Untersuchung zum Phosphorylierungsstatus der katalytischen Untereinheit der PKA mittels proteomischer Techniken
| dc.contributor.corporatename | Kassel, Universität Kassel, Fachbereich 10, Abteilung Biochemie | |
| dc.contributor.referee | Herberg, Friedrich W. | |
| dc.contributor.referee | Urlaub, Henning | |
| dc.contributor.referee | Schäfer, Mireille | |
| dc.contributor.referee | Prinz, Anke | |
| dc.date.accessioned | 2011-11-16T11:15:31Z | |
| dc.date.available | 2011-11-16T11:15:31Z | |
| dc.date.examination | 2011-10-17 | |
| dc.date.issued | 2011-11-16 | |
| dc.description.sponsorship | Promotionskolleg Proteomics der Universiät Kassel | ger |
| dc.identifier.uri | urn:nbn:de:hebis:34-2011111639723 | |
| dc.identifier.uri | http://hdl.handle.net/123456789/2011111639723 | |
| dc.language.iso | ger | |
| dc.rights | Urheberrechtlich geschützt | |
| dc.rights.uri | https://rightsstatements.org/page/InC/1.0/ | |
| dc.subject | Proteomik | ger |
| dc.subject | Phosphoformen | ger |
| dc.subject.ddc | 500 | |
| dc.subject.ddc | 570 | |
| dc.subject.swd | Phosphorylierung | ger |
| dc.subject.swd | Proteinkinase A | ger |
| dc.subject.swd | Proteomanalyse | ger |
| dc.title | Untersuchung zum Phosphorylierungsstatus der katalytischen Untereinheit der PKA mittels proteomischer Techniken | ger |
| dc.type | Dissertation | |
| dcterms.abstract | ZUSAMMENFASSUNG: Das Phosphorylierungsmuster eines Proteins ist kein statischer Zustand, sondern vielmehr ein dynamischer Status, den es in der modernen funktionellen (Phospho-) Proteomik und Analytik abzubilden gilt. Klassischerweise erfolgt der Nachweis der Proteinphosphorylierung auf Peptid-Ebene mittels MS/MS Sequenzierung. Diese Standardmethode der shotgun Phosphoproteomanalytik vernachlässigt jedoch wegen den in LC MS/MS Analysen oftmals schwer detektierbaren Phosphopeptiden gerade den variablen und oftmals nur geringen Phosphorylierungsgrad vieler Phosphorylierungsstellen (P-Stellen). Mittels phosphospezifischer Anreicherungsstrategien und MS/MS Sequenzierung konnten an der Modellkinase PKA-Cα nach rekombinanter Expression in E. coli insgesamt acht P-Stellen identifiziert werden. Der Phosphorylierungsgrad wurde in Kooperation mit Dr. J. Seidler über quantitative Signalintensitätsmessungen bestimmt und zeigte eine nahezu vollständige Phosphorylierung von pS10, pS139, pT197 und pS338, während der Phosphorylierungsgrad für pS34, pS53, pS65 und pS259 zwischen <5 und 45 % variierte. Neben der Quantifizierung der P-Stellen wurde auch das Auftreten und die Verteilung definierter Phosphoformen der PKA-Cα untersucht und deren Abhängigkeit von der primären Aminosäureabfolge, dem Auftreten von zusätzlichen Modifikationen sowie den gewählten Expressions- und Reinigungsbedingungen aufgezeigt. Endogene, aus Säugergewebe isolierte PKA-Cα wies nur eine einzige Phosphoform mit den P-Stellen pT197 und pS338 auf. Auch in vitro autophosphorylierte rekombinante PKA-Cα, die zuvor dephosphoryliert worden war, wies eine zweifach modifizierte Phosphoform auf. Im Vergleich zum endogenen Protein ließ sich dieses Protein an S10 und S338 exzessiv phosphorylieren, wohingegen an T197 keine Autophosphorylierung nachzuweisen war. Das Ausbleiben weiterer Phosphorylierungen stellt in Frage, ob die Hyperphosphorylierung in E. coli ausschließlich auf Autophosphorylierungsprozessen beruht, was anhand einer nicht phosphorylierten, katalytisch inaktiven Variante von PKA-Cα (PKA-Cα K72H) vermutet wurde. Im Hinblick auf die funktionellen P-Stellen pT197 und pS338 erfordert diese Entdeckung sowie der unabhängige Nachweis, dass zellfrei exprimierte PKA-Cα nur an S338 phosphoryliert ist, eine Modifizierung des sequenziellen Vorhersagemodells, wonach die Phosphorylierung an T197 eine zwingende Voraussetzung für die nachfolgende Phosphorylierung an S338 ist. Ferner konnte über phosphomimetische Mutagenese die Funktionalität der Phosphorylierung an S53 innerhalb der glycinreichen Schleife der PKA-Cα und somit ein potenzieller Weg zur Regulation der enzymatischen Aktivität gezeigt werden. Ein weiterer möglicher upstream Regulator von PKA-Cα ist die