Date
2017-05-03Metadata
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Dissertation
Charakterisierung des lignocellulolytischen Degradationssystems des xylobiontischen Phanerochaete chrysosporium (Basidiomycota)
Abstract
In der vorliegenden Arbeit wurde das funktionelle lignocellulolytische Proteom von Phanerochaete chrysosporium mittels Massenspektrometrie charakterisiert.
Ziel war es, den Einfluss des natürlichen Substrats Rotbuche (Fagus sylvatica) und Gemeine Fichte (Picea abies) auf die Proteinexpression der Lignocellulose abbauenden Proteine zu vergleichen, das Cellulose-Abbausystem, Hemicellulose-Abbausystem, Lignin-Depolymerisationssystem und Pektin-Degradationssystem zu modifizieren bzw. zu vervollständigen und bezüglich ihrer Funktion bisher noch unbekannte Proteine zu annotieren. Weiterhin sollte ein hypothetisches Schema des Degradationssystems von Phanerochaete chrysosporium erstellt und Protokolle zur Kultivierung, Protein-Extraktion, 1D-PAGE und zum Protein-in-Gel-Verdau modifiziert werden.
Dazu wurde der Pilz in Fest- und Flüssigkultur angezüchtet, die sekretierten Proteine extrahiert, mit Hilfe der 1D-PAGE visualisiert und nach einem Protein-in-Gel-Verdau mittels nano-LC-ESI-MS/MS detektiert.
Dabei konnten folgende Ergebnisse erhalten werden:
Die Protokolle zur Kultivierung, Protein-Extraktion, 1D-PAGE und zum Protein-in-Gel-Verdau wurden modifiziert und eine Apparaturanordnung für die Flüssigkultur etabliert.
Das extrazelluläre Cellulose-Abbausystem und die Protease-Aktivität konnten bestätigt, das Hemicellulose- und Lignin-Depolymerisationssystem ergänzt und ein umfassendes Pektin-Abbausystem entwickelt werden. Weiterhin wurde anhand der Literatur und der Ergebnisse ein hypothetisches Schema des Lignocellulose-Abbaus erstellt. 62 in den Datenbanken whiterot1 v2.0, UniProtKB / Swiss-Prot, KEGG, KOG und GO unbeschriebene Proteinsequenzen konnten mithilfe des ExPASy Proteomics Servers annotiert werden, 126 unbeschriebene Proteine bieten für zukünftige Studien einen großen Datensatz.
Über Fichten-Holzpuder konnten 120 extrazelluläre lignocellulolytische und über Buchen-Holzpuder 113 Proteine erhalten werden. Zwischen den Kulturen über Rotbuchen- und Fichten-Holzpuder als auch während 1 und 3 Wochen der Anzucht konnten keine signifikanten Unterschiede verzeichnet werden. Phanerochaete chrysosporium wächst ubiquitär auf sehr vielen einheimischen Laub- und Nadelholzarten und sekretiert universell und gleichzeitig extrazelluläre Proteine. Zur Bestimmung des Zeitpunkts der Exprimierung und der Konzentration der einzelnen lignocellulolytischen Enzyme sollte eine quantitative Studie zwingend angeschlossen werden. Auch weitere Parameter während der Anzucht (Temperatur, pH-Wert oder das Substrat) könnten variiert werden.
Ziel war es, den Einfluss des natürlichen Substrats Rotbuche (Fagus sylvatica) und Gemeine Fichte (Picea abies) auf die Proteinexpression der Lignocellulose abbauenden Proteine zu vergleichen, das Cellulose-Abbausystem, Hemicellulose-Abbausystem, Lignin-Depolymerisationssystem und Pektin-Degradationssystem zu modifizieren bzw. zu vervollständigen und bezüglich ihrer Funktion bisher noch unbekannte Proteine zu annotieren. Weiterhin sollte ein hypothetisches Schema des Degradationssystems von Phanerochaete chrysosporium erstellt und Protokolle zur Kultivierung, Protein-Extraktion, 1D-PAGE und zum Protein-in-Gel-Verdau modifiziert werden.
