Mechanistic Insights into the intrinsic Kinase Regulation of LRRK2

Obwohl Morbus Parkinson (PD) die zweithäufigste neurodegenerative Erkrankung darstellt, ist der Pathomechanismus kaum verstanden. Es ist jedoch erwiesen, dass PD assoziierte Mutationen die Aktivität der Leucine rich repeat kinase 2 (LRRK2) beeinflussen, sodass diese ein potentielles Drug Target darstellt. Für ein besseres Verständnis wurden daher der intrinsische regulatorische Mechanismus und der Einfluss von Mutationen auf LRRK2 untersucht. Zusätzlich wurde der Einfluss von Nanobodies gegen die ROC Domäne von LRRK2 auf die Kinase Aktivität überprüft. Die Nanobodies konnten in hoch- und niedrigaffine ROCDomänen- Binder unterteilt werden, dabei erkannten die hochaffinen ein anderes Epitop (Bins) als die niedrigaffinen. Die Zugabe von hochaffinen Nanobodies erhöhte die Kinaseaktivität von LRRK2, jedoch nicht die eines N-terminal verkürzten ROC-COR-Kinase-WD40- Konstruktes (RCKW). Zusammen mit Ergebnissen anderer Forschergruppen kann daher von einer autoinhibitorischen Domäne um die Aminosäure S1292 ausgegangen werden. Überdieswurde in der vorliegenden Arbeit gezeigt, dass nukleotidfreies LRRK2 eine höhere Kinaseaktivität besitzt als die GDP- oder GTP-gebundene Form. Dies deutet auf eine Regulation der Kinasedomäne durch Modulation des Monomer-Dimer-Zyklus aufgrund des G-Nukleotid-Status der ROC Domäne hin. Die R-Spine Mutation Y2018F, welche das für Kinasen essenzielle DFG (LRRK2: DYG) Motiv wiederherstellt, erhöht wie G2019S die Kinaseaktivität um den Faktor drei bis vier. Außerdem bildet LRRK2 Y2018F, ebenso wie die PD assoziierte Mutation I2020T, mit erhöhter Wahrscheinlichkeit Filamente um Mikrotubuli. Sowohl die erhöhte Kinaseaktivität als auch die Filamentbildung stehen im engen Zusammenhang mit der Entstehung von PD. Y2018F vereint beide pathogenen Effekte vermutlich durch die Stabilisierung einer spezifischen aktiven LRRK2-Konformation, welche sich zur der von G2019S unterscheidet. LRRK2 bildet ebenfalls nach Inhibition durch MLi-2 Filamente aus. Daher ist die Bildung von Filamenten wahrscheinlich auf die aktive Konformation und nicht die Kinaseaktivität zurückzuführen. Zusätzlich ist eine schützende Funktion des N-Terminus wahrscheinlich, da das RCKW Konstrukt unabhängig von Mutationen oder MLi-2-Behandlung Filamente bildet. Nur die RCKW-Kinase-Tot-Mutante D2017A konnte die Filamentbildung reduzieren. Dies bestätigt zusätzlich, dass eine aktive Kinase-Konformation für das Bilden von LRRK2-Filamenten benötigt wird, während dieser Prozess zusätzlich durch den N-Terminus reguliert wird. Zusammenfassend nehmen die ROC-Domäne sowie der N-Terminus wichtige regulative Rollen bei der Kontrolle von Kinaseaktivität und Filamentbildung bei LRRK2 ein. Abschließend wurde das Spine-Modell für Kinasen auf LRRK2 angewendet sowie Spine-Mutationen, welche potenziell die Stabilität der Kinase erhöhen, eingebracht und charakterisiert. Die Flexibilität dieses hydrophoben Netzwerks basiert auf einem fein abgestimmten Gleichgewicht zwischen dem aktiven und inaktiven Status der Kinase. Dieses Gleichgewicht kann relativ einfach durch pathogene Mutationen wie G2019S oder I2020T, die den aktiven Status präferieren, beeinträchtigt werden. Interessanterweise wurde die R-Spine-Mutation Y2018F als eine neue hyperaktive Kinase-Mutation in LRRK2 identifiziert.