work, a construct was generated which expresses dnmA under the control of the endogenous promoter. Thus, the protein has been shown as a cell‐type specific protein during development; i.e. it was identified as a Prespore and subsequently as Spore specific protein. For the analysis of the in vivo function of the protein, this work considered the results from gene and/or protein characterization in order to test in vivo substrate candidates and further to identify the mechanism that causes differences in enzyme activity. It became evident that of all the substrate candidates, only tRNA^Asp could be confirmed as an in vivo substrate. Surprisingly, a quantitative difference is detected in the methylation level between different wildtype strains. Thus, this result is the first analysis regarding the differences in methylation activity of wildtype strains. It was shown in vivo that DnmA has a highlysequence‐specific interaction with parts of the retrotransposon DIRS‐1. Thus, this region could not be characterized as a methylation substrate but as a partner for DnmA binding. Also for the non tRNA substrate candidate snRNA U2 a stably bound in vitro complex between U2 and hDnmt2 is shown. In conclusion, based on the identified expression data a new characterization of the substrates of the Dnmt2 homolog, DnmA, has been done in vivo and in vitro. open access Windhof-Jaidhauser, Indra Maria Kassel, Universität, FB 10, Mathematik und Naturwissenschaften, Institut für Biologie Nellen, Wolfgang (Prof. Dr.) Schaffrath,Raffael (Prof. Dr.) Dictyostelium discoideum Methylierung DNS-Methyltransferase 2014-05-26 </resource>
The following license files are associated with this item:
:Urheberrechtlich geschützt