Date
2018-08-30Author
Autenrieth, KarolinSubject
500 Science 570 Life sciences; biology BiochemieMolekularbiologieProteinkinasenInteraktionsanalyseMetadata
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Dissertation
Molekulare Grundlagen der PKA-Lokalisierung durch A-Kinase-Ankerproteine
Abstract
A-Kinase-Ankerproteine (AKAPs) tragen maßgeblich zur Spezifität des ubiquitären cAMP-Signalweges bei. Dies geschieht unter anderem durch die Verankerung der cAMP-abhängigen Proteinkinase (PKA) an verschiedene Zellorganellen, wodurch die PKA-Effekte lokal und zeitlich begrenzt werden. AKAPs variieren erheblich in Größe und Struktur, zeigen aber als gemeinsames Strukturmotiv eine amphipathische Helix auf. Alle vier Isoformen der regulatorischen Untereinheit der PKA (PKA-R) bilden bei Dimerisierung eine hydrophobe Oberfläche. Hierüber wird die Protein-Protein-Interaktion mit der hydrophoben Seite der amphipathischen Helix, auch A-Kinase-Bindedomäne genannt, vermittelt. In der vorliegenden Arbeit wurden zunächst die isoform-spezifischen Wechselwirkungen zwischen PKA-R und AKAPs untersucht. Es zeigte sich, dass qualitative Daten zur Isoformspezifität maßgeblich vom methodischen Ansatz abhängig sind. Zur korrekten Charakterisierung ist eine Differenzierung zwischen Spezifität und Selektivität erforderlich, da die Konzentrationen der PKA-R lokal und zeitlich sehr variieren. Das small membrane AKAP (smAKAP) ist als eins der wenigen RIbindenden AKAPs bekannt. In dieser Arbeit wurden kinetische Bindungsstudien mit einem smAKAP-Volllängenprotein durchgeführt. SmAKAP, von dem die RI-Spezifität bereits in vivo nachgewiesen wurde, besitzt auch hohe Affinitäten zur RII6. Die Bezeichnung RI-selektiv ist passender, da die Isoformspezifität abhängig von den lokalen Konzentrationen der verschiedenen R-Isoformen ist. Die vorliegende Arbeit fokussierte weiterhin auf den grundlegenden Mechanismus der Isoformspezifität von AKAPs. Dabei wurde eine konservierte kritische Aminosäure im ersten helikalen Register der RIbindenden AKAPs identifiziert. Diese N-terminal gelegene, meist aromatische Aminosäure, bindet in eine sterisch eng gepackte Furche der RI-D/D-Domäne. Eine hohe Affinität von RI:AKAP-Komplexen besteht nur mit sterisch passenden Aminosäuren an dieser Position der A-Kinase-Bindedomäne. Im Gegenteil dazu besteht eine hohe Flexibilität bei Bindung an die RII-D/D-Domäne, da sich diese Position aufgrund einer N-terminalen Drehung am flexiblen N-Terminus der RII-D/D-Domäne befindet. Basierend auf Kristallstruktur-Daten wurde der Einfluss hydrophiler Aminosäuren in der A-Kinase-Bindedomäne untersucht. Der Einsatz der bisherigen Methoden demonstrierte eindeutig einen Einfluss dieser hydrophilen Anker. Im Screening zeigte sich, dass die Beiträge zwischen den AKAPs variieren, obwohl es sich hier um in AKAPs konservierte Aminosäuren handelt. Mit SPR-Bindungsstudien der untersuchten AKAPs konnte ein positiver Einfluss der hydrophilen Anker auf die Dissoziationsrate festgestellt werden. Die Beiträge der hydrophilen Anker tragen jedoch nicht maßgeblich zur hohen Affinität bei, vielmehr kann aus den kinetischen Ergebnissen geschlussfolgert werden, dass ihre Funktion das optimale Positionieren des AKAPs an die hydrophobe Oberfläche der D/DDomäne ist. Der Bindemodus zwischen PKA-R und AKAPs wird durch die hydrophilen Anker mitbestimmt, die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit liefern somit neue Erkenntnisse zum molekularen Mechanismus dieser hydrophoben Interaktion.
Sponsorship
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