| dcterms.abstract | Hairpin Ribozyme kommen natürlich in den Minussträngen der Satelliten RNAs dreier Pflanzenviren (sTRsV, sArMV and sCYMoV) vor. In dieser Arbeit wurden mit dem Programm Mfold darin mehrere distinkte Sekundärstrukturelemente gefunden, die außerhalb des katalytischen Zentrums der Ribozyme lokalisieren. Verschiedene Varianten der drei Ribozyme wurden hergestellt und die Funktion der beobachteten peripheren Strukturelemente biochemisch untersucht. Die sTRsV Hairpin Ribozyme mit unterschiedlichen Längen in Arm C wiesen ähnliche cis-Spaltungsreaktionen auf, unabhängig von der Anzahl interner bulges in Arm C. Das gleiche Verhalten, jedoch bei schnelleren Spaltungsraten, wurde nach Entfernen der three-way junction, die 3’ von der Spaltstelle in Arm A liegt, beobachtet. Hier hat Arm C demnach keinen Einfluss auf die Katalyse, wogegen ein verlängerter Arm A die Reaktion verlangsamt. Unter den experimentellen Bedingungen war die Rückreaktion in Anwesenheit des natürlichen Arms A nicht messbar. Im Gegensatz dazu zeigten alle Varianten ohne die Arm A Erweiterung Ligationsaktivität, die am höchsten in dem Molekül mit dem längsten Arm C war, und gleichermaßen erniedrigt für zwei Varianten mit kürzerem Arm C. Keine der Reaktionen diverser sArMV Hairpin Ribozyme konnte reproduzierbar analysiert werden. Für das sCYMoV Hairpin Ribozym wurde schließlich in cis-Spaltungsreaktionen eine Zunahme der Geschwindigkeit mit Abnahme der Länge von Arm D beobachtet. Dies war der Fall in Anwesenheit der three-way junction in Arm A, nicht jedoch in ihrer Abwesenheit, wo Varianten mit unterschiedlichen Längen des Arms D ähnliche Spaltungsreaktionen aufwiesen. In Anwesenheit der three-way junction in Arm A war eine Reduzierung der Ligationsgeschwindigkeit zu beobachten, und bei ihrer Abwesenheit stieg diese mit der Länge von Arm D. Dies zeigt, dass sowohl die three-way junction in Arm A, als auch die Länge und Anzahl der bulges in Arm D die Reaktion des Hairpin Ribozyms aus sCYMoV beeinflussen, wobei sich Unterschiede in Vorwärts- und Rückreaktion auf die experimentellen Bedingungen zurückführen lassen. In zwei Serien wurde die zentrale five-way junction dieses Ribozyms durch verschiedene four-way junctions ersetzt. Die kinetischen Parameter der Selbstspaltung waren ähnlich für Varianten ohne Arm E auf, jedoch verlangsamt bei Varianten ohne Arm C. Dies zeigt, dass das sCYMoV Hairpin Ribozym auch um eine four-way junction gebildet werden kann, deren konstituierenden Helices jedoch nicht beliebig sind.
In einem zweiten Projekt wurde die Konservierung von Hammerhead Ribozym-motiven, die bereits früher im Genom der Brassicacee A. thaliana gefunden worden waren, exemplarisch an zehn Mitgliedern dieser Familie untersucht. Da deren Genome nicht sequenziert sind, wurde PCR mit Primern angewandt, die für die A. thaliana Motive spezifisch waren. Damit konnten Ribozymmotive in allen untersuchten Brassicaceen außer B. nigra and B. oleracea gefunden werden. Diese gehören zu den sechs Brassica Pflanzen, für die der koreanische Botaniker U 1935 im “triangle of U” die genetische Verwandtschaft beschrieb. Darin ist B. carinata, für die Ribozymmotive gezeigt wurden, die Tochterspezies der Brassica Pflanzen ohne diese Motive. Dieser Widerspruch könnte darauf zurückzuführen sein, dass in der PCR unspezifische Primer genutzt wurden, oder aber die Motive aus B. carinata könnten ein Artefakt aus einer Luft-übertragenen Kontamination sein. Technische Schwierigkeiten in der Durchführung von Southern Blots, mit denen zwischen diesen Möglichkeiten unterschieden werden sollte, haben eine abschließende Antwort verhindert. Nach einer Optimierung der Methode sollte diese aber geeignet sein, diese Frage zu klären. | ger |
