Characterization of the molecular clockwork in the cockroach Rhyparobia maderae
Der Wechsel von Tag und Nacht erzeugt einen regelmĂ€Ăigen Rhythmus von verschiedenen Umweltreizen, allen voran Licht und Temperatur. Fast jedes bis zum heutigen Tage untersuchte Lebewesen besitzt einen endogenen Mechanismus zur Zeitwahrnehmung, und diese "innere Uhr" befĂ€higt Lebewesen dazu, sich vorausschauend an rhythmische Umwelt-Ănderungen anzupassen. Circadiane Rhythmen bestehen auch ohne jegliche Ă€uĂere Reize und basieren auf einem molekularen RĂŒckkopplungs-Mechanismus, der Rhythmen in Genexpression und Proteinkonzentration von etwa 24 Stunden erzeugt. Obwohl sich die grundsĂ€tzlichen Mechanismen und Komponenten dieses molekularen Uhrwerks in allen Insekten Ă€hneln, zeigte sich jedoch immer mehr, dass es im Detail doch wesentliche Unterschiede zwischen verschiedenen Insektengruppen gibt. WĂ€hrend das molekulare Uhrwerk der Fruchtfliege Drosophila melanogaster inzwischen sehr gut untersucht ist, fehlen bei den meisten Insektengruppen immernoch eingehende Untersuchungen. Fast nichts ist ĂŒber die molekulare Basis von circadianen Rhythmen bei der Schabe Rhyparobia maderae bekannt, obwohl diese Art bereits seit Langem als Modellorganismus in der Chronobiologie dient. Um mit der Forschung am molekularen, circadianen System von R. maderae zu beginnen, wurde die Struktur und das Expressionsprofil der core feedback loop Gene per, tim1 und cry2 analysiert. Mittels degenerierten Primern und RACE konnte das vollstĂ€ndige offene Leseraster (OLR) von rmPer und rmCry2, und ein Teil des rmTim1 OLR kloniert werden. Eine phylogenetische Analyse gruppierte rmPER und rmCRY2 gemeinsam mit den Orthologa hemimetaboler Insekten. Viele bei D. melanogaster funktionell charakterisierte DomĂ€nen sind bei diesen Proteinen konserviert, was auf eine Ă€hnliche Funktion in der inneren Uhr von R. maderae hinweist. Mittels quantitativer PCR konnte gezeigt werden, dass die mRNA von rmPer, rmTim1 und rmCry2 in verschiedenen Lichtregimen in der gleichen Phasenlage Tageszeit-abhĂ€ngig schwankt. Die Phasenlage stellte sich bei unterschiedlichen Photoperioden jeweils relativ zum Beginn der Skotophase ein, mit Maxima in der ersten HĂ€lfte der Nacht. Auch im Dauerdunkel zeigen sich Rhythmen in der rmTim1 und rmCry2 Expression. Die Amplitude der rmPer Expressionsrhythmen war jedoch so gering, dass keine signifikanten Unterschiede zwischen den einzelnen Zeitgeberzeiten (ZT) festgestellt werden konnten. Mittels Laufrad-Assays wurde untersucht wie Kurz- und Langtag Lichtregime die Verhaltensrhythmen beeinflussen. Es konnten nur Unterschiede in der PeriodenlĂ€nge unter freilaufenden Bedingungen festgestellt werden, wenn höhere LichtintensitĂ€ten (1000lx) zur Synchronisation (entrainment) genutzt wurden. Die Periode des freilaufenden Rhythmus war bei Tieren aus dem Kurztag lĂ€nger. Die photoperiodische PlastizitĂ€t zeigte sich also auch auf Verhaltensebene, obwohl höhere LichtintensitĂ€ten notwendig waren um einen Effekt zu beobachten. Basierend auf den Sequenzen der zuvor klonierten OLR wurden gegen rmPER, rmTIM1 und rmCRY2 gerichtete Antikörper hergestellt. Die Antikörper gegen rmPER und rmTIM1 erkannten in western blots sehr wahrscheinlich spezifisch das jeweilige Protein. Zeitreihen von Gehirngewebe-Homogenisaten zeigten keinen offensichtlichen circadianen Rhythmus in der Proteinkonzentration, wahrscheinlich auf Grund einer Oszillation mit niedriger Amplitude. In Immunhistochemischen FĂ€rbungen konnte nur mit dem gegen rmPER gerichteten Antikörper aus Kaninchen ein Signal beobachtet werden. Beinahe jede Zelle des Zentralnervensystems war rmPER-immunreaktiv im Zellkern. Es konnten keine Unterschiede zwischen den untersuchten ZTs festgestellt werden, Ă€hnlich wie bei den western blot Zeitreihen. In dieser Studie konnten erstmals molekulare Daten der circadianen Uhr von R. maderae erfasst und dargestellt werden. Die Uhrgene per, tim1 und cry2 werden in dieser Schabenart exprimiert und ihre DomĂ€nenstruktur sowie das circadiane Expressionsmuster Ă€hneln dem hypothetischen ursprĂŒnglichen Insektenuhrwerk, welches der circadianen Uhr von Vertebraten nahesteht. Das molekulare Uhrwerk von R. maderae kann sich an unterschiedliche Photoperioden anpassen, und diese Anpassungen manifestieren sich im Expressionsprofil der untersuchten Uhrgene ebenso wie im Verhalten.
@phdthesis{urn:nbn:de:hebis:34-2014051445427, author ={Werckenthin, Achim}, title ={Characterization of the molecular clockwork in the cockroach Rhyparobia maderae}, keywords ={500 and 570 and Genexpression and Leucophaea maderae and Tagesrhythmus}, copyright ={https://rightsstatements.org/page/InC/1.0/}, language ={en}, school={UniversitĂ€t Kassel, FB 10, Mathematik und Naturwissenschaften, Institut fĂŒr Biologie, Abteilung Tierphysiologie}, year ={2014-05-14} }