Characterization of the molecular clockwork in the cockroach Rhyparobia maderae
| dc.contributor.corporatename | Universität Kassel, FB 10, Mathematik und Naturwissenschaften, Institut für Biologie, Abteilung Tierphysiologie | |
| dc.contributor.referee | Stengl, Monika (Prof. Dr.) | |
| dc.contributor.referee | Schäfer, Mireille (Prof. Dr.) | |
| dc.date.accessioned | 2014-05-14T12:52:48Z | |
| dc.date.available | 2014-05-14T12:52:48Z | |
| dc.date.examination | 2014-02-17 | |
| dc.date.issued | 2014-05-14 | |
| dc.identifier.uri | urn:nbn:de:hebis:34-2014051445427 | |
| dc.identifier.uri | http://hdl.handle.net/123456789/2014051445427 | |
| dc.language.iso | eng | |
| dc.rights | Urheberrechtlich geschützt | |
| dc.rights.uri | https://rightsstatements.org/page/InC/1.0/ | |
| dc.subject | circadian clock | eng |
| dc.subject | Rhyparobia maderae | eng |
| dc.subject | feedback loop | eng |
| dc.subject | gene expression | eng |
| dc.subject | period | eng |
| dc.subject | timeless 1 | eng |
| dc.subject | cryptochrome 2 | eng |
| dc.subject.ddc | 500 | |
| dc.subject.ddc | 570 | |
| dc.subject.swd | Genexpression | ger |
| dc.subject.swd | Leucophaea maderae | ger |
| dc.subject.swd | Tagesrhythmus | ger |
| dc.title | Characterization of the molecular clockwork in the cockroach Rhyparobia maderae | eng |
| dc.type | Dissertation | |
| dcterms.abstract | Der Wechsel von Tag und Nacht erzeugt einen regelmäßigen Rhythmus von verschiedenen Umweltreizen, allen voran Licht und Temperatur. Fast jedes bis zum heutigen Tage untersuchte Lebewesen besitzt einen endogenen Mechanismus zur Zeitwahrnehmung, und diese "innere Uhr" befähigt Lebewesen dazu, sich vorausschauend an rhythmische Umwelt-Änderungen anzupassen. Circadiane Rhythmen bestehen auch ohne jegliche äußere Reize und basieren auf einem molekularen Rückkopplungs-Mechanismus, der Rhythmen in Genexpression und Proteinkonzentration von etwa 24 Stunden erzeugt. Obwohl sich die grundsätzlichen Mechanismen und Komponenten dieses molekularen Uhrwerks in allen Insekten ähneln, zeigte sich jedoch immer mehr, dass es im Detail doch wesentliche Unterschiede zwischen verschiedenen Insektengruppen gibt. Während das molekulare Uhrwerk der Fruchtfliege Drosophila melanogaster inzwischen sehr gut untersucht ist, fehlen bei den meisten Insektengruppen immernoch eingehende Untersuchungen. Fast nichts ist über die molekulare Basis von circadianen Rhythmen bei der Schabe Rhyparobia maderae bekannt, obwohl diese Art bereits seit Langem als Modellorganismus in der Chronobiologie dient. Um mit der Forschung am molekularen, circadianen System von R. maderae zu beginnen, wurde die Struktur und das Expressionsprofil der core feedback loop Gene per, tim1 und cry2 analysiert. Mittels degenerierten Primern und RACE konnte das vollständige offene Leseraster (OLR) von rmPer und rmCry2, und ein Teil des rmTim1 OLR kloniert werden. Eine phylogenetische Analyse gruppierte rmPER und rmCRY2 gemeinsam mit den Orthologa hemimetaboler Insekten. Viele bei D. melanogaster funktionell charakterisierte Domänen sind bei diesen Proteinen konserviert, was auf eine ähnliche Funktion in der inneren Uhr von R. maderae hinweist. Mittels quantitativer PCR konnte gezeigt werden, dass die mRNA von rmPer, rmTim1 und rmCry2 in verschiedenen Lichtregimen in der gleichen Phasenlage Tageszeit-abhängig schwankt. Die Phasenlage stellte sich bei unterschiedlichen Photoperioden jeweils relativ zum Beginn der Skotophase ein, mit Maxima in der ersten Hälfte der Nacht. Auch im Dauerdunkel zeigen sich Rhythmen in der rmTim1 und rmCry2 Expression. Die Amplitude der rmPer Expressionsrhythmen war jedoch so gering, dass keine signifikanten Unterschiede zwischen den einzelnen Zeitgeberzeiten (ZT) festgestellt werden konnten. Mittels Laufrad-Assays wurde untersucht wie Kurz- und Langtag Lichtregime die Verhaltensrhythmen beeinflussen. Es konnten nur Unterschiede in der Periodenlänge unter freilaufenden Bedingungen festgestellt werden, wenn höhere Lichtintensitäten (1000lx) zur Synchronisation (entrainment) genutzt wurden. Die Periode des freilaufenden Rhythmus war bei Tieren aus dem Kurztag länger. Die photoperiodische Plastizität zeigte sich also auch auf Verhaltensebene, obwohl höhere Lichtintensitäten notwendig waren um einen Effekt zu beobachten. Basierend auf den Sequenzen der zuvor klonierten OLR wurden gegen rmPER, rmTIM1 und rmCRY2 gerichtete Antikörper hergestellt. Die Antikörper gegen rmPER und rmTIM1 erkannten in western blots sehr wahrscheinlich spezifisch das jeweilige Protein. Zeitreihen von Gehirngewebe-Homogenisaten zeigten keinen offensichtlichen circadianen Rhythmus in der Proteinkonzentration, wahrscheinlich auf Grund einer Oszillation mit niedriger