| dc.date.accessioned | 2012-01-25T08:12:23Z | |
| dc.date.available | 2012-01-25T08:12:23Z | |
| dc.date.issued | 2012-01-25 | |
| dc.identifier.uri | urn:nbn:de:hebis:34-2012012540421 | |
| dc.identifier.uri | http://hdl.handle.net/123456789/2012012540421 | |
| dc.description.sponsorship | Studienstiftung des deutschen Volkes | ger |
| dc.language.iso | ger | |
| dc.rights | Urheberrechtlich geschützt | |
| dc.rights.uri | https://rightsstatements.org/page/InC/1.0/ | |
| dc.subject | tRNA | ger |
| dc.subject.ddc | 500 | |
| dc.subject.ddc | 570 | |
| dc.title | Biologische Funktionsanalyse und Identifizierung neuer Substrate der Methyltransferase Dnmt2 | ger |
| dc.type | Dissertation | |
| dcterms.abstract | Obwohl die DNA Methyltransferase 2 (Dnmt2) hoch konserviert ist und zu der am weitesten verbreiteten eukaryotischen MTase-Familie gehört, ist ihre biologische Funktion nach wie vor unklar. Nachdem lange Zeit keine DNA Methylierungsaktivität nachgewiesen werden konnte, wurde vor einigen Jahren über geringe Mengen an 5-Methylcytosin (5mC) in Retroelementen der “Dnmt2-only”-Organismen D. melanogaster, D. discoideum und E. histolytica berichtet (Kunert et al. 2003; Fisher et al. 2004; Kuhlmann et al. 2005; Phalke et al. 2009). Als kurze Zeit später robuste Methylierung der tRNAAsp durch humane Dnmt2 gezeigt wurde (Goll et al. 2006), wurde zunächst eine Dualspezifität des Enzyms vorgeschlagen (Jeltsch et al. 2006). Neuere Daten zum 5mC-Status verschiedener „Dnmt2-only“-Organismen bilden Anlass für kontroverse Diskussionen über Ausmaß und Bedeutung der DNA Methyltransferaseaktivität von Dnmt2 (Schaefer et al. 2010a; Krauss et al. 2011).
Die vorliegende Arbeit konzentriert sich auf die Identifizierung neuer RNA Substrate des Dnmt2-Homologs DnmA aus D. discoideum sowie die biologische Bedeutung der tRNA-Methylierung durch Dnmt2. Wie in anderen Organismen beschrieben, fungiert auch DnmA als tRNAAsp(GUC) MTase in vitro und in vivo. Zusätzlich konnte in vitro tRNAGlu(UUC) als neues Substrat der Dnmt2-Homologe aus D. discoideum und dem Menschen identifiziert werden. In einem Kooperationsprojekt wurde außerdem auch tRNAAsp-Methylierungsaktivität für das Dnmt2-Homolog aus S. pombe (Pmt1) nachgewiesen.
Crosslink-RNA-Immunopräzipitationen (RNA-CLIP) mit anschließender Next-Generation-Sequenzierung der mit DnmA assoziierten RNAs zeigen, dass DnmA mit tRNA Fragmenten interagiert, die sich vom Anticodonloop bis in den T-loop erstrecken. Neben der tRNAAsp(GUC) und tRNAGlu(UUC/CUC) sind Fragmente der tRNAGly(GCC) verstärkt angereichert. Inwiefern diese Fragmente eine biologische Funktion haben oder spezifische Degradationsprodukte darstellen, ist noch ungeklärt. Interessanterweise sind von einigen tRNAs wenige Sequenzen von antisense-Fragmenten in den RNA-CLIP Daten zu finden, die etwas kürzer, jedoch exakt komplementär zu den genannten sense-Fragmenten sind. Besonders stark sind diese Fragmente der tRNAGlu(UUC) vertreten. In einem weiteren RNA-CLIP Experiment wurden U-snRNAs, snoRNA und intergenische Sequenzen mit DnmA angereichert. Bei nachfolgenden in vitro Methylierungsstudien konnte ausschließlich die U2-snRNA als potentielles Nicht-tRNA-Substrat der hDnmt2 und DnmA identifiziert werden.