Dazu wurde der Pilz in Fest- und Flüssigkultur angezüchtet, die sekretierten Proteine extrahiert, mit Hilfe der 1D-PAGE visualisiert und nach einem Protein-in-Gel-Verdau mittels nano-LC-ESI-MS/MS detektiert.
Dabei konnten folgende Ergebnisse erhalten werden:
Die Protokolle zur Kultivierung, Protein-Extraktion, 1D-PAGE und zum Protein-in-Gel-Verdau wurden modifiziert und eine Apparaturanordnung für die Flüssigkultur etabliert.
Das extrazelluläre Cellulose-Abbausystem und die Protease-Aktivität konnten bestätigt, das Hemicellulose- und Lignin-Depolymerisationssystem ergänzt und ein umfassendes Pektin-Abbausystem entwickelt werden. Weiterhin wurde anhand der Literatur und der Ergebnisse ein hypothetisches Schema des Lignocellulose-Abbaus erstellt. 62 in den Datenbanken whiterot1 v2.0, UniProtKB / Swiss-Prot, KEGG, KOG und GO unbeschriebene Proteinsequenzen konnten mithilfe des ExPASy Proteomics Servers annotiert werden, 126 unbeschriebene Proteine bieten für zukünftige Studien einen großen Datensatz.
Über Fichten-Holzpuder konnten 120 extrazelluläre lignocellulolytische und über Buchen-Holzpuder 113 Proteine erhalten werden. Zwischen den Kulturen über Rotbuchen- und Fichten-Holzpuder als auch während 1 und 3 Wochen der Anzucht konnten keine signifikanten Unterschiede verzeichnet werden. Phanerochaete chrysosporium wächst ubiquitär auf sehr vielen einheimischen Laub- und Nadelholzarten und sekretiert universell und gleichzeitig extrazelluläre Proteine. Zur Bestimmung des Zeitpunkts der Exprimierung und der Konzentration der einzelnen lignocellulolytischen Enzyme sollte eine quantitative Studie zwingend angeschlossen werden. Auch weitere Parameter während der Anzucht (Temperatur, pH-Wert oder das Substrat) könnten variiert werden.
In the present study the functional lignocellulolytic proteome of Phanerochaete chrysosporium was characterized by mass spectrometry.
The aim was to compare the influence of the natural substrates beech (Fagus sylvatica) and spruce (Picea abies) on protein expression of lignocellulose degrading proteins. Thus it was aimed to close knowledge gaps within the cellulose and hemicellulose degradation systems, as well as the lignin depolymerization and pectin degradation systems, and to annotate previously unknown proteins with respect to their function. Further, a hypothetical scheme of the P. chrysosporium wood degradation system was to be created and protocols of culturing, protein extraction, 1D PAGE, and protein in-gel digestion should be enhanced.
For this, the fungus was grown in solid substrate and liquid submerged cultures. Secreted proteins were extracted, visualized using 1D PAGE, and detected after a protein in-gel digestion using nanoLC-ESI MS/MS.
The following results were obtained:
The protocols for culturing, protein extraction, 1D PAGE, and protein in-gel digestion were enhanced, and a novel apparatus arrangement for the liquid submerged cultures was established.
Presence of the extracellular cellulose degradation system and protease activity was confirmed, whereas the hemicellulose and lignin depolymerization system could be supplemented, and a comprehensive pectin degradation system was developed. Furthermore, a hypothetical scheme of lignocellulose degradation was created based on both own results and literature. Using the ExPASy Proteomics server, 62 previously undescribed protein sequences in the databases whiterot1 v2.0, UniProtKB / Swiss-Prot, KEGG, KOG, and GO were annotated, and 126 still undescribed proteins provide a large data set for future studies.