Amplitude. In Immunhistochemischen Färbungen konnte nur mit dem gegen rmPER gerichteten Antikörper aus Kaninchen ein Signal beobachtet werden. Beinahe jede Zelle des Zentralnervensystems war rmPER-immunreaktiv im Zellkern. Es konnten keine Unterschiede zwischen den untersuchten ZTs festgestellt werden, ähnlich wie bei den western blot Zeitreihen. In dieser Studie konnten erstmals molekulare Daten der circadianen Uhr von R. maderae erfasst und dargestellt werden. Die Uhrgene per, tim1 und cry2 werden in dieser Schabenart exprimiert und ihre Domänenstruktur sowie das circadiane Expressionsmuster ähneln dem hypothetischen ursprünglichen Insektenuhrwerk, welches der circadianen Uhr von Vertebraten nahesteht. Das molekulare Uhrwerk von R. maderae kann sich an unterschiedliche Photoperioden anpassen, und diese Anpassungen manifestieren sich im Expressionsprofil der untersuchten Uhrgene ebenso wie im Verhalten. | ger |
| dcterms.abstract | The change of day and night generates a daily rhythm of various environmental cues, most importantly light and temperature. Almost every organism examined to date exhibits endogenous circadian timekeeping mechanisms, and this "circadian clock" enables an organism to anticipate external rhythms. Circadian rhythms are endogenous and persist under constant conditions. They are based upon molecular feedback mechanisms that generate rhythms in gene expression and protein abundance of approximately 24 hours. Although the basic principles and components of this clockwork are essentially the same in all insects, it became obvious in the last decade that there are various interesting variations of the scheme. Whereas the molecular circadian clockwork in the fruitfly D. melanogaster is well studied, most other insect groups lack comprehensive investigations. Almost nothing is known about the molecular basis of circadian rhythms in the cockroach R. maderae, despite its long use as a circadian model organism. To analyze the molecular circadian system of R. maderae, the structure and expression profile of the core feedback loop genes per, tim1 and cry2 were analyzed. Using degenerate primers and RACE, the full length coding sequences of rmPer and rmCry2, and a fragment of rmTim1 were obtained. Phylogenetic analysis grouped rmPER and rmCRY2 with other hemimetabolous insects, and the proteins' domain structure suggests a similar function in the molecular clockwork as in other insects. Using quantitative PCR, it was shown that the transcripts of rmPer, rmTim1 and rmCry2 cycle in phase in different light regimes. The phase adjusts relative to the onset of the scotophase, with peak levels in the first half of the night. In constant darkness, cycling of rmTim1 and rmCry2 continues, but no significant differences between ZTs could be observed for rmPer, due to low amplitude cycling. Based on the acquired sequences, antibodies directed against rmPER, rmTIM1 and rmCRY2 were generated. In western blots antibodies against rmPER and rmTIM1 specifically detected protein bands in the expected molecular weight range. Time series using brain tissues did not detect any obvious cycling in protein abundance of rmPER and rmTIM1, perhaps because of low amplitude cycling. To gain information about the cellular expression of the core feedback loop genes, fluorescent immunohistochemistry was employed. Only the rm-PER antibody, derived in rabbits, yielded a signal above background. These stainings suggested a widespread expression of rmPER in the CNS without circadian oscillation, similar to the results obtained with western blots. The staining was exclusively nuclear at all times and almost every cell in the central nervous system was PER-ir. Running wheel assays were used to examine the locomotor activity of the short and long day photoperiods used in the quantitative PCR experiments. There was no significant difference in the free-running periods of animals kept at 100 lx illumination, however at 1000 lx animals kept in short days exhibited a highly significant prolonged free-running period compared to animals kept in long days. In summary, the first molecular data of the R. maderae circadian clock was obtained. The core feedback loop genes per, tim1 and cry2 are expressed in the cockroach, and their structure and circadian expression profile suggests a function similar to the ancestral insect and mammalian clock. The molecular clockwork of R. maderae has the ability to adapt to different photoperiods and these adaptations manifested on the molecular and behavioral level. | eng |
| dcterms.accessRights | open access | |
| dcterms.alternative | The core feedback loop genes period, timeless 1 and cryptochrome 2 | eng |
| dcterms.creator | Werckenthin, Achim |