Da tRNA Modifikationen im Anticodonloop die Codonerkennung beeinflussen können, wurde ein System etabliert um die Translationseffizienz eines GFP-Reportergens in Wildtyp- und dnmAKO-Zellen zu messen. In D. discoideum wird das Aspartat-Codon GAU ca. zehnmal häufiger genutzt als das GAC Codon, allerdings ist nur eine tRNAAsp(GUC) im Genom der Amöbe kodiert. Aus diesem Grund wurde zusätzlich die Frage adressiert, inwiefern die DnmA-abhängige Methylierung dieser tRNA das „Wobbling“ beeinflusst. Dazu wurde dem Reportergen jeweils eine (GAU)5- und (GAC)5-Leadersequenz vorgeschaltet. Entgegen der Annahme wurde der (GAC)5-Leader in beiden Stämmen etwas effizienter translatiert. Insgesamt zeigte der dnmAKO-Stamm eine leicht erhöhte Translationseffizienz der Reportergene.
Vergleichende Analysen zur Aufnahme von Fremd-DNA zeigten signifikant reduzierte Transformationseffizienzen mit einem integrierenden Plasmid in dnmAKO-Zellen. Ein weiterer dnmAKO-Stamm zeigte diesen Effekt jedoch nicht, wobei bei derselben Mutante eine deutlich reduzierte Aufnahme eines extrachromosomalen Plasmids zu verzeichnen war.
Untersuchungen zum Einfluss von DnmA auf die Regulation des Retroelements skipper ergaben keinen Zusammenhang zwischen der Generierung kleiner RNAs und der erhöhten Transkription des Retrotransposons in dnmAKO-Zellen (Kuhlmann et al. 2005). Durch Kompensationsversuche sowie Experimente mit einer weiteren dnmAKO-Mutante konnte die Mobilisierung des Retrotransposons nicht eindeutig als DnmA-Funktion eingeordnet werden.
In einem weiteren Projekt wurden die Bindung des m5C-bindenden Proteins EhMLBP aus E. histolytica an DNA mittels Rasterkraftmikroskopie abgebildet (Lavi et al. 2006). Neben vermutlich unspezifischen Endbindungsereignissen konnte eine bevorzugte Bindungsstelle des Proteins an LINE DNA (long intersperesed nuclear element) identifiziert werden. Möglicherweise fällt diese mit einem von zwei A/T-reichen Bereichen der LINE DNA zusammen, von denen vermutet wird, dass diese für die Bindung von EhMLBP an DNA von Bedeutung sind.
Insgesamt bestätigen die Ergebnisse dieser Arbeit die tRNAAsp Methylierungsaktivität als konservierte Dnmt2-Funktion. Darüber hinaus erweitern sie das Substratspektrum der Dnmt2-Methyltransferasen im Bereich der tRNA. Außerdem wird erstmals ein potentielles Nicht-tRNA Substrat vorgeschlagen. Zusätzlich geben neu entdeckte Phänotypen Hinweise auf vielfältige zelluläre Dnmt2-Funktionen. | ger |
| dcterms.abstract | The highly conserved DNA methyltransferase 2 (Dnmt2) is the most widely distributed eukaryotic DNA methyltransferase; however, its biological function is still enigmatic. Although weak m5C-DNA methylation on retroelements has been reported for “Dnmt2-only” organisms like D. discoideum, D. melanogaster and E. histolytica, its role is still controversially discussed (Kunert et al. 2003; Banerjee et al. 2005; Kuhlmann et al. 2005; Phalke et al. 2009; Schaefer et al.). Recent data have shown methyltransferase activity on tRNAAsp for different Dnmt2 homologues and, thus, suggested a dual activity (Goll et al. 2006; Jeltsch et al. 2006).