Cultures with spruce wood powder yielded 120 extracellular lignocellulolytic proteins, while 113 proteins were obtained from beech wood powder cultures. The comparison of extracellular proteins from beech and spruce cultures, as well as harvesting after 1 and 3 weeks of cultivation, showed no significant differences. P. chrysosporium grows ubiquitously on a large number of native deciduous and coniferous wood species and secretes extracellular proteins universally and simultaneously. To determine the expression time and concentration of the individual lignocellulolytical enzymes, a quantitative study would be necessary. Variation of other parameters (temperature, pH, or substrate) during the cultivation might also lead to valuable insights on possible adaptive strategies on different substrates.
The aim was to compare the influence of the natural substrates beech (Fagus sylvatica) and spruce (Picea abies) on protein expression of lignocellulose degrading proteins. Thus it was aimed to close knowledge gaps within the cellulose and hemicellulose degradation systems, as well as the lignin depolymerization and pectin degradation systems, and to annotate previously unknown proteins with respect to their function. Further, a hypothetical scheme of the P. chrysosporium wood degradation system was to be created and protocols of culturing, protein extraction, 1D PAGE, and protein in-gel digestion should be enhanced.
For this, the fungus was grown in solid substrate and liquid submerged cultures. Secreted proteins were extracted, visualized using 1D PAGE, and detected after a protein in-gel digestion using nanoLC-ESI MS/MS.
The following results were obtained:
The protocols for culturing, protein extraction, 1D PAGE, and protein in-gel digestion were enhanced, and a novel apparatus arrangement for the liquid submerged cultures was established.
Presence of the extracellular cellulose degradation system and protease activity was confirmed, whereas the hemicellulose and lignin depolymerization system could be supplemented, and a comprehensive pectin degradation system was developed. Furthermore, a hypothetical scheme of lignocellulose degradation was created based on both own results and literature. Using the ExPASy Proteomics server, 62 previously undescribed protein sequences in the databases whiterot1 v2.0, UniProtKB / Swiss-Prot, KEGG, KOG, and GO were annotated, and 126 still undescribed proteins provide a large data set for future studies.
Cultures with spruce wood powder yielded 120 extracellular lignocellulolytic proteins, while 113 proteins were obtained from beech wood powder cultures. The comparison of extracellular proteins from beech and spruce cultures, as well as harvesting after 1 and 3 weeks of cultivation, showed no significant differences. P. chrysosporium grows ubiquitously on a large number of native deciduous and coniferous wood species and secretes extracellular proteins universally and simultaneously. To determine the expression time and concentration of the individual lignocellulolytical enzymes, a quantitative study would be necessary. Variation of other parameters (temperature, pH, or substrate) during the cultivation might also lead to valuable insights on possible adaptive strategies on different substrates.
Sponsorship
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Ziel war es, den Einfluss des natürlichen Substrats Rotbuche (Fagus sylvatica) und Gemeine Fichte (Picea abies) auf die Proteinexpression der Lignocellulose abbauenden Proteine zu vergleichen, das Cellulose-Abbausystem, Hemicellulose-Abbausystem, Lignin-Depolymerisationssystem und Pektin-Degradationssystem zu modifizieren bzw. zu vervollständigen und bezüglich ihrer Funktion bisher noch unbekannte Proteine zu annotieren. Weiterhin sollte ein hypothetisches Schema des Degradationssystems von Phanerochaete chrysosporium erstellt und Protokolle zur Kultivierung, Protein-Extraktion, 1D-PAGE und zum Protein-in-Gel-Verdau modifiziert werden. Dazu wurde der Pilz in Fest- und Flüssigkultur angezüchtet, die sekretierten Proteine extrahiert, mit Hilfe der 1D-PAGE visualisiert und nach einem Protein-in-Gel-Verdau mittels nano-LC-ESI-MS/MS detektiert. Dabei konnten folgende Ergebnisse erhalten werden: Die Protokolle zur Kultivierung, Protein-Extraktion, 1D-PAGE und zum Protein-in-Gel-Verdau wurden modifiziert und eine Apparaturanordnung für die Flüssigkultur etabliert. Das extrazelluläre Cellulose-Abbausystem und die Protease-Aktivität konnten bestätigt, das Hemicellulose- und Lignin-Depolymerisationssystem ergänzt und ein umfassendes Pektin-Abbausystem entwickelt werden. Weiterhin wurde anhand der Literatur und der Ergebnisse ein hypothetisches Schema des Lignocellulose-Abbaus erstellt. 