Proteinphosphatase 5, die in der Lage war, die bislang als phosphatasestabil beschriebene P Stelle pT197 in vitro zu dephosphorylieren. Die vorliegende Arbeit zeigt, dass der Phosphorylierungszustand eines Proteins von zahlreichen internen und externen Faktoren abhängt – eine Tatsache, die gerade für rekombinante Proteine, insbesondere enzymatisch aktive Kinasen, oft vernachlässigt wurde. Daher müssen auch in der shotgun Phosphoproteomanalytik P-Stellen nicht mehr nur identifiziert und quantifiziert werden, sondern die resultierenden Proteinphosphoformen differenziert auch in ihrem physiologischen Kontext beschrieben werden. | ger |
| dcterms.abstract | SUMMARY: Investigating the dynamic phosphostatus of single proteins, cells or tissues is of pivotal importance to understand protein function on a molecular level - hence, it is a major challenge in proteomics: In general, phosphorylation status analyses are performed on phosphopeptide level following protein cleavage. However, such phosphosite specific screens show limitations, since they do not sufficiently consider - apart from the variability - the generally low abundance and substoichiometry of phosphoproteins as well as the fact that phosphopeptides are often suppressed when applying LC-coupled mass spectrometry (MS). Using a classical MS approach in combination with phosphospecific enrichment strategies, a total of eight phosphorylation sites (P-sites) could be identified on the model kinase PKA-Cα when expressed in E. coli. In collaboration with Dr. J. Seidler signal intensity measurements were performed to quantify the stoichiometry of P-sites: While pS10, pS139, pT197 and pS338 were found to be completely phosphorylated, the phosphorylation degree for residual P-sites at pS34, pS53, pS65 and pS259 varied between <5 and 45 %. On intact protein level, PKA-Cα reveals certain distinct phosphoforms displaying a different molecular weight depending on the primary amino acid sequence, on the introduction of additional protein modifications as well as the chosen expression conditions and purification strategies. Interestingly, endogenous mammalian PKA-Cα purified from animal tissue displayed only a single phosphoform with two P sites at pT197 and pS338. Several results from this work argue that hyperphosphorylation of PKA-Cα in E. coli is exclusively based on autophosphorylation, which earlier was concluded from a kinase death mutant (PKA-Cα K72H) that does not exhibit any phosphorylation at all. In an in vitro autophosphorylation assay on recombinantly expressed and dephosphorylated PKA-Cα, however, the dominant phosphoform turned out to be phosphorylated only twice as was PKA-C isolated from animal tissue. During autophosphorylation, no further modification was detected at T197, while S10 and S338 were found to be excessively phosphorylated. Concerning the functional P- sites at pT197 and pS338, these data, as well as data from protein expressed in a cell free expression system that displayed only a single P-site at S338, also do challenge the long accepted hypothesis that phosphorylation at T197 is a prerequisite for phosphorylation of S338. Phosphorylation in the glycine-rich loop of PKA-Cα was investigated via phosphomimetic mutagenesis of S53 and might be involved in fine-tuning the enzyme’s specific activity. Protein phosphatase 5 could be identified as a putative upstream regulator of PKA-Cα, which in vitro was able to efficiently dephosphorylate the predicted phosphatase stable P-site pT197. Finally, this work demonstrates that the overall phosphorylation pattern of a protein depends on various internal and external conditions – a fact that should be generally considered when working on the phosphostatus of recombinant proteins, especially of enzymatically active kinases. In the future, general shotgun phosphoproteomic studies will have to draw deeper attention to the physiological background of a given protein while identifying P-sites and phosphoforms as well as quantifying their phosphorylation degree. | eng |
| dcterms.accessRights | open access | |
| dcterms.creator | Hanke, Susanne Eva |