My work focused on identification of new RNA substrates and the biological function of tRNA methylation by Dnmt2. Methylation analysis of the Dictyostelium Dnmt2-homologue, DnmA, has also revealed a tRNA methylation activity for tRNAAsp in vitro and in vivo. Additionally, tRNAGlu(UUC) was identified as substrate in vitro. For the Dnmt2-Homologue of S. pombe (Pmt1) tRNAAsp methylation activity was also experimentally verified.
To identify further RNA substrates, a crosslink-RNA-immunoprecipitation (RNA-CLIP) of GFP-tagged DnmA was combined with Next-Generation-Sequencing of associated RNAs. This approach revealed interaction of DnmA with tRNA fragments covering the part from the anticodon loop to the T-loop of a tRNA. In addition to fragments of tRNAAsp(GUC) and tRNAGlu(UUC/CUC) enrichment of tRNAGly(GCC) was observed. However, the origin of these fragments as well as the biological function are still unknown. Interestingly, for some tRNA we detected antisense fragments with a low number of reads. These fragments show complementarities to the sense fragments but are a few nucleotides smaller. Moreover, a separate RNA-CLIP experiment reveals several additional RNA candidate substrates. In further validation experiments rnu2 (U2 snRNA) but not sno7 (snoRNA 7) and two previously not annotated intergenic transcripts could be methylated to a low extend in vitro by DnmA and Dnmt2.
In D. discoideum the aspartate codon GAC is used at least ten times less in comparison to GAU. But only tRNAAsp complementary to the rare GAC codon is annotated in Dictybase. The question arises if a putative tRNAAsp methylation caused by DnmA has an influence on codon recognition and “wobbling”. A GFP-reporter system with either a (GAU)5- or a (GAC)5-leader has been established to approach differences in translation efficiency between wildtype cells and dnmAKO mutants. Contradicting the hypothesis the (GAC)5-GFP construct was translated slightly more efficiently than the (GAU)5-leader. Overall, the translation efficiency was elevated in dnmAKO mutants.
Approaching the uptake of external DNA by dnmAKO mutants and wildtype cells I observed significantly reduced transformation efficiency with an integrating plasmid for one but not a second dnmAKO strain. However, the uptake of an extrachromsomal plasmid was impaired in this second strain in comparison to wildtype.
Investigating the role of DnmA in regulation of the skipper retrotransposon no realationship between the generation of small skipper RNA and enhanced transcription in dnmAKO cells was detected. Furthermore, experiments with a second mutant as well as rescue experiments failed to link the skipper mobilisation to DnmA function.
In a further project the binding of the m5C-binding protein of E. histolytica (EhMLBP) to LINE DNA (long interspersed nuclear element) was imaged using atomic force microscopy. Despite many end binding events a preferential binding site could be defined. Possibly this site correspond to one out of two A/T-rich sequences which are anticipated to be involved in EhMLBP target recognition.
In summary, my results confirm tRNAAsp methylation as conserved Dnmt2 function. Moreover, they indicate that DnmA has additional tRNA substrates and for the first time a putative non-tRNA substrate is presented. In addition, several new phenotypes hint at extended roles of Dnmt2 in cellular function. | ger |
| dcterms.accessRights | open access | |
| dcterms.creator | Müller, Sara | |
| dc.contributor.corporatename | Universität Kassel | |
| dc.contributor.referee | Nellen, Wolfgang (Prof. Dr.) | |
| dc.contributor.referee | Jeltsch, Albert (Prof. Dr.) | |
| dc.subject.msc | 92C40 | ger |
| dc.subject.swd | Epigenetik | ger |
| dc.subject.swd | Methylierung | ger |
| dc.subject.swd | Transfer-RNS | ger |
| dc.subject.swd | Methyltransferasen | ger |
| dc.date.examination | 2011-12-23 | |