62 in den Datenbanken whiterot1 v2.0, UniProtKB / Swiss-Prot, KEGG, KOG und GO unbeschriebene Proteinsequenzen konnten mithilfe des ExPASy Proteomics Servers annotiert werden, 126 unbeschriebene Proteine bieten für zukünftige Studien einen großen Datensatz. Über Fichten-Holzpuder konnten 120 extrazelluläre lignocellulolytische und über Buchen-Holzpuder 113 Proteine erhalten werden. Zwischen den Kulturen über Rotbuchen- und Fichten-Holzpuder als auch während 1 und 3 Wochen der Anzucht konnten keine signifikanten Unterschiede verzeichnet werden. Phanerochaete chrysosporium wächst ubiquitär auf sehr vielen einheimischen Laub- und Nadelholzarten und sekretiert universell und gleichzeitig extrazelluläre Proteine. Zur Bestimmung des Zeitpunkts der Exprimierung und der Konzentration der einzelnen lignocellulolytischen Enzyme sollte eine quantitative Studie zwingend angeschlossen werden. Auch weitere Parameter während der Anzucht (Temperatur, pH-Wert oder das Substrat) könnten variiert werden. In the present study the functional lignocellulolytic proteome of Phanerochaete chrysosporium was characterized by mass spectrometry. The aim was to compare the influence of the natural substrates beech (Fagus sylvatica) and spruce (Picea abies) on protein expression of lignocellulose degrading proteins. Thus it was aimed to close knowledge gaps within the cellulose and hemicellulose degradation systems, as well as the lignin depolymerization and pectin degradation systems, and to annotate previously unknown proteins with respect to their function. Further, a hypothetical scheme of the P. chrysosporium wood degradation system was to be created and protocols of culturing, protein extraction, 1D PAGE, and protein in-gel digestion should be enhanced. For this, the fungus was grown in solid substrate and liquid submerged cultures. Secreted proteins were extracted, visualized using 1D PAGE, and detected after a protein in-gel digestion using nanoLC-ESI MS/MS. The following results were obtained: The protocols for culturing, protein extraction, 1D PAGE, and protein in-gel digestion were enhanced, and a novel apparatus arrangement for the liquid submerged cultures was established. Presence of the extracellular cellulose degradation system and protease activity was confirmed, whereas the hemicellulose and lignin depolymerization system could be supplemented, and a comprehensive pectin degradation system was developed. Furthermore, a hypothetical scheme of lignocellulose degradation was created based on both own results and literature. Using the ExPASy Proteomics server, 62 previously undescribed protein sequences in the databases whiterot1 v2.0, UniProtKB / Swiss-Prot, KEGG, KOG, and GO were annotated, and 126 still undescribed proteins provide a large data set for future studies. Cultures with spruce wood powder yielded 120 extracellular lignocellulolytic proteins, while 113 proteins were obtained from beech wood powder cultures. The comparison of extracellular proteins from beech and spruce cultures, as well as harvesting after 1 and 3 weeks of cultivation, showed no significant differences. P. chrysosporium grows ubiquitously on a large number of native deciduous and coniferous wood species and secretes extracellular proteins universally and simultaneously. To determine the expression time and concentration of the individual lignocellulolytical enzymes, a quantitative study would be necessary. Variation of other parameters (temperature, pH, or substrate) during the cultivation might also lead to valuable insights on possible adaptive strategies on different substrates. open access Bernauer, Torsten Kassel, Universität Kassel, Fachbereich Naturwissenschaften und Mathematik, Institut für Biologie Langer, Ewald (Prof. Dr.) Herberg, Friedrich W. (Prof. Dr.) Phanerochaete chrysosporium Proteomanalyse Biologischer Abbau Rotbuche Fichte 2016-05-19 </resource>
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